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WO2001005436A1 - Methode de production d'anticorps dans le jaune d'oeuf et utilisation des anticorps ainsi obtenus - Google Patents

Methode de production d'anticorps dans le jaune d'oeuf et utilisation des anticorps ainsi obtenus Download PDF

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WO2001005436A1
WO2001005436A1 PCT/FR2000/002006 FR0002006W WO0105436A1 WO 2001005436 A1 WO2001005436 A1 WO 2001005436A1 FR 0002006 W FR0002006 W FR 0002006W WO 0105436 A1 WO0105436 A1 WO 0105436A1
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immunization
antibodies
antigen
pres
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PCT/FR2000/002006
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Lucyna Cova
Christian Trepo
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Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
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Application filed by Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) filed Critical Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing antibodies in the egg yolk and the use of the antibodies thus obtained in human or veterinary immunotherapy and as a diagnostic tool.
  • IgG immunoglobulins
  • the amount of antibody per egg yolk is of the order of 10 mg / g whereas it is 35 mg / ml in rabbit serum; knowing that a hen lays about 250 eggs per year, then after immunization at 0, 2, 4 6, 22 and 28 weeks, we recover a total of 40 g of antibodies, while in rabbits we recover only 1, 4 g after bleeding the animal.
  • the amount of antibodies produced by chicken is greater by about 30 times that of the antibodies contained in the serum of a rabbit (Hatta H. Biosci, Biotech. Biochem., (1993) 57, 450-454),
  • this technique is limited by a high cost associated with the production and purification of large quantities of antigens for the immunization of poultry, including chickens or ducks. Indeed these antigens are mostly proteins or fragments of recombinant proteins and to obtain a continuous production of antibodies at high levels in the yolk of egg. it is necessary to hyperimmunize avians, by repeated injections of these antigens.
  • the production and purification, in large quantities of recombinant proteins using eukaryotic expression vectors or prokaryotes which is long, expensive and laborious, because of the many stages and the complexity of the techniques implemented therefore limits the use of this technique for the production on an industrial scale, of antibodies for diagnosis and immunotherapy . Due to the drawbacks described above, this technique is not suitable for the rapid production of banks of antibodies directed against numerous mutants or variants of the same antigen, in particular for the differential diagnosis of human or animal infections.
  • this technique is also limited by the fact that certain recombinant proteins are difficult to produce due to their low level of expression or their instability, or are produced in a weak immunogenic form (insoluble protein, protein whose conformation is different of that of the native protein or protein whose antigenic structure is altered during purification).
  • naked DNA for genetic immunization is a very effective vaccine approach developed over the past ten years (Tang D. C. et al. Nature, (1992), 356, 152-154). It consists in injecting, into the host organism to be vaccinated, naked DNA coding for a protein antigen; this DNA allows a prolonged synthesis of the antigen by the host cells as well as a durable presentation of this antigen to the immune system (Tang D. C. et al. Nature, (1992), 356, 152-154). This approach has shown particular promise in several animal models of infections caused by viruses, bacteria, parasites or mycoplasmas (Lai W.C. et al. Critical Reviews in Immunology (1998), 18, 449-484).
  • Immunization with naked DNA makes it possible to produce antibodies which have a protective effect (Tang DC et al. Nature, (1992), 356, 152-154) and induces a cellular immune response characterized by the production of T lymphocytes, able to recognize and lyse infected cells (Ulmer JB et al. ASM News
  • the mechanism of naked DNA immunization is completely different from that of protein immunization.
  • the extracellular antigens are captured and degraded by antigen presenting cells which will then activate the humoral responses.
  • the injection of naked DNA leads to the transfection of cells as well as the intracellular neosynthesis of a protein which when secreted leads to activating the humoral and cellular responses Consequently, the humoral response induced by the immunization by a DNA coding for a non-secreted protein is often much more weak than immunization induced by DNA coding for a secreted proteme
  • the immune response (humoral and / or cellular) induced by immunization with naked DNA also varies depending on the animal model, the nature (circular or linear) of the DNA or the immunization method. used (Fyman et al. Proc Nat Acad Sci USA, (1993), 90, 11478 - 11482; Fyman et al., DNA and Cell Biology, (1993), 12, 785-789, T ⁇ yatm et al, Journal of Virology, (1998), 72, 84-94, Sakaguchi et al,, Vaccine, (1996), 14, 747-752)
  • the inventors have recently shown that the immunization of ducks, by naked DNA expressing the preS and S regions of the envelope protein (protein L), of the duck hepatitis B virus (DHBV), induces a strong, specific and long-lasting humoral response
  • This humoral response is at least as good as that induced by the purified recombinant preS antigen and is capable of neutralizing the virus and protecting newborn ducklings against viral infection (Rolher C.
  • the subject of the present invention is therefore a method of producing antibodies in egg yolk, characterized in that it comprises
  • the immunization is carried out in the hen or the duck.
  • naked DNA means both a DNA coding for an appropriate antigen or protein and cloned in a vector, in particular in a plasmid, as linear fragments of DNA which express a eukaryotic or prokaryotic gene, including LEEs (Linear Expression Elements) such as those described by Sykes KF et al. (Nature Biotechnology (1999), 17, 355-359).
  • LEEs Linear Expression Elements
  • the method of production of antibodies of the invention has the following advantages: - it is simple, rapid and economical because it requires neither the expression of proteins, nor their purification, which is very expensive, long and cumbersome to implement. work due to the development of specific techniques adapted to each protein,
  • the inventors have shown that the purification of the preS protein corresponding to the antigenic region of the protein L of the duck hepatitis virus in a prokaryotic expression system requires three weeks of work and involves complex and costly steps. while the corresponding plasmid is purified in three days, at low cost, using standard conventional techniques.
  • the standard standardized techniques for DNA purification can be used whatever the sequence of the antigen contained in this DNA.
  • the method according to the invention allows to quickly change the sequence of the antigen, by site-directed mutagenesis, so as to generate different DNA which may be used separately or mixed for the production in large quantities of antibodies specific for different antigens and variants thereof for example, immunization with a different DNA mixture used to produce libraries of antibodies specific for different antigens and their variants, which at present can not be detected by diagnostic tests using antibodies obtained by immunization with protemes
  • DNA uses code for an antigen of interest, in particular for proteins of animal or vegetable origin or proteins of pathogenic organisms.
  • DNAs coding for proteins of animal or vegetable origin mention may be made in particular of the DNAs coding for antigens expressed by tumor cells, insulin, allergens, toxins, venoms and growth factors.
