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WO2016013352A1 - 脱分化脂肪細胞の製造方法 - Google Patents

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WO2016013352A1
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adipocytes
dedifferentiated
cells
less
mature
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雅規 本田
仁奈 鶴町
大輔 秋田
守雄 外木
浩一郎 加野
太郎 松本
Original Assignee
学校法人日本大学
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  • the present invention relates to a method for producing dedifferentiated fat cells (DFAT cells). More specifically, the present invention relates to a method for isolating mature adipocytes by treating adipose tissue with a specific concentration of collagenase and producing dedifferentiated adipocytes from the mature adipocytes.
  • DFAT cells dedifferentiated fat cells
  • the present inventors have isolated mature adipocytes from adipose tissue and produced dedifferentiated adipocytes from the mature adipocytes.
  • Dedifferentiated adipocytes are cells that have re-acquired pluripotency obtained by spontaneously initiating dedifferentiation of mature adipocytes by culturing isolated mature adipocytes by a ceiling culture method. It is considered useful as a cell source for regenerative medicine.
  • it is important to efficiently isolate mature adipocytes from adipose tissue under conditions that do not damage the cells as much as possible. Therefore, the present inventors examined the optimum collagenase concentration in the treatment of adipose tissue for producing a large amount of dedifferentiated adipocytes in the present invention.
  • An object is to provide an efficient method for producing dedifferentiated adipocytes.
  • the inventors of the present invention have found that the concentration of collagenase conventionally used at a concentration of 0.1 w / v% in the isolation of mature adipocytes from adipose tissue Matured adipocytes can be collected at a efficiency about 3 times higher than the conventional concentration when the concentration is higher than 0.01 w / v% and lower than 0.1 w / v%. Has been found to be able to be produced, and the present invention has been completed.
  • the present invention relates to the following (1) to (6) methods for producing dedifferentiated adipocytes.
  • a method for producing dedifferentiated adipocytes comprising the following step A.
  • A. A step of isolating mature adipocytes by treating adipose tissue with collagenase at a concentration higher than 0.01 w / v% and lower than 0.1 w / v% (2) The concentration of collagenase is 0.02 w / v
  • the production method according to (1) wherein the production method is v% or more and 0.05% or less.
  • the present invention it becomes possible to collect mature adipocytes with high efficiency without damaging isolated mature adipocytes.
  • the cost can be reduced by reducing the amount of collagenase used in the treatment.
  • the “method for producing dedifferentiated adipocytes” of the present invention may be any method for producing dedifferentiated adipocytes, including the following step A, and includes other steps useful for efficient production of dedifferentiated adipocytes. It may be included.
  • adipose tissue obtained from subcutaneous or internal organs is treated with collagenase at a concentration higher than 0.01 w / v% and lower than 0.1 w / v%.
  • the enzyme solution containing mature adipocytes obtained by this collagenase treatment is filtered with a mesh having a pore size of 100 and 150 ⁇ m, and a single fraction consisting of only monocystic adipocytes which are mature adipocytes For example, isolation of mature adipocytes.
  • the concentration of collagenase may be higher than 0.01 w / v% and lower than 0.1 w / v%, particularly 0.02 w / v% or more and 0.05% or less. Is preferred.
  • the mature adipocytes to be produced may have a normal size of about 60 to 100 ⁇ m, but are preferably less than 60 ⁇ m, particularly preferably less than 40 ⁇ m.
  • the “dedifferentiated adipocyte production method” of the present invention may further include the following step B.
  • the isolated mature adipocytes are cultured by a ceiling culture method. Can be mentioned.
  • the present invention of the present inventors Patent Nos. 5055611 and 5055613 may be referred to.
  • the “method for producing mesenchymal cells” of the present invention may be any method for producing mesenchymal cells, including the step of inducing differentiation of dedifferentiated adipocytes obtained by “method for producing dedifferentiated adipocytes”. Other processes useful in the production of mesenchymal cells may be included. “Mesenchymal cells” include osteoblasts, myoblasts, cardiomyocytes, endothelial cells, chondrocytes or adipocytes. In the step of inducing differentiation of dedifferentiated adipocytes, any conventionally known methods such as agents and methods useful for inducing differentiation can be used in accordance with the cells to be differentiated.
  • Step A Step of isolating mature adipocytes from adipose tissue 5 g of adipose tissue collected from the buccal fat pad located under the human buccal mucosa is added with collagenase (Type II; SIGMA) and NaHCO 3 -containing Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM; SIGMA) And treated with collagenase.
  • collagenase Type II; SIGMA
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • the collagenase concentration in the medium was 0.02 w / v%, and a comparison was made with a concentration of 0.01 w / v%, 0.10 w / v%, or 0.50 w / v% for comparison.
