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WO2003048367A1 - Genetische stammoptimisierung zur verbesserten herstellung von riboflavin - Google Patents

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WO2003048367A1
WO2003048367A1 PCT/EP2002/013660 EP0213660W WO03048367A1 WO 2003048367 A1 WO2003048367 A1 WO 2003048367A1 EP 0213660 W EP0213660 W EP 0213660W WO 03048367 A1 WO03048367 A1 WO 03048367A1
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WO
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gene
riboflavin
genes
rib
increased
Prior art date
Application number
PCT/EP2002/013660
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French (fr)
Inventor
Henning ALTHÖFER
Jose L. Revuelta Doval
Original Assignee
Basf Aktiengesellschaft
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Filing date
Publication date
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Priority to AU2002358083A priority patent/AU2002358083A1/en
Priority to US10/497,526 priority patent/US20050239161A1/en
Priority to JP2003549544A priority patent/JP2005511053A/ja
Publication of WO2003048367A1 publication Critical patent/WO2003048367A1/de

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P25/00—Preparation of compounds containing alloxazine or isoalloxazine nucleus, e.g. riboflavin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a genetic process for the production of riboflavin.
  • the riboflavin production in these organisms is increased by the special selection of riboflavin biosynthesis genes or their combination in organisms of the genus Ashbya and their expression.
  • Vitamin B2 also called riboflavin, is produced by all plants and a variety of microorganisms. It is essential for humans and animals as they are unable to synthesize it. Riboflavin plays an important role in metabolism. For example, it is involved in the utilization of carbohydrates. With vitamin B2 deficiency, inflammation of the mucous membranes of the mouth and throat, itching and inflammation in the skin folds and similar skin damage, conjunctivitis, decreased visual acuity and clouding of the cornea occur. Growth and weight loss may occur in infants and children. Vitamin B2 is therefore of great economic importance, for example as a vitamin preparation for vitamin deficiency and as a feed additive. Various foods are added. It is also used as a food coloring, for example in mayonnaise, ice cream, pudding etc. used.
  • Vitamin B2 is produced either chemically or microbially (see e.g. Kurth et al., 1996, Riboflavin, in: Ulimann's Encyclopedia of industrial chemistry, VCH Weinheim). In the chemical production process, riboflavin is usually obtained as a pure end product in multi-stage processes, with relatively expensive starting products, e.g. D-Ribose, must be used.
  • riboflavin is the fermentative production of vitamin B2 by microorganisms. Renewable raw materials such as sugar or vegetable oils are used as starting materials.
  • the production of riboflavin by fermentation of fungi such as Eremothecium ashbyii or Ashbya gossypii is known (The Merck Index, Windholz et al., Eds. Merck & Co., page 1183, 1983), but also yeasts, e.g. Candida, Pichia and Saccharomyces or bacteria, e.g.
  • Bacillus, clostridia or corynebacteria are described as riboflavin producers.
  • EP-A-0 405 370 and EP-A-0 821 063 describes the production of riboflavin with recombinant bacterial strains, the strains being obtained by transformation with riboflavin biosynthetic genes from Bacillus subtilis.
  • WO 95/26406 and WO 94/11515 describe the cloning of the genes specific for riboflavin biosynthesis from the eukaryotic organisms Ashbya gossypii or Saccharomyces cerevisiae, as well as microorganisms which have been transformed with these genes, and the use of such microorganisms for riboflavin synthesis described.
  • WO 99/61623 describes the use of the selection of riboflavin biosynthesis genes (rib3, rib4, rib5) for increasing the riboflavin formation.
  • GTP guanosine triphosphate
  • ribulose-5-phosphate guanosine triphosphate
  • GTP guanosine triphosphate
  • the GTP cyclohydrolase II ribl gene product converts GTP to 2,5-diamino-6- (ribosylamino) -4- (3H) -pyrimidinone-5-phosphate. This compound is then replaced by the 2,5-diamino-6- (ribosylamino) -4-
  • 2,5-diamino-ribitylamino-2,4- (1H, 3H) -pyrimidine-5-phosphate reduced and then by a specific deaminase (rib2 gene product) to 5-amino-6-ribitylamino-2,4- (1H, 3H) -pyrimidinedione-5-phosphate deaminated.
  • the phosphate is then split off by an unspecific phosphatase.
  • Ribulose-5-phosphate in addition to GTP the second starting product of the last enzymatic steps in riboflavin biosynthesis, is converted to 3,4-dihydroxy by the 3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate synthase (rib3 gene product).
  • 2-butanone-4-phosphate (DBP) implemented.
  • DBP and 5-amino-6-ribitylamino-2,4- (1H, 3H) -pyrimidinedione are the educts of the enzymatic synthesis of 6, 7-dimethyl-8-ribityllumazine. This reaction is catalyzed by the rib4 gene product (DMRL synthase). DMRL is then converted to riboflavin by ribofavin synthase (rib5 gene product) (Bacher et al. (1993), Bioorg. Chem. Front. Vol. 3, Springer Verlag).
  • the process for the increased production of riboflavin is advantageously carried out with an organism which is capable of synthesizing riboflavin, in which, for example, the combination of the following rib gene products (the numbers indicate the corresponding rib gene product) have increased activity : 1 + 2, 1 + 4, 1 + 7, 2 + 4, 2 + 7, 4 + 7.
  • Organisms in which the combination of the following rib gene products (the numbers indicate the corresponding rib gene product) have an increased activity are particularly preferred: 1 + 2 + 4, 1 + 2 + 7, 1 + 4 + 7, 2 + 4 + 7.
  • the increased activity of the rib gene products is evaluated in comparison to the Ashbya gossypii strain ATCC 10895, which serves as a reference organism.
  • the corresponding methods for measuring the activity of the rib gene products, i.e. the enzyme activities are familiar to the person skilled in the art and are described in the literature.
  • Another advantage of increasing vitamin B2 productivity is the combination of increasing the natural enzyme activity and introducing the above-mentioned gene combination to increase gene expression.
  • Rib gene products are not only the polypeptide sequences described in the sequence listing in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, but also those of these sequences by exchange, insertion or deletion of up to 5%, preferably up to 3%, particularly preferably up to 2% of the amino acid codons available polypeptide sequences. Such sequences occur, for example, as natural allele variations or can be treated by mutation of the parent strain, for example by mutagenic substances or electromagnetic radiation and subsequent selection for increased riboflavin productivity can be obtained.
  • the combination according to the invention of the rib genes ribl, rib2, rib4 and rib7 and / or the increase in activity of the genes and their gene products leads to a significantly increased riboflavin productivity.
  • the genes mentioned can in principle be introduced into the organisms used by all methods known to the person skilled in the art; they are advantageously introduced into the organisms or their cells via transformation, transfection, electroporation, with the so-called particle gun or via microinjection.
  • particle gun or via microinjection for microorganisms, the person skilled in the art can use the corresponding textbooks from Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, by F.M. Ausubel et al.
  • the REMI technique is based on the cotransformation of a linear DNA construct, which was cut at both ends with the same restriction endonuclease, together with the restriction endonuclease, which was used for this restriction of the DNA construct, into an organism.
  • the restriction endonuclease then cuts the genomic DNA of the organism into which the DNA construct was introduced together with the restriction enzyme. This leads to an activation of the cell's own repair mechanisms. These repair mechanisms repair caused by the endonuclease strand breaks' of the genomic DNA and build it at a certain frequency and the cotransformed DNA construct into the genome one. As a rule, the restriction sites at both ends of the DNA are preserved.
  • the REMI method can be used to integrate biosynthetic genes into the genome of the above-mentioned organisms and thus production processes for the production of metabolic products of primary or secondary metabolism, especially of biosynthetic pathways, for example of amino acids such as lysine, methionine, threonine or Tryptophan, vitamins such as vitamins A, B2, B6 B12, C, D, E, F, S-adenosylmethionine, biotin, pantothenic acid or folic acid,
  • Carotenoids such as ⁇ -carotene, lycopene, canthaxanthin, astaxanthin or zeaxanthin or proteins such as hydrolases such as lipases, esterases, amidases, nitrilases, proteases, mediators such as cytokines such as lymphokines such as MIF, MAF, TNF, interleukins such as interleukin 1, interferons such as interferons , tPA, hormones such as proteohormones, glycohormones, oligo or polypeptide hormones such as vassopressin, endorphins, endostatin, angiostatin, growth factors erythropoietin, transcription factors, integrins such as GPIIb / IIIa or oC v ßlll, receptors such as the various glutamate receptors are optimized can.
  • hydrolases such as lipases, esterases, amidases, nitrilases, proteases,
  • the nucleic acid fragments according to the invention or other of the genes mentioned above can be placed at transcriptionally active sites in the genome.
  • the nucleic acids are advantageously cloned together with at least one reporter gene into a DNA construct which is introduced into the genome.
  • This reporter gene should allow easy detection via a growth, fluorescence, chemo- or bioluminescence assay or via a photometric measurement.
