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WO2018168582A1 - 殺虫剤および殺虫剤の製造方法 - Google Patents

殺虫剤および殺虫剤の製造方法 Download PDF

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WO2018168582A1
WO2018168582A1 PCT/JP2018/008631 JP2018008631W WO2018168582A1 WO 2018168582 A1 WO2018168582 A1 WO 2018168582A1 JP 2018008631 W JP2018008631 W JP 2018008631W WO 2018168582 A1 WO2018168582 A1 WO 2018168582A1
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WO
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fatty acid
insecticide
acid
proteobacteria
producing
Prior art date
Application number
PCT/JP2018/008631
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English (en)
French (fr)
Inventor
大野　勝也
久美子 高田
Original Assignee
イビデン株式会社
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Publication date
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria

Definitions

  • the present invention relates to an insecticide and a method for producing the insecticide.
  • drugs such as pyrethrin, which is an active ingredient of pesticide chrysanthemums, and synthetic pyrethroids such as allethrin derived from pyrethrin derivatives have been used. While pyrethroids have low toxicity to mammals and birds, they act strongly on insect nerve cells to produce neurotoxins and kill insects. In recent years, neonicotinoid insecticides that kill insects by binding to the insect neurotransmitter acetylcholine receptor have been widely used as insecticides.
  • insects are directly killed using components that are generally toxic to such insects
  • beneficial insects may be affected over a long period of time with insecticides that have a long residual effect, such as neonicotinoids, due to their ability to penetrate into plants.
  • insecticides that have a long residual effect, such as neonicotinoids, due to their ability to penetrate into plants.
  • insecticide-resistant insects due to excessive application of agricultural chemicals is also a problem. From the viewpoint of environmental impact such as soil contamination, reduction of the amount of chemically synthesized pesticides is desired.
  • Patent Document 1 describes a microbial biosurfactant.
  • Patent Document 1 discloses a method for controlling pests using a fermentation broth filtrate containing rhamnolipid as a biosurfactant, which can be used as an insecticide for controlling house flies and nematodes. Are listed. However, the drug described in Patent Document 1 has a problem that even large-sized pests such as moth larvae cannot be killed.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide an insecticide having a low soil contamination and toxicity and having an excellent insecticidal effect, and a method for producing the same.
  • the present invention relates to an insecticide containing a fatty acid metabolite obtained by metabolizing a fatty acid having 4 to 30 carbon atoms to proteobacteria under a dissolved oxygen concentration environment of 0.1 to 8 mg / l (liter).
  • fatty acid is a fatty acid that is liquid at 20 ° C.
  • An insecticide wherein the metabolism is metabolism in the presence of at least one mineral selected from Mg, P, Na and K is preferred.
  • An insecticide wherein the proteobacteria are pre-cultured proteobacteria is preferred.
  • the pre-cultured proteobacterium is a proteobacterium pre-cultured to 1 ⁇ 10 8 to 9 ⁇ 10 10 cells / ml (milliliter).
  • the insecticide is an insecticide containing a biosurfactant.
  • Insecticides in which the metabolism is metabolism under conditions of 20 to 30 ° C. are preferred.
  • the present invention also relates to a method for producing an insecticide containing a fatty acid metabolite comprising a fatty acid metabolism step of metabolizing a fatty acid having 4 to 30 carbon atoms to proteobacteria under a dissolved oxygen concentration environment of 0.1 to 8 mg / l. .
  • a method for producing an insecticide wherein the fatty acid is a fatty acid which is liquid at 20 ° C. is preferred.
  • a method for producing an insecticide wherein the fatty acid metabolism step is carried out in the presence of at least one mineral selected from Mg, P, Na and K is preferred.
  • a method for producing an insecticide wherein the proteobacteria are pre-cultured proteobacteria is preferred.
  • Proteobacteria said preincubated
  • the method for producing a pesticide is preferably proteobacteria, which is pre-cultured in the number 1 ⁇ 10 8 ⁇ 9 ⁇ 10 10 cells / ml bacteria.
  • a method for producing an insecticide which is a method for producing an insecticide containing a biosurfactant, is preferred.
  • a method for producing an insecticide wherein the fatty acid metabolism step is carried out at 20-30 ° C. is preferred.
  • the insecticide of the present invention has low soil contamination and toxicity and is excellent in insecticidal effect. Furthermore, according to the method for producing an insecticide of the present invention, an insecticide having low soil contamination and toxicity and excellent insecticidal effect can be produced.
  • the insecticide of the present invention comprises a fatty acid metabolite obtained by metabolizing a fatty acid having 4 to 30 carbon atoms to proteobacteria under a dissolved oxygen concentration environment of 0.1 to 8 mg / l. .
  • insects By bringing fatty acid metabolites into contact with pests, pests, particularly micro-pests, can be killed by airway blockade.
  • the insecticide of the present invention is considered to be effective for micro-insects that are early in generation change so that drug resistance to insecticides can be easily obtained, and for insects that have developed drug resistance against conventional insecticides.
  • fatty acid metabolites are much less toxic than chemically synthesized pesticides.
  • fatty acid metabolites are a group of genes involved in the production of infection-specific proteins (pathogenesis-related (PR) protein), salicylic acid or It is considered that the gene group involved in the production of enzymes that produce jasmonic acid is activated to induce systemic acquired resistance in plants. This is presumably because the fatty acid metabolite contains a substance that activates the salicylic acid pathway or jasmonic acid pathway related to resistance induction or a precursor of this substance.
  • PR pathogenesis-related
  • Metabolism in the present invention means that a fatty acid having 4 to 30 carbon atoms is decomposed by an enzyme or the like secreted by proteobacteria under an environment of dissolved oxygen concentration of 0.1 to 8 mg / l.
  • a method of culturing proteobacteria in a medium containing fatty acid under a dissolved oxygen concentration environment of 0.1 to 8 mg / l can be mentioned.
