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WO1994024162A1 - SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES CODANT POUR LE RECEPTEUR β3-ADRENERGIQUE (RAβ3) BOVIN ET LEURS APPLICATIONS - Google Patents

SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES CODANT POUR LE RECEPTEUR β3-ADRENERGIQUE (RAβ3) BOVIN ET LEURS APPLICATIONS Download PDF

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WO1994024162A1
WO1994024162A1 PCT/FR1994/000447 FR9400447W WO9424162A1 WO 1994024162 A1 WO1994024162 A1 WO 1994024162A1 FR 9400447 W FR9400447 W FR 9400447W WO 9424162 A1 WO9424162 A1 WO 9424162A1
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WO
WIPO (PCT)
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sequence
leu
ala
pro
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Application number
PCT/FR1994/000447
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English (en)
Inventor
Gerlinda Lenzen
Archana Kapoor
Original Assignee
Vetigen
Virbac
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Vetigen, Virbac filed Critical Vetigen
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Priority to US08/351,473 priority patent/US5656440A/en
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70571—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor

Definitions

  • NUCLEOTIDE SEQUENCES ENCODING THE BOVINE ⁇ 3-ADRENERGIC RECEPTOR (RA ⁇ 3) AND THEIR APPLICATIONS.
  • the present invention relates to nucleotide sequences coding for the bovine ⁇ 3-adrenergic receptor (RA ⁇ 3), to the use of said sequences as probes and for the expression of peptides and / or fragments thereof having Ra ⁇ 3 activity. bovine, to the vector useful for said expression as well as to the cellular hosts containing said vector.
  • RA ⁇ 3 bovine ⁇ 3-adrenergic receptor
  • the present invention also relates to a process for screening substances, with an agonist or antagonist action with respect to peptides of bovine origin having a ⁇ 3 -adrenergic receptor activity.
  • catecholamines such as adrenaline and noradrenaline
  • the synthetic agonists of these catecholamines which mimic their biological functions and antagonists, which block these biological functions, exert their effects by binding to recognition sites (receptors specific), located on cell membranes.
  • ⁇ adrenergic receptors Two main classes of adrenergic receptors have been defined, ⁇ adrenergic receptors and ⁇ adrenergic receptors.
  • catecholamine receptors ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 1, ⁇ 2 and ⁇ 3-RA.
  • Their genes have been recently isolated and identified (S. COTECCHIA et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 7159-7163; BK KOBILKA et al., 1987, Science, 238, 650-656; T. FRIELLE et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7920-7924; LJ EMORINE et al., 1987, Proc. Natl. Acad.
  • membrane receptors when they have fixed the appropriate ligand (agonist or antagonist), undergo a change in conformation, which induces an intracellular signal, which modifies the behavior of the target cell.
  • ⁇ -adrenergic receptors when they bind with catecholamine agonists, they catalyze the activation of a class of proteins G, which in turn stimulates the activity of adenylate cyclase, while the RA ⁇ antagonists act in competition with agonists for binding to the receptor and prevent activation of adenylate cyclase.
  • adenylate cyclase When activated, it catalyzes the production of an intracellular mediator or second messenger, in particular cyclic AMP.
  • RA-Hu ⁇ 3 new ⁇ -adrenergic receptors in humans, called RA-Hu ⁇ 3, and in mice (International Application WO 92/12246), called RA-Mu ⁇ 3, and characterized by properties different from those of ⁇ 1 and ⁇ 2 receptors, in particular in that they behave differently with respect to substances respectively antagonists and agonists of the ⁇ 1 and ⁇ 2 receptors (International Application WO 90/08775).
  • the RA-Hu ⁇ 3 receptor is more particularly constituted by a sequence of 408 amino acids and is considered to comprise seven hydrophobic transmembrane regions separated by hydrophilic loops intra- and extra-cellular and the RA-Mu ⁇ 3 receptor is constituted by 400 amino acid sequence and also has 7 transmembrane regions.
  • Previous work on RA-Hu ⁇ 3 and RA-Mu ⁇ 3 has particularly shown that the ⁇ 3-adrenergic receptor is involved in diseases such as diabetes and / or obesity, insofar as it is expressed in tissues that play a role. important role in metabolism (adipose tissue, skeletal muscles in particular).
  • RA-Bo ⁇ 3 ⁇ 3 adrenergic receptor in cattle
  • the subject of the present invention is a nucleotide sequence, characterized in that it corresponds to 1 ⁇ DNc of the bovine gene coding for the bovine ⁇ 3 adrenergic receptor.
  • nucleotide sequence comprises the sequence of nucleotides and the deduced sequence of amino acids of formula (I) (SEQ ID No. 1) below:
  • GGC CGG CGG CCG GCG CGC CTT CTG CCT CTG CGG GAA CAC CGC GCC CTG 979 Gly Arg Arg Pro Ala Arg Leu Leu Pro Leu Arg Glu His Arg Ala Leu
  • Said sequence comprises in particular the following unique restriction sites:
  • the subject of the invention is also the fragments of said sequence, useful for the expression of the corresponding peptide and / or the detection of the bovine gene coding for the bovine ⁇ 3 adrenergic receptor.
  • the present invention also relates to cDNA clones, characterized in that they comprise a fragment of a sequence coding for the bovine ⁇ 3 receptor
  • M13-6.6 includes 2979 base pairs, includes the sequence of formula I and includes the following unique restriction sites: EcoR V, Bcg I, Nhe I, BstE II, BspH I, Bsg I, Sap I, BamH I, Asc I, Stu I, Fse I, Drd I, Srf I , Sfc I, Ase I, Bsm I, Dra I, Bsp1407 I, Csp6 I, Rsa I, Ssp I, Dra III, Bgl II, Afl II, Spe I, Tfi I, Hpa I, Nde I, EcoN I, BsaB I, Pvu I.
  • the present invention also relates to nucleotide probes, characterized in that they consist of a nucleotide sequence as defined above, or a fragment thereof, marked using a marker such as a radioactive isotope, a suitable enzyme or a fluorochrome.
  • Said nucleotide probes are characterized in that they hybridize with the nucleotide sequences as defined above but do not hybridize with the genes coding for the ⁇ 1 and ⁇ 2 adrenergic receptors, nor with the messenger RNA of said ⁇ 1 receptors and ⁇ 2 adrenergic.
  • its sequence is homologous or complementary to that of a segment of at least 10 bp of sequence I.
  • homologous sequence includes not only the sequences identical to sequence I, or to a fragment thereof, but also those differing only by substitution, deletion or addition of 'A small number of nucleotides, provided that the sequences thus modified have a specificity of hybridization equivalent to that of the sequence (I) or of the unmodified segment considered.
  • hybridization conditions are defined as follows:
  • the appropriate hybridization conditions are as follows:
  • suitable hybridization conditions are those indicated above for the shortest probes, but in which the above-defined medium contains 40% formamide instead of 10 to 25% formamide.
  • said probe can be advantageously defined by any one of the above nucleotide sequences and in particular by the fragment of 2 kbases, which corresponds to the entire sequence of formula I.
  • the present invention also relates to a peptide and / or a peptide fragment, characterized in that it is encoded by a nucleotide sequence as defined above and in that it exhibits ⁇ 3-adrenergic receptor activity.
  • a ⁇ 3-adrenergic receptor activity is that defined in French Patent Application No. 89 00918, namely that, when the fragment is exposed on the surface of a cell, it is capable of participating in the activation of adenylate cyclase in the presence of one of the following agonists: BRL 28410, BRL 37344, CGP 12177A, (1) -isoproterenol and carazolol; either it is capable of being recognized by antibodies which recognize neither the ⁇ 1 adrenergic receptor nor the adrenergic receptor ⁇ 2; either it is capable of generating antibodies which recognize neither the ⁇ 1 receptor nor the ⁇ 2 receptor.
  • said peptide comprises 405 amino acids and has the following amino acid sequence of formula II (SEQ ID No. 2):
  • This peptide is hereinafter called the bovine ⁇ 3-adrenergic receptor (RA-Bo ⁇ 3).
  • the invention also includes the peptides variants of those defined above, which contain certain mutations, without the peptides losing the properties of ⁇ 3-adrenergic receptor.
  • the present invention also relates to fragments or combinations of fragments of RA-Bo ⁇ 3, in accordance with the invention, and in particular:
  • Said fragments can advantageously be obtained by synthesis, in particular by the Merrifield method.
  • the present invention also relates to a recombinant cloning and / or expression vector, characterized in that it comprises a nucleotide sequence in accordance with the invention.
  • the term “recombinant vector” means both a plasmid, a cosmid and a phage.
  • said vector consists of an appropriate recombinant vector, comprising in particular an origin of replication in an appropriate host microorganism, in particular a bacterium or a eukaryotic cell, at least one gene whose expression allows the selection either bacteria or eukaryotic cells having received said vector, an appropriate regulatory sequence, in particular a promoter allowing the expression of genes in said bacteria or eukaryotic cells, and into which is inserted a nucleotide sequence or a sequence fragment such as defined above, which vector is an expression vector for a peptide, a peptide fragment or a combination of peptide fragments having bovine adrenergic ⁇ 3 receptor activity.
  • said vector consists of a pRc / CMV expression vector into which is inserted, at the level of the multisite linker, at least the fragment coding for the bovine ⁇ 3-adrenergic receptor; such a plasmid was named pRc / CMV-Bo ⁇ 3-ADR, and was deposited with the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) held by the INSTITUT PASTEUR, dated April 15, 1993 under the n ° I-1297 .
  • CNCM National Collection of Cultures of Microorganisms
  • the present invention also relates to an appropriate host cell, obtained by genetic transformation, characterized in that it is transformed by an expression vector in accordance with the invention.
  • Such a cell is capable of expressing a peptide, of bovine origin, having a ⁇ 3-adrenergic receptor activity.
  • the host cell is in particular constituted by the cells of the CHO (Chinese Hamster Ovary) line.
  • Another of the microorganisms used can consist of a bacterium, in particular Escherichia coli.
  • the bovine ⁇ 3-adrenergic receptors in accordance with the invention constitute a tool for the selection of ligands involved in the activation of these receptors and make it possible to identify and select specific ⁇ -adrenergic ligands ⁇ 3-adrenergic receptors and in particular ligands which are more affine and more selective for the bovine ⁇ 3-adrenergic receptor than for the human ⁇ 3-adrenergic receptor.
  • the method of selection and identification of substances capable of behaving as a specific ligand with respect to a peptide comprises:
  • bovine peptide bovine ⁇ 3 adrenergic receptor
  • Such a method allows the selection, either of ligands specific for the ⁇ 3-adrenergic receptor, or of ligands specific for the bovine ⁇ 3-adrenergic receptor exclusively.
