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WO1999036432A2 - Orotidin-5'-phosphatdecarboxylase-gen, genkonstrukt enthaltend dieses gen und seine verwendung - Google Patents

Orotidin-5'-phosphatdecarboxylase-gen, genkonstrukt enthaltend dieses gen und seine verwendung Download PDF

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WO1999036432A2
WO1999036432A2 PCT/EP1998/008382 EP9808382W WO9936432A2 WO 1999036432 A2 WO1999036432 A2 WO 1999036432A2 EP 9808382 W EP9808382 W EP 9808382W WO 9936432 A2 WO9936432 A2 WO 9936432A2
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WO
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gene
homologues
orotidine
phosphate decarboxylase
genes
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PCT/EP1998/008382
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WO1999036432A3 (de
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Markus Pompejus
Jose Luis Revuelta Doval
Maria Angeles Santos Garcia
Original Assignee
Basf Aktiengesellschaft
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Priority to US09/582,779 priority patent/US6927026B1/en
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Publication of WO1999036432A3 publication Critical patent/WO1999036432A3/de

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01023—Orotidine-5'-phosphate decarboxylase (4.1.1.23)

Definitions

  • Orotidine 5 'phosphate decarboxylase gene gene construct containing this gene and its use
  • the invention relates to an orotidine 5 'phosphate decarboxylase gene with the sequence SEQ ID No. 1 or its homologues, a gene construct containing this gene or its homologues and their use.
  • the invention also relates to vectors or
  • the invention further relates to a method for producing uracil auxotrophic microorganisms and a method for introducing DNA into uracil auxotrophic microorganisms.
  • Vitamin B2 also called riboflavin, is essential for humans and animals. With vitamin B2 deficiency, inflammation of the mucous membranes of the mouth and throat, itching and inflammation in the skin folds and similar skin damage, conjunctivitis, decreased visual acuity and clouding of the cornea occur. Growth and weight loss may occur in infants and children. Vitamin B2 is therefore of economic importance, in particular as a vitamin additive in the case of a vitamin deficiency and as a feed additive. It is also used as a food coloring, for example in mayonnaise, ice cream, pudding, etc.
  • Vitamin B2 is produced either chemically or microbially (see e.g. Kurth et al., 1996, Riboflavin, in: Ullmann's Encyclopedia of industrial chemistry, VCH Weinheim).
  • riboflavin is usually obtained as a pure end product in multi-stage processes, with relatively expensive starting products, such as D-ribose, having to be used.
  • An alternative to the chemical synthesis of riboflavin is the production of this substance by microorganisms. Renewable raw materials such as sugar or vegetable oils are used as starting materials.
  • riboflavin by fermentation of fungi such as Eremothecium ashbyii or Ashbya gossypii is known (The Merck Index, Windholz et al., Eds. Merck & Co., page 1183, 1983), but also yeasts, such as Candida, Pichia and Saccharomyces or bacteria such as Bacillus, Clostridia or Corynebacteria are described as riboflavin producers.
  • DE 44 20 785 describes six riboflavin biosynthesis genes from Ashbya gossypii, as well as microorganisms which have been transformed with these genes and the use of such microorganisms for riboflavin synthesis.
  • genes have been introduced into fungal riboflavin producers such as Ashbya gossypii via the markers leu2 (eucin auxotrophy), thr4 (threonine auxotrophy) or kan (kanamycin resistance) (WO 92/00379).
  • leu2 eucin auxotrophy
  • thr4 threonine auxotrophy
  • kan kanamycin resistance
  • Saccharomyces cerevisiae is one of the classic markers that has the desired properties and with the help of which genes can be transformed into microorganisms such as yeasts and fungi.
  • yeasts and fungi In a series of studies, the isolation of species-specific URA3 genes or the isolation of the corresponding one
  • Homologs of the orotidine 5'-phosphate decarboxylase gene according to the invention with the sequence SEQ ID NO: 1 are to be understood, for example, as allelic variants which have at least 80% homology at the derived amino acid level, preferably at least 90% homology, very particularly preferably at least 95% Show homology.
  • the amino acid sequence derived from SEQ ID NO: 1 can be found in SEQ ID NO: 1.
  • Allelic variants include, in particular, functional variants which can be obtained by deleting, inserting or substituting nucleotides from the sequence shown in SEQ ID NO: 1, the enzymatic activity of the derived synthesized proteins, however, advantageously being retained for the introduction of one or more genes.
  • mutants are to be produced in the orotidine 5 'phosphate decarboxylase gene, then non-functional genes, that is to say genes which lead to lead enzymatically inactive proteins used.
  • Sequences are advantageously used uses the homologies to SEQ ID NO: 1 or its homologs advantageously at the 3 'and 5' end.
  • Homologs of SEQ ID NO: 1 are furthermore to be understood, for example, as fungal or vegetable homologs, shortened sequences, single-stranded DNA or RNA of the coding and non-coding DNA sequence.
  • Homologs of SEQ ID NO: 1 have a homology of at least 60%, preferably at least 70%, particularly preferably at least 80%, very particularly preferably at least 90% over the entire DNA specified in SEQ ID NO: 1 at the DNA level -Area.
  • homologs of SEQ ID NO: 1 are to be understood as derivatives such as promoter variants.
  • the promoters which precede the specified nucleotide sequences can be changed by one or more nucleotide exchanges, by insertion (s) and / or deletion (s), but without the functionality or effectiveness of the promoters being impaired.
  • the effectiveness of the promoters can be increased by changing their sequence, or completely replaced by more effective promoters, including organisms of other species.
  • Derivatives are also to be understood as variants whose nucleotide sequence has been changed in the range from -1 to -200 before the start codon in such a way that the gene expression and / or the protein expression is preferably increased in a changed manner.
  • SEQ ID NO: 1 or its homologues can preferably be isolated from microorganisms of the Metschnikowiaceae family, particularly preferably from microorganisms of the genera Eremothecium, Ashbya or Nematospora, very particularly preferably from microorganisms of the genus and species Eremothecium ashbyii or Ashbya gossypii.
  • the URA3 gene sequences SEQ ID No. 1 and its homologs which have been functionally linked to one or more regulatory signals to increase gene expression.
  • these regulatory sequences are sequences to which inducers or repressors bind and thus regulate the expression of the nucleic acid.
  • the natural regulation of these sequences may still be present before the actual structural genes and may have been genetically modified so that the natural regulation has been switched off and the expression of the genes increased.
  • the gene construct can also have a simpler structure, that is to say there were no additional regulation signals before the sequence SEQ ID No. 1 or its homologues inserted and the natural promoter with its regulation was not removed.
  • the gene construct can also advantageously contain one or more so-called “enhancer sequences” functionally linked to the promoter, which enable increased expression of the nucleic acid sequence. Additional advantageous sequences, such as further regulatory elements or terminators, can also be inserted at the 3 'end of the DNA sequences.
  • the URA3 genes can be contained in one or more copies in the gene construct, wherein the gene or genes can also be inactivated. With the help of this or these inactivated genes, uracil auxotrophic mutants can be generated in the method according to the invention. In order to introduce further genes into a microorganism, further genes are advantageously contained in the gene construct.
