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WO1994009130A1 - Polypeptides ayant une activite de recepteur serotoninergique (5ht2c) et utilisations - Google Patents

Polypeptides ayant une activite de recepteur serotoninergique (5ht2c) et utilisations Download PDF

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WO1994009130A1
WO1994009130A1 PCT/FR1993/001012 FR9301012W WO9409130A1 WO 1994009130 A1 WO1994009130 A1 WO 1994009130A1 FR 9301012 W FR9301012 W FR 9301012W WO 9409130 A1 WO9409130 A1 WO 9409130A1
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WO
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polypeptide
leu
sequence
ser
ile
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Application number
PCT/FR1993/001012
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Inventor
Luc Maroteaux
Original Assignee
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
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Publication date
Application filed by Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) filed Critical Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
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Priority to EP93923577A priority patent/EP0665885A1/fr
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Priority to US08/416,788 priority patent/US5780245A/en
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    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to new polypeptides and the genetic material allowing their expression. More particularly, it relates to new polypeptides having a serotonergic receptor activity.
  • Serotonin is a neuromodulator capable of inducing and modulating a wide variety of behaviors such as sleep, appetite, locomotion, sexual activity or even vascular contraction. It is recognized that the activity of serotonin is mediated by its interaction with receptors, designated serotonergic receptors or 5-HT receptors (for 5-hydroxytryptamine). Molecular biology studies as well as pharmacological studies have revealed that there are a large number of 5-HT receptor subtypes. The 5-HT receptors which have been described until now belong either to the family of receptors linked to ion channels (5-HT3 receptors), or to the family of receptors which interact with G proteins and which have seven transmembrane domains.
  • 5-HT receptors which have been described until now belong either to the family of receptors linked to ion channels (5-HT3 receptors), or to the family of receptors which interact with G proteins and which have seven transmembrane domains.
  • the 5-HT1 receptors comprising the mammalian subtypes 5HT1A, 5HT1B and 5HT1D as well as three 5HT Drosophila receptors; and 5HT2 receptors including the 5HT2 and 5HT1C subtypes.
  • 5HT4 receptors are probably not the only 5HT receptors existing, since pharmacological studies have revealed other subtypes such as 5HT4 receptors as well as certain receptors related to the 5HT1 subtype ("5HT1 like" receptors). . In addition, additional molecular biology studies have also revealed heterogeneities within the 5HT1B / 1D subtypes.
  • the 5HT2 receptors have been very little studied.
  • the 5HT2 receptors act through phospholipase C, and are responsible for many physiological activities of serotonin at the central and peripheral levels.
  • They are involved in the contraction of blood vessels and in changes in the morphology of platelets; at the level of the central nervous system, they act on the neurons sensitization to tactile stimuli and to mediate the hallucinogenic effects of lysergic diethylamide and related phenylisopropylamines.
  • the present invention results from the discovery of new polypeptides having a serotonergic receptor activity. Although belonging to the family of receptors which interact with G proteins, these new polypeptides differ from the serotonergic receptors already described (5HT1, 5HT2, 5HT3 and 5HT4) from the structural point of view as from the pharmacological point of view. More particularly, the invention results from the isolation and characterization of these new polypeptides, designated 5HT2C, as well as from the genetic material allowing their expression or their identification. The pharmacological study of these receptors shows that they could account for the atypical effects of serotonin observed previously.
  • a first object of the invention therefore resides in polypeptides comprising all or part of the peptide sequence SEQ ID No. 2 or a derivative thereof.
  • the term derivative designates any molecule obtained by modification of genetic and / or chemical nature of the peptide sequence SEQ ID No. 2.
  • modification of genetic and / or chemical nature one can hear any mutation, substitution , deletion, addition and / or modification of one or more residues.
  • Such derivatives can be generated for different purposes, such as in particular that of increasing the affinity of the peptide for its ligand (s), that of improving its production levels, that of increasing its resistance to proteases, that of increasing and / or modifying its activity, or that of conferring on it new pharmacokinetic and / or biological properties.
  • derivatives resulting from an addition mention may, for example, be made of chimeric polypeptides comprising an additional heterologous part linked at one end.
  • the term derivative also includes polypeptides homologous to the polypeptide SEQ ID n ° 2, from other cellular sources and in particular from cells of human origin, or from other organisms, and having an activity of the same type. Such homologous polypeptides can be obtained by hybridization experiments as described in the examples.
  • Example 5 describes a derivative according to the invention (truncated form).
  • the polypeptides of the invention are polypeptides having the capacity to bind serotonin. Even more preferably, they are polypeptides having a serotonergic receptor activity. Still according to a preferred mode, the polypeptides of the invention are capable of being recognized by antibodies recognizing the complete SEQ ID No. 2 peptide sequence.
  • a particular embodiment of the invention is represented by the 5HT2C polypeptide comprising the entire peptide sequence SEQ ID No. 2. As indicated in the examples, this polypeptide can be expressed in different cell types to form a functional serotonergic receptor.
  • This polypeptide comprises 479 amino acids, and has a calculated molecular weight of 56,508 Daltons.
  • polypeptides of the invention can be obtained by expression in a cellular host of a nucleotide sequence as described below, by chemical synthesis, on the basis of the sequence SEQ ID No. 2 using the techniques known in the art. skilled in the art, or by a combination of these techniques.
  • polypeptides of the invention as defined above are designated by 5HT2C polypeptides.
  • the present invention also relates to any nucleotide sequence coding for a 5HT2C polypeptide. More preferably, it is a sequence chosen from:
  • sequences derived from sequences (a) and (b) due to the degeneration of the genetic code can be of artificial origin or not. They can be genomic sequences, cDNA, RNA, hybrid sequences or synthetic or semi-synthetic sequences. These sequences can be obtained for example by screening DNA libraries (cDNA library, genomic DNA library) by means of probes prepared on the basis of the sequence SEQ ID No. 1. Such libraries can be prepared for starting from cells of different origins by conventional molecular biology techniques known to those skilled in the art.
  • the nucleotide sequences of the invention can also be prepared by chemical synthesis, in particular according to the phosphoramidite method, or also by mixed methods including chemical or enzymatic modification of sequences obtained by screening of libraries.
  • the nucleotide sequences of the invention can be used for the production of the 5HT2C polypeptides as defined above.
  • the part coding for said polypeptide is generally placed under the control of signals allowing its expression in a cellular host.
  • the choice of these signals can vary depending on the cell host used.
  • the nucleotide sequences of the invention can be part of a vector, which can be autonomous or integrative replication. More particularly, autonomously replicating vectors can be prepared using autonomously replicating sequences in the chosen host. As regards integrative vectors, these can be prepared for example by using sequences homologous to certain regions of the host genome, allowing, by homologous recombination, the integration of the vector.
  • the cellular hosts which can be used for the production of the 5HT2C polypeptides of the invention by the recombinant route are both eukaryotic and prokaryotic hosts.
  • suitable eukaryotic hosts there may be mentioned animal cells, yeasts, or fungi.
  • yeasts mention may be made of yeasts of the genus Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces, or Hansenula.
  • yeasts mention may be made of yeasts of the genus Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces, or Hansenula.
  • animal cells mention may be made of COS, CHO, C127, NIH-3T3 cells, etc.
  • the mushrooms there may be mentioned more particularly Aspergillus ssp. or Trichoderma ssp.
  • prokaryotic hosts it is preferred to use the following bacteria E.coli, Bacillus, or Streptomyces.
  • nucleotide sequences of the present invention are also usable in the pharmaceutical field, either for the production of antisense sequences usable in the context of gene therapy, or also for the production of probes allowing the detection, by hybridization experiments, of the expression of serotonergic receptors in biological samples and the detection of genetic anomalies (polymorphism, mutations) or outliers. Inhibition of the expression of certain genes by antisense sequences has proven to be a promising strategy in controlling the activity of a gene.
  • Antisense sequences are DNA sequences coding for complementary RNAs and, therefore, capable of specifically hybridizing with a given mRNA, inhibiting its translation into protein.
  • the subject of the invention is therefore the antisense sequences capable of at least partially inhibiting the production of 5HT2C polypeptides as defined above.
  • sequences can consist of all or part of the nucleotide sequences defined above. They are generally sequences or fragments of sequences complementary to sequences coding for peptides of the invention. Such sequences can be obtained from the sequence SEQ ID No. 1, by fragmentation, etc. or by chemical synthesis.
  • the invention also allows the production of nucleotide probes, synthetic or not, capable of hybridizing with the nucleotide sequences defined above which code for 5HT2C polypeptides of the invention, or with the corresponding mRNAs .