  • DNAs coding for proteins of pathogenic organisms we can cite the DNA coding for
  • proteins of viral origin in particular proteins from HIV (human immunodeficiency virus), influenza, rabies virus, rotaviruses, hepatitis B, C, D and E, human cytomegalovirus, herpes virus, dengue virus, polio virus, measles virus, HTLV I (Human T-cell Leukemia Virus), NDV (Newcastle Disease Virus), seen us Ebola, papillomavirus and Sendai virus,
  • HIV human immunodeficiency virus
  • influenza influenza
  • rabies virus rotaviruses
  • hepatitis B, C, D and E human cytomegalovirus
  • herpes virus dengue virus
  • polio virus measles virus
  • HTLV I Human T-cell Leukemia Virus
  • NDV Newcastle Disease Virus
  • proteins of bacterial origin in particular proteins from M ⁇ cobacteruun tuberculosis and bovis, from Salmonella typhi, from Clostridium telami and from coplasma pulmoms,
  • the proteins of parasites in particular the protozoan protemes such as Plasmodium ⁇ oll ⁇ (agent of malaria), Leishmania, Toxoplasma gondu or Sclustosoma mansoni
  • the DNA can be injected either by the intradermal route, or by the intramuscular route, or by the venous route.
  • either orally or intramuconasally DNA can be injected in all forms known to those skilled in the art, in particular in saline solution, in the form of complexes with lipids, in the form of an aerosol, adsorbed on gold beads or encapsulated in microparticles
  • said step of immunization consists of two multi-sequential administrations and of said naked DNA
  • the present invention also relates to the use of at least one antibody obtained by the method according to the invention, said antibody being optionally associated with an appropriate substance, for the preparation of an immunological reagent capable of being used for the screening, diagnosis and / or monitoring of diseases, in humans and animals
  • the present invention also relates to a method of screening, diagnosis and / or monitoring of a disease, in humans or in animal, comprising detecting the presence of an optionally present antigen in a biological sample, in particular in blood, caracte ⁇ see in that it implements at least one appropné antibody produced according to the invention in the context of said method, when the antigen is present in the biological sample to be checked, it then binds to the antibody and said binding is revealed by any suitable means known to those skilled in the art, in particular by RIA, EIA, ELISA, or by Immunoflurorescence and immunoelectromicroscopy techniques
  • the present invention also relates to a diagnostic kit or kit for screening, diagnosis and / or monitoring of a disease, characterized in c e that it uses at least one antibody obtained according to the method according to the invention, suitable reagents and means for detecting the formation of the antigen-antibody bond
  • the present invention also relates to
  • the medicament is useful in immunotherapy.
  • the medicament is to be administered orally, optionally as an food additive, for passive immunization against enteric pathogenic viruses. especially rotaviruses, or against oral infections.
  • the medicament is intended to treat an infection chosen from the group consisting of infections of viral, bacterial origin and those due to protozoa.
  • the medicament is intended to treat a disease chosen from cancers and allergies.
  • FIG. 1 illustrates the kinetics of the humoral response in 3 canes, after immunization with the plasmid pCI-preS / S according to the method described in Example 1.
  • the detection of anti-preS antibodies was carried out by a direct ELISA test according to the procedure described in example 1.
  • the arrows indicate the DNA injections carried out 4, 7, 10 and 28 weeks after birth (- x -) first cane, (- B -) second cane, (- O -) third cane.
  • FIG. 2 illustrates the evolution of the mean anti-preS antibody titer either in the egg yolk of ducks immunized with the empty plasmid pCI according to the method described in Example 1 (- O -), or in the serum canes immunized with the plasmid pCI-preS / S according to the method described in example 1 (- x -) or in egg yolks of canes immunized with the plasmid pCI-preS / S according to the method described in 'example 1 (- B -).
  • the detection of anti-preS antibodies was carried out by a direct ELISA test, according to the procedure described in Example 1.
  • the arrow indicates the injection of DNA.
  • FIG. 3 illustrates the specificity of the purified antibodies (IgY) obtained according to the method according to the invention.
  • DHBV-infected serum (DHBV +) and non-infected semen (DHBV -) proteins were revealed by immunoblotting with (A) anti-DHBerieS polyclonal rabbit antisemm, (B) serum from canes immunized with pCI- preS / S, (C) IgY of eggs laid by ducks immunized with pCI-preS / S and (D) IgY of eggs laid by canes immunized with the empty plasmid pCI "p36" corresponds to the L protein of DHBV.
  • FIG. 4 illustrates the in vitro neutralization of the infectivity of DHBV with cane semm or with antibodies (IgY) from cane egg yolks
  • IgY antibodies
  • FIG. 4 illustrates the in vitro neutralization of the infectivity of DHBV with cane semm or with antibodies (IgY) from cane egg yolks
  • Primary cultures of cane hepatocytes are infected with an inoculum of pre DHBV -incubate with semm or IgY according to the procedure described in Example 2
  • the release of the viral particles is quantified in the culture medium by a quantitative molecular hybridization method (dot Mot hybndization).
  • Figure 5 illustrates the kinetics of the humoral response in three canes after immunization with naked DNA encoding the preS and S regions of the large envelope protein of DHBV (plasmid pCI-preS / S) or by the recombinant preS protein (DHB preS). according to the protocol dec ⁇ t in example 5.
  • the detection of anti-preS antibodies was carried out by a direct ELISA test according to the procedure dec ⁇ t in example 1
  • the solid arrow represents the first injection 4 weeks after birth and the arrow empty represents the booster injection 15 weeks after birth (- ⁇ -) pCI, (- Q—) pCI-discS / S, (- • -) DHBLiteS
  • FIG. 6 illustrates the kinetics of the humoral response in 3 3-day-old ducklings, after immunization with naked DNA encoding the preS and S regions of the envelope protein of DHBV (plasmid pCI-preS / S) or by the recombinant preS protein (DHS preS), according to the protocol described in Example 6.
  • the DNA fragment of DHBV coding for the preS / S gene (nucleotides 801 - 1785) is cloned by PCR into the Not I site of the multiple binding site ipo linker) of the vector pCI (Promega, Charbonippos, France) allowing 'get the plasmid pCI-genieS / S.
  • This pCI-preS / S plasmid which codes for the preS / S protein which is not secreted in the extracellular medium and the pCI plasmid (negative control) are introduced into Escherichia coli and the DNAs are purified by anion exchange chromatography on Qiagen columns (Qiagen, Hilden, Germany) and quantified by measuring the optical density at 260 nm with labeling with ethidium bromide.
  • a group of canes is immunized by intramuscular injection into the right anterior quadriceps of 100 ⁇ g of plasmid pCI-preS / S coding for the L protein of DHBV, in solution in 0.9% NaCl, another group receiving in same conditions the plasmid pCI.
  • DNA injections are carried out, at weeks 4, 7, 10 and 28 after birth, at the rate of 100 ⁇ g of DNA per injection for weeks 4.7 and 10 and 200 ⁇ g of DNA per injection for the week 28.
  • Antibodies are extracted and purified from each egg yolk using the EGGstract kit (Promega) following the supplier's instructions.