  • genes can be within a U.RA3 gene, wherein advantageously an intact copy of URA3 gene and / or other selectable gene such as leu2, or THR4 kan in n construct should be contained, or they may lie outside the URA3 gene . Even in the case of an intact URA3 gene in the gene construct, further markers such as those mentioned above may optionally be contained in the gene construct for selection.
  • Advantageous regulatory sequences for the method according to the invention are, for example, in promoters such as cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lac1 « . Contain T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, ⁇ -P R - or in the ⁇ -P L promoter, which are advantageously used in gram-negative bacteria.
  • regulatory sequences are, for example, in 0 the gram-positive promoters amy and SP02, in the yeast or
  • the promoters of 5 pyruvate decarboxylase and methanol oxidase from, for example, Hansenula are also advantageous. Artificial promoters for regulation can also be used.
  • the gene construct may also contain further genes 5 which are to be introduced into the microorganisms. These genes can be inserted inside or outside of the marker genes such as ura3, leu2, thr4 or kan. In principle can all types of genes can be introduced into microorganisms with the aid of the URA3 gene according to the invention with the sequence SEQ ID NO: 1 or its homologues.
  • Regulatory genes such as genes for inducers, repressors or enzymes which intervene in the regulation via their enzymatic activity, or one or more or all genes of a biosynthetic pathway such as the genes of riboflavin biosynthesis such as, for example, the rib genes or genes, can advantageously be used Biosynthetic pathways that lead to other fine chemicals, secondary metabolites or proteins such as the genes of biotin, lysine, methionine, vitamin B12 or carotenoid biosynthesis, or genes that lead to aroma, growth or odorants or individual genes for enzymes such as proteases or introduce and express lipases into host organisms via the URA3 sequence. These genes can be of heterologous or homologous origin. The genes introduced can have their own
  • the gene construct is advantageously inserted into a vector such as, for example, a plasmid, a phage or other DNA, which enables optimal expression of the genes in the host.
  • a vector such as, for example, a plasmid, a phage or other DNA, which enables optimal expression of the genes in the host.
  • Suitable plasmids are, for example, in E.
  • plasmids mentioned represent a small selection of the possible plasmids. Further plasmids are well known to the person skilled in the art and can be found, for example, in the book Cloning Vectors (Eds. Pouwels PH et al. Elsevier,. Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018).
  • the gene construct for the expression of the further genes contained additionally contains 3 'and / or 5' terminal regulatory sequences for increasing expression, which are selected depending on the selected host organism and gene or genes for optimal expression.
  • regulatory sequences are intended to enable targeted expression of the genes and protein expression. Depending on the host organism, this can mean, for example, that the gene is only expressed or overexpressed after induction, or that it is expressed and / or overexpressed immediately.
  • the regulatory sequences or factors can preferably influence the gene expression of the introduced genes positively and thereby increase.
  • the regulatory elements can advantageously be strengthened at the transcription level by using strong transcription signals such as promoters and / or enhancers.
  • an increase in translation is also possible, for example, by improving the stability of the mRNA.
  • the gene construct according to the invention can also advantageously be introduced into the microorganisms in the form of a linear DNA and integrated into the genome of the host organism via heterologous or homologous recombination.
  • This linear DNA can consist of a 5 linearized plasmid or only of the gene construct as a vector.
  • prokaryotic or eukaryotic organisms 0 can be considered as host organisms for the gene construct according to the invention.
  • Microorganisms such as bacteria, fungi, yeasts, animal or plant cells are advantageously used as host organisms.
  • Mushrooms or yeasts are preferably used, particularly preferably mushrooms, very particularly preferably mushrooms of the Metschnikowiaceae family such as Eremothecium, Ashbya or Nematospora.
  • the invention also relates to a method for producing uracil auxotrophic microorganisms.
  • the orotidine-5 '-phosphate decarboxylase- Q gene with SEQ ID NO: 1 or its homologues is modified, for example by mutagenesis, in such a way that the protein encoded by the gene is inactivated.
  • This inactivated gene is then introduced into a microorganism, for example via transformation or electroporation. Homologous recombination in 5 the microorganisms finally results in auxotrophic mutants which can be screened for their resistance to 5-fluororotic acid (see Boeke et al., Mol. Gen. Genet., Vol. 197, 1984: 345-346).
  • a linear DNA is preferably used as the vector.
  • Fungi particularly of the Metschnikowiaceae family, such as Eremothecium, Ashbya or Nematosprora, particularly preferably microorganisms of the Ashbya genus, are preferably used as microorganisms in this process.
  • Any plasmid in particular a plasmid which carries the origin of replication of the 2m plasmid from S. 0 cerevisiae
  • plasmid which autonomously replicates in the cell, but also, as described above, a linear DNA fragment which enters the Host genome integrated.
  • This integration can take place via hetero- or homologous recombination.
  • preferred via homologous recombination Stepiner et al., 5 Genetics, Vol. 140, 1995: 973-987).
  • the URA3 gene according to the invention with the sequence SEQ ID NO: 1 or its homologs can advantageously be used as a selection marker in the method according to the invention.
  • Genes 0 can preferably be introduced into Ashbya gossypii using this selection marker.
  • Another advantage is that one can make a selection in the transformation of Ashbya gossypii with the help of this gene without having to use foreign DNA (i.e. DNA that does not come from Ashbya gossypii).
  • any further genes Q can be introduced. This makes it possible to construct strains that carry individual genes or multiple genes in additional copies either on plasmids or in the genome.
  • the vector contains at least one gene of riboflavin synthesis as a further gene.
  • Genes of riboflavin synthesis are understood to mean genes which are involved in the synthesis in the entire metabolism of riboflavin producers such as Ashbya.
  • Ashbya gossypii ATCC10895 genomic DNA was prepared by the method described in WO97 / 03208.
  • the genomic DNA was prepared by the method described in WO97 / 03208.
  • Genbank based on this DNA, was according to the in Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press or in F.M. et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons described method in pRS314 and in YEp351 (Hill et al., Yeast, Vol. 2, 1986: 163-167).
  • WO97 / 03208 other plasmids such as plasmids of the pRS series (Sikorski and Hieter, Genetics, 1989: 19-27) or cosmids, such as e.g. SuperCosl (Stratagene, La Jolla, USA) suitable for the production of the gene bank.
  • the complete URA3 gene from Saccharomyces cerevisiae was used as a probe (1.1 kb in length) in order to screen a genomic cosmid gene bank from Ashbya gossypii (see Example 1).
  • the experiment was carried out as described in Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press or Ausubel, F.M. et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, using hybridization temperatures of 52 ° C to 68 ° C. No clones could be identified in the gene bank that gave a positive signal with the URA3 gene from S. cerevisiae as a probe.
  • Aspergillus niger (Acc. Number: P07817) Aspergillus nidulans (Acc. Number: P10652)
  • Schizosaccharomyces pombe (Acc. Number: P14965) Penicillium chrysogenum (Acc. Number: P09463) Kluyveromyces lactis (Acc. Number: P07922) Candida albicans (Acc. Number: P13649) Neurospora crassa (Acc. Number: P05035) Ustilago maydis (Acc. number: P15188) Saccharomyces cerevisiae (Acc. number: P03962) Drosophila melanogaster (Acc. number: Q01637) Mouse (Acc. number: P13439) Human (Acc. number: P11172) The numbers given in brackets come from the SWISS & PIR Translated Database Release 103.
