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WO1998036060A1 - Utilisation a des fins de diagnostic et therapeutiques d'un polypeptide a activite de recepteur ob25 exprime par les cellules myelinisantes - Google Patents

Utilisation a des fins de diagnostic et therapeutiques d'un polypeptide a activite de recepteur ob25 exprime par les cellules myelinisantes Download PDF

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WO1998036060A1
WO1998036060A1 PCT/FR1998/000283 FR9800283W WO9836060A1 WO 1998036060 A1 WO1998036060 A1 WO 1998036060A1 FR 9800283 W FR9800283 W FR 9800283W WO 9836060 A1 WO9836060 A1 WO 9836060A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
polypeptide
receptor
myelin
sequence
cells
Prior art date
Application number
PCT/FR1998/000283
Other languages
English (en)
Inventor
Julien Allard
Sonia Barron
Pierre Sokoloff
Jean-Charles Schwartz
Original Assignee
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR9701692A external-priority patent/FR2759374B1/fr
Application filed by Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) filed Critical Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
Publication of WO1998036060A1 publication Critical patent/WO1998036060A1/fr

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70571—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to the use for diagnostic and therapeutic purposes of a polypeptide having a receptor activity expressed in myelinating cells, called the OB25 receptor.
  • the invention relates in particular to the diagnosis of diseases of genetic origin involving myelin-producing cells or to the search for factors of susceptibility to such a disease.
  • the invention also relates to the use of this polypeptide for the development of medicaments intended for the treatment of the abovementioned conditions.
  • the invention also relates to the use of nucleotide probes capable of fixing by hybridization on the sequence or the complementary sequence, the transcript or the genes coding for said polypeptide and intended for the diagnosis and the selection of medicaments usable in the treatment neurological or metabolic diseases, especially for the treatment of myelin diseases, neuromuscular diseases.
  • the invention also relates to the use of monoclonal or polyclonal antibodies, directed against said polypeptide, for the aforementioned purposes.
  • the invention relates to medicaments intended in particular for the treatment of neurological or metabolic disorders mainly affecting myelin-producing cells, in particular multiple sclerosis or gliomas, neuro-muscular diseases, containing a substance having an affinity high for said polypeptide with 0 receptor activity specific for myelinating cells in rats or else substances having activity on cells transfected with a sequence coding for said polypeptide.
  • the diseases of myéhnisation can be acquired following an inflammation or an infection, be of nutritional or toxic origin, secondary to a neuronal affection or even to genetic determinants
  • the ways of treatment known to date for the diseases of myéhnisation are essentially symptomatic (anti-inflammatory)
  • one of the objectives is to obtain stimulation of the synthesis and production of myelin or else the multiplication or differentiation of the cells producing myelin (oligodendrocytes and Schwann cells). of this objective comes up against the fact that there are very few known factors capable of specifically modulating the activity of myelin-producing cells
  • genes involved in the synthesis, coiling or compaction of myelin constitute, obviously, candidate genes in demyelimiting conditions for which a genetic component is evoked or proven, and whose locus remains to be identified.
  • myelin diseases in particular neuromuscular diseases, in using a receptor expressed by myelin producing cells and its natural or synthetic ligands
  • the present invention meets this need by providing useful means for the purposes of diagnosis and treatment of myehnization diseases.
  • the polypeptide having an OB25 receptor activity used according to the invention consists of or comprises all or part of the sequence d amino acid of rat defined in the sequence identifier SEQ ID No. 2 or a homologous sequence containing the site or sites forming part of said peptide sequence whose presence is necessary for the polypeptide to have the same pharmacological characteristics as the OB25 receptor or for it to be recognized by antibodies which also recognize the aforementioned amino acid sequence
  • This homology may be a species homology or a homology corresponding to artificial or spontaneous mutations of a point nature and not modifying the essential properties of the polypeptide and in particular its activity on the OB25 receptor.
  • the polypeptide according to the invention was obtained by screening a DNA library of rat olfactory bulb using nucleotide probes coding for receptors of the family of heptahelical receptors coupled to G proteins.
  • polypeptide according to the invention can be used by being isolated or fixed on supports, in a completely conventional manner, or also by being associated with amino acid sequences unrelated to the OB25 receptor.
  • This sequence has a species homology with the sequences listed in GENBANK under the numbers HSU78192, HSU8081 1, BTU48236, MMU70622 and MMU48235.
  • a portion of the OB25 receptor coding sequence is also homologous (91; 1% nucleotide identity) to a human sequence (Genbank access code HSC1 CG081), obtained by systematic sequencing of complementary DNA (Expressed Sequence Tags ), without the correspondence with a receptor fragment nor, a fortiori, that a function is not attributed to it
  • OB25 is expressed in myelin-producing cells, namely Schwann cells and oligodendrocytes and that its expression during development is consistent with a role in myehnization
  • the inventors have in particular established this localization of the OB25 receptor in humans and in rats. The existence and location of such an expression of the OB25 receptor had so far not been determined
  • the present invention also relates to the nucleic acids constituted by or comprising all or part of the nucleotide sequence coding for the polypeptide according to the invention, as well as the homologous nucleic acids.
  • Nucleic acids according to the invention are in particular nucleic acids comprising or consisting of the sequence SEQ ID No. 1 of the attached list of sequences or fragments thereof
  • nucleic acids according to the invention those consisting of the sequence extending from the nucleotide in position 152 to the nucleotide in position 1243 of the sequence SEQ ID No. 1 appended are particularly interesting
  • the homologous nucleic acids according to the invention may include variations specific to the degeneration of the code as well as localized mutations insofar as the variant nucleic acids hybridize with the probes capable of hybridizing, specifically, with the sequence SEQ ID # 1
  • nucleic acids having a species homology are nucleic acids having a species homology and which are such that they can be identified and cloned by conventional methods through the use of nucleotide probes constituted by or comprising all or part of the sequence SEQ ID No. 1 or of the sequences of Genbank U18405 or HSC1 CG081, HSU78192, HSU80811, BTU48236, MMU70622 and M MU 48235
  • nucleic acids, once cloned can be sequenced in the usual way
  • homologous nucleic acid sequences include in particular the sequences of ovine or human origin constituted by or containing all or part of the sequence Genbank U 18405 or of the sequence HSC1 CG081, HSU78192, HSU80811, BU48236, MMU70622 and
  • nucleic acids according to the invention can be obtained by conventional chemical synthesis of nucleic acid, by replication in vectors which contain them or by any other means, and in particular multiplication by the PCR process from a small amount of acid. nucleic acid according to the invention
  • the invention also relates to the recombinant vectors, which can be used for cloning or for the expression of nucleic acids and containing a nucleic acid according to the invention, such as plasmids, phages or viruses containing the sequence according to the invention, in a non essential site for rephcation
  • the vectors according to the invention may contain, where appropriate, the elements necessary for expression in a cellular host such as promoter, initiation codon, terminator, signal sequence or anchoring sequence or any other element useful for regulation.
  • the invention also relates to cellular hosts transformed by a vector according to the invention and capable of expressing the polypeptide according to the invention so as to present on the membrane surface one or more sites specific for the vector OB25
  • These hosts can be cells in culture such as CHO (Chinese Hamster Ovary), COS or even PC12 or NG 108-15
  • Another subject of the invention is the use of the nucleic acids according to the invention for cloning and then sequencing ovine or human nucleic acid sequences and in particular the genes of the ovine and human receptors having a corresponding activity in sheep or humans to that of the OB25 receptor in rats
  • the determination of these sequences makes it possible, by genetic recombination, to express the ovine or human receptors and to use them for the induction of antibodies and the screening of medicaments for the treatment of neurological or metabolic disorders mainly affecting the cells producing myelin, such as multiple sclerosis or ghomes, or neuromuscular diseases
  • the invention also relates to monoclonal or polyclonal antibodies directed against the OB25 receptor
  • antibodies are obtained by induction from a polypeptide according to the invention, comprising all or part of the sequence given in the appendix, or from any other sequences comprising polypeptide sites sufficiently close to said sequence for the antibodies thus produced. recognize the latter
  • antibodies can be obtained by repeated subcutaneous injections of a mixture of Freund's adjuvant and of a polypeptide according to the invention or of a fragment of this polypeptide fused or coupled with a current protein such as serum albumin, ovalbumin .
  • antibodies according to the invention are useful, for example, for diagnosing by antibody-antigen reaction demonstrated using a standard revelation technique, a proliferation of cells expressing the OB25 receptor or the presence of an endogenous antibody in an autoimmune disease of myelin-producing cells
  • the subject of the invention is the use of nucleotide probes capable of binding by hybridization to the complementary sequence, the transcript or the gene coding for the polypeptide according to the invention, for the diagnosis and the therapy of diseases of myelin-producing cells.
  • the probes consist of part or all of the sequence given in the appendix, or of any other homologous sequences, such that the latter would hybridize with the sequence in the appendix.
