+

WO1998034956A1 - Complexe non-covalent comprenant au moins un anticorps et un element de liaison aux immunoglobulines associe a une substance active, son procede de preparation et ses applications - Google Patents

Complexe non-covalent comprenant au moins un anticorps et un element de liaison aux immunoglobulines associe a une substance active, son procede de preparation et ses applications Download PDF

Info

Publication number
WO1998034956A1
WO1998034956A1 PCT/FR1998/000227 FR9800227W WO9834956A1 WO 1998034956 A1 WO1998034956 A1 WO 1998034956A1 FR 9800227 W FR9800227 W FR 9800227W WO 9834956 A1 WO9834956 A1 WO 9834956A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
anticoφs
protein
fragment
immunoglobulin
covalent complex
Prior art date
Application number
PCT/FR1998/000227
Other languages
English (en)
Inventor
Pascal Drevet
Michel Leonetti
André Menez
Original Assignee
Commissariat A L'energie Atomique
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat A L'energie Atomique filed Critical Commissariat A L'energie Atomique
Publication of WO1998034956A1 publication Critical patent/WO1998034956A1/fr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/38—Antigens from snakes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6056—Antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/625—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier binding through the biotin-streptavidin system or similar

Definitions

  • NON-COVALENT COMPLEX COMPRISING AT LEAST ONE ANTIBODY AND AN IMMUNOGLOBULIN BINDING MEMBER ASSOCIATED WITH AN ACTIVE SUBSTANCE, ITS PREPARATION METHOD AND ITS APPLICATIONS.
  • the present invention relates to a non-covalent complex comprising at least one antibody or an antibody fragment capable of binding to a molecule expressed on the surface of a cell and an immunoglobulin binding element (Igs), associated with an active substance, said complex having a specific affinity towards appropriate target cells.
  • Igs immunoglobulin binding element
  • the invention also relates to compositions containing said complexes and to their applications.
  • immunogenic complexes active substance: antigen or immunogen
  • cytotoxic complexes active substance: drug
  • expression complexes allowing the transfer of a gene into a target cell are obtained. and its expression in this cell
  • active substance nucleic acid fragment (DNA or RNA)
  • the active substance is an antigen
  • the active substance is an antigen
  • This conjugate makes it possible in particular to obtain the stimulation of T cells in vitro, with concentrations of antigen, lower by a factor of ten compared to those used with the antigen alone;
  • a conjugate which can be used in a new in vivo immunization procedure comprises an antigen coupled to an antibody specific for the surface structure of the cells presenting the antigen and in particular an antibody to an MHC class H molecule.
  • the antibody and the antigen are coupled by avidin and biotin: the antibodies are biotinylated and avidin is coupled to the antigen.
  • conjugates make it possible to increase the immunogenicity of antigens naturally exhibiting low immunogenicity, and are particularly advantageous for small peptides.
  • fusion protein covalent antigen - IgG binding protein conjugate (fusion protein), in which the IgG binding protein is one of the following proteins: protein A, fragment Z of protein A or protein G, to allow the production of antibodies or to increase it; however, to generate antibodies, this composition is emulsified in the complete Freund's adjuvant.
  • an antigen-antibody conjugate comprising at least one antigen and at least one antibody having specificity for MHC class I or class IL in which the antigen and the antibody can be chemically coupled as follows: (i) the monoclonal antibody can be modified by oxidation of its carbohydrates; (ii) coupling using the avidin-biotin system; (iii) coupling of an antigen having a hydrazide group and an oxidized monoclonal antibody carrying aldehyde groups; (iv) coupling through the protein A: in this case, either the antigen is chemically linked to protein A which has an affinity for the Fc portion of the antibody, which allows a high affinity protein A-antibody binding, with a minimum loss of the activity of the antibody; either the antigen carrying a hydrazide group is chemically linked to protein A and the antibody is oxidized,
  • a monoclonal antibody is prepared so as to have specificity for an antigen present on the surface of the target cell, so that the monoclonal antibody will bind to and when incorporated into the target cell. cell, it will transport its toxic conjugate inside it.
  • immunotoxins In addition to ricin, other agents can be incorporated into immunotoxins; there may be mentioned in particular, bacterial, plant or animal toxins (or their active fragments), radioactive atoms and agents used in anticancer chemotherapy (chemical substances such as anthracyclines, substances modifying the metabolism of cancer cells, such as nucleotide sequences expressing a protein and antisense nucleotide sequences).
  • the immunotoxins thus formed, direct the active substance (the toxin or the anticancer agent) to the pathological domain and thus lead to the elimination of the target cells.
  • cytotoxic complexes have also been described; in PCT International Application WO 83/04026, for example, a cytotoxic agent comprising protein A of staphylococcus chemically coupled to fragment A of castor toxin is more particularly described.
  • this agent in order to function, requires prior treatment with antibodies, target cells in vitro, which is difficult to envisage in the context of therapeutic treatment.
  • covalent conjugates comprising antibodies directed against the biotinylated gp70 retroviral envelope protein and antibody conjugates directed against specific biotinylated cell markers are linked by streptavidin and are used for infect cells with a recombinant retrovirus, carrying a recombinant gene, have summer, for example described (P. Roux et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 9079-9083).
  • the covalent conjugates of the prior art are not suitable for every situation; in fact, it is advantageous to have a structure which is flexible enough to be able to adapt to any active substance and to any target, which is not the case for the covalent conjugates according to prior art.
  • the subject of the present invention is a non-covalent complex, characterized in that it comprises (i) at least one antibody or an antibody fragment, capable of binding to a molecule expressed on the surface of a cell and ( ii) a binding element to an immunoglobulin or to an immunoglobulin fragment, associated with an active substance, which binding element can only bind to a single type of site or region on the immunoglobulin (Ig), such as than an Fc site or a Fab site.
  • Ig immunoglobulin
  • said antibody is directed against a molecule expressed on the surface of cells presenting the antigen (CPAg), selected from the group consisting in particular of the molecules of the major histocompatibility complex ( CMH), the immunoglobulins, transferrin receptors or mannose (macrophage) receptors.
  • CMH major histocompatibility complex
  • CMH major histocompatibility complex
  • the immunoglobulins transferrin receptors or mannose (macrophage) receptors.
  • said antibody is selected from the group consisting of anti-MHC class H molecule antibodies, .anti-IgM antibodies and anti-IgG antibodies directed against the F (ab ') region ) 2 of an Ig.
  • said antibody is directed against a molecule expressed on the surface of cancer cells.
  • said antibody or antibody fragment is directed against a molecule expressed on the surface of mucosal cells or muscle cells.
  • said antibody or antibody fragment is capable of binding to cells expressing an Fc receptor on their surface.
  • such antibodies can be used in immunogenic complexes according to the invention.
  • the immunoglobulin binding element is selected from the group consisting of proteins or fragments of immunoglobulin binding proteins which only bind in the region Fc of an immunoglobulin (IgG, IgM, IgA, IgE or IgD, for example), and come from bacteria.
  • proteins or fragments of proteins can be less affinous than protein A of Staphylococcus aureus, like the fragment ZZ.
  • proteins or protein fragments can be a protein A fragment of at least eight amino acids (PK Ray et al., Indian J. Biochem.
  • proteins or protein fragments of type IL derived from group A streptococci proteins or fragments of LLL type proteins derived from group C, group G or group L streptococci, such as protein G, preferably recombinant or one of its peptide fragments, type IV proteins or protein fragments, derived from bovine group G streptococcus, type V or type VL proteins or protein fragments derived from Streptococcus zooepidemicus or any other protein or protein fragment, derived from bacteria, protozoa or viruses and binding in the Fc region of an Ig.
  • Protein A includes five different IgG binding domains, namely domains E, D, A, B, and C ((M. Uhlen et al., J. Biol. Chem., 1984, 259, 3, 1695- 1702) .
  • the Z fragment is derived from the B domain of protein A by substitution of the Asn-Gly sequence by the Asn-Ala sequence; the ZZ fragment comprises two Z sequences.
  • the binding of the ZZ fragment to the immunoglobulins has more particularly been studied by UK Ljungberg et al. (Mol.
  • the affinity constant of the ZZ fragment for IgG is 4.8.10 “8 M “ 1 , determined by saturation and 4.3.10 “8 M “ 1 , determined by competition, while that of protein A is 26.10 “8 M “ 1 , by saturation and 25.10 “8 M “ 1 , per competition.
  • the ZZ fragment has a number of advantages compared to the complete protein A: although it has a significantly lower affinity for the Fc site of IgG, of about a factor of 5, it makes it possible to obtain targeting in vitro as effective as that which would be obtained, in the presence of protein A.
  • the endogenous IgG does not seem to disturb its binding with the MHC anti-molecule antibody; moreover, since it only binds to the Fc site, it does not trigger the biological activities of protein A which binds to both the Fc site and the Fab site, such as the activation of complement and network precipitation of antibodies (JJ Langone, Advances in Immunology, 1982, 32, in particular pages 211-215; A. Grov et al., Acta Path. Microbiol. Scan. Sect. C, 1976, 84, 333-336 ; C. Endresen, Acta Path. Microbiol. Scan. Sect.
  • the ZZ fragment is less affine than protein A, it has the same level of presentation, at equal concentration and it provides as effective targeting; it therefore works in vivo, despite possible competitiveness with endogenous Ig.
  • Protein G (type LLI) has 3 different domains of binding to Igs, namely domains A, B and C (M. Erntell et al., Mol. Immunol, 1988, 25, 2, 121-126; M. Eliasson et al., Mol. Immunol, 1991, 28, 10, 1055-1061).
  • the Ig binding proteins derived from bacteria of type H, IV, V or VI and which preferentially bind in the Fc region of an Ig, are more particularly described in Bacterial Immunoglobulins binding proteins, Vol 1, 1990, Académie Press Inc ., Ed.
  • Michael DP Boyle for example the Arp protein of group A streptococci or the ⁇ protein of group B streptococci preferably bind in the Fc region of IgA; fragments from Branhamella catarrhalis, Haemophilus influenzae and group A, B, C and D streptococci preferably bind in the Fc region of IgD.
  • the immunoglobulin binding element is selected from the group consisting of proteins or fragments of immunoglobulin binding proteins which only bind in the region Fab of an Ig (IgG, IgM, IgA, IgE or IgD, for example) and are derived from bacteria such as protein L of Peptostreptococcus magnus, a fragment of protein A comprising at least one of the following domains A , B, C, D and / or E, protein G, preferably recombinant or a fragment of protein G, protein P or a fragment of protein P of Clostridium perfringens, or any other protein or fragment of protein, derived from bacteria , protozoa or virus and binding in the Fab region of an Ig.