  • oligonucleotides are understood to mean oligonucleotides in which mixtures of nucleotides have been incorporated at several positions during the synthesis.
  • R stands for G or A
  • Y stands for C or T
  • W stands for A or T
  • M stands for A or C
  • K stands for G or T
  • S stands for C or G
  • H stands for where A, C or T
  • V stands for A, C or G
  • B stands for C, G or T
  • PCR reactions 25 were carried out using genomic DNA from Ashbya gossypii as a template.
  • Example 6 As described in DE 44 20 785 AI (Example 1), a cDNA-45 bank from Ashbya gossypii was created.
  • Example 6 As described in DE 44 20 785 AI (Example 1), a cDNA-45 bank from Ashbya gossypii was created.
  • Single clones were selected from E. coli clones containing the Ashbya gossypii library described in Example 5.
  • the cells were cultured in suitable media (e.g. Luria-Broth with 100 mg / 1 ampicillin) according to customary methods and plasmid DNA was isolated from these cells.
  • Oligonucleotides that hybridize in the vector portion were used as primers for the sequencing of the cDNA clones. Fragments of the cloned cDNAs were recorded. The sequences were analyzed as described in Example 7.
  • Disruption of a gene is understood to mean the destruction of the functionality of a genomic copy of the gene either by (a) removing part of the gene sequence, or by (b) interrupting the gene by inserting a piece of foreign DNA into the gene or by (c) Replacement of part of the gene with foreign DNA.
  • the foreign DNA used is arbitrary, but preferably a gene which brings about resistance to any chemical. Any resistance genes can be used to disrupt genes.
  • the kanamycin resistance gene from Tn903 which is under the control of the Ashbya gossypii TEF promoter (see Yeast 10, pp. 1793-1808, 1994 or WO92 / 00379), was used.
  • the gene is flanked 5 'and 3' by several cleavage sites for restriction endonucleases, so that a cassette could be built up, which enables any construction of gene disruptions with customary methods of in vitro manipulation of DNA.
  • the internal 370 bp Pstl-Kpnl fragment from AgURA3 was replaced by a resistance cassette as outlined above.
  • the construct obtained was given the name ura3 :: G418.
  • the resulting plasmid can be multiplied after transformation in E. coli.
  • the Xhol-Sphl fragment of the construct ura3 :: G418 was subjected to agarose gel electrophoresis and subsequent elution of the DNA from the gel (see Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 615- 619, 1979) and used to transform Ashbya gossypii.
  • the fragment was transformed into Ashbya gossypii either via protoplast transformation (Gene 109, 99-105, 1991) or preferably by electroporation (BioRad Gene Pulser, conditions: cuvettes with a gap width of 0.4 mm, 1500V, 25 ⁇ F, 100 ⁇ ).
  • Transformed cells were selected on solid medium containing G418 (WO 97/03208).
  • G418-resistant clones were obtained using customary methods of PCR and Southern blot analysis (Sa brook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press or in FM et al.
  • the transformation of Ashbya gossypii with this deleted ura3 fragment was carried out as described in Example 10.
  • it is in principle also possible to use all other methods for inactivating the gene such as mutations via insertions, duplications, reversions, exchange of several nucleotides or point mutations. Point mutations are less preferred because they easily revert.
  • the isocitrate lyase gene described in WO 97/03208 was introduced with the aid of the plasmid pAGlOO, as described in WO 97/03208 (examples 4 and 5), into AgURA3 disruption mutants A. gossypii (see examples 9 and 10), the selection marker in A gossypii the AgURA3 gene was used instead of the described G418 resistance.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylase-Gen mit der Sequenz SEQ ID No. 1 oder seine Homologen, ein Genkonstrukt enthaltend dieses Gen oder seine Homologen und dessen Verwendung. Die Erfindung betrifft ausserdem Vektoren oder Organismen enthaltend ein Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylase-Gen mit der Sequenz SEQ ID No. 1 oder seine Homologen. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Uracil auxotrophen Mikroorganismen sowie ein Verfahren zum Einbringen von DNA in Uracil auxotrophe Mikroorganismen.

Description

Orotidin-5' -Phosphatdecarboxylase-Gen, Genkonstrukt enthaltend dieses Gen und seine Verwendung
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Orotidin-5' -Phosphatdecarboxylase-Gen mit der Sequenz SEQ ID No. 1 oder seine Homologen, ein Genkonstrukt enthaltend dieses Gen oder seine Homologen und dessen Verwendung. Die Erfindung betrifft außerdem Vektoren oder
Organismen enthaltend ein Orotidin-5' -Phosphatdecarboxylase-Gen mit der Sequenz SEQ ID No. 1 oder seine Homologen.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Uracil auxotrophen Mikroorganismen sowie ein Verfahren zum Einbringen von DNA in Uracil auxotrophe Mikroorganismen.
Vitamin B2 , auch Riboflavin genannt, ist für Mensch und Tier essentiell. Bei Vitamin B2-Mangel treten Entzündungen der Mund- und Rachenschleimhäute, Juckreiz und Entzündungen in den Haut- falten und ähnliche Hautschäden, Bindehautentzündungen, verminderte Sehschärfe und Trübung der Hornhaut auf. Bei Säuglingen und Kindern können Wachstumsstillstand und Gewichtsabnahme auftreten. Vitamin B2 hat daher wirtschaf liche Bedeutung insbesondere als Vitaminzusatz bei Vitaminmangel und als Futtermittelzusatz. Daneben wird es als Lebensmittelfarbstoff, beispielsweise in Mayonnaise, Eiscreme, Pudding etc. eingesetzt.