  • FIG. 1a shows the restriction map of the 2000 bp coding fragment, which corresponds to formula I;
  • FIG. 1b shows the restriction map of clone 6.6 which contains the bovine ⁇ 3-adrenergic gene and comprises 3 kb, in all;
  • - Figure 2 is a comparison of human, murine (mouse and rat) and bovine ⁇ 3 receptors;
  • - Figure 3 shows a comparison of the coding sequences for RA-Hu ⁇ 3 and bovine RA- ⁇ 3;
  • FIG. 4 shows the expression vector pRc / CMV-Bo ⁇ 3-ADR
  • FIG. 5 shows the expression vector pRc / CMV including a multisite linker comprising the following unique restriction sites: Hind III, BstX I, Not I, Xba I and Apa I.
  • EXAMPLE 1 Isolation and identification of the bovine ⁇ 3-adrenergic gene.
  • the bovine ⁇ 3-adrenergic gene was isolated from a cDNA library of brown calf adipose tissue, built in the bacteriophage ⁇ gt11.
  • RNAs are extracted from brown calf adipose tissue, by the method using guanidinium thiocyanate, then the poly A + messenger RNAs are purified using oligo (dT) columns (Pharmacia ref.: 27- 9258-01).
  • RNAs and messenger RNAs were analyzed in a Northern blot to verify the presence and size of the messengers of the gene sought. After electrophoresis, the RNA was transferred to a positively charged nylon membrane (Amersham Hybond® N + ref. RPN 203B). This membrane is then hybridized with a radiolabelled probe (radiolabelling see screening for recombinant phages, below), consisting of a DNA fragment of 2900 base pairs containing the entire murine ⁇ 3-adrenergic gene previously isolated in the laboratory (NAHMIAS et al., 1991, EMBO J., 10, 3721-3727; International Application WO 92/12246).
  • a radiolabelled probe see screening for recombinant phages, below
  • RNA is indeed brown adipose tissue
  • Northern blot obtained above was hybridized with a radiolabeled probe corresponding to the gene for human uncoupling protein (hUCP).
  • hUCP human uncoupling protein
  • oligo (dT) 15 primer from the kit "RiboClone cDNA synthesis System" (Promega ref. C 2100) .
  • the synthesis of the first strand of cDNA is carried out in the presence of reverse transcriptase AMV, and the synthesis of the second strand is carried out using two enzymes acting simultaneously (E. coli polymerase I and E. coli RNase H). Then the double stranded cDNA is treated with T4 DNA polymerase, in order to obtain blunt ends.
  • the Promega C 2100 kit is used for all of these reactions.
  • EcoRI EcoRI are added, in order to be able to insert the cDNA obtained in the bacteriophage ⁇ gtll, under the following conditions, described in the EcoR I Adapter Ligation System I kit (Promega, ref .: C 1900):
  • cDNA is centrifuged through a template
  • the adapters are phosphorylated in the presence of T4 polynucleotide kinase.
  • the bacteriophage ⁇ gt11 used as a vector, comes from the "Protoclone Lambda gt11 System” kit (Promega ref. T 301 / 0-2).
  • the phage DNA is digested with EcoRI and dephosphorylated. Dephosphorylation prevents the vector from closing in on itself.
  • the reconstituted phage particles are used to infect bacteria, in particular the Y1090 (r-) strain.
  • each plaque corresponds to a recombinant phage.
  • the titer of the cDNA library is determined and is approximately 4 million recombinant phages.
  • the background noise of the vector alone without insert is 3.5%, which is perfectly acceptable.
  • LE 392 Genotype: F-, hsdR 574 (r-, m +), supE44, supF58, lacY1 or ⁇ (lac1ZY) 6, galk2, galT22, metB1, trpR55, ⁇ -).
  • primer ⁇ gt11 sense strand of 24 seas, of formula: 5 'd (GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG) 3', and
  • primer ⁇ gt11 anti-sense strand of 24 seas also, of formula: 5 'd (TTGACACCAGACCAACTGGTAATG) 3' (New England Biolabs).
  • clone # 6 was chosen for further analysis since it contains the largest insert of cDNA sought (3 kilobases).
  • the fragment comprising the cDNA was inserted into the bacteriophage M13 tg 131 in order to be able to sequence the gene.
  • This DNA fragment was purified from the DNA of clone 6 and subcloned into the EcoR I site of the vector M13tg131.
  • the M13 clones having integrated the DNA fragment in the 2 opposite orientations (6.3 and 6.6) were identified and sequenced.
  • the USB Sequenase Version 2.0 kit (United States Biochemical ref .: 70770) was used.
  • the sequence was carried out using specific primers, which hybridize on the sense strand.
  • results obtained show the nucleotide sequence of bovine RA ⁇ 3 (1215 bp) and non-coding regions (106 bp in 5 'and 638 bp in 3') (formula I) .
  • the restriction sites contained in the 2000 bp fragment are positioned in FIG. La (bov 6.6 short (pA)).
  • Figure 1b shows the unique restriction sites contained in the 3 kb fragment that has been sequenced.
  • the comparison of the coding regions of the human and bovine ⁇ 3 genes indicates a strong homology (85% at the level of the nucleotide sequences between bovine and human RA); the comparison of the coding regions of the bovine and murine ⁇ 3 genes also shows a high homology (76% at the level of the nucleotide sequences between bovine RA and murine RA).
  • the bovine ⁇ 3 gene codes for the peptide of
  • the restriction map of the 2 kb fragment which has been sequenced indicates the presence of a cleavage site by the enzyme Srf I at position 1598, ie 270 nucleotides downstream of the coding region of the ⁇ 3 gene of beef.
  • the DNA of clone M13-6.6 was digested with the enzymes EcoR I and Srf I to release the fragment of 1598 base pairs containing the coding region of the bovine ⁇ 3 gene and part of the 3 'untranslated region. This DNA fragment was purified, then inserted into the expression vector pRc / CMV, at the Hind III and Xba I cleavage sites (FIG. 5).
  • EXAMPLE 4 Pharmacological properties of the expression product of the bovine ⁇ 3 gene.
  • the bovine ⁇ 3 gene is expressed on the surface of eukaryotic cells, which have all the elements necessary for signal transduction.
  • the recombinant plasmid pRc / CMV of Example 3 was transfected into CHO-K1 cells by a lypofectin transfection method; the transfected cells are selected with geneticin (G418) (derived from neomycin).
  • transfection method is carried out as follows:
  • the CHO-K1 cells (ATCC CCL 61) are cultured at confluence in a culture medium containing: DMEM medium at 45%, F12-Ham medium at 45%, fetal calf serum inactivated with heat at 10%, 2 mM glutamine, 100 U / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin.
  • 1 ⁇ g of DNA from the bovine pRc / CMV ⁇ 3 plasmid is mixed with 5 ⁇ l of lipofectin (GIBCO) and 1000 ⁇ l of the abovementioned culture medium, devoid of serum.
  • This mixture is added to cultured cells, which are left to incubate at 37oC, for 5 hours.
  • the medium is replaced with the abovementioned culture medium, containing serum, and the cells are again incubated at 37 ° C. for 48 hours.
  • the cells are then distributed in 96 wells according to variable dilutions and incubated in the presence of geneticin (G418, Gibco) at 400 ⁇ g / ml, in a complete medium, for approximately 10 days, the medium being changed every two days.
  • geneticin G418, Gibco
  • the different colonies obtained are then subcloned, first in 48 wells, then in 6 wells, before screening.
  • Stable colonies are screened for their ability to specifically bind [ 125 I] -cyanopindolol and also for their ability to stimulate adenylate cyclase, in the presence of isoproterenol, according to the protocol described in TATE et al., Eur . J.
  • RA ⁇ 3 binds the [ 125 I] -cyanopindolol, with an affinity equivalent to that of the corresponding RA ⁇ 3 in humans or mice, also obtained by cloning.
  • a set of subclones was selected from the stable clones; one of them, named 62-26, was used for the pharmacological evaluation of bovine RA ⁇ 3.
  • the pharmacological characterization of the bovine RA ⁇ 3 receptor was carried out using the stable clone 62-26.
  • the pharmacological properties of 10 ⁇ 3-adrenergic ligands were determined by adenylate cyclase stimulation and [ 125 I] -cyanopindolol binding studies.
  • the pre-influent cells in six-well plates (0.6 ⁇ 10 6 cells / well) are placed in the presence, or not, of increasing doses of ligands for 30 minutes at 37 ° C.
  • the reaction is stopped by washing in PBS at 4oC and addition of 500 ⁇ l of 1N NaOH. After centrifugation and neutralization with 1N acetic acid, the cell lysates are recovered and the total amount of accumulated cAMP is determined using a commercial assay kit.
  • RA ⁇ 3 ( ⁇ 1-, ⁇ 2-RA antagonists): CGP12177A, ICI201651, bucindolol. Bupranolol was also tested as described as an antagonist of the three receptor types (BLIN et al., Br. J. Pharmacol., 1994, in press). Finally, the (-) propranolol described as a partial agonist of the human RA ⁇ 3 receptor and antagonist of the mouse RA ⁇ 3 receptor (NAHMIAS et al., EMBO J., 1991, 10, 3721-3727) was tested. The values of the activation constants of adenylate cyclase (Kact), of the inhibition constants
  • the ligands specific for the RA ⁇ 3 receptor all have a lower Kact value for the bovine RA ⁇ 3 receptor compared to the human, mouse RA ⁇ 3 receptors, and therefore have better efficacy in stimulating adenylate cyclase.
  • Propranolol is a partial agonist on bovine RA ⁇ 3 as for the human RA ⁇ 3 receptor.
  • bupranolol which is described as a potent antagonist for the human and murine RA ⁇ 3 receptors, is a partial agonist on the bovine RA ⁇ 3 receptor.
  • GGC CGG CGG CCG GCG CGC CTT CTG CCT CTG CGG GAA CAC CGC GCC CTG 979 Gly Arg Arg Pro Ala Arg Leu Leu Pro Leu Arg Glu His Arg Ala Leu
  • CTGGCTTCCT CACTGTAGAC ACACCTACCT CACAGCATTT TCAGGACTTT ACTTTAGCCT 1851

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Abstract

Séquences nucléotidiques codant pour le récepteur β3-adrénergique (RAβ3) bovin, utilisation desdites séquences comme sondes et pour l'expression de peptides et/ou de fragments de ceux-ci ayant une activité de RAβ3 bovin, vecteur utile pour ladite expression ainsi que les hôtes cellulaires contenant ledit vecteur. Procédé de criblage d'une substance, à action agoniste ou antagoniste vis-à-vis des peptides ayant une action de récepteur β3-adrénergiques, particulièrement sélective vis-à-vis du récepteur bovin.

Description

SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES CODANT POUR LE RECEPTEUR β3-ADRENERGIQUE (RAβ3) BOVIN ET LEURS APPLICATIONS.
La présente invention est relative à des séquences nucléotidiques codant pour le récepteur β3-adrénergique (RAβ3) bovin, à l'utilisation desdites séquences comme sondes et pour l'expression de peptides et/ou de fragments de ceux-ci ayant une activité de Raβ3 bovin, au vecteur utile pour ladite expression ainsi qu'aux hôtes cellulaires contenant ledit vecteur.
La présente invention est également relative à un procédé de criblage de substances, à action agoniste ou antagoniste vis-à-vis des peptides d'origine bovine ayant une activité de récepteur β3 -adrénergique.
