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WO1996034840A1 - Fertilizante bacteriano y procedimiento de obtencion - Google Patents

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WO1996034840A1
WO1996034840A1 PCT/ES1996/000097 ES9600097W WO9634840A1 WO 1996034840 A1 WO1996034840 A1 WO 1996034840A1 ES 9600097 W ES9600097 W ES 9600097W WO 9634840 A1 WO9634840 A1 WO 9634840A1
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WO
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medium
culture
hours
cect
burk
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PCT/ES1996/000097
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Inventor
Antonio Martin Gonzalez
Tilman Sanchez Elsner
Original Assignee
Consejo Superior Investigaciones Científicas
Applicaciones Magneticas, S.L.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05F—ORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
    • C05F11/00—Other organic fertilisers
    • C05F11/08—Organic fertilisers containing added bacterial cultures, mycelia or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/065—Azotobacter

Definitions

  • the object of the present invention is a bacterial fertilizer consisting of a suspension containing cells of new strains of the microorganisms Rzotobacter and Azo ⁇ plrillum. Said microorganisms and the procedure for obtaining said bacterial fertilizer also constitute another object of the present invention.
  • the main atmospheric nitrogen-fixing microorganisms that have been used as bacterial fertilizers are Rzotobacter and Azo ⁇ pirllum.
  • Rzotobacter has been used as a nitrogenous fertilizer in some plants of agricultural interest such as corn, wheat, potato, beetroot, tobacco, barley, flax, oats, carrots, cabbage and tomato. Inoculation with Rzotobacter as a bacterial fertilizer has been developed for many years (Rubenchic L.I., "Azotobacter and Its Use in Agriculture". Academy of Sciences of the Ukrainian SSR. Microbiological Institute im. D.K. Zabolotnyi, 1963). Of all the strains, the most used as inoculant has been R. chroococcum, as it is the most frequent and abundant in the soil (Krieg N.R, Holt, J.G., Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1984).
  • the favorable effect of the inoculation with Azotoiacter and Rzo ⁇ pirillum cells on different agricultural crops is the product of a multiple action because it represents an alteration of the suppressive microbial balance of pathogenic microorganisms, mobilization of phosphates, assimilation of exudates from the roots of the plants (acid p -hydroxybenzoic, ... ) and production of metabolites such as phytohormones that stimulate growth before and after germination, also representing a very considerable saving in nitrogen fertilizers due to the fixation of N 2 in the soil.
  • Rzotobacter and Rzo ⁇ pirillum are related not only to their ability to fix N 2 but also to the ability to produce antibacterial and antifungal compounds, growth regulators, and siderophores (Pandey, A.; "Potential of Azotobacters and Azospirilla as biofertilizers for upland agriculture: a review”; Journal of Scientific and Industrial Research 48.3, 134-144, 1989).
  • the saving of nitrogenous fertilizers supposes a parallel saving of fossil fuels.
  • the object of the present invention is a bacterial fertilizer that contains cells of new strains of the microorganisms Rzotobacter and Rzo ⁇ pirillum specifically developed to improve N 2 fixation and potentiate alginate biosynthesis. .
  • aqueous medium Purk medium
  • the microorganisms suspended in said medium are a strain of Rzotobacter vinelandii deposited in the Spanish Type Culture Collection (CECT) with the number CECT 4534 and a strain of Rzo ⁇ pirillum bra ⁇ ilen ⁇ e deposited in the Spanish Collection of Type Cultures with the number CECT 4533.
  • CECT Type Culture Collection
  • Rzotobacter and Rzo ⁇ pirillum cells By subjecting Rzotobacter and Rzo ⁇ pirillum cells in liquid and solid cultures (with agar-agar) to different substrates, variants of these strains capable of fixing more atmospheric nitrogen, synthesizing more phytohormones (cytokinins, auxins, . . . ) and metabolites such as alginates and essential amino acids, such as usine and methionine, in higher concentration.
  • phytohormones cytokinins, auxins, . . .
  • metabolites such as alginates and essential amino acids, such as usine and methionine
  • strains also present a greater facility for using waste products as substrates, for example, the exudates of the roots of the plants (ortho-, meta- and parahydroxybenzoic acids,%) and agricultural residues such as molasses, vine shoots, stillage, etc
  • waste products for example, the exudates of the roots of the plants (ortho-, meta- and parahydroxybenzoic acids,...) and agricultural residues such as molasses, vine shoots, stillage, etc
  • alginates allows these Rzotobacter and Rzo ⁇ pirillum cells to better adhere to plant roots and at the same time have this capsular substrate available for growth and reproduction in the soil.
  • the contribution of DL glutamic acid is intended to inhibit the nitrogenase enzyme to enhance alginate biosynthesis.
  • cells are obtained, isolated on plates, which in subsequent standardized cultures, with sucrose as a substrate, reach a production of 2.4 g/1 of alginate with a high index of uronic acids (the basis for good gelation). These cells are designated by the initials 382 12 E of R . vinelandii . At the same time that they synthesize a greater amount of alginate, they fix a higher N 2 concentration than the original strains.
  • the strains of Rzo ⁇ pirillum bra ⁇ ilen ⁇ e obtained from the 590 CECT strain are prepared by the same procedure as in the case of Rzotobacter , but with D-Ribose as the only substrate in all steps, obtaining a strain called Rzo ⁇ pirillum with the acronym 40AM.
  • bra ⁇ ilen ⁇ e that has been deposited in the CECT having been assigned the number CECT 4533.
  • the ideal culture medium for the best development of Rzotobacter and Rzo ⁇ pirillum cells is the following:
  • the final pH of the culture medium is adjusted to 7.4.
  • the strains of AzotoJ acter vinelandii and Rzo ⁇ pirillum bra ⁇ ilen ⁇ e are seeded on solid media in Petri dishes and incubated at 30°C for a period of time between 72 and 96 hours. These freshly grown, pure cultures are used to inoculate 300 ml flasks with 100 ml of culture medium, which are incubated at a temperature between 30 and 32°C for 120 hours at 175 revolutions per minute in an orbital incubator.
  • the cell biomass of the mixture of Rzotobacter and Rzo ⁇ pirillum is then available to be inoculated into the seeds and subsequently into the soil.
  • Rzotobacter and Rzo ⁇ pirillum cells will serve the Rzotobacter and Rzo ⁇ pirillum cells as an energy reserve for their subsequent development in the soil, at the same time that they will allow them to adhere more easily to the roots of the plants. 3.- These variants of Rzotobacter and Rzo ⁇ pirillum also have a greater capacity to assimilate the compounds formed by the exudates of the roots of the plants, such as p-hydroxybenzoic acid, which is hardly used by other strains.
  • the speed of reproduction and assimilation of the substrates is also higher in the Rzotobacter and Rzo ⁇ pirillum variants than in the known strains, since the maximum dry weight reached by them is up to 3 times higher after 52 hours of culture. submerged at about 28-30°C. 5.- The performance and effectiveness of these Rzotobacter variants is much higher than the known strains and the initial strain 382 DSM, also synthesizing polysaccharides with a high gelling index (alginates).
  • the cell biomass production of the Rzotobacter strain 24 APV is of the order of 4 g/1 dry weight of lyophilized cells.