  • probes can be used in vitro as a diagnostic tool, for the detection of the expression of a 5HT2C serotoninergic receptor, or also for the detection of genetic anomalies (poor splicing, polymorphism, point mutations, etc.). Given the multiple activities of serotonin, the probes of the invention can thus make it possible to identify neurological, cardiovascular or psychiatric conditions as being linked to the 5HT2C receptors.
  • probes can also be used for the detection and isolation of homologous nucleic acid sequences coding for 5HT2C polypeptides as defined above, from other cellular sources and preferably from cells of human origin, as well as illustrated in the examples.
  • the probes of the invention generally contain at least 10 bases, and they can contain up to the entire sequence SEQ ID No. 1 or its complementary strand. Preferably, these probes are, prior to their use, marked. For this, different techniques known to those skilled in the art can be used (radioactive, enzymatic labeling, etc.). Conditions hybridization in which these probes can be used are indicated in the general cloning techniques below as well as in the examples.
  • Another subject of the invention relates to recombinant cells capable of expressing on their surface a 5HT2C polypeptide as defined above. These cells can be obtained by introducing a nucleotide sequence as defined above coding for a polypeptide of the invention, then culturing said cells under conditions of expression of said sequence.
  • the recombinant cells according to the invention can be both eukaryotic and prokaryotic cells.
  • eukaryotic cells which are suitable, mention may be made of animal cells, yeasts, or fungi.
  • yeasts mention may be made of yeasts of the genus Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces, or Hansenula.
  • animal cells mention may be made of COS, CHO, C127, NIH-3T3 cells, etc.
  • the mushrooms there may be mentioned more particularly Aspergillus ssp. or Trichoderma ssp.
  • prokaryotic cells it is preferred to use the following bacteria E.
  • the cells thus obtained can be used to measure the capacity of different molecules to behave as a ligand or as a modulator of the activity of the polypeptides of the invention. More particularly, they can thus be used in a process for the detection and isolation of ligands or of modulator of the activity of the polypeptides of the invention, and, more preferably, of agonists and antagonists of serotonin .
  • Another object of the invention therefore relates to a process for detecting and / or isolating ligands of the 5HT2C polypeptides of the invention, according to which the following steps are carried out:
  • a molecule or a mixture containing different molecules, possibly unidentified is brought into contact with a recombinant cell as described above expressing on its surface a polypeptide of the invention under conditions allowing the interaction between said polypeptide of the invention and said molecule in the event that it has an affinity for said polypeptide, and, - the molecules linked to said polypeptide of the invention are detected and / or isolated.
  • this method of the invention is suitable for the detection and / or isolation of agonists and antagonists of serotonin for the 5HT2C polypeptides.
  • Another object of the invention relates to a method for detecting and / or isolating modulators of the 5HT2C polypeptides of the invention, according to which the following steps are carried out:
  • a molecule or mixture containing different molecules, possibly unidentified is brought into contact with a recombinant cell as described above, expressing on its surface a polypeptide of the invention, in the presence of 5HT, under conditions allowing interaction between said polypeptide of the invention and 5HT, and,
  • Another object of the invention relates to the use of a ligand or of a modulator identified and / or obtained according to the process described above as a medicament.
  • ligands or modulators can indeed make it possible to treat certain neurological, cardiovascular or psychiatric affections linked to the 5HT2C receptors.
  • the invention also relates to any medicament comprising as active principle at least one molecule acting on a 5HT2C polypeptide of the invention.
  • the molecule is a ligand or a modulator identified and / or isolated according to the method described above.
  • Figure 1 Scatchard curve of the results of the saturation binding experiments of [ 125 I] -DOI to the membranes of Cos-7 cells expressing the 5HT2C receptor.
  • Figure 2 Demonstration of homologous sequences by PCR on total RNA (10 ⁇ g) of different mouse tissues: line 1: RNA of the LMTK cell line, line 2: RNA of 10-day embryos, line 3: RNA of testes, line 4: RNA of the 3T6 cell line, line 5: RNA of the MBK cell line, line 6: RNA of liver, line 7: RNA of brain, line 8: RNA of heart, line 9: RNA of intestine, line 10: spleen RNA, line 11: kidney RNA, line 12: total brain RNA.
  • Table 1 Pharmacological profile of the whole (N) or truncated (T) 5HT2C receptor.
  • the results correspond to competitive experiments for the binding of [ 125 I] -DOI to the membranes of Cos-7 cells expressing the 5HT2C receptor.
  • the values, expressed in pKD (-log mol / l) are the result of at least three separate experiments, carried out in triplicate.
  • RNA polymerase I DNA polymerase I
  • T4 polynucleotide kinase T4 DNA ligase
  • T3 or T7 RNA polymerases were provided by New England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL ), Boehringer-Mannheim or Stratagene and are used according to supplier recommendations.
  • the DNA fragments are separated according to their size by electrophoresis in agarose or acrylamide gels, extracted with phenol or with a phenol / chloroform mixture, precipitated with ethanol and then incubated in the presence of DNA.
  • phage T4 ligase according to supplier's recommendations.
  • the protruding 5 'ends are filled with the Klenow fragment of E. coli DNA Polymerase I according to the supplier's specifications.
  • the destruction of the prominent 3 'ends is carried out in the presence of the DNA polymerase of phage T4 used according to the manufacturer's recommendations.
  • the destruction of the protruding 5 ′ ends is carried out by gentle treatment with nuclease S1.
  • Verification of the nucleotide sequences is carried out by the method developed by Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467].
  • the normal stringency conditions are generally as follows: hybridization: 5 ⁇ SCC in the presence of 5 ⁇ Denhart's at 65 ° C; washing: 0.5 ⁇ SSC at 65 ° C.
  • AGAACTAGTGGTACCCA G, A) IGT (G, A) TAIACIA (G, A) IGG (G, A) TT
  • AGAACTAGTGGTACCC (G, C) (A, T) (G, A) (G, A) (G, A) CAIAC (G, A) TAICC (G, A, T) ATCCA
  • a cloning multisite was added to the 5 'end of the oiligonucleotides, to allow subsequent subcloning of the amplified fragment.
  • the PCR reactions were carried out as follows: 1 ⁇ g of mouse genomic DNA was denatured for 1 minute at 94 ° C, maintained for 2 minutes at 55 ° C, then subjected to 20 cycles of amplification at 72 ° C in the presence of 10 units of Taq polymerase (Cetus), 3 mM MgCl 2 , and 1 ⁇ g of each of the oligonucleotides (i) and (ii).
  • This clone was designated NP75.
  • the insert carried by the clone NP75 was sequenced on the 2 strands using the dideoxynucleotide technique using synthetic oligonucleotides. Analysis of the sequence obtained reveals the presence of an open reading phase coding for a protein of 479 amino acids (SEQ ID No. 1 and 2). Furthermore, the hydrophobicity analysis shows that this protein carries seven hydrophobic domains, a peculiarity encountered in members of the family of receptors coupled to G proteins. The N-terminal end also contains 1 potential site of N- glycosylation, and the suspected cytoplasmic domain contains the consensus sites for phosphorylation by protein kinases C and A. In addition, the presence of 19 serine or threonine residues in the 121 C-terminal amino acids seems to indicate that this region is involved in desensitization of the receptor by kinases.
  • the sequence of the 5HT2C receptor isolated above was compared with the sequences of the receptors coupled to the following G proteins: 5HT1A, 5HT1B, 5HT1C and 5HT2. These experiments revealed a homology in the transmembrane domains I to VII with the receptors 5HT1C and 5HT2, superior to the homology encountered with the receptors 5HT1A and 5HT1B. These results suggest that the receptors of the invention belong to the 5HT2 subtype. This is also in agreement with the presence of 2 introns in the gene coding for the 5HT2C receptor (not shown in the sequence).
  • the cDNA fragment isolated in Example 1 was inserted into a eukaryotic expression vector, which was used to transfect Cos-7 cells.
  • the membranes of the transfected cells obtained were then prepared and tested for their capacity to bind certain labeled serotonergic ligands.
  • the cDNA coding for the 5HT2C receptor was isolated in the form of an XbaI-EcoRI fragment of 1372 bp, then inserted into the corresponding sites of the vector p513.
  • the vector p513 is derived from the vector pSG5 [Green et al., Nucl. Acids Res. 16 (1988) 369] by adding a multisite of cloning.
  • the recombinant vector thus obtained, designated p513NP75 was then used (10 ⁇ g per 10 cm plate) to transfect the Cos-7 cells in the presence of calcium phosphate.