  • the probes are used in a conventional manner by being brought into contact, under the usual conditions, with preparations having nucleic acids suspected of having an abnormality They may also be used, for example, to detect a pathological expression of the OB25 receptor by revealing the presence of its messenger RNA
  • the polypeptide and the nucleic acids according to the invention can be used for the diagnosis and the development of medicaments intended for the treatment of myelin disorders in humans as described below.
  • the invention thus provides a method for screening drugs for the treatment of neurological or metabolic conditions primarily affecting myelin-producing cells, such as multiple sclerosis or gliomas, or neuromuscular diseases Screening for a drug may use the capacity of the candidate molecule to behave as a gand with respect to a polypeptide according to the invention
  • the candidate molecule in contacting, in a suitable medium, the candidate molecule with the membranes of a cellular host transformed by a vector comprising an insert coding for a polypeptide according to the invention and capable of expressing said polypeptide. so as to present on the membrane surface one or more specific sites of the OB25 receptor, in such a way that the specific binding of the candidate gand can be evaluated or indirectly estimated, for example by detecting the possible ligand-polypeptide complex
  • This method can also include the measurement of a response induced by the binding with the cell, such as for example the production of cyclic AMP so as to make it possible to differentiate the molecules which behave like agonists or like antagonists
  • a method determining the affinity of the OB25 receptor for determined ligands in which the transformed cell host expressing the corresponding polypeptide is cultivated, after which the cell culture is brought into contact with the determined hgand and checks whether a specific bond is formed between the cell host and the hgand, in particular by radiolocation tests preferably, measuring the rate of production or release of a suitable indicator such as cyclic AMP, or ions intracellular such as calcium, these latest tests allowing to distinguish and define the agonists and their partial character, as well as the antagonists
  • the invention also provides a method for screening for detectable ligands, in particular labeled ligands such as radioactive or fluorescent ligands, in which the specific binding of candidate ligands is measured with the membrane of a cell transformed by a vector comprising a coding insert for a polypeptide according to the invention and capable of expressing said polypeptide so as to express on the membrane surface one or more specific sites of this polypeptide in such a way that the specific binding of the candidate ligand can be evaluated or indirectly estimated
  • the invention therefore relates to a method of identifying tissues or cells expressing spontaneously in their membrane surface the polypeptide according to the invention such that said tissues or cells can be used for the development of drugs or labeled ligands, usable in diseases involving myelin-producing cells
  • the invention also relates to drugs for the treatment neurological conditions or m Etabolic agents mainly affecting myelin producing cells, containing, in a dose intended to be administered, a therapeutically effective amount of an active substance on a polypeptide having an OB25 receptor activity, in a pharmaceutically acceptable vehicle
  • Another subject of the invention is the use of an active substance on a polypeptide having an OB25 receptor activity, for the preparation of a medicament intended for the treatment of neurological conditions or metabolic effects primarily affecting myelin-producing cells, including multiple sclerosis or gliomas, or neuromuscular conditions
  • the invention also relates to a method of treating neurological or metabolic conditions mainly affecting myelin-producing cells, comprising administering to a subject in need of such treatment a therapeutically effective amount of a whole substance on a polypeptide having activity OB25 receiver according to the invention
  • the invention also relates to the use of a nucleic acid encoding the OB25 receptor or of a polypeptide having an OB25 receptor activity, for the preparation of a medicament intended for the treatment of neurological or metabolic disorders mainly affecting cells producing myelin, including multiple sclerosis or gliomas
  • Particularly targeted are disorders involving dysfunction or under-expression of endogenous OB25 receptors in myelin-producing cells.
  • the invention relates more particularly to the use of the OB25 receptor gene for a therapeutic purpose for the treatment of diseases of genetic origin involving myelin-producing cells
  • the invention thus relates to a method of treatment of a disease of genetic origin involving myelin-producing cells, comprising administering to a subject in need of such treatment a therapeutically effective amount of a nucleic acid encoding the OB25 receptor or of a polypeptide having OB25 receptor activity
  • a suitable retroviral vector can be modified to express the normal receptor gene transfected into host cells as described above to produce infectious retroviral particles.
  • retroviral particles can be used to transfect eukaryotic cells in vitro or in vivo, in patients whose OB25 receptor gene is defective
  • the present invention also relates to the use of genetic markers for the diagnosis of a disease of genetic origin involving myelin-producing cells or for investigating the factors of susceptibility to such a disease
  • Polymorphism No. 1 relates to nucleotide No. 1063 in the sequence given in FIG. 1 in the appendix.
  • This base is either a cytosine or a thymidine.
  • the corresponding base No. 1064 in the GenBank reference HSU78192 is a cytosine
  • the corresponding base No. 1052 in the sequence described in document WO96 / 39436 is a cytosine
  • the corresponding base No. 1250 in the sequence described in document WO97 / 00952 is a thymidine
  • Polymorphism No. 2 relates to base No. 1252 in the sequence given in FIG. 1 in the appendix This base is either a guanine or a thymidine
  • This base is either a guanine or a thymidine
  • the corresponding base No. 1694 in the sequence described in document WO96 / 39436 is a thymidine
  • the corresponding base No. 1442 in the sequence described in document WO97 / 00952 is a guanine
  • the mutation concerns nucleotide n ° 627 of the sequence of figure 1 in appendix
  • the thymidine is replaced by a cytosine, which transforms the corresponding amino acid, casethiomne n ° 178 into threonine
  • This sequence variant has never been described in previous documents
  • the genomic DNA can be obtained from patient cells, blood, urine, saliva, a biopsy or any tissue obtained from autopsy
  • Genomic DNA is extracted from tissue according to techniques known in the art, such as phenol-chloroform extraction followed by ethanol precipitation cDNA from illegitimately transcribed RNA can also be used for the determination of polymorphisms and mutation
  • the DNA thus purified or the cDNA is used directly or after amplification by PCR of the DNA fragments containing the mutation and the polymorphisms
  • sequences on which the polymorphisms and the mutation are found can be amplified by PCR with the pairs of primers
  • Analysis of the sequences thus amplified can be done by sequencing using the conventional methods with radiolabelled nucleotides or labeled primers, in particular with fluorochromes.
  • Other methods can be used to determine the presence of the mutation or of the various alleles linked to the polymorphism, in particular methods using Rnase A digestion, or migration to a non-denaturing gel during which DNA fragments of different sequence stand out from each other, according to the known technique of SSCP
  • the mutation and polymorphisms can also be studied by restriction analysis of the DNA fragments.
  • the enzymes Msl, I, Mae III and BstX I can be used to detect the presence of the mutation, Ace I and Mae III for polymorphism 1 and Mnl I for polymorphism 2
  • the human OB25 receptor gene has been located on the long arm of chromosome 9, in the cytogenetic region q31 3-32, near the polymorphic marker D9S1683
  • D9S1675, D9S1854, AFM317zf1, IB280 or D9S179 are also close to the OB25 receptor gene
  • the invention also relates to a method for diagnosing a disease of genetic origin involving myelin-producing cells, comprising the detection of one or more mutations in the chromosomal region q31 3-32 of chromosome 9, inducing a difference in the expression of the OB25 receptor gene or a difference in the relative expression of alleles in the OB25 receptor gene
  • the invention also relates to such a diagnostic method, comprising the detection of one or more mutations in the chromosomal DNA region located near the marker D9S1683, or one of the markers D9S1675, D9S1854, AFM317zf1 , IB280 or D9S179 Genetic diagnosis can also be established from genomic DNA prepared as indicated above, using the polymorphic marker D9S1683 Markers D9S1675, D9S1854, AFM317zf1, IB280 or D9S179 can also be used
  • the diagnostic method according to the invention comprises in particular the detection of a mutation in the codon coding for amino acid No. 178 of the sequence of FIG. 1
  • the diagnostic method according to the invention comprises in particular the determination of the genotype of the OB25 receptor and the detection of at least one polymorphism in the gene for said receptor
  • the genotyping resulting from the study of polymorphisms and mutations in the OB25 receptor gene makes it possible to predict the probability of the appearance of a disease involving a myehnization disorder, in the subject himself and in his descendants
  • Genotyping makes it possible in particular to establish the existence of the disease before the onset of symptoms and therefore to take appropriate therapeutic and prophylactic measures
  • rat olfactory bulb (Stratagene, Ozyme, Montig ⁇ y-le-Bretonneux) was screened under low stress conditions with a mixture of 32 P labeled DNA probes encoding the heptahelical dopamine receptors, rat D 2 receptor (nucleotides 172-1191), Xenopus D 2 receptor (nucleotides 76-1273), D 3 receptor (nucleotides 196-1242) and rat D 4 receptor (nucleotides 306-635 and 985 -1125) Seven clones corresponding to a new and same coding sequence have been isolated.