Il est connu que les catécholamines telles que l'adrénaline et la noradrénaline, les agonistes synthétiques de ces catécholamines, qui miment leurs fonctions biologiques et les antagonistes, qui bloquent ces fonctions biologiques, exercent leurs effets en se liant à des sites de reconnaissance (récepteurs membranaires) spécifiques, situés sur les membranes cellulaires.
Deux classes principales de récepteurs adrénergiques ont été définies, les récepteurs adrénergiques α et les récepteurs adrénergiques β.
Dans l'ensemble de ces deux classes, on distingue, maintenant, cinq sous-types de récepteurs aux catécholamines (α1, α2, β1, β2 et β3-RA). Leurs gènes ont été récemment isolés et identifiés (S. COTECCHIA et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 7159-7163 ; B.K. KOBILKA et al., 1987, Science, 238, 650-656 ; T. FRIELLE et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7920-7924 ; L.J. EMORINE et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 6995-6999 ; L.J. EMORINE et al., 1989, Science, 245, 1118-1121). L'analyse de ces gènes a permis de reconnaître leur appartenance à une famille de récepteurs membranaires intégraux présentant certaines homologies (R.A.F. DIXON et al., 1988, Annual Reports in Médicinal Chemistry, 221-233 ; L.J. EMORINE et al., 1988, Proc. NATO Adv. Res. Workshop), notamment au niveau de 7 régions transmembranaires, qui sont couplées à des protéines régulatrices, appelées protéines G, susceptibles de fixer des molécules de guanosine triphosphate (GTP).
Ces récepteurs membranaires, lorsqu'ils ont fixé le ligand approprié (agoniste ou antagoniste), subissent un changement de conformation, qui induit un signal intracellulaire, qui modifie le comportement de la cellule cible.
Dans le cas des récepteurs β-adrénergiques, lorsqu'ils se lient avec des agonistes des catécholamines, ils catalysent l'activation d'une classe de protéines G, qui stimule à son tour l'activité de l'adénylate cyclase, alors que les antagonistes des RAβ agissent en compétition avec les agonistes pour la liaison au récepteur et empêchent l'activation de l'adénylate cyclase.
Lorsque l'adénylate cyclase est activée, elle catalyse la production d'un médiateur intracellulaire ou second messager, notamment l'AMP cyclique.
Les Inventeurs ont récemment mis en évidence de nouveaux récepteurs β-adrénergiques chez l'Homme, dénommés RA-Huβ3, et chez la souris (Demande Internationale WO 92/12246), dénommés RA-Muβ3, et caractérisés par des propriétés différentes de celles des récepteurs β1 et β2, notamment en ce qu'ils se comportent de façon différente vis-à-vis de substances respectivement antagonistes et agonistes des récepteurs β1 et β2 (Demande Internationale WO 90/08775).
En particulier, le récepteur RA-Huβ3 est plus particulièrement constitué par une séquence de 408 amino-acides et est considéré comme comportant sept régions transmembranaires hydrophobes séparées par des boucles hydrophiles intra- et extra-cellulaires et le récepteur RA-Muβ3 est constitué par une séquence de 400 amino-acides et comporte également 7 régions transmembranaires. Les travaux antérieurs concernant le RA-Huβ3 et le RA-Muβ3 ont particulièrement montré que le récepteur β3-adrénergique intervient dans les maladies telles que le diabète et/ou l'obésité, dans la mesure où il est exprimé dans des tissus qui jouent un rôle important dans le métabolisme (tissus adipeux, muscles squelettiques notamment).
Poursuivant ses travaux dans cette voie, l'un des Inventeurs a cherché à mettre en évidence un tel récepteur adrénergique β3 chez les bovins (RA-Boβ3), afin de pouvoir disposer d'un outil de régulation de la quantité de graisses chez ces animaux, notamment dans un but d'amélioration de la qualité de la viande.
La présente invention a pour objet une séquence nucléotidique, caractérisée en ce qu'elle correspond à 1 ΑDNc du gène bovin codant pour le récepteur adrénergique β3 bovin.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite séquence nucléotidique, elle comprend la séquence en nucléotides et la séquence déduite en aminoacides de formule (I) (SEQ ID n° 1) suivante :
CCCAGGCCAG GGAAATCGCT CCCACGCCCC GATGCCCCCG CCGCTGAGCA GGGTGAGCTG 60
GGAGACCCTT TCCCTCATTC CTTCCCGCCC CACGCGCGAC GCGGGG ATG GCT CCG 115
Met Ala Pro
1
TGG CCT CCT GGG AAC AGC TCT CTG ACC CCG TGG CCA GAT ATC CCC ACC 163 Trp Pro Pro Gly Asn Ser Ser Leu Thr Pro Trp Pro Asp Ile Pro Thr
5 10 15
CTG GCA CCC AAT ACT GCC AAC GCG AGT GGG CTG CCA GGG GTG CCC TGG 211
Leu Ala Pro Asn Thr Ala Asn Ala Ser Gly Leu Pro Gly Val Pro Trp
20 25 30 35 GCG GTG GCG CTG GCG GGG GCG CTG TTG GCG CTA GCG GTG CTG GCC ACC 259
Ala Val Ala Leu Ala Gly Ala Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr
40 45 50
GTG GGA GGC AAC CTG CTG GTA ATC GTG GCC ATC GCC CGG ACG CCG AGA 307 Val Gly Gly Asn Leu Leu Val Ile Val Ala Ile Ala Arg Thr Pro Arg
55 60 65
CTC CAG ACC ATG ACC AAC GTG TTC GTG ACT TCG CTG GCC ACA GCC GAC 355
Leu Gln Thr Met Thr Asn Val Phe Val Thr Ser Leu Ala Thr Ala Asp
70 75 80 CTG GTG GTG GGG CTC CTG GTC GTG CCC CCG GGG GCC ACG TTG GCG CTG 403 Leu Val Val Gly Leu Leu Val Val Pro Pro Gly Ala Thr Leu Ala Leu
85 90 95
ACC GGC CAC TGG CCC CTG GGC GTC ACC GGT TGC GAG CTG TGG ACC TCA 451 Thr Gly His Trp Pro Leu Gly Val Thr Gly Cys Glu Leu Trp Thr Ser 100 105 110 115
GTG GAC GTG CTG TGT GTG ACC GCC AGC ATC GAA ACC CTG TGC GCC CTG 499 Val Asp Val Leu Cys Val Thr Ala Ser Ile Glu Thr Leu Cys Ala Leu
120 125 130
GCG GTG GAC CGC TAC CTG GCC GTG ACC AAC CCG CTG CGC TAC GGC GCG 547 Ala Val Asp Arg Tyr Leu Ala Val Thr Asn Pro Leu Arg Tyr Gly Ala
135 140 145
CTG GTC ACC AAA CGC CGC GCC CTA GCA GCC GTG GTC CTG GTG TGG GTG 595
Leu Val Thr Lys Arg Arg Ala Leu Ala Ala Val Val Leu Val Trp Val
150 155 160
GTG TCC GCC GCG GTG TCG TTT GCG CCC ATC ATG AGC AAA TGG TGG CGC 643
Val Ser Ala Ala Val Ser Phe Ala Pro Ile Met Ser Lys Trp Trp Arg
165 170 175
ATC GGG GCC GAT GCC GAG GCG CAG CGT TGC CAC TCC AAC CCG CGC TGC 691 Ile Gly Ala Asp Ala Glu Ala Gln Arg Cys His Ser Asn Pro Arg Cys 180 185 190 195
TGC ACC TTC GCC TCC AAC ATG CCC TAC GCG CTG CTC TCC TCC TCG GTC 739 Cys Thr Phe Ala Ser Asn Met Pro Tyr Ala Leu Leu Ser Ser Ser Val
200 205 210
TCG TTC TAT CTT CCG CTC CTG GTG ATG CTC TTC GTC TAC GCA CGA GTT 787 Ser Phe Tyr Leu Pro Leu Leu Val Met Leu Phe Val Tyr Ala Arg Val
215 220 225
TTC GTG GTG GCC ACG CGC CAG CTG CGC TTG CTG CGC CGG GAG CTG GGT 835 Phe Val Val Ala Thr Arg Gln Leu Arg Leu Leu Arg Arg Glu Leu Gly
230 235 240
CGC TTC CCG CCA GAG GAG TCT CCG CCG GCT CCT TCT CGC TCC GGA TCC 883 Arg Phe Pro Pro Glu Glu Ser Pro Pro Ala Pro Ser Arg Ser Gly Ser
245 250 255
CCT GGC CTG GCG GGG CCG TGC GCC TCG CCC GCG GGG GTG CCC TCC TAC 931
Pro Gly Leu Ala Gly Pro Cys Ala Ser Pro Ala Gly Val Pro Ser Tyr
260 265 270 275
GGC CGG CGG CCG GCG CGC CTT CTG CCT CTG CGG GAA CAC CGC GCC CTG 979 Gly Arg Arg Pro Ala Arg Leu Leu Pro Leu Arg Glu His Arg Ala Leu
280 285 290
CGC ACC TTG GGG CTC ATC ATG GGA ACC TTC ACT CTC TGC TGG TTG CCT 1027
Arg Thr Leu Gly Leu Ile Met Gly Thr Phe Thr Leu Cys Trp Leu Pro
295 300 305
TTC TTT GTG GTC AAC GTG GTG CGC GCC CTC GGG GGC CCC TCT CTG GTG 1075
Phe Phe Val Val Asn Val Val Arg Ala Leu Gly Gly Pro Ser Leu Val
310 315 320
TCC GGC CCC ACT TTC CTC GCC CTT AAC TGG CTG GGC TAT GCC AAC TCT 1123 Ser Gly Pro Thr Phe Leu Ala Leu Asn Trp Leu Gly Tyr Ala Asn Ser
325 330 335 GCC TTC AAC CCG CTC ATC TAC TGC CGC AGC CCG GAC TTT CGG AGC GCC 1171 Ala Phe Asn Pro Leu Ile Tyr Cys Arg Ser Pro Asp Phe Arg Ser Ala 340 345 350 355 TTC CGC CGC CTG CTG TGT CGC TGC CGG CCG GAG GAG CAC CTC GCC GCT 1219 Phe Arg Arg Leu Leu Cys Arg Cys Arg Pro Glu Glu His Leu Ala Ala
360 365 370
GCC TCC CCG CCC CGA GCC CCC TCC GGC GCC CCC ACG GCC CTG ACC AGC 1267 Ala Ser Pro Pro Arg Ala Pro Ser Gly Ala Pro Thr Ala Leu Thr Ser
375 380 385
CCC GCT GGC CCC ATG CAG CCC CCA GAG CTC GAC GGG GCT TCC TGC GGA 1315 Pro Ala Gly Pro Met Gln Pro Pro Glu Leu Asp Gly Ala Ser Cys Gly
390 395 400
CTT TCT TAGGCCTTGA AGAAACAACT CCATTGATCC GGAACCTTTG GAAAGCCTCT 1371 Leu Ser
405
GGCCGGCCTC GGTTCAGAAT GAGCCCCGTG GAGTTTCCCA GCTGGAAAAC TCTGCCCTCC 1431
CCAGCCTGAC GACTGGGTCC TGGGAGGAGG CGCGGGGGCT GACTGGGGAG GGGAAATCCT 1491 TACCAAGTGG GTTTTCGCfC TCTTTCTGAG AGAAGTTTTC TACACCCCAG CCCTGAACTT 1551
CACCGCTGCC TCAGCAGCTC CCGCGTCTGG TTTCCCATGC CCAGGTGCCC GGGCAGGAGC 1611
TGGGCTGCGT TTAGCCCCGG GACCCGCACC TGTCCCACTC GGGTGCTGTG TGCGCAGGGG 1671
CAAGGCGGGC ACCTTCATTC TGTTCCTTCT GCCGCCCAGA CCCTGAGGAA CCCACCGGGG 1731
TGCTGGAGGC CCAGGCTGAG AAGAGGAAGG TGGGGAAGGT CACGGTTTGG GCTTCTGTCC 1791 CTGGCTTCCT CACTGTAGAC ACACCTACCT CACAGCATTT TCAGGACTTT ACTTTAGCCT 1851
TTGGGGTGGG GGTGGGGGGG CGCTCCTGGT TTCCTGGGAA GGTGAACCAT TAGAATGGGT 1911
CCCTTTTCCT TTTGAAATCA AATTAATAAA TGTTACTGAA TGCAGTTTAA AAAAAAAAAA 1971
AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAA 2000
(I)
Dans cette séquence, l'ATG souligné qui se trouve en position 107, correspond probablement au codon d'initiation de la synthèse protéique.