  • the solution was filtered through a nylon mesh to obtain a cell suspension.
  • the obtained cell suspension is centrifuged at 700 G for 1 minute, the monocystic fat fraction separated in the upper layer is added to fresh DMEM medium supplemented with 10% FBS, and the centrifugation at 700 G is repeated 3 times for 1 minute.
  • mature adipocytes were obtained as monocystic adipocytes.
  • Step B Step of obtaining dedifferentiated adipocytes from mature adipocytes
  • the monocystic adipocytes obtained by step A are transferred to a tissue culture flask (Falcon, 3107), and are added to a DMEM medium supplemented with 20% FBS, 1% penicillin / streptomycin.
  • the flask was completely filled, and it was left to stand in a carbon dioxide culture apparatus adjusted to a gas phase of 37 ° C., 5% CO 2 , 95% air, and cultured for 7 days. After 4 days of culture, most of the cells adhered firmly to the ceiling surface of the flask, and the morphology changed to multivesicular adipocytes having lipid droplets of various sizes around the large lipid droplets.
  • the lipid droplets became even smaller, and many cells that changed to a fibroblast-like morphology without any lipid droplets were observed.
  • the medium in the flask was replaced with 20% FBS-added DMEM medium, and culturing was continued for 10 days in a carbon dioxide culture apparatus so that the cell adhesion surface was the bottom. The medium was changed every 4 days. Cells without lipid droplets proliferated actively, and after 10 days in culture, the cells in the flask became only fibroblast-like cells and reached confluence.
  • This fibroblast-like cell has an active proliferative ability and also has a differentiation ability to redifferentiate into adipocytes having lipid droplets by a differentiation inducer such as DEX, INS, IBMX, etc. It was created as a cell-derived dedifferentiated adipocyte.
  • the produced dedifferentiated adipocytes were resuspended in DMEM medium supplemented with 20% FBS so as to be 1 ⁇ 10 4 cells / ml. Thereafter, the cells were seeded in a culture flask for tissue culture (Falcon, 3001) coated with collagen type II, and left in a carbon dioxide culture apparatus adjusted to a gas phase of 37 ° C., 5% CO 2 and 95% air. And cultured. The medium was changed every 4 days. After 8 days of culture, the number of cells was counted when the dedifferentiated adipocytes of the present invention reached confluence (FIGS. 1-3, P1). Thereafter, the second subculture was performed and the number of cells was similarly counted (FIGS. 1 to 3, P2), and then the third subculture was performed and the number of cells was similarly counted (FIGS. 1 to 3). , P3).
  • Example 2 Method for producing dedifferentiated adipocytes (2) 1. Comparison of the number of mature adipocytes A collagen tissue treatment was performed on adipose tissue collected from human buccal fat pad in the same manner as in Example 1. After treatment with collagenase at each concentration for 1 hour, extracellular matrix components were removed using a 100 ⁇ m cell strainer (BD FALCON), followed by filtration and low-speed centrifugation to obtain a mature adipocyte fraction. The number of cells contained in 200 ⁇ l of the floating cell fraction at each collagenase concentration was measured using a Coulter Counter (registered trademark) Multisizer 3 (Beckman Coulter, Miami, FL, USA), and the number of mature fat cells collected. Compared. This measurement was performed three times for each concentration.
  • BD FALCON 100 ⁇ m cell strainer
  • the number of cells contained in 200 ⁇ l of the floating cell fraction at each collagenase concentration was measured using a Coulter Counter (registered trademark) Multisizer 3 (Beckman Co
  • the number of mature adipocytes obtained by the above 1 and 2 is shown in FIG.
  • mature fat cells having a size in the range of 60 ⁇ m or more and less than 100 ⁇ m were collected in the same number of mature fat cells at any collagenase concentration.
  • mature adipocytes with a size of less than 60 ⁇ m can be collected in a significantly larger amount than other concentrations when the collagenase concentration is 0.02 w / v%.
  • mature adipocytes having a size of less than 40 ⁇ m can be collected 6 times or more when the collagenase concentration is 0.02 w / v% compared to other concentrations.
  • Fluorescent staining The fraction of cells less than 40 ⁇ m or the fraction of cells less than 40 ⁇ m and less than 100 ⁇ m collected in Adipore (Lonza, Walkerslive, MD, USA) positive for lipid droplets (triglycerides) and Hoechst 33342 (Sigma) positive for nuclei -Aldrich, 5 ⁇ g / ml) was stained for 20 minutes and observed with a fluorescence microscope (KEYENCE). As a result, as shown in FIG. 5, both the cell fraction of less than 40 ⁇ m (FIG. 5, A) and the cell fraction of 40 ⁇ m to less than 100 ⁇ m (FIG. 5, B) were stained with triglycerides and nuclei. It was confirmed to be a mature adipocyte.