  • Anti-preS antibodies are detected by a direct ELISA test using microtiter plates coated with DHB retailer S polypeptide, blocked, washed and revealed by the method described by S. Chassot et al. (Virology (1994), 200, 72-78). The final titer is considered as the reverse of the highest semm dilution which gives an optical density greater than 3SD above the average witness signal.
  • preS in serum on the order of 3200 to 14,000 on average per blood sample.
  • the amount of antibody reaches its maximum from the first injection of DNA, then we observe a plateau which is maintained until 40 weeks after birth.
  • the antibody titer per egg is 3200 to 6400 for all eggs collected during the six weeks.
  • the quantity of antibodies purified per harvested egg is approximately 60 to 100 mg, without significant variation from one egg to another.
  • the DHBV particles are prepared by ultracentrifugation of cane semen with high viraemia and the particles serving as negative controls are prepared by ultracentrifugation of uninfected cane semen.
  • Cane liver proteins infected or not with DHBV are extracted according to the technique described by S. Chassot et al. (Virology (1993), 192, 217-223).
  • the process is that described by Borel C. et al. (Virology (1998), 242, 90-98) and uses either a polyclonal rabbit antiserum anti-DHBerieS (1: 1000), or a serum of canes immunized with pCI-preS / S, or IgY of laid eggs by canes immunized with pCI-preS / S, i.e. IgY of eggs laid by canes immunized with pCI.
  • the IgY antibodies produced in egg yolks after immunization with pCI-preS / S recognize the envelope protein of DHBV, protein L, with a molecular weight of 36 kDa. present in the concentrated particles derived from the semm ( Figure 3C).
  • the immunoblotting profile is comparable to that obtained with the serum of ducks previously immunized with the plasmid pCI-preS / S ( Figure 3B), or with the serum of rabbits immunized with the recombinant DHBV envelope protein ( Figure 3A) .
  • EXAMPLE 3 In vitro measurement of the neutralizing power of antibodies produced in egg yolks 3.1. Materials and methods 3.1.1. Virus: The viral inoculum is prepared from a pool of semilins of ducklings which have been transfected with DHBV cloned and sequenced by Mandait E. et al. (J. Virol. (1984), 49, 782-792) and quantified in genome equivalents of vims (vge) by quantitative molecular hybridization (dot Mot hybridization) as described by S. Borel (1998) (reference cited). 3.1.2. .Power measurement; . neutrahsant_ "_ v tro
  • the neutralization test is carried out according to the method described by Rollier C. et al. (1999) (reference cited).
  • the release of the viral particles is followed for 8 days by quantitative molecular hybridization.
  • the area under the curve of DHBV rates in the supernatants reflect the total viral secretion.
  • Fertilized eggs from ducks immunized either with the empty plasmid pCI or with the plasmid pCI-preS / S are incubated until hatching.
  • the ducklings Two days after their birth, the ducklings are inoculated with DHBV and the humoral response and the viremia are measured for 17 days.
  • viremia is measured by quantitative hybridization and represents the total amount of virions released during the follow-up period. All ducklings born from ducks immunized by pCI-discS / S and who against a vimlante test
  • a group of 3 canes is immunized at the age of 4 weeks by subcutaneous injection of a volume / volume mixture of 200 ⁇ g of recombinant preS antigen in solution in 0.9% NaCl and an equivalent amount Freund's complete adjuvant. At the age of 15 weeks, the canes receive a booster injection of an equivalent mixture in incomplete Freund's adjuvant.
  • a group of 3 canes is immunized at 4 weeks of age by a multisite intramuscular injection, at three distinct sites in the anterior quadriceps muscles of the two legs, of 200 ⁇ g of plasmid pCI-preS / S in solution in
  • the canes receive a booster injection, according to the same experimental protocol.
  • a group of 3 canes receiving the plasmid pCI under the same conditions is used as a control.
  • Seric antibodies are detected by ELISA, according to the protocol described in Example 1.
  • the amount of antico ⁇ s reaches its maximum at the I7th week with a peak in antico ⁇ s of 12800, that is to say 300 times superior to that obseive with the protein preS, then we observe a plateau which is maintained at least until 22 weeks after birth, without booster injection
  • the plasmid pCI-preS / S and the control plasmid pCI are prepared under the conditions determined in Example 1
  • the recombinant preS antigen pu ⁇ fie is piepare as dec ⁇ t in Rolher et al, 1999, cited above
  • a group of 3 ducklings is immunized at the age of 3 days by a multisite intramuscular injection, at three distinct sites in the quad ⁇ ceps anteiieuis muscles of the two legs, of 100 ⁇ ig of plasmid pCI-preS / S in solution in NaCl a 0.9%> and no recall is made
  • the antico ⁇ s se ⁇ ques are detected by ELISA, according to the protocol 0 decnt to 1 example 1
  • the recombinant preS antigen induces a delayed and transient humoral response; the antico ⁇ s are detectable from the 15 th week and disappear completely from the 20 th week.

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Abstract

Méthode de production d'anticorps dans le jaune d'oeuf comprenant une étape d'immunisation d'aviaires par un ADN nu codant pour un antigène protéique, la collecte des oeufs et éventuellement la purification des anticorps produits dans les jaunes d'oeufs. Utilisation des anticorps ainsi obtenus en immunothérapie humaine ou vétérinaire et comme outil de diagnostic.

Description

METHODE DE PRODUCTION D'ANTICORPS DANS LE JAUNE D'ŒUF ET UTILISATION
DES ANTICORPS AINSI OBTENUS
La présente invention a pour objet une méthode de production d'anticorps dans le jaune d'ceuf et l'utilisation des anticorps ainsi obtenus en immunothérapie humaine ou vétérinaire et comme outil de diagnostic.
F. Klemperer a observé pour la première fois que des poules immunisées transmettent les immunoglobulines (IgG) du sérum au jaune d'oeuf (Arc . Exp. Pathol. Pharmacol. (1893), 31, 356-382). Les anticorps du jaune d'oeuf, appelés IgY, sont considérés comme des analogues des IgG humaines mais présentent une structure très différente, notamment au niveau de la chaîne lourde (G. Camenish. et al. the F ASEB Journal, (1999) 13, 81-88). La production d'anticorps dans le jaune d'oeuf, après immunisation par un antigène, présente plusieurs avantages, notamment :
- la quantité d'anticorps par jaune d'ceuf est de l'ordre de 10 mg/g alors qu'elle est de 35 mg/ml dans le sérum de lapin ; sachant qu'une poule pond par an environ 250 oeufs, alors après immunisation à 0, 2, 4 6, 22 et 28 semaines, on récupère au total 40 g d'anticorps, alors que chez le lapin on récupère seulement 1 ,4 g après saignée de l'animal. Ainsi la quantité d'anticorps produits par poule est supérieur d'environ 30 fois à celle des anticorps contenus dans le sérum d'un lapin, (Hatta H. Biosci, Biotech. Biochem., (1993) 57, 450-454),
- les anticorps contenus dans le jaune d'ceuf ne présentent pas de réactions croisées avec les IgG de mammifères, du fait de leurs différences de structures (Hatta H., (référence citée) ; Liu S. S. Comp. Biochem. Physiol. (1999) 97B, 637-644), ce qui en fait un réactif de choix dans les tests d'immunodiagnostics,
- la récolte des oeufs, est un moyen non-invasif d'isoler les anticorps, et - les méthodes de purification d'anticorps à partir du jaune d'ceuf sont simples à mettre en oeuvre (Hatta H. référence citée).