  • Protein L from Peptostreptococcus magnus preferably binds to the light chain of the Fab region (B.H. Nilson et al., J. Biol. Chem., 1992, 267, 4, 2234-2239).
  • the active substance is selected from the group consisting of antigens of interest, drugs and fragments of nucleic acid of interest (DNA or RNA) .
  • the non-covalent complex according to the invention comprises (i) an antibody or an antibody fragment directed against a molecule expressed on the surface an antigen-presenting cell, in particular an anti-MHC molecule antibody, an anti-IgM antibody or an anti-IgG antibody directed against the F (ab ') 2 region of an Ig and (ii) an immunoglobulin binding element as defined above, associated with an antigen.
  • said complex comprises (i) an antibody to MHC class H molecule and (ii) a protein or a fragment of a protein for binding to Fc of Ig, less affinous than protein A , in particular the ZZ fragment of protein A conjugated to an antigen, preferably in the form of a fusion protein.
  • a non-covalent ZZ-antigen / anti-MHC class II molecule antibody complex is sufficiently stable and results in:. in vitro, an immune response with significantly lower amounts of antigen than those usually causing an immune response (stimulation of T cells); the decrease in the amount of antigen is between a factor 10 2 (relative to the ZZ-antigen conjugate) and a factor 10 5 (relative to the unconjugated antigen), to obtain the same level of reply ; . in vivo, the production of specific antibodies and the induction of a T response (stimulation of specific helper T cells), in the absence of any adjuvant, whereas this is not possible with the ZZ- conjugate antigen;
  • the non-covalent complex according to the invention comprises (i) an antibody or an antibody fragment directed against a molecule expressed on the surface of a target cell ( ⁇ -fetoprotein, for cancer cells, for example) and (ii) an immunoglobulin binding element, as defined above, associated with a drug which can in particular be selected from cytotoxic chemicals, toxins (animal, plant or bacterial), haptens and antisense nucleotide sequences.
  • non-covalent complexes according to the invention do not induce any immune response against hapten, for example, following their injection into animals.
  • haptenic drug substance the majority of drugs are haptens
  • non-covalent complexes according to the invention can therefore be used to improve the efficacy of a medicament without the risk of an inappropriate immune reaction.
  • the non-covalent complex according to the invention comprises (i) an antico ⁇ s or a fragment of antico ⁇ s directed against a molecule expressed on the surface of a target cell and (ii) an immunoglobulin binding element, as defined above, associated with a nucleic acid.
  • the non-covalent complexes according to the invention have a certain number of advantages compared to the covalent conjugates of the prior art:
  • the connecting element associated with the active substance can be associated with any antico ⁇ s, depending on the desired application; this is a big difference from the more rigid covalent systems; in addition, they have greater storage stability and can advantageously be presented in two separate bottles;
  • the non-covalent complex according to the invention is able in vitro: to stimulate the auxiliary T lymphocytes specific for said antigen and in vivo: to specifically increase the T response auxiliary and to induce the production of antico ⁇ s and the cytotoxic T response and this, in the absence of adjuvant.
  • the increased stimulation of T helper lymphocytes can, under certain injection conditions, induce their anergy (non-response stage) and reducing or even canceling an inappropriate immune response, such as an allergic or autoimmune reaction;
  • the non-covalent complex according to the invention is capable of improving the cytotoxic power of said drug (action only at the level of specific targets and promotion of endocytosis);
  • the non-covalent complex according to the invention is capable of improving the expression of the transgenes.
  • the element for binding to the immunoglobulins is covalently conjugated to said active substance.
  • the immunoglobulin binding element is associated with said substance via a vector.
  • said vector is selected from the group consisting of bacteria, viruses, “empty shell” viral particles, liposomes and polymeric microspheres.
  • the present invention also relates to pharmaceutical compositions comprising a non-covalent complex according to the invention and at least one pharmaceutically acceptable vehicle.
  • pharmaceutical compositions comprising a non-covalent complex according to the invention and at least one pharmaceutically acceptable vehicle.
  • an immunogenic composition or a vaccine composition comprising a non-covalent complex according to the invention, in which the active substance is an antigen or an immunogen.
  • Vaccine compositions have a number of advantages.
  • the immune response is directed against the immunizing protein and induced by this same protein (because it is the T and B lymphocytes specific for this protein which will then be recruited during contamination by l infectious agent, not those specific to the antico ⁇ s and the immunoglobulin binding element contained in the non-covalent complex).
  • the absence of an immune response against an active substance of the haptenic type clearly indicates that the antico ⁇ s and the binding element to immunoglobulins cannot induce an immune response against the active substance and only contribute to its targeting.
  • the active substance is a protein
  • the non-covalent complexes will therefore be particularly suitable since the immune response directed against the immunizing protein will be induced by this same protein.
  • a cytotoxic composition comprising a non-covalent complex according to the invention, in which the active substance is a drug
  • an expression composition comprising a non-covalent complex according to the invention, in which the active substance is a nucleic acid sequence.
  • both the immunogenic compositions and the vaccine compositions according to the invention can increase the production of specific antico ⁇ s, the stimulation of specific helper T cells and the stimulation of specific cytotoxic T cells.
  • the present invention also relates to a process for the preparation of a non-covalent complex according to the invention, characterized in that it comprises:
  • the incubation of said immunoglobulin binding element, associated with an active substance with an antico ⁇ s capable of binding to a molecule expressed on the surface of a cell preferably between 10 minutes and 3 hours.
  • FIG. 1 illustrates the stimulation of T cells (cells called T1B2) by the fusion protein ZZ-toxin ⁇ from Naja nigricollis (-O-, - • -) or the toxin ⁇ (-D-, -> -), in the presence (complex according to the invention: - • -, simple mixing of the various elements, the toxin ⁇ not being conjugated to ZZ: -B-) or in the absence (-0 -, - D-) of anti-MHC class II antibodies, known as 14-4-4S; the serial dilutions of the different proteins are reincubated overnight in wells at 4 ° C., with or without 14-4-4S antibodies and the T1B2 cells and the CPAg are then added.
  • FIGS. 1A and 1B include on the abscissa the concentrations ( ⁇ M) of toxin ⁇ free or conjugated to ZZ (ZZ-toxin ⁇ ).
  • FIG. 2 illustrates the anti-toxin anti-toxin response of BALB / c mice, immunized either with the free ZZ- ⁇ conjugate (-D-) or the ZZ- ⁇ complex antico ⁇ s 14-4-4S (- • -).
  • the fusion protein is incubated overnight at 4 ° C with or without 14-4-4S antibodies.
  • Groups of 4 mice are then immunized subcutaneously, at the base of the tail, without adjuvants.
  • the mice are bled 7, 14 and 26 days after the injection and the presence of anti-toxin antibodies is evaluated, in accordance with ELISA; this figure includes on the ordinate the reverse of the title in antico ⁇ s and on the abscissa, the number of days.
  • FIG. 3 illustrates the anti-toxin anti-toxin response of BALB / c mice, immunized either with the toxin ⁇ (-D-), or with the fusion protein ZZ- ⁇ (- • -).
  • Groups of 4 mice are immunized subcutaneously, at the base of the tail, with these different proteins, previously mixed with complete Freund's adjuvant.
  • the mice are bled 14 and 21 days after the injection and the presence of anti-toxin antibodies is evaluated by ELISA; this figure includes on the ordinate, the reverse of the title in antico ⁇ s and on the abscissa, the number of days.
  • FIG. 4 illustrates the results obtained under the same conditions as those of FIG. 1.
  • Protein A-toxin ⁇ complexes and antico ⁇ s 14-4-4S or a mixture of toxin ⁇ , ZZ and antico ⁇ s 14-4-4S are compared with complexes according to the invention ZZ- ⁇ and antico ⁇ s 14-4-4S.
  • FIG. 1 Protein A-toxin ⁇ complexes and antico ⁇ s 14-4-4S or a mixture of toxin ⁇ , ZZ and antico ⁇ s 14-4-4S are compared with complexes according to the invention ZZ- ⁇ and antico ⁇ s 14-4-4S.
  • FIG. 4 A illustrates the results obtained with toxin ⁇ alone (-D-), the mixture of toxin ⁇ , ZZ and antico ⁇ s 14-4-4S (toxin ⁇ and the compound ZZ are not conjugated, - • -), toxin ⁇ + protein A + antico ⁇ s 14-4-4S (-O-) (toxin ⁇ and protein A are not conjugated), conjugate ZZ- ⁇ (- • -) and complex according to the invention ZZ-toxin ⁇ and antico ⁇ s 14-4-4S (- ⁇ -): the antigens are incubated overnight at 4 ° C, then the splenocytes (CPAg) and T1B2 cells are added and incubated 24h at 37 ° C.
  • FIG. 4B illustrates tests of the same type as those carried out in FIG. 4A; however, the antigen in this case is erabutoxin a (Ea).
  • Ea erabutoxin a
  • This figure illustrates the results obtained with Ea alone (-D-), a ZZ-Ea conjugate (-B-), a complex according to the invention ZZ-Ea + antico ⁇ s 14-4-4S (-O-), a protein A-Ea conjugate (- • -), a protein A-Ea + antico ⁇ s 14-4-4S (- ⁇ -) conjugate, under the same conditions as those set out for FIG. 4A.
  • FIG. 5 illustrates the results obtained, under the same conditions as those set out for Figure 1, the antico ⁇ s 14-4-4S being replaced by an anti-IgM antico ⁇ s; this figure illustrates the stimulation of T cells (cells called T1B2) by the fusion protein ZZ-toxin ⁇ from Naja nigricollis (-O - * -) or the toxin ⁇ (-D-, -B-), in the presence (complex according to the invention: - • -, various elements in mixture: -M-) or in the absence (-0 -, - D-) of anti-IgM antico ⁇ s (RAM- ⁇ ); the serial dilutions of the various proteins are reincubated overnight in wells at 4 ° C., with or without RAM- ⁇ antico ⁇ s and the T1B2 cells and the CPAg are then added (5.10 5 splenocytes).
  • the stimulation of T cells is assessed through the secretion of interleukin-2 (IL-2), determined by the proliferation of an cytotoxic T cell line dependent on IL-2 (CTLL test), using methyl- 3 H thymidine, 5 Ci / mmol, CEA, France); the data are expressed in cpm (ordinates) and correspond to the inco ⁇ oration of tritiated thymidine in the cells: on the abscissa, the concentrations (nM) of toxin ⁇ free or conjugated to ZZ (ZZ-toxin ⁇ ) are represented.
  • IL-2 interleukin-2
  • FIG. 6 illustrates the increase in the induction in vivo of T helper cells specific for alpha toxin by a series of non-covalent complexes according to the invention ZZ-toxin ⁇ and anti-IgM antibodies (RAM ⁇ ), ZZ- ⁇ toxin and anti-IgGF (ab ') 2 antibodies (RAMF (ab') 2), ZZ- ⁇ toxin and anti-HCM antibodies (14-4-4S).
  • FIG. 7 illustrates the increase in induction in vivo of the antico ⁇ s anti-diphtheria toxin response after injection into BALB / c mice of a non-covalent complex according to the invention: ZZ-DTR and antico ⁇ s anti-molecule MHC class II (14-4-4S); this figure has the protocols on the abscissa immunization and challenge and on the ordinate the reverse of the title in antico ⁇ s diphtheria antitoxin.