  • the number of mature adipocytes of less than 40 ⁇ m is significantly larger than that of mature adipocytes of 40 ⁇ m or more and less than 100 ⁇ m from the 6th day of the ceiling culture, and dedifferentiated adipocytes are removed. It was confirmed that it differentiated.
  • CD13 PE-CD13
  • CD44 FITC-CD44
  • CD45 FITC-CD45
  • CD73 PE-CD73
  • CD90 APC-CD90
  • CD105 APC-CD105
  • the reaction was performed with CD146 (PE-CD146), CD271 (PE-CD271), and STRO-1 (FITC-STRO1) (all of which were BD Biosciences, San Jose, CA, USA) for 20 minutes. Thereafter, the cells after the reaction were washed with PBS, and the percentage of positive cells was measured with a flow cytometer.
  • dedifferentiated adipocytes obtained from a cell fraction of less than 40 ⁇ m are more mesenchymal stem cells than dedifferentiated adipocytes obtained from a cell fraction of 40 ⁇ m or more and less than 100 ⁇ m. It was confirmed that the ratio of CD146 positive cells as a marker was about 1.5 to 2 times higher.
  • Example 3 Method for producing mesenchymal cells Subcultured dedifferentiated adipocytes obtained from the cell fraction of less than 40 ⁇ m obtained in Example 2 and dedifferentiated adipocytes obtained from the cell fraction of 40 ⁇ m or more and less than 100 ⁇ m, Cells from the first passage were seeded at 1 ⁇ 10 4 in a 12-well plate, and when they became confluent, induction culture was performed in an osteoblast induction medium for 21 days.
  • the composition of the differentiation-inducing medium (DIFFERENTIATION-INDUCING CULTURE MEDIUM (may be referred to as IM or Osteogenic medium in the drawing)) is the growth medium (Growth medium (may be indicated as GM in the drawing)) [DMEM, 10% (v / v) fetal bovine serum (FBS; 13B103, Sigma-Aldrich), 1% antibiotics] to 100 nM dexamethasone (Sigma-Aldrich), 10 mM b-glycerphosphine (Sigma-Aldrich-Sigma-Aldrich-Sigma-Aldrich-Sigma-Aldrich-Sigma-Aldrich-Sigma-Aldrich-Sigma-Albich-Sigma-Aldrich-Sigma-Albich Aldrich) is added. This osteoblast induction was evaluated by alkaline phosphatase activity, alizarin red S staining, and calcium quantitative test
  • alkaline phosphatase activity The cells at 0, 3, 5, 7, 10, 14 days after the start of induction were collected, the protein amount was measured using Pierce BCA protein Assay Reagent Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) and alkaline phosphatase Activity was measured. As a result, as shown in FIG. 7, dedifferentiated fat cells obtained from the cell fraction of less than 40 ⁇ m (FIG. 7, under 40 ⁇ m IM) were obtained from the cell fraction of 40 ⁇ m or more and less than 100 ⁇ m. Compared to (FIG. 7, 40-100 ⁇ m IM), alkaline phosphatase activity was significantly higher on days 3, 5, and 7 after the start of induction.
  • the present invention it becomes possible to efficiently collect mature adipocytes without damaging the isolated mature adipocytes.
  • a large amount of dedifferentiated adipocytes can be produced, so that they can be widely used as a cell source for regenerative medicine.