Il existe 85 % d'homologie entre les séquences nucléotidiques bovine et humaine codant pour le récepteur adrénergique β3 et il existe 76 % d'homologie entre les séquences nucléotidiques bovine et murine codant pour le récepteur adrénergique β3.
Ladite séquence comprend notamment les sites de restriction uniques suivants :
Bpu1102 I, Fok I, EcoR V, Bcg I, Nhe I,
BspM I, Afl III, Age I, BstE II, BspH I, Bsg I, Nsp I, Nsp7524 I, NspC I, Sap I, BamH I, BstY I, Asc I, Sty I, Hinc II, Apa I, Bsp120 I, Bbe I, Ehe I, Kas I, Nar I, Ec1136 I, Sac I, Stu I, Fse I, Drd I, Tth111 I, Srf I, Bsu36 I, Sfc I, BstX I, Ase I, Bsm I, Dra I.
L'invention a également pour objet les fragments de ladite séquence, utiles pour l'expression du peptide correspondant et/ou la détection du gène bovin codant pour le récepteur adrénergique β3 bovin.
Parmi lesdits fragments, on peut citer :
- le fragment de 78 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 218-295 de la séquence de formule I, et qui code pour la région transmembranaire TM1,
- le fragment de 72 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 332-403 de la séquence de formule I, et qui code pour la région transmembranaire TM2,
- le fragment de 66 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 434-499 de la séquence de formule I, et qui code pour la région transmembranaire TM3 ,
- le fragment de 69 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 572-640 de la séquence de formule
I, et qui code pour la région transmembranaire TM4,
- le fragment de 72 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 713-784 de la séquence de formule I, et qui code pour la région transmembranaire TM5,
- le fragment de 66 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 983-1048 de la séquence de formule I, et qui code pour la région transmembranaire TM6,
- le fragment de 78 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 1070-1147 de la séquence de formule I, et qui code pour la région transmembranaire TM7.
La présente invention a également pour objet des clones d'ADNc, caractérisés en ce qu'ils comprennent un fragment de séquence codant pour le récepteur β3 bovin
(RA-Boβ3).
Conformément à l'invention, le clone dénommé
M13-6.6 comprend 2979 paires de bases, inclut la séquence de formule I et comprend les sites de restriction uniques suivants : EcoR V, Bcg I, Nhe I, BstE II, BspH I, Bsg I, Sap I, BamH I, Asc I, Stu I, Fse I, Drd I, Srf I, Sfc I, Ase I, Bsm I, Dra I, Bsp1407 I, Csp6 I, Rsa I, Ssp I, Dra III, Bgl II, Afl II, Spe I, Tfi I, Hpa I, Nde I, EcoN I, BsaB I, Pvu I.
La présente invention a également pour objet des sondes nucléotidiques, caractérisées en ce qu'elles sont constituées par une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, ou un fragment de celle-ci, marquée à l'aide d'un marqueur tel qu'un isotope radioactif, une enzyme appropriée ou un fluorochrome.
Lesdites sondes nucléotidiques sont caractérisées en ce qu'elles s'hybrident avec les séquences nucléotidiques telles que définies ci-dessus mais ne s'hybrident pas avec les gènes codant pour les récepteurs β1 et β2 adrénergiques, ni avec l'ARN messager desdits récepteurs β1 et β2 adrénergiques.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite sonde, sa séquence est homologue ou complémentaire de celle d'un segment d'au moins 10 pb de la séquence I.
Au sens de la présence invention, "séquence homologue" englobe non seulement les séquences identiques à la séquence I, ou à un fragment de celle-ci, mais également celles n'en différant que par la substitution, la délétion ou l'addition d'un petit nombre de nucléotides, à condition que les séquences ainsi modifiées aient une spécificité d'hybridation équivalente à celle de la séquence (I) ou du segment non modifié considéré.
De même, on entend par "séquence complémentaire", non seulement les séquences strictement complémentaires de la séquence (I) ou de ses segments, mais également des séquences modifiées, comme indiqué précédemment, possédant une spécificité d'hybridation équivalente à celle desdites séquences strictement complémentaires. Les conditions d'hybridation sont définies comme suit :
Pour les sondes les plus courtes, c'est-à-dire d'environ 10 à environ 100 nucléotides, les conditions d'hybridation appropriées sont les suivantes :
750 mM de NaCl, 75 mM de Tris-sodium citrate, 50 μg/ml d'ADN de sperme de saumon, 50 mM de phosphate de sodium, 1 mM de pyrophosphate de sodium, 100 μM d'ATP, 10 à 25 % de formamide, 1 % Ficoll ("PHARMACIA" poids moléculaire moyen de 400,00), 1 % de polyvinylpyrrolidone, 1 % de sérum albumine bovine, pendant 14 à 16 h à 42ºC.
Pour les sondes les plus longues, c'est-à-dire présentant plus d'environ 100 nucléotides, des conditions d'hybridation appropriées sont celles indiquées précédemment pour les sondes les plus courtes, mais dans lesquelles le milieu sus-défini contient 40 % de formamide au lieu de 10 à 25 % de formamide.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite sonde peut être avantageusement définie par l'une quelconque des séquences nucléotidiques ci-dessus et notamment par le fragment de 2 kbases, qui correspond à la totalité de la séquence de formule I.
La présente invention a également pour objet un peptide et/ou un fragment de peptide, caractérisé en ce qu'il est codé par une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus et en ce qu'il présente une activité de récepteur β3-adrénergique.
Une activité de récepteur β3-adrénergique est celle définie dans la Demande de Brevet français nº 89 00918, à savoir que, lorsque le fragment est exposé à la surface d'une cellule, il est capable de participer à l'activation de l'adénylate cyclase en présence d'un des agonistes suivants : BRL 28410, BRL 37344, CGP 12177A, (1)-isoprotérénol et carazolol ; soit il est susceptible d'être reconnu par des anticorps qui ne reconnaissent ni le récepteur adrénergique β1, ni le récepteur adrénergique β2 ; soit il est susceptible de générer des anticorps qui ne reconnaissent ni le récepteur β1, ni le récepteur β2.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit peptide, il comprend 405 ammo-acides et présente la séquence en amino-acides de formule II (SEQ ID n° 2) suivante :
Met Ala Pro Trp Pro Pro Gly Asn Ser Ser Leu Thr Pro Trp Pro Asp
1 5 10 15
Ile Pro Thr Leu Ala Pro Asn Thr Ala Asn Ala Ser Gly Leu Pro Gly
20 25 30
Val Pro Trp Ala Val Ala Leu Ala Gly Ala Leu Leu Ala Leu Ala Val
35 → TM1 40 45
Leu Ala Thr Val Gly Gly Asn Leu Leu Val Ile Val Ala Ile Ala Arg
50 55 60 TM1 ←
Thr Pro Arg Leu Gln Thr Met Thr Asn Val Phe Val Thr Ser Leu Ala 65 70 75 → TM2 80
Thr Ala Asp Leu Val Val Gly Leu Leu Val Val Pro Pro Gly Ala Thr
85 90 95
Leu Ala Leu Thr Gly His Trp Pro Leu Gly Val Thr Gly Cys Glu Leu
TM2 ← 100 105 110
→ TM3
Trp Thr Ser Val Asp Val Leu Cys Val Thr Ala Ser Ile Glu Thr Leu
115 120 125
Cys Ala Leu Ala Val Asp Arg Tyr Leu Ala Val Thr Asn Pro Leu Arg
130 TM3← 135 140
Tyr Gly Ala Leu Val Thr Lys Arg Arg Ala Leu Ala Ala Val Val Leu 145 150 155 → TM4 160
Val Trp Val Val Ser Ala Ala Val Ser Phe Ala Pro Ile Met Ser Lys
165 170 175
Trp Trp Arg Ile Gly Ala Asp Ala Glu Ala Gln Arg Cys His Ser Asn
TM4 ← 180 185 190
Pro Arg Cys Cys Thr Phe Ala Ser Asn Met Pro Tyr Ala Leu Leu Ser
195 200 →TM5 205
Ser Ser Val Ser Phe Tyr Leu Pro Leu Leu Val Met Leu Phe Val Tyr
210 215 220
Ala Arg Val Phe Val Val Ala Thr Arg Gln Leu Arg Leu Leu Arg Arg 225 TM5← 230 235 240
Glu Leu Gly Arg Phe Pro Pro Glu Glu Ser Pro Pro Ala Pro Ser Arg
245 250 255
Ser Gly Ser Pro Gly Leu Ala Gly Pro Cys Ala Ser Pro Ala Gly Val
260 265 270
Pro Ser Tyr Gly Arg Arg Pro Ala Arg Leu Leu Pro Leu Arg Glu His
275 280 285 Arg Ala Leu Arg Thr Leu Gly Leu Ile Met Gly Thr Phe Thr Leu Cys 290 →TM6 295 300
Trp Leu Pro Phe Phe Val Val Asn Val Val Arg Ala Leu Gly Gly Pro 305 310 TM6← 315 320
Ser Leu Val Ser Gly Pro Thr Phe Leu Ala Leu Asn Trp Leu Gly Tyr
→TM7 325 330 335
Ala Asn Ser Ala Phe Asn Pro Leu Ile Tyr Cys Arg Ser Pro Asp Phe
340 345 TM7← 350
Arg Ser Ala Phe Arg Arg Leu Leu Cys Arg Cys Arg Pro Glu Glu His
355 360 365
Leu Ala Ala Ala Ser Pro Pro Arg Ala Pro Ser Gly Ala Pro Thr Ala
370 375 380
Leu Thr Ser Pro Ala Gly Pro Met Gln Pro Pro Glu Leu Asp Gly Ala
385 390 395 400
Ser Cys Gly Leu Ser
405
(II)
Ce peptide est dénommé ci-après récepteur β3-adrénergique bovin (RA-Boβ3).