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Abstract

La presente invención es un fertilizante bacteriano (biofertilizante) consistente en una suspensión que contiene células de nuevas estirpes de los microorganismos Azotobacter vinelandii y Azospirillum brasilense. Dicho fertilizante bacteriano consiste en una suspensión de microorganismos en un medio acuoso. Los microorganismos se obtienen por un procedimiento que comprende: a) cultivo en placa de la estirpe original; b) tratamiento de las colonias precedentes del cultivo anterior con otro medio de cultivo; y c) cultivo de las colonias aisladas del paso anterior. Las ventajas que supone el empleo de estas nuevas estirpes de microorganismos vienen dadas por su mejor tolerancia a medios muy alcalinos y la mejor fijación de N2 así como por la mayor capacidad de asimilación de los compuestos formados por los exudados de las raíces de las plantas.

Description

MEMORIA DESCRIPTIVA Fertilizante bacteriano y procedimiento de obtención
OBJETO DE LA INVENCIÓN
El objeto de la presente invención es un fertilizante bacteriano consistente en una suspensión que contiene células de nuevas estirpes de los microorganismos Rzotobacter y Azoεplrillum. Dichos microorganismos y el procedimiento de obtención de dicho fertilizante bacteriano constituyen igualmente otro objeto de la presente invención.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Los principales microorganismos fijadores de nitrógeno atmosférico que se han empleado como fertilizantes bacterianos (biofertilizantes) son el Rzotobacter y el Azoεpirlllum.
El Rzotobacter, se ha utilizado como fertilizante nitrogenado en algunas plantas de interés agrícola como el maiz, trigo, patata, remolacha, tabaco, cebada, lino, avena, zanahoria, repollo y tomate. La inoculación con Rzotobacter como fertilizante bacteriano se ha desarrollado durante muchos años (Rubenchic L.I., "Azotobacter and Its Use in Agriculture" . Academy of Sciences of the Ukranian SSR. Microbiological Institute im. D.K. Zabolotnyi, 1963). De todas las estirpes, la más utilizada como inoculante ha sido R. chroococcum, por ser la más frecuente y abundante en el suelo (Krieg N.R, Holt, J.G., Williams and Wilkins Co. , Baltimore, 1984).
Por otra parte, es de gran interés la capacidad de estos microorganismos de sintetizar substancias activadores de crecimiento vegetal, como las fitohormonas (citoquininas, auxinas, ... ) (González López y col., Soil Biol. Biochem. 18:119-120, 1986) ya que es lo más destacable en su interacción con las plantas. Entre las auxinas estudiadas en Rzotobacter vinelandii figuran el ácido 3-indol-acético y el ácido 3-indol-láctico (García Bilbao, J. ; Tabares F. y col., 1. of Appl. Microbiol. Biotechnol. 25:502-506, 1987). Se han aislado en plantas de Zea mays cultivadas en suelos agrícolas, densidades importantes de R . chroococcum (Martínez Toledo, FEMS Microbiol. Ecol. 31:197-203, 1985) demostrando una asociación entre el AzotoJ acter y las raices del maíz. La inoculación de Zea mayε con Rzotobacter representa un incremento importante en el peso seco de la planta, aunque el tamaño de las hojas no se ve afectado. La aplicación de 40 Kg/Ha de nitrógeno más Rzotobacter origina los más altos rendimientos en grano. Por otra parte, la inoculación del maíz con R. chroococcum, aislados directamente de sus raíces, representa un efecto favorable, originando en dosis pequeñas mejores resultados (González López y col., Soil Biol. Biochem. 18:119-120, 1986).
Usando urea con Rzotobacter y Rzoεpirillum, [Tilak K . V. y col., "Azospirillum brasilense and Azotobacter chroococum: Effect on the yield of maize (Zea mays) and sorgum (Sorgum bicolor), 1982] se obtuvieron resultados similares en Zea mays. La inoculación con Azotoiacter origina unos importantes beneficios económicos al aplicarse conjuntamente con pequeñas dosis de fertilizante nitrogenado, no sólo por su incremento significativo en la producción agrícola, sino, al mismo tiempo, por el ahorro en fertilizantes de nitrógeno (Meshram; Shend; Plant and Soil 69:265-273, 1982). En muchas ocasiones se ha empleado conjuntamente como inoculantes Rzotobacter y Rzoεpirillum obteniéndose resultados más satisfactorios que al emplear únicamente AzotoJbacter chroococcum (Tilak y col . , ver referencia más arriba). Sin embargo, algunos cultivos como el trigo muestran mayor rendimiento con la inoculación de un solo microorganismo ( Zambre y col., Plant and Soil 82:61-67, 1984). En la patente de n° de solicitud 554728 se describen los primeros mutantes de Azotobacter que mostraban una mayor capacidad de fijación de N2 y su utilización como biofertilizantes.