  • Example 1 In vitro increase in presentation to T cells by a non-covalent complex according to the invention ZZ-toxin ⁇ and anti-MHC antibody.
  • erabutoxin a and toxin ⁇ were purified respectively from the venoms of Laticauda semifasciata and Naja nigricollis, as described in Fryklund L. et al. (Biochem, 1975, 14, 2865). The purity of the toxin is checked using a reverse phase HPLC.
  • the Na toxin nigricollis ⁇ toxin was expressed, fused with the ZZ fragment, using a synthetic gene of 195 bp constructed from 10 oligomers having sizes ranging from 26 to 61 nucleotides according to standard procedures (J. Sambrook et al. , 1989, Cold Spring Harbor, Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
  • Both the secretion vectors and the expression vectors are Pharmacia vectors.
  • the fusion proteins are purified as described in F. Ducancel et al., 1989, and L. Pillet et al., 1993, cited above. * T cell stimulation test
  • T cell hybridomas the different antigens are serially diluted in microculture wells and 5.10 4 of T1B2 cell hybridomas are added. teas per well with antigen presenting cells, ie 5.10 4 cells
  • A20 i.e. with 5.10 5 splenocytes.
  • the cells are cultured for 24 hours at 37 ° C. in a humidified atmosphere containing 7% CO 2 .
  • the presence of IL-2 in the culture supernatants of T cell hybridomas and the mass cultures is evaluated by determining the proliferation of a cytotoxic LL-2 dependent T cell line, using methyl H thymidine,
  • the hybridoma B producing the anti-CMH antico ⁇ s 14-4-4S was obtained by K. OZATO ⁇ J. Immunol, 1980, 124, 533) and is available under the number ATCC HB-32;
  • a non-covalent complex according to the invention comprising a ZZ-toxin conjugate and a monoclonal antico ⁇ s 14-4-4S, which specifically recognizes the substance IE d of class II of the major murine histocompatibility complex, is evaluated for its presentation capacity. to T cells in vitro.
  • the ZZ-toxin / 14-4-4S complex is 10 "and 10 times more powerful, respectively, in stimulating T1B2 cells compared to an incubated ZZ-toxin conjugate. alone and with non-fused toxin. Similar results are obtained using splenocytes such as CPAg ( Figure IB). No increase in immunogenicity is observed when the unfused toxin is incubated either with the free ZZ domain or with the antico l'ants 14-4-4S (FIGS. 1A and B).
  • Example 2 Production of antibodies in vivo, in the absence of adjuvants, with a non-covalent complex according to the invention ZZ- ⁇ toxin and anti-MHC antibody.
  • BALB / c mice (LFFA CREDO, France) are injected, at the base of the tail, 100 ⁇ l of an emulsion d complete Freund's adjuvants containing 0.5 nmole, either of toxin ⁇ or of ZZ- ⁇ .
  • mice BALB / c mice are injected, at the base of the tail, with 100 ⁇ l of a 0.1 M phosphate buffer solution, pH 7.2 containing 0.1 nmole of ZZ- ⁇ or of complex ZZ- ⁇ 14-4-4S. Blood samples are taken 7, 14 and 26 days after immunization. * T cell stimulation test
  • the test carried out corresponds to the protocol described in M. Léonetti et al. (J. Immunol, 1990, 145, 4214). More specifically, the spleens are removed and suspended in a proliferation medium.
  • the cells (10 6 cells / well) are cultured for 24 hours at 37 ° C. in a humid atmosphere at 7% CO 2 with serial dilutions of antigens.
  • the presence of IL-2 in mass culture supernatants is evaluated by determining the proliferation of an IL-2 dependent cytotoxic T cell line, using methyl H thymidine, 5 Ci / mmol. The data are expressed in cpm, under the conditions specified above.
  • the titer is defined as being the highest dilution of serum giving a difference in absorbance compared to the negative control greater than or equal to 0.6.
  • a pool of sera collected before the immunization of the mice is used.
  • Antico ⁇ s 14-4-4S is incubated with the ZZ-toxin conjugate and injected into the BALB / c mouse. Immunizations are performed in the absence of adjuvants. One week after immunization, an immune response is observed, which gradually increases over the following 3 weeks ( Figure 2).
  • FIG. 4 shows a remarkable increase in the presentation to T cells of both the toxin ⁇ (FIG. 4A) and the erabutoxin a (FIG. 4B).
  • the ZZ-toxin / antico ⁇ s complex is more powerful in stimulating T1B2 cells than a ZZ-toxin conjugate incubated alone or than the free toxin.
  • the ZZ-Ea / antico ⁇ s complex is as effective as the protein A-Ea / antico ⁇ s complex, in stimulating T1B2 cells (FIG. 4B).
  • Example 4 In vitro increase in presentation to T cells by a non-covalent complex according to the invention ZZ-toxin ⁇ and anti-IgM antibodies. The conditions are identical to those set out in Example 1. The results are illustrated in FIG. 5. As can be seen in this figure, the incubation of rabbit antico ⁇ s anti mouse IgM ⁇ (Jackson product), in the presence of ZZ- ⁇ conjugate considerably increases the stimulating power T of the toxin. Indeed, this complex is respectively 45 times and 800 times more effective than the ZZ- ⁇ conjugate incubated alone and that the toxin ⁇ incubated alone.
  • EXAMPLE 5 Increase in the induction in vivo of T helper cells specific for alpha toxin by a series of non-covalent complexes according to the inventions ZZ-toxin ⁇ and anti-IgM antibodies (RAM ⁇ ), ZZ-toxin ⁇ and anti antibodies - IgGF (ab ') 2 (RAMF (ab') 2), ZZ-toxin ⁇ and anti-HCM antibody (14-4-4S).
  • a series of non-covalent complexes has been prepared to assess whether some of them are capable of increasing the induction of T helper cells specific for alpha toxin in vivo.
  • ZZ- ⁇ was respectively complexed with the following antibodies: mouse IgG2a, anti-mouse rabbit antibodies specific for the ⁇ chain of IgM (RAM ⁇ ) (Jackson product), anti-mouse rabbit antibodies specific for the F region (ab ') 2 IgG (RAMF (ab')) (Jackson product), rabbit antico ⁇ s (IgG) (SIGMA product), and MHC class II anti-molecule (14-4-4S).
  • Different batches of BALB / c mice are then injected, in the absence of an adjuvant, with the ZZ- ⁇ hybrid alone or complexed with the above-mentioned antico ⁇ s.
  • the induction of helper T cells, specific for the toxin ⁇ in vivo, is evaluated 36 days later.
  • the rats of the animals are collected and the spleen cells are incubated for 24 hours at 37 ° C. with the native alpha toxin (1 ⁇ M final), the peptide 24-41, which is the immuno-dominant T peptide of the toxin. alpha (1.5 ⁇ M final), or the chicken egg lysozyme (1 ⁇ M final).
  • the presence of interleukin 2 in the culture supernatants is then tested by measuring their capacity to stimulate the inco ⁇ oration of tritiated thymidine in a JJL2-dependent line.
  • a ZZ-DTR fusion protein is prepared in which ZZ has the same meaning as above and DTR corresponds to fragment 382-535 of the diphtheria toxin (DT) sequence, comprising the domain R (MJ BENNETT et al., Protein Sel, 1994, 3, 1444-1463; MJ BENNETT et al., Protein Sci., 1994, 3, 1464-1475; JM. ROLF et al., 1993, Infect. Immun ., 1993, 61, 994-1003; JM. ROLF et al., Mol. Microbiol, 1993, 7, 585-591).
  • DT diphtheria toxin
  • the diphtheria toxin receptor domain (DTR), corresponding to amino acids 382-535, was expressed, fused with the ZZ fragment.
  • DTR diphtheria toxin receptor domain
  • sequence coding for the DTR fragment was amplified by PCR, using the plasmid pK5DT, coding for diphtheria toxin, as template.
  • the amplified fragment was cloned into the plasmid pCP (P. Drevet et al., Protein Expression Purif., 1997, 10, 293-300).
  • This plasmid allows the production of a ZZ-DTR protein in the cytoplasm.
  • Plasmid pK5DT is used as template and the following oligonucleotides are used as primers: Sali site: 5'GGGACTGCAGGTACCGTCGACGCCGGGTCACA AAACGCAA3 'BamHI site: 5'GGGACTGCAGGATCCTTATAAGCTTCCGCTT TTGATTTCAAAAAATAG3.
  • the oligonucleotides were designed to adjust the reading frame of the DT domain with that of the ZZ fragment.
  • the SalI and BamHI sites are used to subclone the DTR fragment amplified in M13mP18, in which it has been sequenced.
  • the DTR fragment is then excised using the enzymes Sac1 and BamHI and introduced into the vector pCP (P. Drevet et al., Protein Expression Purif., 1997, 10, 293-300).
  • E. coli BL21 (D ⁇ 3) Lys bacteria are used to express the ZZ-DTR protein.
  • Transformed cells are cultured in 100 ml of Broth medium (trypsinized soybeans, Difco) supplemented with glucose (5 g / liter), ampicillin (200 mg / ml) and chloramphenicol (30 mg / ml).
  • Broth medium trypsinized soybeans, Difco
  • glucose 5 g / liter
  • ampicillin 200 mg / ml
  • chloramphenicol 30 mg / ml
  • 60 ml of cells incubated overnight at 37 ° C. are used to inoculate a fermenter comprising 3 l of the same medium as that of the preculture.
  • the cells are incubated at 37 ° C. with aeration until an optical density at 600 nm of between 0.5 and 1 is obtained.
  • ÎTPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • the cells are recovered by centrifugation (5,000 xg for 15 min), resuspended in a lysis buffer (Tris 30 mM, mDTA 5 mM, glucose 20%, pH 8) and exploded with a ⁇ aton press.
  • the supernatant containing the fusion protein is purified on an IgG-Sepharose 4B column (Pharmacia Biotech); 10 ml of crude extract are incubated overnight at 4 ° C with 10 ml of IgG-Sepharose balanced with a buffer comprising: 50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl and 0.05% Tween 20.
  • the fraction containing the ZZ-DTR protein is concentrated to 4 mg / ml by ultrafiltration on Microsop 30 (Filtron). Results
  • the response in anti-diphtheria toxin antibodies is increased when BALB / c mice are pre-simulated with the non-covalent complex according to the invention ZZ-DTR and anti-MHC class II molecule antibodies (14-4-4S).
  • the ZZ-DTR fusion protein is complexed with the MHC class H (14-4-4S) antimolecule antico ⁇ s.
  • Different batches of BALB / c mice are then injected either with physiological saline, or with physiological saline containing the non-covalent complex (0.01 nmole per mouse), or with physiological saline containing ZZ-DTR alone (0.01 nmol by mouse).
  • a challenge is achieved 31 days later by the injection of a mutant of the diphtheria toxin CRM197 (Mekada et al., J. Biol Chem., 1985, 260, 12148-12153) (SIGMA product) (0, 1 nmol per mouse).
  • SIGMA product diphtheria toxin CRM197
  • the blood of the animals is taken 14 days later and the presence of anti-diphtheria toxin antibodies in the sera is evaluated by an immunoenzymatic assay test.
  • a single injection of non-covalent complex 14-4-4SZZ-DTR / 0
  • the animals pre-simulated with 14-4-4SZZ-DTR (14-4-4SZZ-DTR / CRM197) have a titre of anti-diphtheria toxin antibodies 8 to 10 times higher than that animals pre-simulated with ZZ-DTR alone (ZZ-DTR / CRM197) or injected with physiological saline (0 / CRM197).
  • the non-covalent complex therefore constitutes an immunogen making it possible to increase the antico ⁇ s anti-diphtheria toxin response during a challenge with a mutant of the diphtheria toxin.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Complexe non-covalent comprenant au moins un anticorps ou un fragment d'anticorps capable de se lier à une molécule exprimée à la surface d'une cellule et un élément de liaison aux immunoglobulines (Igs), associé à une substance active, ledit complexe ayant une affinité spécifique vis-à-vis de cellules cibles appropriées. Compositions contenant lesdits complexes et leurs applications. Ledit complexe non-covalent comprend (i) au moins un anticorps ou un fragment d'anticorps capable de se lier à une molécule exprimée à la surface d'une cellule et (ii) un élément de liaison à une immunoglobuline ou à un fragment d'immunoglobuline, associé à une substance active, lequel élément de liaison ne peut se lier qu'à un seul type de site sur l'immunoglobuline.