Die Herstellung von Vitamin B2 erfolgt entweder chemisch oder mikrobiell (siehe z.B. Kurth et al . , 1996, Riboflavin, in: Ullmann's Encyclopedia of industrial chemistry, VCH Weinheim). Bei den chemischen Herstellverfahren wird Riboflavin in der Regel in mehrstufigen Prozessen als reines Endprodukt gewonnen, wobei relativ kostspielige Ausgangsprodukte, wie z.B. D-Ribose, eingesetzt werden müssen. Eine Alternative zur chemischen Synthese von Riboflavin ist die Herstellung dieses Stoffes durch Mikroorganismen. Als Ausgangsstoffe dienen dabei nachwachsende Rohstoffe, wie Zucker oder pflanzliche Öle. Die Herstellung von Riboflavin durch Fermentation von Pilzen wie Eremothecium ashbyii oder Ashbya gossypii ist bekannt (The Merck Index, Windholz et al . , eds . Merck & Co., Seite 1183, 1983), aber auch Hefen, wie z.B. Candida, Pichia und Saccharomyces oder Bakterien, wie z.B. Bacillus, Clostridien oder Corynebakterien sind als Riboflavin- Produzenten beschrieben. In der DE 44 20 785 wurden sechs Riboflavin-Biosynthesegene aus Ashbya gossypii beschrieben, sowie Mikroorganismen, die mit diesen Genen transformiert wurden und die Verwendung solcher Mikroorganismen zur Riboflavinsynthese. 5 Bisher werden Gene über die Marker leu2 ( eucin-Auxotrophie) , thr4 (Threonin-Auxotrophie) oder kan (Kanamycin-Resistenz) in pilzliche Riboflavinproduzenten wie Ashbya gossypii eingebracht (WO 92/00379) . In Hefen wird als weiterer Marker metl5 (Methionin-Auxotrophie, Cost et al . , Yeast, Vol. 12, 1996: 939 -
10 941) beschrieben. Von Nachteil bei diesen Marker ist, daß entweder die Transformationseffizienz sehr gering ist und/oder aber zur Selektion ständig Antibiotika gegeben werden muß. In jedem Fall ist jedoch eine Gegenselektion auf den Verlust des Markers unter Erhalt der eingebrachten Gene im Mikroorganismen nicht oder
,c nur unter einem sehr hohen Aufwand möglich, so daß weitere Gene mit diesen Markern in der Regel nicht mehr in die Mikroorganismen eingebracht werden können. Es ist deshalb wünschenswert einen Selektionsmarker, der eine hohe Transformationseffizienz aufweist, leicht selektionierbar ist und eine Gegenselektion er- . möglicht, zu haben.
Das Orotidin-5' -Phosphatdecarboxylase-Gen (= URA3-Gen) aus
Saccharomyces cerevisiae ist einer der klassischen Marker, der die gewünschten Eigenschaf en besitzt und mit dessen Hilfe Gene in Mikroorganismen wie Hefen und Pilze transformiert werden 25 können. In einer Reihe von Arbeiten wird die Isolierung art- spezifischer URA3-Gene bzw. die Isolierung des entsprechenden
Gens aus Pilzen (= pyrG) sowie deren Sequenzen aus Pichia stipitis, Candida boidinii, Kluyveromyces marxianus, Yamadazyma
Oahmeri, Candida maltosa, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae,
30 . . .
Aspergillus nidulans, Mucor circmelloides, Phycomyces blakes- leeanus, Penicillium chrysogenum, und Aspergillus awamori beschrieben (Appl. Environ. Microbiol . , Vol. 60, No . 12, 1994 : 4245 - 4254, Nucl. Acids Res . , Vol. 18, No. 23, 1990: 7183, J. Ferment. Bioeng., Vol. 73, No 4, 1992: 255 - 260, Yeast,
35 Vol. 9, 1993: 677 - 681, Yeast, Vol. 10, 1994: 1601 - 1612, Curr. Genet., Vol. 23, 1993: 205 - 210, Nucl. Acids Res., Vol.16, No. 5, 1988: 2339, Curr. Genet., Vol. 16, 1989: 159 - 163, Gene, Vol. 61, 1987: 385 - 399, Gene, Vol. 116, 1992: 59- 67, Mol. Gen. Genet., Vol. 224, 1990: 269 - 278, Nucl. Acids Res., Vol. 16,
40 No. 16, 1988: 8177, Nucl. Acids Res., Vol. 18, No. 23, 1990: 7183 und Curr. Genet., Vol. 27, 1995: 536 - 540).
Arbeiten von Rose et al . (Gene, Vol. 29, 1984: 113 - 124) zeigten, daß das URA3-Gen aus Saccharomyces cerevisiae sogar eine 45 entsprechende Mutation (pyrF-Gen = URA3) in Prokaryonten wie Escherichia coli komplementieren kann und als Selektionsmarker sinnvoll verwendet werden kann. Bei genetischen Arbeiten zur Riboflavinsynthese von Ashbya gossypii (Vitamin B2-Synthese) zeigte sich jedoch, daß das URA3-Gen aus Saccharomyces cerevisiae oder das pyrF-Gen aus Escherichia coli keine Uracil auxotrophen Ashbya gossypii-Mutan- ten komplementieren können und deshalb diese Gene zur Klonierung von Genen in Ashbya gossypii nicht vejrwendet werden kann.
Es wurde deshalb versucht, da daß dem URA3-Gen oder pyrF-Gen entsprechende Gen aus Ashbya gossypii unbekannt ist, dies zu klonieren. Versuche zur Klonierung des Ashbya-Gens nach den in der Literatur beschriebenen Methoden über beispielsweise Hybridisierung mit URA3-Gen-Fragmenten oder über degenerierte Oligo- nukleotide auf Basis konservierter Aminosäuresequenzen verschiedener Orotidin-5 ' -phosphatdecarboxylasen und Screening einer "cDNA-library" mit diesen Oligonukleotiden und der PCR-Technik waren erfolglos (Bergkamp et al. Yeast, Vol. 9, 1993: 677 - 681, Piredda et al., Yeast, Vol. 10, 1994: 1601 - 1612, Benito et al., Gene, Vol. 116, 1992: 59 - 67 und Diaz-Minguez et al . , Mol. Gen. Genet., Vol. 224, 1990: 269 - 278).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, deshalb einen leicht selektionierbaren, mit hoher Ausbeute transformierbaren und einfach gegenselektionierbaren Marker zur Verfügung zu stellen, der das Einbringen von Genen in Mikroorganismen ermöglicht.
Diese Aufgabe wurde durch die erfindungsgemäße Orotidin-5'- Phosphatdecarboxylase mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder seine Homologen, die mindestens 80 % Homologie zur Sequenz SEQ ID NO: 1 aufweisen, gelöst.
Unter Homologe des erfindungsgemäßen Orotidin-5' -Phosphatde- carboxylase-Gens mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 sind beispielsweise Allelvarianten zu verstehen, die mindestens 80 % Homologie auf der abgeleiteten Aminosäureebene, bevorzugt mindestens 90 % Homologie, ganz besonders bevorzugt mindestens 95 % Homologie auf - weisen. Die von SEQ ID NO: 1 abgeleitete Aminosäuresequenz ist SEQ ID NO: 1 zu entnehmen. Allelvarianten umfassen insbesondere funktioneile Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz erhältlich sind, wobei die enzymatische Aktivität der abgeleiteten synthetisierten Proteine vorteilhafterweise für das Einbringen eines oder mehrerer Gene jedoch erhalten bleiben sollte. Sollen mit Hilfe der SEQ ID NO : 1 und seiner Homologen im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Uracil auxotrophen Mikroorganismen jedoch Mutanten im Orotidin-5' -Phosphat - decarboxylase-Gen hergestellt werden, so werden nicht funktio- nelle Gene das heißt Gene, die zu enzymatisch inaktiven Proteinen führen, verwendet. Dabei werden vorteilhafterweise Sequenzen ver- wendet, die Homologien zur SEQ ID NO: 1 oder seinen Homologen vorteilhaft am 3 ' - und 5 '-Ende aufweisen.