  • the nucleotide sequence of the clone OB25 comprises 1543 bases, code for a receptor of 364 amino acids whose homologies with all the known receptors allow to conclude that is part of the family of 7 transmembrane receptors coupled to a G protein
  • the expression vectors are derived from the plasmid SV-D2 (Sokoloff, et al, Nature, 347 146-151, 1990)
  • To express the OB25 receptor the HindIII-BamHI restriction fragment of pSVD2 is replaced by a Hindlll-BamHI fragment of the plasmid Bluesc ⁇ pt OB25 resulting from the screening of the copy DNA bank
  • This construction is cultured then the plasmid extracted and purified (Birnboim, Enzymol, 100 243-255, 1983) Chinese Hamster Ovary cells deficient in dihydrofolate reductase are then transfected using DOTAP (Boehnnger, Mannheim)
  • DOTAP Boehnnger, Mannheim
  • the stable transfectants are selected in a culture medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium) without hypoxanthine and without thymidine Stimulation of transfected cells with a brain extract induces a decrease in cycl
  • the expression vector consists of the Hindlll-Xbal fragment of the Bluesc ⁇ pt plasmid containing the sequence of the OB25 receptor inserted into the Rc / CMV plasmid (Invitrogen, San Diego) previously digested with the enzymes Hindlll and Xbal
  • the PC12 cells are transfected by electroporation ( Potter, et al, Proc Natl Acad Sa USA, 81 7161-7165, 1984), then selected in a culture medium containing neomycme
  • the expression vector is the recombinant Rc / CMV plasmid described above.
  • the cells are transfected using DOTAP (Boehnnger, Mannheim). Stable transfectants are selected in a culture medium containing neomycm or geneticin sulfate at a concentration of 800 ⁇ g / ml
  • In situ hybridizations are practiced in rats at different stages of development. For this, sections (10 ⁇ M) fixed with 4% paraformaldehyde for 40 min are used. These sections are hybridized with a ⁇ -probe encoding the complementary reverse sequence of the Pstl fragment, located in the 5 ′ part of the messenger RNA sequence of the OB25 receptor, labeled with UTP- 33 P (Simmons, et al, J Histotechnol, 12 169-181, 1989) After hybridization, the sections are exposed for 3 weeks against ⁇ -max films To know the variations during the development of the OB25 receptor, messenger RNAs are prepared from the brains of rats of different postnatal ages (RNABLe®, Eurobio, Les Ullis) Samples (10 ⁇ g) are denatured, subjected to agarose electrophoresis, transferred to nitrocellulose menbrans and then hybridized using a 520 bp fragment labeled with 32 P obtained by PCR amplification of the 5 'part
  • the transcript expression grows from 1 to 21 th day after birth and then decreases slightly and remains This increase transcript is parallel to the myéhnisation phase MBP, PLP and CNPase, specific markers of myelin, have a practically identical temporal development (Kanfer, et al, J Mol Neurosci, 1 39-46, 1989) Spatial development takes place according to a caudo-rostral gradient, identical once again to that of MBP
  • In situ hybridization was carried out with a 32 P-labeled cDNA probe, specific for the human sequence using as matrix cDNA obtained by reverse transcription-PCR with cerebellum RNA and the primers 5'-CTCCTAGCATGACTTCGATCT-3 'and 5'-TCTGCAGCAGCCAGATTAGC-3' and cloned into pGEM-4Z
  • matrix cDNA obtained by reverse transcription-PCR with cerebellum RNA and the primers 5'-CTCCTAGCATGACTTCGATCT-3 'and 5'-TCTGCAGCAGCCAGATTAGC-3' and cloned into pGEM-4Z
  • paraffin sections (5 ⁇ m thick) of the anterior temporal cortex of the brain previously fixed in a 5% solution of zinc-formamide, a signal of intense hybridization is observed in the white substance with the anti-sense probe, contrasting with a very weak signal in the gray substance
  • the localization was first established using a panel of irradiation of human / hamster hydndes cells (Research Genetics Inc)
  • the direct primer 5'-CCACTAAGCAGAGACCTTGTC-3 ' was used with the complementary primers 5 '-CGTAATGTGCCTCTCGATTGC-3' and 5'-
  • GAACATAGCCAAAGATGTGAGC-3 to determine the presence of the gene human in hybrid cells using 25 ng of DNA per 10 ⁇ l of PCR reaction
  • the localization of the gene was thus established in the vicinity of the polymorphic marker D9S1707 on chromosome 9q, which corresponds to the cytological region q31 3-32 This localization was specified by testing by PCR with the same primers of the artificial yeast chromosomes (YACs ) from the Center for the Study of Human Polymorphism YACs 947-2, 714-a-4, 936-e-5, 907- c-2 contain the coding part of the OB25 gene and have in common the marker D9S1683

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Abstract

Application du polypeptide selon l'invention au diagnostic ou au traitement d'affections neurologiques ou métaboliques, notamment d'origine génétique, affectant principalement les cellules productrices de la myéline.

Description

UTILISAΗON A DES FINS DE DIAGNOSTIC ET THERAPEUΗQUES D'UN POLYPEPTIDE A ACTIVITE DE RECEPTEUR OB25 EXPRIME PAR LES CELLULES MYELINISANTES
La présente invention a trait à l'utilisation à des fins de diagnostic et thérapeutiques d'un polypeptide ayant une activité de récepteur exprimé dans les cellules myelinisantes, dénommé récepteur OB25.
Elle concerne ainsi l'utilisation de ce polypeptide pour le diagnostic d'affections neurologiques ou métaboliques affectant principalement les cellules produisant la myéline.
L'invention est en particulier relative au diagnostic de maladies d'origine génétique impliquant les cellules productrices de myéline ou à la recherche de facteurs de susceptibilité à une telle maladie. L'invention concerne encore l'utilisation de ce polypeptide pour la mise au point de médicaments destinés au traitement des affections précitées.
Elle concerne aussi le traitement de maladies génétiques impliquant les cellules productrices de myéline.
L'invention est encore relative à l'utilisation de sondes nucléotidiques susceptibles de se fixer par hybridation sur la séquence ou la séquence complémentaire, le transcrit ou les gènes codant pour ledit polypeptide et destinées au diagnostic et à la sélection de médicaments utilisables dans le traitement de maladies neurologiques ou métaboliques, notamment pour le traitement de maladies de la myéline, de maladies neuromusculaires.
L'invention a également trait à l'utilisation d'anticorps monocloπaux ou polyclonaux, dirigés contre ledit polypeptide, aux fins précitées.
Elle concerne aussi des moyens de criblage de candidats médicaments pour le traitement desdites affections. Enfin, l'invention a trait à des médicaments destinés notamment au traitement d'affections neurologiques ou métaboliques affectant principalement les cellules productrices de la myéline, notamment la sclérose en plaques ou les gliomes, les maladies neuro-musculaires, contenant une substance ayant une affinité élevée pour ledit polypeptide à activité de 0 récepteur spécifique des cellules myelinisantes chez le rat ou encore des substances ayant une activité sur des cellules transfectées par une séquence codant pour ledit polypeptide. Les maladies de la myéhnisation peuvent être acquises suite à une inflammation ou à une infection, être d'origine nutπtionnelle ou toxique, secondaires à une affection neuronale ou bien encore à déterminants génétiques Les voies de traitement connues à ce jour pour les maladies de la myéhnisation sont essentiellement symptomatiques (anti-inflammatoires)
Dans le traitement de ces maladies profondément handicapantes, l'un des objectifs est d'obtenir une stimulation de la synthèse et de la production de myéline ou bien la multiplication ou la différentiation des cellules produisant la myéline (oligodendrocytes et cellules de Schwann) La réalisation de cet objectif se heurte au fait qu'il n'existe que très peu de facteurs connus susceptibles de moduler spécifiquement l'activité des cellules productrices de myéline
Les gènes impliqués dans la synthèse, l'enroulement ou la compaction de la myéline constituent, à l'évidence, des gènes candidats dans les affections démyélimsantes pour lesquelles une composante génétique est évoquée ou avérée, et dont le locus reste à identifier
Il y a donc un intérêt pour le diagnostic et le traitement des maladies de la myéline, notamment des maladies neuromusculaires, à utiliser un récepteur exprimé par les cellules productrices de myéline et ses ligands naturels ou synthétiques
La présente invention répond à ce besoin en fournissant des moyens utiles à des fins de diagnostics et de traitement des maladies de la myéhnisation Le polypeptide ayant une activité de récepteur OB25 utilisé selon l'invention est constitué par ou comprend tout ou partie de la séquence d'acides aminés de rat définie dans l'identificateur de séquence SEQ ID N° 2 ou une séquence homologue contenant le ou les sites faisant partie de ladite séquence peptidique dont la présence est nécessaire pour que le polypeptide ait les mêmes caractéristiques pharmacologiques que le récepteur OB25 ou pour qu'il soit reconnu par des anticorps qui reconnaissent également la séquence d'acides aminés précitée Cette homologie peut être une homologie d'espèce ou une homologie correspondant à des mutations artificielles ou spontanées de nature ponctuelle et ne modifiant pas les propriétés essentielles du polypeptide et notamment son activité sur le récepteur OB25. Le polypeptide selon l'invention a été obtenu par criblage d'une banque d'ADN copie de bulbe olfactif de rat en utilisant des sondes nucléotidiques codant pour des récepteurs de la famille des récepteurs heptahélicaux couplés aux protéines G.