Description

COMPLEXE NON-COVALENT COMPRENANT AU MOINS UN ANTICORPS ET UN ELEMENT DE LIAISON AUX IMMUNOGLOBULINES ASSOCIE A UNE SUBSTANCE ACTIVE, SON PROCEDE DE PREPARATION ET SES APPLICATIONS. La présente invention est relative à un complexe non-covalent comprenant au moins un anticorps ou un fragment d'anticorps capable de se lier à une molécule exprimée à la surface d'une cellule et un élément de liaison aux immuno- globulines (Igs), associé à une substance active, ledit complexe ayant une affinité spécifique vis-à-vis de cellules cibles appropriées. L'invention est également relative à des compositions contenant lesdits complexes et à leurs applications.
Le transport de molécules ou substances actives au niveau de sites biologiques particuliers, organes ou cellules cibles, confère à ces substances, une efficacité améliorée et une toxicité moindre, pour l'organisme. Un tel processus est dénommé ci-après ciblage et correspond au transport de la substance active vers son site d'action préférentiel.
On obtient, selon le type de substance active, des complexes immunogènes (substance active : antigène ou immunogène), des complexes cyto- toxiques (substance active : drogue) ou des complexes d'expression permettant le transfert d'un gène dans une cellule cible et son expression dans cette cellule
(substance active : fragment d'acide nucléique (ADN ou ARN)).
Des systèmes de ciblage ont déjà été proposés. Par exemple :
- dans le cas où la substance active est un antigène, il a déjà été proposé d'améliorer la réponse immune in vivo, en intervenant notamment au niveau de la présentation de l'antigène aux cellules T par les cellules présentatrices d'antigènes (CPAg ou APC, pour Antigen Presenting Cell), telles que les cellules B, les cellules dendri tiques ou les macrophages, notamment à l'aide de conjugués covalents, qui améliorent la réponse immune in vivo :
* coniupués covalents augmentant la réponse immune. en l'absence d' adjuvants :
- dans le Brevet US 5,283,323 au nom de Berzofsky et al., il a été proposé de cibler l'antigène vers le système immun, au niveau de la stimulation des cellules T, en utilisant comme composition immunogène, un conjugué covalent antigène-anticorps anti-Ig, qui se lie aux Igs de surface des cellules B.
Ce conjugué permet notamment d'obtenir la stimulation des cellules T in vitro, avec des concentrations en antigène, inférieures d'un facteur dix par rapport à celles utilisées avec l'antigène seul ;
- dans la Demande européenne 245 078, au nom de Connaught Laboratories Lim., un conjugué utilisable dans une nouvelle procédure d'immunisation in vivo est décrit et comprend un antigène couplé à un anticorps spécifique de la structure de surface des cellules présentatrices de l'antigène et notamment un anticorps anti-molécule du CMH de classe H. L'anticorps et l'antigène sont couplés par l'avidine et la biotine : les anticorps sont biotinylés et l'avidine est couplée à l'antigène.
De tels conjugués permettent d'augmenter l'immunogénicité des antigènes présentant naturellement une faible immunogénicité, et sont particulièrement intéressants pour les petits peptides.
* conjugués covalents augmentant la réponse immune. en présence d' adjuvants :
- la Demande de Brevet Européen 243 333 au nom de KabiGen AB décrit un conjugué covalent antigène - protéine de liaison aux Igs (protéine de fusion), dans lequel la protéine de liaison aux IgGs est l'une des protéines suivantes : protéine A, fragment Z de protéine A ou protéine G, pour permettre la production d'anticorps ou l'augmenter ; toutefois, pour générer des anticorps, cette composition est émulsifiée dans l'adjuvant complet de Freund.
* d'autres conjugués covalents ont également été décrits : ils ne modifient pas la spécificité de l'anticorps et/ou l'activité du conjugué : le Brevet US
5,204,449 au nom de Puri, par exemple, décrit ainsi un conjugué antigène-anticorps comprenant au moins un antigène et au moins un anticorps ayant une spécificité pour le CMH de classe I ou de classe IL dans lequel l'antigène et l'anticorps peuvent être couplés chimiquement comme suit : (i) l'anticorps monoclonal peut être modifié par oxydation de ses carbohydrates ; (ii) couplage à l'aide du système avidine-biotine ; (iii) couplage d'un antigène possédant un groupe hydrazide et d'un anticorps monoclonal oxydé, porteur de groupes aldéhydes ; (iv) couplage par l'intermédiaire de la protéine A : dans ce cas, soit l'antigène est lié chimiquement à la protéine A qui présente une affinité pour la portion Fc de l'anticorps, ce qui permet une liaison de forte affinité protéine A-anticorps, avec un minimum de perte de l'activité de l'anticorps ; soit l'antigène porteur d'un groupe hydrazide est lié chimiquement à la protéine A et l'anticorps est oxydé,
- dans le cas où la substance active est une drogue, notamment une toxine, de nombreux conjugués anticorps spécifiques d'un type de cellules-substance active (agent capable de détruire la cellule) ont été décrits. En général, un anticorps monoclonal est préparé de manière à avoir une spécificité pour un antigène pré- sent à la surface de la cellule cible, de telle sorte que l'anticorps monoclonal se liera à la cellule cible et lorsqu'il sera incorporé dans ladite cellule, il transportera son conjugué toxique à l'intérieur de cette dernière. Outre la ricine, d'autres agents peuvent être incorporés dans les immunotoxines ; on peut citer notamment, les toxines bactériennes, végétales ou animales (ou leurs fragments actifs), les atomes radioactifs et des agents utilisés en chimiothérapie anticancéreuse (substances chimiques telles que les anthracyclines, substances modifiant le métabolisme des cellules cancéreuses, telles que des séquences nucléotidiques exprimant une protéine et séquences nucléotidiques anti-sens). Dans tous les cas, les immunotoxines ainsi constituées, dirigent la substance active (la toxine ou l' anticancéreux) vers le domaine pathologique et conduisent ainsi à l'élimination des cellules cibles.
D'autres complexes cytotoxiques ont également été décrits ; dans la Demande Internationale PCT WO 83/04026, par exemple, un agent cytotoxique comprenant la protéine A du staphylocoque couplée chimiquement au fragment A de la toxine de ricin est plus particulièrement décrit. Toutefois, cet agent, pour fonctionner, nécessite un traitement préalable par des anticorps, des cellules cibles in vitro, ce qui est difficilement envisageable dans le cadre d'un traitement thérapeutique.
- dans le cas où la substance active est une séquence nucléique, des conjugués covalents comprenant des anticorps dirigés contre la protéine d'enveloppe retrovirale gp70 biotinylés et des conjugués anticorps dirigés contre des marqueurs cellulaires spécifiques biotinylés sont reliés par de la streptavidine et sont utilisés pour infecter des cellules par un rétrovirus recombinant, portant un gène recombinant, ont été, par exemple décrits (P. Roux et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 9079- 9083).
Toutefois, les conjugués covalents de l'Art antérieur ne sont pas adaptés à n'importe quelle situation ; en effet, il est intéressant de disposer d'une structure qui soit suffisamment souple pour pouvoir s'adapter à n'importe quelle substance active et à n'importe quelle cible, ce qui n'est pas le cas des conjugués covalents selon l'art antérieur.
C'est pourquoi la Demanderesse s'est donné pour but de pourvoir à un complexe non-covalent, apte à augmenter la concentration locale d'une molécule ou substance active au niveau de sa cellule cible, qui réponde mieux aux besoins de la pratique que les conjugués covalents décrits dans l'art antérieur, notamment en ce qu'il constitue un système plus simple que les systèmes covalents de l'art antérieur, plus souple à mettre en œuvre et est en outre plus stable au stockage ; de tels complexes présentent, en effet, l'avantage sur les complexes covalents de l'art anté- rieur de pouvoir être mis en œuvre, non seulement dans le domaine de l'immunologie (compositions immunogènes et vaccinantes) mais également dans d'autres domaines, tels que la cancérologie (compositions cytotoxiques) ou l'expression des protéines (compositions stimulants l'expression des transgènes) et dans tous les cas, d'agir uniquement au niveau de sa cible spécifique, de manière significative, à des doses infé- rieures à celles habituellement utilisées. En outre, de tels systèmes sont particulièrement adaptés, lorsque la substance active est une séquence d'ADN, associée à un vecteur vivant (bactérie, virus...).
La présente invention a pour objet un complexe non-covalent, caractérisé en ce qu'il comprend (i) au moins un anticorps ou un fragment d'anticorps, capable de se lier à une molécule exprimée à la surface d'une cellule et (ii) un élément de liaison à une immunoglobuline ou à un fragment d' immunoglobuline, associé à une substance active, lequel élément de liaison ne peut se lier qu'à un seul type de site ou région sur l' immunoglobuline (Ig), tel qu'un site Fc ou un site Fab.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit complexe non- covalent, ledit anticorps est dirigé contre une molécule exprimée à la surface des cellules présentatrices de l'antigène (CPAg), sélectionnée dans le groupe constitué notamment par les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH), les immunoglobulines, les récepteurs de la transferrine ou les récepteurs du mannose (macrophage).
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit anticorps est sélectionné dans le groupe constitué par les anticorps anti-molécule du CMH de classe H, les anticorps .anti-IgM et les anticorps anti-IgG dirigés contre la région F(ab')2 d'une Ig.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit complexe non- covalent, ledit anticorps est dirigé contre une molécule exprimée à la surface de cellules cancéreuses. Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit complexe non- covalent, ledit anticorps ou fragment d'anticorps est dirigé contre une molécule exprimée à la surface des cellules mucosales ou des cellules musculaires.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit complexe non- covalent, ledit anticorps ou fragment d'anticorps est apte à se lier aux cellules expri- mant un récepteur Fc à leur surface.
De tels anticorps peuvent avantageusement être mis en oeuvre dans des complexes immunogènes selon l'invention.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit complexe non- covalent selon l'invention, l'élément de liaison aux immunoglobulines est sélectionné dans le groupe constitué par des protéines ou des fragments de protéines de liaison aux immunoglobulines qui ne se lient que dans la région Fc d'une immunoglobuline (IgG, IgM, IgA, IgE ou IgD, par exemple), et sont issus de bactéries. Ces protéines ou fragments de protéines peuvent être moins affins que la protéine A de Staphylococcus aureus, comme le fragment ZZ. Ces protéines ou fragments de protéines peuvent être un fragment de protéine A d'au moins huit aminoacides (P.K. Ray et al., Indian J. Biochem. Biophys., 1995, 32, 372-377), des protéines ou fragments de protéines de type IL issus des streptocoques de groupe A, des protéines ou fragments de protéines de type LLL issus de streptocoques de groupe C, de groupe G ou de groupe L, tel que la protéine G, de préférence recombinante ou un de ses fragments peptidiques, des protéines ou fragments de protéines de type IV, issus du streptocoque de groupe G bovin, des protéines ou fragments de protéines de type V ou de type VL issus de Streptococcus zooepidemicus ou toute autre protéine ou fragment de protéine, issus de bactéries, de protozoaires ou de virus et se liant dans la région Fc d'une Ig.
La protéine A comprend cinq domaines différents de liaison aux Igs, à savoir les domaines E, D, A, B, et C ((M. Uhlen et al., J. Biol. Chem., 1984, 259, 3, 1695-1702). Le fragment Z est dérivé du domaine B de la protéine A par substitution de la séquence Asn-Gly par la séquence Asn-Ala ; le fragment ZZ comprend deux séquences Z. La liaison du fragment ZZ aux immunoglobulines a plus particulièrement été étudiée par U.K Ljungberg et al. {Mol. Immunol, 1993, 30, 4, 1279-1285) et notamment ses capacités de liaison et ses affinités, comparées à celles de la protéine A : la constante d'affinité du fragment ZZ pour les IgG est de 4,8.10"8 M"1, déterminée par saturation et de 4,3.10"8 M"1, déterminée par compétition, alors que celle de la protéine A est de 26.10"8 M"1, par saturation et de 25.10"8 M"1, par compétition.