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

高効率に脂肪組織から成熟脂肪細胞を単離し、該成熟脂肪細胞より脱分化脂肪細胞を製造する方法の提供を課題とする。 次のＡの工程を含む、脱分化脂肪細胞の製造方法を提供する。 Ａ．脂肪組織を０．０２ｗ／ｖ％のコラゲナーゼで処理することにより、成熟脂肪細胞を単離する工程

Description

脱分化脂肪細胞の製造方法
　本発明は、脱分化脂肪細胞（Ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ　ｆａｔ　ｃｅｌｌｓ；ＤＦＡＴ　ｃｅｌｌｓ）の製造方法に関する。さらに詳しくは、脂肪組織を特定の濃度のコラゲナーゼで処理することにより成熟脂肪細胞を単離し、該成熟脂肪細胞より脱分化脂肪細胞を製造する方法に関する。
　従来、脂肪組織から成熟脂肪細胞を単離するために、脂肪組織をコラゲナーゼで処理して組織中の細胞外マトリックスから細胞を切り離し、成熟脂肪細胞のみを採取する方法が行われてきた。この方法において、一般的に０．１ｗ／ｖ％の濃度でコラゲナーゼが使用されている。
　この０．１ｗ／ｖ％というコラゲナーゼの濃度は、Ｒｏｄｂｅｌｌが１９６４年に報告したものであり（非特許文献１、２）、現在に至るまで、この濃度のままコラゲナーゼを使用するのが一般的である。しかし、コラゲナーゼはトリプシンと同様に細胞への障害作用があるため、濃度が高いほど細胞に与える傷害が大きくなるという問題がある。
　本発明者らは脂肪組織から成熟脂肪細胞を単離し、該成熟脂肪細胞より脱分化脂肪細胞を製造している。脱分化脂肪細胞は、単離した成熟脂肪細胞を天井培養法によって培養することで、成熟脂肪細胞が自発的に脱分化を開始することによって得られる多分化能を再獲得した細胞であるため、再生医療の細胞源として有用視されている。
　このような脱分化脂肪細胞を大量に製造するには、細胞に極力障害を与えない条件で、脂肪組織より成熟脂肪細胞を効率的に単離することが重要となる。そこで、本発明者らは本発明において、脱分化脂肪細胞を大量に製造するための、脂肪組織の処理にあたり最適なコラゲナーゼ濃度を検討した。
　なお、脂肪組織のコラゲナーゼによる処理について、特許文献１において、ウシ科動物組織を０．２５ｖ／ｖ％のコラゲナーゼ濃度で消化させたこと、また、ヒト、イヌ科動物等の脂肪組織が通常の濃度（０．０２％または０．０５％）のコラゲナーゼで全て消化されたことが開示されている。しかし、この文献は、脱分化脂肪細胞を大量に製造することを目的とする、本発明とは異なるものである。
特表２０１４－５１１８２７号公報
ＬＯＣＡＬＩＺＡＴＩＯＮ　ＯＦ　ＬＩＰＯＰＲＯＴＥＩＮ　ＬＩＰＡＳＥ　ＩＮ　ＦＡＴ　ＣＥＬＬＳ　ＯＦ　ＲＡＴ　ＡＤＩＰＯＳＥ　ＴＩＳＳＵＥ．　ＲＯＤＢＥＬＬ　Ｍ　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．　１９６４　Ｍａｒ；２３９：７５３－５． ＭＥＴＡＢＯＬＩＳＭ　ＯＦ　ＩＳＯＬＡＴＥＤ　ＦＡＴ　ＣＥＬＬＳ．　Ｉ．　ＥＦＦＥＣＴＳ　ＯＦ　ＨＯＲＭＯＮＥＳ　ＯＮ　ＧＬＵＣＯＳＥ　ＭＥＴＡＢＯＬＩＳＭ　ＡＮＤ　ＬＩＰＯＬＹＳＩＳ．　ＲＯＤＢＥＬＬ　Ｍ．　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．　１９６４　Ｆｅｂ；２３９：３７５－８０
　脱分化脂肪細胞の効率的な製造方法の提供を課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、脂肪組織からの成熟脂肪細胞の単離において、従来、０．１ｗ／ｖ％の濃度で用いられてきたコラゲナーゼの濃度を０．０１ｗ／ｖ％より高く、かつ、０．１ｗ／ｖ％より低い濃度にした場合に従来の濃度と比較して約３倍の高効率で成熟脂肪細胞が採取でき、脱分化脂肪細胞を製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は次の（１）～（６）の脱分化脂肪細胞の製造方法等に関する。
（１）次のＡの工程を含む、脱分化脂肪細胞の製造方法。
Ａ．脂肪組織を０．０１ｗ／ｖ％より高く、かつ、０．１ｗ／ｖ％より低い濃度のコラゲナーゼで処理することにより、成熟脂肪細胞を単離する工程
（２）コラゲナーゼの濃度が０．０２ｗ／ｖ％以上であり、かつ、０．０５％以下である上記（１）に記載の製造方法。
（３）成熟脂肪細胞が６０μｍ未満の大きさである上記（１）または（２）に記載の方法。
（４）さらに次のＢの工程を含む、上記（１）～（３）のいずれかに記載の脱分化脂肪細胞の製造方法。
Ｂ．上記Ａの工程により単離された成熟脂肪細胞より、脱分化脂肪細胞を取得する工程