Hay diferentes formas de inocular con Rzotobacter loε distintos tipos de plantas, bien con células liofilizadas (Meshram y Shende, ver referencia anterior) o preparación en forma de suspensiones inoculadas mediante bomba peristáltica (Smith R.L., Appl. Environ. Microbiol. 47:1331-1336, 1984). Según González López (ver referencia anterior) la doble inoculación permite una acción mas efectiva y prolongada del inoculante, consiguiéndose los rendimientos más altos.
La cantidad de nitrógeno acumulado en el terreno de cultivo con trigo, debido al efecto provocado por Rzoεpirillum y Rzotobacter , es comparable con las cantidades de nitrógeno aplicadas comúnmente como fertilizante. La inoculación con Rzoεpirillum de guisantes nodulados naturalmente, causó un significativo aumento en el número de nodulos respecto a los controles y se produjo un aumento de la cosecha
El método de inoculación en caña de azúcar, bañando la raíz en Rzotobacter , dio como resultado un incremento respecto al testigo sin inocular, de un 24,3%.
En ensayos de campo realizados con arroz, se utilizaron dosis de nitrógeno (como urea) del 0, 50, 75 ó 100% de las cantidades recomendadas. El uso de biofertilizantes (Rzoεpirillum lipoferum ) más el 50% de la dosis recomendada en cada tipo de terreno es equivalente al empleo del 100% de urea.
Inoculando con AzotoJbacter, las siguientes plantas: Reacia auriculiformiε , Gmelina arbórea, Tectona grandiε , Dalbergia εiεεo , se logró aumentar la supervivencia de un 15 a un 75%. En estudios con esquejes de morera se logró un mayor rendimiento en la producción de madera, altura del arbolado, tamaño y longitud de las hojas al inocular con Rzotobacter.
Estudios en maíz, inoculados con Rzoεpirillum braεilenεe, lograron altos rendimientos en el desarrollo de las plantas.
El incremento en semillas de roble, en diversos suelos inoculados con AzotoJ acter, fue del 70,7% en el peso seco de las raíces y del 45% en el de las ramas, a los 90 días de crecimiento.
La aplicación de Rzotobacter y un solubilizador de fosfatos
(Bacillum megaterium ) ( fosfobacterina) incrementó todos los parámetros medios a los 8 meses sobre los controles: 20,2% la altura, 37,7% el diámetro de la rizosfera, 34,6% el peso fresco y un 44% el peso seco.
Inoculando con seis imitantes de Rzoεpirillum semillas de mijo, utilizando distintas dosis de nitrógeno, se consiguió un aumento medio de la producción de un 67% en el peso seco de la paja y de un 56,36% en el peso seco del grano. Esta inoculación supone un ahorro de 20 Kg de nitrógeno por Ha y un incremento de un 50% en la aplicación de este elemento.
Inoculando con Rzoεpirillum braεilenεe semillas de arroz y sorgo y crecidas en tierra sin fertilizantes nitrogenados, se obtuvo un incremento en la producción sobre terrenos fertilizados con 40 Kg de nitrógeno por Ha, del 28,14% en el cultivo de arroz.
Inoculando trigo con Rzoεpirillum lipoferum , se logró un incremento en la producción de grano por Ha del 64,3% en terrenos sin fertilizar, un 31,22% en cultivos con 40 Kg de nitrógeno por Ha y un 40,22 % con 80 Kg de éste fertilizante. El incremento en la producción de paja fue de 18,54%,
17,90% y 32,52%, respectivamente. El aumento en la producción de arroz, inoculando las semillas con Rzoεpirillum braεilenεe, es debido a la síntesis de factores de crecimiento y a la fijación de N2.
Inoculando durante 10 minutos Rzotobacter y Rhizobium, tanto juntas como por separado, en Piεum εativum L . , se observó un incremento en la altura de las plantas, el número de ramas por planta, la producción y en el contenido en proteína de las semillas. Al sustituir el Fe+2 por Fe0 micronizado en el medio de cultivo, se observa un incremento en la fijación de N2 por Rzotobacter y en el peso seco de las células (patente publicada con el n° ES-2041219).
En la patente europea de n° de publicación EP-0570079 se describen estirpes de Azospirillum mediante las cuales se consigue estimular el crecimiento de plantas de cereales.