  • Examples include reporter genes, antibiotic resistance genes, hydrolase genes, fluorescence protein genes, bioluminescence genes, glucosidase genes, peroxidase genes or biosynthesis genes such as the riboflaving genes, the luciferase gene, ⁇ -galactosidase gene, gfp gene, lipase gene, esterase gene, acoxidase gene, peroxidase gene, peroxidase gene, peroxidase gene Called adenyltransferase gene. These genes enable the transcription activity and thus the expression of the genes to be measured and quantified easily. This enables genome sites to be identified which show a productivity difference of up to a factor of 2 (see FIG. 1).
  • an additional reporter gene can be dispensed with.
  • genes are to be introduced into the organism, all of them can be introduced into the organism together with a reporter gene in a single vector or each individual gene with a reporter gene can be introduced into the organism, the different vectors being able to be introduced simultaneously or successively.
  • Gene fragments that code for the respective activities can also be used in REMI technology.
  • restriction enzymes are suitable for the method according to the invention for integrating biosynthesis genes into the genome of organisms. Restriction enzymes that only recognize 4 base pairs as a restriction site are less preferred because they cut too frequently in the genome or in the vector to be integrated; preference is given to enzymes that recognize 6, 7, 8 or more base pairs as an interface, such as BamHI, EcoRI, Bglll, SphI , Spei, Xbal, Xhol, Ncol, Sall, Clal, Kpnl, Hindl l, Sacl, PstI, Bpnl, Notl, Srfl or Sfil to name just a few of the possible enzymes.
  • the enzymes used no longer have interfaces in the DNA to be introduced, this increases the efficiency of the integration.
  • 5 to 500 U, preferably 10 to 250, particularly preferably 10 to 100 U of the enzymes are used in the REMI approach.
  • the enzymes are advantageously used in an aqueous solution, the substances for osmotic stabilization such as sugar such as sucrose, trehalose or glucose, polyols such as glycerol or polyethylene glycol, a buffer with an advantageous buffering in the range from pH 5 to 9, preferably 6 to 8, particularly preferably 7 to 8 such as Tris, MOPS, HEPES, MES or PIPES and / or substances for stabilizing the
  • Nucleic acids contain such as inorganic or organic salts of Mg, Cu, Co, Fe, Mn or Mo. If appropriate, other substances may also be present, such as EDTA, EDDA, DTT, ⁇ -mercaptoethanol or nuclease inhibitors. However, it is also possible to carry out REMI technology without these additives.
  • the process according to the invention is carried out in a temperature range from 5 to 80 ° C., preferably from 10 to 60 ° C., particularly preferably from 20 to 40 ° C. All known methods for destabilizing cell membranes, such as electroporation, fusion with loaded vesicles or destabilization via various alkali or alkaline earth metal salts such as lithium, rubidium or calcium salts, the lithium salts are preferred.
  • nucleic acids can be used for the reaction according to the invention directly or after purification.
  • the combination of the rib genes according to the invention can be introduced into plants by all methods known to the person skilled in the art.
  • transformation The transfer of foreign genes into the genome of a plant is called transformation.
  • the methods described for the transformation and regeneration of plants from plant tissues or plant cells for transient or stable transformation are used. Suitable methods are protoplast transformation by polyethylene glycol-induced DNA uptake, the use of a gene cannon, electroporation, the incubation of dry embryos in DNA-containing solution, microinjection and the gene transfer mediated by Agrobacterium.
  • the methods mentioned are described, for example, in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, published by S.D. Kung and R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 and in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol.
  • the construct to be expressed is preferably cloned into a vector which is suitable for transforming Agrobacterium turne faciens, for example pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711).
  • pBin19 Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711.
  • the transformation of plants with Agrobacterium tumefaciens is described, for example, by Höfgen and Willuser in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877.
  • Agrobacteria transformed with an expression vector according to the invention can also be used in a known manner to transform plants, in particular crop plants, such as cereals, corn, soybeans, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, flax, hemp, potato, tobacco, tomato, rapeseed, alfalfa , Lettuce and the various tree, nut and wine species and legumes can be used, e.g. by bathing wounded leaves or leaf pieces in an agrobacterial solution and then cultivating them in suitable media.
  • crop plants such as cereals, corn, soybeans, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, flax, hemp, potato, tobacco, tomato, rapeseed, alfalfa , Lettuce and the various tree, nut and wine species and legumes can be used, e.g. by bathing wounded leaves or leaf pieces in an agrobacterial solution and then cultivating them in suitable media.
  • the genetically modified plant cells can be regenerated using all methods known to the person skilled in the art. Appropriate methods can be found in the above-mentioned writings by SD Kung and R. Wu, Potrykus or Höfgen and Willmitzer. There are a number of ways to increase the enzyme activity of the rib gene products in the cell.
  • One possibility is to change the endogenous rib genes 1, 2, 4 and 7 in such a way that they code for enzymes with increased rib 1,2,4 or 7 activity compared to the starting enzymes.
  • Another increase in enzyme activity can be achieved, for example, by changing the catalytic centers to increase substrate conversion or by canceling the action of enzyme inhibitors, ie they have an increased specific activity or their activity is not inhibited.
  • an increased enzyme activity can also take place by increasing the enzyme synthesis in the cell, for example by switching off factors which repress the enzyme synthesis or by increasing the activity of factors or regulatory elements which promote increased synthesis, or preferably by introducing further ones gene copies. These measures increase the overall activity of the gene products in the cell without changing the specific activity.
  • a combination of these methods can also be used, ie increasing the specific activity and increasing the overall activity.
  • these changes can be introduced into the nucleic acid sequences of the genes, regulatory elements or their promoters by all methods known to the person skilled in the art.
  • the sequences can be subjected, for example, to a mutagenesis such as a "site directed mutagenesis" as described in D.M. Glover et al., DNA Cloning Vol. 1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), Chapter 6, page 193 ff.
  • modified nucleic acid sequences are then brought back into the organisms via vectors.
  • modified promoter regions can also be placed in front of the natural genes, so that the expression of the genes is increased and thus the activity is ultimately increased.
  • Sequences can also be introduced at the 3 'end which, for example, increase the stability of the mRNA and thereby enable increased translation. This also leads to higher enzyme activity.
  • rib genes 1, 2, 7 and 4 are preferably introduced into the cell together. These gene copies can be subject to natural regulation, a changed regulation, the natural regulatory regions being changed in such a way that they enable increased expression of the genes, or else regulatory sequences of foreign genes or even genes of other species can be used.
  • the gene expression of the rib genes 1, 2, 7 and 4 can advantageously be increased by increasing the ribl, 2, 7, 4 gene copy number and / or by strengthening regulatory factors which have a positive effect on the ribl, 2,7 and 4 gene expression become. So one can
  • Regulatory elements are strengthened preferably at the transcription level by using stronger transcription signals such as promoters and enhancers.
  • an increase in translation is also possible, for example, by improving the stability of the ribl, 2, 7 and 4 mRNA, or by increasing the reading efficiency of this mRNA on the ribosomes.
  • the rib genes 1, 2, 7 and 4, or homologous genes can be incorporated, for example, into a nucleic acid fragment or into a vector which preferably contains the regulatory gene sequences assigned to the respective rib genes or promoter activity acting in an analogous manner , In particular, those regulatory sequences are used which increase gene expression.
  • each of the genes described can be brought into a single vector and transformed into the respective production organism.
  • the rib gene sequences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 7 or to understand their functional equivalents which have been functionally linked with one or more regulation signals advantageously to increase gene expression.
  • these regulatory sequences are sequences to which inducers or repressors bind and thus regulate the expression of the nucleic acid.
  • the natural regulation of these sequences may still be present before the actual structural genes and may have been genetically modified so that the natural regulation has been switched off and the expression of the genes increased.
  • the gene construct can also have a simpler structure, which means that no additional regulatory signals have been placed in front of the sequences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 or SEQ ID No. 7 or their functional equivalents were inserted and the natural promoter with its regulation was not removed. Instead, the natural regulatory sequence was mutated in such a way that regulation no longer takes place and gene expression is increased. These modified promoters can also be placed in front of the natural genes to increase activity.
  • the gene construct may advantageously also comprise one or more "enhancer sequences" functionally linked to the promoter contain 0, which allow increased expression of the nucleic acid sequence. Additional advantageous sequences, such as further regulatory elements or terminators, can also be inserted at the 3 'end of the DNA sequences.
  • the rib genes can be contained in one or more copies in the gene construct. 5
  • Advantageous regulatory sequences for the method according to the invention are, for example, in promoters such as cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacl ⁇ - T7, T5, T3 -, gal-, trc-, ara-, SP6-, ⁇ -P R - or contain in the ⁇ -P L promoter, which are advantageously used in gram-negative bacteria.
  • promoters such as cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacl ⁇ - T7, T5, T3 -, gal-, trc-, ara-, SP6-, ⁇ -P R - or contain in the ⁇ -P L promoter, which are advantageously used in gram-negative bacteria.