Le polypeptide selon l'invention peut être utilisé en étant isolé ou fixé sur des supports, d'une façon tout-à-fait classique, ou encore en étant associé à des séquences d'acides aminés sans relation avec le récepteur OB25.
Ayant établi la séquence codante du récepteur OB25 (donnée dans la liste de séquences annexée), les inventeurs ont constaté que celle-ci est homologue (82,8% d'identité en nucleotides) à une séquence obtenue chez le mouton, apparaissant dans la base Genbank sous le code d'accès U 18405. Les informations accompagnant cette séquence n'indiquent qu'une structure compatible avec un couplage à une protéine G, mais aucune fonction ni utilisation pratique de cette séquence n'est suggérée. De même, I. Masana et coll. (Receptors and Channels, 1995, 3 :
255-262) décrivent le clonage de l'ADNc de mouton correspondant à cette séquence et l'expression dans une cellule CHO dont le pouvoir de division en présence de sérum paraît accru. Cette réponse mitogène est commune à de nombreux récepteurs recombinants de la même superfamille et ne suggère en rien la fonction ni l'utilisation pratique du récepteur exprimé dans ce système artificiel.
Cette séquence possède une homologie d'espèce avec les séquences répertoriées dans GENBANK sous les n° HSU78192, HSU8081 1 , BTU48236, MMU70622 et MMU48235. Une portion de la séquence codante du récepteur OB25 est également homologue (91 ; 1 % d'identité en nucleotides) à une séquence humaine (code d'accès à Genbank HSC1 CG081 ), obtenue par séquençage systématique d'ADN complémentaires (Expressed Séquence Tags), sans que la correspondance avec un fragment de récepteur ni , a fortiori, qu'une fonction ne lui soit attribuée
Une homologie a également été constatée avec les séquences humaines décrites dans les documents WO 96/39436 et WO 97/00952 De manière inattendue, les inventeurs ont établi que le récepteur
OB25 est exprimé dans les cellules productrices de myéline, à savoir les cellules de Schwann et les oligodendrocytes et que son expression au cours du développement est en accord avec un rôle dans la myéhnisation
Les inventeurs ont en particulier établi cette localisation du récepteur OB25 chez l'homme et chez le rat. L'existence et la localisation d'une telle expression du récepteur OB25 n'avaient jusqu'ici pas été déterminées
La présente invention concerne également les acides nucléiques constitués par ou comprenant tout ou partie de la séquence nucléotidique codant pour le polypeptide selon l'invention, ainsi que les acides nucléiques homologues
Des acides nucléiques selon l'invention sont notamment des acides nucléiques comprenant ou constitués par la séquence SEQ ID n°1 de la liste de séquences annexée ou des fragments de celle-ci
Parmi les acides nucléiques selon l'invention, ceux constitués par la séquence s'étendant du nucléotide en position 152 au nucléotide en position 1243 de la séquence SEQ ID N°1 annexée sont particulièrement intéressants
Les acides nucléiques homologues selon l'invention peuvent comporter des variations propres à la dégénérescence du code ainsi que des mutations localisées dans la mesure où les acides nucléiques variants s'hybπdent avec les sondes susceptibles de s'hybπder, de façon spécifique, avec la séquence SEQ ID n°1
D'autres acides nucléiques homologues selon l'invention sont des acides nucléiques présentant une homologie d'espèce et qui sont tels qu'ils peuvent être identifiés et clones par les méthodes classiques grâce à l'utilisation de sondes nucléotidiques constituées par ou comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID n°1 ou des séquences de Genbank U18405 ou HSC1 CG081, HSU78192, HSU80811 , BTU48236, MMU70622 et M MU 48235 Ces acides nucléiques, une fois clones, peuvent être séquences de manière usuelle
De telles séquences d'acides nucléiques homologues comprennent notamment les séquences d'origine ovine ou humaine constituées par ou contenant tout ou partie de la séquence Genbank U 18405 ou de la séquence HSC1 CG081 , HSU78192, HSU80811 , BTU48236, MMU70622 et
MMU48235
Les acides nucléiques selon l'invention peuvent être obtenus par synthèse chimique classique d'acide nucléique, par réplication dans des vecteurs qui les contiennent ou par tout autre moyen, et notamment multiplication par le procédé PCR à partir d'une faible quantité d'acide nucléique selon l'invention
L'invention concerne aussi les vecteurs recombinants, utilisables pour le clonage ou pour l'expression des acides nucléiques et contenant un acide nucléique selon l'invention, tel que des plasmides, des phages ou des virus contenant la séquence selon l'invention, en un site non essentiel pour la réphcation
Les vecteurs selon l'invention peuvent contenir, le cas échéant, les éléments nécessaires pour l'expression dans un hôte cellulaire tels que promoteur, codon d'initiation, terminateur, séquence signal ou séquence d'ancrage ou tout autre élément utile à la régulation
L'invention concerne encore les hôtes cellulaires transformés par un vecteur selon l'invention et susceptibles d'exprimer le polypeptide selon l'invention de façon à présenter à la surface membranaire un ou plusieurs sites spécifiques du vecteur OB25
Ces hôtes peuvent être des cellules en culture telles que CHO (Chinese Hamster Ovary), COS ou encore PC12 ou NG 108-15
L'invention a encore pour objet l'utilisation des acides nucléiques selon l'invention pour cloner puis séquencer des séquences d'acides nucléiques ovine ou humaine et notamment les gènes des récepteurs ovin et humain présentant chez le mouton ou l'homme une activité correspondant à celle du récepteur OB25 chez le rat La détermination de ces séquences permet, par recombinaison génétique, d'exprimer les récepteurs ovin ou humain et de les utiliser pour l'induction d'anticorps et le criblage de médicaments pour le traitement d'affections neurologiques ou métaboliques affectant principalement les cellules productrices de myéline, telles que la sclérose en plaques ou les ghomes, ou des maladies neuromusculaires
L'invention a aussi pour objet des anticorps monoclonaux ou polyclonaux dirigés contre le récepteur OB25
Ces anticorps sont obtenus par induction à partir d'un polypeptide selon l'invention, comprenant la totalité ou une partie de la séquence donnée en annexe, ou de toutes autres séquences comprenant des sites polypeptidiques suffisamment proche de ladite séquence pour que les anticorps ainsi fabriqués reconnaissent cette dernière
Ces anticorps peuvent être obtenus par injections sous- cutanées répétées d'un mélange d'adjuvant de Freund et d'un polypeptide selon l'invention ou d'un fragment de ce polypeptide fusionné ou couplé avec une protéine courante telle que sérum albumine, ovalbumine.