  • Proteobacteria have a gene that produces lipoxygenase (LOX), an enzyme involved in fatty acid metabolism, and can produce fatty acid metabolites.
  • LOX lipoxygenase
  • the carbon number of the fatty acid used in the present invention is 4-30, and preferably 10-20.
  • the melting point / boiling point is low, and therefore, the volatility tends to increase at the temperature at the time of culturing and hardly remain in the medium.
  • the number of carbons exceeds 30, the melting point / boiling point becomes high, so that it becomes a solid at the temperature at the time of culturing and tends to be separated without being mixed with the medium.
  • the melting point may not depend only on the number of carbons depending on the number of hydrogen bonds.
  • the fatty acid used in the present invention is preferably a liquid at 20 to 30 ° C. and more preferably a liquid at 20 ° C. from the viewpoint of metabolic efficiency and suppression of solidification in the medium.
  • the fatty acid of the present invention can be a saturated fatty acid, an unsaturated fatty acid, or a mixture containing both.
  • a free fatty acid (monocarboxylic acid) is preferable because it is excellent in a decomposition rate.
  • Free fatty acids having 4 to 30 carbon atoms include butyric acid (butyric acid), valeric acid (valeric acid), caproic acid, enanthic acid (heptylic acid), caprylic acid, pelargonic acid, capric acid, lauric acid, myristic acid, pentadecyl Acid, palmitic acid, palmitoleic acid, margaric acid, stearic acid, oleic acid, vaccenic acid, linoleic acid, ⁇ -linolenic acid, ⁇ -linolenic acid, eleostearic acid, arachidic acid, mead acid, arachidonic acid, behenic acid, Examples include lignoceric acid, nervonic acid, serotic acid, montanic acid, and melicic acid.
  • capric acid having 10 to 20 carbon atoms, lauric acid, myristic acid, pentadecylic acid, palmitic acid, palmitoleic acid, margaric acid, stearin Acid, oleic acid, vaccenic acid, linoleic acid, ⁇ -linolenic acid, ⁇ Linolenic acid, eleostearic acid, arachidic acid, mead acid, arachidonic acid are preferred, oleic acid having 18 carbon atoms, linoleic acid, alpha-linolenic acid, .gamma.-linolenic acid are more preferred.
  • the content of fatty acid is preferably 120 g / l or less, more preferably 100 g / l or less, and even more preferably 60 g / l or less. If it exceeds 120 g / l, emulsification with water in the medium becomes difficult, which may deteriorate metabolic efficiency and inhibit the growth of proteobacteria.
  • the lower limit of the fatty acid content is not particularly limited, but is preferably 1.0 g / l or more.
  • the medium containing fatty acid contains other mineral components.
  • a mineral component it is not specifically limited, The mineral component normally used for microorganism culture can be mentioned.
  • the component which has magnesium (Mg), phosphorus (P), sodium (Na), or potassium (K) is mentioned. These components can be used alone or in combination. Preferably two of these components may be used, more preferably three or more.
  • the content of the mineral component in the medium is not particularly limited, and can be the amount used in the conventional aerobic bacterium culture method, but since salt damage may occur during application to plants, preferably It can be used at 15 g / l or less, more preferably at 10 g / l or less.
  • proteobacteria used in the present invention is not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired. From the viewpoint of fatty acid metabolism efficiency and growth efficiency, proteobacteria having a temperature suitable for growth (optimum temperature) of 10 to 40 ° C. are preferred, and proteobacteria having 20 to 30 ° C. are more preferred.
  • the proteobacteria are preferably pre-cultured proteobacteria because they are excellent in fatty acid metabolic efficiency, and the number of bacteria is preferably pre-cultured to 1 ⁇ 10 8 to 9 ⁇ 10 10 cells / ml. preferable.
  • metabolism is performed in a dissolved oxygen concentration environment of 0.1 to 8 mg / l.
  • the dissolved oxygen concentration is less than 0.1 mg / l, the activity of proteobacteria tends to decrease and the metabolic efficiency of fatty acids tends to be extremely low.
  • the dissolved oxygen concentration exceeds 8 mg / l, in parallel with the metabolic process by proteobacteria, decomposition of the fatty acid as a substrate by oxygen in the medium proceeds, resulting in a decrease in metabolic efficiency, and consequently an active ingredient. There is a risk that the production amount of the metabolite is reduced.
  • the dissolved oxygen concentration is 0.1 to 5 mg / l, more preferably 0.1 to 4 mg / l.
  • the dissolved oxygen concentration is a value measured by a diaphragm galvanic electrode method or a diaphragm polarographic method on a PO electrode with a dissolved oxygen meter manufactured by HORIBA, Ltd.
  • the temperature in metabolism can be appropriately adjusted according to the proteobacteria used, and is preferably 20 to 30 ° C. from the viewpoint of fatty acid metabolic efficiency.
  • the insecticide may contain a biosurfactant in addition to the fatty acid metabolite.
  • Fatty acid metabolites are easily dispersed in water, which is considered preferable from the viewpoint of handling of insecticides.
  • the biosurfactant according to the present invention means a surfactant-like substance that is produced by a microorganism to take up a highly hydrophobic substance and secreted outside the cell.
  • the biosurfactant secreted by proteobacteria facilitates the dispersion of fatty acid metabolites in water, so that spray treatment of insecticides containing fatty acid metabolites can be performed efficiently and easily.
  • biosurfactants not only biosurfactants produced by the proteobacteria of the present invention at the time of fatty acid degradation, but also biosurfactants produced by other microorganisms may be used, that is, the insecticides of the present invention. Biosurfactants produced by other microorganisms may be further added. Compared to artificially synthesized surfactants, biosurfactants are less toxic to living organisms and are also more biodegradable, which may result in more environmentally friendly insecticides. In addition, in order to promote fatty acid degradation by proteobacteria, biosurfactants produced by other microorganisms may be added during fatty acid degradation by proteobacteria. Fatty acid uptake by proteobacteria may be promoted.