  • Further advantageous regulatory sequences are, for example, in the gram-positive promoters ay and SP02, in the yeast or fungal promoters ADC1, MF ⁇ , AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH or in the plant promoters CaMV / 35S [Franck 5 et al., Cell 21 (1980) 285-294], PRPl [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, LEB4, nos or in the ubiquitin or phaseolin promoter.
  • promoters of pyruvate decarboxylase and methanol oxidase from, for example, Hansenula are also advantageous.
  • Further advantageous plant promoters are, for example, one that can be induced by benzenesulfonamide (EP 388186), one that can be induced by tetracycline (Gatz et al., (1992) Plant J. 2, 397-404), one that can be induced by abscisic acid (EP335528) or an ethanol or cyclohexanone inducible (W09321334) promoter.
  • Plant promoters which express in tissues or parts of plants are particularly advantageous
  • the promoter of the phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase from Glycine max can also be used advantageously.
  • the nucleic acid fragment may also contain further genes which are to be introduced into the organisms. These genes can be under separate regulation or under the same regulatory region as the rib genes. These genes are for example
  • plasmid 35 for example a plasmid, a phage or other DNA, which enables an optimal expression of the genes in the host.
  • Suitable plasmids are, for example, in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHSl, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III 113 -Bl, ⁇ gtll or pBdCI,
  • plasmids The plasmids mentioned represent a small selection of the possible plasmids. Further plasmids are well known to the person skilled in the art and can be found, for example, in the book cloning Vectors (Eds. Pouwels PH et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018). Suitable plant vectors are described in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Chap. 6/7, p.71-119.
  • the nucleic acid fragment for the expression of the other genes contained additionally contains 3 'and / or 5' terminal regulatory sequences for increasing expression, which are selected for optimal expression depending on the host organism selected and gene or genes.
  • regulatory sequences are intended to enable targeted expression of the genes and protein expression. Depending on the host organism, this can mean, for example, that the gene is only expressed and / or overexpressed after induction, or that it is immediately expressed and / or overexpressed.
  • the regulatory sequences or factors can preferably influence the gene expression of the introduced genes positively and thereby increase.
  • the regulatory elements can advantageously be strengthened at the transcription level by using strong transcription signals such as promoters and / or "enhancers".
  • an increase in translation is also possible, for example, by improving the stability of the mRNA.
  • the gene construct according to the invention can also advantageously be introduced into the microorganisms in the form of a linear DNA and integrated into the genome of the host organism via heterologous or homologous recombination.
  • This linear DNA can consist of a linearized plasmid or only of the nucleic acid fragment as a vector.
  • Any plasmid in particular a plasmid which carries the origin of replication of the 2 ° em plasmid from S. cerevisiae
  • the vector which replicates autonomously in the cell, but also a linear DNA fragment as described above, that integrates into the genome of the host.
  • This integration can take place via hetero- or homologous recombination.
  • preferred via homologous recombination Stepiner et al., Genetics, Vol. 140, 1995: 973-987.
  • the genes ribl, rib2, rib4 and rib7 can be present individually in the genome at different locations or on different vectors or together in the genome or on one vector.
  • the organisms used in the process according to the invention which contain the combination of the rib genes 1, 2, 7 and 4 or their functional equivalents show increased riboflavin production.
  • the organisms used for the production of riboflavin are grown in a medium which enables these organisms to grow.
  • This medium can be a synthetic or a natural medium.
  • media known to the person skilled in the art are used.
  • the media used contain a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts and possibly small amounts of vitamins and trace elements.
  • Advantageous carbon sources are, for example, sugars such as mono-, di- or polysaccharides such as glucose, fructose, mannose, xylose, galactose, ribose, sorbose, ribulose, lactose, maltose, sucrose, raffinose, starch or cellulose, complex sugar sources such as molasses, sugar phosphates such as fructose -1, 6-bis-phosphate, sugar alcohols such as mannitol, polyols such as glycerol, alcohols such as methanol or ethanol, carboxylic acids such as citric acid, lactic acid or acetic acid, fats such as soybean oil or rapeseed oil, amino acids such as an amino acid mixture, for example so-called casamino acids (Difco ) or individual amino acids such as glycine or aspartic acid or aminosugar, the latter can also be used simultaneously as a nitrogen source.
  • sugars such as mono-,
  • Advantageous nitrogen sources are organic or inorganic nitrogen compounds or materials that contain these compounds.
  • ammonium salts such as NH 4 CI or (NH 4 ) S ⁇ 4 , nitrates , urea, or complex nitrogen sources such as corn steep liquor, brewer's yeast autolysate, soybean meal, wheat gluten, yeast extract, meat extract, casein hydrolyzate, yeast or potato protein, which can often also serve as a nitrogen source at the same time.
  • inorganic salts are the salts of calcium, magnesium, sodium, cobalt, molybdenum, manganese, potassium, zinc, copper and iron.
  • the chlorine, sulfate and phosphate ions are particularly worth mentioning as the anion of these salts.
  • An important factor in increasing the productivity in the process according to the invention is the control of the Fe 2 + _ or Fe 3+ ion concentration in the production medium.
  • growth factors are added to the nutrient medium, such as vitamins or growth promoters such as biotin, riboflavin, thiamine, folic acid, nicotinic acid, pantothenate or pyridoxine, amino acids such as alanine, cysteine, proline, Aspartic acid, glutamine, serine, phenylalanine, ornithine or valine, carboxylic acids such as citric acid, formic acid, pimelic acid or lactic acid, or substances such as dithiothreitol.
  • vitamins or growth promoters such as biotin, riboflavin, thiamine, folic acid, nicotinic acid, pantothenate or pyridoxine
  • amino acids such as alanine, cysteine, proline, Aspartic acid, glutamine, serine, phenylalanine, ornithine or valine
  • carboxylic acids such as citric acid, formic acid, pimelic acid or lactic
  • the mixing ratio of the nutrients mentioned depends on the type of fermentation and is determined in each individual case.
  • the medium components can all be introduced at the beginning of the fermentation, after they have been sterilized separately if necessary or sterilized together, or else they can be added continuously or discontinuously during the fermentation as required.
  • the breeding conditions are determined in such a way that the organisms grow optimally and that the best possible yields are achieved.
  • Preferred cultivation temperatures are 15 ° C to 40 ° C. Temperatures between 25 ° C and 37 ° C are particularly advantageous.
  • the pH is preferably held in a range from 3 to 9. PH values between 5 and 8 are particularly advantageous.
  • an incubation period of a few hours to a few days, preferably 8 hours to 21 days, particularly preferably 4 hours to 14 days, is sufficient. The maximum amount of product in the medium accumulates within this time.
  • the process according to the invention can be carried out continuously or batchwise in batch or fed-batch fashion.
  • the riboflavin productivity can be increased to different extents by the method according to the invention.
  • productivity can advantageously be increased by at least 5%, preferably by at least 10%, particularly preferably by 20%, very particularly preferably by at least 100% in each case compared to the starting organism.
  • Sequence 1 shows the DNA construct which, in addition to the selection marker required for the transformation, bears the gene fragments of ribl, rib2, rib4 and rib7.
  • the sequencing of recombinant DNA molecules was carried out with a laser fluorescence DNA sequencer from ABI according to the method of Sanger (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA74, 5463-5467). Fragments resulting from a polymerase chain reaction were sequenced and checked to avoid polymerase errors in constructs to be expressed.
  • the vector TefG418Tefrib3, 4, 5 is described in WO 99/61623. This vector was cut with Kpnl, felled and released again and then partially digested with Nhel. The larger fragment, once cut with Nhel and Kpnl, was purified from an agarose gel.
  • the rib7 gene was amplified from vector pJR765 (described in WO 95/26406) with the aid of PCR (primer: TCGAGGTACCGGGCCCCCCCTCGA; TCGAACTAGTAGACCAGTCAT). The specific PCR product was cut with Kpnl / Spel and ligated with the Kpnl / Nhel cut vector described above.
  • TefG418Tefrib7 4.
  • the rib2 gene was amplified from the vector pJR758 (WO 95/26406) with PCR and the resulting product was cut with Spei and Nhel (primer: CCCAACTAGTCTGCAGGACAATTTAAA; AGTGCTAGCCTACAATTCGCAGCAAAAT). This DNA fragment is with the Cut and phosphatase-treated vector TefG418Tefrib7.4 was ligated.
  • the result was vector TefG418Tef-rib7,4,2.
  • the ribl gene was amplified from vector pJR765 (WO95 / 26406) by PCR (primer: GTAGTCTAGAACTAGCTCGAAACGTG;
  • the resulting DNA construct represents the vector Tef-G418-ribl, 2,7,4.
  • Example 2 Transformation of the DNA construct into the Ashbya gossypii fungus
  • the DNA construct described in Example 1 (vector Tef-G418-ribl, 2,4,7) was completely cut with the restriction enzyme Xbal and the insert which carries the rib gene sequences purified by agarose gel separation.