Weiterhin sind unter Homologe der SEQ ID NO: 1 beispielsweise pilzliche oder pflanzliche Homologe, verkürzte Sequenzen, Einzel - strang-DNA oder RNA der codierenden und nichtcodierenden DNA- Sequenz zu verstehen. Homologe der SEQ ID NO: 1 besitzen auf DNA-Ebene eine Homologie von mindestens 60 %, bevorzugt von mindestens 70 %, besonders bevorzugt von mindestens 80 %, ganz besonders bevorzugt von mindestens 90 % über den gesamten in SEQ ID NO: 1 angegebenen DNA-Bereich.
Außerdem sind unter Homologe der SEQ ID NO: 1 Derivate wie beispielsweise Promotorvarianten zu verstehen. Die Promotoren, die den angegebenen Nukleotidsequenzen vorgeschalten sind, können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion (en) und/oder Deletion(en) verändert sein, ohne daß aber die Funktionalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des weiteren können die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden.
Unter Derivaten sind auch Varianten zu verstehen, deren Nukleotidsequenz im Bereich von -1 bis -200 vor dem Startkodon so verändert wurden, daß die Genexpression und/oder die Proteinexpression verändert bevorzugt erhöht wird.
Bevorzugt läßt sich die SEQ ID NO: 1 oder seine Homologen aus Mikroorganismen der Familie Metschnikowiaceae, besonders bevor- zugt aus Mikroorganismen der Gattungen Eremothecium, Ashbya oder Nematospora, ganz besonders bevorzugt aus Mikroorganismen der Gattung und Art Eremothecium ashbyii oder Ashbya gossypii isolieren.
Unter dem erfindungsgemäßen Genkonstrukt sind die URA3-Gen- sequenzen SEQ ID No. 1 und seine Homologen zu verstehen, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Erhöhung der Genexpression funktioneil verknüpft wurden. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nukleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so daß die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Sequenz SEQ ID No. 1 oder seine Homologen inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Stattdessen wurde die natürliche Regulationssequenz so mutiert, daß keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression 5 gesteigert wird. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktioneil verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nucleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3' -Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequen- 0 zen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die URA3-Gene können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein, wobei das oder die Gene auch inaktiviert sein können. Mit Hilfe dieses oder dieser inaktivierten Gene können im erfindungsgemäßen Verfahren Uracil-auxotrophe Mutanten erzeugt werden. Zum Einbringen weiterer Gene in einen Mikroorganismus sind im Genkonstrukt vorteilhafterweise weitere Gene enthalten. Diese Gene können innerhalb eines U.RA3-Genes liegen, wobei vorteilhaft eine intakte Kopie des URA3-Gens und/ oder ein anderes selektierbares Gen wie leu2, thr4 oder kan im n Konstrukt enthalten sein sollte, oder sie können außerhalb des URA3-Genes liegen. Auch im Falle eines intakten URA3-Gens im Genkonstrukt können noch weitere Marker wie die oben genannten gegebenenfalls zur Selektion im Genkonstrukt enthalten sein.
Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Verfahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacl«--. T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-PR- oder im λ-PL-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden.
Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in 0 den gram-positiven Promotoren amy und SP02, in den Hefe- oder
Pilzpromotoren ADC1, MFα , AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH oder in den Pflanzenpromotoren Ca.MV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos oder im Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor enthalten. In diesem Zusammenhang sind auch die Promotoren der 5 pyruvatdecarboxylase und der Methanoloxidase aus beispielsweise Hansenula vorteilhaft. Es können auch künstliche Promotoren für die Regulation verwendet werden.
Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren 0 Regulationssequenzen wie die oben genannten für das erfindungs- gemäße Verfahren verwendet werden. Darüberhinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.
Im Genkonstrukt können wie oben beschrieben noch weitere Gene, 5 die in die Mikroorganismen eingebracht werden sollen, enthalten sein. Diese Gene können innerhalb oder außerhalb der Markergene wie ura3 , leu2, thr4 oder kan inseriert sein. Prinzipiell können alle Arten von Genen mit Hilfe des erfindungsgemäßen URA3-Gens mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder seiner Homologen in Mikroorganismen eingebracht werden. Vorteilhafterweise lassen sich regulatorische Gene wie Gene für Induktoren, Repressoren oder Enzyme, die über ihre enzymatische .Aktivität in die Regulation eingreifen, oder ein oder mehrere oder alle Gene eines Bio- syntheseweges wie die Gene der Riboflavinbiosynthese wie beispielsweise die rib-Gene oder Gene von Biosynthesewegen, die zu anderen Feinchemikalien, Sekundärmetaboliten oder Proteinen führen wie die Gene der Biotin-, Lysin-, Methionin-, Vitamin B12- oder Carotinoidbiosynthese, oder Gene, die zu Aroma-, Wuchs- oder Geruchsstoffen führen oder einzelne Gene für Enzyme wie Proteasen oder Lipasen über die URA3-Sequenz in Wirtsorganismen einbringen und exprimieren. Diese Gene können heterologen oder homologen Ursprungs sein. Die eingebrachten Gene können einen eigenen
Promotor haben oder aber unter der Regulation des Promotors der Sequenz SEQ ID No. 1 oder seiner Homologen liegen.
Das Genkonstrukt wird zur Expression in den oben genannten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen Vektor wie beispielsweise einem Plasmid, einem Phagen oder sonstiger DNA inseriert, das eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4 , pHSl, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-Bl, λgtll oder pBdCI, in Streptomyces pIJlOl, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUBHO, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALSl, pIL2 oder pBB116, in Hefen 2μM, pAG-1, YEp6 , YEpl3 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23, pGHlac+, pBIN19 , pAK2004 oder pDH51. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, .Amsterdam-New York-Oxford, 1985 , ISBN 0 444 904018) entnommen werden.
vorteilhafterweise enthält das Genkonstrukt zur Expression der weiteren enthaltenen Gene zusätzlich noch 3' und/oder 5' Terminale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtsorganismus und Gen oder Gene für eine optimale Expression ausgewählt werden.
Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, daß das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder daß es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird. Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhaf erweise auf der Trans - 5 kriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
0 In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann das erfindungsgemäße Genkonstrukt auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem 5 linearisierten Plasmid oder nur aus dem Genkonstrukt als Vektor bestehen.
Als Wirtsorganismen für das erfindungsgemäße Genkonstrukt kommen prinzipiell alle prokaryontischen oder eukaryontisehen Organismen 0 in Frage. Vorteilhafterweise werden als Wirtsorganismen Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze, Hefen, tierische oder pflanzliche Zellen verwendet. Bevorzugt werden Pilze oder Hefen, besonders bevorzugt Pilze, ganz besonders bevorzugt Pilze der Familie Metschnikowiaceae wie Eremothecium, Ashbya oder Nematospora ver- 5 wendet.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung von Uracil auxotrophen Mikroorganismen. Zur Erzeugung von Uracil auxotrophen Mutanten wird das Orotidin-5' -Phosphatdecarboxylase- Q Gen mit der SEQ ID NO: 1 oder seine Homologen beispielsweise durch Mutagenese so verändert, daß das durch das Gen codierte Protein inaktiviert wird. Dieses inaktivierte Gen wird anschließend in einen Mikroorganismus beipielsweise über Transformation oder Elektroporation eingeführt. Durch homologe Rekombination in 5 den Mikroorganismen entstehen schließlich auxotrophe Mutanten, die über ihre Resistenz gegen 5-Fluororotsäure gescreent werden können (siehe Boeke et al . , Mol. Gen. Genet., Vol. 197, 1984: 345 - 346) .