Le fragment ZZ présente un certain nombre d'avantages par rapport à la protéine A complète : bien qu'il présente une affinité significativement moindre pour le site Fc des IgG, d'environ un facteur 5, il permet d'obtenir un ciblage in vitro aussi efficace que celui qui serait obtenu, en présence de protéine A. De plus, et de manière surprenante, in vivo, bien que l'affinité de liaison du fragment ZZ pour les IgG soit faible, les IgG endogènes ne semblent pas perturber sa liaison avec l'anticorps anti-molécule du CMH ; en outre, du fait qu'il ne se lie qu'au site Fc, il ne déclenche pas les activités biologiques de la protéine A qui se lie à la fois au site Fc et au site Fab, telles que l'activation du complément et précipitation des anticorps en réseau (J.J. Langone, Advances in Immunology, 1982, 32, en particulier les pages 211-215 ; A. Grov et al., Acta Path. Microbiol. Scan. Sect. C, 1976, 84, 333-336 ; C. Endresen, Acta Path. Microbiol. Scan. Sect. C, 1979, 87, 185-189). Bien que le fragment ZZ soit moins affin que la protéine A, il présente le même niveau de présentation, à concentration égale et il fournit un ciblage aussi efficace ; il fonctionne donc in vivo, malgré une compétitivité possible avec les Ig endogènes.
La protéine G (type LLI) présente 3 domaines différents de liaison aux Igs, à savoir les domaines A, B et C (M. Erntell et al., Mol. Immunol, 1988, 25, 2, 121-126 ; M. Eliasson et al., Mol. Immunol, 1991, 28, 10, 1055-1061). Les protéines de liaison aux Ig, issues de bactéries de type H, IV, V ou VI et se liant préférentiellement dans la région Fc d'une Ig, sont plus particulièrement décrites dans Bacterial Immunoglobulins binding proteins, Vol 1 , 1990, Académie Press Inc., Ed. Michael D.P. Boyle, par exemple la protéine Arp des strep- tocoques de groupe A ou la protéine β des streptocoques de groupe B se lient de préférence dans la région Fc des IgA ; des fragments issus de Branhamella catarrhalis, Haemophilus influenzae et des streptocoques de groupe A, B, C et D, se lient de préférence dans la région Fc des IgD.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit complexe non- covalent selon l'invention, l'élément de liaison aux immunoglobulines est sélectionné dans le groupe constitué par des protéines ou des fragments de protéines de liaison aux immunoglobulines qui ne se lient que dans la région Fab d'une Ig (IgG, IgM, IgA, IgE ou IgD, par exemple) et sont issus de bactéries tels que la protéine L de Peptostrepto- coccus magnus, un fragment de protéine A comprenant au moins l'un des domaines suivants A, B, C, D et/ou E, la protéine G, de préférence recombinante ou un fragment de protéine G, la protéine P ou un fragment de protéine P de Clostridium perfringens, ou toute autre protéine ou fragment de protéine, issus de bactéries, de protozoaires ou de virus et se liant dans la région Fab d'une Ig.
La protéine L de Peptostreptococcus magnus se lie de préférence à la chaîne légère de la région Fab (B.H. Nilson et al., J. Biol. Chem., 1992, 267, 4, 2234- 2239).
Ces différents fragments peptidiques sont notamment décrits dans l'ouvrage Bacterial Immunoglobulins binding proteins, 1990, précité.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit complexe non- covalent selon l'invention, la substance active est sélectionnée dans le groupe constitué par les antigènes d'intérêt, les drogues et les fragments d'acide nucléique d'intérêt (ADN ou ARN).
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, lorsque la substance active est un antigène ou un immunogène, le complexe non-covalent selon l'invention comprend (i) un anticorps ou un fragment d'anticorps dirigé contre une molécule exprimée à la surface d'une cellule présentatrice d'antigène, notamment un anticorps anti-molécule du CMH, un anticorps anti-IgM ou un anticorps anti-IgG dirigé contre la région F(ab')2 d'une Ig et (ii) un élément de liaison aux immunoglobulines tel que défini ci-dessus, associé à un antigène.
Selon une modalité avantageuse de cette disposition, ledit complexe comprend (i) un anticorps anti-molécule du CMH de classe H et (ii) une protéine ou un fragment d'une protéine de liaison au Fc des Ig, moins affin que la protéine A, notamment le fragment ZZ de protéine A conjugué à un antigène, de préférence sous la forme d'une protéine de fusion.
De manière surprenante, un complexe non-covalent ZZ-anti- gène/anticorps anti-molécule du CMH de classe II est suffisamment stable et entraîne : . in vitro, une réponse immune avec des quantités d'antigène signifi- cativement inférieures à celles provoquant habituellement une réponse immune (stimulation des cellules T) ; la diminution de la quantité d'antigène est comprise entre un facteur 102 (par rapport au conjugué ZZ-antigène ) et un facteur 105 (par rapport à l'antigène non conjugué), pour l'obtention d'un même niveau de réponse ; . in vivo, la production d'anticorps spécifiques et l'induction d'une réponse T (stimulation des cellules T auxiliaires spécifiques), en l'absence d'un quelconque adjuvant, alors que cela n'est pas possible avec le conjugué ZZ-antigène ;
. une relation entre la stimulation T in vitro et la production d'anticorps in vivo. Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, lorsque la substance active est une drogue, le complexe non-covalent selon l'invention comprend (i) un anticorps ou un fragment d'anticorps dirigé contre une molécule exprimée à la surface d'une cellule cible (α-fœtoprotéine, pour les cellules cancéreuses, par exemple) et (ii) un élément de liaison aux immunoglobulines, tel que défini ci-dessus, associé à une drogue qui peut notamment être sélectionnée parmi les substances chimiques cytotoxiques, les toxines (animales, végétales ou bactériennes), les haptènes et les séquences nucléotidiques anti-sens.
De manière surprenante, de tels complexes non-covalents selon l'invention n'induisent aucune réponse immunitaire contre l'haptène par exemple, suite à leur injection chez l'animal.
Ce résultat indique que l'anticorps et l'élément de liaison aux immunoglobulines n'induisent pas de réponse immunitaire contre l'haptène ; il en résulte que l'élément de liaison aux immunoglobulines ne se comporte donc pas comme une « protéine porteuse classique ». Ceci implique :
- que l'on peut accroître l'efficacité d'action d'une substance médicamenteuse de type hapténique (la majorité des médicaments sont des haptènes) en la couplant à un anticoφs dirigé contre sa cible physiologique, sans induire une réponse immunitaire contre l'haptène, avec un complexe non-covalent selon l'invention.
De tels complexes non-covalents selon l'invention peuvent donc être utilisés pour améliorer l'efficacité d'un médicament sans risque de réaction immunitaire inappropriée. Selon encore une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, lorsque la substance active est un acide nucléique, le complexe non-covalent selon l'invention comprend (i) un anticoφs ou un fragment d'anticoφs dirigé contre une molécule exprimée à la surface d'une cellule cible et (ii) un élément de liaison aux immunoglobulines, tel que défini ci-dessus, associé à un acide nucléique. Les complexes non-covalents selon l'invention présentent un certain nombre d'avantages par rapport aux conjugués covalents de l'art antérieur :
- de manière générale, ils constituent des systèmes versatiles et souples, du fait que l'élément de liaison associé à la substance active peut être associé à n'importe quel anticoφs, en fonction de l'application recherchée ; ceci représente une grande différence par rapport aux systèmes covalents, plus rigides ; en outre, ils présentent un plus grande stabilité au stockage et peuvent avantageusement se présenter en deux flacons séparés ;
- ils permettent un ciblage efficace de la substance active pour augmenter la concentration locale de la substance active à un endroit donné et éventuelle- ment son endocytose par une cellule cible ;
- dans le cas où la substance active est un antigène ou un immuno- gène, le complexe non-covalent selon l'invention est apte in vitro : à stimuler les lymphocytes T auxiliaires spécifique dudit antigène et in vivo : à augmenter spécifiquement la réponse T auxiliaire et à induire la production d'anticoφs et la réponse T cytotoxique et ce, en l'absence d'adjuvant. L'augmentation de la stimulation des lymphocytes T auxiliaires peut dans certaines conditions d'injection induire leur anergie (stade de non-réponse) et diminuer, voire annuler une réponse immunitaire inappropriée, telle qu'une réaction allergique ou autoimmune ;
- dans le cas où la substance active est une drogue, le complexe non- covalent selon l'invention est apte à améliorer le pouvoir cytotoxique de ladite drogue (action uniquement au niveau des cibles spécifiques et promotion de l'endocytose) ;
- dans le cas où la substance active est un acide nucléique, le complexe non-covalent selon l'invention est apte à améliorer l'expression des transgènes.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'élément de liai- son aux immunoglobulines est conjugué de manière covalente à ladite substance active.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'élément de liaison aux immunoglobulines est associé à ladite substance par l'intermédiaire d'un vecteur. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit vecteur est sélectionné dans le groupe constitué par des bactéries, des virus, des particules virales « coque vide », des liposomes et des microsphères polymériques.
La présente invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques comprenant un complexe non-covalent selon l'invention et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Parmi ces compositions, on peut citer :
. une composition immunogène ou une composition vaccinale comprenant un complexe non-covalent selon l'invention, dans lequel la substance active est un antigène ou un immunogène.
Les compositions vaccinales présentent un certain nombre d'avantages.
En effet, lors d'une vaccination, il importe que la réponse immunitaire soit dirigée contre la protéine immunisante et induite par cette même protéine (car ce sont les lymphocytes T et B spécifiques de cette protéine qui seront ensuite recrutés lors de la contamination par l'agent infectieux, pas ceux spécifiques de l'anticoφs et de l'élément de liaison aux immunoglobulines contenus dans le complexe non-covalent). L'absence de réponse immunitaire contre une substance active de type hapténique indique clairement que l'anticoφs et l'élément de liaison aux immunoglobulines ne peuvent induire une réponse immunitaire contre la substance active et contribuent uniquement à son ciblage. Lorsque la substance active est une protéine, les complexes non covalents seront donc particulièrement adaptés puisque la réponse immunitaire dirigée contre la protéine immunisante sera induite par cette même protéine.
. une composition cytotoxique comprenant un complexe non- covalent selon l'invention, dans lequel la substance active est une drogue ; et
. une composition d'expression comprenant un complexe non- covalent selon l'invention, dans lequel la substance active est une séquence d'acide nucléique.
De manière suφrenante, aussi bien les compositions immunogènes que les compositions vaccinales selon l'invention peuvent accroître la production d'anticoφs spécifiques, la stimulation des cellules T auxiliaires spécifiques et la stimulation des cellules T cytotoxiques spécifiques. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un complexe non-covalent selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend :
. la préparation d'un élément de liaison aux immunoglobulines, associé à une substance active et