  • the insecticide of the present invention is an air-sealed insecticide with low soil contamination and toxicity but excellent insecticidal effect. Furthermore, when the insecticide of the present invention is applied to a plant, it can induce systemic acquired resistance to the plant to increase the expression level of the resistance gene, thereby allowing the plant to produce an insecticidal component against the pest. Moreover, since the insecticide of the present invention can express both upstream and downstream genes in both the salicylic acid pathway and the jasmonic acid pathway, it is considered that resistance induction persists and a sustained insecticidal effect is obtained. .
  • the insecticide of the present invention can be used to kill micro pests.
  • the micro pests include, but are not limited to, pests such as aphids such as cotton aphids, spider mites, scarabs, crabs, and wasps and / or their larvae.
  • the method of applying the insecticide of the present invention is not particularly limited. For example, it can be applied to pests, pested plants and / or soil. Moreover, the plant to be applied is not limited, and it can be used favorably for plants in general. Examples thereof include dicotyledonous plants such as eggplant, cucurbitaceae, and roseceae, and monocotyledonous plants such as gramineous.
  • the method for producing an insecticide containing a fatty acid metabolite of the present invention includes a fatty acid metabolism step of metabolizing a fatty acid having 4 to 30 carbon atoms to proteobacteria in a dissolved oxygen concentration environment of 0.1 to 8 mg / l. It is characterized by.
  • the fatty acid metabolism step is a step in which a fatty acid having 4 to 30 carbon atoms is decomposed by an enzyme or the like that is secreted or secreted by proteobacteria under a dissolved oxygen concentration environment of 0.1 to 8 mg / l.
  • an enzyme or the like that is secreted or secreted by proteobacteria under a dissolved oxygen concentration environment of 0.1 to 8 mg / l.
  • the dissolved oxygen concentration in the fatty acid metabolism process is 0.1 to 8 mg / l.
  • the dissolved oxygen concentration is less than 0.1 mg / l, the activity of proteobacteria tends to decrease and the metabolic efficiency of fatty acids tends to be extremely low.
  • the dissolved oxygen concentration exceeds 8 mg / l, in parallel with the metabolic process by proteobacteria, decomposition of the fatty acid as a substrate by oxygen in the medium proceeds, resulting in a decrease in metabolic efficiency, and consequently an active ingredient. There is a risk that the production amount of the metabolite is reduced.
  • the dissolved oxygen concentration is 0.1 to 5 mg / l, more preferably 0.1 to 4 mg / l.
  • the dissolved oxygen concentration is a value measured by a diaphragm galvanic electrode method or a diaphragm polarographic method on a PO electrode with a dissolved oxygen meter manufactured by HORIBA, Ltd.
  • the dissolved oxygen concentration can be adjusted by the culture vessel, the number of shakes, the amount of aeration, etc.
  • the culture conditions in the fatty acid metabolism step can be the same as the conventional conditions for culturing aerobic bacteria except that the dissolved oxygen concentration is within a predetermined range. Examples thereof include a method of culturing for 3 to 7 days by shaking with a flask and aeration culture with a spinner flask or a jar fermenter.
  • the number of days of culture is preferably the number of days during which the fatty acid is sufficiently emulsified and decomposed, but the number of days of culture varies depending on the agitation and the amount of bacteria.
  • the fatty acid decomposition state is determined by measuring the absorbance at a wavelength of 230 nm, thin layer chromatography (TLC), high performance liquid chromatography (HPLC), gas chromatography mass spectrometry (GC / MS), liquid chromatography. It is preferable to confirm by graph mass spectrometry (LC / MS) or the like.
  • the temperature in the fatty acid metabolism step can be appropriately adjusted according to the proteobacteria used, and it is preferable to carry out the treatment at 20 to 30 ° C. from the viewpoint of fatty acid metabolic efficiency.
  • fatty acid and proteobacteria in the fatty acid metabolism step those described above in the description of the insecticide of the present invention can be used.
  • the pre-culturing step for proteobacteria is not particularly limited, and a normal method for culturing aerobic bacteria can be used. It is preferable that only the cells are collected from the preculture solution by centrifugation or the like and used in the fatty acid metabolism step.
  • the insecticide obtained by the production method of the present invention can contain a biosurfactant in addition to a fatty acid metabolite.
  • the biosurfactant according to the present invention means a surfactant-like substance that is produced by a microorganism to take up a highly hydrophobic substance and secreted outside the cell.
  • the biosurfactant secreted by proteobacteria also facilitates the dispersion of fatty acid metabolites in water. It is thought that the handling property of the insecticide is improved.
  • the insecticide of the present invention can be obtained as a culture solution that is a mixture with a culture medium, a proteobacterial exocrine product containing a biosurfactant, microbial cells, and the like.
  • the culture solution may be used as it is as the insecticide of the present invention, or the supernatant obtained by removing the cells from the culture solution by centrifugation or the like may be used as the insecticide.
  • the culture solution can be used as it is, but when applied to plants with pests, if the solution is used as it is, the treated part of the plant will evaporate and concentrate due to osmotic pressure at high temperatures. It is desirable to dilute the stock solution for use.
  • the dilution factor is not particularly limited as long as the effect of the present invention is exhibited, but is preferably 10 to 1000 times diluted, more preferably 10 to 100 times diluted.
  • Preparation of insecticide for test ⁇ Pre-culture process> 20 g of peptone (Difco protein enzyme hydrolyzate), 1.5 g of magnesium sulfate heptahydrate and 1.5 g of dipotassium hydrogen phosphate in 1 l (liter) of water in a glass Erlenmeyer flask, or 1 l (liter) ) 10 g of peptone (Difco protein enzyme hydrolyzate), 5 g of yeast extract and 10 g of sodium chloride are dissolved in autoclaved water at 121 ° C. for 20 minutes, cooled to room temperature, Inoculated. The mouth of the culture vessel was sealed with a silicon stopper.