（５）上記（１）～（４）のいずれかの方法によって製造された脱分化脂肪細胞を分化誘導する工程を含む、間葉系細胞の製造方法
（６）間葉系細胞が、骨芽細胞、筋芽細胞、心筋細胞、内皮細胞、軟骨細胞または脂肪細胞から選ばれるいずれかである上記（５）に記載の方法。
　本発明の提供により、単離する成熟脂肪細胞に損傷を与えることなく、高効率で成熟脂肪細胞を採取することが可能となる。また、処理に使用するコラゲナーゼの量を減らすことでコストを抑えることも可能となる。
脱分化脂肪細胞の各継代培養時における細胞数を示した図である（実施例１）。 脱分化脂肪細胞の各継代培養時における細胞数を示した図である（実施例１）。 脱分化脂肪細胞の各継代培養時における細胞数を示した図である（実施例１）。 採取された成熟脂肪細胞の細胞数を示した図である（実施例２）。 採取された成熟脂肪細胞を蛍光染色した結果を示した図である（実施例２）。 脱分化脂肪細胞の細胞数を示した図である（実施例２）。 アルカリフォスファターゼ活性を示した図である（実施例３）。 アリザリンレッドＳ染色の結果を示した図である（実施例３）。 カルシウム沈着量を示した図である（実施例３）。
　本発明の「脱分化脂肪細胞の製造方法」は、次のＡの工程を含む、脱分化脂肪細胞の製造方法であれば良く、脱分化脂肪細胞の効率的な製造にあたり有用なその他の工程を含んでいても良い。
Ａ．脂肪組織を０．０１ｗ／ｖ％より高く、かつ、０．１ｗ／ｖ％より低い濃度のコラゲナーゼで処理することにより、成熟脂肪細胞を単離する工程
　例えば、「成熟脂肪細胞を単離する工程」には、皮下や内臓等から得られた脂肪組織を０．０１ｗ／ｖ％より高く、かつ、０．１ｗ／ｖ％より低い濃度のコラゲナーゼで処理することに加えて、このコラゲナーゼ処理によって得られた成熟脂肪細胞を含む酵素液を孔径１００および１５０μｍのメッシュでフィルトレーションし、成熟脂肪細胞である単胞性脂肪細胞のみからなる単一の画分として成熟脂肪細胞を単離すること等が挙げられる。
　コラゲナーゼの濃度は０．０１ｗ／ｖ％より高く、かつ、０．１ｗ／ｖ％より低い濃度であれば良く、特に０．０２ｗ／ｖ％以上であり、かつ、０．０５％以下であることが好ましい。
　製造される成熟脂肪細胞は、６０～１００μｍ程度の通常の大きさであっても良いが、６０μｍ未満であることが好ましく、特に４０μｍ未満であることが好ましい。
　また、本発明の「脱分化脂肪細胞の製造方法」は、さらに、次のＢの工程を含むものであっても良い。
Ｂ．上記Ａの工程により単離された成熟脂肪細胞より、脱分化脂肪細胞を取得する工程
　この「脱分化脂肪細胞を取得する工程」には、単離された成熟脂肪細胞を天井培養法によって培養することが挙げられる。
　これらの工程を行うにあたり、本発明者らの先願発明（特許第５０５５６１１号、特許第５０５５６１３号）を参照して行っても良い。
　本発明の「間葉系細胞の製造方法」は、「脱分化脂肪細胞の製造方法」によって得られた脱分化脂肪細胞を分化誘導する工程を含む、間葉系細胞の製造方法であれば良く、間葉系細胞の製造にあたり有用なその他の工程を含んでいても良い。
　「間葉系細胞」には、骨芽細胞、筋芽細胞、心筋細胞、内皮細胞、軟骨細胞または脂肪細胞等が挙げられる。脱分化脂肪細胞を分化誘導する工程では、分化誘導する各細胞に合わせて分化誘導に有用な剤、方法等の従来知られているいずれの方法も用いることができる。
　以下、実施例、試験例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　本発明の実施例、比較例では、特に記載がない限り、次の試料を使用した。
１）酵素
　コラゲナーゼ（ＴｙｐｅＩＩ；Ｃ６８８５－１Ｇ，ＳＩＧＭＡ）を使用した。
２）脂肪組織
　顎変形症の手術の際に得られたヒト頬脂肪体から脂肪組織を得た。
〔実施例１〕
脱分化脂肪細胞の製造方法（１）
工程Ａ．脂肪組織から成熟脂肪細胞を単離する工程
　ヒト頬粘膜下に位置する頬脂肪体より採取した脂肪組織５ｇを、コラゲナーゼ（ＴｙｐｅＩＩ；ＳＩＧＭＡ）添加のＮａＨＣＯ３含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；ＳＩＧＭＡ）に入れ、コラゲナーゼ処理を行った。本発明において該培地におけるコラゲナーゼの濃度を０．０２ｗ／ｖ％とし、比較として０．０１ｗ／ｖ％、０．１０ｗ／ｖ％または０．５０ｗ／ｖ％の濃度としたものも作成した。
　各濃度のコラゲナーゼ処理を行った後、ナイロンメッシュにて濾過し、細胞懸濁液を得た。得られた細胞懸濁液を１分間、７００Ｇで遠心分離し、上層に分離される単胞性脂肪画分を新鮮な１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に加え、１分間、７００Ｇの遠心分離を３回繰り返すことで、単胞性脂肪細胞として成熟脂肪細胞を得た。