Toutefois, cette technique est limitée par un coût de revient très élevé lié à la production et à la purification en grande quantité d'antigènes pour l'immunisation d'aviaires, notamment des poules ou des canards. En effet, ces antigènes sont pour la plupart des protéines ou des fragments de protéines recombinantes et, afin d'obtenir une production continue d'anticorps à des niveaux élevés dans le jaune d'ceuf. il est nécessaire d'hyperimmuniser des aviaires, par des injections répétées de ces antigènes. La production et la purification, en grande quantité de protéines recombinantes à l'aide de vecteurs d'expression eucaryotes ou procaryotes qui est longue, coûteuse et laborieuse, du fait des nombreuses étapes et de la complexité des techniques mises en oeuvre limite donc l'utilisation de cette technique pour la production à l'échelle industrielle, d'anticorps pour le diagnostic et l'immunothérapie. Du fait des inconvénients décrits ci-dessus, cette technique n'est pas adaptée à la production rapide de banques d'anticorps dirigés contre de nombreux mutants ou variants d'un même antigène, notamment pour le diagnostic différentiel d'infections humaines ou animales.
En outre, cette technique est également limitée du fait que certaines protéines recombinantes sont difficiles à produire en raison de leur niveau d'expression faible ou de leur instabilité, ou sont produites sous une forme peu immunogène (protéine insoluble, protéine dont la conformation est différente de celle de la protéine native ou bien protéine dont la structure antigénique est altérée lors de la purification).
En conséquence, dans le cas de ces protéines difficiles à produire ou peu immunogenes, cette technique n'est pas adaptée à la production d'anticorps présentant une spécificité et un titre élevés pour les antigènes contre lesquels ils sont dirigés.
L'utilisation d'ADN nu pour l'immunisation génétique est une approche vaccinale très efficace développée depuis une dizaine d'années (Tang D. C. et al. Nature, (1992), 356, 152-154). Elle consiste à injecter, dans l'organisme hôte à vacciner, un ADN nu codant un antigène protéique ; cet ADN permet une synthèse prolongée de l'antigène par les cellules de l'hôte ainsi qu'une présentation durable de cet antigène au système immunitaire (Tang D. C. et al. Nature, (1992), 356, 152-154). Cette approche s'est montrée particulièrement prometteuse dans plusieurs modèles animaux d'infections causées par des virus, des bactéries, des parasites ou des mycoplasmes (Lai W.C. et al. Critical Reviews in Immunology (1998), 18, 449-484).
L'immunisation par l'ADN nu permet de produire des anticorps qui ont un effet protecteur (Tang D. C. et al. Nature, ( 1992), 356, 152-154) et induit une réponse immunitaire cellulaire caractérisée par la production de lymphocytes T, capables de reconnaître et de lyser les cellules infectées (Ulmer J. B. et al. ASM News
( 1996), 62, 476-479).
Cependant, le mécanisme d'immunisation par l'ADN nu est complètement différent de celui de l'immunisation par les protéines. En effet, lors d'une immunisation par des protéines, les antigènes extracellulaires sont capturés et dégradés par des cellules présentatrices d'antigène qui vont ensuite activer les réponses humorales. En revanche, l'injection d'ADN nu conduit à la transfection de cellules ainsi qu'à la neosynthese intracellulaire d'une protéine qui lorsqu'elle est sécrétée conduit à activer les réponses humorales et cellulaires En conséquence, la réponse humorale induite par l'immunisation par un ADN codant pour une protéine non sécrétée est souvent beaucoup plus faible que l'immunisation induite par un ADN codant pour une proteme sécrétée
En outre, la réponse immunitaire (humorale et/ou cellulaire) induite par l'immunisation avec l'ADN nu varie également en fonction du modèle animal, de la nature (circulaire ou linéaire) de l'ADN ou de la méthode d'immunisation utilisées (Fyman et al . Proc Nat Acad Sci USA, (1993), 90, 11478 - 11482 ; Fyman et al., DNA and Cell Biology, (1993), 12, 785-789 , Tπyatm et al , Journal of Virology, ( 1998), 72, 84-94 , Sakaguchi et al , , Vaccine, (1996), 14, 747-752)
En utilisant cette méthode d'immunisation, les Inventeurs ont montre récemment que l'immunisation de canards, par un ADN nu expπmant les régions préS et S de la protéine d'enveloppe (protéine L), du virus de l'hépatite B de canard (DHBV), induit une réponse humorale forte, spécifique et de longue durée Cette réponse humorale est au moins aussi bonne que celle induite par l'antigène préS recombinant purifié et est capable de neutraliser le virus et de protéger les canetons nouveaux-nes contre une infection virale (Rolher C. et al Gastroenterology (1999), 116, 658-665) Aussi, poursuivant leurs travaux, les Inventeurs se sont donnes pour but de pourvoir a une méthode de production d'anticorps dans le jaune d'ceuf par immunisation d'espèces aviaires qui pallie les inconvénients des méthodes existantes, en ce qu'elle est simple a mettre en œuvre, rapide, peu coûteuse, et permet de produire, en grandes quantités, des anticorps spécifiques, susceptibles d'être utilisés en immunothérapie humaine ou vétérinaire, et également comme outil de diagnostic
La présente invention a en conséquence pour objet, une méthode de production d'anticorps dans le jaune d'ceuf, caractérisée en ce qu'elle comprend
- une étape d'immunisation des aviaires par un ADN nu codant un antigène protéique, - la collecte des œufs puis des jaunes d'œufs, et
- éventuellement la purification des anticorps produits dans les jaunes d'oeufs Dans un mode de mise en œuvre particulier de ladite méthode, l'immunisation est réalisée chez la poule ou la cane.
Au sens de la présente invention, on entend par ADN nu, aussi bien un ADN codant un antigène ou une protéine appropriés et clone dans un vecteur, notamment dans un plasmide, que les fragments linéaires d'ADN qui expriment un gène eucaryote ou procaryote, notamment les LEEs (Linear Expression Eléments) tels que ceux décrits par Sykes K.F. et al. (Nature Biotechnology (1999), 17, 355-359).