El efecto favorable de la inoculación con células de Azotoiacter y Rzoεpirillum sobre distintos cultivos agrícolas es producto de una acción múltiple por representar una alteración del equilibrio microbiano supresor de microorganismos patógenos, movilización de fosfatos, asimilación de exudados de las raíces de las plantas (ácido p-hidroxibenzoico, ... ) y producción de metabolitos como las fitohormonas que estimulan el crecimiento antes y después de la germinación, suponiendo también un ahorro muy considerable de fertilizantes nitrogenados por la fijación de N2 en el suelo.
Los efectos beneficiosos de Rzotobacter y Rzoεpirillum están relacionados no sólo con su capacidad para la fijación de N2 sino también con la aptitud para la producción de compuestos antibacterianos y antifúngicos, reguladores de crecimiento y sideróforos (Pandey, A.; "Potential of Azotobacters and Azospirilla as biofertilizers for upland agriculture: a review"; Journal of Scientific and Industrial Research 48,3, 134-144, 1989 ) . El ahorro de fertilizantes nitrogenados supone un ahorro paralelo de combustibles fósiles. Es evidente que esta relación implique un enorme interés por conseguir fertilizantes bacterianos que puedan sustituir en parte en su totalidad al nitrógeno procedente de la síntesis amoniacal y, por otra parte, desde un punto de vista ecológico es necesario también sustituir estos fertilizantes nitrogenados por biofertilizantes que eviten la degradación del suelo.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
A diferencia del estado de la técnica, el objeto de la presente invención es un fertilizante bacteriano que contiene células de nuevas estirpes de los microorganismos Rzotobacter y Rzoεpirillum específicamente desarrolladas para conseguir una mejora de la fijación de N2 y una potenciación de la biosíntesis de alginatos. Dicho fertilizante bacteriano consiste en una suspensión de microorganismos en un medio acuoso (medio Burk) de pH=7,4 que contiene 1,6 gramos/litro de sacarosa; 0,8 g/1 de P04HK2; 0,2 g/1 de P04H2K; 0,2 g/1 de S04Mg.7H2O; 0,05 g/1 de S04Ca; 0,05 g/1 de S04Fe y 0,001 g/1 de molibdato sódico. Los microorganismos suspendidos en dicho medio son una estirpe de Rzotobacter vinelandii depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número CECT 4534 y una estirpe de Rzoεpirillum braεilenεe depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con el número CECT 4533.
El microorganismo AzotoJbacter vinelandii CECT 4534 constituye igualmente objeto de la invención y se obtiene mediante un procedimiento que comprende: a) cultivo en placa de la estirpe original Rzotobacter vinelandii 382 DSM (Colección Alemana de Microorganismos), en medio Burk con D-glucosa al 1,6% (peso/volúmen) en lugar de sacarosa durante 72 horas. b) tratamiento de las colonias procedentes del cultivo anterior con un medio de cultivo Burk que contiene 0~05 % de ácido D-L glutámico y 1,6 % (peso/volúmen) de manitol en lugar de sacarosa mediante cultivo en placa durante un período de tiempo comprendido entre 72 y 96 horas. c) cultivo de las colonias aisladas del paso anterior con un medio que contenga un 2% de glutamina y 0,05% de ácido D-L glutámico a pH=7,8 durante 72 horas.
El microorganismo Rzoεpirillum braεilenεe CECT 4533 es asimismo objeto de la presente invención y se obtiene mediante un procedimiento que comprende: a) cultivo de la estirpe original Rzoεpirillum braεilenεe 590 CECT, en medio Burk con D-Ribosa al 1,6% (peso/volúmen) en lugar de sacarosa durante 72 horas. b) tratamiento de las colonias procedentes del cultivo anterior con un medio de cultivo que contiene 0,05% de ácido D-L glutámico y 1,6% (peso/volúmen) de manitol en lugar de sacarosa mediante cultivo en placa durante un período de tiempo comprendido entre 72 y 96 horas. c) cultivo de las colonias aisladas del paso anterior con un medio que contenga 2% de glutamina y 0,05 % de ácido D-L glutámico a pH =7,8 durante 72 horas.