L'invention comprend également les peptides variants de ceux définis ci-dessus, qui comportent certaines mutations, sans que les peptides ne perdent les propriétés de récepteur β3-adrénergique.
Parmi ces variants, on peut mentionner ceux qui sont reconnus par des anticorps reconnaissant les régions transmembranaires, ainsi que ceux qui sont reconnus par des anticorps reconnaissant les régions autres que les régions transmembranaires.
La présente invention a également pour objet des fragments ou des combinaisons de fragments du RA-Boβ3, conforme à l'invention, et notamment :
- un fragment de 26 amino-acides, correspondant au segment 38-63 de la formule II et constituant la région transmembranaire TM1,
- un fragment de 24 amino-acides, correspondant au segment 76-99 de la formule II et constituant la région transmembranaire TM2, - un fragment de 22 amino-acides, correspondant au segment 110-131 de la formule II et constituant la région transmembranaire TM3,
- un fragment de 23 amino-acides, correspondant au segment 156-178 de la formule II et constituant la région transmembranaire TM4,
- un fragment de 24 amino-acides, correspondant au segment 203-226 de la formule II et constituant la région transmembranaire TM5,
- un fragment de 22 amino-acides, correspondant au segment 293-314 de la formule II et constituant la région transmembranaire TM6,
- un fragment de 26 amino-acides, correspondant au segment 322-347 de la formule II et constituant la région transmembranaire TM7.
Lesdits fragments peuvent avantageusement être obtenus par synthèse, notamment par la méthode de Merrifield.
La présente invention a également pour objet un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique conforme à l'invention.
On entend, au sens de la présente invention, par vecteur recombinant, aussi bien un plasmide, un cosmide, qu'un phage.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit vecteur, il est constitué par un vecteur recombinant approprié, comprenant en particulier une origine de réplication dans un microorganisme hôte approprié, notamment une bactérie ou une cellule eucaryote, au moins un gène dont l'expression permet la sélection soit des bactéries, soit des cellules eucaryotes ayant reçues ledit vecteur, une séquence régulatrice appropriée, notamment un promoteur permettant l'expression des gènes dans lesdites bactéries ou cellules eucaryotes, et dans lequel est insérée une séquence nucléotidique ou un fragment de séquence tels que définis ci-dessus, lequel vecteur est un vecteur d'expression d'un peptide, d'un fragment de peptide ou d'une combinaison de fragments de peptide ayant une activité de récepteur β3 adrénergique bovin.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit vecteur est constitué d'un vecteur d'expression pRc/CMV dans lequel est inséré, au niveau du lieur multisite, au moins le fragment codant pour le récepteur β3-adrénergique bovin ; un tel plasmide a été dénommé pRc/CMV-Boβ3-ADR, et a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) tenue par l' INSTITUT PASTEUR, en date du 15 avril 1993 sous le n° I-1297.
La présente invention a également pour objet une cellule hôte appropriée, obtenue par transformation génétique, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur d'expression conforme à l'invention.
Une telle cellule est capable d'exprimer un peptide, d'origine bovine, ayant une activité de récepteur β3-adrénergique.
Selon un mode de réalisation avantageux, la cellule hôte est notamment constituée par les cellules de la lignée CHO (Chinese Hamster Ovary).
Un autre des microorganismes utilisés peut être constitué par une bactérie, notamment Escherichia coli .
Il n'était pas évident que les bovins aient des récepteurs β3-adrénergiques, dont l'activation permet, de manière inattendue, de réguler la quantité et la qualité des graisses, ce qui permet d'améliorer la qualité de la viande bovine.
De manière avantageuse, les récepteurs β3-adrénergiques bovins conformes à l'invention constituent un outil pour la sélection de ligands intervenant dans l'activation de ces récepteurs et permettent d'identifier et de sélectionner des ligands β-adrénergiques spécifiques des récepteurs β3-adrénergiques et en particulier des ligands plus affins et plus sélectifs pour le récepteur β3-adrénergique bovin que pour le récepteur β3-adrénergique humain.
Conformément à l'invention, le procédé de sélection et d'identification de substances capables de se comporter comme ligand spécifique vis-à-vis d'un peptide (récepteur β3-adrénergique bovin) conforme à l'invention comprend :
- la mise en contact de ladite substance avec une cellule hôte préalablement transformée par un vecteur d'expression tel que défini ci-dessus, laquelle cellule hôte exprime ledit peptide bovin (récepteur adrénergique β3 bovin), le cas échéant après induction physique ou chimique appropriée, et laquelle mise en contact est réalisée dans des conditions permettant la formation d'une liaison entre l'un au moins des sites spécifiques et ladite substance s'il y a lieu, et
- la détection de la formation éventuelle d'un complexe du type ligand-peptide.
Un tel procédé permet la sélection, soit de ligands spécifiques du récepteur β3-adrénergique, soit de ligands spécifiques du récepteur β3-adrénergique bovin exclusivement.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, avec référence aux dessins annexés dans lesquels :
- la figure 1a représente la carte de restriction du fragment codant de 2 000 pb, qui correspond à la formule I ;
- la figure 1b représente la carte de restriction du clone 6.6 qui contient le gène β3-adrénergique bovin et comprend 3 kb, en tout ;
- la figure 2 est une comparaison des récepteurs β3 humain, murin (souris et rat) et bovin ; - la figure 3 représente une comparaison des séquences codantes pour le RA-Huβ3 et le RA-β3 bovin ;
- la figure 4 représente le vecteur d'expression pRc/CMV-Boβ3-ADR ;
- la figure 5 représente le vecteur d'expression pRc/CMV incluant un lieur multisite comprenant les sites uniques de restriction suivants : Hind III, BstX I, Not I, Xba I et Apa I.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 : Isolement et identification du gène β3-adrénergique bovin.
- Préparation d'ARN :
Le gène β3-adrénergique bovin a été isolé à partir d'une banque d'ADNc de tissu adipeux brun de veau, construite dans le bactériophage λgt11.
Pour ce faire, les ARN totaux sont extraits de tissu adipeux brun de veau, par la méthode utilisant le thiocyanate de guanidinium, puis on purifie les ARN messagers poly A+ à l'aide de colonnes oligo(dT) (Pharmacia réf. : 27-9258-01).
Les ARN totaux et les ARN messagers ont été analysés en Northern blot pour vérifier la présence et la taille des messagers du gène recherché. Après électrophorèse, l'ARN a été transféré sur une membrane de nylon chargée positivement (Amersham Hybond® N+ réf. RPN 203B). Cette membrane est ensuite hybridée avec une sonde radiomarquée (radiomarquage voir criblage des phages recombinants, ci-après), constituée par un fragment d'ADN de 2900 paires de bases contenant la totalité du gène β3-adrénergique murin précédemment isolé dans le laboratoire (NAHMIAS et al., 1991, EMBO J., 10, 3721-3727 ; Demande Internationale WO 92/12246). Après hybridation avec la sonde radiomarquée, les filtres sont lavés et exposés pen dant plusieurs jours sur film d'autoradiographie (KODAK X-OMAT AR), on observe un fragment d'environ 2,0 kilobases, aussi bien dans la fraction d'ARN totaux que dans la fraction des ARN messagers purifiés. Ceci confirme que le gène correspondant au récepteur β3-adrénergique est exprimé dans le tissu adipeux brun de veau et que l'on peut construire la banque d'ADNc à partir de ces ARN messagers poly A+ purifiés.
Pour vérifier que la source d'ARN est bien du tissu adipeux brun, le Northern blot obtenu ci-dessus a été hybride avec une sonde radiomarquée correspondant au gène de la protéine découplante humaine (hUCP). Cette protéine est seulement présente dans ce type de tissu adipeux, et peut être considérée comme une sorte de "marqueur" du tissu adipeux brun. Avec cette sonde, un signal fortement positif est décelé.
- Synthèse d'ADNc :
On synthétise ensuite 1 ΑDNc correspondant, en prenant comme matrice les ARN messagers poly A+ purifiés, et comme amorce pour la synthèse du premier brin un primer oligo (dT)15 provenant du kit "RiboClone cDNA synthesis System" (Promega réf. C 2100). La synthèse du premier brin d'ADNc se fait en présence d'AMV réverse transcriptase, et la synthèse du deuxième brin est réalisée à l'aide de deux enzymes agissant simultanément ( E. coli polymérase I et E. coli RNase H). Ensuite l'ADNc double brin est traité par la T4 DNA polymérase, afin d'obtenir des bouts francs. Le kit Promega C 2100 est utilisé pour l'ensemble de ces réactions.
Ensuite, des adaptateurs comportant des sites
EcoRI sont ajoutés, afin de pouvoir insérer l'ADNc obtenu dans le bactériophage λgtll, dans les conditions suivantes, décrites dans le kit EcoR I Adaptor Ligation System I (Promega, réf.: C 1900) :
l'ADNc est centrifugé à travers une matrice
Sephacryl® S-400 (kit) pour éliminer les molécules de pe tite taille ; puis les adaptateurs sont ajoutés à l'ADNc par ligature, en présence de T4 ADN ligase, pendant une nuit et une deuxième centrifugation est effectuée à travers une colonne Sephacryl® S-400, de manière à éliminer les adaptateurs non fixés.
Avant d'insérer l'ADNc ainsi traité dans le vecteur λgt11, on phosphoryle les adaptateurs, en présence de T4 polynucléotide kinase.
- Insertion de l'ADNc dans le bactériophaσe λgt11 :
Le bactériophage λgt11, utilisé comme vecteur, provient du kit "Protoclone Lambda gt11 System" (Promega réf. T 301/0-2). L'ADN du phage est digéré par EcoRI et déphosphorylé. La déphosphorylation empêche le vecteur de se refermer sur lui-même.
On effectue plusieurs ligations avec des quantités variables de l'ADNc obtenu, avec 0,5 μg d'ADN de vecteur, dans les conditions suivantes, pour chaque ligation : pendant 3 heures à température ambiante, en présence de T4 ADN ligase (kit Promega C1900).
On procède ensuite à une encapsidation in vi tro, à l'aide des extraits "Packagene" présents dans le kit Promega T301/0-2.