  • the recombinant cells are harvested and the membranes are prepared according to the technique described by Amlaiky and Caron [J. Biol. Chem. 260 (1985) 1983].
  • [ 125 I] -DOI (dimethoxyphenyl isopropylamine) was first used alone, to detect the expression of the gene encoding the receptors of the invention in the membranes of the recombinant cells. For this, 100 ⁇ l of membrane suspension (50 ⁇ g / ml of protein) were incubated for 30 minutes at 30 ° C. in the presence of the radioactive ligand (50 ⁇ l) and 50 ⁇ l of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4 ), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl 2 , final volume: 200 ⁇ l.
  • the reaction is then stopped by adding an ice-cold iso-osmotic solution, then by filtration through Whatman GF / B filters, followed by 4 rinses in 5 ml of the above-frozen buffer.
  • the filters are then dried and the radioactivity is measured by counting ( ⁇ counter).
  • the non-specific binding determined in the presence of 10 ⁇ M of cold DOI, represented approximately 30% of the total mass.
  • the results obtained show that the DOI binds specifically to the membranes of the transfected cells, and not to the membranes of the control cells (transfected with the plasmid pSG5). These cells therefore clearly express a functional serotonin receptor.
  • the affinity of DOI for transfected cells is high and the binding is saturable ( Figure 1).
  • the apparent KD is 25.8 +/- 0.54 nM, and the apparent Bmax varies between 14.8 and 21.0 pmol / mg of protein, depending on the transformation efficiency.
  • the nucleotide sequence SEQ ID No. 1 was then used to demonstrate homologous sequences from other tissues by PCR.
  • tissues used for the search for homologous sequences are the following of murine origin: intestine, heart, brain, kidney, spleen and liver.
  • the probe (iv) corresponds to position 85 on SEQ ID No. 1 and the probe (v) at position 547 (complementary strand).
  • RNAs were prepared from the tissues indicated above according to the technique described by Cathala et al. (DNA 2 (4) (1983). 10 ⁇ g of these RNAs were subjected to reverse transcription in the presence of 13 units of AMV reverse transcriptase, 5 units of Taq polymerase and 1 ⁇ g of probes (iv) and (v ), for 15 minutes at 50 ° C., then amplified (20, 25 and 30 cycles) (Maroteaux et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89 (1992) 3020). As internal standard, the primers corresponding to ribosomal elongation factor EF1A mRNA was used, under the same conditions as probes (iv) and (v).
  • the products thus obtained were then transferred to nitrocellulose filters and hybrids under the following conditions:
  • the probe used for the hybridization had the following sequence:
  • Hybridization was carried out under high stringency conditions: 50 ° C, in 20 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5) containing 5 ⁇ SSC, 1 ⁇ Denhardt's, 0.1% SDS and 100 ⁇ g / ml of tRNA. Washings were carried out at 50 ° C. in a 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS buffer. This study made it possible to highlight specific DNA fragments which are homologous in the intestine, the heart, the kidneys and the brain (FIG. 2).
  • RNA comes from the use of an alternative splicing donor at the end of exon 2, leading to the elimination of bases 550-568 from the nucleic sequence SEQ ID No. 1. This causes a phase change and introduces a stop codon into the RNA, producing a truncated protein after the third trans-membrane domain.
  • This alternative form of mRNA first isolated from brain RNA, is differentially expressed depending on the tissue. The relative rate of expression of truncated RNA compared to complete RNA is maximum in the heart of mice, where it represents more than 50%, whereas it is only 15% in the intestine.
  • ATC AAA AAG CCA ATT CAG GCC AAT CAG TGC AAC ACC CGG GCT ACT GCA 531 Ile Lys Lys Pro Ile Gln Ala Asn Gln Cys Asn Thr Arg Ala Thr Ala

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Abstract

La présente invention concerne de nouveaux polypeptides désignés 5HT2C ayant une activité de récepteur sérotoninergique, le matériel génétique permettant leur expression, toute cellule recombinante exprimant ces polypeptides, et leur utilisation.

Description

POLYPEPTIDES AYANT UNE ACTIVITE DE RECEPTEUR SEROTONINERGIQUE (5HT2C) ET UTILISATIONS
La présente invention concerne de nouveaux polypeptides et le matériel génétique permettant leur expression. Plus particulièrement, elle concerne de nouveaux polypeptides ayant une activité de récepteur sérotoninergique.
La sérotonine est un neuromodulateur capable d'induire et de moduler une grande variété de comportements tels que le sommeil, l'appétit, la locomotion, l'activité sexuelle ou encore la contraction vasculaire. Il est admis que l'activité de la sérotonine est médiée par son interaction avec des récepteurs, désignés récepteurs sérotoninergiques ou récepteurs 5-HT (pour 5-hydroxytryptamine). Des études de biologie moléculaire ainsi que des études pharmacologiques ont révélé qu'il existait un grand nombre de sous-types de récepteurs 5-HT. Les récepteurs 5-HT qui ont été décrits jusqu'à aujourd'hui appartiennent soit à la famille des récepteurs liés à des canaux ioniques (récepteurs 5-HT3), soit à la famille des récepteurs qui interagissent avec des protéines G et qui possèdent sept domaines transmembranaires. Par ailleurs, l'analyse des séquences d'acides aminés a montré que les récepteurs 5-HT interagissant avec des protéines G peuvent être sous-divisés en deux groupes distincts : Les récepteurs 5HT1, comprenant les sous-types mammifères 5HT1A, 5HT1B et 5HT1D ainsi que trois récepteurs 5HT de drosophile; et les récepteurs 5HT2 comprenant les sous-types 5HT2 et 5HT1C.
Ces récepteurs ne sont sans doute pas les seuls récepteurs 5HT existant, dans la mesure où des études pharmacologiques ont révélé d'autres sous-types tels que les récepteurs 5HT4 ainsi que certains récepteurs apparentés au sous-type 5HT1 (récepteurs "5HT1 like"). De plus, des études supplémentaires de biologie moléculaire ont également révélé des hétérogénéités au sein des sous-types 5HT1B/1D.
Aujourd'hui, au contraire des autres sous-types, les récepteurs 5HT2 n'ont été que très peu étudiés. Les récepteurs 5HT2 agissent par l'intermédiaire de la phospholipase C, et sont responsables de nombreuses activités physiologiques de la sérotonine au niveau central et périphérique. Au niveau cardiovasculaire, ils interviennent dans la contraction des vaisseaux sanguins et dans les changements de morphologie des plaquettes; au niveau du système nerveux central, ils agissent sur la sensibilisation des neurones aux stimuli tactiles et sur la médiation des effets hallucinogènes de l'acide diethylamide lysergique et des phénylisopropylamines apparentées.
De nombreuses études montrent que les récepteurs 5HT2 décrits à ce jour ne rendent pas compte de toutes les propriétés qui leur sont attribuées. Notamment, certains effets de type 5HT2 de la sérotonine sur les muscles lisses périphériques sont classés comme des effets atypiques, dont les effets seraient médiés par des récepteurs inconnus.
La présente invention résulte de la mise en évidence de nouveaux polypeptides ayant une activité de récepteur sérotoninergique. Bien qu'appartenant à la famille des récepteurs qui interagissent avec des protéines G, ces nouveaux polypeptides diffèrent des récepteurs sérotoninergiques déjà décrits (5HT1, 5HT2, 5HT3 et 5HT4) du point de vue structural comme du point de vue pharmacologique. Plus particulièrement, l'invention résulte de l'isolement et de la caractérisation de ces nouveaux polypeptides, désignés 5HT2C, ainsi que du matériel génétique permettant leur expression ou leur identification. L'étude pharmacologique de ces récepteurs montre qu'ils pourraient rendre compte des effets atypiques de la sérotonine observés antérieurement.
Un premier objet de l'invention réside donc dans des polypeptides comprenant tout ou partie de la séquence peptidique SEQ ID n° 2 ou d'un dérivé de celle-ci.
Au sens de la présente invention, le terme dérivé désigne toute molécule obtenue par modification de nature génétique et/ou chimique de la séquence peptidique SEQ ID n° 2. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus. De tels dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'augmenter l'affinité du peptide pour son (ses) ligand(s), celui d'améliorer ses niveaux de production, celui d'augmenter sa résistance à des protéases, celui d'augmenter et/ou de modifier son activité, ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés pharmacocinetiques et/ou biologiques. Parmi les dérivés résultant d'une addition, on peut citer par exemple les polypeptides chimères comportant une partie hétérologue supplémentaire liée à une extrêmité. Le terme dérivé comprend également les polypeptides homologues au polypeptide SEQ ID n° 2, issus d'autres sources cellulaires et notamment de cellules d'origine humaine, ou d'autres organismes, et possédant une activité de même type. De tels polypeptides homologues peuvent être obtenus par des expériences d'hybridation comme décrit dans les exemples. En particulier, l'exemple 5 décrit un dérivé selon l'invention (forme tronquée).