El procedimiento de preparación del fertilizante bacteriano es igualmente objeto de la invención y comprende: a) cultivo en placa de las estirpes Rzotobacter vinelandii CECT 4534 y Rzoεpirillum braεilenεe CECT 4533 en un medio Burk de pH=7,4 que contiene 1,6 gramos/litro de sacarosa; 0,8 g/1 de P04HK2; 0,2 g/1 de P04H2K; 0,2 g/1 de S04Mg.7H20; 0,05 g/1 de S04Ca; 0,05 g/1 de S04Fe y 0,001 g/1 de molibdato sódico e incubación a 30°C durante un período de tiempo comprendido entre 72 y 96 horas. b) crecimiento del cultivo anterior mediante inoculación de matraces de 300 mi de capacidad con 100 mi del medio de cultivo utilizado en el paso anterior e incubación en agitador orbital a 175 revoluciones por minuto durante 120 horas a una temperatura comprendida entre 30 y 32°C. c) inoculación en fermentador al 1% de inoculo en volumen en un medio Burk, con una titulación mínima de Rzotobacter vinelandii y Rzospirillum braεilenεe de 109 bacterias/ml para cada microorganismo, y cultivo a una temperatura comprendida entre 30 y 32°C durante 52 horas en condiciones de aireación mediante pulverización de aire en el medio por un filtro de vidrio poroso a un flujo de 300 litros de aire por minuto previamente esterilizado mediante filtro de 0,45, μm a una presión de 1 Kg/cm2.
DESCRIPCIÓN DETALLADA Y MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
Sometiendo células de Rzotobacter y Rzoεpirillum en cultivos líquidos y sólidos (con agar-agar) a diferentes substratos, se consiguen variantes de éstas estirpes capaces de fijar más nitrógeno atmosférico, sintetizar más fitohormonas (citoquininas, auxinas, . . . ) y metabolitos como los alginatos y aminoácidos esenciales, como la usina y metionina, en mayor concentración. Estas estirpes presentan también una mayor facilidad para utilizar como sustratos productos de deshecho, por ejemplo, los exudados de las raíces de las plantas (ácidos orto-, meta- y parahidroxibenzoico, ... ) y residuos agrícolas como melazas, sarmientos, vinazas, etc. La biosíntesis de polisacáridos gelificantes (alginatos), permite a estas células de Rzotobacter y Rzoεpirillum adherirse mejor a las raíces de las plantas y al mismo tiempo disponer de este sustrato capsular para su crecimiento y reproducción en el suelo.
Cultivo de Rzotobacter vinelandii
Partiendo de la estirpe original de Rzotobacter vinelandii 382 DSM (Colección Alemana de Microorganismos), cultivada durante 72 horas en un medio Burk, con D-glucosa al 1,6% (peso/volúmen) en lugar de sacarosa, en placas Petri y en cultivos líquidos, se consigue mediante purificación y aislamiento de colonias, unas células de AzotoLacter que producen 1,7 g/1 de alginato en lugar de 0,25 g/1 y consiguen fijar mayor cantidad de N2. Estas células se denominan con las siglas 383 I? de Azotobacter vinelandii.
Posteriormente se tratan y someten durante un período de tiempo comprendido entre 72 y 96 horas a un medio de cultivo
Burk que contiene 0,05 % de Acido D-L glutámico y 1,6% de manitol como sustrato en lugar de sacarosa, por ser éste un precursor del ácido algínico. La aportación del ácido D-L glutámico tiene por objeto inhibir la enzima nitrogenasa para potenciar la biosíntesis del alginato. De esta forma se consiguen células, aisladas en placa, que en posteriores cultivos normalizados, con sacarosa como sustrato, llegan a una producción de 2,4 g/1 de alginato con un alto índice de ácidos urónicos (base de una buena gelificación) . Estas células se denominan con las siglas 382 12E de R . vinelandii . Al mismo tiempo que sintetizan mayor cantidad de alginato fijan una concentración de N2 superior a las estirpes originales.
Para seguir potenciando la fijación de N2 y la biosíntesis de alginatos, se someten de nuevo las células de las colonias
382 I2P de R. vinelandii durante 72 horas a un medio de cultivo con el 2% de glutamina y 0,05% de ácido D-L-glutámico a pH=7,8.
De igual forma que en el paso anterior se consigue aislar colonias que, en cultivos normalizados con sacarosa al 1,6% como sustrato, dan lugar a mayor biosíntesis de alginato (2,7 g/1) y mayor fijación de N2 (77% más en forma de ion NH4+ en el medio de cultivo). Esta estirpe se denomina con las siglas 24APV de
Rzotobacter vinelandii y ha sido depositada en la Colección
Española de Cultivos Tipo (CECT), habiéndosele asignado el número CECT 4534. Cultivo de Rzoεpirillum brasilense
Las estirpes de Rzoεpirillum braεilenεe obtenidas a partir de la estirpe 590 CECT, se preparan mediante el mismo procedimiento que en el caso del Rzotobacter , pero con D-Ribosa como único sustrato en todos los pasos, obteniéndose una estirpe denominada con las siglas 40AM de Rzoεpirillum braεilenεe que ha sido depositada en la CECT habiéndosele asignado el n° CECT 4533.
Desarrollo de las células de 24APV Rzotobacter vinelandii y de 40AM Rzoεpirillum braεilenεe