Ces anticorps selon l'invention sont utiles, par exemple, pour diagnostiquer par réaction anticorps-antigène mise en évidence à l'aide d'une technique de révélation classique, une prolifération de cellules exprimant le récepteur OB25 ou la présence d'un anticorps endogène dans une maladie auto-immune des cellules productrices de myéline
L'invention a pour objet l'utilisation de sondes nucléotidiques susceptibles de se fixer par hybridation sur la séquence complémentaire, le transcrit ou le gène codant pour le polypeptide selon l'invention, pour le diagnostic et la thérapeutique des maladies des cellules productrices de myéline
Les sondes sont constituées d'une partie ou de la totalité de la séquence donnée en annexe, ou de toutes autres séquences homologues, telles que ces dernières hybπderaient avec la séquence en annexe
Les sondes sont utilisées de façon classique en étant mise en contact, dans les conditions usuelles, avec des préparations présentant des acides nucléiques suspectés de présenter une anomalie Elles peuvent aussi être utilisées, par exemple, pour détecter une expression pathologique du récepteur OB25 en révélant la présence de son ARN messager
Le polypeptide et les acides nucléiques selon l'invention peuvent être utilisés pour le diagnostic et la mise au point de médicaments destinés au traitement d'affections de la myéline chez l'homme comme il est décrit ci-après L'invention fournit ainsi un procédé de criblage de médicaments destinés au traitement d'affections neurologiques ou métaboliques affectant principalement les cellules productrices de la myéline, telles que la sclérose en plaques ou les gliomes, ou des maladies neuromusculaires Le criblage d'un médicament peut utiliser la capacité de la molécule candidate à se comporter comme gand vis-à-vis d'un polypeptide selon l'invention
Il consiste, par exemple, à mettre en contact, dans un milieu convenable, la molécule candidate avec les membranes d'un hôte cellulaire transformé par un vecteur comprenant un insert codant pour un polypeptide selon l'invention et susceptible d'exprimer ledit polypeptide de façon à présenter à la surface membranaires un ou plusieurs sites spécifiques du récepteur OB25, de manière telle que la liaison spécifique du gand candidat puisse être évaluée ou indirectement estimée, par exemple en détectant l'éventuel complexe ligand-polypeptide
Ce procédé peut également comprendre la mesure d'une réponse induite par la liaison avec la cellule, telle que par exemple la production d'AMP cyclique de façon à permettre de différencier les molécules qui se comportent comme des agonistes ou comme des antagonistes Dans ce but de criblage, on peut également utiliser un procédé déterminant l'affinité du récepteur OB25 pour des ligands déterminés, dans lequel on cultive l'hôte cellulaire transformé exprimant le polypeptide correspondant, après quoi on met la culture cellulaire en contact avec le hgand déterminé et on vérifie s'il se forme une liaison spécifique entre l'hôte cellulaire et le hgand, notamment par des tests de radioliaison de préférence, de mesure de taux de production ou de libération d'un indicateur convenable tel que l'AMP cyclique, ou ions intracellulaires tels que du calcium, ces derniers tests permettant de distinguer et de définir les agonistes et leur caractère partiel, ainsi que les antagonistes
L'invention fournit aussi un procédé de criblage de ligands détectables, notamment des ligands marqués tels que des ligands radioactifs ou fluorescents, dans lequel on mesure la liaison spécifique de ligands candidats avec la membrane d'une cellule transformée par un vecteur comprenant un insert codant pour un polypeptide selon l'invention et susceptible d'exprimer ledit polypeptide de façon à exprimer à la surface membranaire un ou plusieurs sites spécifiques de ce polypeptide de manière telle que la liaison spécifique du ligand candidat puisse être évaluée ou indirectement estimée
On peut également utiliser un hôte cellulaire transformé comme précédemment décrit, pour exprimer et présenter dans sa membrane le récepteur OB25 pour identifier le gand endogène du récepteur OB25 Ce gand peut être utilisé pour synthétiser des analogues pour servir à la mise au point ou au criblage de médicaments interagissant avec le récepteur OB25 Le gand endogène peut être utilisé pour générer des anticorps utilisables en diagnostic ou thérapeutique pour diminuer son action sur les cellules productrices de myéline L'invention a ainsi pour objet un procédé d'identification de tissus ou cellules exprimant spontanément à leur surface membranaire le polypeptide selon l'invention tel que lesdits tissus ou cellules puissent servir à la mise au point de médicaments ou ligands marqués, utilisables dans les maladies impliquant les cellules productrices de myéline L'invention a encore pour objet des médicaments pour le traitement d'affections neurologiques ou métaboliques affectant principalement les cellules productrices de la myéline, contenant, dans une dose prévue pour être administrée, une quantité thérapeutiquement efficace d'une substance active sur un polypeptide ayant une activité de récepteur OB25, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable
L'invention a encore pour objet l'utilisation d'une substance active sur un polypeptide ayant une activité de récepteur OB25, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'affections neurologiques ou métaboliques affectant principalement les cellules productrices de myéline, notamment la sclérose en plaques ou les gliomes, ou des affections neuromusculaires
L'invention concerne aussi un procédé de traitement des affections neurologiques ou métaboliques affectant principalement les cellules productrices de myéline, comprenant le fait d'administrer à un sujet nécessitant un tel traitement une quantité thérapeutique efficace d'une substance entière sur un polypeptide ayant une activité de récepteur OB25 selon l'invention
On peut ainsi prévoir l'injection d'anticorps dirigés contre les polypeptides selon l'invention ou des homologues de ceux-ci, notamment chez le mouton ou chez l'homme, comme défini précédemment
On peut également prévoir l'administration de médicaments sélectionnés par les procédés de criblage décrits ci-dessus
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un acide nucléique codant pour le récepteur OB25 ou d'un polypeptide ayant une activité de récepteur OB25, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'affections neurologiques ou métaboliques affectant principalement les cellules productrices de myéline, notamment la sclérose en plaque ou les gliomes
Sont en particulier visées les troubles impliquant un dysfonctionnement ou une sous-expression des récepteurs OB25 endogènes dans les cellules productrices de myéline
L'invention a plus particulièrement trait à l'utilisation du gène du récepteur OB25 dans un but thérapeutique pour le traitement de maladies d'origine génétique impliquant les cellules productrices de myéline L'invention a ainsi pour objet un procédé de traitement d'une maladie d'origine génétique impliquant les cellules productrices de myéline, comprenant le fait d'administrer à un sujet nécessitant un tel traitement, une quantité thérapeutiquement efficace d'un acide nucléique codant pour le récepteur OB25 ou d'un polypeptide ayant une activité de récepteur OB25 Par exemple, un vecteur rétroviral adéquat peut être modifié pour exprimer le gène normal du récepteur, transfecté dans des cellules hôtes telles que décrites précédemment pour produire des particules rétrovirales infectieuses De telles particules rétrovirales peuvent être employées pour transfecter des cellules eucaryotes in vitro ou in vivo, chez des patients dont le gène du récepteur OB25 est défectueux
La présente invention concerne aussi l'utilisation de marqueurs génétiques pour le diagnostic d'une maladie d'origine génétique impliquant les cellules productrices de myéline ou pour rechercher les facteurs de susceptibilité à une telle maladie
La structure du gène humain (figure 1 ) du récepteur OB25 a été établie ainsi que sa localisation dans le génome humain L'existence de deux polymorphismes bi-alléhques et d'une mutation rare a été établie par sequençage d'ADN genomique de différents sujets Les polymorphismes ont été déterminés chez 34 individus non apparentés
Le polymorphisme n° 1 concerne le nucléotide n° 1063 dans la séquence donnée à la figure 1 en annexe Cette base est soit une cytosine soit une thymidine La base correspondante n° 1064 dans la référence GenBank HSU78192 est une cytosine, la base correspondante n° 1052 dans la séquence décrite dans le document WO96/39436 est une cytosine, la base correspondante n° 1250 dans la séquence décrite dans le document WO97/00952 est une thymidine
Le polymorphisme n° 2 concerne la base n° 1252 dans la séquence donnée à la figure 1 en annexe Cette base est soit une guanine soit une thymidine La base correspondante n° 1694 dans la séquence décrite dans le document WO96/39436 est une thymidine, la base correspondante n° 1442 dans la séquence décrite dans le document WO97/00952 est une guanine
La mutation concerne le nucléotide n° 627 de la séquence de la figure 1 en annexe La thymidine est remplacée par une cytosine, ce qui transforme l'acide aminé correspondant, méthiomne n° 178 en thréonine Ce variant de séquence n'a jamais été décrit dans les documents antérieurs