  • the inoculated container was cultured for 24 hours under the conditions of 25 ⁇ 5 ° C. and 120 rpm using a bioshaker (BR-23UM manufactured by Taitec Corporation).
  • the number of bacteria in the culture was 5 ⁇ 10 8 cells / ml.
  • the cells were collected from the culture solution by centrifuging the culture solution under conditions of 15,000 ⁇ G and 20 ° C.
  • ⁇ Fatty acid metabolism process In 1 l (liter) of sterilized water in a glass Erlenmeyer flask, 12 g of linoleic acid (primary linoleic acid manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 1.5 g of magnesium sulfate heptahydrate and / or dipotassium hydrogen phosphate 1 .5 g and the total amount of the cells obtained from the pre-culture step were added. This was cultured for 4 days under the conditions of 20 ° C., 120 rpm, and dissolved oxygen concentration of 4 mg / l using a bioshaker (BR-23UM manufactured by Taitec Corporation).
  • a bioshaker BR-23UM manufactured by Taitec Corporation
  • the degradation of linoleic acid involves measuring the concentration of oxidized lipid, which is one of linoleic acid intermediate products, in the culture solution using a spectrophotometer BioSpec-mini manufactured by Shimadzu Corporation at a wavelength of 230 nm. Confirmed by. The following evaluation was performed after culture
  • Example 1 A cucumber true leaf having a maximum length of 10 cm was cut into 2 cm squares, and 20 adult cotton aphids were fixed on the back of the leaf.
  • the test insecticide stock solution (Example 1) and its 10-fold and 100-fold dilutions (Examples 2 and 3) were sprayed onto the worm bodies at a spray amount of 190 ⁇ l / cm 2 .
  • Leaves and insects were placed in a petri dish, sprayed with the insecticide of the present invention, and the number of live and dead insects was measured 24 hours later. As a control, the insect body was sprayed with water, and the number of live and dead insects of the test insects was measured in the same manner.
  • Comparative examples 1-6 instead of the test pesticide, the existing air-sealed insecticide containing sodium oleate as an active ingredient (Comparative Example 1) and the air-sealed insecticide containing hydroxypropyl starch as an active ingredient (Comparative Example) 2) Insecticide containing pyrethrin as an active ingredient (Comparative Example 3), Insecticide containing acetamiprid as an active ingredient (Comparative Example 4), 1% solution of Surfactin sodium as a typical biosurfactant (Comparative Example 5) And the corrected mortality was determined in the same manner as in Examples 1 to 3 except that 1% SDS (Comparative Example 6) was used. The results are shown in FIG.
  • the insecticide of the present invention has an excellent insecticidal effect equivalent to that of conventional air-sealed insecticides, pyrethroids and acetamiprid insecticides.