Préférentiellement, les polypeptides de l'invention sont des polypeptides possédant la capacité de lier la sérotonine. Encore plus préférentiellement, il s'agit de polypeptides ayant une activité de récepteur sérotoninergique. Toujours selon un mode préféré, les polypeptides de l'invention sont susceptibles d'être reconnus par des anticorps reconnaissant la séquence peptidique SEQ ID n° 2 complète.
Un mode de réalisation particulier de l'invention est représenté par le polypeptide 5HT2C comprenant toute la séquence peptidique SEQ ID n° 2. Comme indiqué dans les exemples, ce polypeptide peut être exprimé dans différents types cellulaires pour former un récepteur sérotoninergique fonctionnel. Ce polypeptide comprend 479 acides aminés, et possède un poids moléculaire calculé de 56 508 Daltons.
Les polypeptides de l'invention peuvent être obtenus par expression dans un hôte cellulaire d'une séquence nucléotidique telle que décrite ci-dessous, par synthèse chimique, sur la base de la séquence SEQ ID n° 2 en utilisant les techniques connues de l'homme du métier, ou par une combinaison de ces techniques.
Dans ce qui suit, les polypeptides de l'invention tels que définis ci-dessus sont désignés par polypeptides 5HT2C.
La présente invention a également pour objet toute séquence nucléotidique codant pour un polypeptide 5HT2C. Plus préférentiellement, il s'agit d'une séquence choisie parmi :
(a) tout ou partie de la séquence nucléotidique SEQ ID n° 1 ou de son brin complémentaire,
(b) toute séquence hybridant avec une séquence (a) et codant pour un polypeptide tel que défini précédemment, et,
(c) les séquences dérivées des séquences (a) et (b) en raison de la dégénérescence du code génétique. Les différentes séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. Il peut s'agir de séquences génomiques, d'ADNc, d'ARN, de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Ces séquences peuvent être obtenues par exemple par criblage de banques d'ADN (banque d'ADNc, banque d'ADN génomique) au moyen de sondes élaborées sur la base de la séquence SEQ ID n° 1. De telles banques peuvent être préparées à partir de cellules de différentes origines par des techniques classiques de biologie moléculaire connues de l'homme du métier. Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent également être préparées par synthèse chimique, notamment selon la méthode des phosphoramidites, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatiqe de séquences obtenues par criblage de banques.
Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être utilisées pour la production des polypeptides 5HT2C tels que définis précédemment. Dans ce cas, la partie codant pour ledit polypeptide est généralement placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire. Le choix de ces signaux (promoteurs, terminateurs, etc) peut varier en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent faire partie d'un vecteur, qui peut être à réplication autonome ou intégratif . Plus particulièrement, des vecteurs à réplication autonome peuvent être préparés en utilisant des séquences à réplication autonome chez l'hôte choisi. S'agissant des vecteurs intégratifs, ceux-ci peuvent être préparés par exemple en utilisant des séquences homologues à certaines régions du génome de l'hôte, permettant, par recombinaison homologue, l'intégration du vecteur. Les hôtes cellulaires utilisables pour la production des polypeptides 5HT2C de l'invention par voie recombinante sont aussi bien des hôtes eucaryotes que procaryotes. Parmi les hôtes eucaryotes qui conviennent, on peut citer les cellules animales, les levures, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomyces , Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces, ou Hansenula. S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules COS, CHO, C127, NIH-3T3, etc. Parmi les champignons, on peut citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp. Comme hôtes procaryotes, on préfère utiliser les bactéries suivantes E.coli, Bacillus, ou Streptomyces .
Les séquences nucléotidiques de la présente invention sont également utilisables dans le domaine pharmaceutique, soit pour la réalisation de séquences antisens utilisables dans le cadre d'une thérapie génique, soit encore pour la réalisation de sondes permettant la détection, par des expériences d'hybridation, de l'expression de récepteurs sérotoninergiques dans des échantillons biologiques et la mise en évidence d'anomalies génétiques (polymorphisme, mutations) ou d'expressions aberrantes. L'inhibition de l'expression de certains gènes par des séquences antisens s'est avérée être une stratégie prometteuse dans le contrôle de l'activité d'un gène. Les séquences antisens sont des séquences d'ADN codant pour des ARN complémentaires et, de ce fait, capables d'hybrider spécifiquement avec un ARNm donné, inhibant sa traduction en protéine. L'invention a ainsi pour objet les séquences antisens capables d'inhiber au moins partiellement la production de polypeptides 5HT2C tels que définis précédemment. De telles séquences peuvent être constituées par tout ou partie des séquences nucléotidiques définies ci-avant. Il s'agit généralement de séquences ou de fragments de séquences complémentaires de séquences codant pour des peptides de l'invention. De telles séquences peuvent être obtenues à partir de la séquence SEQ ID n° 1, par fragmentation, etc. ou par synthèse chimique.
Comme indiqué ci-dessus, l'invention permet également la réalisation de sondes nucléotidiques, synthétiques ou non, capables de s'hydrider avec les séquences nucléotidiques définies ci-avant qui codent pour des polypeptides 5HT2C de l'invention, ou avec les ARNm correspondant. De telles sondes peuvent être utilisées in vitro comme outil de diagnostic, pour la détection de l'expression d'un récepteur sérotoninergique 5HT2C, ou encore pour la mise en évidence d'anomalies génétiques (mauvais épissage, polymorphisme, mutations ponctuelles, etc). Compte tenu des activités multiples de la sérotonine, les sondes de l'invention peuvent ainsi permettre d'identifier des affections neurologique, cardiovasculaire ou psychiatrique comme étant liées aux récepteurs 5HT2C. Ces sondes peuvent également être utilisées pour la mise en évidence et l'isolement de séquences d'acides nucléiques homologues codant pour des polypeptides 5HT2C tels que définis précédemment, à partir d'autres sources cellulaires et préférentiellement de cellules d'origines humaines, ainsi qu'illustré dans les exemples. Les sondes de l'invention comportent généralement au moins 10 bases, et elles peuvent comporter jusqu'à l'intégralité de la séquence SEQ ID n° 1 ou de son brin complémentaire. Préférentiellement, ces sondes sont, préalablement à leur utilisation, marquées. Pour cela, différentes techniques connues de l'homme du métier peuvent être employées (marquage radioactif, enzymatique, etc). Les conditions d'hybridation dans lesquelles ces sondes peuvent être utilisées sont indiquées dans les techniques générales de clonage ci-après ainsi que dans les exemples.
Un autre objet de l'invention concerne les cellules recombinées capables d'exprimer à leur surface un polypeptide 5HT2C tel que défini ci-avant. Ces cellules peuvent être obtenues par introduction d'une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus codant pour un polypeptide de l'invention, puis culture desdites cellules dans des conditions d'expression de ladite séquence.
Les cellules recombinées selon l'invention peuvent être aussi bien des cellules eucaryotes que procaryotes. Parmi les cellules eucaryotes qui conviennent, on peut citer les cellules animales, les levures, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces, ou Hansenula. S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules COS, CHO, C127, NIH-3T3, etc. Parmi les champignons, on peut citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp. Comme cellules procaryotes, on préfère utiliser les bactéries suivantes E. coli, Bacillus, ou Streptomyces. Les cellules ainsi obtenues peuvent être utilisées pour mesurer la capacité de différentes molécules à se comporter comme ligand ou comme modulateur de l'activité des polypeptides de l'invention. Plus particulièrement, elles peuvent ainsi être utilisées dans un procédé de mise en évidence et d'isolement de ligands ou de modulateur de l'activité des polypeptides de l'invention, et, plus préférentiellement, d'agonistes et d'antagonistes de la sérotonine.
Un autre objet de l'invention concerne donc un procédé de mise en évidence et/ou d'isolement de ligands des polypeptides 5HT2C de l'invention, selon lequel on réalise les étapes suivantes :
- on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec une cellule recombinée telle que décrite ci-dessus exprimant à sa surface un polypeptide de l'invention dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide de l'invention et ladite molécule dans le cas où celle-ci posséderait une affinité pour ledit polypeptide, et, - on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide de l'invention.