La méthode de production d'anticorps de l'invention présente les avantages suivants : - elle est simple, rapide et économique car elle ne nécessite ni l'expression des protéines, ni leur purification, laquelle est très coûteuse, longue et lourde à mettre en œuvre du fait de la mise au point de techniques spécifiques adaptées à chaque protéine,
- elle est efficace et ne nécessite pas rhyperirnmunisation des aviaires par de nombreuses injections successives ; du fait de la persistance de l'ADN dans les cellules qui conduit à la néo-synthèse permanente de l'antigène, la stimulation constante du système immunitaire résulte en un maintien d'un titre élevé en anticorps pendant de longues périodes,
- elle permet de s'affranchir des problèmes liés à la production et à l'immunogénicité de certaines protéines recombinantes difficiles voir impossibles à exprimer in vitro et peu ou pas solubles car dans la méthode de l'invention, les protéines sont synthétisées in vivo par les cellules de l'hôte et sont donc présentées au système immunitaire sous forme d'un antigène natif,
- elle est facile à mettre en œuvre du fait que l'on peut facilement construire et manipuler des vecteurs à ADN contenant la séquence codante de n'importe quelle protéine dont la séquence est connue,
- elle permet de produire rapidement des banques d'anticorps dirigés contre des mutants ou des variants d'un antigène, notamment des variants antigéniques de virus qui ne peuvent actuellement être détectés du fait de l'absence de réactifs spécifiques.
Par exemple, les Inventeurs ont montré que la purification de la protéine préS correspondant à la région antigénique de la protéine L du virus de l'Hépatite du canard dans un système d'expression procaryote nécessite trois semaines de travail et comporte des étapes complexes et coûteuses alors que le plasmide correspondant est purifié en trois jours, à un coût faible, à l'aide de techniques classiques standardisées. En effet, contrairement, aux techniques de production et de purification de protéines qui demandent de nombreuses mises au point pour chaque protéine, les techniques classiques standardisées de purification d'ADN sont utilisables quelle que soit la séquence de l'antigène contenue dans cet ADN Ainsi, la méthode selon l'invention permet de modifier rapidement la séquence de l' antigène, par mutagenese dirigée, de façon à générer des ADN différents qui pourront être utilises séparément ou en mélange pour la production en grandes quantités d'anticorps spécifiques de différents antigènes et de leurs variants Par exemple, l'immunisation avec un mélange d'ADN différents permet de produire des banques d'anticorps spécifiques de différents antigènes et de leurs variants, qui à l'heure actuelle ne peuvent être détectes par des tests de diagnostic utilisant des anticorps obtenus par immunisation avec des protemes
Au sens de la présente invention, l'ADN utilise code pour un antigène d'intérêt, notamment pour des protéines d'origine animale ou végétale ou des protéines d'organismes pathogènes
Parmi les ADN codant pour des protéines d'oπgine animale ou végétale, on peut notamment citer les ADN codant pour des antigènes expπmés par des cellules tumorales, l'insuline, les allergènes, les toxines, les venins et les facteurs de cioissance Parmi les ADN codant pour des protéines d'organismes pathogènes , on peut citei les ADN codant pour
- les protéines d'origine virale, notamment les protéines du VIH (virus de l'immunodeficience humaine), de la grippe, du virus de la rage, des rotavirus, des hépatites B, C, D et E, du cytomegalovirus humain, des virus de l'herpès, du viras de la dengue, du virus de la polio, du virus de la rougeole, du HTLV I (Human T-cell Leukemia Virus), du NDV (Newcastle Disease Virus), du vu us Ebola, des papillomavirus et du virus de Sendai,
- les protéines d'origine bactérienne, notamment les protéines de M\ cobacteruun tuberculosis et bovis, de Salmonella typhi, de Clostridium telami et de coplasma pulmoms,
- les protéines de parasites, notamment les protemes de protozoaires tels que Plasmodium \ollι (agent de la malaria), Leishmania, Toxoplasma gondu ou Sclustosoma mansoni
Pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention, l'ADN peut êtie injecte soit par voie intradermique, soit par voie intramusculaire, soit par voie mtiaveineuse. soit par voie orale, soit par voie intramuconasale L'ADN peut être injecte sous toutes formes connues de l'homme du métier, notamment en solution saline, sous forme de complexes avec des lipides, sous forme d'aérosol, adsorbe sur des billes d'or ou encapsulé dans des microparticules
De manière inattendue, en utilisant comme modèle la protéine L d'enveloppe du viras de l'Hépatite B du canard, les Inventeurs ont également montre que l 'immunisation par l'ADN nu stimule le système immunitaire de façon plus efficace que l'immunisation par la protéine correspondante notamment lorsqu'un protocole d'immunisation simplifié ne nécessitant qu'un nombre limité d'injection est utilise Selon, un mode de mise en œuvre avantageux de l'invention ladite étape d' immunisation consiste en deux administrations multisites et séquentielles dudit ADN nu
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un anticorps obtenu par la méthode selon l' invention, ledit anticorps étant éventuellement associe a une substance appropπee, pour la préparation d'un reactif îmmunologique susceptible d'être utilise pour le dépistage, le diagnostic et/ou le suivi de maladies, chez l'homme et chez l'animal
Parmi les dites maladies, on peut citer notamment les maladies infectieuses, les cancers et les allergies La présente invention a également pour objet une méthode de dépistage, de diagnostic et/ou de suivi d'une maladie, chez l'homme ou chez l'animal, consistant a détecter la présence d'un antigène éventuellement présent dans un échantillon biologique, notamment dans le sang, caracteπsee en ce qu'elle met en œuvre au moins un anticorps appropné produit conformément à l'invention Dans le cadre de ladite méthode, lorsque l' antigène est présent dans l'échantillon biologique à contrôler, il se lie alors à l'anticorps et ladite liaison est î evelee pai tout moyen approprié connu de l'homme du métier, notamment par RIA, EIA, ELISA, ou par des techniques d'immunoflurorescence et d' immunoelectromicroscopie La présente invention a également pour objet un kit ou trousse de diagnostic pour le dépistage, le diagnostic et/ou le suivi d'une maladie, caractérisé en ce qu' il utilise au moins un anticorps obtenu selon la méthode conforme a l'invention, des reactifs appropries et des moyens pour détecter la formation de la liaison antigène- anticorps La présente invention a également pour objet l'utilisation des jaunes d'oeufs, ou de fractions de jaunes d'oeufs contenant les anticorps produits conformément à l'invention ou des anticorps purifiés produits conformément à l'invention, pour la préparation d'un médicament.
Dans un mode particulier de mise en oeuvre de cette utilisation, le médicament est utile en immunothérapie. Dans un mode encore plus particulier de mise en oeuvre de ladite utilisation, le médicament est destiné à être administré par voie orale, éventuellement en tant qu'additif alimentaire, pour l'immunisation passive contre les virus pathogènes entériques. notamment les rotavirus, ou contre les infections buccales.
Dans un autre mode encore plus particulier de mise en oeuvre de ladite utilisation, le médicament est destiné à traiter une infection choisie dans le groupe constitué par les infections d'origines virales, bactériennes et celles dues aux protozoaires.