  • Example 4 The moth larvae collected from roses cultivated outdoors were raised at about 25 ° C. for 48 hours, and then divided into three groups (less than 1.0 cm, 1.0 to 2.0 cm, and more than 2.0 cm) according to body length. . Rose leaves were placed in the petri dish, and one moth larvae from any one of the three groups was placed thereon. For each group, 4 (less than 1.0 cm long), 5 (length 1.0-2.0 cm), 5 (greater than 2.0 cm) moth larvae were used. A diluted solution obtained by diluting the test insecticide 30 times with water was sprayed on the worm body with a spray amount of 1.1 ml. The petri dish lid was closed and allowed to stand in the dark. After 24 hours, the moth larvae were observed for life and death, and the death rate was produced. As a control, moth larvae sprayed with water were similarly tested. The results are shown in Table 1.
  • the insecticide of the present invention has an excellent insecticidal effect, particularly a high insecticidal effect against micro pests.
  • insecticide of the present invention and the insecticide produced by the production method of the present invention are insecticides having low soil contamination and toxicity and excellent insecticidal effect.

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Abstract

土壌汚染や毒性が低く、殺虫効果に優れた殺虫剤、およびその製造方法を提供する。炭素数４～３０の脂肪酸を０．１～８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させることで得られる脂肪酸代謝物を含む殺虫剤、および炭素数４～３０の脂肪酸を０．１～８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させる脂肪酸代謝工程を含む、脂肪酸代謝物を含む殺虫剤の製造方法。

Description

殺虫剤および殺虫剤の製造方法
　本発明は、殺虫剤および殺虫剤の製造方法に関する。
　従来より、植物害虫に対し殺虫を目的として、除虫菊の有効成分であるピレトリン、そしてピレトリンの誘導体由来のアレスリンなどの合成ピレスロイドなどをはじめとした薬剤が使用されてきた。ピレスロイド類は、哺乳類や鳥類に対する毒性は低い一方、昆虫類の神経細胞に強力に作用して神経毒をもたらし殺虫する。また、近年では昆虫類の神経伝達物質アセチルコリン受容体に結合することで殺虫するネオニコチノイド系殺虫剤も広範囲に殺虫剤として使用されている。
　しかしながら、このような虫にとって一般的に毒となる成分を用いて直接殺虫する殺虫方法では、受粉などに必要な有益昆虫や天敵虫も一様に殺虫してしまうという問題がある。生態系の乱れが懸念される。また、ネオニコチノイドのように植物への浸透移行性などにより残効が長い殺虫剤では、有益昆虫が長期にわたって影響を受けてしまう恐れもある。さらに、過多の農薬散布による殺虫剤耐性虫の発生も問題となっている。土壌汚染などの環境への負荷の観点からも、化学合成農薬の使用量の削減が望まれている。
　一方、虫に対する毒ではなく、オレイン酸や脂肪酸エステル、合成でんぷんなどを有効成分とした気門封鎖系の殺虫剤の使用も知られている。気門封鎖型殺虫剤は、害虫の気門を塞ぎ、窒息させることで効果を発揮するため、大型の有益昆虫類を殺虫するリスクや薬剤耐性虫を発生させるリスクが少ないと考えられている。
　また、害虫を忌避する方法や化学合成農薬を使用せずに天然物質に由来する薬剤を用いて植物を病害虫から防除する方法などの対策が報告されている。天然物質に由来する薬剤としては、例えば、特許文献１には、微生物バイオサーファクタントが記載されている。
特表２００８－５０１０３９号公報
　特許文献１には、バイオサーファクタントとして、ラムノリピドを含有させた発酵ブロス濾液を用いた病害虫を防除する方法が開示されており、これをイエバエや線虫を防除するための殺虫剤として使用することが記載されている。しかしながら、特許文献１に記載の薬剤では、蛾の幼虫のような大型の害虫まで殺虫できないという問題があった。
　本発明は、前記課題に鑑み、土壌汚染や毒性が低く、殺虫効果に優れた殺虫剤、およびその製造方法を提供することを目的とする。
　本発明は、炭素数４～３０の脂肪酸を０．１～８ｍｇ／ｌ（リットル）の溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させることで得られる脂肪酸代謝物を含む殺虫剤に関する。
　前記脂肪酸が、２０℃で液体の脂肪酸である殺虫剤が好ましい。
　前記代謝が、Ｍｇ、Ｐ、ＮａおよびＫから選ばれる少なくとも１種以上のミネラルの存在下での代謝である殺虫剤が好ましい。
　前記プロテオバクテリアが、前培養されたプロテオバクテリアである殺虫剤が好ましい。
　前記前培養されたプロテオバクテリアが、菌数１×１０8～９×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（ミリリットル）に前培養されたプロテオバクテリアである殺虫剤が好ましい。
　前記殺虫剤が、バイオサーファクタントを含む殺虫剤であることが好ましい。
　前記代謝が、２０～３０℃の条件下での代謝である殺虫剤が好ましい。
　また、本発明は、炭素数４～３０の脂肪酸を０．１～８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させる脂肪酸代謝工程を含む、脂肪酸代謝物を含む殺虫剤の製造方法に関する。
　前記脂肪酸が、２０℃で液体の脂肪酸である殺虫剤の製造方法が好ましい。
　前記脂肪酸代謝工程を、Ｍｇ、Ｐ、ＮａおよびＫから選ばれる少なくとも１種以上のミネラルの存在下で実施する殺虫剤の製造方法が好ましい。
　前記プロテオバクテリアが、前培養されたプロテオバクテリアである殺虫剤の製造方法が好ましい。