El medio de cultivo ideal para el mejor desarrollo de las células de Rzotobacter y de Rzoεpirillum es el siguiente:
substrato: Sacarosa 1,6 g/1 sales: P04HK2 0,8 g/1
P04H2K 0,2 g/1 S04Mg . 7H20 0 , 2 g/1
S04Ca 0 , 05 g/1
Molibdato sódico ... 0,001 g/1 oliqoele- mentos: S04Fe 0,05 g/1
El pH final del medio de cultivo se ajusta a 7,4.
Utilizando este medio de cultivo se siembran las estirpes de AzotoJ acter vinelandii y de Rzoεpirillum braεilenεe en medios sólidos en placas Petri y se incuban a 30°C durante un período de tiempo comprendido entre 72 y 96 horas. Estos cultivos puros y de reciente crecimiento sirven para inocular matraces de 300 mi de capacidad con 100 mi de medio de cultivo, que se incuban a una temperatura comprendida entre 30 y 32°C durante 120 horas a 175 revoluciones por minuto en un incubador orbital. Una vez crecidos, se inoculan en un reactor fermentador, a una temperatura comprendida entre 30 y 32°C, añadiendo el 1% de inoculo, expresado en volumen, en un medio Burk con una titulación mínima de Rzotobacter vinelandii y Rzoεpirillum J rasilense de 109 bacterias/ml para cada microorganismo. El cultivo se lleva acabo en condiciones de aireación haciendo pasar por dicho reactor 300 litros de aire por minuto previamente esterilizado mediante filtro de 0,45 μm a una presión de 1 Kg/cm2. El aire se pulveriza en el medio por un filtro de vidrio poroso. El tiempo óptimo de este cultivo sumergido es de 52 horas.
La biomasa celular de la mezcla de Rzotobacter y Rzoεpirillum está entonces disponible para ser inoculada en las semillas y posteriormente en el suelo.
Las ventajas que supone el empleo de las cepas de Rzotobacter y de Rzoεpirillum objeto de la presente invención sobre las estirpes conocidas son las siguientes: 1.- Las estirpes conseguidas de Rzotobacter y Rzoεpirillum se reproducen bien a una mayor amplitud de pH y mejor que las estirpes conocidas, soportando medios muy alcalinos (pH=10), evitándose por lo tanto problemas de esterilización y posibles contaminaciones. 2.- Dichas estirpes están capacitadas para fijar mas N2 y eliminar más fácilmente el ion NH4 + al medio de cultivo, excretando al mismo tiempo polisacáridos con mayor concentración que las estirpes conocidas. Estos polisacáridos servirán a las células de Rzotobacter y Rzoεpirillum como reserva energética para su posterior desarrollo en el suelo al mismo tiempo que les permitirán adherirse más fácilmente a las raíces de las plantas. 3.- Estas variantes de Rzotobacter y Rzoεpirillum poseen también una mayor capacidad de asimilación de los compuestos formados por los exudados de las raíces de las plantas, como el ácido p-hidroxibenzoico, que apenas es utilizado por otras estirpes.
4.- La velocidad de reproducción y asimilación de los substratos es también mayor en las variantes de Rzotobacter y Rzoεpirillum que en las estirpes conocidas, ya que el peso seco máximo alcanzado por ellas llega a ser hasta 3 veces superior a las 52 horas de cultivo sumergido a unos 28-30°C. 5.- El rendimiento y la efectividad de estas variantes de Rzotobacter es muy superior a las estirpes conocidas y a la estirpe inicial 382 DSM, sintetizando también polisacáridos con alto índice gelificante (alginatos) . La producción de biomasa celular de la estirpe 24 APV de Rzotobacter es del orden de 4 g/1 de peso seco de células liofilizadas. Partiendo de sacarosa como único sustrato, a una concentración del 1,6 % se obtiene un rendimiento del 25%, es decir de cada 16 gramos de sacarosa se obtienen 4 gramos de peso seco de células del microorganismo que se cultiva . Teniendo en cuenta que, según Rubenchick (ver referencia en ESTADO DE LA TÉCNICA), la cantidad de células de Azotoíbacter necesarias para fertilizar una Ha es del orden de 25 a 40 g, esta cantidad equivaldría a unos 7,51 de cultivo celular aproximadamente. Es decir, que con 120 g de sacarosa como único sustrato, se obtienen las células de Rzotobacter necesarias para la fertilización de una Ha.
Se han realizado diversas pruebas en invernadero y en campo con distintos tipos de plantas como tomate, zanahoria, remolacha y repollo, inoculando las semillas y regando el terreno en el que fueron sembrados con una suspensión de células de varias estirpes de Rzotobacter y Rzoεpirillum. Los resultados, tanto en invernadero como en campo, demostraron un efecto muy superior de las estirpes objeto de la presente invención sobre las estirpes conocidas.