Après une incubation à 22ºC, durant 2 heures, les particules de phages reconstituées sont utilisées pour infecter des bactéries, notamment la souche Y1090(r-)
(Génotype : Δ(lacU169), proA+, Δ(lon), araD139, strA, supF, (trpC22: :Tn10), (pMC9), hsd(r-, m+)), dans les conditions suivantes : on dilue très fortement (1/1 000 ou 1/10 000) les phages encapsidés ; chaque dilution de phages est incubée avec des cellules Y1090(r-) à 37ºC, durant 30 minutes, et ensuite, ces bactéries infectées sont étalées sur un milieu nutritif (LB agar) contenu dans des boîtes de Pétri. Les boîtes sont incubées une nuit à 37ºC, et le lendemain, on observe des plages de lyse, chaque plage correspond à un phage recombinant. En comp tant les nombres de plages de lyse et en multipliant avec le facteur de dilution donné, le titre de la banque d'ADNc est déterminé et est d'environ 4 millions de phages recombinants. Le bruit de fond du vecteur seul sans insert est de 3,5 %, ce qui est tout à fait acceptable.
- Criblage des phages recombinants :
En se basant sur les résultats obtenus, environ 200 000 phages ont été étalés sur boîte de Pétri (milieu LB agar), afin de pouvoir les cribler avec une sonde radiomarquée, dans les conditions suivantes :
souche bactérienne utilisée : LE 392 (Génotype : F-, hsdR 574 (r-, m+), supE44, supF58, lacY1 or Δ(lac1ZY)6, galk2, galT22, metB1, trpR55, λ-).
- sonde : fragment d'ADN de 2900 paires de bases (gène β3-adrénergique murin), tel que précisé cidessus pour le Northern Blot, radiomarqué par Random priming (Kit Boehringer réf. 1004 760), en incorporant 50 μCi de dATP (α32P) et 50 μCi de dCTP (α32P) (références Amersham : PB 10204 et PB 10205).
Après transfert de l'ADN des plages de lyse sur des membranes Hybond® N+ (Amersham réf. RPN 132B), ces dernières sont hybridées avec la sonde radiomarquée, puis lavées et exposées une nuit sur film d'autoradiographie.
17 signaux d'hybridation ont été observés, dont 11 se sont, par la suite, révélés être des faux positifs. Les 6 clones restant (1, 3, 5, 6, 8 et 9) ont été purifiés par quatre isolements successifs, suivis d'une hybridation avec la sonde β3-adrénergique murine décrite ci-dessus.
- Analyse des clones positifs :
Pour identifier le (s) clone (s) contenant lé gène β3-adrénergique bovin en entier, c'est-à-dire l'ADNc correspondant à la région codante pour toute la protéine, 2 méthodes ont été utilisées : l'amplification par PCR et la coupure par une endonucléase de restriction, avec le but de trouver parmi les clones positifs celui qui comporte l'insert le plus grand.
1) L'amplification par PCR a été faite sur lysat de phages (particules de phages encapsidées) à l'aide des deux amorces suivantes :
1218 : amorce λgt11 (brin sens) de 24 mers, de formule : 5' d(GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG) 3 ' , et
1222 : amorce λgt11 (brin anti-sens) de 24 mers également, de formule : 5' d(TTGACACCAGACCAACTGGTAATG) 3 ' (New England Biolabs).
Etant donné que ces amorces s'hybrident de part et d'autre du site d'insertion de l'ADNc dans le phage, il a été possible de connaître ainsi la taille des fragments insérés dans les différents clones positifs.
2) L'ADN des 6 phages intéressants a été préparé et coupé par l'enzyme de restriction EcoRI, afin de vérifier la taille des inserts ; l'hybridation avec la sonde β3-adrénergique murine a permis de déceler le clone comportant le plus grand insert positif.
Issu de ces deux approches, le clone nº 6 a été choisi pour une analyse plus poussée étant donnée qu'il comporte le plus grand insert d'ADNc recherché (3 kilobases).
Après coupure du phage λ par l'enzyme de restriction EcoR I, le fragment comportant l'ADNc a été inséré dans le bactériophage M13 tg 131 afin de pouvoir séquencer le gène.
EXEMPLE 2 : Séquençage du gène β3-adrénergique bovin.
On a séquence le fragment d'ADN d'environ 3 kb délimité par les sites de l'enzyme EcoR I.
Ce fragment d'ADN a été purifié à partir de l'ADN du clone 6 et sous-cloné dans le site EcoR I du vecteur M13tg131. Les clones M13 ayant intégrés le fragment d'ADN dans les 2 orientations opposées (6.3 et 6.6) ont été identifiés et séquencés. Pour effectuer les réactions de séquençage, le kit USB Sequenase Version 2.0 (United States Biochemical réf.: 70770) a été utilisé.
La séquence a été réalisée en utilisant des amorces spécifiques, qui s'hybrident sur le brin sens
(clone M13-6.6) ou sur le brin anti-sens (clone M13-6.3), conformément à la méthode de Sanger (MANIATIS et al.,
Molecular Cloning, 2ème édition, pages 13.3-13.10).
Les résultats obtenus, à partir de la séquence du fragment EcoR I de 3 kilobases, montrent la séquence nucléotidique du RAβ3 bovin (1215 pb) et des régions non codantes (106 pb en 5' et 638 pb en 3') (formule I). Les sites de restriction contenus dans le fragment de 2 000 pb sont positionnés sur la figure la (bov 6.6 court (pA)).
La figure 1b montre les sites de restriction uniques contenus dans le fragment de 3 kb qui a été séquence.
La comparaison des régions codantes des gènes β3 humain et bovin (figure 3), indique une forte homologie (85 % au niveau des séquences nucléotidiques entre RA bovin et humain) ; la comparaison des régions codants des gènes β3 bovin et murin montre également une forte homologie (76 % au niveau des séquences nucléotidiques entre RA bovin et RA murin).
Le gène β3 bovin code pour le peptide de
405 aminoacides, qui présente une très grande homologie avec le peptide β3 humain ou le peptide β3 murin (figure 2), comme indiqué plus haut.
EXEMPLE 3 : Construction d'un vecteur pour l'expression du RA-β3 bovin.
La carte de restriction du fragment de 2 kb qui a été séquence (figure 1a) indique la présence d'un site de coupure par l'enzyme Srf I à la position 1598, soit 270 nucléotides en aval de la région codante du gène β3 de boeuf. L'ADN du clone M13-6.6 a été digéré avec les enzymes EcoR I et Srf I pour libérer le fragment de 1598 paires de bases contenant la région codante du gène β3 bovin et une partie de la région 3' non traduite. Ce fragment d'ADN a été purifié, puis inséré dans le vecteur d'expression pRc/CMV, aux sites de coupure Hind III et Xba I (figure 5).
Comme les extrémités générées par les enzymes Hind III et Xba I d'une part et EcoR I et Srf I d'autre part, ne sont pas compatibles, on a pris soin de traiter les extrémités EcoR I et Srf I de l' insert d'une part avec le fragment Klenow de la polymérase I, et les extrémités Hind III et Xba I du vecteur d'autre part, avec le fragment Klenow de la polymérase I, de façon à obtenir des bouts francs (MANIATIS et al., Molecular Cloning, 2ème édition, pages 5.40-5.42).
On a ainsi obtenu le plasmide recombinant pRc/CMV-Boβ3-ADR, représenté sur la figure 4.
EXEMPLE 4 : Propriétés pharmacologiques du produit d'expression du gène β3 bovin.
a) Transfection de cellules CHO-K1 Pour mieux caractériser le récepteur adrénergique β3 bovin, on exprime le gène β3 bovin à la surface de cellules eucaryotes, qui possèdent tous les éléments nécessaires à la transduction du signal.
Le plasmide recombinant pRc/CMV de l'exemple 3 a été transfecte dans des cellules CHO-K1 par une méthode de transfection à la lypofectine ; les cellules transfectées sont sélectionnées avec de la généticine (G418) (dérivé de la néomycine).
De manière plus précise, ladite méthode de transfection est réalisée comme suit :
Les cellules CHO-K1 (ATCC CCL 61) sont cultivées à confluence dans un milieu de culture contenant : du milieu DMEM à 45 %, du milieu F12-Ham à 45 %, du sérum de veau foetal inactivé à la chaleur à 10 %, de la glutamine 2 mM, de la pénicilline 100 U/ml et de la streptomycine 100 μg/ml. 1 μg d'ADN du plasmide pRc/CMV β3 bovin est mélangé avec 5 μl de lipofectine (GIBCO) et 1 000 μl du milieu de culture précité, dépourvu de sérum.
On ajoute ce mélange à des cellules en culture, que l'on laisse incuber à 37ºC, pendant 5 heures.
Le milieu est remplacé avec un milieu de culture précité, contenant du sérum et les cellules sont à nouveau incubées à 37°C, pendant 48 heures. Les cellules sont alors réparties dans 96 puits selon des dilutions variables et incubées en présence de généticine (G418, Gibco) à 400 μg/ml, dans un milieu complet, pendant environ 10 jours, le milieu étant changé tous les deux jours.
Les différentes colonies obtenues sont ensuite sous-clonées, d'abord dans 48 puits, puis dans 6 puits, avant le criblage.
Les colonies stables sont criblées pour leur capacité à lier de manière spécifique l'[125I]-cyanopindolol et également pour leur capacité à stimuler l'adénylate cyclase, en présence d'isoprotérénol, conformément au protocole décrit dans TATE et al., Eur. J.
Biochem., 1991, 196, 357-361.
Les cellules transfectées et exprimant de façon stable le RAβ3, lient le [125I]-cyanopindolol, avec une affinité équivalente à celle des RAβ3 correspondants chez l'Homme ou chez la Souris, également obtenus par clonage.
On a sélectionné, à partir des clones stables, un ensemble de sous-clones ; l'un d'entre eux, dénommé 62-26, a été utilisé pour l'évaluation pharmacologique du RAβ3 bovin.
b) Caractéristiques pharmacologiques du récepteur RAβ3 bovin
La caractérisation pharmacologique du récepteur RAβ3 bovin a été réalisée en utilisant le clone stable 62-26. Les propriétés pharmacologiques de 10 ligands β3-adrénergiques ont été déterminées par des études de stimulation de l'adénylate cyclase et de liaison du [125I]-cyanopindolol.
Les expériences d'activation de l'adénylate cyclase ont été réalisées suivant le protocole détaillé dans BLIN et al., Mol. Pharmacol., 1991, 44, 1094-1104.
Brièvement, les cellules préconfluentes en plaques six puits (0,6 × 106 cellules/puits) sont mises en présence, ou non, de doses croissantes de ligands pendant 30 minutes à 37ºC. La réaction est arrêtée par lavage en PBS à 4ºC et addition de 500 μl de NaOH 1N. Après centrifugation et neutralisation avec de l'acide acétique 1N, les lysats cellulaires sont récupérés et la quantité totale d'AMPc accumulé est déterminée à l'aide d'un kit de dosage commercial.
L'étude de la liaison des ligands en compétition a été réalisée sur cellules intactes suivant le protocole détaillé dans BLIN et al., Mol. Pharmacol., 1991, 44, 1094-1104. Brièvement, 105 cellules sont incubées avec 0,5 nM d' [125I]-cyanopindolol en présence ou en absence de concentrations croissantes de compétiteurs, pendant 30 minutes à 37ºC. La réaction est stoppée par dilution avec du PBS glacé, les cellules sont filtrées et la radioactivité est mesurée dans un compteur gamma. Les résultats ont été analysés en utilisant le logiciel Graph-Pad©.