工程Ｂ．成熟脂肪細胞より、脱分化脂肪細胞を取得する工程
　工程Ａによって得られた単胞性脂肪細胞を組織培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ，３１０７）に移し、２０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地でフラスコ内を完全に満たし、３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気の気相に調節した炭酸ガス培養装置内にフラスコ底面が上となるように静置して７日間培養した。
　培養４日後には大部分の細胞がフラスコ天井面にしっかりと接着し、大型の脂肪滴の周辺に種々の大きさの脂肪滴を有する多胞性脂肪細胞へと形態変化した。培養６日後には脂肪滴がさらに小さくなり、脂肪滴をまったく持たない線維芽細胞様の形態に変化する細胞が多数観察された。
　培養７日後にフラスコ内の培地を２０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に交換し、細胞接着面が底面になるようにして炭酸ガス培養装置内で１０日間培養を続けた。培地交換は４日毎に行った。脂肪滴を持たない細胞は活発に増殖し、培養１０日後にはフラスコ内の細胞は線維芽細胞様の細胞のみとなり、コンフルエントに達した。
　この線維芽細胞様の細胞は、活発な増殖能を有し、またＤＥＸ、ＩＮＳ、ＩＢＭＸ等の分化誘導剤により、脂肪滴を有する脂肪細胞に再分化する分化能を有することから、単胞性脂肪細胞由来の脱分化脂肪細胞として作出された。
　作出された脱分化脂肪細胞を１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように２０％ＦＢＳ添加したＤＭＥＭ培地に再浮遊させた。その後、コラーゲンタイプＩＩを塗布した組織培養用の培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ，３００１）中に播種し、３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気の気相に調節した炭酸ガス培養装置内に静置して培養した。なお、培地の交換は４日ごとに行った。培養８日後、本発明の脱分化脂肪細胞がコンフルエントに到達した段階で細胞数を数えた（図１～３、Ｐ１）。
　その後、２回目の継代培養を行い、同様に細胞数を数えた（図１～３、Ｐ２）後、さらに３回目の継代培養を行い、同様に細胞数を数えた（図１～３、Ｐ３）。
　その結果、図１～３に示されるように、コラゲナーゼの濃度を０．０２ｗ／ｖ％として脂肪組織から単離した成熟脂肪細胞を用いた場合、コラゲナーゼの濃度を０．０１ｗ／ｖ％、０．１０ｗ／ｖ％、０．５０ｗ／ｖ％とした場合と比べて、有意に大量の脱分化脂肪細胞が製造できることが確認された。図１～３以外にも同様の試験を複数回行ったが、いずれもコラゲナーゼの濃度を０．０２ｗ／ｖ％とした場合に、有意に大量の脱分化脂肪細胞を製造することができ、同様の結果であった。
〔実施例２〕
脱分化脂肪細胞の製造方法（２）
１．成熟脂肪細胞数の比較
　実施例１と同様の方法に、ヒトの頬脂肪体より採取した脂肪組織をコラゲナーゼ処理した。各濃度のコラゲナーゼ処理を１時間行った後、１００μｍのセルストレーナー（ＢＤ　ＦＡＬＣＯＮ）を用いて細胞外基質成分を除去した後、濾過および低速遠心分離を行い、成熟脂肪細胞分画を得た。この各コラゲナーゼ濃度の浮遊細胞分画２００μｌ中に含まれる細胞数をコールターカウンター：Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｃｏｕｎｔｅｒ（登録商標）　Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ３（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ，ＵＳＡ）を用いて測定し、採取された成熟脂肪細胞数を比較した。この測定は各濃度それぞれ３回行った。
２．成熟脂肪細胞分画の大きさによる分取
　上記１において低速遠心分離後に単離した浮遊細胞分画を、４０μｍのセルストレーナー（ＢＤ　ＦＡＬＣＯＮ）で濾過し、得られた細胞分画を４０μｍ未満の細胞分画とした。また、同じく１００μｍのセルストレーナーで濾過後、さらに４０μｍのセルストレーナーで４０μｍ未満の細胞分画を排除して得た細胞分画を４０μｍ以上１００μｍ未満の細胞分画とした。