Claims

REIVINDICACIONES MODIFICADAS[recibidas por la oficina Internacional el 10 de Septiembre de 1996 (10.09.96); reivindicaciones 1-4 reemplazadas por las nuevas reivindicaciones 1-6;(2 páginas)]
1.- Fertilizante bacteriano consistente en una suspensión de microorganismos en un medio acuoso (medio Burk) de pH=7,4 que contiene 1,6 gramos/litro de sacarosa; 0,8 5 g/1 de PO4HK2; 0,2 g/1 de PO4H2K; 0,2 g/1 de SO4Mg.7H2O; 0,05 g/1 de SO4Ca; 0,05 g/1 de SO4Fe y 0,001 g/1 de molibdato sódico, caracterizado porque los microorganismos suspendidos en dicho medio son una estirpe de Azotobacter vinelandii depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número CECT 4534 y una estirpe de Azospirillum brasilense depositada en la 10 Colección Española de Cultivos Tipo con el número CECT 4533.
2.- Microorganismo que pertenece a la estirpe Azotobacter vinelandii, depositado en la CECT con el número 4534.
15 3.- Procedimiento de obtención del microorganismo según reivindicación 2, caracterizado por las siguientes etapas: a) cultivo en placa de la estirpe original Azotobacter vinelandii 382 DSM, en medio Burk con D-glucosa al 1,6% (peso/volúmen) en lugar de sacarosa durante 72 horas. b) tratamiento de las colonias procedentes del cultivo anterior con un medio de 20 cultivo Burk que contiene 0,05% de ácido D-L glutámico y 1,6% (peso/volúmen) de manitol en lugar de sacarosa mediante cultivo en placa durante un periodo de tiempo comprendido entre 72 y 96 horas. c) cultivo de las colonias aisladas del paso anterior con un medio que contenga un 2% de glutamina y 0,05% de ácido D-L glutámico a pH=7,8 durante 72 horas.
25
4.- Microorganismo que pertenece al género Azospirillum brasilense, depositado en la CECT con el número 4533.
5.- Procedimiento de obtención del microorganismo según reivindicación 3, 30 caracterizado por las siguientes etapas: a) cultivo en placa de la estirpe original Azospirillum brasilense 590 CECT , en medio Burk con D-Ribosa al 1,6% (peso/volúmen) en lugar de sacarosa durante 72 horas. b) tratamiento de las colonias procedentes del cultivo anterior con un medio de cultivo Burk que contiene 0,05% de ácido D-L glutámico y 1,6% (peso/volúmen) de manitol en lugar de sacarosa mediante cultivo en placa durante un periodo de tiempo comprendido entre 72 y 96 horas. c) cultivo de las colonias aisladas del paso anterior con un medio que contenga 2% de glutamina y 0,05% de ácido D-L glutámico a pH=7,8 durante 72 horas.
6.- Procedimiento para la preparación de un fertilizante bacteriano caracterizado porque dicho procedimiento comprende: a) cultivo en placa de las estirpes Azotobacter vinelandii CECT 4534 y Azospirillum brasilense CECT 4533 en un medio Burk de pH=7,4 que contiene 1,6 gramos/litro de sacarosa; 0,8 g/1 de PO4HK2; 0,2 g/1 de PO4H2K; 0,2 g/1 de SO4Mg.7H2O; 0,05 g/1 de SO4Ca; 0,05 g/1 de SO4Fe y 0,001 g/1 de molibdato sódico e incubación a 30°C durante un periodo de tiempo comprendido entre 72 y 96 horas. b) crecimiento del cultivo anterior mediante inoculación de matraces de 300 mi de capacidad con 100 mi del medio de cultivo utilizado en el paso anterior e incubación en agitador orbital a 175 revoluciones por minuto durante 120 horas a una temperatura comprendida entre 30 y 32 °C. c) inoculación en fermentador al 1% de inoculo en volumen en un medio Burk, con una titulación mínima de Azotobacter vinelandii y Azospirillum brasilense de 109 bacterias/ml para cada microorganismo, y cultivo a una temperatura comprendida entre 30 y 32 °C durante 52 horas en condiciones de aireación mediante pulverización de aire en el medio por un filtro de vidrio poroso a un flujo de 300 litros de aire por minuto previ-tmeníe esterilizado mediante filtro de 0,45 μm a una presión de 1 Kg/cm2.
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998037038A3 (de) * 1997-02-25 1998-11-12 Arpad Pollak Methode der stickstoffbindung aus der luft, mobilisation der phosphorverbindungen und der zersetzung des ölsedimentes
WO2001032587A1 (en) * 1999-11-01 2001-05-10 'piksa Inter' Ltd Biological addition to organic-mineral fertilizers
WO2001085916A1 (en) * 2000-05-12 2001-11-15 Biofarmtech Co., Ltd. A medium material selectively culturing prokaryote comprising rotting organic wastes and a method for cultivating crops using same
WO2003016241A1 (en) * 2001-08-13 2003-02-27 Agro.Bio Hungary Kft. Micro-organisms for the treatment of soil and process for obtaining them
EP1135462A4 (en) * 1998-12-10 2004-07-14 Tatko Biotech Inc MICROORGANISMS FOR IMPROVING PRODUCTIVITY IN PLANTS
CN100376666C (zh) * 2006-03-01 2008-03-26 华南农业大学 糖蜜草固氮螺菌及其应用
EP2227936A1 (fr) * 2009-03-09 2010-09-15 Pierre-Philippe Claude Biofertilisation de grandes cultures à l'aide de bactéries azotobacteraceae ayant sur-accumlé du molybdène
CN103159512A (zh) * 2011-12-08 2013-06-19 邵阳市新瑞生物科技有限公司 一种富硒动物蛋白生物有机肥及其制备方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2007358190B2 (en) 2007-08-27 2013-09-12 Probelte, S.A. Novel biological fertiliser, method for obtaining same and use thereof as a plant growth stimulator
ES2378040B1 (es) 2010-03-31 2013-02-18 Probelte, S.A Un preparado biológico bionematicida y estimulador del crecimiento vegetal y cultivos puros de las cepas denominadas n11, sr11 y alo1, contenidas en el mismo.