Parmi les ligands testés, quatre sont décrits comme agonistes des récepteurs β1, β2, β3-RA :
(-) isoprotérénol, (-) épinéphrine, (-)norépinéphrine, BRL
37344 ; trois sont décrits comme spécifiques du récepteur
RAβ3 (β1-, β2-RA antagonistes) : CGP12177A, ICI201651, bucindolol. Le bupranolol a été également testé car décrit comme antagoniste des trois sous types de récepteur (BLIN et al., Br. J. Pharmacol., 1994, sous presse). Enfin, on a testé le (-)propranolol décrit comme agoniste partiel du récepteur RAβ3 humain et antagoniste du récepteur RAβ3 de souris (NAHMIAS et al., EMBO J., 1991, 10, 3721-3727). Les valeurs des constantes d'activation de l'adénylate cyclase (Kact), des constantes d'inhibition
(Ki) et de l'activité intrinsèque (AI) correspondant au rapport effet du ligand à 10-4 M/effet de l'isoprotérénol à 10-4 M, obtenus pour les différents ligands sont présentés dans le Tableau ci-après. Les quatres ligands agonistes des trois sous types de récepteurs (β1, β2, β3- RA) ont des valeurs de Kact et de Ki voisines de celles obtenues pour le récepteur RAβ3 humain (BLIN et al., Br. J. Pharmacol., 1994, sous presse), de souris (NAHMIAS etal., EMBO J., 1991, 10, 3721-3727), et de rat (GRANNEMAN et al., J. Pharmacol. Exp. Therap., 1991, 40, 895-899 ;
MUZZIN et al., J. Biol. Chem., 1991, 266 , 24053-24058).
Les ligands spécifiques du récepteur RAβ3 ont tous une valeur de Kact plus faible pour le récepteur RAβ3 bovin comparée aux récepteurs RAβ3 humain, de souris, et donc une meilleure efficacité à stimuler l'adénylate cyclase. Le (-)propranolol est agoniste partiel sur RAβ3 bovin comme pour le récepteur RAβ3 humain. Par contre, le bupranolol, qui est décrit comme un antagoniste puissant pour les récepteurs RAβ3 humain et murin, est agoniste partiel sur le récepteur RAβ3 bovin.
Figure imgf000026_0001
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention.
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: VETIGEN
(B) RUE: 66 rue de Javel
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75015
(A) NOM: VIRBAC
(B) RUE: 1ere Avenue - 2065 M - L.I.D.
(C) VILLE: CARROS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 06516
(ii) TITRE DE L' INVENTION: SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES CODANT POUR LE
RECEPTEUR BETA3 -ADRENERGIQUE BOVIN ET LEURS APPLICATIONS.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 2
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB)
(vi) DONNEES DE LA DEMANDE ANTERIEURE:
(A) NUMERO DE DEPOT: FR 93 04670
(B) DATE DE DEPOT: 21-APR-1993
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 2000 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 107..1324
(D) AUTRES RENSEIGNEMENTS: /function= "Bovin beta-3 receptor" /product= "Adrenergic, Beta Receptor"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
CCCAGGCCAG GGAAATCGCT CCCACGCCCC GATGCCCCCG CCGCTGAGCA GGGTGAGCTG 60
GGAGACCCTT TCCCTCATTC CTTCCCGCCC CACGCGCGAC GCGGGG ATG GCT CCG 115
Met Ala Pro
1
TGG CCT CCT GGG AAC AGC TCT CTG ACC CCG TGG CCA GAT ATC CCC ACC 163 Trp Pro Pro Gly Asn Ser Ser Leu Thr Pro Trp Pro Asp Ile Pro Thr
5 10 15
CTG GCA CCC AAT ACT GCC AAC GCG AGT GGG CTG CCA GGG GTG CCC TGG 211 Leu Ala Pro Asn Thr Ala Asn Ala Ser Gly Leu Pro Gly Val Pro Trp
20 25 30 35
GCG GTG GCG CTG GCG GGG GCG CTG TTG GCG CTA GCG GTG CTG GCC ACC 259 Ala Val Ala Leu Ala Gly Ala Leu Leu Ala Leu Ala Val Leu Ala Thr 40 45 50
GTG GGA GGC AAC CTG CTG GTA ATC GTG GCC ATC GCC CGG ACG CCG AGA 307 Val Gly Gly Asn Leu Leu Val Ile Val Ala Ile Ala Arg Thr Pro Arg
55 60 65
CTC CAG ACC ATG ACC AAC GTG TTC GTG ACT TCG CTG GCC ACA GCC GAC 355 Leu Gln Thr Met Thr Asn Val Phe Val Thr Ser Leu Ala Thr Ala Asp
70 75 80
CTG GTG GTG GGG CTC CTG GTC GTG CCC CCG GGG GCC ACG TTG GCG CTG 403 Leu Val Val Gly Leu Leu Val Val Pro Pro Gly Ala Thr Leu Ala Leu
85 90 95
ACC GGC CAC TGG CCC CTG GGC GTC ACC GGT TGC GAG CTG TGG ACC TCA 451 Thr Gly His Trp Pro Leu Gly Val Thr Gly Cys Glu Leu Trp Thr Ser
100 105 110 115
GTG GAC GTG CTG TGT GTG ACC GCC AGC ATC GAA ACC CTG TGC GCC CTG 499 Val Asp Val Leu Cys Val Thr Ala Ser Ile Glu Thr Leu Cys Ala Leu
120 125 130
GCG GTG GAC CGC TAC CTG GCC GTG ACC AAC CCG CTG CGC TAC GGC GCG 547 Ala Val Asp Arg Tyr Leu Ala Val Thr Asn Pro Leu Arg Tyr Gly Ala
135 140 145
CTG GTC ACC AAA CGC CGC GCC CTA GCA GCC GTG GTC CTG GTG TGG GTG 595 Leu Val Thr Lys Arg Arg Ala Leu Ala Ala Val Val Leu Val Trp Val
150 155 160
GTG TCC GCC GCG GTG TCG TTT GCG CCC ATC ATG AGC AAA TGG TGG CGC 643 Val Ser Ala Ala Val Ser Phe Ala Pro Ile Met Ser Lvs Trp Trp Arg
165 170 175
ATC GGG GCC GAT GCC GAG GCG CAG C3T TGC CAC TCC AAC CCG CGC TGC 691 Ile Gly Ala Asp Ala Glu Ala Gln Arg Cys His Ser Asn Pro Arg Cys
180 135 190 195
TGC ACC TTC GCC TCC AAC ATG CCC TAC GCG CTG CTC TCC TCC TCG GTC 739 Cys Thr Phe Ala Ser Asn Met Pro Tyr Ala Leu Leu Ser Ser Ser Val
200 205 210
TCG TTC TAT CTT CCG CTC CTG GTG ATG CTC TTC GTC TAC GCA CGA GTT 787 Ser Phe Tyr Leu Pro Leu Leu Val Met Leu Phe Val Tyr Ala Arg Val
215 220 225
TTC GTG GTG GCC ACG CGC CAG CTG CGC TTG CTG CGC CGG GAG CTG GGT 835 Phe Val Val Ala Thr Arσ Gln Leu Arg Leu Leu Arg Arg Glu Leu Gly
230 235 240
CGC TTC CCG CCA GAG GAG TCT CCG CCG GCT CCT TCT CGC TCC GGA TCC 883 Arg Phe Pro Pro Glu Glu Ser Pro Pro Ala Pro Ser Arg Ser Gly Ser
245 250 255
CCT GGC CTG GCG GGG CCG TGC GCC TCG CCC GCG GGG GTG CCC TCC TAC 931 Pro Gly Leu Ala Gly Pro Cys Ala Ser Pro Ala Gly Val Pro Ser Tyr
260 265 270 275
GGC CGG CGG CCG GCG CGC CTT CTG CCT CTG CGG GAA CAC CGC GCC CTG 979 Gly Arg Arg Pro Ala Arg Leu Leu Pro Leu Arg Glu His Arg Ala Leu
280 285 290
CGC ACC TTG GGG CTC ATC ATG GGA ACC TTC ACT CTC TGC TGG TTG CCT 1027 Arg Thr Leu Gly Leu Ile Met Gly Thr Phe Thr Leu Cys Trp Leu Pro
295 300 305
TTC TTT GTG GTC AAC GTG GTG CGC GCC CTC GGG GGC CCC TCT CTG GTG 1075 Phe Phe Val Val Asn Val Val Arg Ala Leu Gly Gly Pro Ser Leu Val
310 315 320 TCC GGC CCC ACT TTC CTC GCC CTT AAC TGG CTG GGC TAT GCC AAC TCT 1123 Ser Gly Pro Thr Phe Leu Ala Leu Asn Trp Leu Gly Tyr Ala Asn Ser
325 330 335
GCC TTC AAC CCG CTC ATC TAC TGC CGC AGC CCG GAC TTT CGG AGC GCC 1171 Ala Phe Asn Pro Leu Ile Tyr Cys Arg Ser Pro Asp Phe Arg Ser Ala
340 345 350 355
TTC CGC CGC CTG CTG TGT CGC TGC CGG CCG GAG GAG CAC CTC GCC GCT 1219 Phe Arg Arg Leu Leu Cys Arg Cys Arg Pro Glu Glu His Leu Ala Ala
360 365 370
GCC TCC CCG CCC CGA GCC CCC TCC GGC GCC CCC ACG GCC CTG ACC AGC 1267 Ala Ser Pro Pro Arg Ala Pro Ser Gly Ala Pro Thr Ala Leu Thr Ser
375 380 385
CCC GCT GGC CCC ATG CAG CCC CCA GAG CTC GAC GGG GCT TCC TGC GGA 1315 Pro Ala Gly Pro Met Gln Pro Pro Glu Leu Asp Gly Ala Ser Cys Gly
390 395 400
CTT TCT TAGGCCTTGA AGAAACAACT CCATTGATCC GGAACCTTTG GAAAGCCTCT 1371 Leu Ser
405
GGCCGGCCTC GGTTCAGAAT GAGCCCCGTG GAGTTTCCCA GCTGGAAAAC TCTGCCCTCC 1431
CCAGCCTGAC GACTGGGTCC TGGGAGGAGG CGCGGGGGCT GACTGGGGAG GGGAAATCCT 1491
TACCAAGTGG GTTTTCGCTC TCTTTCTGAG AGAAGTTTTC TACACCCCAG CCCTGAACTT 1551
CACCGCTGCC TCAGCAGCTC CCGCGTCTGG TTTCCCATGC CCAGGTGCCC GGGCAGGAGC 1611
TGGGCTGCGT TTAGCCCCGG GACCCGCACC TGTCCCACTC GGGTGCTGTG TGCGCAGGGG 1671
CAAGGCGGGC ACCTTCATTC TGTTCCTTCT GCCGCCCAGA CCCTGAGGAA CCCACCGGGG 1731
TGCTGGAGGC CCAGGCTGAG AAGAGGAAGG TGGGGAAGGT CACGGTTTGG GCTTCTGTCC 1791
CTGGCTTCCT CACTGTAGAC ACACCTACCT CACAGCATTT TCAGGACTTT ACTTTAGCCT 1851
TTGGGGTGGG GGTGGGGGGG CGCTCCTGGT TTCCTGGGAA GGTGAACCAT TAGAATGGGT 1911
CCCTTTTCCT TTTGAAATCA AATTAATAAA TGTTACTGAA TGCAGTTTAA AAAAAAAAAA 1971
AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAA 2000
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 405 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Met Ala Pro Trp Pro Pro Gly Asn Ser Ser Leu Thr Pro Trp Pro Asp
1 5 10 15
Ile Pro Thr Leu Ala Pro Asn Thr Ala Asn Ala Ser Gly Leu Pro Gly
20 25 30
Val Pro Trp Ala Val Ala Leu Ala Gly Ala Leu Leu Ala Leu Ala Val
35 40 45
Leu Ala Thr Val Gly Gly Asn Leu Leu Val Ile Val Ala Ile Ala Arg
50 55 60 Thr Pro Arg Leu Gln Thr Met Thr Asn Val Phe Val Thr Ser Leu Ala 65 70 75 80
Thr Ala Asp Leu Val Val Gly Leu Leu Val Val Pro Pro Gly Ala Thr
85 90 95
Leu Ala Leu Thr Gly His Trp Pro Leu Gly Val Thr Gly Cys Glu Leu
100 105 110
Trp Thr Ser Val Asp Val Leu Cys Val Thr Ala Ser Ile Glu Thr Leu
115 120 125
Cys Ala Leu Ala Val Asp Arg Tyr Leu Ala Val Thr Asn Pro Leu Arg 130 135 140
Tyr Gly Ala Leu Val Thr Lys Arg Arg Ala Leu Ala Ala Val Val Leu 145 150 155 160
Val Trp Val Val Ser Ala Ala Val Ser Phe Ala Pro Ile Met Ser Lys
165 170 175
Trp Trp Arg Ile Gly Ala Asp Ala Glu Ala Gln Arg Cys His Ser Asn
180 185 190
Pro Arg Cys Cys Thr Phe Ala Ser Asn Met Pro Tyr Ala Leu Leu Ser
195 200 205
Ser Ser Val Ser Phe Tyr Leu Pro Leu Leu Val Met Leu Phe Val Tyr 210 215 220
Ala Arg Val Phe Val Val Ala Thr Arg Gln Leu Arg Leu Leu Arg Arg 225 230 235 240
Glu Leu Gly Arg Phe Pro Pro Glu Glu Ser Pro Pro Ala Pro Ser Arg
245 250 255
Ser Gly Ser Pro Gly Leu Ala Gly Pro Cys Ala Ser Pro Ala Gly Val
260 265 270
Pro Ser Tyr Gly Arg Arg Pro Ala Arg Leu Leu Pro Leu Arg Glu His