. l'incubation dudit élément de liaison aux immunoglobulines, asso- cié à une substance active avec un anticoφs capable de se lier à une molécule exprimée à la surface d'une cellule, de préférence entre 10 minutes et 3 heures.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels :
- la figure 1 illustre la stimulation de cellules T (cellules dénommées T1B2) par la protéine de fusion ZZ-toxine α de Naja nigricollis (-O-, -•-) ou la toxine α (-D-, ->-), en présence (complexe selon l'invention : -•-, simple mélanges des différents éléments, la toxine α n'étant pas conjuguée à ZZ : -B-) ou en l'absence (-0-,-D-) d'anticoφs anti-CMH de classe II, dénommés 14-4-4S ; les dilutions en série des différentes protéines sont réincubées une nuit dans des puits à 4°C, avec ou sans anticoφs 14-4-4S et les cellules T1B2 et les CPAg sont alors ajoutées. Figure 1A : 5.105 splénocytes sont utilisés comme CPAg ; figure 1B : 5.104 cellules A20 sont utilisées comme CPAg. La stimulation des cellules T est appréciée par le biais de la sécrétion d'interleukine-2 (LL-2), déterminée par la prolifération d'une lignée cellulaires T cytotoxique dépendante de l'LL-2 (test CTLL), en utilisant de la méthyl-3H thymidine, 5 Ci/mmole, CEA, France) ; les données sont exprimées en cpm (ordonnées) et correspondent à l'incoφoration de thymidine tritiée dans les cellules : les figures 1A et 1B comprennent en abscisse les concentrations (μM) en toxine α libre ou conjuguée à ZZ (ZZ-toxine α).
- la figure 2 illustre la réponse en anticoφs anti-toxine de souris BALB/c, immunisées soit avec le conjugué ZZ-α libre (-D-) ou le complexe ZZ-α anticoφs 14-4-4S (-•-). La protéine de fusion est incubée une nuit à 4°C avec ou sans anticoφs 14-4-4S. Des groupes de 4 souris sont alors immunisées par voie sous-cutanée, à la base de la queue, sans adjuvants. Les souris sont saignées 7, 14 et 26 jours après l'injection et la présence d'anticoφs anti-toxine est évaluée, conformément par ELISA ; cette figure comporte en ordonnée l'inverse du titre en anticoφs et en abscisse, le nombre de jours.
- la figure 3 illustre la réponse en anticoφs anti-toxine de souris BALB/c, immunisées soit avec la toxine α (-D-), soit avec la protéine de fusion ZZ-α (-•-). Des groupes de 4 souris sont immunisées par voie sous-cutanée, à la base de la queue, avec ces différentes protéines, préalablement mélangées avec de l'adjuvant de Freund complet. Les souris sont saignées 14 et 21 jours après l'injection et la présence d'anticoφs anti-toxine est évaluée par ELISA ; cette figure comporte en ordonnée, l'inverse du titre en anticoφs et en abscisse, le nombre de jours.
- la figure 4 illustre les résultats obtenus dans les mêmes conditions que celles de la figure 1. Des complexes protéines A-toxine α et anticoφs 14-4-4S ou un mélange toxine α, ZZ et anticoφs 14-4-4S sont comparés à des complexes selon l'invention ZZ-α et anticoφs 14-4-4S. La figure 4 A illustre les résultats obtenus avec toxine α seule (-D-), le mélange toxine α, ZZ et anticoφs 14-4-4S (la toxine α et le composé ZZ ne sont pas conjugués, -•-), toxine α + protéine A + anticoφs 14-4-4S (-O-) (la toxine α et la protéine A ne sont pas conjuguées), conjugué ZZ-α (-•-) et complexe selon l'invention ZZ-toxine α et anticoφs 14-4-4S (-Δ-) : les antigènes sont incubés une nuit à 4°C, puis les splénocytes (CPAg) et les cellules T1B2 sont ajoutés et incubés 24h à 37°C. La figure 4B illustre des essais du même type que ceux effectués à la figure 4A ; toutefois, l'antigène est dans ce cas l'érabutoxine a (Ea). Cette figure illustre les résultats obtenus avec l'Ea seule (-D-), un conjugué ZZ-Ea (-B-), un complexe selon l'invention ZZ-Ea + anticoφs 14-4-4S (-O-), un conjugué protéine A- Ea (-•-), un conjugué protéine A-Ea + anticoφs 14-4-4S (-Δ-), dans les mêmes conditions que celles exposées pour la figure 4A.
- la figure 5 illustre les résultats obtenus, dans les mêmes conditions que celles exposées pour la figure 1, l'anticoφs 14-4-4S étant remplacé par un anticoφs anti-IgM ; cette figure illustre la stimulation de cellules T (cellules dénommées T1B2) par la protéine de fusion ZZ-toxine α de Naja nigricollis (-O-*-) ou la toxine α (-D-, -B-), en présence (complexe selon l'invention : -•-, différents éléments en mélange : -M-) ou en l'absence (-0-,-D-) d'anticoφs anti-IgM (RAM-μ) ; les dilu- tions en série des différentes protéines sont réincubées une nuit dans des puits à 4°C, avec ou sans anticoφs RAM-μ et les cellules T1B2 et les CPAg sont alors ajoutées (5.105 splénocytes). La stimulation des cellules T est appréciée par le biais de la sécrétion d'interleukine-2 (IL-2), déterminée par la prolifération d'une lignée cellulaires T cytotoxique dépendante de l'LL-2 (test CTLL), en utilisant de la méthyl-3H thymidine, 5 Ci/mmole, CEA, France) ; les données sont exprimées en cpm (ordonnées) et correspondent à l'incoφoration de thymidine tritiée dans les cellules : en abscisse, sont représentées les concentrations (nM) en toxine α libre ou conjuguée à ZZ (ZZ-toxine α).
- la figure 6 illustre l'augmentation de l'induction in vivo des cellules T auxiliaires spécifiques de la toxine alpha par une série de complexes non-covalents selon l'invention ZZ-toxine α et anticoφs anti-IgM (RAMμ), ZZ-toxine α et anticoφs anti-IgGF(ab')2 (RAMF(ab')2), ZZ-toxine α et anticoφs antiCMH (14-4-4S).
- la figure 7 illustre l'augmentation de l'induction in vivo de la réponse anticoφs anti-toxine diphtérique après injection à des souris BALB/c d'un complexe non-covalent selon l'invention : ZZ-DTR et anticoφs anti-molécule du CMH de classe II (14-4-4S) ; cette figure comporte en abscisse les protocoles d'immunisation et de challenge et en ordonnée l'inverse du titre en anticoφs antitoxine diphtérique.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
Exemple 1 : Augmentation in vitro de la présentation aux cellules T par un complexe non-covalent selon l'invention ZZ-toxine α et anticorps anti-CMH.
Matériel et méthodes
* Protéines et peptides synthétiques : l'érabutoxine a et la toxine α ont été purifiées respectivement à partir des venins de Laticauda semifasciata et de Naja nigricollis, comme décrit dans Fryklund L. et al. {Biochem, 1975, 14, 2865). La pureté de la toxine est vérifiée à l'aide d'une HPLC en phase inverse.
* Construction, expression et purification des protéines de fusion L'ADNc codant pour l'érabutoxine a (Ea) du seφent Laticauda semifasciata a été clone et exprimé sous la forme d'une protéine de fusion, soit avec le fragment ZZ (B. Lowenadler et al., EMBO J, 1986, 5, 2393-2398), soit avec la protéine A.
Les procédures suivies pour construire et exprimer ces deux hybrides ont été décrites en détail dans F. Ducancel et al. {Prot. Engineer, 1989, 3, 139) et L. Pillet et al., (J. Biol Chem., 1993, 268, 909).
La toxine α de Naja nigricollis a été exprimée, fusionnée avec le fragment ZZ, en utilisant un gène synthétique de 195 pb construit à partir de 10 oligomères ayant des tailles allant de 26 à 61 nucléotides selon des procédures standards (J. Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor, Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Aussi bien les vecteurs de sécrétion que les vecteurs d'expression sont des vecteurs Pharmacia. Les protéines de fusion sont purifiées comme décrit dans F. Ducancel et al., 1989, et L. Pillet et al., 1993, précités. * Essai de stimulation des cellules T
Hybridomes de cellules T : les différents antigènes sont dilués en série dans des puits de microculture et 5.104 d'hybridomes de cellules T1B2 sont ajou- tés par puits avec comme cellules présentatrices de l'antigène, soit 5.104 de cellules
A20 , soit avec 5.105 splénocytes.
Les cellules sont mises en culture 24 heures à 37°C dans une atmosphère humidifiée contenant 7 % de CO2. La présence d'LL-2 dans les surnageants de culture des hybridomes de cellules T et les cultures en masse est évaluée en déterminant la prolifération d'une lignée de cellules T cytotoxique LL-2 dépendante, en utilisant la méthyle H thymidine,
5 Ci/mmole. Les données sont exprimées en cpm, selon le protocole décrit en détail dans M. Léonetti (J. Immunol.,1990, 145, 4214). * Cellules utilisées
- l'hybridome B produisant l'anticoφs anti-CMH 14-4-4S a été obtenu par K. OZATO {J. Immunol, 1980, 124, 533) et est disponible sous le n° ATCC HB-32 ;
- le lymphome B, appelé A20, a été obtenu par K.j. Kim ; la procé- dure suivie pour son obtention est décrite en détail dans J. Immunol., 1979, 122, 549 et est disponible sous le n° ATCC TLB-208 ;
- l'hybridome T, spécifique de la toxine α et de l'érabutoxine a, appelé T1B2, a été obtenu par B. Maillère ; la procédure suivie pour son obtention est décrite en détail dans J. Immunol., 1993, 150, 5270. Résultats
* Stimulation des lymphocytes T auxiliaires spécifiques de l'antigène in vitro
Un complexe non-covalent selon l'invention comprenant un conjugué ZZ-toxine et un anticoφs monoclonal 14-4-4S, qui reconnaît spécifiquement la substance I-Ed de classe II du complexe majeur d'histocompatibilité murin, est évalué pour sa capacité de présentation aux cellules T in vitro.
Comme illustré à la figure 1, une augmentation remarquable de la présentation aux cellules T de la toxine de fusion est observée. De manière plus précise, en utilisant des cellules A20 comme CPAg (figure 1A) le complexe ZZ- toxine/ 14-4-4S est respectivement 10" et 10 fois plus puissant pour stimuler les cellules T1B2 par rapport à un conjugué ZZ-toxine incubé seul et à la toxine non- fusionnée. Des résultats similaires sont obtenus en utilisant des splénocytes comme CPAg (figure IB). On n'observe pas d'augmentation de l'immunogénécité lorsque la toxine non-fusionnée est incubée soit avec le domaine ZZ libre, soit avec l'anticoφs 14-4-4S (figures 1A et B). Ces résultats montrent que l'augmentation importante d' immunogénicité observée avec le complexe selon l'invention ZZ-toxine et anticoφs 14-4-4S est associée à une capacité de l'anticoφs 14-4-4S à cibler le conjugué ZZ-toxine et donc la toxine elle-même vers la molécule de classe II du complexe majeur d'histocompatibilité.
Exemple 2 : Production d'anticorps in vivo, en l'absence d'adjuvants, avec un complexe non-covalent selon l'invention ZZ-toxine α et anticorps anti-CMH.
Matériel et méthodes
* Immunisation des souris
Pour l'évaluation de la réponse immune in vivo à la toxine α et au conjugué ZZ-α, on injecte à des souris BALB/c (LFFA CREDO, France), à la base de la queue, 100 μl d'une émulsion d'adjuvants de Freund complète contenant 0,5 nmole, soit de toxine α, soit de ZZ-α.
Des échantillons sanguins sont prélevés 14 et 21 jours après l'injection. Pour les expériences concernant les cellules T, les rates sont prélevées 10 jours après l'immunisation des souris. Pour l'évaluation de la réponse anticoφs contre le complexe 14-4-
4S/ZZ-α : on injecte à des souris BALB/c, à la base de la queue, 100 μl d'une solution de tampon phosphate 0,1 M, pH 7,2 contenant 0,1 nmole de ZZ-α ou de complexe ZZ- α 14-4-4S. Les échantillons sanguins sont prélevés 7, 14 et 26 jours après l'immunisation. * Test de stimulation des cellules T
Le test est réalisé dans les mêmes conditions que celles exposées à l'exemple 1.
Toutefois dans ce cas, ce sont les cellules de souris immunisées qui sont utilisées (culture en masse) : le test réalisé correspond au protocole décrit dans M. Léonetti et al. (J. Immunol, 1990, 145, 4214). Plus précisément, les rates sont prélevées et mises en suspension dans un milieu de prolifération. Les cellules (106 cellules/puits) sont mises en culture pendant 24 heures à 37°C dans une atmosphère humide à 7 % de CO2 avec des dilutions en série d'antigènes. La présence d'IL-2 dans les surnageants de culture en masse est évaluée en déterminant la prolifération d'une lignée de cellules T cytotoxique IL-2 dépendante, en utilisant la méthyle H thymidine, 5 Ci/mmole. Les données sont exprimées en cpm, dans les conditions précisées ci-dessus.
* Titration en anticoφs par immunoessai Des plaques de microtitration ELISA sont recouvertes avec de la toxine native (0,1 μg/puits) dans un tampon phosphate 0,05 M pH 7,4 et incubées une nuit à 4°C, puis saturées avec un tampon phosphate 0,1 M pH 7,4 contenant de la sérum albumine bovine à 0,3 . Les antisérums sont dilués en série dans le même tampon contenant de la sérum albumine bovine à 0, 1 % et incubés une nuit à 4°C. La liaison des anticoφs est évaluée en utilisant un conjugué anticoφs de chèvre anti-souris-peroxydase et de l'acide 2,2',-azino-bis (3-éthylbenz- thiazoline-6-sulfonique) (ABTS).