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Einbringen 0 von DNA in Organismen, dadurch gekennzeichnet, daß man in einen Orotidin-5' -Phosphatdecarboxylase-Gen (= URA3-Gen) defizienten Organismus bevorzugt einen Mikroorganismus einen Vektor einbringt, der ein intaktes URA3-Gen mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder seine Homologen vorteilhafterweise zusammen mit weiterer DNA 5 vorzugsweise mit mindestens einem weiteren Gen enthält, und diesen Organismus auf oder in einem Kulturmedium kultiviert, das kein Uracil enthält. In diesem Medium können nur diese Organismen wachsen, die den Vektor erhalten haben. Bevorzugt wird in diesem Verfahren als Vektor eine lineare DNA verwendet. Als Mikroorganismen werden in diesem Verfahren bevorzugt Pilze besonders der Familie Metschnikowiaceae wie Eremothecium, Ashbya oder 5 Nematosprora, besonders bevorzugt Mikroorganismen der Gattung Ashbya veirwendet.
Als Vektor kann auch ein beliebiges Plasmid (insbesondere aber ein Plasmid, das den Replikationsursprung des 2m Plasmids aus S. 0 cerevisiae trägt) verwendet werden, das in der Zelle autonom repliziert, aber auch wie oben beschrieben ein lineares DNA-Fragment, das in das Genom des Wirtes integriert. Diese Integration kann über hetero- oder homologe Rekombination erfolgen. Bevorzugt wie erwähnt jedoch über homologe Rekombination (Steiner et al . , 5 Genetics, Vol. 140, 1995: 973 - 987).
Das erfindungsgemäße URA3-Gen mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder seine Homologen lassen sich vorteilhaft als Selektionsmarker im erfindungsgemäßen Verfahren verwenden. Bevorzugt lassen sich Gene 0 unter Verwendung dieses Selektionsmarkers Gene in Ashbya gossypii einbringen.
Von Vorteil ist weiterhin, daß man bei der Transformation von Ashbya gossypii mit Hilfe dieses Genes selektionieren kann, ohne Fremd-DNA (d.h. DNA, die nicht aus Ashbya gossypii stammt) verwenden zu müssen.
Bei der Transformation von Ashbya gossypii mit dem Gen mit der SEQ ID NO: 1 oder seiner Homologen können beliebige weitere Gene Q miteingebracht werden. Dadurch ist es möglich, Stämme zu konstruieren, die einzelne Gene oder mehrere Gene in weiteren Kopien entweder auf Plasmiden oder im Genom tragen.
Des weiteren ist es möglich, Ashbya-Stämme zu konstruieren, bei 5 denen chromosomale Kopien von Genen durch die Insertion des URA3 Gens mit der SEQ ID NO: 1 oder seiner Homologen zerstört wurden.
Ein besonderer Vorteil des AgURA3 Gens ist die Möglichkeit, den Marker mehrfach hintereinander im gleichen Stamm zu ve.rwenden. Q Wenn man 5' und 3' des Gens identische Nukleotidsequenzen in gleicher Orientierung (sogenannte direct repeats) setzt, kann man den AgURA3 Marker bei Bedarf durch Homologe Rekombination und Selektion auf Uracil- und FOA-haltigen Medium wieder entfernen und dann in einer weiteren Runde zusätzliche DNA mit Hilfe dieses Gens einbringen. Ein weiterer Vorteil ist die deutlich höhere Transformationseffizienz im Vergleich zu den Markern thr, leu oder kan. Im erfindungsgemäßen Verfahren enthält der Vektor als weiteres Gen mindestens ein Gen der Riboflavinsynthese. Unter Gene der Riboflavinsynthese sind solche Gene zu verstehen, die an der Synthese im gesamten Stoffwechsel von Riboflavinproduzenten wie Ashbya beteiligt sind.
Beispiele:
Beispiel 1:
Herstellung einer genomischen Genbank aus Ashbya gossypii ATCC10895
Genomische DNA aus Ashbya gossypii ATCC10895 wurde nach dem in WO97/03208 beschriebenen Verfahren präpariert. Die genomische
Genbank, ausgehend von dieser DNA, wurde nach der in Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press bzw. in F.M. et al. (1994) Current proto- cols in molecular biology, John Wiley and Sons beschriebenen Me- thode in pRS314 und in YEp351 (Hill et al., Yeast, Vol. 2, 1986: 163 - 167) erstellt. Wie beispielsweise WO97/03208 zu entnehmen ist, sind auch andere Plasmide wie Plasmide der pRS-Reihe (Sikorski und Hieter, Genetics, 1989: 19-27) oder Cosmiden, wie z.B. SuperCosl (Stratagene, La Jolla, USA) für die Herstellung der Genbank geeignet .
Beispiel 2:
Es wurde zunächst versucht das Gen für die Orotidin-5' -Phosphat - decarboxylase (= OMP-DC) aus Ashbya gossypii über eine funktioneile Komplementation einer entsprechenden URA3 auxotrophen Mutante von Saccharomyces cerevisiae zu klonieren.
Dazu wurde eine Genbank von genomischer Ashbya gossypii DNA in pRS314 erstellt (wie in Beispiel 1 beschrieben) . Mit dieser DNA wurde der S. cerevisiae Stamm .MW3317-21A (Genotyp: M.AT α, trpl, adeδΔKpn, ura3-52, hom3-10, metl3, met4, ade2 , his3-Kpn, siehe z.B. Kramer et al., Mol. Cell. Biol . 9, 1989: 4432-4440), nach der Lithiumacetat-Methode (siehe z.B. Kramer et al . , Mol. Cell. Biol. 9, 1989: 4432-4440) transformiert. Es wurde kein Klon erhalten, bei dem die genomische Deletion des ura3 Gens des S. cerevisiae- Stammes durch ein Genfragment aus Ashbya komplementiert wurde. Auch der Versuch über eine funktionelle Komplementation in einer pyrF-Mutante von E. coli das URA3 Gen von Ashbya gossypii zu klonieren schlug fehl.
Beispiel 3:
Auch ein Versuch, das OMP-DC-Gen aus Ashbya gossypii über Hybridisierung mit einem Fragment des entsprechenden Gens aus Saccharomyces cerevisiae zu klonieren, gelang nicht.
Dazu wurde das komplette URA3-Gen aus Saccharomyces cerevisiae (Genbank entry yscodcd) als Sonde (1,1 kb Länge) verwendet, um eine genomische Cosmid-Genbank von Ashbya gossypii (siehe Beispiel 1) zu screenen. Der Versuch wurde wie in Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F.M. et al . (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons beschrieben durchgeführt, wobei Hybridisierungstemperaturen von 52°C bis 68°C verwendet wurden. Es konnten keine Klone in der Genbank identi- fiziert werden, die ein positives Signal mit dem URA3-Gen aus S. cerevisiae als Sonde lieferten.