Dans un mode particulier, ce procédé de l'invention est adapté à la mise en évidence et/ou l'isolement d'agonistes et d'antagonistes de la sérotonine pour les polypeptides 5HT2C. Un autre objet de l'invention concerne un procédé de mise en évidence et/ou d'isolement de modulateurs des polypeptides 5HT2C de l'invention, selon lequel on réalise les étapes suivantes :
- on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec une cellule recombinée telle que décrite ci-dessus exprimant à sa surface un polypeptide de l'invention, en présence de 5HT, dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide de l'invention et le 5HT, et,
- on détecte et/ou isole les molécules capables de moduler l'activité du 5HT sur ledit polypeptide de l'invention.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un ligand ou d'un modulateur identifié et/ou obtenu selon le procédé décrit ci-avant comme médicament. De tels ligands ou modulateurs peuvent en effet permettre de traiter certaines affections neurologique, cardiovasculaire ou psychiatrique liées aux récepteurs 5HT2C.
L'invention concerne également tout médicament comprenant comme principe actif au moins une molécule agissant sur un polypeptide 5HT2C de l'invention. Préférentiellement la molécule est un ligand ou un modulateur identifié et/ou isolé selon le procédé décrit précédemment. D'autres avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Légende des figures
Figure 1 : Courbe Scatchard des résultats des expériences de liaison à saturation du [125I]-DOI aux membranes des cellules Cos-7 exprimant le récepteur 5HT2C.
Figure 2 : Mise en évidence de séquences homologues par PCR sur des ARN totaux (10 μg) de différents tissus de souris : ligne 1 : ARN de la lignée cellulaire LMTK, ligne 2 : ARN d'embryons de 10 jours, ligne 3 : ARN de testicules, ligne 4 : ARN de la lignée cellulaire 3T6, ligne 5 : ARN de la lignée cellulaire MBK, ligne 6 : ARN de foie, ligne 7 : ARN de cerveau, ligne 8 : ARN de coeur, ligne 9 : ARN d'intestin, ligne 10 : ARN de rate, ligne 11 : ARN de rein, ligne 12 : ARN de cerveau total. Table 1 : Profil pharmacologique du récepteur 5HT2C entier (N) ou tronqué (T). Les résultats correspondent à des expériences de compétition pour la liaison du [125I]-DOI aux membranes des cellules Cos-7 exprimant le récepteur 5HT2C. Les valeurs, exprimées en pKD (-log mol/l) sont le résultat d'au moins trois expériences séparées, effectuées en triple.
Techniques générales de clonage
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extractions de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc, sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les enzymes de restriction, la transcriptase inverse AMV, l'ADN polymérase I, 1a polynucléotide kinase T4, l'ADN ligase T4, et les ARN polymérases T3 ou T7 ont été fournies par New England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL), Boehringer-Mannheim ou Stratagene et sont utilisées selon les recommandations des fournisseurs.
Pour les ligatures, les fragments d'ADN sont séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 selon les recommandations du fournisseur.
Le remplissage des extrémités 5' proéminentes est effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d' E. coli selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques est effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764]. L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de
PCR [Polymérase-catalyzed Chain Réaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985)
1350-1354 ; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] est effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant.
La vérification des séquences nucléotidiques est effectuée par 1a méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467].
Pour les expériences d'hybridation, les conditions de stringence normales sont généralement les suivantes : hybridation : 5 × SCC en présence de 5 × Denhart's à 65°C ; lavage : 0,5 × SSC à 65°C.
1. Isolement du récepteur 5HT2C
Les comparaisons de séquences entre les différents récepteurs sérotoninergiques connus font apparaître une certaine conservation. Dans le but de mettre en évidence et d'isoler un nouveau récepteur, trois oligonucléotides dégénérés correspondant aux régions transmembranaires VI et VII ont été préparés, puis utilisés dans une série de réactions de PCR sur une préparation d'ADN génomique de souris. La séquence des oligonucléotides dégénérés est la suivante :
Oligonucléotide (i)
TACCTCGAGGTCGACGGTIATGTGGTG(C,T)CCITT(C,T)TT(C,T)AT Oligonucléotide (ii)
AGAACTAGTGGTACCCA(G,A)IGT(G,A)TAIACIA(G,A)IGG(G,A)TT
Oligonucléotide (iii)
AGAACTAGTGGTACCC(G,C) (A,T) (G,A)CAIAC(G,A)TAICC(G,A,T) ATCCA
Un multisite de clonage a été ajouté à l'extrémité 5' des oiligonucléotides, pour permettre le sous-clonage ultérieur du fragment amplifié. Les réactions de PCR ont été réalisées de la manière suivante : 1 μg d'ADN génomique de souris a été dénaturé pendant 1 minute à 94°C, maintenu 2 minutes à 55°C, puis soumis à 20 cycles d'amplification à 72°C en présence de 10 unités de polymérase Taq (Cetus), de MgCl2 3 mM, et de 1 μg de chacun des oligonucléotides (i) et (ii). 1/10e du produit de cette réaction a ensuite été soumis à 20 cycles d'amplification supplémentaires dans les mêmes conditions, en présence de 1 μg de chacun des oligonucléotides (i) et (iii). Les produits ainsi obtenus ont été digérés avec les enzymes Spel et Xhol, insérés aux sites correspondant du plasmide Bluescript (Stratagène), et séquences. L'un des fragments ainsi obtenus, présentant une certaine homologie avec les récepteurs sérotoninergiques 5HT2, a été synthétisé in vitro et marqué à son extrémité 5' par la polynucléotide kinase, puis utilisé comme sonde pour cribler une banque de cDNA de cerveau de souris. Un clone positif a été sélectionné. Ce clone a été désigné NP75. L'insert porté par le clone NP75 a été séquence sur les 2 brins en utilisant la technique des dideoxynucléotides au moyen d'oligonucléotides synthétiques. L'analyse de la séquence obtenue révèle la présence d'une phase ouverte de lecture codant pour une protéine de 479 acides aminés (SEQ ID n°1 et 2). Par ailleurs, l'analyse d'hydrophobicité montre que cette protéine porte sept domaines hydrophobes, une particularité rencontrée chez les membres de la famille des récepteurs couplés à des protéines G. L'extrémité N-terminale contient par ailleurs 1 site potentiel de N-glycosylation, et le domaine cytoplasmique présumé contient les sites consensus de phosphorylation par les protéines kinases C et A. En outre, la présence de 19 résidus serine ou thréonine dans les 121 acides aminés C-terminaux semble indiquer que cette région est impliquée dans la désensibilisation du récepteur par les kinases.
2. Etude d'homologies de séquence
La séquence du récepteur 5HT2C isolé ci-dessus a été comparée avec les séquences des récepteurs couplés à des protéines G suivants : 5HT1A, 5HT1B, 5HT1C et 5HT2. Ces expériences ont révélé une homologie dans les domaines transmembranaires I à VII avec les récepteurs 5HT1C et 5HT2, supérieure à l'homologie rencontrée avec les récepteurs 5HT1A et 5HT1B. Ces résultats suggèrent que les récepteurs de l'invention appartiennent au sous-type 5HT2. Ceci est d'ailleurs en accord avec la présence de 2 introns dans le gène codant pour le récepteur 5HT2C (non montrés sur la séquence).
3. Expression du récepteur 5HT2C dans les cellules Cos-7 et caractérisation pharmacologique
Le fragment d'ADNc isolé dans l'exemple 1 a été inséré dans un vecteur d'expression eucaryote, qui a été utilisé pour transfecter des cellules Cos-7. Les membranes des cellules transfectées obtenues ont ensuite été préparées et testées pour leur capacité à lier certains ligands sérotoninergiques marqués. L'ADNc codant pour le récepteur 5HT2C a été isolé sous forme d'un fragment XbaI-EcoRI de 1372 pb, puis inséré aux sites correspondants du vecteur p513. Le vecteur p513 dérive du vecteur pSG5 [Green et al., Nucl. Acids Res. 16 (1988) 369] par addition d'un multisite de clonage. Le vecteur recombinant ainsi obtenu, désigné p513NP75 a ensuite été utilisé (10 μg par plaque de 10 cm) pour transfecter les cellules Cos-7 en présence de phosphate de calcium.
48 heures après la transfection, les cellules recombinantes sont récoltées et les membranes sont préparées selon la technique décrite par Amlaiky et Caron [J. Biol. Chem. 260 (1985) 1983].