  • MA2 medium (10 g / 1 Bacto-Peptone, 1 g / 1 yeast extract, 0.3 g / 1 myo-inositol and 10 g / 1 D-glucose) was inoculated with Ashbya gossypii spores. The culture was incubated for 12 h at 4 C and then with shaking for 13 h at 28 ° C.
  • Figure 1 shows the riboflavin yields of the different clones.

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Abstract

Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Riboflavin indem man einen zur Riboflavinprodulktion fähigen Mikroorganismus der Gattung Ashbya, züchtet, der in mindestens zwei der Genprodukte aus der Gruppe ribl, rib2, rib4 und rib7 höhere Aktivitäten aufweist als der Wildtyp ATCC 10895, und anschliessend das gebildete Riboflavin aus dem Kulturmedium isoliert.

Description

Genetische Stammoptimierung zur verbesserten Herstellung von Riboflavin
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein genetisches Verfahren zur Herstellung von Riboflavin. Durch die spezielle Auswahl von Genen der Riboflavinbiosynthese bzw. deren Kombination in Organismen der Gattung Ashbya und deren Expression wird die Riboflavin- produktion in diesen Organismen gesteigert.
Vitamin-B2, auch Riboflavin genannt, wird von allen Pflanzen und einer Vielzahl von Mikroorganismen hergestellt. Für Mensch und Tier ist es essentiell, da sie nicht in der Lage sind, es zu synthetisieren. Riboflavin spielt eine wichtige Rolle im Metabolismus . So ist es beispielsweise an der Verwertung von Kohlenhydraten beteiligt. Bei Vitamin B2-Mangel treten Entzündungen der Mund- und Rachenschleimhäute, Juckreiz und Ent- Zündungen in den Hautfalten und ähnliche Hautschäden, Bindehautentzündungen, verminderte Sehschärfe und Trübung der Hornhaut auf. Bei Säuglingen und Kindern können Wachstumsstillstand und Gewichtsabnahme auftreten. Vitamin-B2 hat deshalb eine große wirtschaftliche Bedeutung beispielsweise als Vitaminpräparat bei Vitaminmangel sowie als Futtermittelzusatz. Es wird verschiedensten Lebensmitteln zugesetzt. Daneben wird es auch als Lebensmittelfarbstoff, beispielsweise in Mayonnaise, Eiscreme, Pudding etc . verwendet .
Die Herstellung von Vitamin B2 erfolgt entweder chemisch oder mikrobiell (siehe z.B. Kurth et al . , 1996, Riboflavin, in: Ulimann's Encyclopedia of industrial chemistry, VCH Weinheim). Bei den chemischen Herstellverfahren wird Riboflavin in der Regel in mehrstufigen Prozessen als reines Endprodukt gewonnen, wobei relativ kostspielige Ausgangsprodukte, wie z.B. D-Ribose, eingesetzt werden müssen.
Eine Alternative zur chemischen Synthese von Riboflavin ist die fermentative Herstellung des Vitamin B2 durch Mikroorganismen. Als Ausgangsstoffe dienen dabei nachwachsende Rohstoffe, wie Zucker oder pflanzliche Öle. Die Herstellung von Riboflavin durch Fermentation von Pilzen wie Eremothecium ashbyii oder Ashbya gossypii ist bekannt (The Merck Index, Windholz et al . , eds. Merck & Co., Seite 1183, 1983), aber auch Hefen, wie z.B. Candida, Pichia und Saccharomyces oder Bakterien, wie z.B.
Bacillus, Clostridien oder Corynebakterien sind als Riboflavin- Produzenten beschrieben. In EP-A-0 405 370 und EP-A-0 821 063 wird die Herstellung von Riboflavin mit rekombinanten Bakterienstämmen beschrieben, wobei die Stämme durch Transformation mit Riboflavin-Biosynthesegenen aus Bacillus subtilis erhalten wurden.
In WO 95/26406 bzw. WO 94/11515 wird die Klonierung der für die Riboflavin-Biosynthese spezifischen Gene aus den eukaryontischen Organismen Ashbya gossypii bzw. Saccharomyces cerevisiae, sowie Mikroorganismen, die mit diesen Genen transformiert wurden, und die Verwendung solcher Mikroorganismen zur Riboflavinsynthese beschrieben.
WO 99/61623 beschreibt die Nutzung der Auswahl von Riboflavin- Biosynthesegenen (rib3, rib4, rib5) zur Erhöhung der Riboflavin- bildung.
In beiden oben genannten Organismen katalysieren 6 Enzyme ausgehend von Guanosintriphosphat (GTP) und von Ribulose-5- Phosphat die Bildung von Riboflavin. Hierbei setzt die GTP-Cyclo- hydrolase-II (ribl-Genprodukt) GTP zu 2, 5-Diamino-6-(ribosyl- amino) -4-(3H)-pyrimidinon-5-phosphat um. Diese Verbindung wird anschließend durch die 2, 5-Diamino-6-(ribosylamino)-4-
(3H) -pyrimidinon-5-phosphat Reduktase (rib7 Genprodukt) zu
2 , 5-Diamino-ribitylamino-2 , 4- (1H, 3H) - pyrimidin-5-phosphat reduziert und dann durch eine spezifische Deaminase (rib2-Gen- produkt) zu 5-Amino-6-ribitylamino-2,4-(lH, 3H) -pyrimidindion- 5-phosphat deaminiert. Durch eine unspezifische Phosphatase wird daraufhin das Phosphat abgespalten.
Ribulose-5-phosphat, neben GTP das zweite Ausgangsprodukt der letzten enzymatischen Schritte der Riboflavinbiosynthese, wird durch die 3 , 4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat-Synthase (rib3-Gen- produkt) zu 3 , 4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat (DBP) umgesetzt.
Sowohl DBP als auch 5-Amino-6-ribitylamino-2, 4-(lH, 3H) -Pyrimidin- dion sind die Edukte der enzymatischen Synthese von 6 , 7-Dimethyl- 8-ribityllumazin. Diese Reaktion wird durch das rib4-Genprodukt (DMRL-Synthase) katalysiert. DMRL wird daraufhin durch die Ribo- flavin-Synthase (rib5-Genprodukt) zu Riboflavin umgesetzt (Bacher et al. (1993), Bioorg. Chem. Front. Vol. 3, Springer Verlag) .
Trotz dieser Fortschritte in der Herstellung von Riboflavin besteht nach wie vor ein Bedarf zur Verbesserung und Steigerung der Vitamin B2-Produktivität um den steigenden Bedarf zu decken und die Herstellung von Riboflavin effizienter zu gestalten. Es bestand daher die Aufgabe die Vitamin B2-Produktivität weiter zu verbessern. Diese Aufgabe wurde gelöst durch ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Riboflavin, indem man einen zur fähigen Mikroorganismus der Gattung Ashbya, züchtet, der in mindestens zwei der Genprodukte aus der Gruppe ribl, rib2, rib4 und rib7 höhere Aktivitäten aufweist als der Wildtyp ATCC 10895, und anschließend das gebildete Riboflavin aus dem Kulturmedium isoliert .
Vorteilhaft wird das Verfahren zur gesteigerten Herstellung von Riboflavin mit einem Organismus, der in der Lage ist Riboflavin zu synthetisieren, durchgeführt, bei dem beispielsweise die Kombination der folgenden rib-Genprodukte (die Zahlen geben jeweils das entsprechende rib-Genprodukt an) eine erhöhte Aktivität aufweisen: 1+2, 1+4, 1+7, 2+4, 2+7, 4+7.
Besonders bevorzugt sind solche Organismen bei denen die Kombination der folgenden rib-Genprodukte (die Zahlen geben jeweils das entsprechende rib-Genprodukt an) eine erhöhte Aktivität aufweisen: 1+2+4, 1+2+7, 1+4+7, 2+4+7.
Die erhöhte Aktivität der rib Genprodukte wird dabei im Vergleich zu dem Ashbya gossypii Stamm ATCC 10895 bewertet, der als Referenzorganismus dient. Die entsprechenden Verfahren zur Messung der Aktivität der rib-Genprodukte, d.h. die Enzymaktivitäten sind dem Fachmann geläufig und in der Literatur beschrieben.
Weiter vorteilhaft zur Steigerung der Vitamin-B2-Produktivität ist die Kombination von Steigerung der natürlichen Enzymaktivität und Einbringen der oben genannten Genkombination zur Erhöhung der Genexpression.
Als Organismen bzw. Wirtsorganismen für das erfindungsgemäße Verfahren eignen sich prinzipiell alle Organismen der Gattung Ashbya, die in der Lage sind Riboflavin zu synthetisieren.