Beispiel 4 :
Im nächsten Ansatz wurde die Klonierung des Gens für OMP-DC aus Ashbya gossypii über Amplifikation von Genfragmenten mit Hilfe von degenerierten Oligonukleotiden und der PCR-Technik versucht.
Für diesen Versuch wurden die bekannten .Aminosäuresequenzen der verschiedenen Orotidin-5' -Phosphatdecarboxylasen aus den folgenden Organismen miteinander verglichen und Bereiche ausgewählt, die in allen Enzymen höchstmöglich konserviert sind:
Aspergillus niger (Acc. number: P07817) Aspergillus nidulans (Acc. number: P10652)
Schizosaccharomyces pombe (Acc. number: P14965) Penicillium chrysogenum (Acc. number: P09463) Kluyveromyces lactis (Acc. number: P07922) Candida albicans (Acc. number: P13649) Neurospora crassa (Acc. number: P05035) Ustilago maydis (Acc. number: P15188) Saccharomyces cerevisiae (Acc. number: P03962) Drosophila melanogaster (Acc. number: Q01637) Mouse (Acc. number: P13439) Human (Acc. number: P11172) Die in den Klammer angegebenen Nummern stammen aus der SWISS&PIR- Translated Datenbank Release 103.
Auf Basis dieser Informationen wurden degenerierte Olgonukleotide 5 synthetisiert.
Unter degenerierten Oligonukleotiden versteht man Oligo- nukleotide, bei denen während der Synthese an mehreren Positionen Mischungen von Nukleotiden eingebaut wurden.
10
R steht dabei für G oder A, Y steht dabei für C oder T, W steht dabei für A oder T, M steht dabei für A oder C, K steht dabei für G oder T, S steht dabei für C oder G, H steht dabei für A, C oder T, V steht dabei für A, C oder G, B steht dabei für C, G oder T,
15 D steht dabei für A, G oder T, N steht dabei für G,A,T oder C.
Es wurden folgende Oligonukleotide verwendet:
URA3-A: 5 ' -YTNGGNCCNTAYATHTGY-3 '
20 URA3-B: 5 ' -TAYTGYTGNCCNARYTTRTCNCC-3«
URA3-C : 5 ' -TTYYTNATHTTYGARGAYMGNAARTT-3 '
URA3-D : 5 ' -GCNARNARNARNARNCCNC-3 '
Mit diesen Oligonukleotiden als Primer wurden PCR Reaktionen 25 durchgeführt mit genomischer DNA von Ashbya gossypii als Matrize verwendet .
Es wurden folgende Primerkombinationen verwendet:
30 URA3-A + URA3-B; URA3-A + URA3-D; URA3C + URA3-B and URA3-C + URA3-D.
Folgende Hybridisierungstemperaturen wurden verwendet:
35 52 °C, 48 °C, 44 °C, 40 °C und 37 °C .
Die aus den PCR-Reaktionen entstandenen Produkte wurden nach üblichen Methoden in den Vektor pGEMT (Promega) kloniert und sequenziert. Es konnten keine Fragmente amplifiziert werden, die 40 Homologie zu bekannten oben genannten OMP-DC Genen zeigten.
Beispiel 5:
Wie in DE 44 20 785 AI (Beispiel 1) beschrieben wurden eine cDNA- 45 Bank von Ashbya gossypii erstellt. Beispiel 6 :
Analyse von Nukleinsäuresequenzen der Genbank
Von E.coli Klonen, die die in Beispiel 5 beschriebene Genbank von Ashbya gossypii enthalten, wurden Einzelklone selektiert. Nach üblichen Methoden wurden die Zellen in geeigneten Medien (z.B. Luria-Broth mit 100 mg/1 Ampicillin) kultiviert und Plasmid-DNA aus diesen Zellen isoliert.
Es wurde Oligonukleotide, die im Vektoranteil hybridisieren als Primer für die Sequenzierung der cDNA Klone verwendet. Dabei wurden Fragmente der klonierten cDNAs erfasst. Die Sequenzen wurden wie in Beispiel 7 beschrieben analysiert.
Beispiel 7:
Es wurde eine Computer-unterstützte .Analyse der gefundenen Nukleotidsequenzen über Sequenzvergleiche neu identifizierter Sequenzen mit bestehenden DNA und Proteindatenbanken mit Hilfe folgender Algorithmen z.B. mit BLAST Algorithmen (Altschul et al . (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410), dem Clustal Algoritlmus mit Hilfe der PAM250 Gewichtungstabelle oder dem Wilbur-Lipman DNA alignment Algorithmus (wie z.B. in dem Programmpaket MegAlign 3.06 der Firma DNAstar implementiert) durchgeführt. Auf diesem Weg konnten Ähnlichkeiten der neu entdeckten Sequenzen mit bereits bekannten Sequenzen entdeckt und neue Gene oder Teil- sequenzen von Genen in ihrer Funktion beschrieben werden.
Beispiel 8:
Identifikation von E. coli Klonen, die das Gen für OMP-DC aus Ashbya gossypii (AgURA3) tragen.
Nach Untersuchung einer Vielzahl von Klonen wie in Bsp. 6 und 7 (> 100 Klone) beschrieben wurde eine Sequenz gefunden, die Ähnlichkeiten zu den bekannten OMP-DC Genen zeigte. Mit dieser homologen Sonde wurde dann die genomische Ashbya Genbank (siehe Beispiel 1) nochmals gescreent und es konnten Klone bzw. Cosmide identifiziert werden, die ein spezifisches positives Signal ergaben und ein gemeinsames 1,3 kb XhoI-EcoRI-Fragment trugen. Die Sequenzierung der Klone ergab die Sequenz wie in SEQ ID NO: 1 beschrieben. Die Sequenz zeigt Ähnlichkeiten zu bekannten URA3 Genen und codiert für ein ca. 29246 Dalton großes Protein. Beispiel 9 :
Disruption der chromosomalen Kopie des AgURA3 Gens mit Antibiotika-Resistenzgenen
Unter Disruption eines Genes versteht man die Zerstörung der Funktionalität einer genomischen Kopie des Gens entweder durch (a) Entfernen eines Teiles der Gensequenz, oder durch (b) der Unterbrechung des Gens durch Einfügung eines Stückes Fremd-DNA in das Gen oder durch (c) Ersatz eines Teil des Gens durch Fremd- DNA. Die verwendete Fremd-DNA ist beliebig, bevorzugt aber ein Gen, das Resistenz gegen eine beliebige Chemikalie bewirkt. Zur Disruption von Genen können beliebige Resistenzgene verwendet werden.
Zur Disruption des AgURA3-Gens von Ashbya gossypii ATCC10895 wurde das Kanamycin-Resistenzgen aus Tn903, das unter Kontrolle des TEF-Promotors von Ashbya gossypii (siehe Yeast 10, S. 1793-1808, 1994 oder WO92/00379) verwendet. Das Gen ist 5' und 3' von mehreren Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen flankiert, so daß eine Kassette aufgebaut werden konnte, die beliebige Konstruktionen von Gen-Disruptionen mit üblichen Methoden der in vi tro Manipulation von DNA ermöglichen.