Des expériences de liaison à saturation et de compétition ont ensuite été réalisées sur ces membranes en présence de [125I]-DOI (2200 Ci/mmole; New England Nuclear) et de différents composés test.
Le [125I]-DOI (dimethoxyphenyl isopropylamine) a tout d'abord été utilisé seul, pour détecter l'expression du gène codant pour les récepteurs de l'invention dans les membranes des cellules recombinantes. Pour cela, 100 μl de suspension membranaire (50 μg/ml de protéines) ont été incubés 30 minutes à 30°C en présence du ligand radioactif (50 μl) et de 50 μl de tampon Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, MgCl2 10 mM, volume final : 200 μl. La réaction est ensuite stopée par addition d'une solution glacée iso-osmotique, puis par filtration sur filtres Whatman GF/B, suivie de 4 rinçages dans 5 ml du tampon ci-dessus glacé. Les filtres sont ensuite séchés et la radioactivité est mesurée par comptage (compteur γ). La liaison non-spécifique, déterminée en présence de 10 μM de DOI froid, représentait environ 30% de la laison totale.
Les résultats obtenus montrent que le DOI se lie spécifiquement aux membranes des cellules transfectées, et non aux membranes des cellules témoin (transfectées avec le plasmide pSG5). Ces cellules expriment donc bien un récepteur sérotonine fonctionnel. De plus, l'affinité du DOI pour les cellules transfectées est élevée et la liaison est saturable (figure 1). Le KD apparent est de 25,8 +/- 0,54 nM, et le Bmax apparent varie entre 14,8 et 21,0 pmol/mg de protéine, selon l'efficacité de transformation.
Pour déterminer le profil pharmacologique de ce récepteur, le [125I]-DOI lié aux membranes a été déplacé en présence de différentes drogues sérotoninergiques
(table 1). Pour cela, les membranes cellulaires sont incubées dans les conditions décrites ci-dessus, avec, à la place des 50 μl de tampon, des concentrations croissantes des composés à tester. Ces différentes drogues montrent l'ordre d'efficacité de déplacement suivant : ritansérine > N-acétyl 5-HT > methysergide > sétoperone = cyproheptadine > spiperone > kétansérine > tryptamine > 5-HT > 8-OH-DPAT (table 1). La faible affinité (relative) de ce récepteur pour la sérotonine confirme son appartenance au sous-type 5HT2. De plus, l'absence de compétition par les composés ICS 205-930, MDL 72222 et quipazine, qui sont spécifiques des récepteurs 5HT3, écarte la possibilité que les récepteurs de l'invention appartiennent à ce sous-type.
4. Recherche de séquences homologues dans d'autres tissus
La séquence nucléotidique SEQ ID n° 1 a ensuite été utilisée pour la mise en évidence de séquences homologues à partir d'autres tissus par PCR.
Les tissus utilisés pour la recherche de séquences homologues sont les suivants d'origine murine : intestin, coeur, cerveau, rein, rate et foie.
Les sondes suivantes ont été utilisées :
Sonde (iv) : 5'-GATCCTGACTAACCGTTCTGGA-3'
Sonde (v) : 5'-TGCCTATTGAAATTAACCATACCA-3'
La sonde (iv) correspond à la position 85 sur la SEQ ID n° 1 et la sonde (v) à la position 547 (brin complémentaire).
Les ARN totaux ont été préparés à partir des tissus indiqués ci-dessus selon la technique décrite par Cathala et al. (DNA 2(4) (1983). 10 μg de ces ARN ont été soumis à une transcription inverse en présence de 13 unités de transcriptase inverse AMV, de 5 unités de polymérase Taq et de 1 μg des sondes (iv) et (v), pendant 15 minutes à 50°C, puis amplifiés (20, 25 et 30 cycles) (Maroteaux et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89 (1992) 3020). Comme standard interne, les amorces correspondant à l'ARNm du facteur d'élongation ribosomal EF1A on été utilisées, dans les mêmes conditions que les sondes (iv) et (v).
Les produits ainsi obtenus ont ensuite été transférés sur filtres de nitro-cellulose et hybrides dans les conditions suivantes : La sonde utilisée pour l'hybridation avait la séquence suivante :
Sonde (vi) : 5'-TGCCTGGTTATTCCTCGATGTTC-3' correspondant à la position 398 sur la séquence SEQ ID nº 1. L'hybridation a été réalisée dans des conditions de stringence élevées : 50°C, dans un tampon phosphate de sodium 20 mM (pH 6,5) contenant 5 × SSC, 1 × Denhardt's, 0,1 % de SDS et 100 μg/ml d'ARNt. Les lavages ont été effectués à 50°C dans un tampon 1 × SSC, 0,1 % SDS. Cette étude a permis de mettre en évidence des fragments d'ADN spécifiques homologues dans l'intestin, le coeur, les reins et le cerveau (figure 2).
Il est entendu que les même expériences peuvent être répétées en utilisant d'autres tissus et notamment des tissus d'origine humaine, d'autres sondes, et d'autres techniques (hybridation in situ; Northern blot, etc). Par ailleurs, les séquences homologues mises en évidence lors de ces expériences peuvent évidemment être ensuite isolées et/ou amplifiées par les techniques classiques de biologie moléculaire.
5. Isolement et caractérisation d'un récepteur tronqué SEQ ID n° 2 (1- 177) -SEQ ID n° 3.
Au cours du clonage du cDNA codant pour le récepteur 5-HT2C (exemple 1), de nombreuses formes de mRNA tronqués ont été identifiées. L'une d'entre elles, après caractérisation, s'avère coder pour un récepteur ne présentant que les trois premiers domaines trans-membranaires [résidus 1 à 177 SEQ ID n° 2, auxquels s'ajoutent les 14 acides aminés C-terminaux suivants : Ala Ser Pro Ser Gin Ser Leu
Leu Lys Glu Ser Arg Leu Met (SEQ ID n° 3)]. L'analyse de l'organisation de l'ADN génomique montre que cet ARN provient de l'utilisation d'un donneur alternatif d'épissage à l'extrémité de l'exon 2, conduisant à l'élimination des bases 550-568 de la séquence nucléique SEQ ID n° 1. Ceci provoque un changement de phase et introduit un codon stop dans le RNA, produisant une protéine tronquée après le troisième domaine trans-membranaire. Cette forme alternative de mRNA, isolée en premier lieu à partir de RNA de cerveau, est exprimée différentiellement suivant les tissus. Le taux relatif d'expression du RNA tronqué par rapport au RNA complet est maximum dans le coeur de souris, où il représente plus de 50 %, alors qu'il n'est que de 15 % dans l'intestin.
De manière inattendue, l'analyse du profil pharmacologique de cette protéine tronquée par expression transitoire dans les cellules COS selon la méthodologie décrite dans l'exemple 3, montre que celle-ci lie la sérotonine avec une affinité très voisine de celle observée pour le récepteur complet (Table 1). De plus son affinité pour les agonistes demeure, bien que légèrement diminuée, alors que la liaison des antagonistes est complètement abolie, ainsi que la transduction du signal intracellulaire. Le rôle physiologique de cette forme du récepteur reste inconnu, mais il semble probable qu'elle serve à protéger certaines cibles sensibles, telles que l'endothélium vasculaire, des stimulations nocives en "diluant" localement l'effet du ligand, en l'occurrence la sérotonine.
Enfin, l'analyse plus précise, par hybridation in situ, des sites d'expression du récepteur 5-HT2C au niveau du coeur de souris localise ceux-ci au niveau de l'endothélium endocardial et vasculaire. Cette expression est aussi détectée au niveau de la couche interne (endothélium) des ébauches cardiaques chez des embryons précoces de souris (8,5 jours). Sachant que la sérotonine est impliquée dans les phénomènes de développement du système cardio-vasculaire chez l'embryon de poulet (Huether et al., Biog Aminé 8 (1992) 421), il est possible que le récepteur 5-HT2C participe à ces phénomènes. De même, des observations récentes impliquent la sérotonine dans la pathophysiologie des maladies coronariennes : l'athérosclérose coronarienne humaine est associée à une sensibilité accrue à la sérotonine de la contraction des artères coronaires. Ce phénomène peut être atténué par la kétanserine, (Golino et al., New Engl. J. Med. 324 (1991) 641) et résulte de lésions de l'endothélium vasculaire où la sérotonine est relarguée par les plaquettes. Il est ainsi probable que le récepteur 5-HT2C tronqué exprimé au niveau de l'endothélium vasculaire participe à la régulation de l'effet de la sérotonine sur le système cardiovasculaire autant au cours de sa différenciation que de sa dérégulation pathologique.