Dans un autre mode de mise en oeuvre de ladite utilisation, le médicament est destiné à traiter une maladie choisie parmi les cancers et les allergies. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description et des exemples illustrés par les figures dans lesquelles :
- la figure 1 illustre la cinétique de la réponse humorale chez 3 canes, après immunisation par le plasmide pCI-préS/S selon la méthode décrite dans l'exemple 1. La détection des anticorps anti-préS a été réalisée par un test ELISA direct selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 1. Les flèches indiquent les injections d'ADN réalisées 4, 7, 10 et 28 semaines après la naissance ( — x — ) première cane, ( — B — ) deuxième cane, ( — O — ) troisième cane.
- la figure 2 illustre l'évolution du titre moyen en anticorps anti-préS soit dans le jaune d'œuf de canes immunisées avec le plasmide vide pCI selon la méthode décrite dans l'exemple 1 ( — O — ), soit dans le sérum de canes immunisées avec le plasmide pCI-préS/S selon la méthode décrite dans l'exemple 1 ( — x — ), soit dans des jaunes d'œufs de canes immunisées avec le plasmide pCI-préS/S selon la méthode décrite dans l'exemple 1 ( — B — ). Les résultats sont exprimés en moyenne ± s.e.m. (n=3). La détection des anticorps anti-préS a été réalisée par un test ELISA direct, selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 1. La flèche indique l'injection d'ADN.
- la figure 3 illustre la spécificité des anticorps (IgY) purifiés obtenus conformément à la méthode selon l'invention. Les protéines de sérum infecté par le DHBV (DHBV +) et de sémm non infecté (DHBV -) ont été révélées par immunoblotting avec (A) un antisémm de lapin polyclonal anti-DHBpréS, (B) un sérum de canes immunisées par pCI-préS/S, (C) des IgY d'oeufs pondus par des canes immunisées par pCI-préS/S et (D) des IgY d'oeufs pondus par des canes immunisées par le plasmide vide pCI "p36" correspond à la protéine L du DHBV.
- la figure 4 illustre la neutralisation in vitro de l'infectivité du DHBV par du semm de canes ou par des anticorps (IgY) des jaunes d'œufs de canes Des cultures primaires d'hepatocytes de canes sont infectées par un inoculum de DHBV pre-incube avec du sémm ou des IgY selon le mode opératoire décπt dans l'exemple 2 La libération des particules virales est quantifiée dans le milieu de culture pai une méthode d'hybridation quantitative moléculaire (dot Mot hybndization). Les résultats sont expπmés en moyenne ± s.e.m. (n=2). ( — • — ) pré-mcubation avec du tampon phosphate, ( — — ) pré-incubation avec du sémm de cane témoin immunisée avec le plasmide vide pCI, ( — + — ) pré-incubation avec des IgY témoins, ( — • — ) pre-incubation avec du sémm de canes immunisées par le plasmide pCI-préS/S, (— x— ) pre-incubation avec des IgY d'œufs de canes immunisées par le plasmide pCI préS/S. la figure 5 illustre la cinétique de la réponse humorale chez 3 canes, après immunisation par l'ADN nu codant les régions préS et S de la grande protéine d'enveloppe du DHBV (plasmide pCI-préS/S) ou par la protéine préS recombinante (DHB préS). selon le protocole décπt dans l'exemple 5. La détection des anticorps anti-préS a été réalisée par un test ELISA direct selon le mode opératoire décπt dans l'exemple 1 La flèche pleine représente la première injection 4 semaines après la naissance et la flèche vide représente l'injection de rappel 15 semaines après la naissance ( — \ — ) pCI, ( — Q— )pCI-préS/S, ( — • — ) DHBpréS
- la figure 6 illustre la cinétique de la réponse humorale chez 3 canetons de 3 jours, après immunisation par l'ADN nu codant les régions préS et S de la giande protéine d'enveloppe du DHBV (plasmide pCI-préS/S) ou par la protéine préS recombinante (DHB préS), selon le protocole décrit dans l'exemple 6. La détection des anticorps anti-préS a été réalisée par un test ELISA direct selon le mode opei atoire décrit dans l'exemple 1 La flèche pleine représente l'injection, à 3 jours, de la pioteme recombinante DHBpréS ou du plasmide pCI-préS/S ( — D — ) pCI-préS/S, et ( — • — )DHBpréS EXEMPLE 1 : Production d'anticorps dans le jaune d'œuf après immunisation par ADN
1 1 Matériel et méthodes 1 1 .1. Préparation du plasmide .
Le fragment d'ADN du DHBV codant pour le gène préS/S (nucleotides 801 - 1785) est clone par PCR dans le site Not I du site multiple de liaison ipo linker) du v ecteur pCI (Promega, Charbonnières, France) permettant d'obtenir le plasmide pCI-préS/S. Ce plasmide pCI-préS/S qui code pour la protéine préS/S qui n'est pas sécrétée dans le milieu extracellulaire et le plasmide pCI (témoin négatif) sont introduits dans Escherichia coli et les ADN sont purifiés par chromatographie échangeuse d'anions sur des colonnes Qiagen (Qiagen, Hilden, Germany) et quantifiés par mesure de la densité optique à 260 nm avec marquage au bromure d'éthidium.
1.1.2. Immunisation des : canes :
Un groupe de canes est immunisé par injection intramusculaire dans le quadriceps antérieur droit, de 100 μg de plasmide pCI-préS/S codant pour la protéine L du DHBV, en solution dans du NaCl à 0,9 %, un autre groupe recevant dans les mêmes conditions le plasmide pCI.
Les injections d'ADN sont réalisées, aux semaines 4, 7, 10 et 28 après la naissance, à raison de 100 μg d'ADN par injection pour les semaines 4,7 et 10 et 200 μg d'ADN par injection pour la semaine 28.
1.1.3. Purification . des anticorps : Les anticorps sont extraits et purifiés à partir de chaque jaune d'œuf en utilisant le kit EGGstract (Promega) en suivant les instmctions du fournisseur.
1.1.4. Dosage des anticorps par ELISA :
Les anticorps anti-préS sont détectés par un test ELISA direct utilisant des plaques de microtitration recouvertes de polypeptide DHBpréS, bloquées, lavées et révélées par la méthode décrite par S. Chassot et al. ( Virology (1994), 200, 72-78). Le titre final est considéré comme l'inversé de la plus haute dilution de sémm qui donne une densité optique supérieure à 3SD au dessus du signal moyen des témoins.
1.2. Résultats : 1.2.1. Production .d'anticorps, dans le sérum :
Les résultats sont illustrés dans la figure 1.
La cinétique de la réponse humorale, dans le sémm de trois canes, montre que l'immunisation par un ADN nu, codant pour la protéine préS/S qui n'est pas sécrétée dans le milieu extracellulaire, induit un titre élevé en anticorps anti-préS dans le sérum de l'ordre de 3200 à 14 000 en moyenne par prélèvement de sang.