L'étude des polymorphismes et de la mutation chez les individus porteurs ou susceptibles d'être atteints par une maladie d'origine génétique impliquant les cellules productrices de myéline permet la mise au point d'un procédé de diagnostic de ladite maladie Selon un mode de réalisation d'un tel procédé, l'ADN genomique peut être obtenu à partir de cellules du patient, du sang, de l'urine, de la salive, d'une biopsie ou de n'importe quel tissu obtenu à l'autopsie L'ADN genomique est extrait du tissu selon les techniques connues de l'art, comme par exemple l'extraction phénol-chloroforme suivie d'une précipitation à l'éthanol De l'ADNc issu de l'ARN illégitimement transcrit peut aussi être utilisé pour la détermination des polymorphismes et de la mutation
L'ADN ainsi purifié ou l'ADNc est utilisé directement ou après amplification par PCR des fragments d'ADN contenant la mutation et les polymorphismes
Les séquences sur lesquelles se trouvent les polymorphismes et la mutation peuvent être amplifiées par PCR avec les couples d'amorces
5'-TGC GAC AATGGT GGC TTC CA-3' et 5-CTT TTC TTC TCC TCT CTC ACA CCC-3' 5'-ATA TAA AGG TGC CTC ATC CC-3' et 5'-GCT TTA AAT TTG
GAC CTG TGC-3'
Ces amorces permettent d'amplifier la totalité des exons 2 et 3 de la séquence codante donnée à la figure 1
Tout autre couple d'amorces permettant l'amplification de fragments comprenant la séquence sur laquelle sont localisées la mutation et les polymorphismes peut être utilisé
L'analyse des séquences ainsi amplifiées peut être faite par sequençage en utilisant les procédés conventionnels avec des nucleotides radiomarqués ou des amorces marquées, notamment par des fluorochromes D'autres méthodes peuvent être utilisées pour déterminer la présence de la mutation ou des différents allèles liés au polymorphisme, notamment des méthodes faisant appel à la digestion par la Rnase A, ou à la migration sur gel non dénaturant au cours de laquelle des fragments d'ADN de séquence différente se démarquent les uns des autres, selon la technique connue de SSCP
La mutation et les polymorphismes peuvent aussi être étudiés par une analyse de restriction des fragments d'ADN Par exemple, les enzymes Msl, I, Mae III et BstX I peuvent être utilisées pour détecter la présence de la mutation, Ace I et Mae III pour le polymorphisme 1 et Mnl I pour le polymorphisme 2
Le gène humain du récepteur OB25 a été localisé sur le bras long du chromosome 9, dans la région cytogénétique q31 3-32, à proximité du marqueur polymorphe D9S1683 Les marqueurs polymorphes D9S1675,
D9S1675, D9S1854, AFM317zf1 , IB280 ou D9S179 sont aussi à proximité du gène du récepteur OB25
L'invention a également pour objet un procédé de diagnostic d'une maladie d'origine génétique impliquant les cellules productrices de myéline comprenant la mise en évidence d'une ou plusieurs mutations dans la région chromosomique q31 3-32 du chromosome 9, induisant une différence de l'expression du gène du récepteur OB25 ou une différence de l'expression relative des allèles du gène du récepteur OB25
L'invention a encore trait à un tel procédé de diagnostic, comprenant la mise en évidence d'une ou plusieurs mutations dans la région d'ADN chromosomique située à proximité du marqueur D9S1683, ou de l'un des marqueurs D9S1675, D9S1854, AFM317zf1 , IB280 ou D9S179 Le diagnostic génétique peut aussi être établi à partir de l'ADN genomique préparé comme indiqué plus haut, en utilisant le marqueur polymorphe D9S1683 Les marqueurs D9S1675, D9S1854, AFM317zf1 , IB280 ou D9S179 peuvent aussi être utilisés
Ces marqueurs peuvent être utilisés selon les méthodes classiques connues de l'homme du métier
Le procédé de diagnostic selon l'invention comprend notamment la mise en évidence d'une mutation du codon codant pour l'acide aminé n° 178 de la séquence de la figure 1
Le procédé de diagnostic selon l'invention comprend notamment la détermination du génotype du récepteur OB25 et la mise en évidence d'au moins un polymorphisme dans le gène dudit récepteur
Le génotypage résultant de l'étude des polymorphismes et mutations dans le gène du récepteur OB25 permet de prévoir la probabilité de l'apparition d'une maladie impliquant un trouble de la myéhnisation, chez le sujet lui-même et dans sa descendance
Le génotypage permet en particulier d'établir l'existence de la maladie avant l'apparition des symptômes et donc de prendre les mesures thérapeutiques et prophylactiques adéquates
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante donnée à titre illustratif et non limitatif
1. Clonage du récepteur OB25. On a criblé une banque d'ADN copie de bulbe olfactif de Rat (Stratagene, Ozyme, Montigπy-le-Bretonneux) dans des conditions de stπngence basse avec un mélange de sondes ADN marquées au 32P codant pour les récepteurs heptahélicaux de la dopamine, le récepteur D2 de rat (nucleotides 172-1191 ), le récepteur D2 de Xénope (nucleotides 76-1273), le récepteur D3 (nucleotides 196-1242) et le récepteur D4 de rat (nucleotides 306-635 et 985-1125) Sept clones correspondant à une nouvelle et même séquence codante ont été isolés La séquence nucléotidique du clone OB25 comporte 1543 bases, code pour un récepteur de 364 acides aminées dont les homologies avec l'ensemble des récepteurs connus permettent de conclure qu'il fait partie de la famille des récepteurs à 7 domaines transmembranaires couplés à une protéine G
2. Expression du récepteur OB25 dans les cellules CHO.
Le vecteurs d'expression dérivent du plasmide SV-D2 (Sokoloff, et al , Nature, 347 146-151 ,1990) Pour exprimer le récepteur OB25, le fragment de restriction HindIII-BamHI du pSVD2 est remplacé par un fragment Hindlll- BamHI du plasmide Bluescπpt OB25 issus du criblage de la banque d'ADN copie Cette construction est cultivée puis le plasmide extrait et purifié (Birnboim, Enzymol , 100 243-255, 1983) Des cellules d'Ovaire de Hamster Chinois déficientes en dihydrofolate réductase sont aiors transfectées en utilisant la DOTAP (Boehnnger, Mannheim) Les transfectants stables sont sélectionnés dans un milieu de culture (Dulbecco's Modified Eagle Médium) sans hypoxanthine et sans thymidine La stimulation par un extrait de cerveau des cellules transfectées induit une diminution de la formation d'AMP cyclique
3. Expression du récepteur OB25 dans les cellules PC12. Le vecteur d'expression est constitué du fragment Hindlll-Xbal du plasmide Bluescπpt contenant la séquence du récepteur OB25 inséré dans le plasmide Rc/CMV (Invitrogen, San Diego) préalablement digéré par les enzymes Hindlll et Xbal Les cellules PC12 sont transfectées par électroporation (Potter, et al , Proc Natl Acad Sa U S A , 81 7161-7165, 1984), puis sélectionnées dans un milieu de culture contenant de la néomycme
4. Expression du récepteur OB25 dans les cellules NG 108-15.
Ces cellules sont choisies de préférence aux cellules PC12, car elles n'expriment pas naturellement le récepteur OB25 Le vecteur d'expression est le plasmide Rc/CMV recombinant décrit précédemment Les cellules sont transfectées en utilisant la DOTAP (Boehnnger, Mannheim) Les transfectants stables sont sélectionnés dans un milieu de culture contenant de la néomycme ou du sulfate de généticine à la concentration de 800 μg/ml
5. Expression au cours du développement.
Des hybridations in situ sont pratiquées chez le rat à différents stades du développement Pour cela, on utilise des coupes (10 μM) fixés au paraformaldéhyde 4 % pendant 40 min Ces coupes sont hybridées avec une πbosonde codant pour la séquence inverse complémentaire du fragment Pstl, située dans la partie 5' de la séquence de l'ARN messager du récepteur OB25, marquée avec de l'UTP-33P (Simmons, et al , J Histotechnol , 12 169-181 , 1989) Après l'hybridation, les coupes sont exposées 3 semaines contre des films β-max Pour connaître les variations au cours du développement du récepteur OB25, des ARN messagers sont préparés à partir de cerveau de rats à différent âges postnataux (RNABLe®, Eurobio, Les Ullis) Des échantillons (10 μg) sont dénaturés, soumis à une électrophorèse sur agarose, transférés sur des menbranes de nitrocellulose puis hybridées en utilisant un fragment de 520 pb marqué au 32P obtenu par amplification par PCR de la partie 5' de la séquence d'ADN codant pour le récepteur
L'expression du transcrit croît du 1er au 21eme jour après la naissance puis diminue légèrement et se maintient Cette augmentation du transcrit est parallèle à la phase de myéhnisation La MBP, la PLP et la CNPase, marqueurs spécifiques de la myéline, ont un développement temporel pratiquement identique (Kanfer, et al , J Mol Neurosci , 1 39-46, 1989) Le développement spatial se fait selon un gradient caudo-rostral, identique une fois de plus à celui de la MBP
6. Expression du récepteur selon l'invention chez l'adulte.
L'hybridation simple montre que le récepteur OB25 est uniquement localisé dans la substance blanche au niveau central Des expériences de colocalisation ont utilisé une 2e e sonde codant pour un marqueur des oligodendrocytes, la protéine basique de la myéline, marquée par de l'UTP-DIG (Boehnnger, Mannheim) et révélée par la phosphatase alcaline (Miller, et al , J Histochem And Cytochem , 41 4741-1750, 1993) Le récepteur OB25 apparaît localisé exclusivement dans les oligodendrocytes Au niveau périphérique, le récepteur OB25 est présent dans les racines de nerfs moteurs, dans le nerf sciatique et d'autres nerfs myélimsés, ce qui montre qu'il est exprimé aussi par les cellules de Schwann, qui produisent la myéline périphérique