Par conséquent le développement de composés spécifiques du récepteur 5-HT2C entier ou tronqué présente un intérêt thérapeutique dans certaines pathologies cardiaques humaines.
Figure imgf000017_0001
LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: INSERM
(B) RUE: 101 rue de Tolbiac
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: France
(F) CODE POSTAL: 75654
(ii) TITRE DE L' INVENTION: NOUVEAUX POLYPEPTIDES AYANT UNE ACTIVITE DE RECEPTEUR SEROTONINERGIQUE, ACIDES NUCLEIQUES CODANT POUR CES POLYPEPTIDES ET UTILISATIONS.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 3
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB)
( 2 ) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1533 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Souris
(F) TYPE DE TISSUE: CERVEAU
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
(B) CLONE: NP75
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 19..1458 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1 :
TGAGTCACCA AAAGGCGA ATG GCT TCA TCT TAT AAA ATG TCT GAA CAA AGC 5
Met Ala Ser Ser Tyr Lys Met Ser Glu Gln Ser
1 5 10
ACA ACT TCT GAG CAC ATT TTA CAG AAG ACA TGT GAT CAC CTG ATC CTG 9 Thr Thr Ser Glu His Ile Leu Gln Lys Thr Cys Asp His Leu Ile Leu
15 20 25 ACT AAC CGT TCT GGA TTA GAG ACA GAC TCA GTA GCA GAG GAA ATG AAG 14 Thr Asn Arg Ser Gly Leu Glu Thr Asp Ser Val Ala Glu Glu Met Lys
30 35 40 CAG ACT GTG GAG GGA CAG GGG CAT ACA GTG CAC TGG GCA GCT CTC CTG 195 Gln Thr Val Glu Gly Gln Gly His Thr Val His Trp Ala Ala Leu Leu
45 50 55
ATA CTC GCG GTG ATA ATA CCC ACC ATT GGT GGG AAC ATC CTT GTG ATT 243 Ile Leu Ala Val Ile Ile Pro Thr Ile Gly Gly Asn Ile Leu Val Ile
60 65 70 75
CTG GCT GTT GCA CTG GAG AAA AGG CTG CAG TAC GCT ACC AAC TAC TTT 291 Leu Ala Val Ala Leu Glu Lys Arg Leu Gln Tyr Ala Thr Asn Tyr Phe
80 85 90
TTA ATG TCC TTG GCG ATA GCA GAT TTG CTG GTT GGA TTG TTT GTG ATG 339 Leu Met Ser Leu Ala Ile Ala Asp Leu Leu Val Gly Leu Phe Val Met
95 100 105
CCG ATT GCC CTC TTG ACA ATC ATG TTT GAG GCT ATA TGG CCC CTC CCA 387 Pro Ile Ala Leu Leu Thr Ile Met Phe Glu Ala Ile Trp Pro Leu Pro
110 115 120
CTG GCC CTG TGT CCT GCC TGG TTA TTC CTC GAT GTT CTC TTT TCA ACT 435 Leu Ala Leu Cys Pro Ala Trp Leu Phe Leu Asp Val Leu Phe Ser Thr
125 130 135
GCC TCC ATC ATG CAT CTC TGT GCC ATT TCC CTG GAC CGC TAT ATA GCC 483 Ala Ser Ile Met His Leu Cys Ala Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Ile Ala
140 145 150 155
ATC AAA AAG CCA ATT CAG GCC AAT CAG TGC AAC ACC CGG GCT ACT GCA 531 Ile Lys Lys Pro Ile Gln Ala Asn Gln Cys Asn Thr Arg Ala Thr Ala
160 165 170
TTC ATC AAG ATT ACA GTG GTA TGG TTA ATT TCA ATA GGC ATC GCC ATC 579 Phe Ile Lys Ile Thr Val Val Trp Leu Ile Ser Ile Gly Ile Ala Ile
175 180 185
CCA GTC CCT ATT AAA GGA ATC GAG ACT GAT GTG ATT AAT CCA CAC AAT 627 Pro Val Pro Ile Lys Gly Ile Glu Thr Asp Val Ile Asn Pro His Asn
190 195 200
GTC ACC TGT GAG CTG ACA AAG GAC CGC TTT GGC AGT TTT ATG GTC TTT 675 Val Thr Cys Glu Leu Thr Lys Asp Arg Phe Gly Ser Phe Met Val Phe
205 210 215
GGG TCA CTG GCT GCT TTC TTC GTA CCT CTC ACC ATC ATG GTA GTC ACT 723 Gly Ser Leu Ala Ala Phe Phe Val Pro Leu Thr Ile Met Val Val Thr
220 225 230 235
TAC TTT CTC ACC ATT CAC ACT TTA CAG AAG AAA GCT TAC TTG GTC AAA 771 Tyr Phe Leu Thr Ile His Thr Leu Gln Lys Lys Ala Tyr Leu Val Lys
240 245 250
AAT AAG CCA CCT CAA CGC CTA ACA CGG TGG ACT GTG CCC ACA GTT TTC 819 Asn Lys Pro Pro Gln Arg Leu Thr Arg Trp Thr Val Pro Thr Val Phe
255 260 265
CTA AGG GAA GAC TCA TCC TTT TCA TCA CCA GAA AAG GTG GCA ATG CTG 867 Leu Arg Glu Asp Ser Ser Phe Ser Ser Pro Glu Lys Val Ala Met Leu
270 275 280
GAT GGG TCT CAC AGG GAT AAA ATT CTA CCT AAC TCA AGT GAT GAG ACA 915 Asp Gly Ser His Arg Asp Lys Ile Leu Pro Asn Ser Ser Asp Glu Thr
285 290 295 CTT ATG CGA AGA ATG TCC TCA GTT GGA AAA AGA TCA GCC CAA ACC ATT 963 Leu Met Arg Arg Met Ser Ser Val Gly Lys Arg Ser Ala Gln Thr Ile
300 305 310 315
TCT AAT GAG CAG AGA GCC TCG AAG GCC CTT GGA GTC GTG TTT TTC CTT 1011 Ser Asn Glu Gln Arg Ala Ser Lys Ala Leu Gly Val Val Phe Phe Leu
320 325 330
TTT CTG CTT ATG TGG TGC CCC TTT TTT ATT ACA AAT CTA ACT TTA GCT 1059 Phe Leu Leu Met Trp Cys Pro Phe Phe Ile Thr Asn Leu Thr Leu Ala
335 340 345
CTG TGT GAT TCC TGC AAT CAG ACC ACT CTC AAA ACA CTC CTG GAG ATA 1107 Leu Cys Asp Ser Cys Asn Gln Thr Thr Leu Lys Thr Leu Leu Glu Ile
350 355 360
TTT GTG TGG ATA GGC TAC GTT TCC TCG GGG GTG AAT CCT CTG ATC TAT 1155 Phe Val Trp Ile Gly Tyr Val Ser Ser Gly Val Asn Pro Leu Ile Tyr
365 370 375
ACA CTC TTC AAT AAG ACA TTT CGG GAA GCA TTT GGC AGG TAC ATC ACC 1203 Thr Leu Phe Asn Lys Thr Phe Arg Glu Ala Phe Gly Arg Tyr Ile Thr
380 385 390 395
TGC AAT TAC CGA GCC ACA AAG TCA GTA AAA GCA CTT AGG AAG TTT TCC 1251 Cys Asn Tyr Arg Ala Thr Lys Ser Val Lys Ala Leu Arg Lys Phe Ser
400 405 410
AGT ACA CTT TGT TTT GGG AAT TCA ATG GTA GAA AAC TCT AAA TTT TTC 1299 Ser Thr Leu Cys Phe Gly Asn Ser Met Val Glu Asn Ser Lys Phe Phe
415 420 425
ACA AAA CAT GGA ATT CGA AAT GGG ATC AAC CCT GCC ATG TAC CAG AGC 1347 Thr Lys His Gly Ile Arg Asn Gly Ile Asn Pro Ala Met Tyr Gln Ser
430 435 440
CCA ATG AGG CTC CGA TGT TCA ACC ATT CAG TCC TCA TCA ATC ATC CTC 1395 Pro Met Arg Leu Arg Cys Ser Thr Ile Gln Ser Ser Ser Ile Ile Leu
445 450 455
CTC GAT ACC CTT CTC ACT GAA AAC GAT GGC GAC AAA GCG GAA GAG CAG 1443 Leu Asp Thr Leu Leu Thr Glu Asn Asp Gly Asp Lys Ala Glu Glu Gln
460 465 470 475
GTC AGC TAC ATA TAGCAGGAAC GGGCCGGCCT CATCTTGAGA GAGGGTGATG 1491 Val Ser Tyr Ile
AGCAGGACGC ACGCGCACCA TGGCAGGTTC AAGAGTG 1533
( 2 ) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 479 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Met Ala Ser Ser Tyr Lys Met Ser Glu Gln Ser Thr Thr Ser Glu His 1 5 1 0 1 5
Ile Leu Gln Lys Thr Cys Asp His Leu Ile Leu Thr Asn Arg Ser Gly
20 25 30
Leu Glu Thr Asp Ser Val Ala Glu Glu Met Lys Gln Thr Val Glu Gly
35 40 45
Gln Gly His Thr Val His Trp Ala Ala Leu Leu Ile Leu Ala Val Ile 50 55 60
Ile Pro Thr Ile Gly Gly Asn Ile Leu Val Ile Leu Ala Val Ala Leu 65 70 75 80 Glu Lys Arg Leu Gln Tyr Ala Thr Asn Tyr Phe Leu Met Ser Leu Ala
85 90 95
Ile Ala Asp Leu Leu Val Gly Leu Phe Val Met Pro Ile Ala Leu Leu
100 105 110
Thr Ile Met Phe Glu Ala Ile Trp Pro Leu Pro Leu Ala Leu Cys Pro
115 120 125
Ala Trp Leu Phe Leu Asp Val Leu Phe Ser Thr Ala Ser Ile Met His 130 135 140
Leu Cys Ala Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Ile Ala Ile Lys Lys Pro Ile 145 150 155 160 Gln Ala Asn Gln Cys Asn Thr Arg Ala Thr Ala Phe Ile Lys Ile Thr
165 170 175
Val Val Trp Leu Ile Ser Ile Gly Ile Ala Ile Pro Val Pro Ile Lys
180 185 190