　上記１、２により得られた成熟脂肪細胞数を図４に示した。図４に示されるように、６０μｍ以上１００μｍ未満の範囲の大きさの成熟脂肪細胞は、いずれのコラゲナーゼ濃度であっても同程度の数の成熟脂肪細胞が採取された。一方で、６０μｍ未満の大きさの成熟脂肪細胞は、コラゲナーゼ濃度を０．０２ｗ／ｖ％とした場合に、他の濃度と比較して有意に大量に採取できることが示された。さらに、４０μｍ未満の大きさの成熟脂肪細胞は、コラゲナーゼ濃度を０．０２ｗ／ｖ％とした場合に、他の濃度とした場合と比べて６倍以上採取できることが確認できた。
３．蛍光染色
　上記２．において分取した４０μｍ未満の細胞分画または４０μｍ以上１００μｍ未満の細胞分画について、脂肪滴（トリグリセリド）に陽性を示すＡｄｉｐｏｒｅｄ（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｌｉｖｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）および核に陽性を示すＨｏｅｃｈｓｔ　３３３４２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，５μｇ／ｍｌ）にて２０分染色を行い、蛍光顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ）にて観察を行った。
　その結果、図５に示されるように、４０μｍ未満の細胞分画（図５、Ａ）も４０μｍ以上１００μｍ未満の細胞分画（図５、Ｂ）のいずれもトリグリセリドおよび核が染色されたことから、成熟脂肪細胞であることが確認できた。
４．脱分化脂肪細胞数の比較
　４０μｍ未満の細胞分画または４０μｍ以上１００μｍ未満の細胞分画の成熟脂肪細胞を１フラスコあたり、１×１０４個ずつ播種し、天井培養を行った。天井培養開始後６日目の細胞数を測定した後、その後７日目にフラスコを反転し、１０日目、１４日目、１８日目の脱分化脂肪細胞の数を測定した。
　その結果、図６に示されるように、４０μｍ未満の成熟脂肪細胞の方が４０μｍ以上１００μｍ未満の成熟脂肪細胞に比較して、天井培養開始６日目から有意に多く、脱分化脂肪細胞へ脱分化することが確認できた。
５．細胞表面抗原の確認
　上記４．にて得られた４０μｍ未満の成熟脂肪細胞または４０μｍ以上１００μｍ未満の成熟脂肪細胞から得られた脱分化脂肪細胞をそれぞれ継代培養し、１継代目の細胞を１×１０５個ずつ１０ｃｍ　ｄｉｓｈに播種し、６０％コンフルエントの細胞を回収した。これを５×１０５／ｔｕｂｅに分注した。
　それぞれの脱分化脂肪細胞について、ＣＤ１３（ＰＥ－ＣＤ１３）、ＣＤ４４（ＦＩＴＣ－ＣＤ４４）、ＣＤ４５（ＦＩＴＣ－ＣＤ４５）、ＣＤ７３（ＰＥ－ＣＤ７３）、ＣＤ９０（ＡＰＣ－ＣＤ９０）、ＣＤ１０５（ＡＰＣ－ＣＤ１０５）、ＣＤ１４６（ＰＥ－ＣＤ１４６）、ＣＤ２７１（ＰＥ－ＣＤ２７１）、ＳＴＲＯ－１（ＦＩＴＣ－ＳＴＲＯ１）（いずれもＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で２０分間反応させた。その後、反応後の細胞をＰＢＳで洗浄し、フローサイトメーターにて陽性細胞の割合を計測した。
　その結果、表１に示されるように、４０μｍ未満の細胞分画から得られた脱分化脂肪細胞は４０μｍ以上１００μｍ未満の細胞分画から得られた脱分化脂肪細胞に対して間葉系幹細胞のマーカーであるＣＤ１４６陽性細胞の割合が約１．５～２倍多いことが確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
　従って、これら１．～５．の結果より、４０μｍ未満の成熟脂肪細胞を得ることにより、効率的に脱分化脂肪細胞が製造できることが示された。また、脂肪組織より４０μｍ未満の成熟脂肪細胞を得るには、コラゲナーゼ濃度を０．０２ｗ／ｖ％として採取することが特に好ましいことも確認できた。
〔実施例３〕
間葉系細胞の製造方法
　実施例２において得た４０μｍ未満の細胞分画から得られた脱分化脂肪細胞と４０μｍ以上１００μｍ未満の細胞分画から得られた脱分化脂肪細胞を継代培養し、１継代目の細胞を１×１０４個ずつ１２ウェルプレートに播種した、コンフルエントになったら、骨芽細胞誘導培地にて２１日間誘導培養を行った。