275 280 285
Arg Ala Leu Arg Thr Leu Gly Leu Ile Met Gly Thr Phe Thr Leu Cys 290 295 300
Trp Leu Pro Phe Phe Val Val Asn Val Val Arg Ala Leu Gly Gly Pro 305 310 315 320
Ser Leu Val Ser Gly Pro Thr Phe Leu Ala Leu Asn Trp Leu Gly Tyr
325 330 335
Ala Asn Ser Ala Phe Asn Pro Leu Ile Tvr Cys Arg Ser Pro Asp Phe
340 345 350
Arg Ser Ala Phe Arg Arg Leu Leu Cys Arg Cys Arg Pro Glu Glu His
355 360 365
Leu Ala Ala Ala Ser Pro Pro Arg Ala Pro Ser Gly Ala Pro Thr Ala 370 375 380
Leu Thr Ser Pro Ala Gly Pro Met Gln Pro Pro Glu Leu Asp Gly Ala 385 390 395 400
Ser Cys Gly Leu Ser
405
Figure imgf000032_0001

Claims

REVENDICATIONS
1°) Séquence nucléotidique, caractérisée en ce qu'elle correspond à l'ADNc du gène bovin codant pour le récepteur adrénergique β3 bovin.
2 ° ) Séquence nucléotidique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence en nucléotides et la séquence déduite en aminoacides SEQ ID n° 1.
3º) Séquence selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle comprend notamment les sites de restriction uniques suivants :
Bpu1102 I, Fok I, EcoR V, Bcg I, Nhe I, BspM I, Afl III, Age I, BstE II, BspH I, Bsg I, Nsp I, Nsp7524 I, NspC I, Sap I, BamH I, BstY I, Asc I, Sty I, Hinc II, Apa I, Bsp120 I, Bbe I, Ehe I, Kas I, Nar I, Ec1136 I, Sac I, Stu I, Fse I, Drd I, Tth111 I, Srf I, Bsu36 I, Sfc I, BstX I, Ase I, Bsm I, Dra I.
4°) Fragment de la séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un segment de 78 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 218-295 de la séquence ID nº 1, lequel fragment code pour la région transmembranaire TM1.
5°) Fragment de la séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un segment de 72 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 332-403 de la séquence ID n° 1, lequel fragment code pour la région transmembranaire TM2.
6°) Fragment de la séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un segment de 66 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 434-499 de la séquence ID nº 1, lequel fragment code pour la région transmembranaire TM3.
7º) Fragment de la séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un segment de 69 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 572-640 de la séquence ID nº 1, lequel fragment code pour la région transmembranaire TM4.
8') Fragment de la séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un segment de 72 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 713-784 de la séquence ID nº 1, lequel fragment code pour la région transmembranaire TM5.
9º) Fragment de la séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un segment de 66 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 983-1048 de la séquence ID nº 1, lequel fragment code pour la région transmembranaire TM6.
10º) Fragment de la séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un segment de 78 paires de bases, qui correspond aux nucléotides 1070-1147 de la séquence ID nº 1, lequel fragment code pour la région transmembranaire TM7.
11') Clones d'ADNc, caractérisés en ce qu'ils comprennent un fragment de séquence codant pour le récepteur β3 bovin (RA-Boβ3), selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.
12º) Clone selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend 2979 paires de bases, inclut la séquence ID nº 1 selon la revendication 2 et comprend les sites de restriction uniques suivants : EcoR V, Bcg I, Nhe I, BstE II, BspH I, Bsg I, Sap I, BamH I, Asc I, Stu I, Fse I, Drd I, Srf I, Sfc I, Ase I, Bsm I, Dra I, Bsp1407 I, Csp6 I, Rsa I, Ssp I, Dra III, Bgl II, Afl II, Spe I, Tfi I, Hpa I, Nde I, EcoN I, BsaB I, Pvu I.
13º) Sondes nucléotidiques, caractérisées en ce qu'elles sont constituées par une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou un fragment de celles-ci, marquées à l'aide d'un marqueur tel qu'un isotope radioactif, une enzyme appropriée bu un fluorochrome et en ce qu'elles s'hybrident avec les séquences nucléotidiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 mais ne s'hybrident pas avec les gènes codant pour les récepteurs β1 et β2 adrénergiques, ni avec l'ARN messager desdits récepteurs β1 et β2 adrénergiques.
14*) Sonde selon la revendication 13, caractérisée en ce que sa séquence est homologue ou complémentaire de celle d'un segment d'au moins 10 pb de la séquence ID nº 1.
15') Peptide et/ou un fragment de peptide, caractérisé en ce qu'il est codé par une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 et en ce qu'il présente une activité de récepteur β3-adrénergique.
16º) Peptide selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comprend 405 amino-acides et présente la séquence en amino-acides SEQ ID nº 2.
17°) Fragment de peptide selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend un fragment de 26 amino-acides, correspondant au segment 38-63 de la séquence ID n° 2 et constituant la région transmembranaire TM1.
18°) Fragment de peptide selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend un fragment de 24 amino-acides, correspondant au segment 76-99 de la séquence ID nº 2 et constituant la région transmembranaire TM2.
19°) Fragment de peptide selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend un fragment de 22 amino-acides, correspondant au segment 110-131 de la séquence ID nº 2 et constituant la région transmembranaire TM3.
20º) Fragment de peptide selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend un fragment de 23 amino-acides, correspondant au segment 156-178 de la séquence ID nº 2 et constituant la région transmembranaire TM4.
21º) Fragment de peptide selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend un fragment de 24 amino-acides, correspondant au segment 203-226 de la séquence ID nº 2 et constituant la région transmembranaire TM5.
22º) Fragment de peptide selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend un fragment de 22 amino-acides, correspondant au segment 293-314 de la séquence ID nº 2 et constituant la région transmembranaire TM6.
23') Fragment de peptide selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend un fragment de 26 amino-acides, correspondant au segment 322-347 de la séquence ID nº 2 et constituant la région transmembranaire TM7.
24') Vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 12.
25º) Vecteur selon la revendication 24, caractérisé en ce qu'il est constitué par un vecteur recombinant approprié, comprenant en particulier une origine de réplication dans un microorganisme hôte approprié, notamment une bactérie ou une cellule eucaryote, au moins un gène dont l'expression permet la sélection soit des bactéries, soit des cellules eucaryotes ayant reçues ledit vecteur, une séquence régulatrice appropriée, notamment un promoteur permettant l'expression des gènes dans lesdites bactéries ou cellules eucaryotes, et dans lequel est insérée une séquence nucléotidique ou un fragment de séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, lequel vecteur est un vecteur d'expression d'un peptide, d'un fragment de peptide ou d'une combinaison de fragments de peptide ayant une activité de récepteur β3 adrénergique bovin.
26') Vecteur selon la revendication 25, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un vecteur d'expression pRc/CMV dans lequel est inséré, au niveau du lieur multisite, au moins le fragment codant pour le récepteur β3-adrénergique bovin, et en ce qu'il a été déposé auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) tenue par l'INSTITUT PASTEUR, en date du 15 avril 1993 sous le nº 1-1297.
27°) Cellule hôte appropriée, obtenue par transformation génétique, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur d'expression selon l'une quelconque des revendications 24 à 26.
28º) Cellule hôte selon la revendication 27, caractérisée en ce qu'elle est constituée par les cellules de la lignée CHO (Chinese Hamster Ovary).
29°) Cellule hôte selon la revendication 27, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une bactérie, notamment Escherichia coli .
30°) Procédé de sélection et d'identification de substances capables de se comporter comme ligand spécifique vis-à-vis d'un peptide (récepteur β3-adrénergique bovin) selon l'une quelconque des revendications 15 à 23, lequel procédé comprend :
- la mise en contact de ladite substance avec une cellule hôte préalablement transformée par un vecteur d'expression selon l'une quelconque des revendications 24 à 26, laquelle cellule hôte exprime ledit peptide bovin (récepteur adrénergique β3 bovin), le cas échéant après induction physique ou chimique appropriée, et laquelle mise en contact est réalisée dans des conditions permettant la formation d'une liaison entre l'un au moins des sites spécifiques et ladite substance s'il y a lieu, et
- la détection de la formation éventuelle d'un complexe du type ligand-peptide.
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