7. Expression du récepteur OB25 humain dans les cellules productrices de myéline.
Une hybridation in situ a été réalisée avec une sonde de cDNA marquée au 32P, spécifique de la séquence humaine en utilisant comme matrice du cDNA obtenu par transcription réverse-PCR avec de l'ARN de cervelet et les amorces 5'-CTCCTAGCATGACTTCGATCT-3' et 5'-TCTGCAGCAGCCAGATTAGC-3' et clone dans du pGEM-4Z Sur des coupes paraffinées (5 μm d'épaisseur) de cortex temporal antérieur de cerveau fixé préalablement dans une solution à 5 % de zinc-formamide, un signal d'hybridation intense est observé dans la substance blanche avec la sonde anti-sens, contrastant avec un signal très faible dans la substance grise
8. Production d'un anticorps anti-récepteur OB25. Un peptide synthétique de séquence NH2-Y-K-R-T-I-L-A-G-V-H-S-N-D-H-S-V- V-COOH (code à une lettre) a été couplé à la sérum albumine bovine par l'intermédiaire de la diaminobenzidine L'antigène dilué dans l'adjuvant de Freund a été injecté par voie sous-cutanée à des lapins Des rappels ont été effectués avec un antigène couplé à la Keyhole Limpet Hemocyanin, puis de nouveau avec un antigène couplé à la sérum albumine bovine La présence d'anticorps a été détectée par ELISA et confirmée par analyse de Western, sur des extraits de cellules CHO, PC 12 et NG 108-15 exprimant le récepteur OB25
9. Structure du gène du récepteur humain Une banque d'ADN genomique humaine (Clontech) a été criblée dans des conditions de stingence basse avec une sonde d'ADN marquée au 32P correspondant à la totalité de la séquence codante du rat (nucléotide 120- 1280 de la séquence N° 1 ) Onze phages parmi les 45 isolés au premier tour ont été étudiés par analyse de restriction (enzymes BamH1 , Bglll, Sacl, Pstl), conjuguée à un transfert sur membrane de nitrocellulose et à une hybridation avec la sonde de rat La même banque a été criblée dans des conditions similaires avec une sonde o gonucléotide (5'-ACAGGGATGGAAGTAGAGATG- 3") spécifique de la séquence humaine (séquence GenBank HSU78192) marquée au 32P II a ainsi été localisé 2 introns dans la séquence codante, ainsi que 1 intron dans la partie 5' non-codante
10. Localisation chromosomique
La localisation a été établie dans un premier temps à l'aide d'un panel d'irradiation de cellules hydndes homme/hamster (Research Genetics Inc ) L'amorce directe 5'-CCACTAAGCAGAGACCTTGTC-3' a été utilisée avec les amorces complémentaires 5'-CGTAATGTGCCTCTCGATTGC-3' et 5'-
GAACATAGCCAAAGATGTGAGC-3' pour déterminer la présence du gène humain dans les cellules hybrides en utilisant 25 ng d'ADN pour 10 μl de réaction de PCR
La localisation du gène a ainsi été établie au voisinage du marqueur polymorphe D9S1707 sur le chromosome 9q, ce qui correspond à la région cytologique q31 3-32 Cette localisation a été précisée en testant par PCR avec les mêmes amorces des chromosomes artificiels de levure (YACs) du Centre d'Etude du Polymorphisme Humain Les YACs 947- 2, 714-a-4, 936-e-5, 907- c-2 contiennent la partie codante du gène OB25 et ont en commun le marqueur D9S1683
LI STE DE S EQUENCES
t l i I N FORMATION GENERALE :
( 1 ) DEPOSANT :
(A) NOM: INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA
RECHERCHE MEDICALE
(B) RUE: 101 rue de Tolbiac
(C) VILLE: PARIS
(D) PROVINCE: FRANCE (F) CODE POSTAL: 75654
(il) TITRE DE L'INVENTION: Polypeptide a activité de récepteur 0B25
!m) NOMBRE DE SEQUENCES: 2
(îv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D'EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (OEB)
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(1) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1543 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME : récepteur OB25 chez le ra t
( îx ) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE :
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 152..1243
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
CACGAGCAGC CGCCCCGCGT CTCCTGCCCT TTGGCCAGGC TTTCAGTTCC TCCTAGCATG 60
ACTGAGATCT GACCAGCCGA CTCACGAGTT GCTTCTTGTG CCACCACTGC AGTGCTGGGG 120
CCTCTTCATC GCTCCAAACT ACAGCACTGT C ATG GCA GCT GCC TCT ACT TCC 172
Met Ala Ala Ala Ser Thr Ser
1 5
AGC CCT GTG ATT TCA CAG CCC CAG TTC ACA GCC ATG AAC GAA CAA CAG 220
Ser Pro Val Ile Ser Gin Pro Gin Phe Th - Ala Met Asn r,lu Gin Gin TGC TTC TAC AAC GAG TCT ATC GCC TTC TTC TAT AAC CGG AGT GGA AAG 268 Cys Phe Tyr Asn Glu Ser Ile Ala Phe Phe Tyr Asn Arg Ser Gly Lys 25 30 35
TAT CTA GCC ACA GAA TGG AAC ACT GTG AGC AAG CTG GTG ATG GGA CTG 316 Tyr Leu Ala Thr Glu Trp Asn Thr Val Ser Lys Leu Val Met Gly Leu 40 45 50 55
GGC ATC ACT GTC TGC GTG TTC ATC ATG CTG GCC AAT CTA CTG GTC ATG 364 Gly Ile Thr Val Cys Val Phe Ile Met Leu Ala Asn Leu Leu Val Met 60 65 70
GTG GCA ATT TAC GTC AAC CGC CGC TTC CAT TTC CCT ATT TAT TAC TTG 412 Val Ala Ile Tyr Val Asn Arg Arg Phe His Phe Pro Ile Tyr Tyr Leu 75 80 85
ATG GCC AAC CTG GCT GCT GCA GAC TTC TTC GCT GGA CTG GCC TAC TTC 460 Met Ala Asn Leu Ala Ala Ala Asp Phe Phe Ala Gly Leu Ala Tyr Phe 90 95 100
TAC CTG ATG TTC AAC ACG GGA CCT AAT ACC CGG AGA CTG ACC GTG AGC 508 Tyr Leu Met Phe Asn Thr Gly Pro Asn Thr Arg Arg Leu Thr Val Ser 105 110 115
ACA TGG CTT CTC CGG CAG GGC CTC ATC GAC ACC AGC CTG ACG GCT TCT 556 Thr Trp Leu Leu Arg Gin Gly Leu Ile Asp Thr Ser Leu Thr Ala Ser 120 125 130 135
GTG GCC AAC CTG CTG GCC ATT GCC ATC GAG AGG CAC ATC ACA GTT TTC 604 Val Ala Asn Leu Leu Ala Ile Ala Ile Glu Arg His Ile Thr Val Phe 140 145 150
CGA ATG CAG CTC CAT ACA CGA ATG AGC AAC CGA CGT GTG GTG GTG GTG 652 Arg Met Gin Leu His Thr Arg Met Ser Asn Arg Arg Val Val Val Val 155 160 165
ATT GTA GTC ATC TGG ACT ATG GCC ATT GTG ATG GGT GCC ATA CCC AGT 700 Ile Val Val Ile Trp Thr Met Ala Ile Val Met Gly Ala Ile Pro Ser 170 175 180
GTG GGC TGG AAC TGC ATC TGT GAT ATC GAT CAT TGT TCC AAC ATG GCG 748 Val Gly Trp Asn Cys Ile Cys Asp Ile Asp His Cys Ser Asn Met Ala 185 190 195
CCC CTC TAC AGT GAC TCC TAC TTA GTC TTC TGG GCC ATT TTC AAC CTG 796 Pro Leu Tyr Ser Asp Ser Tyr Leu Val Phe Trp Ala Ile Phe Asn Leu 200 205 210 215
GTG ACC TTT GTG GTC ATG GTG GTT CTC TAC GCT CAC ATC TTT GGC TAT 844 Val Thr Phe Val Val Met Val Val Leu Tyr Ala His Ile Phe Gly Tyr 220 225 230
GTT CGC CAG AGG ACT ATG AGA ATG TCC CGG CAT AGT TCT GGA CCC AGG 892 Val Arg Gin Arg Thr Met Arg Met Ser Arg His Ser Ser Gly Pro Arg 235 240 245
AGG AAT CGG GAC ACC ATG ATG AGC CTT CTG AAG ACT GTG GTC ATT GTG 940 Arg Asn Arg Asp Thr Met Met Ser Leu Leu Lys Thr Val Val Ile Val 250 255 260
CTG ^GT GCC TTT ATT GTC TGC TGG ACT CCG GGA TTG GTC TTG CTA CTG 988 Leu Gly Ala Phe Ile Val Cys Trp Thr Pro Gly Leu Val Leu Leu Leu 265 270 275 .TC GAT GTG TGT TGC CCG CAG TGC GAT GTC CTG GCC TAT GAG AAG TTC 1036 Leu Asp Val Cys Cys Pro Gin Cys Asp Val Leu Ala Tyr Glu Lys Phe 280 285 290 295
TTC CTC CTC CTG GCC GAG TTC AAC TCT GCT ATG AAC CCC ATC ATC TAC 1084 Phe Leu Leu Leu Ala Glu Phe Asn Ser Ala Met Asn Pro Ile Ile Tyr 300 305 310
TCC TAC CGC GAC AAA GAG ATG AGC GCC ACC TTC AGG CAG ATC CTG TGT 1132 Ser Tyr Arg Asp Lys Glu Met Ser Ala Thr Phe Arg Gin Ile Leu Cys 315 320 325
TGC CAG CGC AAC GAG AAC CCC AAC GGC CCC ACG GAA GGC TCT GAC CGC 1180 Cys Gin Arg Asn Glu Asn Pro Asn Gly Pro Thr Glu Gly Ser Asp Arg 330 335 340
TCG GCC TCC TCC CTC AAC CAC ACT ATT CTG GCT GGA GTT CAC AGC AAT 1228 Ser Ala Ser Ser Leu Asn His Thr Ile Leu Ala Gly Val His Ser Asn 345 350 355
GAC CAC TCT GTG GTT TAGAAGGAAG CCAGCCGGCC TTTGTGGATT TGTGAACCCC 1283 Asp His Ser Val Val