　分化誘導培地（ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ－ＩＮＤＵＣＩＮＧ　ＣＵＬＴＵＲＥ　ＭＥＤＩＵＭ（図面においてＩＭまたはＯｓｔｅｏｇｅｎｉｃ　ｍｅｄｉｕｍと示す場合がある））の組成は増殖培地（Ｇｒｏｗｔｈ　ｍｅｄｉｕｍ（図面においてＧＭと示す場合がある））［ＤＭＥＭ、１０％（ｖ／ｖ）　ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ；１３Ｂ１０３，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ），１％　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ］に１００ｎＭ　ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ），１０ｍＭ　ｂ－ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ），５０ｍＭ　Ｌ－ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ－２－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加したものである。
　この骨芽細胞誘導の評価は、アルカリフォスファターゼ活性、アリザリンレッドＳ染色、カルシウム定量試験にて行った。
１．アルカリフォスファターゼ活性
　誘導開始０、３、５、７、１０、１４日目の細胞を回収し、Ｐｉｅｒｃｅ　ＢＣＡ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いてタンパク量を測定およびアルカリフォスファターゼ活性の測定を行った。
　その結果、図７に示すように、４０μｍ未満の細胞分画から得た脱分化脂肪細胞（図７、ｕｎｄｅｒ　４０μｍ　ＩＭ）の方が、４０μｍ以上１００μｍ未満の細胞分画から得た脱分化脂肪細胞（図７、４０－１００μｍ　ＩＭ）に比較して、誘導開始３、５、７日目に有意に高いアルカリフォスファターゼ活性を示した。
２．アリザリンレッドＳ染色
　誘導開始０、７、１４、２１日目の細胞を１０％中性ホルマリン緩衝液で固定し、アリザリンレッドＳ染色液　（Ｗａｋｏ）を用いて１０分染色を行った。
　その結果、図８に示すように、４０μｍ未満の細胞分画から得た脱分化脂肪細胞（図８、ｕｎｄｅｒ　４０μｍ　Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ　ｍｅｄｉｕｍ）は４０μｍ以上１００μｍ未満の細胞分画から得た脱分化脂肪細胞（図８、４０－１００μｍ　Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ　ｍｅｄｉｕｍ）に比較して、誘導開始７日目に有意に強いアリザリンレッドＳ染色を示した。
３．カルシウム定量試験
　誘導開始０、７、１４、２１日目のカルシウム沈着量をＣａ－Ｅテストキットを用いて測定した。
　その結果、図９に示すように、４０μｍ未満の成熟脂肪細胞から得た脱分化脂肪細胞（図９、ｕｎｄｅｒ　４０μｍ　ＩＭ）は、４０μｍ以上１００μｍ未満の成熟脂肪細胞から得た脱分化脂肪細胞（図９、４０－１００μｍ　ＩＭ）に比較して、誘導開始７および２１日目に有意に多いカルシウム沈着量を示した。なお、増殖培地にて培養した脱分化脂肪細胞（図９、ｕｎｄｅｒ　４０μｍ　ＧＭおよび４０－１００μｍ　ＧＭ）は、いずれも誘導開始２１日までカルシウムの沈着は見られなかった。
　従って、これら１．～３．の結果より、４０μｍ未満の細胞分画から得られた脱分化脂肪細胞も、４０μｍ以上１００μｍ未満の細胞分画から得られた脱分化脂肪細胞もいずれも間葉系細胞に分化誘導できることが確認できた。そして、４０μｍ未満の細胞分画から得られた脱分化脂肪細胞の方が、間葉系細胞の誘導に有用であることが確認できた。
　本発明の提供により、単離する成熟脂肪細胞に損傷を与えることなく、効率的に成熟脂肪細胞を採取することが可能となる。本発明の提供により、大量に脱分化脂肪細胞を製造できるため、再生医療の細胞源として幅広く使用することも可能となる。
 

Claims (6)

  1. 次のＡの工程を含む、脱分化脂肪細胞の製造方法。
    Ａ．脂肪組織を０．０１ｗ／ｖ％より高く、かつ、０．１ｗ／ｖ％より低い濃度のコラゲナーゼで処理することにより、成熟脂肪細胞を単離する工程
  2. コラゲナーゼの濃度が０．０２ｗ／ｖ％以上であり、かつ、０．０５％以下である請求項１に記載の製造方法。
  3. 成熟脂肪細胞が６０μｍ未満の大きさである請求項１または２に記載の方法。
  4. さらに次のＢの工程を含む、請求項１～３のいずれかに記載の脱分化脂肪細胞の製造方法。
    Ｂ．上記Ａの工程により単離された成熟脂肪細胞より、脱分化脂肪細胞を取得する工程
  5. 請求項１～４のいずれかの方法によって製造された脱分化脂肪細胞を分化誘導する工程を含む、間葉系細胞の製造方法
  6. 間葉系細胞が、骨芽細胞、筋芽細胞、心筋細胞、内皮細胞、軟骨細胞または脂肪細胞から選ばれるいずれかである請求項５に記載の方法。
     
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