Als rib Genprodukte werden nicht nur die im Sequenzprotokoll in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 beschriebenen Polypeptidsequenzen bezeichnet, sondern auch solche von diesen Sequenzen durch Austausch, Insertion oder Deletion von bis zu 5 % bevorzugt bis zu 3 %, besonders bevorzugt bis zu 2 % der A inosäurecodons erhältliche Polypeptidsequenzen bezeichnet. Solche Sequenzen kommen beispielsweise als natürliche Allelvariationen vor oder können durch Mutationsbehandlung des Ausgangsstammes beispielsweise durch mutagene Substanzen oder elektromagnetische Strahlung und anschließende Selektion auf erhöhte Riboflavinprod ktivität erhalten werden.
Die erfindungsgemäße Kombination der rib-Gene ribl, rib2 , rib4 und rib7 und/oder die Aktivitätserhöhung der Gene und ihrer Genprodukte führt zu einer deutlich gesteigerten Riboflavinproduktivität. Die genannten Gene lassen sich prinzipiell über alle dem Fachmann bekannten Methoden in die verwendeten Organismen einführen, vorteilhaft werden sie über Transformation, Transfektion, Elektroporation, mit der sog. Partikelgun oder über Mikroinjektion in die Organismen bzw. deren Zellen eingebracht . Für Mikroorganismen kann der Fachmann entsprechende Methoden den Lehrbüchern von Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, von F.M. Ausubel et al . (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, von D.M. Glover et al., DNA Cloning Vol. 1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9) , von Kaiser et al. (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Habor Laboratory Press oder Guthrie et al . Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, 1994, Academic Press entnehmen. Als vorteilhaft seien beispielhaft Methoden wie das Einbringen der DNA über homologe oder heterologe Rekombination beispielsweise mit Hilfe des ura-3-Gens, speziell des ura-3- Gens von Ashbya, wie in der deutschen Anmeldung DE 19801120.2 beschrieben und/oder über die im folgenden beschriebene REMI- Methode (= "Restriktion-Enzyme-Mediated-Integration"), genannt.
Die REMI-Technik basiert auf der Kotransformation eines linearen DNA-Konstruktes, das an beiden Enden mit derselben Restriktions- endonuklease geschnitten wurde, zusammen mit der Restriktions- endonuklease, die für diese Restriktion des DNA-Konstrukts verwendet wurde, in einen Organismus. Die Restriktionsendo- nuklease schneidet daraufhin die genomische DNA des Organismus, in den das DNA-Konstrukt zusammen mit dem Restriktionsenzym eingebracht wurde. Dies führt zu einer Aktivierung der zelleigenen Reparaturmechanismen. Diese Reparaturmechanismen reparieren die durch die Endonuklease hervorgerufene Strangbrüche' der genomischen DNA und bauen dabei mit einer gewissen Frequenz auch das kotransformierte DNA-Konstrukt mit ins Genom ein. In der Regel bleiben dabei die Restriktionsschnittstellen an beiden Enden der DNA erhalten.
Diese Technik wurde von Bölker et al . (Mol Gen Genet, 248, 1995: 547-552) für die Insertionsmutagenese von Pilzen beschrieben. Von Schiestl und Petes (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88, 1991: 7585-7589) wurde die Methode zur Aufklärung, ob es bei Saccharo- myces eine heterologe Rekombination gibt, verwendet. Zur stabilen Transformation und regulierten Expression eines induzierbaren Reportergens wurde die Methode von Brown et al . (Mol. Gen. Genet. 251, 1996: 75-80) beschrieben. Das System wurde bisher noch nicht als gentechnisches Werkzeug zur Optimierung von Stoff- wechselwegen oder zur kommerzielle Überexpression von Proteinen eingesetzt.
Am Beispiel der Riboflavinsynthese wurde gezeigt, dass mit Hilfe der REMI-Methode Biosynthesegene in das Genom der oben ge- nannten Organismen integriert werden kann und damit Produktionsverfahren zur Herstellung von Stoffwechselprodukten des Primäroder Sekundärmetabolismus speziell von Biosynthesewegen beispielsweise von Aminosäuren wie Lysin, Methionin, Threonin oder Tryptophan, Vitaminen wie Vitamin A, B2, B6 B12, C, D, E, F, S-Adenosylmethionin, Biotin, Panthotensäure oder Folsäure,
Carotinoiden wie ß-Carotin, Lycopin, Canthaxanthin, Astaxanthin oder Zeaxanthin oder Proteinen wie Hydrolasen wie Lipasen, Esterasen, Amidasen, Nitrilasen, Proteasen, Mediatoren wie Cytokine z.B. Lymphokine wie MIF, MAF, TNF, Interleukine wie Interleukin 1, Interferone wie γ-Interferon, tPA, Hormone wie Proteohormone, Glykohormone, Oligo- oder Polypetidhormone wie Vassopressin, Endorphine, Endostatin, Angiostatin, Wachstumsfaktoren Erythropoietin, Transkriptionsfaktoren, Integrine wie GPIIb/IIIa oder oCvßlll, Rezeptoren wie die verschiedenen Glutamat- rezeptoren, Angiogenesefaktoren wie Angiotensin optimiert werden können.
Mit Hilfe der REMI-Methode können die erfindungsgemäßen Nukleinsäurefragmente oder andere der oben genannten Gene an transcriptionsaktive Stellen im Genom plaziert werden.
Vorteilhafterweise werden die Nukleinsäuren zusammen mit einem mindestens einem Reportergen in ein DNA-Konstrukt kloniert, das in das Genom eingebracht wird. Dieses Reportergen sollte eine leichte Detektierbarkeit über einen Wachstums-, Fluoreszenz-, Chemo- oder Biolumineszenzassay oder über eine photometrische Messung ermöglichen. Beispielhaft seien als Reportergene Anti- biotikaresistenzgene, Hydrolasegene, Fluoreszenzproteingene, Biolumineszenzgene, Glucosidasegene, Peroxidasegen oder Biosynthesegene wie die Riboflavingene, das Luciferasegen, ß-Galactosidasegen, gfp-Gen, Lipasegen, Esterasegen, Peroxidasegen, ß-Lactamasegen, Acetyl-, Phospo- oder Adenyltransferasegen genannt. Diese Gene ermöglichen eine leichte Messbarkeit und Quantifizierbarkeit der Transcriptionsaktivität und damit der Expression der Gene. Damit lassen sich Genomstellen identifizieren, die eine bis zu Faktor 2 unterschiedliche Produktivität zeigen (siehe Figur 1) . Figur 1 zeigt die Klone Lu21#l und LU21#2, die nach Integration erhalten wurden, mit ihren unterschiedlichen Vitamin B2- (= Riboflavin) Produktivitäten.
Im Falle, dass die Biosynthesegene selber eine leichte Detektier- barkeit ermöglichen, kann wie beispielsweise im Falle des Ribo- flavins auf ein zusätzliches Reportergen verzichtet werden.
Sollen mehrere Gene in den Organismus eingeführt werden, so können alle zusammen mit einem Reportergen in einem einzigen Vektor oder jedes einzelne Gen mit einem Reportergen in je einem Vektor in den Organismus eingebracht werden, wobei die verschiedenen Vektoren gleichzeitig oder sukzessive eingebracht werden können. Auch Genfragmente, die für die jeweiligen Aktivitäten kodieren können in der REMI-Technik eingesetzt werden.
Für das erfindungsgemäße Verfahren zur Integration von Biosynthesegenen in das Genom von Organismen eignen sich prinzipiell alle bekannten Restriktionsenzyme. Restriktionsenzyme, die nur 4 Basenpaare als Restriktionsschnittstelle erkennen, sind weniger bevorzugt, da sie zu häufig im Genom oder im zu integrierenden Vektor schneiden, bevorzugt sind Enzyme die 6, 7, 8 oder mehr Basenpaare als Schnittstelle erkennen wie BamHI, EcoRI, Bglll, SphI, Spei, Xbal, Xhol, Ncol, Sall, Clal, Kpnl, Hindl l, Sacl, PstI, Bpnl, Notl, Srfl oder Sfil um nur einige der möglichen Enzyme zu nennen. Von Vorteil ist, wenn die verwendeten Enzyme keine Schnittstellen mehr in der einzuführenden DNA haben, dies erhöht die Effizienz der Integration. In der Regel werden 5 bis 500 U, bevorzugt 10 bis 250, besonders bevorzugt 10 bis 100 U der Enzyme im REMI-Ansatz verwendet. Die Enzyme werden vorteilhaft in einer wässrigen Lösung eingesetzt, die Substanzen zur osmotischen Stabilisierung wie Zucker wie Saccharose, Trehalose oder Glucose, Polyole wie Glycerin oder Polyethylenglycol , eine Puffer mit einer vorteilhaften Pufferung im Bereich von pH 5 bis 9, bevorzugt 6 bis 8, besonders bevorzugt 7 bis 8 wie Tris, MOPS, HEPES, MES oder PIPES und/oder Substanzen zur Stabilisierung der
Nukleinsäuren enthalten wie anorganische oder organische Salze von Mg, Cu, Co, Fe, Mn oder Mo. Es können gegebenenfalls noch weitere Stoffe enthalten sein wie EDTA, EDDA, DTT, ß-Mercapto- ethanol oder Nukleasehemmstoffe. Es ist aber auch möglich die REMI-Technik ohne diese Zusätze durchzuführen.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird in einem Temperaturbereich von 5 bis 80°C, bevorzugt von 10 bis 60°C, besonders bevorzugt von 20 bis 40°C durchgeführt. Für das Verfahren eignen sich alle bekannten Methoden zur DeStabilisierung von Zellmembranen wie beispielsweise die Elektroporation, die Fusion mit beladenen Vesikeln oder die Destabilisierung über verschiedene Alkali- oder Erdalkalisalze wie Lithium, Rubidium- oder Calziumsalze bevorzugt sind die Lithiumsalze.