Gly Ile Glu Thr Asp Val Ile Asn Pro His Asn Val Thr Cys Glu Leu
195 200 205
Thr Lys Asp Arg Phe Gly Ser Phe Met Val Phe Gly Ser Leu Ala Ala 210 215 220
Phe Phe Val Pro Leu Thr Ile Met Val Val Thr Tyr Phe Leu Thr Ile 225 230 235 240 His Thr Leu Gln Lys Lys Ala Tyr Leu Val Lys Asn Lys Pro Pro Gln
245 250 255
Arg Leu Thr Arg Trp Thr Val Pro Thr Val Phe Leu Arg Glu Asp Ser
260 265 270
Ser Phe Ser Ser Pro Glu Lys Val Ala Met Leu Asp Gly Ser His Arg
275 280 285
Asp Lys Ile Leu Pro Asn Ser Ser Asp Glu Thr Leu Met Arg Arg Met 290 295 300
Ser Ser Val Gly Lys Arg Ser Ala Gln Thr Ile Ser Asn Glu Gln Arg
305 310 315 320 Ala Ser Lys Ala Leu Gly Val Val Phe Phe Leu Phe Leu Leu Met Trp
325 330 335
Cys Pro Phe Phe Ile Thr Asn Leu Thr Leu Ala Leu Cys Asp Ser Cys 340 345 350
Asn Gln Thr Thr Leu Lys Thr Leu Leu Glu Ile Phe Val Trp Ile Gly
355 360 365
Tyr Val Ser Ser Gly Val Asn Pro Leu Ile Tyr Thr Leu Phe Asn Lys 370 375 380
Thr Phe Arg Glu Ala Phe Gly Arg Tyr Ile Thr Cys Asn Tyr Arg Ala 385 390 395 400
Thr Lys Ser Val Lys Ala Leu Arg Lys Phe Ser Ser Thr Leu Cys Phe
405 410 415 Gly Asn Ser Met Val Glu Asn Ser Lys Phe Phe Thr Lys His Gly Ile
420 425 430
Arg Asn Gly Ile Asn Pro Ala Met Tyr Gln Ser Pro Met Arg Leu Arg
435 440 445
Cys Ser Thr Ile Gln Ser Ser Ser Ile Ile Leu Leu Asp Thr Leu Leu 450 455 460
Thr Glu Asn Asp Gly Asp Lys Ala Glu Glu Gln Val Ser Tyr Ile 465 470 475
(2 ) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 14 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Ala Ser Pro Ser Gln Ser Leu Leu Lys Glu Ser Arg Leu Met
1 5 10

Claims

REVENDICATIONS
1. Polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID n° 2 ou d'un dérivé de celle-ci.
2. Polypeptide selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il possède la capacité de lier la sérotonine.
3. Polypeptide selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'il possède une activité de récepteur sérotoninergique.
4. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il peut être reconnu par des anticorps reconnaissant la séquence SEQ ID n° 2 complète.
5. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il comprend toute la séquence peptidique SEQ ID n° 2 ou le polypeptide SEQ ID n° 2(1-177)-SEQ ID n° 3.
6. Séquence nucléotidique codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5.
7. Séquence selon la revendication 6 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi :
(a) tout ou partie de la séquence nucléotidique SEQ ID n° 1 ou de son brin complémentaire,
(b) toute séquence hybridant avec une séquence (a) et codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5, et,
(c) les séquences dérivées des séquences (a) et (b) en raison de la dégénérescence du code génétique.
8. Séquence selon la revendication 7 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les séquences génomiques, d'ADNc, d'ARN, les séquences hybrides ou les séquences synthétiques ou semi-synthétiques.
9. Séquence selon l'une des revendications 6 à 8 caractérisée en ce que la partie codant pour ledit polypeptide est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire.
10. Séquence antisens capable d'inhiber au moins partiellement la production de polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5.
11. Séquence selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'elle est constituée par tout ou partie d'une séquence nucléotidique selon la revendication 7.
12. Sonde nucléotidique capable de s'hydrider avec une séquence selon la revendication 6 ou avec l'ARNm correspondant.
13 Sonde selon la revendication 12 caractérisée en ce qu'elle comporte au moins 10 bases.
14. Sonde selon la revendication 13 caractérisée en ce qu'elle comporte l'intégralité de la séquence SEQ ID n° 1 ou de son brin complémentaire.
15. Sonde selon la revendication 13 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les sondes (i), (ii), (iii), (iv), (v) et (vi).
16. Utilisation d'une sonde selon l'une des revendications 12 à 15 pour la détection de l'expression d'un récepteur sérotoninergique 5HT2C; ou pour la mise en évidence d'anomalies génétiques (mauvais épissage, polymorphisme, mutations ponctuelles, etc); ou pour identifier des affections neurologique, cardiovasculaire ou psychiatrique comme étant liées aux récepteurs 5HT2C; ou encore pour la mise en évidence et l'isolement de séquences d'acides nucléiques homologues codant pour des polypeptides 5HT2C.
17. Cellule recombinée capable d'exprimer à sa surface un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5.
18. Cellule selon la revendication 17 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les cellules eucaryotes ou procaryotes.
19. Procédé de mise en évidence et/ou d'isolement de ligands des polypeptides tels que définis dans les revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes suivantes :
- on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec une cellule recombinée selon la revendication 17 exprimant à sa surface un polypeptide tel que défini dans les revendications 1 à 5 dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite molécule dans le cas où celle-ci posséderait une affinité pour ledit polypeptide, et,
- on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide.
20. Procédé selon la revendication 19 pour la mise en évidence et/ou l'isolement d'agonistes ou d'antagonistes de la sérotonine.
21. Procédé de mise en évidence et/ou d'isolement de modulateurs des polypeptides tels que définis dans les revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes suivantes :
- on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec une cellule recombinée selon la revendication 17 exprimant à sa surface un polypeptide tel que défini dans les revendications 1 à 5, en présence de 5HT, dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et le 5HT, et,
- on détecte et/ou isole les molécules capables de moduler l'activité du 5HT sur ledit polypeptide.
22. Ligand ou modulateur d'un polypeptide tel que défini dans les revendications 1 à 5, susceptible d'être obtenu selon les procédés des revendications 19 à 21.
23. Utilisation d'un ligand ou modulateur identifié et/ou obtenu selon les procédés des revendications 19 à 21 comme médicament.
24. Médicament comprenant comme principe actif au moins une molécule agissant sur un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5.
25. Médicament selon la revendication 24 caractérisé en ce que la molécule est un ligand ou un modulateur identifié et/ou isolé selon le procédé des revendications 19 à 21.
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