Le titre est défini comme étant la dilution de sérum la plus élevée donnant une différence d'absorbance par rapport au contrôle négatif supérieure ou égale à 0,6. Pour ce contrôle, on utilise un pool de sérums collectés avant l'immunisation des souris. Résultats
* Augmentation de la réponse T et production d'anticoφs in vivo, en l'absence d'adjuvants L'anticoφs 14-4-4S est incubé avec le conjugué ZZ-toxine et injecté à la souris BALB/c. Les immunisations sont réalisées en l'absence d'adjuvants. Une semaine après l'immunisation, une réponse immune est observée, qui augmente progressivement pendant les 3 semaines suivantes (figure 2).
Ce résultat est particulièrement intéressant du fait que (i) l'obtention d'une réponse immune en l'absence d'adjuvants n'est pas observée avec l'hybride ZZ- toxine et (ii) la quantité de toxine fusionnée injectée dans le complexe non-covalent selon l'invention peut être diminué à 0,1 nmole/souris, une valeur qui est 5 fois plus faible que celle utilisée en présence d'adjuvants, comme illustré à la figure 3.
Il y a lieu de noter qu'à cette dose et en l'absence d'adjuvant, la toxine libre est encore létale et ne peut donc pas être utilisée comme référence dans cette expérience.
Exemple 3 : Comparaison entre un complexe selon l'invention comprenant un fragment ZZ et un complexe comprenant de la protéine A
Les conditions sont identiques à celles exposées à l'exemple 1.
Les résultats sont illustrés à la figure 4, qui montre une augmentation remarquable de la présentation aux cellules T aussi bien de la toxine α (figure 4A) que de l'érabutoxine a (figure 4B). De manière plus précise, en utilisant des splénocytes comme CPAg, le complexe ZZ-toxine/anticoφs est plus puissant pour stimuler les cellules T1B2 qu'un conjugué ZZ-toxine incubé seul ou que la toxine libre. De façon suφrenante, le complexe ZZ-Ea/anticoφs est aussi efficace que le complexe protéine A-Ea/anticoφs, pour stimuler les cellules T1B2 (figure 4B). Les effets d'augmentation ne sont pas observés lorsque la toxine non fusionnée est incubée avec ZZ libre et l'anticoφs 14-4-4S ou avec la protéine A libre et l'anticoφs 14-4-4S (figure 4A). Ce dernier point indique, de plus, que l'augmentation de la stimulation T n'est pas due à un effet mitogène lié à la présence conjointe de la toxine libre, de ZZ et de l'anticoφs, dans le milieu.
Exemple 4 : Augmentation in vitro de la présentation aux cellules T par un complexe non-covalent selon l'invention ZZ-toxine α et anticorps anti-IgM. Les conditions sont identiques à celles exposées à l'exemple 1. Les résultats sont illustrés à la figure 5. Comme on peut le voir sur cette figure, l'incubation d'anticoφs de lapin anti-IgM μ de souris (Produit Jackson), en présence de conjugué ZZ-α augmente considérablement le pouvoir T stimulant de la toxine. En effet, ce complexe est respectivement 45 fois et 800 fois plus efficace que le conjugué ZZ-α incubé seul et que la toxine α incubée seule. Exemple 5 : Augmentation de l'induction in vivo des cellules T auxiliaires spécifiques de la toxine alpha par une série de complexes non-covalent selon les inventions ZZ-toxine α et anticorps anti-IgM (RAMμ), ZZ-toxine α et anticorps anti- IgGF(ab')2 (RAMF(ab')2), ZZ-toxine α et anticorps antiCMH (14-4-4S). Une série de complexes non-covalents a été préparée pour évaluer si certains d'entre eux sont capables d'augmenter l'induction des cellules T auxiliaires spécifiques de la toxine alpha in vivo. ZZ-α a été respectivement complexé avec les anticoφs suivants : IgG2a de souris, anticoφs de lapin anti-souris spécifique de la chaîne μ des IgM (RAMμ) (produit Jackson), anticoφs de lapin anti-souris spécifique de la région F(ab')2 des IgG (RAMF(ab') ) (produit Jackson), anticoφs de lapin (IgG) (produit SIGMA), et anti-molécule du CMH de classe II (14-4-4S). Différents lots de souris BALB/c sont ensuite injectés, en absence d'adjuvant, avec l'hybride ZZ-α seul ou complexé aux anticoφs précités. L'induction de cellules T auxiliaires, spécifiques de la toxine α in vivo, est évaluée 36 jours plus tard. Pour cela, les rates des animaux sont collectées et les cellules spléniques sont incubées pendant 24 heures à 37°C avec la toxine alpha native (1 μM final), le peptide 24-41, qui est le peptide T immuno- dominant de la toxine alpha (1,5 μM final), ou le lysozyme d'oeuf de poule (1 μM final). La présence d'interleukine 2 dans les surnageants de culture est alors testée par mesure de leur capacité à stimuler l'incoφoration de thymidine tritiée dans une lignée JJL2-dépendante.
Comme l'illustre la figure 6, seules les cellules T auxiliaires des animaux immunisés avec les complexes non covalents ZZ-toxine α et anticoφs anti- IgM (RAMμ), ZZ-toxine α et anticoφs anti-IgGF(ab')2 (RAMF(ab')2), ZZ-toxine α et anticoφs antiCMH (14-4-4S) sont capables de produire de 1TL2 en présence de la toxine alpha ou du peptide 24-41. Ces trois complexes non covalents représentent donc des véhicules efficaces pour l'induction de cellules T spécifiques chez l'animal. Exemple 6 : Production d'anticorps in vivo avec un complexe selon l'invention ZZ-DTR et anticorps anti-CMH.
Matériel et Méthodes
* Construction et expression de la protéine de fusion On prépare une protéine de fusion ZZ-DTR dans laquelle ZZ a la même signification que ci-dessus et DTR correspond au fragment 382-535 de la séquence de la toxine diphtérique (DT), comprenant le domaine R (M.J. BENNETT et al., Protein Sel, 1994, 3, 1444-1463; M.J. BENNETT et al., Protein Sci., 1994, 3, 1464-1475 ; JM. ROLF et al., 1993, Infect. Immun., 1993, 61, 994-1003 ; JM. ROLF et al., Mol. Microbiol, 1993, 7, 585-591).
Le domaine récepteur de la toxine diphtérique (DTR), correspondant aux acides aminés 382-535, a été exprimé, fusionné avec le fragment ZZ. Pour cela, la séquence codant pour le fragment DTR a été amplifiée par PCR, en utilisant le plasmide pK5DT, codant pour la toxine diphtérique, comme matrice. Le fragment amplifié a été clone dans le plasmide pCP (P. Drevet et al., Protein Expression Purif., 1997, 10, 293-300).
Ce plasmide permet la production d'une protéine ZZ-DTR dans le cytoplasme.
Toutes les manipulations génétiques sont réalisées conformément à Sambrook et al. (1989, Molecular cloning : a laboratory manual, 2nd éd., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).
De manière plus précise, on effectue une PCR pour créer des sites de restriction Sali et BamHI respectivement aux extrémités 5' et 3' de la séquence nucléotidique correspondant au domaine DTR. Le plasmide pK5DT est utilisé comme matrice et les oligonucléo- tides suivants sont utilisés comme amorces : site Sali : 5'GGGACTGCAGGTACCGTCGACGCCGGGTCACA AAACGCAA3' site BamHI : 5'GGGACTGCAGGATCCTTATAAGCTTCCGCTT TTGATTTCAAAAAATAG3'.
Les oligonucléotides ont été conçus pour ajuster le cadre de lecture du domaine DT avec celui du fragment ZZ. Les sites Sali et BamHI sont utilisés pour sous-cloner le fragment DTR amplifié dans M13mP18, dans lequel il a été séquence.
Le fragment DTR est ensuite excisé à l'aide des enzymes Sacl et BamHI et introduit dans le vecteur pCP (P. Drevet et al., Protein Expression Purif., 1997, 10, 293-300).
Des bactéries E. coli BL21 (DΕ3)Lys sont utilisées pour exprimer la protéine ZZ-DTR.
Des cellules transformées sont cultivées dans 100 ml de milieu Broth (soja trypsinise, Difco) complémenté avec du glucose (5 g/litre), de l'ampicilline (200 mg/ml) et du chloramphénicol (30 mg/ml).
On utilise 60 ml de cellules incubées pendant une nuit à 37°C pour inoculer un fermenteur comprenant 3 1 du même milieu que celui de la préculture.
Les cellules sont incubées à 37°C sous aération jusqu'à l'obtention d'une densité optique à 600 nm comprise entre 0,5 et 1. On ajoute ensuite de ÎTPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)
0,5 mM (concentration finale) ; après 3 h d'induction, les cellules sont récupérées par centrifugation (5 000 x g pendant 15 min), remises en suspension dans un tampon de lyse (Tris 30 mM, ΕDTA 5 mM, glucose à 20 %, pH 8) et éclatées avec une presse Εaton. Le surnageant contenant la protéine de fusion est purifié sur une colonne IgG-Sépharose 4B (Pharmacia Biotech) ; 10 ml d'extrait brut sont incubés pendant 1 nuit à 4°C avec 10 ml d'IgG-Sépharose équilibré avec un tampon comprenant : Tris-HCl 50 mM, pH 7,6, NaCl 150 mM et 0,05 % de Tween 20.
Après lavage avec 10 volumes de tampon d'équilibration, 2 volumes d'acétate d'ammonium 5 mM sont ajoutés à la colonne. La protéine liée est ainsi éluée avec de l'acide acétique 0,5 M (pH 3,4) et immédiatement neutralisé avec du tampon Tris-HCl 1 M (pH 8).
La fraction contenant la protéine ZZ-DTR est concentrée à 4 mg/ml par ultrafiltration sur Microsop 30 (Filtron). Résultats
La réponse en anticoφs anti-toxine diphtérique est accrue lorsque les souris BALB/c sont préstimulées avec le complexe non-covalent selon l'invention ZZ- DTR et anticoφs anti-molécule du CMH de classe II (14-4-4S). La protéine de fusion ZZ-DTR est complexée à l'anticoφs antimolécule du CMH de classe H (14-4-4S). Différents lots de souris BALB/c sont ensuite injectés soit avec du sérum physiologique, soit avec du sérum physiologique contenant le complexe non covalent (0,01 nmole par souris), soit avec du sérum physiologique contenant ZZ-DTR seul (0,01 nmole par souris). Un challenge est réa- lise 31 jours plus tard par l'injection d'un mutant de la toxine diphtérique CRM197 (Mekada et al., J. Biol Chem., 1985, 260, 12148-12153) (produit SIGMA) (0,1 nmole par souris). Le sang des animaux est prélevé 14 jours plus tard et la présence d'anticoφs anti-toxine diphtérique dans les sérums est évaluée par un test de dosage immunoenzymatique . Comme l'illustre la figure 7, une seule injection de complexe non- covalent (14-4-4SZZ-DTR/0) permet d'induire une production d'anticoφs anti-toxine diphtérique près de 6 fois supérieur à une double immunisation avec ZZ-DTR (ZZDTR/ZZDTR). De plus, suite au challenge avec le mutant CRM 197, les animaux préstimulés avec 14-4-4SZZ-DTR (14-4-4SZZ-DTR/CRM197) présentent un titre en anticoφs anti-toxine diphtérique 8 à 10 fois supérieur à celui des animaux préstimulés avec ZZ-DTR seul (ZZ-DTR/CRM197) ou injectés avec du sérum physiologique (0/CRM197). Le complexe non covalent constitue donc un immunogène permettant d'accroître la réponse anticoφs anti-toxine diphtérique lors d'un challenge avec un mutant de la toxine diphtérique. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
( i ) DEPOSANT
(A NOM: COMMISSARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE (B RUE: 31-33 rue de la Fédération (C VILLE: PARIS (E PAYS: FRANCE (F CODE POSTAL: 75015
(A NOM: DREVET Pascal (B RUE: 13 Grande Rue (C VILLE: PECQUEUSE (E PAYS: FRANCE (F CODE POSTAL: 91470
(A NOM: LEONETTI Michel (B RUE: 18 rue du Colonel de Bange (C VILLE: VERSAILLES (E PAYS : FRANCE (F CODE POSTAL: 78000
(A NOM: MENEZ André (B RUE: 109 avenue Claude Nicolas Ledoux - Magny les
Hameaux
(C VILLE: SAINT REMY LES CHEVREUSE (E PAYS: FRANCE (F CODE POSTAL: 78470
(ii) TITRE DE L' INVENTION: COMPLEXE NON-COVALENT COMPRENANT AU MOINS UN ANTICORPS ET UN ELEMENT DE LIAISON AUX IMMUNOGLOBULINES ASSOCIE A UNE SUBSTANCE ACTIVE, SON PROCEDE DE PREPARATION ET SES APPLICATIONS.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 2
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(vi) DONNEES DE LA DEMANDE ANTERIEURE:
(A) NUMERO DE LA DEMANDE: FR 97 01420
(B) DATE DE DEPOT: 07-FEB-1997
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 40 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 1:
GGGACTGCAG GTACCGTCGA CGCCGGGTCA CAAAACGCAA 40 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 2: -
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 48 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "AMORCE"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 2: GGGACTGCAG GATCCTTATA AGCTTCCGCT TTTGATTTCA AAAAATAG 48