　前記前培養されたプロテオバクテリアが、菌数１×１０8～９×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌに前培養されたプロテオバクテリアである殺虫剤の製造方法が好ましい。
　バイオサーファクタントを含む殺虫剤の製造方法である殺虫剤の製造方法が好ましい。
　前記脂肪酸代謝工程を、２０～３０℃の条件下で実施する殺虫剤の製造方法が好ましい。
　本発明の殺虫剤は、土壌汚染や毒性が低く、殺虫効果に優れる。また、本発明の殺虫剤の製造方法によれば、土壌汚染や毒性が低く、殺虫効果に優れる殺虫剤を製造することができる。
ワタアブラムシ成虫に対する殺虫効果を示すグラフである。
殺虫剤
　本発明の殺虫剤は、炭素数４～３０の脂肪酸を０．１～８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させることで得られる脂肪酸代謝物を含むことを特徴とする。
　脂肪酸代謝物を害虫に接触させることで、害虫、特には微小害虫を気門封鎖によって殺虫することができる。本発明の殺虫剤は、殺虫剤に対する薬剤抵抗性を獲得しやすいような世代交代が早い微小害虫や、従来の殺虫剤に対する薬剤抵抗性を発達させた害虫にも有効であると考えられる。かつ脂肪酸代謝物は、化学合成農薬と比べその毒性が遥かに低い。また、脂肪酸代謝物を植物に施用した場合、トライコーム等の発達が確認できることから、脂肪酸代謝物は、感染特異的タンパク質（pathogenesis-related (PR) protein）の生成に関与する遺伝子群やサリチル酸またはジャスモン酸を生成する酵素産生に関わる遺伝子群などを活性化して、植物に全身獲得抵抗性を誘導していると考えられる。これは、脂肪酸代謝物中に抵抗性誘導に関係するサリチル酸経路やジャスモン酸経路を活性化する物質またはこの物質の前駆体が含まれていることによると考えられる。
　本発明における代謝とは、０．１～８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下においてプロテオバクテリアが外分泌または内分泌する酵素等により炭素数４～３０の脂肪酸の分解が行われることをいう。例えば、０．１～８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下、脂肪酸を含有する培地でプロテオバクテリアを培養する方法が挙げられる。
　プロテオバクテリアは、脂肪酸の代謝に関わる酵素であるリポキシゲナーゼ（lipoxygenase：ＬＯＸ）を産生する遺伝子を持っており、脂肪酸代謝物を生成できる。
　酸素濃度の調整によって、脂肪酸が低分子化される。そして、バイオサーファクタントと脂肪酸代謝物との混合物によるミセルが形成され、ミセル状になることで比較的大型の害虫にも殺虫作用が有効になったものと推定される。ミセルはバイオサーファクタントだけでは形成されない。このため、特表２００８－５０１０３９号公報記載の技術では理論上ミセルは形成されないため、本発明の効果は生じ得ない。
　本発明にて用いられる脂肪酸の炭素数は４～３０であり、１０～２０が好ましい。炭素数が４未満の場合は、融点・沸点が低いため、培養時の温度で揮発性が高まり培地中に残存しにくくなる傾向がある。また、炭素数が３０を超える場合は、融点・沸点が高くなるため、培養時の温度で固体となり培地と混合できず分離してしまう傾向がある。ただし、融点は水素結合の数によって炭素数のみに依存しない場合もある。
　本発明において用いられる脂肪酸は、代謝効率の観点や培地中で固化することを抑制する観点から、２０～３０℃で液体であることが好ましく、２０℃で液体であることがより好ましい。
　本発明の脂肪酸は、飽和脂肪酸もしくは不飽和脂肪酸のいずれか、または両方を含む混合物とすることができる。また、植物油やグリセリドの形態や遊離脂肪酸を用いることができるが、分解速度に優れるという理由から遊離脂肪酸（モノカルボン酸）が好ましい。
　炭素数４～３０の遊離脂肪酸としては、酪酸（ブチル酸）、吉草酸（バレリアン酸）、カプロン酸、エナント酸（ヘプチル酸）、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、α－リノレン酸、γ－リノレン酸、エレオステアリン酸、アラキジン酸、ミード酸、アラキドン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ネルボン酸、セロチン酸、モンタン酸、メリシン酸などが挙げられ、なかでも炭素数が１０～２０のカプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、α－リノレン酸、γ－リノレン酸、エレオステアリン酸、アラキジン酸、ミード酸、アラキドン酸が好ましく、炭素数が１８のオレイン酸、リノール酸、α－リノレン酸、γ－リノレン酸がより好ましい。
　脂肪酸を含有する培地を使用する場合の脂肪酸の含有量は、１２０ｇ／ｌ以下が好ましく、１００ｇ／ｌ以下がより好ましく、６０ｇ／ｌ以下がさらに好ましい。１２０ｇ／ｌを超える場合は、培地の水分との乳化が困難となり、代謝効率が悪化する恐れやプロテオバクテリアの生育を阻害する恐れがある。また、脂肪酸の含有量の下限は特に限定されないが、１．０ｇ／ｌ以上が好ましい。
　脂肪酸を含有する培地は、他にミネラル成分を含有することが好ましい。ミネラル成分としては、特に限定されず微生物培養に通常用いられるミネラル成分を挙げることができる。例えば、マグネシウム（Ｍｇ）、リン（Ｐ）、ナトリウム（Ｎａ）またはカリウム（Ｋ）を有する成分が挙げられる。これらの成分は単独で使用することも、複数を併用することもできる。好ましくはこれらの成分のうちの２種類、さらに好ましくは３種類以上が使用され得る。培地中のミネラル成分の含有量は特に限定されず、従来の好気性細菌の培養方法で使用される量とすることができるが、植物への施用時に塩害が発生する恐れがあるため、好ましくは１５ｇ／ｌ以下、より好ましくは１０ｇ／ｌ以下で使用され得る。
　本発明にて用いられるプロテオバクテリアは、本発明の効果を損なわない限り特に限定されない。好ましくは脂肪酸の代謝効率や生育効率の観点から、増殖に適した温度（至適温度）が１０～４０℃のプロテオバクテリアが好ましく、２０～３０℃のプロテオバクテリアがより好ましい。
　プロテオバクテリアは、脂肪酸の代謝効率に優れるという理由から、前培養されたプロテオバクテリアであることが好ましく、菌数が１×１０8～９×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌまで前培養されていることがより好ましい。