La quantité d'anticorps atteint son maximum dès la première injection d'ADN, puis on observe un plateau qui se maintient jusqu'à 40 semaines après la naissance.
En revanche chez des canes immunisées par le plasmide pCI, on n'observe pas la production d'anticorps (données non montrées).
1.2.2. Production .d'anticorps ; dans le jaune d'œuf : Les résultats sont illustrés dans la figure 2.
Le titre en anticorps par œuf est de 3200 à 6400 et ce, pour tous les œufs récoltés pendant les six semaines.
La quantité d'anticorps purifiés par oeuf récolté est d'environ 60 à 100 mg et ce, sans variation importante d'un oeuf à l'autre.
Pendant les 6 semaines consécutives de l'expérience, on n'observe pas de diminution du titre en anticorps, ni dans le sémm, ni dans les jaunes d'œufs pondus dans les semaines qui suivent l'injection d'ADN et ce, même en l'absence d'une nouvelle injection d'ADN. Lorsqu'on récolte un œuf par semaine et par animal, la quantité totale d'anticorps produits pendant les 6 semaines est de 360 à 600 mg par animal, et ce de manière non invasive.
Sachant qu'une cane pond un œuf par jour, lorsqu'on récolte tous les œufs pondus par un animal, la quantité totale d'anticorps produits pendant les 6 semaines est de 2,5 à 4,2 g par animal.
Aucune production d'anticorps n'est détectée dans les jaunes d'oeufs de canes non immunisées.
EXEMPLE 2 : Spécificité des anticorps présents dans les jaunes d'œufs. 2.1. Matériel et méthodes :
2.1.1. Immuno^lotting :
Les particules de DHBV sont préparées par ultracentrifugation de sémm de canes présentant une virémie élevée et les particules servant de témoins négatifs sont préparées par ultracentrifugation de sémm de canes non infectées. Les protéines de foie de canes infectées ou non par le DHBV sont extraites selon la technique décrite par S. Chassot et al. (Virology (1993), 192, 217- 223).
Le procédé est celui décrit par Borel C. et al. (Virology (1998), 242, 90-98) et uti lise soit un antiserum de lapin polyclonal anti-DHBpréS (1 : 1000), soit un sérum de canes immunisées par pCI-préS/S, soit des IgY d'oeufs pondus par des canes immunisées par pCI-préS/S, soit des IgY d'oeufs pondus par des canes immunisées par pCI. Après lavage, les filtres sont incubés avec des conjugués de peroxydase G et d' immunoglobulines anti-lapin, anti-souris ou anti-canard et la réaction est mesurée par chimiluminescence (kit Amersham, Courtaboeuf, Les Ullis France). 2.2. Résultats :
Ils sont illustrés à la figure 3. Les anticorps IgY produits dans les jaunes d'œufs après immunisation par pCI-préS/S reconnaissent la protéine d'enveloppe du DHBV, protéine L, d'un poids moléculaire de 36 kDa. présentes dans les particules concentrées dérivées du sémm (Figure 3C). Le profil d'immunoblotting est comparable à celui obtenu avec le sérum de canes préalablement immunisées par le plasmide pCI-préS/S (Figure 3B), ou avec le sérum de lapin immunisé par la protéine recombinante d'enveloppe du DHBV (Figure 3A).
Après immunisation par le plasmide pCI, on n'observe pas de réactivité avec la protéine d'enveloppe du DHBV (Figure 3D).
EXEMPLE 3 : Mesure in vitro du pouvoir neutralisant des anticorps produits dans les jaunes d'œufs 3.1. Matériel et méthodes 3.1.1. Virus : L'inoculum viral est préparé à partir d'un pool de sémm de canetons qui ont été transfectés par le DHBV clone et séquence par Mandait E. et al. (J. Virol. ( 1984), 49, 782-792) et quantifié en équivalents génome du vims (vge) par hybridation moléculaire quantitative (dot Mot hybridization) comme décrit par S. Borel (1998) (référence citée). 3.1.2. Mesure du .pouvoir ;.neutrahsant_ «_ v tro
Le test de neutralisation est réalisé selon la méthode décrite par Rollier C. et al. (1999) (référence citée).
Des cultures primaires d'hépatocytes de canards, obtenus par perfusion du foie, en deux étapes, par de la collagènase, selon la technique décrite par C. Borel et al. ( 1998) (référence citée), sont infectées avec du sémm positif au DHBV (2 x 10 vσe/puits) préalablement incubé pendant une nuit à la température ambiante, soit en présence de sémm de canes immunisées (1 : 10), soit en présence de tampon phosphate.
La libération des particules virales est suivie pendant 8 jours par hybridation quantitative moléculaire.
L'aire sous la courbe des taux de DHBV dans les surnageants reflètent la sécrétion virale totale.
La neutralisation est effective lorsque la diminution de la sécrétion virale totale est d'au moins 50 %. 3.2. Résultats :
Ils sont illustrés dans la figure 4. Dans les cultures primaires d'hépatocytes de canard infectés par l'inoculum de DHBV pré-incubé avec du tampon phosphate, on observe une quantité importante de viras libéré.
La pré-incubation de l'inoculum avec du sémm de canes témoins ou avec des IgY de jaunes d'œufs de canes immunisées par le plasmide pCI, ne modifie pas la sécrétion virale.
En revanche après une pré-incubation de l'inoculum avec du sémm de canes immunisées par le plasmide pCI-préS/S, ou avec des IgY de jaunes d'œufs de canes immunisées par le plasmide pCI-préS/S, on observe respectivement une diminution de 96 % et 99 % de la libération des virions dans le milieu.
EXEMPLE 4 : Mesure in vivo du pouvoir protecteur des anticorps produits dans les jaunes d'œufs
4.1. Matériel et méthodes
Des oeufs fécondés de canes immunisées soit par le plasmide vide pCI, soit par le plasmide pCI-préS/S sont incubés jusqu'à l'éclosion.
Deux jours après leur naissance, on inocule aux canetons le DHBV et on mesure la réponse humorale et la virémie pendant 17 jours.
4.2. Résultats
Ils sont illustrés dans le tableau 1 qui suit : Tableau I
Figure imgf000013_0001
la virémie est mesurée par hybridation quantitative et représente la quantité totale de virions libérés pendant la période de suivi. Tous les canetons nés de canes immunisées par pCI-préS/S et qui contre une épreuve vimlante
Figure imgf000014_0001
En revanche, tous les canetons nés de canes immunisées par pCI ont ière été infectés (tableau 1, 1 ligne).
L'ensemble de ces résultats montrent que la méthode de production d'anticorps dans le jaune d'œuf par immunisation à l'ADN nu codant pour un antigène approprié, conformément à l'invention, est facile à mettre en œuvre et permet de produire en grandes quantités, dans les œufs, des anticoφs spécifiques de cet antigène et de ses variants et qui présentent un fort pouvoir neutralisant et sont hautement protecteurs.