360
ACCCTACCCG CATTGCCAGG GCAAGGTGGG GCGCCAGAGG AGACGAAGAC ACTCCTGTAC 1343
TTAACACTAA CCAATGGCAG TATTTGTCCC TAGACCCAAG AGACTTTAGG ATGAACTTGC 1403
TTGGTAGCCC CCATCTTCTC CTTTGGAAAA GAGAAGGGGA CCGTCTTGCA GTGGAATTCA 1463
GAAACGGACT CTGGGGAGAC CGTGTATGTA GCCTTCACTA ACTAGACTTA AAAGATTTTA 1523
TGTGGTTTGG CCTAAGCCAG 1543
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 364 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2 :
Met Ala Ala Ala Ser Thr Ser Ser Pro Val Ile Ser Gin Pro Gin Phe
1 5 10 15
Thr Ala Met Asn Glu Gin Gin Cys Phe Tyr Asn Glu Ser Ile Ala Phe 20 25 30
Phe Tyr Asn Arg Ser Gly Lys Tyr Leu Ala Thr Glu Trp Asn Thr Val 35 40 45
Ser Lys Leu Val Met Gly Leu Gly Ile Thr Val Cys Val Phe Ile Met 50 55 60
Leu Ala Asn Leu Leu Val Met Val Ala Ile Tyr Val Asn Arg Arg Phe
65 70 75 80
>i:s Phe Pro Ile Tyr Tyr Leu Met Ala Asn Leu Ala Ala Ala Asp Phe 85 90 95 Phe Ala Gly Leu Ala Tyr Phe Tyr Leu Met Phe Asn Thr Gly Pro Asn 100 105 110
Thr Arg Arg Leu Thr Val Ser Thr Trp Leu Leu Arg Gin Gly Leu Ile 115 120 125
Asp Thr Ser Leu Thr Ala Ser Val Ala Asn Leu Leu Ala Ile Ala Ile 130 135 140
Glu Arg His Ile Thr Val Phe Arg Met Gin Leu His Thr Arg Met Ser 145 150 155 160
Asn Arg Arg Val Val Val Val Ile Val Val Ile Trp Thr Met Ala Ile 165 170 175
Val Met Gly Ala Ile Pro Ser Val Gly Trp Asn Cys Ile Cys Asp Ile 180 185 190
Asp His Cys Ser Asn Met Ala Pro Leu Tyr Ser Asp Ser Tyr Leu Val 195 200 205
Phe Trp Ala Ile Phe Asn Leu Val Thr Phe Val Val Met Val Val Leu 210 215 220
Tyr Ala His Ile Phe Gly Tyr Val Arg Gin Arg Thr Met Arg Met Ser 225 230 235 240
Arg His Ser Ser Gly Pro Arg Arg Asn Arg Asp Thr Met Met Ser Leu 245 250 255
Leu Lys Thr Val Val Ile Val Leu Gly Ala Phe Ile Val Cys Trp Thr 260 265 270
Pro Gly Leu Val Leu Leu Leu Leu Asp Val Cys Cys Pro Gin Cys Asp 275 280 285
Val Leu Ala Tyr Glu Lys Phe Phe Leu Leu Leu Ala Glu Phe Asn Ser 290 295 300
Ala Met Asn Pro Ile Ile Tyr Ser Tyr Arg Asp Lys Glu Met Ser Ala 305 310 315 320
Thr Phe Arg Gin. Ile Leu Cys Cys Gin Arg Asn Glu Asn Pro Asn Gly 325 330 335
Pro Thr Glu Gly Ser Asp Arg Ser Ala Ser Ser Leu Asn His Thr Ile 340 345 350
Leu Ala Gly Val His Ser Asn Asp His Ser Val Val 355 360

Claims

REVENDICATIONS
1 Utilisation d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux dirigés contre un polypeptide ayant une activité de récepteur OB25, pour détecter par réaction antigène-anticorps une affection neurologique ou métabolique, affectant principalement les cellules produisant la myéline, notamment la sclérose en plaques, les gliomes ou une affection neuro-musculaire
2 Utilisation d'une sonde nucléotidique comprenant ou constituées par tout ou partie de la séquence nucléotidique donnée à l'identificateur de séquence SEQ ID N° 1 , ou des séquences homologues pouvant s'hybrider avec ladite séquence ou la séquence complémentaire, le transcrit ou le gène codant pour un polypeptide ayant une activité de récepteur OB25, par mise en contact avec une préparation contenant des acides nucléiques pour le diagnostic d'affections neurologiques ou métaboliques, affectant principalement les cellules produisant la myéline notamment la sclérose en plaques ou les gliomes
3 Procédé de criblage de médicaments destinés aux traitements d'affections neurologiques ou métaboliques affectant principalement les cellules productrices de la myéline ou d'affections neuromusculaires, dans lequel on met en contact, dans un milieu convenable, une molécule candidate avec les membranes d'un hôte cellulaire transformé par un vecteur comprenant un insert codant pour un polypeptide ayant une activité de récepteur OB25 et susceptible d'exprimer ledit polypeptide de façon à présenter à la surface membranaire un ou plusieurs sites spécifiques de ce polypeptide, l'éventuel complexe hgand- polypeptide qui se forme étant alors détecté 4 Procédé de criblage de médicaments destinés aux traitements d'affections neurologiques ou métaboliques, affectant principalement les cellules produisant la myéline notamment la sclérose en plaques ou les gliomes, dans lequel on mesure une réponse induite par la liaison d'une molécule candidate avec une cellule, transformée par un vecteur comprenant un insert codant pour un polypeptide ayant une activité de récepteur OB25 et susceptible d'exprimer ledit polypeptide de façon à présenter à la surface membranaire un ou plusieurs sites spécifiques de ce polypeptide de telle manière que la mesure d'un signal, tel que la production d'AMP cyclique, permette de différencier les molécules qui se comportent comme des antagonistes ou des agonistes.
5. Procédé d'identification de tissus ou cellules exprimant spontanément à leur surface membranaire un polypeptide ayant une activité de récepteur OB25, tel que lesdits tissus ou cellules puissent servir à la mise au point de médicaments ou ligands marqués selon les revendications 3 ou 4.
6. Utilisation d'une substance active sur un polypeptide ayant une activité de récepteur OB25, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'affections neurologiques ou métaboliques, affectant principalement les cellules produisant la myéline, notamment la sclérose en plaques ou les gliomes.
7. Médicament pour le traitement d'affections neurologiques ou métaboliques, affectant principalement les cellules produisant la myéline notamment la sclérose en plaques ou les gliomes, tel qu'obtenu par le procédé selon l'une des revendications 3 et 4 et ayant une activité contre les affections précitées.
8. Utilisation d'un acide nucléique codant pour le récepteur OB25 ou d'un polypeptide ayant une activité de récepteur OB25, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'affections neurologiques ou métaboliques affectant principalement les cellules productrices de myéline, notamment la sclérose en plaque ou les gliomes.
9. Procédé de diagnostic d'une maladie d'origine génétique impliquant les cellules productrices de myéline comprenant la mise en évidence d'une ou plusieurs mutations dans la région chromosomique q31.3-32 du chromosome 9, induisant une différence de l'expression du gène du récepteur OB25 ou une différence de l'expression relative des allèles du gène du récepteur OB25.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en évidence d'une ou plusieurs mutations dans la région d'ADN chromosomique située à proximité du marqueur D9S1683 ou de l'un des marqueurs D9S1675, D9S1854, AFM317zf1 , IB280 ou D9S179.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 et 10, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en évidence d'au moins une mutation du codon codant pour l'acide aminé n° 178 de la séquence de la figure 1.
12. Procédé selon la revendication 11 , dans lequel ladite mutation consiste en le remplacement de la thymidine n° 627 de la figure 1 pour une cytosine.
13. Procédé de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend la détermination du génotype du récepteur OB25 et la mise en évidence d'au moins un polymorphisme dans le gène du récepteur OB25.
14. Procédé de diagnostic selon la revendication 13, dans lequel ledit polymorphisme est : le polymorphisme n° 1 , selon lequel le nucléotide n° 1063 de la figure 1 est soit une cytosine soit une thymidine, - ou le polymorphisme n° 2, selon lequel le nuclétotide n° 1252 de la figure 1 est soit une guanine soit une thymidine.
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