　本発明においては、前述のように、代謝は、０．１～８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下で行われる。溶存酸素濃度が０．１ｍｇ／ｌ未満の場合は、プロテオバクテリアの活動が低下し脂肪酸の代謝効率が極めて低くなる傾向がある。また、溶存酸素濃度が８ｍｇ／ｌを超える場合は、プロテオバクテリアによる代謝工程と並行して、基質である脂肪酸の培地中の酸素による分解が進行してしまい、代謝効率が低下し、ひいては有効成分である代謝産物の産生量が低下してしまう恐れがある。より好ましくは、溶存酸素濃度は０．１～５ｍｇ／ｌであり、さらに好ましくは０．１～４ｍｇ／ｌである。なお、溶存酸素濃度は株式会社堀場製作所製の溶存酸素計でＰＯ電極に隔膜ガルバニ電極法または隔膜ポーラログラフ法により測定される値とする。
　代謝における温度は使用するプロテオバクテリアに応じて適宜調整することができ、脂肪酸の代謝効率の観点から、２０～３０℃が好ましい。
　本発明において、殺虫剤は、脂肪酸代謝物に加えバイオサーファクタントを含有し得る。脂肪酸代謝物が水に分散されやすくなり、殺虫剤の取扱性の観点から好ましいと考えられる。本発明に係るバイオサーファクタントとは、微生物が疎水性の高い物質を取り込むために産生し、細胞外へと分泌する界面活性剤様の物質を意味する。本発明において、プロテオバクテリアによって分泌されたバイオサーファクタントは、脂肪酸代謝物の水への分散も容易にするため、脂肪酸代謝物を含む殺虫剤の噴霧処理などが効率よく簡単に行えるようになる。しかしながら、バイオサーファクタントとしては、脂肪酸の分解時に本発明のプロテオバクテリアによって産生されたバイオサーファクタントだけではなく、他の微生物が産生したバイオサーファクタントが使用されてもよく、すなわち、本発明の殺虫剤には他の微生物によって産生されたバイオサーファクタントがさらに添加されてもよい。人工的に合成された界面活性剤と比較して、バイオサーファクタントは生物に関する毒性が低く、また、生分解性も高いため、より環境に優しい殺虫剤が得られると考えられる。また、プロテオバクテリアによる脂肪酸分解を促進させるために、他の微生物が産生したバイオサーファクタントが、プロテオバクテリアによる脂肪酸分解において添加されてもよい。プロテオバクテリアによる脂肪酸の取り込みが促進される可能性がある。
　本発明の殺虫剤は、土壌汚染や毒性は低いが、殺虫効果には優れる気門封鎖型殺虫剤である。さらに、本発明の殺虫剤は、植物に施用された場合に、植物に全身獲得抵抗性を誘導して抵抗性遺伝子発現量を増加させ、害虫に対する殺虫成分を植物に産生させることができる。しかも、本発明の殺虫剤は、サリチル酸経路およびジャスモン酸経路ともに、上流および下流の遺伝子の両方を発現させることができるので、抵抗性誘導が持続し、持続的な殺虫効果が得られると考えられる。
　本発明の殺虫剤は、微小害虫を殺虫するために用いられ得る。微小害虫としては、これらに限定される訳ではないが、ワタアブラムシなどのアブラムシ科、ハダニ科、コガネムシ科、ヤガ科、ハバチ科などの害虫および／またはその幼虫が例示される。
　本発明の殺虫剤の施用方法としては特に限定されない。例えば、害虫、害虫のついた植物および／または土壌に施用することが可能である。また、施用される植物も限定されるものではなく、植物一般に対して良好に用いることができる。例えば、ナス科、ウリ科、バラ科などの双子葉類植物、イネ科などの単子葉類植物が挙げられる。
製造方法
　本発明の脂肪酸代謝物を含む殺虫剤の製造方法は、炭素数４～３０の脂肪酸を０．１～８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させる脂肪酸代謝工程を含むことを特徴とする。
　本発明における脂肪酸代謝工程は、０．１～８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下においてプロテオバクテリアが外分泌または内分泌する酵素等により炭素数４～３０の脂肪酸の分解が行われる工程である。例えば、０．１～８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下、脂肪酸を含有する培地でプロテオバクテリアを培養することにより行われる工程が挙げられる。
　脂肪酸代謝工程における溶存酸素濃度は、０．１～８ｍｇ／ｌである。溶存酸素濃度が０．１ｍｇ／ｌ未満の場合は、プロテオバクテリアの活動が低下し脂肪酸の代謝効率が極めて低くなる傾向がある。また、溶存酸素濃度が８ｍｇ／ｌを超える場合は、プロテオバクテリアによる代謝工程と並行して、基質である脂肪酸の培地中の酸素による分解が進行してしまい、代謝効率が低下し、ひいては有効成分である代謝産物の産生量が低下してしまう恐れがある。より好ましくは、溶存酸素濃度は０．１～５ｍｇ／ｌであり、さらに好ましくは０．１～４ｍｇ／ｌである。なお、溶存酸素濃度は株式会社堀場製作所製の溶存酸素計でＰＯ電極に隔膜ガルバニ電極法または隔膜ポーラログラフ法により測定される値とする。
　溶存酸素濃度は、培養容器、振とう数、通気量などによって、調整することができる。
　脂肪酸代謝工程における培養条件は、溶存酸素濃度を所定の範囲とすること以外は、従来の好気性細菌を培養する条件と同様の条件とすることができる。例えば、フラスコによる振とうや、スピナーフラスコまたはジャーファメンターによる通気培養により３～７日間培養する方法が挙げられる。
　培養日数は、脂肪酸の乳化、分解等が充分に行われる日数とすることが好ましいが、撹拌や菌量によって培養日数は変化する。なお、脂肪酸代謝工程の終了は、脂肪酸の分解状態を、波長２３０ｎｍにおける吸光度の測定、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣ／ＭＳ）、液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ／ＭＳ）等で確認することが好ましい。
　脂肪酸代謝工程における温度は使用するプロテオバクテリアに応じて適宜調整することができ、脂肪酸の代謝効率の観点から、２０～３０℃の条件下で実施することが好ましい。
　脂肪酸代謝工程における脂肪酸およびプロテオバクテリアは、本発明の殺虫剤の説明で前述したものを使用することができる。
　なお、プロテオバクテリアの前培養工程としては、特に限定されず通常の好気性細菌の培養方法とすることができる。前培養液から遠心分離等により菌体のみを回収し、脂肪酸代謝工程に用いることが好ましい。
　本発明の製造方法により得られる殺虫剤は、脂肪酸代謝物に加えバイオサーファクタントを含有し得る。本発明に係るバイオサーファクタントとは、微生物が疎水性の高い物質を取り込むために産生し、細胞外へと分泌する界面活性剤様の物質を意味する。本発明において、プロテオバクテリアによって分泌されたバイオサーファクタントは、脂肪酸代謝物の水への分散も容易にする。殺虫剤の取扱性が向上すると考えられる。