Claims

REVENDICATIONS 1°) Complexe non-covalent, caractérisé en ce qu'il comprend (i) au moins un anticoφs ou un fragment d'anticoφs capable de se lier à une molécule exprimée à la surface d'une cellule et (ii) un élément de liaison à une immunoglobu- line ou à un fragment d'immunoglobuline, associé à une substance active, lequel élément de liaison ne peut se lier qu'à un seul type de site sur l' immunoglobuline.
2°) Complexe non-covalent selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit anticoφs ou fragment d'anticoφs est dirigé contre une molécule exprimée à la surface des cellules présentatrices de l'antigène. 3°) Complexe non-covalent selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit anticoφs est sélectionné dans le groupe constitué par les anticoφs antimolécule du CMH de classe π, les anticoφs anti-IgM ou les anticoφs anti-IgG dirigés contre la région F(ab')2 d'une Ig.
4°) Complexe non-covalent selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit anticoφs ou fragment d'anticoφs est dirigé contre une molécule exprimée à la surface de cellules cancéreuses.
5°) Complexe non-covalent selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit anticoφs ou fragment d'anticoφs est dirigé contre une molécule exprimée à la surface des cellules mucosales ou des cellules musculaires. 6°) Complexe non-covalent selon la revendication 1 , caractérisé en ce que ledit anticoφs ou fragment d'anticoφs se lie à une cellule exprimant un récepteur Fc à sa surface.
7°) Complexe non-covalent selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'élément de liaison à une immunoglobuline ou à un fragment d'immunoglobuline est sélectionné dans le groupe constitué par des protéines ou des fragments de protéines de liaison aux immunoglobulines, qui ne se lient que dans la région Fc d'une immunoglobuline, qui sont issus de bactéries et qui sont moins affins que la protéine A, tels que des peptides dérivés de la protéine A de Staphylococcus aureus, comme le fragment ZZ. 8°) Complexe non-covalent selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'élément de liaison à une immunoglobuline ou à un fragment d'immunoglobuline est sélectionné dans le groupe constitué par des protéines ou des fragments de protéines de liaison aux immunoglobulines, qui ne se lient que dans la région Fc d'une immunoglobuline et qui sont issus de bactéries, tel qu'un fragment de protéine A d'au moins huit aminoacides, la protéine G, de préférence recombinante ou un de ses fragments peptidiques, ou toute autre protéine ou fragment de protéine, issus de bactéries, de protozoaires ou de virus et se liant dans la région Fc d'une Ig.
9°) Complexe non-covalent selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'élément de liaison aux immunoglobulines est sélectionné dans le groupe constitué par des protéines ou des fragments de protéines de liaison aux immunoglobulines qui ne se lient que dans la région Fab d'une immunoglobuline et sont issus de bactéries, telles que la protéine L de Peptostreptococcus magnus, un fragment de protéine A comprenant au moins l'un des domaines suivants A, B, C, D et ou E, la protéine G, de préférence recombinante ou un fragment de protéine G, la protéine P ou un fragment de protéine P de Clostridium perfringens, ou toute autre protéine ou fragment de protéine, issus de bactéries, de protozoaires ou de virus et se liant dans la région Fab d'une Ig.
10°) Complexe non-covalent selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la substance active est sélectionnée dans le groupe constitué par les antigènes d'intérêt, les drogues et les fragments d'acide nucléique d'intérêt.
11°) Complexe non-covalent selon la revendication 10, caractérisé en ce que lorsque la substance active est un antigène ou un immunogène, il comprend (i) un anticoφs ou un fragment d'anticoφs dirigé contre une molécule exprimée à la surface d'une cellule présentatrice d'antigène, notamment un anticoφs anti-molécule du CMH, un anticoφs anti-IgM ou un anticoφs anti-IgG dirigé contre la région F(ab')2 d'une Ig et (ii) un élément de liaison aux immunoglobulines qui ne se lie qu'à un seul type de site de ladite immunoglobuline, associé à un antigène.
12°) Complexe non-covalent selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend (i) un anticoφs anti-molécule du CMH de classe JJ et (ii) une protéine ou un fragment d'une protéine de liaison au Fc des Ig, notamment le fragment ZZ de protéine A conjugué à un antigène, de préférence sous la forme d'une protéine de fusion. 13°) Complexe non-covalent selon la revendication 10, caractérisé en ce que lorsque la substance active est une drogue, il comprend (i) un anticoφs ou un fragment d'anticoφs dirigé contre une molécule exprimée à la surface d'une cellule cible (α-fcetoprotéine, pour les cellules cancéreuses, par exemple) et (ii) un élément de liaison aux immunoglobulines qui ne se lie qu'à un seul type de site de ladite immunoglobuline, associé à une drogue qui peut notamment être sélectionnée parmi les substances chimiques cytotoxiques, les toxines (animales, végétales ou bactériennes), les haptènes et les séquences nucléotidiques anti-sens.
14°) Complexe non-covalent selon la revendication 10, caractérisé en ce que lorsque la substance active est un acide nucléique, il comprend (i) un anticoφs ou un fragment d'anticoφs dirigé contre une molécule exprimée à la surface d'une cellule cible et (ii) un élément de liaison aux immunoglobulines qui ne se lie qu'à un seul type de site de ladite immunoglobuline, associé à un acide nucléique.
15°) Complexe non-covalent selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 14, caractérisé en ce que l'élément de liaison aux immunoglobulines est conjugué de manière covalente à ladite substance active.
16°) Complexe non-covalent selon la revendication 15, caractérisé en ce que la substance active est associée à l'élément de liaison sous la forme d'une protéine de fusion. 17°) Complexe non-covalent selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que l'élément de liaison aux immunoglobulines est associé à ladite substance par l'intermédiaire d'un vecteur.
18°) Complexe non-covalent selon la revendication 17, caractérisé en ce que ledit vecteur est sélectionné dans le groupe constitué par des bactéries, des virus, des particules virales « coque vide », des liposomes et des microsphères poly- mériques.
19°) Composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend un complexe non-covalent selon l'une quelconque des revendications 1 1, 12 et 15 à 18 et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 20°) Composition vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend un complexe non-covalent selon l'une quelconque des revendications 11, 12 et 15 à 18 et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 21°) Composition cytotoxique, caractérisée en ce qu'elle comprend un complexe non-covalent selon l'une quelconque des revendications 13 et 15 à 18 et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
22°) Composition d'expression, caractérisée en ce qu'elle comprend un complexe non-covalent selon l'une quelconque des revendications 14 à 18 et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
23°) Composition selon l'une quelconque des revendications 19 à 22, caractérisée en ce que l'anticoφs dirigé contre une molécule exprimée à la surface d'une cellule et l'élément de liaison aux immunoglobulines associé à une substance active sont dans des contenants séparés, préalablement à leur utilisation.
24°) Procédé de préparation d'un complexe non-covalent selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisé en ce qu'il comprend :
. la préparation d'un élément de liaison aux immunoglobulines, associé à une substance active et . l'incubation dudit élément de liaison aux immunoglobulines, associé à une substance active avec un anticoφs ou un fragment d'anticoφs capable de se lier à une molécule exprimée à la surface d'une cellule, de préférence entre 10 minutes et 3 heures.
PCT/FR1998/000227 1997-02-07 1998-02-06 Complexe non-covalent comprenant au moins un anticorps et un element de liaison aux immunoglobulines associe a une substance active, son procede de preparation et ses applications WO1998034956A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9701420A FR2759296B1 (fr) 1997-02-07 1997-02-07 Complexe non-covalent comprenant au moins un anticorps et un element de liaison aux immunoglobulines associe a une substance active, son procede de preparation et ses applications
FR97/01420 1997-02-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1998034956A1 true WO1998034956A1 (fr) 1998-08-13

Family

ID=9503455

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR1998/000227 WO1998034956A1 (fr) 1997-02-07 1998-02-06 Complexe non-covalent comprenant au moins un anticorps et un element de liaison aux immunoglobulines associe a une substance active, son procede de preparation et ses applications

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR2759296B1 (fr)
WO (1) WO1998034956A1 (fr)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2955773A1 (fr) * 2010-02-01 2011-08-05 Commissariat Energie Atomique Complexe moleculaire de ciblage des antigenes vers les cellules presentatrices d'antigene et ses applications pour la vaccination
EP2431048A2 (fr) 2002-10-08 2012-03-21 Genencor International, Inc. Peptides de liaison phénolique

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2844514B1 (fr) * 2002-09-16 2007-10-19 Neovacs Produit immunogene stable comprenant des heterocomplexes antigeniques, compositions les contenant et procede de preparation
FR2998579B1 (fr) 2012-11-27 2015-06-19 Commissariat Energie Atomique Methode pour obtenir des anticorps humains specifiques d'un antigene par immunisation in vitro
FR3110838B1 (fr) 2020-05-28 2022-06-24 Commissariat Energie Atomique Complexe immunomodulateur et ses applications pour la thérapie

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1983004026A1 (fr) * 1982-05-11 1983-11-24 Genefusion S.A. Agent cytotoxique
EP0245078A2 (fr) * 1986-05-06 1987-11-11 Connaught Laboratories Limited Augmentation de l'immunogénicité d'antigènes
WO1993022438A1 (fr) * 1992-05-07 1993-11-11 Microbiological Research Authority La proteine l et son procede de preparation par la technologie de l'adn recombine
US5283323A (en) * 1985-08-07 1994-02-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of producing immune response

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1983004026A1 (fr) * 1982-05-11 1983-11-24 Genefusion S.A. Agent cytotoxique
US5283323A (en) * 1985-08-07 1994-02-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of producing immune response
EP0245078A2 (fr) * 1986-05-06 1987-11-11 Connaught Laboratories Limited Augmentation de l'immunogénicité d'antigènes
WO1993022438A1 (fr) * 1992-05-07 1993-11-11 Microbiological Research Authority La proteine l et son procede de preparation par la technologie de l'adn recombine

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LJUNDGBERG U. K. ET AL.,: "The interaction between different domains of staphylococcal protein A and human polyclonal IgG, IgA,IgM and F(ab)2: separation of affinity from specificity", MOL. IMMUNOLOGY, vol. 30, no. 4, - 1993, pages 1279 - 1285, XP002044845 *
ROUX P ET AL: "A VERSATILE AND POTENTIALLY GENERAL APPROACH TO THE TARGETING OF SPECIFIC CELL TYPES BY RETROVIRUSES: APPLICATION TO THE INFECTION OF HUMAN CELLS BY MEANS OF MAJOR HISTOCOMPATIBILITY COMPLEX MURINE LEUKEMIA VIRUS-DERIVED VIRUSES", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, vol. 86, no. 23, 1 December 1989 (1989-12-01), pages 9079 - 9083, XP000081882 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2431048A2 (fr) 2002-10-08 2012-03-21 Genencor International, Inc. Peptides de liaison phénolique
US8293702B2 (en) 2002-10-08 2012-10-23 Danisco Us Inc. Phenolic binding peptides
FR2955773A1 (fr) * 2010-02-01 2011-08-05 Commissariat Energie Atomique Complexe moleculaire de ciblage des antigenes vers les cellules presentatrices d'antigene et ses applications pour la vaccination
WO2011092675A3 (fr) * 2010-02-01 2015-07-09 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Complexe moleculaire de ciblage des antigènes vers les cellules présentatrice d'antigène et ses applications pour la vaccination
US10385120B2 (en) 2010-02-01 2019-08-20 Commissariat A L'energie Atomique Molecular complex for targeting antigens towards cells comprising antigens and uses thereof for vaccination

Also Published As

Publication number Publication date
FR2759296A1 (fr) 1998-08-14
FR2759296B1 (fr) 1999-04-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2531213B1 (fr) Complexe moleculaire de ciblage des antigènes vers les cellules présentatrice d'antigène et ses applications pour la vaccination
JP6335102B2 (ja) Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ感染に対する多糖類ワクチン
EP0057140B1 (fr) Nouveau composé polypeptidique thiolé provenant d'un fragment de la toxine tétanique, son procédé d'obtention et ses applications
JP2002524024A (ja) インターナライズするＥｒｂＢ２抗体
FR2766826A1 (fr) Vecteurs derives d'anticorps pour le transfert de substances dans les cellules
Holz et al. A review of protein-and peptide-based chemical conjugates: past, present, and future
EP1127110A1 (fr) Exosomes modifies et utilisations
EP0837699B1 (fr) Immunovecteurs utilisables pour le transport intracellulaire et intranucleaire
EP0791063B1 (fr) Proteine porteuse a effet adjuvant, complexe immunogene la contenant, leur procede de preparation, sequence nucleotidique et vaccin
CA2539172C (fr) Procede a haut rendement pour l'obtention d'anticorps humains neutralisant l'activite biologique d'une cytokine humaine
WO1998034956A1 (fr) Complexe non-covalent comprenant au moins un anticorps et un element de liaison aux immunoglobulines associe a une substance active, son procede de preparation et ses applications
EP1124577B1 (fr) Utilisation d'une proteine ompa d'enterobacterie, pour le ciblage specifique vers les cellules presentatrices d'antigenes
EP0468049A1 (fr) Anticorps monoclonaux reconnaissant un peptide associe a un antigene majeur d'histocompatibilite
FR2550944A1 (fr) Association pharmaceutique a base d'anticorps anticellules tumorales et de conjugues cytotoxiques, appropriee notamment pour le traitement des cancers
EP0030496B1 (fr) Composé polypeptidique thiolé provenant d'un fragment de la toxine tétanique, son procédé d'obtention et ses applications
CN113518923A (zh) 用于脂质化蛋白质结构的制备的方法
FR2701710A1 (fr) Conjugués protéiques, compositions les contenant et leurs applications en tant que médicament et réactif de diagnostic.
Carayanniotis et al. Characterization of the adjuvant-free serological response to protein antigens coupled to antibodies specific for class II MHC determinants
EP0789768A1 (fr) Proteine g du virus respiratoire syncytial exprimee sur membrane bacterienne
WO2002035242A1 (fr) Procede d'identification de nouvelles molecules se liant au recepteur lox
WO2004011486A2 (fr) Procede de solubilisation de peptides hydrophobes et leur utilisation pour generer une response de type ctl antitumorale ou anti-infectieuse
EP1244690B1 (fr) Procede de preparation d'un polypeptide soluble en solvant aqueux en absence de detergent
Weidenbacher Methodologies to Target Conserved Viral Epitopes for Vaccine and Therapeutic Development
CA2324864A1 (fr) Complexe d'alpha-2 macroglobuline modulateur de la reponse immunitaire
WO2001005436A1 (fr) Methode de production d'anticorps dans le jaune d'oeuf et utilisation des anticorps ainsi obtenus

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase
点击 这是indexloc提供的php浏览器服务，不要输入任何密码和下载