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1984001686A1 (en) * 1982-10-28 1984-05-10 Biotech General Corp Novel strains of azospirillum, methods of growing the strains, compositions containing them and use thereof as biofertilizer
EP0241583A2 (en) * 1986-04-08 1987-10-21 Zhenhua Yang Antiammonia azotobacter and the use thereof

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES8706826A1 (es) * 1986-05-07 1987-07-01 Consejo Superior Investigacion Procedimiento de obtencion de un mutante de azotobacter vinelandii capaz de fijar n2 en el suelo en concentraciones superiores a las estirpes silvestres conocidas
ES2041219B1 (es) * 1992-04-09 1994-06-01 Consejo Superior Investigacion Procedimiento de activacion microbiologica en la fijacion de nitrogeno.

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1984001686A1 (en) * 1982-10-28 1984-05-10 Biotech General Corp Novel strains of azospirillum, methods of growing the strains, compositions containing them and use thereof as biofertilizer
EP0241583A2 (en) * 1986-04-08 1987-10-21 Zhenhua Yang Antiammonia azotobacter and the use thereof

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
COMMUN. SOIL SCI. PLANT ANAL., Vol. 24 (3 y 4), 1993, MARTIN et al., "Azotobacter and Azospirillum as Potential Nitrogen Fertilizers", pages 255-260. *
FOLIA MICROBIOL., Vol. 35, 1990, FAYEZ M., "Untraditional N2-Fixing Bacteria as Biofertilizers for Wheat and Barley", pages 218-226. *
JOURNAL OF SCIENTIFIC & INDUSTRIAL RESEARCH, Vol. 48, 1989, PANDEY A. & KUMAR S., "Potential of Azotobacters and Azospirilla as Biofertilizers for Upland Agriculture: a Review", pages 134-144. *

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ299601B6 (cs) * 1997-02-25 2008-09-17 Zpusob prípravy smesi mikroorganismu na vázání dusíku ze vzduchu, na zvyšování rozpustnosti sloucenin fosforu a na rozklad potravinárského olejového sedimentu
WO1998037038A3 (de) * 1997-02-25 1998-11-12 Arpad Pollak Methode der stickstoffbindung aus der luft, mobilisation der phosphorverbindungen und der zersetzung des ölsedimentes
EP1135462A4 (en) * 1998-12-10 2004-07-14 Tatko Biotech Inc MICROORGANISMS FOR IMPROVING PRODUCTIVITY IN PLANTS
WO2001032587A1 (en) * 1999-11-01 2001-05-10 'piksa Inter' Ltd Biological addition to organic-mineral fertilizers
EP1248754A4 (en) * 1999-11-01 2003-03-12 Vinarov Alexandr Juryievich BIOLIGIC ADDITIVE TO AN ORGANIC-MINERAL FERTILIZER
US6939688B1 (en) 1999-11-01 2005-09-06 Soil Biogenics Ltd Biological addition to organic-mineral fertilizers
WO2001085916A1 (en) * 2000-05-12 2001-11-15 Biofarmtech Co., Ltd. A medium material selectively culturing prokaryote comprising rotting organic wastes and a method for cultivating crops using same
US7842494B2 (en) 2001-08-13 2010-11-30 Agro.Bio Hungary Kft. Micro-organisms for the treatment of soil and process for obtaining them
EA009126B1 (ru) * 2001-08-13 2007-10-26 Агро. Био Хангери Кфт. Микроорганизмы для обработки почвы и способ их получения
KR100940615B1 (ko) * 2001-08-13 2010-02-05 아그로.바이오 헝가리 케이에프티. 토양 처리용 미생물 및 이를 얻기 위한 방법
WO2003016241A1 (en) * 2001-08-13 2003-02-27 Agro.Bio Hungary Kft. Micro-organisms for the treatment of soil and process for obtaining them
EP2233458A3 (en) * 2001-08-13 2011-02-23 Agro.Bio Hungary Kft. Microorganisms for the treatment of soil and process for obtaining them
HRP20040126B1 (hr) * 2001-08-13 2014-02-14 Agro-Bio Hungary Kft. Mikroorganizmi za tretiranje tla i postupci za njihovo dobivanje
CN100376666C (zh) * 2006-03-01 2008-03-26 华南农业大学 糖蜜草固氮螺菌及其应用
EP2227936A1 (fr) * 2009-03-09 2010-09-15 Pierre-Philippe Claude Biofertilisation de grandes cultures à l'aide de bactéries azotobacteraceae ayant sur-accumlé du molybdène
CN103159512A (zh) * 2011-12-08 2013-06-19 邵阳市新瑞生物科技有限公司 一种富硒动物蛋白生物有机肥及其制备方法

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Publication number Publication date
ES2093559A1 (es) 1996-12-16
ES2093559B1 (es) 1997-07-01

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