Die Nukleinsäuren können nach dem Isolieren direkt oder nach Aufreinigung für die erfindungsgemäße Reaktion verwendet werden.
Das Einbringen der erfindungsgemäßen Kombination der rib-Gene in Pflanzen kann prinzipiell nach allen dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen.
Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplasten- transformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, die Verwendung einer Genkanone, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikro- injektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 sowie in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium turne faciens zu transformieren, beispielsweise pBinl9 (Bevan et al . , Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Die Transformation von Pflanzen mit Agrobacterium tumefaciens wird beispielsweise von Höfgen und Will- nutzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 beschrieben.
Mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformierte Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie Getreide, Mais, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat und den verschiedenen Baum-, Nuss- und Weinspezies sowie Leguminosen verwendet werden, z.B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.
Die genetisch veränderten Pflanzenzellen können über alle dem Fachmann bekannten Methoden regeneriert werden. Entsprechende Methoden können den oben genannten Schriften von S.D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer entnommen werden. Es gibt eine Vielzahl von Möglichkeiten die Enzymaktivität der rib-Genprodukte in der Zelle zu erhöhen.
Eine Möglichkeit besteht darin, die endogenen rib-Gene 1,2,4 und 7 so zu verändern, dass sie für Enzyme mit gegenüber den Ausgangsenzymen erhöhter rib 1,2,4 bzw. 7-Aktivität kodieren. Eine andere Erhöhung der Enzymaktivität kann beispielsweise erreicht werden, indem durch Veränderung der katalytischen Zentren ein erhöhter Substratumsatz erfolgt oder indem die Wirkung von Enzym- inhibitoren aufgehoben wird, das heißt sie weisen eine erhöhte spezifische Aktivität auf oder ihre Aktivität wird nicht gehemmt. Auch kann eine erhöhte Enzymaktivität in einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform durch Erhöhung der Enzymsynthese in der Zelle erfolgen, beispielsweise durch Ausschaltung von Faktoren, die die Enzymsynthese reprimieren oder durch Erhöhung der Aktivität von Faktoren oder Regulatorelementen, die eine verstärkte Synthese fördern, oder bevorzugt durch Einbringen weiterer Genkopien. Durch diese Maßnahmen wird die Gesamtaktivität der Genprodukte in der Zelle erhöht, ohne die spezifische Aktivität zu verändern. Es kann auch eine Kombination dieser Methoden verwendet werden, das heißt Erhöhung der spezifischen Aktivität sowie Erhöhung der Gesamtaktivität. Diese Änderungen können prinzipiell über alle dem Fachmann bekannten Methoden in die Nukleinsäuresequenzen der Gene, Regulationselemente oder deren Promotoren eingebracht werden. Hierzu können die Sequenzen beispielsweise einer Mutageneses wie einer "site directed muta- genesis" unterzogen werden wie sie in D.M. Glover et al., DNA Cloning Vol. 1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), Kapitel 6, Seite 193 ff beschrieben wird.
Von Spee et al. (Nucleic Acids Research, Vol. 21, No. 3, 1993: 777-778) wird eine PCR-Methode unter Verwendung von dITP zur zufälligen Mutagenese beschrieben.
Die Verwendung einer "in vitro" Rekombinationstechnik für die molekulare Evolution wird von Stemmer (Proc. Natl . Acad. Sei. USA, Vol. 91, 1994: 10747-10751) beschrieben.
Von Moore et al . (Nature Biotechnology Vol. 14, 1996: 458-467) wird die Kombination der PCR- und Rekombinationsmethode beschrieben.
Die veränderten Nukleinsäuresequenzen werden anschließend wieder über Vektoren in die Organismen zurückgebracht. Es können zur Erhöhung der Enzymaktivitäten auch veränderte Promotorbereiche vor die natürlichen Gene gebracht werden, so dass die Expression der Gene gesteigert wird und damit die Aktivität letztlich angehoben wird. Auch am 3 '-Ende können Sequenzen eingebracht werden, die beispielsweise die Stabilität der mRNA erhöhen und dadurch eine erhöhte Translation ermöglichen. Dies führt ebenfalls zu einer höheren Enzymaktivität.
Vorzugsweise werden weitere Genkopien der rib-Gene 1,2,7 und 4 gemeinsam in die Zelle eingebracht. Diese Genkopien können der natürlichen Regulation unterliegen, einer veränderten Regulation, wobei die natürlichen Regulationsregionen derart verändert wurden, das sie eine erhöhte Expression der Gene ermöglicht oder aber es können Regulationssequenzen fremder Gene oder sogar artfremder Gene verwendet werden.
Besonders vorteilhaft ist eine Kombination der oben genannten Methoden.
Vorteilhaft im erfindungsgemäßen Verfahren ist die Kombination der Gene mit den Sequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 und SEQ ID No. 7 oder deren funktionelle Äquivalente .
Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die Nukleinsäuresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen "codon usage" zu verändern. Der "codon usage" lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.
Die Genexpression der rib-Gene 1, 2, 7 und 4 kann vorteilhaft durch Erhöhen der ribl, 2, 7, 4 Genkopienzahl und/oder durch Verstärkung regulatorischer Faktoren, die die ribl, 2,7 und 4 Gen- expression positiv beeinflussen, erhöht werden. So kann eine
Verstärkung regulatorischer Elemente vorzugsweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem stärkere Transkriptionssignale wie Promotoren und Enhancer verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispiels- weise die Stabilität der ribl, 2, 7 und 4 mRNA verbessert, oder die Ableseeffizienz dieser mRNA an den Ribosomen erhöht wird.
Zur Erhöhung der Genkopienzahl können die rib-Gene 1,2,7 und 4, oder homologer Gene, beispielsweise in ein Nukleinsäurefragment bzw. in einen Vektor eingebaut werden, der vorzugsweise die den jeweiligen rib-Genen zugeordnete, regulatorische Gensequenzen oder analog wirkende Promotoraktivität enthält . Insbesondere werden solche regulatorische Sequenzen verwendet, die die Genexpression verstärken. Alternativ kann auch jedes der beschriebenen Gene in einen einzelnen Vektor gebracht und in den jeweiligen Produktionsorganismus transformiert werden.
5
Unter dem erfindungsgemäßen Nukleinsäurefrag ent sind die rib-Gensequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 und SEQ ID No. 7 oder deren funktioneile Äquivalente zu verstehen, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafter- ° weise zur Erhöhung der Genexpression funktionell verknüpft wurden. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nucleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulationssequenzen oder anstelle dieser Sequenzen 5 kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das 0 heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Sequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 7 oder deren funktioneile Äquivalente inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt . Stattdessen wurde die natürliche Regulationssequenz so 5 mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert wird. Diese veränderten Promotoren können auch allein vor die natürlichen Gene zur Steigerung der Aktivität gebracht werden. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktioneil 0 verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nucleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3' -Ende der DNA- Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die rib-Gene können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein. 5
Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Verfahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacl^-- T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-PR- oder im λ-PL-Promotor en0 thalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren a y und SP02, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH oder in den Pflanzenpro otoren CaMV/35S [Franck 5 et al., Cell 21 (1980) 285-294], PRPl [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22(1993)], SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, LEB4, nos oder im Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor enthalten. In diesem Zusammenhang sind auch die Promotoren der Pyruvatdecarboxylase und der Methanoloxidase aus beispielsweise Hansenula vorteilhaft. Weitere vorteilhafte Pflanzenpromotoren sind beispielsweise ein durch Benzensulfonamid-induzierbarer (EP 388186), ein 5 durch Tetrazyklin-induzierbarer (Gatz et al . , (1992) Plant J. 2, 397-404) , ein durch Abscisinsäure-induzierbarer (EP335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer (W09321334) Promotor. Vorteilhaft sind insbesonders solche pflanzliche Promotoren, die die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen
10 sicherstellen, in denen die Biosynthese von Purinen bzw. dessen Vorstufen stattfindet. Insbesondere zu nennen sind Promotoren, die eine blattspezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989)
152445-245) . Auch der Promotor der Phosphoribosylpyrophosphat Amidotransferase aus Glycine max (siehe auch Genbank Accession Nummer U87999) oder einen anderen Nodien-spezifischen Promotor wie in EP 249676 können vorteilhaft verwandt werden.