EXEMPLE 5 : Comparaison de la cinétique de la réponse humorale induite par immunisation avec l'ADN nu ou bien avec l'antigène corrrespondant, chez l'adulte. 5. 1 Matériels et méthodes
5.1.1 Préparation du plasmide et de la protéine recombinante Le plasmide pCI-préS/S et le plasmide témoin pCI sont préparés dans les conditions décrites à l'exemple 1. L'antigène préS recombinant purifié est préparé comme décrit dans Rollier et al, 1999, précité. 5.1.2 Immunisation des canes
Un groupe de 3 canes est immunisé à l'âge de 4 semaines par injection sous-cutanée d'un mélange volume/volume de 200 μg d'antigène préS recombinant en solution dans du NaCl à 0,9% et d'une quantité équivalente d'adjuvant complet de Freund. A l'âge de 15 semaines, les canes reçoivent une injection de rappel d'un mélange équivalent dans de l'adjuvant incomplet de Freund.
Un groupe de 3 canes est immunisé à l'âge de 4 semaines par une injection intramusculaire multisites, à trois sites distincts dans les muscles quadriceps antérieurs des deux pattes, de 200 μg de plasmide pCI-préS/S en solution dans du
NaCl à 0,9%. A 15 semaines, les canes reçoivent une injection de rappel, selon le même protocole expérimental.
Un groupe de 3 canes recevant le plasmide pCI dans les mêmes conditions est utilisé comme témoin.
5.1.3 Dosage des anticorps par ELISA
Les anticoφs sériques sont détectés par ELISA, selon le protocole décrit à l'exemple 1.
5.2 Résultats Les résultats sont illustres à la figure 5
La cinétique de la réponse humorale obtenue avec un protocole d'immunisation simplifie comprenant uniquement deux injections (à l'âge de 4 semaines et de 15 semaines), montre que l'ADN nu induit des titres plus élevés que la 5 pioteme coπespondante La quantité d'anticoφs atteint son maximum à la I7ιeme semaine avec un pic en anticoφs de 12800, c'est-a-dire 300 fois supeπeur a celui obseive avec la protéine preS, puis on observe un plateau qui se maintient au moins jusqu'à 22 semaines après la naissance, sans injection de rappel
En revanche, chez des canes immunisées par le plasmide pCI, on 0 n'obseive aucune production d'anticoφs
EXEMPLE 6 : Comparaison de la cinétique de la réponse humorale induite par immunisation avec l'ADN nu ou bien avec l'antigène corrrespondant, chez le caneton.
6. 1 Matériels et méthodes 6 1 1 Préparation du plasmide et de la protéine recombinante
Le plasmide pCI-preS/S et le plasmide témoin pCI sont prépares dans les conditions decπtes a l'exemple 1 L'antigène preS recombinant puπfie est piepare comme decπt dans Rolher et al , 1999, précité
6 1 2 Immunisation des canetons 0 Un groupe de 3 canetons est immunise à l'âge de 3 jours par une injection sous-cutanee d'un mélange volume/volume de 100 μg d'antigène préS î ecoinbmant en solution dans du NaCl a 0.9% et d'une quantité équivalente d'adjuvant complet de Freund et aucun rappel n'est effectue
Un groupe de 3 canetons est immunise à l'âge de 3 jours par une 5 injection intramusculaire multisites, à trois sites distincts dans les muscles quadπceps anteiieuis des deux pattes, de 100 μig de plasmide pCI-preS/S en solution dans du NaCl a 0,9%> et aucun rappel n'est effectue
6 1 3 Dosage des anticorps par ELISA
Les anticoφs seπques sont détectes par ELISA, selon le protocole 0 decnt a 1 exemple 1
6.2 Résultats
Les résultats sont illustres a la figure 6
Les résultats montrent qu'une seule injection d'ADN nu chez le caneton nouveau-ne induit une réponse humorale significative, précoce (détectable a -ι partn de la 7ιeniL semaine) et durable puisque l'on observe un plateau qui se maintient au moins jusqu'à la 22ιurι semaine après la naissance Une seule injection d'ADN nu chez le caneton nouveau-né permet donc d'avoir des anticoφs spécifiques à l'âge ou l'animal est prêt à pondre.
En revanche, l'antigène préS recombinant induit une réponse humorale retardée et transitoire ; les anticoφs sont détectables à partir de la 15ιeme semaine et disparaissent totalement à partir de la 20'erπ semaine.

Claims
REVENDICATIONS
1 Méthode de production d'anticoφs dans le jaune d'œuf caractérisée en ce qu'elle comprend - une étape d'immunisation des aviaires par un ADN nu codant un antigène protéique,
- la collecte des oeufs puis des jaunes d'œufs, et -éventuellement la purification des anticoφs produits dans les jaunes d'œufs 2 Méthode selon la revendication 1, caractéπsée en ce que ladite étape d'immunisation consiste en deux administrations multisites et séquentielles dudit ADN
3 Méthode selon la revendication 1 ou la revendication 2, cai acteπsee en ce que l'immunisation est réalisée chez la poule ou la cane 4 Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caiacteπsee en ce que l'immunisation est réalisée par un plasmide codant un antigène choisi parmi les protéines d'oπgine animale ou végétale et les protéines de microorganismes pathogènes
5 Utilisation d'au moins un anticoφs obtenu par une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, ledit anticoφs étant éventuellement associe a une substance appropriée, pour la préparation d'un reactif immunologique susceptible d'être mis en oeuvre pour le dépistage, le diagnostic et/ou le suivi de maladies chez l'homme ou chez l'animal
6 Méthode de dépistage, de diagnostic et/ou de suivi d'une maladie, chez l'homme ou chez l'animal, consistant à détecter la présence d'un antigène dans un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle met en présence ledit échantillon avec au moins un anticoφs approprie produit par une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 a 4
7 Kit ou trousse de diagnostic pour le dépistage, le diagnostic et/ou le suι\ î d'une maladie, chez l'homme ou chez l'animal, caractérise en ce qu'il met en oeuv ie au moins un anticoφs obtenu par une méthode selon l'une quelconque des îevendications 1 a 4, des reactifs appropries et des moyens pour détecter la formation de liaison antigene-anticoφs
8 Utilisation des jaunes d'oeufs, ou de fractions de jaunes d'oeufs contenant les anticoφs produits par une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 a 4 ou des anticoφs purifies produits par une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, pour la préparation d'un médicament utile en médecine humaine ou vétérinaire.
9. Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que ledit médicament est utile en immunothérapie.
10. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que ledit médicament est destiné à l'immunisation passive contre les agents pathogènes entériques ou les infections buccales, chez l'homme ou chez l'animal.
1 1. Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que ledit médicament est apte à traiter une infection choisie dans le groupe constitué par les infections virales, bactériennes et les infections dues aux protozoaires.
12. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que ledit médicament est apte à traiter les maladies choisies dans le groupe comprenant les cancers et les allergies.
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