Das interne 370 bp Pstl-Kpnl Fragment von AgURA3 (Position 442 - 892 in der Sequenz SEQ ID NO: 1) wurde durch eine wie oben skizzierte Resistenzkassette ersetzt. Das erhaltene Konstrukt erhielt den Namen ura3::G418. Das erhaltene Plasmid läßt sich nach Transformation in E.coli vermehren. Das Xhol-Sphl-Fragment des Kon- struktes ura3::G418 (siehe Figur 1) wurde über Agarosegel-Elek- trophorese und nachfolgender Elution der DNA aus dem Gel (siehe Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76., 615-619, 1979) aufgereinigt und zur Transformation von Ashbya gossypii eingesetzt. Figur 1 zeigt in Abbildung A eine Restriktionskarte des kodierenden Bereichs des AgURA3-Gens und der 5'- und 3 ' -nicht translatierten Regionen (= 5'-UTR und 3'-UTR) . Abbildung B zeigt die Situation nach Insertion der oben beschriebenen Kanamycin-Resistenzkassette (= TEF-kanR) .
Das Fragment wurde entweder über Protoplastentransformation (Gene 109, 99-105, 1991) oder aber bevorzugt durch Elektroporation (BioRad Gene Pulser, Bedingungen: Küvetten mit Spaltbreite 0,4 mm, 1500V, 25μF, 100Ω) in Ashbya gossypii transformiert. Die Selektion transformierter Zellen erfolgte auf G418-haltigem Fest- medium (WO 97/03208) . Erhaltene G418-resistente Klone wurden mit üblichen Methoden der PCR und Southern-Blot Analyse (Sa brook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press bzw. in F.M. et al . (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons) daraufhin untersucht, ob die genomische Kopie des AgURA3 Gens tatsächlich zerstört wurde. Klone, deren AgURA3 Gen zerstört wurde, sind Uracil- auxotroph und resistent gegen 1 mg/ml 5' -Fluoro-Orotsäure (FOA).
Beispiel 10:
Disruption der chromosomalen Kopie des AgURA3 Gens ohne Verwendung von Antibiotika-Resistenzgenen
Ein besonderer Vorteil der Verwendung von URA3 Genen ist die
Möglichkeit sowohl auf An- als auch auf Abwesenheit des Genes zu selektionieren. Man kann mit FOA Mikroorganismen screenen, die ein funktioneil inaktiviertes URA3 Gen besitzen, und mit Hilfe der Selektion auf Uracil- Prototrophie auf ein funktioneil aktives URA3 Gen selektionieren.
Zur Disruption der genomischen Kopie des URA3 Gens wurde einfachheitshalber ein internes Fragment (= Pstl-Fragment) des URA3 Gens aus dem kodierenden Bereich des Gens mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 deletiert (Position 442 bis 520 in der Sequenz SEQ ID NO: 1) . Die Transformation von Ashbya gossypii mit diesem deletierten ura3-Fragment wurde wie in Beispiel 10 beschrieben durchgeführt. Anstelle der Deletion von Teilbereichen des Gens können prinzipiell auch alle anderen Methoden zur Inaktivierung des Gens wie Mutationen über Insertionen, Duplikationen, Reversionen, Austausch mehrerer Nukleotide oder Punktmutationen verwendet werden. Punktmutationen sind weniger bevorzugt, da sie leicht revertieren.
Die Selektion der Transformanten wurde durch Resistenz gegen FOA durchgeführt. Im Gegensatz zu Wild-Typ-Klonen sind Klone, die eine Disruption des AgURA3 Gens tragen sind resistent gegen 1 mg/ml FOA. Beispiel 11 :
Verwendung des AgURA3 Gens zum Einbringen weiterer DNA in A. gossypii .
Das in WO 97/03208 beschriebene Isocitratlyasegen wurde mit Hilfe des Plasmids pAGlOO, wie in WO 97/03208 (Beispiel 4 und 5) beschrieben, in AgURA3-Disruptionsmutanten A. gossypii (siehe Beispiel 9 und 10) eingebracht, wobei als Selektionsmarker in A. gossypii anstelle der beschriebenen G418-Resistenz das AgURA3 Gen verwendet wurde.

Claims

Patentansprüche
1. Orotidin-5' -Phosphatdecarboxylase-Gen mit der Sequenz SEQ ID 5 NO: 1 oder seine Homologen, die mindestens 80 % Homologie zur
Sequenz SEQ ID NO: 1 aufweisen.
2. Homologe nach .Anspruch 1, deren durch sie codierten Genprodukte funktionell sind.
10
3. Orotidin-5' -Phosphatdecarboxylase-Gen mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder seine Homologen, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen oder seine Homologen aus Ashbya gossypii stammt.
15 4. .Aminosäuresequenzen codiert durch ein Gen oder seine Homologe gemäß den Ansprüchen 1 bis 3.
5. Aminosäuresequenzen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um enzymatisch aktive Proteine handelt.
20
6. Genkonstrukt enthaltend ein Orotidin-5'- Phosphatdecarboxylase-Gen mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder seine Homologen nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei das Gen oder seine Homologen funktioneil mit einem oder mehreren Regulations-
25 Signalen verknüpft ist.
7. Genkonstrukt nach Anspruch 6, deren Genexpression durch die Regulationssignale erhöht wird.
30 8. Vector enthaltend ein Genkonstrukt gemäß Anspruch 6 oder 7.
9. Mikroorganismus enthaltend mindestens ein Genkonstrukt gemäß Anspruch 6 oder 7.
35 10. Verfahren zur Herstellung von Uracil auxotrophen Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Orotidin-5'- Phosphatdecarboxylase-Gen mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder seine Homologen gemäß den .Ansprüchen 1 bis 3 so verändert, daß das durch das Gen codierte Protein inaktiv ist, und daß
40 man dieses veränderte Gen in die Mikroorganismen einführt und über homologe Rekombination in das Genom der Organismen integriert und anschließend diese Mikroorganismen auf 5-Fluororotsäureresistenz selektioniert .
45 11. Verfahren zum Einbringen von DNA in Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß man in einen Orotidin-5' -Phosphatdecarboxylase-Gen defizienten Mikroorganismus einen Vector einbringt, der ein intaktes Orotidin-5 ' -Phosphatdecarboxylase-Gen mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder seine Homologen gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 zusammen mit mindestens einem weiteren Gen enthält, und diesen Mikroorganismus auf oder in 5 einem Kulturmedium ohne Uracil anzieht.
12. Verfahren nach .Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß als Vector eine lineare DNA verwendet wird.
10 13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß als Orotidin-5' -Phosphatdecarboxylase-Gen defizienter Mikroorganismus ein Ashbya gossypii Stamm verwendet wird.
14. Verfahren nach Anspruch 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, 15 daß als weiteres Gen mindestens ein Gen der Riboflavin- synthese in den Mikroorganismus eingebracht wird.
15. Verwendung einer Gen-Sequenz oder seiner Homologen gemäß .Zuspruch 1 bis 3 als Selektionsmarker.
20
16. Verwendung nach Anspruch 15 in Ashbya gossypii.
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30
35
40
45
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