20 Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren
RegulationsSequenzen wie die oben genannten für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Darüberhinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.
25 Im Nukleinsäurefragment (= Genkonstrukt) können wie oben beschrieben noch weitere Gene, die in die Organismen eingebracht werden sollen, enthalten sein. Diese Gene können unter getrennter Regulation oder unter der gleichen Regulationsregion wie die rib-Gene liegen. Bei diesen Genen handelt es sich beispiels-
30 weise um weitere Biosynthesegene, die eine gesteigerte Synthese ermöglichen.
Das Nukleinsäurefragment wird zur Expression in den oben genannten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen Vektor wie
35 beispielsweise einem Plasmid, einem Phagen oder sonstiger DNA inseriert, das eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHSl, pHS2 , pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-Bl, λgtll oder pBdCI,
40 in Streptomyces pIJlOl, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUBHO, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALSl, pIL2 oder pBB116, in Hefen 2«=M, pAG-1, YEp6, YEpl3 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 oder pDH51 oder Derivate der vorstehend genannten
45 Plasmide. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P.H. et al . Elsevier, Amsterdam-New York- Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden. Geeignete pflanzliche Vektoren werden unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S.71-119 beschrieben.
Vorteilhafterweise enthält das Nukleinsäurefragment zur Expression der weiteren enthaltenen Gene zusätzlich noch 3 ' und/oder 5' Terminale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtsorganismus und Gen oder Gene für eine optimale Expression ausgewählt werden.
Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert und/oder üb rexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptions- signale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann das erfindungsgemäße Genkonstrukt auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurefragment als Vektor bestehen.
Als Vektor kann auch ein beliebiges Plasmid (insbesondere aber ein Plasmid, das den Replikationsursprung des 2°em Plasmids aus S. cerevisiae trägt) verwendet werden, das in der Zelle autonom repliziert, aber auch wie oben beschrieben ein lineares DNA-Frag- ment, das in das Genom des Wirtes integriert. Diese Integration kann über hetero- oder homologe Rekombination erfolgen. Bevorzugt wie erwähnt jedoch über homologe Rekombination (Steiner et al . , Genetics, Vol. 140, 1995: 973 - 987). Dabei können die Gene ribl, rib2, rib4 und rib7 einzeln im Genom an verschiedenen Orten oder auf verschiedenen Vektoren vorliegen oder gemeinsam im Genom oder auf einem Vektor vorliegen. Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Organismen, die die Kombination der rib-Gene 1,2,7 und 4 oder deren funktioneile Äquivalente enthalten, zeigen eine erhöhte Riboflavin-Produktion.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die für die Herstellung von Riboflavin verwendeten Organismen in einem Medium, das das Wachstum dieser Organismen ermöglicht, angezüchtet. Dieses Medium kann ein synthetisches oder ein natürliches Medium sein. Je nach Organismus werden dem Fachmann bekannte Medien verwendet . Für das Wachstum der Mikroorganismen enthalten die verwendeten Medien eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und gegebenenfalls geringe Mengen an Vitamine und Spurenelemente.
Vorteilhafte Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Zucker wie Mono-, Di- oder Polysaccharide wie Glucose, Fructose, Mannose, Xylose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Stärke oder Cellulose, komplexe Zuckerquellen wie Melasse, Zuckerphosphate wie Fructose-1, 6-bis- phosphat, Zuckeralkohole wie Mannit, Polyole wie Glycerin, Alkohole wie Methanol oder Ethanol, Carbonsäuren wie Citronen- säure, Milchsäure oder Essigsäure, Fette wie Sojaöl oder Rapsöl, Aminosäuren wie ein Aminosäurengemisch beispielsweise sog. Casamino acids (Difco) oder einzelne Aminosäuren wie Glycin oder Asparaginsäure oder Aminozucker, die letztgenannten können auch gleichzeitig als Stickstoffquelle verwendet werden.
Vorteilhafte Stickstoffquellen sind organische oder anorganische StickstoffVerbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Beispiele sind Ammoniumsalze wie NH4CI oder (NH4) Sθ4, Nitrate, Harnstoff, oder komplexe Stickstoffquellen wie Maisquellwasser, Bierhefeautolysat , Sojabohnenmehl, Weizengluten, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Caseinhydrolysat, Hefe oder Kartoffelprotein, die häufig auch gleichzeitig als Stickstoffquelle dienen können.
Beispiele für anorganische Salze sind die Salze von Calcium, Magnesium, Natrium, Cobalt, Molybdän, Mangan, Kalium, Zink, Kupfer und Eisen. Als Anion dieser Salze sind besonders das Chlor-, Sulfat- und Phosphation zu nennen. Ein wichtiger Faktor zur Steigerung der Produktivität im erfindungsgemäßen Verfahren ist die Kontrolle der Fe2+_ oder Fe3+-Ionenkonzentration im Produktionsmedium.
Gegebenenfalls werden dem Nährmedium weitere Wachstumsfaktoren zugesetzt, wie beispielsweise Vitamine oder Wachstumsförderer wie Biotin, Riboflavin, Thiamin, Folsäure, Nicotinsäure, Panto- thenat oder Pyridoxin, Aminosäuren wie Alanin, Cystein, Prolin, Asparaginsäure, Glutamin, Serin, Phenylalanin, Ornithin oder Valin, Carbonsäuren wie Citronensäure, Ameisensäure, Pimelin- säure oder Milchsäure, oder Substanzen wie Dithiothreitol .
Das Mischungsverhältnis der genannten Nährstoffe hängt von der Art der Fermentation ab und wird im Einzelfall festgelegt. Die Mediumkomponenten können alle zu Beginn der Fermentation vorgelegt werden, nachdem sie falls erforderlich getrennt sterilisiert oder gemeinsam sterilisiert wurden, oder aber je nach Bedarf während der Fermentation kontinuierlich oder diskontinuierlich nachgegeben werden.
Die Züchtungsbedingungen werden so festgelegt, dass die Organismen optimal wachsen und dass die bestmöglichen Ausbeuten erreicht werden. Bevorzugte Züchtungstemperaturen liegen bei 15°C bis 40°C. Besonders vorteilhaft sind Temperaturen zwischen 25°C und 37°C. Vorzugsweise wird der pH-Wert in einem Bereich von 3 bis 9 festgehalten. Besonders vorteilhaft sind pH-Werte zwischen 5 und 8. Im allgemeinen ist eine Inkubationsdauer von wenigen Stunden bis zu einigen Tagen bevorzugt von 8 Stunden bis zu 21 Tagen, besonders bevorzugt von 4 Stunden bis 14 Tagen ausreichend. Innerhalb dieser Zeit reichert sich die maximale Menge an Produkt im Medium an.
Wie Medien vorteilhaft optimiert werden können, kann der
Fachmann beispielsweise dem Lehrbuch Applied Microbiol Physio- logy, "A Practical Approach (Eds. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL-Press, 1997, Seiten 53-73, ISBN 0 19 963577 3) entnehmen. Vorteilhafte Medien und Anzuchtbedingungen sind für Bacillus und weitere Organismen beispielsweise der Schrift EP-A-0 405 370 speziell dem Beispiel 9, für Candida der Schrift WO 88/09822 speziell Tabelle 3 und für Ashbya der Schrift von Schmidt et al . (Microbiology, 142, 1996: 419-426) zu entnehmen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann kontinuierlich oder diskontinuierlich in batch- oder fed-batch-weise durchgeführt werden.
Abhängig davon wie hoch die Ausgangsproduktivität des verwendeten Organismus ist, lässt sich die Riboflavin-Produktivität durch das erfindungsgemäße Verfahren unterschiedlich stark steigern. In der Regel lässt sich die Produktivität vorteilhaft um mindestens 5 %, bevorzugt um mindestens 10 %, besonders bevorzugt um 20 %, ganz besonders bevorzugt um mindestens 100 % jeweils gegenüber dem Ausgangsorganismus steigern. Beispiele
Die Isolierung der rib-Gene 1,2,3,4,5 und 7 aus Ashbya gossypii und Saccharomyces cerevisiae wird in den Patenten WO 95/26406 und WO 93/03183 und speziell in den Beispielen beschrieben und wurde entsprechend durchgeführt. Auf diese Schriften wird hier ausdrücklich Bezug genommen.
Sequenz 1 zeigt das DNA-Konstrukt, das neben dem zur Trans- formation notwendigen Selektionsmarker die Genfragmente von ribl , rib2 , rib4 und rib7 trägt .
Allgemeine Nukleinsäureverfahren wie z.B. Klonierunc», Restrikti- onsSpaltungen, Agarose-Gelelektrophorese , Verknüpfen von DNA- Fragmenten, Transformation von Mikroorganismen, Anzucht von
Bakterien und Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden wenn nichts anderes beschrieben wurde wie bei Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) beschrieben durchgeführt .
Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. USA74, 5463-5467) . Fragmente resultierend aus einer Polymerase Ketten- reaktion wurden zur Vermeidung von Polymerasefehlern in zu exprimierenden Konstrukten sequenziert und überprüft.
Beispiel 1
Klonierung des DNA-Konstruktes, das die ribl, rib2 , rib4 und rib7 Genkopien enthält (Vektor Tef-G418-Tef ribl, 2, 7, 4)
Expressionskonstrukte der rib-Gene: Der Vektor TefG418Tefrib3 , 4, 5 ist in WO 99/61623 beschrieben. Dieser Vektor wurde mit Kpnl geschnitten, gefällt und wieder gelöst und anschließend partiell mit Nhel verdaut. Das größere, einmal mit Nhel und Kpnl geschnittene Fragment ist aus einem Agarosegel aufgereinigt worden. Das rib7 Gen wurde aus Vektor pJR765 (beschrieben in WO 95/26406) mit Hilfe der PCR amplifiziert (Primer: TCGAGGTACCGGGCCCCCCCTCGA; TCGAACTAGTAGACCAGTCAT) . Das spezifische PCR Produkt wurde mit Kpnl/Spel geschnitten und mit dem oben beschriebenen Kpnl/Nhel geschnittenen Vektor ligiert. Es entstand Vektor TefG418Tefrib7, 4. Das rib2-Gen ist aus dem Vektor pJR758 (WO 95/26406) mit PCR amplifiziert worden und das resultierende Produkt mit Spei und Nhel geschnitten worden (Primer: CCCAACTAGTCTGCAGGACAATTTAAA; AGTGCTAGCCTACAATTCGCAGCAAAAT) . Dieses DNA-Fragment ist mit dem Nhel geschnittenen und mit Phosphatase behandelten Vektor TefG418Tefrib7,4 ligiert worden. Es entstand Vektor TefG418Tef- rib7,4,2.
Das ribl-Gen ist aus Vektor pJR765 (WO95/26406) durch PCR amplifiziert worden (Primer: GTAGTCTAGAACTAGCTCGAAACGTG;
GATTCTAGAACTAGAACTAGTGGATCCG) und wurde mit Xbal geschnitten. Dieses DNA-Fragment ist mit dem mit Nhel geschnittenen und Phosphatase behandelten Vektor TefG418Tefrib7, 4,2 ligiert worden.
Das resultierende DNA-Konstrukt stellt den Vektor Tef-G418- ribl,2,7,4 dar.
Beispiel 2
Transformation des DNA-Konstruktes in den Pilz Ashbya gossypii Das in Beispiel 1 beschriebene DNA-Konstrukt (Vektor Tef-G418- ribl,2,4,7) wurde mit dem Restriktionsenzym Xbal vollständig geschnitten und das Insert, das die rib-Gen Sequenzen trägt durch Agarosegelauftrennung aufgereinigt . MA2-Medium (10 g/1 Bacto-Peptone, 1 g/1 Hefeextrakt, 0,3 g/1 myo- Inositol und 10 g/1 D-Glucose) wurde mit Ashbya gossypii Sporen o angeimpft. Die Kultur wurde 12 h bei 4 C und anschließend unter Schütteln für 13 h bei 28°C inkubiert. Die Zellsuspension wurde abzentrifugiert und das Zellpellet in 5 ml 50 mM Kaliumphosphat- puffer pH 7,5, 25 mM DTT aufgenommen. Nach einer 30minütigen Wärmebehandlung bei 28°C wurden die Zellen wiederum abzentrifugiert und in 25 ml STM-Puffer (270 mM Saccharose, 10 mM TRIS- HC1 pH 7,5, 1 mM MgCl2) aufgenommen. 0,5 ml dieser Suspension wurden dann mit ca. 3°cg des oben aufgereinigten Inserts und 40 U Spei Enzym versetzt und in einem Biorad Gene Pulser (100Ω, 20 »=F, l,5kV) elektroporiert . Nach der Elektroporation sind die Zellen mit 1 ml MA2-Medium versetzt und auf MA2-Agarkulturplatten ausgestrichen worden. Zur Antibiotikaselektion überschichtet man die Platten nach 5h Inkubation bei 28°C mit 5 ml "Low-Melting"- Agarose, die das Antibiotikum G418 (200°eg/ml) enthält. Die Trans- formanten wurden durch Mikromanipulation klonal aufgereinigt (Steiner und Philipsen (1995) Genetics, 140; 973-987). Die erfolgreiche Integration des Konstrukts wurde durch PCR-Analyse der genomischen DNA der Transformanten verifiziert. Die Isolation der genomischen DNA wurde wie von Carle und Olson (Proc. Natl. Acad. Sei, 1985, 82, 3756-3760) und Wright und Philipsen (Gene, 1991, 109, 99-105) beschrieben durchgeführt. Die PCR mit für das Konstrukt spezifischen Primern ist nach R. Saiki (PCR Protocols, 1990, Academic Press, 13-20) durchgeführt worden. Die Analyse der PCR-Fragmente geschieht durch Auftrennung über ein Agarosegel . Bei allen Transformanten konnte eine erfolgreiche Integration ins Genom durch PCR nachgewiesen werden.
Beispiel 3
RiboflavinbeStimmung im rekombinanten Ashbya gossypii Klon Ashbya gossypii LU21 (Wildtypstamm, ATCC 10895) und die daraus durch Transformation mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Konstrukt hervorgegangenen Stämme LU21#1 und #2 wurden auf Agarmedium bei 28°C 4 Tage lang angezogen. Von dieser Platte wurden drei 100 ml Erlenmeyerkolben mit 10 ml Medium (27,5 g/1 Hefeextrakt, 0,5 g/1 MgS0 , 50 ml/1 Sojaöl, pH 7,0) beimpft. Nach 40 h Stunden Inkubation bei 28°C, 180 rp auf dem Schüttler wurde je 1 ml der Kulturbrühe in 250 ml Erlenmeyerkolben mit 20 ml YPD- Medium überführt (10 g/1 Hefeextrakt, 20 g/1 Baetopepton, 20 g/1 Glucose) . Inkubation 28°C, 300 rpm. Nach 190 h wurde aus jedem Kolben eine 1 ml Probe entnommen und mit 1 ml 1 M Perchlorsäure versetzt. Die Probe wurde filtriert und der Riboflavingehalt mit HPLC-Analytik bestimmt. Dabei wurde eine Eichung mit Riboflavin- Standards (10 mg/1, 20 mg/1, 30 mg/1, 40 mg/1, 50 mg/1) vorgenommen.
Parameter der HPLC-Methode zur Riboflavinbestimmung:
Säule ODS Hypersil 5 mm 200 X 2,1 mm (HP)
Eluent A Wasser mit 340 ml H3PO4 (89 %) auf pH 2 , 3
Eluent B 100 % Acetonitril
Gradient
Stopzeit 0 bis 6 min.: 2 % B auf 50 % B 6 bis 6,5 min: 50 % B auf 2 % B
Fluss 0,5 ml/min
Detektion 280 nm
Temperatur 40°C
Injektion 2 bis 10 «1
Die Ansätze mit Klon#l und #2, die eine zusätzliche Genkopie der rib-Gene 1, 2, 4 und 7 enthalten, zeigen im Vergleich zum Ausgangsstamm eine deutlich erhöhte Riboflavinproduktivität (Figur 1) .
Figur 1 zeigt die Riboflavinausbeuten der verschiedenen Klone. Durch Einbringen der ribl, 2, 4 und 7 Gene konnten Steigerungen der Riboflavinausbeuten von bis zu 135 % im Vergleich zum unmodifizierten Stamm erreicht werden.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Riboflavin indem man einen zur Ribo lavinproduktion fähigen Mikroorganismus der Gattung Ashbya, züchtet, der in mindestens zwei der Genprodukte aus der Gruppe ribl, rib2, rib4 und rib7 höhere Aktivitäten aufweist als der Wildtyp ATCC 10895, und anschließend das gebildete Riboflavin aus dem Kulturmedium isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß drei Genprodukte aus der Gruppe ribl, rib2 , rib4 und rib7 höhere Aktivitäten aufweisen.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß vier Genprodukte aus der Gruppe ribl, rib2, rib4 und rib7 höhere Aktivitäten aufweisen.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die höhere Genaktivität der rib Genprodukte durch eine erhöhte Genexpression bewirkt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die erhöhte Genexpression durch eine erhöhte Genkopienzahl bewirkt wird.
6. Verfahren nach einem der o.g. Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das rib-Genprodukt eine Polypeptidsequenz wie in SEQ ID NO: 2,4,6,8 dargestellt, oder eine von diesen
Sequenzen durch Austausch, Insertion oder Deletion von bis zu 5 % der Aminosäurecodons erhältliche Polypeptidsequenz besitzt.
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