　本発明の殺虫剤は、培地、バイオサーファクタントを含むプロテオバクテリアの外分泌物、菌体などとの混合物である培養液として得られる。当該培養液をそのまま本発明の殺虫剤としてもよく、培養液から遠心分離などにより菌体を除去した上澄み液を殺虫剤としてもよい。培養液は原液のままでも使用することができるが、害虫のついた植物に施用する場合、原液のまま用いると高温時に植物への処理部分が、ミネラル分が蒸発濃縮され浸透圧の影響で縮む恐れがあるため、原液を希釈して使用することが望ましい。希釈倍率としては本発明の効果を発揮する限り特に限定されないが、１０～１０００倍希釈が好ましく、１０～１００倍希釈がさらに好ましい。なお、除去した菌体を再度、脂肪酸を含有する培地で培養することにより本発明の脂肪酸代謝工程を繰り返し行うことが可能である。
　本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものではない。
試験用殺虫剤の調製
＜前培養工程＞
　ガラス製三角フラスコ内の１ｌ（リットル）の水にペプトン（Ｄｉｆｃｏ製のタンパク質酵素加水分解物）２０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物１．５ｇおよびリン酸水素二カリウム１．５ｇ、または、１ｌ（リットル）の水にペプトン（Ｄｉｆｃｏ製のタンパク質酵素加水分解物）１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇおよび塩化ナトリウム１０ｇを溶解させ、１２１℃、２０分間オートクレーブ滅菌を行い、室温まで冷却後、プロテオバクテリアの菌液を植菌した。なお、培養容器の口はシリコン栓で密栓した。植菌後の容器をバイオシェーカー（タイテック株式会社製のＢＲ－２３ＵＭ）を用い、２５±５℃、１２０ｒｐｍの条件下で、２４時間培養を行った。培養液中の菌数は５×１０8ｃｅｌｌｓ／ｍｌであった。培養後、培養液を１５，０００×Ｇ、２０℃の条件で遠心分離することで培養液から菌体を回収した。
＜脂肪酸代謝工程＞
　ガラス製三角フラスコ内の１ｌ（リットル）の滅菌水に、リノール酸（和光純薬工業株式会社製の一級リノール酸）１２ｇ、硫酸マグネシウム七水和物１．５ｇおよび／またはリン酸水素二カリウム１．５ｇ、および前培養工程から得られた菌体の全量を加えた。これを、バイオシェーカー（タイテック株式会社製のＢＲ－２３ＵＭ）を用い、２０℃、１２０ｒｐｍ、溶存酸素濃度４ｍｇ／ｌの条件下で、４日間培養を行った。なお、リノール酸の分解は、リノール酸中間生成物の１つである酸化脂質の培養液中の濃度を株式会社島津製作所製の分光光度計ＢｉｏＳｐｅｃ－ｍｉｎｉを用いて波長２３０ｎｍにおける吸光度を測定することによって、確認した。培養後、菌体を含む培養液を試験用殺虫剤とし、下記の評価を行った。
ワタアブラムシ成虫に対する殺虫効果
・実施例１～３
　最大長さ１０ｃｍのキュウリの本葉を２ｃｍ四方に切り取り、その葉裏にワタアブラムシ成虫２０頭を定着させたものを準備した。試験用殺虫剤の原液（実施例１）ならびにその１０倍および１００倍希釈液（実施例２および３）を、噴霧量１９０μｌ／ｃｍ2で虫体に噴霧した。シャーレの中に葉と虫を載置し、本発明の殺虫剤を噴霧し、２４時間後に、生存虫数、死虫数を測定した。対照として、虫体に水を噴霧し、同様に供試虫の生存虫数、死虫数を測定した。以下の式に基づいて補正死虫率を求めた。
　補正死虫率（％）＝｛（対照における生存虫率－処理後の生存虫率）／対照における生存虫率｝×１００
ここで、補正死虫率が高いものほど殺虫効果が高かったことを示している。結果を図１に示す。
・比較例１～６
　試験用殺虫剤に替えて、既存の、オレイン酸ナトリウムを有効成分として含有する気門封鎖型殺虫剤（比較例１）、ヒドロキシプロピルデンプンを有効成分として含有する気門封鎖型殺虫剤（比較例２）、ピレトリンを有効成分とする殺虫剤（比較例３）、アセタミプリドを有効成分とする殺虫剤（比較例４）、代表的なバイオサーファクタントであるサーファクチンナトリウムの１％溶液（比較例５）、および、１％ＳＤＳ（比較例６）を用いたこと以外は実施例１～３と同様に処理して補正死虫率を求めた。結果を図１に示す。
　図１に示されるように、希釈なしの試験用殺虫剤（原液）で処理した場合、補正死虫率は１００％であり、既存殺虫剤と同等である補正死虫率を示した。したがって、本発明の殺虫剤が、従来の気門封鎖型殺虫剤やピレスロイド系およびアセタミプリド系の殺虫剤と同等の優れた殺虫効果を有していることがわかる。
ガ幼虫に対する殺虫効果
・実施例４
　屋外で栽培中のバラより採取したガ幼虫を約２５℃で４８時間飼育した後、体長別に３つの群（１．０ｃｍ未満、１．０～２．０ｃｍ、２．０ｃｍより大きい）に分けた。シャーレ内にバラの葉を置き、その上に３つの群のうちのいずれか一つの群のガ幼虫１頭を置いた。各群につきそれぞれ４頭（体長１．０ｃｍ未満）、５頭（体長１．０～２．０ｃｍ）、５頭（体長２．０ｃｍより大きい）のガ幼虫を用いた。試験用殺虫剤を水で３０倍に希釈した希釈液を１．１ｍｌの噴霧量で虫体に噴霧した。シャーレの蓋を閉じて暗所で静置し、２４時間後に、ガ幼虫の生死を観察し、死虫率を産出した。対照として、ガ幼虫に水を噴霧したものを同様に試験した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示されるように、試験用殺虫剤の３０倍希釈液を噴霧した場合、２０％～１００％の死虫率を示し、水を噴霧した場合よりも高い死虫率を示した。特に、体長１．０ｃｍ未満の幼齢幼虫では、死虫率は１００％であり、高い殺虫効果が確認された。したがって、本発明の殺虫剤が優れた殺虫効果、とりわけ微小害虫に対する高い殺虫効果を有していることがわかる。
　上記の結果より、本発明の殺虫剤および本発明の製造方法により製造される殺虫剤が、土壌汚染や毒性が低く、殺虫効果に優れた殺虫剤であることがわかる。

Claims (14)

  1. 炭素数４～３０の脂肪酸を０．１～８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させることで得られる脂肪酸代謝物を含む殺虫剤。
  2. 前記脂肪酸が、２０℃で液体の脂肪酸である請求項１記載の殺虫剤。
  3. 前記代謝が、Ｍｇ、Ｐ、ＮａおよびＫから選ばれる少なくとも１種以上のミネラルの存在下での代謝である請求項１または２記載の殺虫剤。
  4. 前記プロテオバクテリアが、前培養されたプロテオバクテリアである請求項１～３のいずれか１項に記載の殺虫剤。
  5. 前記前培養されたプロテオバクテリアが、菌数１×１０8～９×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌに前培養されたプロテオバクテリアである請求項４記載の殺虫剤。
  6. バイオサーファクタントを含む請求項１～５のいずれか１項に記載の殺虫剤。
  7. 前記代謝が、２０～３０℃の条件下での代謝である請求項１～６のいずれか１項に記載の殺虫剤。
  8. 炭素数４～３０の脂肪酸を０．１～８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させる脂肪酸代謝工程を含む、脂肪酸代謝物を含む殺虫剤の製造方法。
  9. 前記脂肪酸が、２０℃で液体の脂肪酸である請求項８記載の殺虫剤の製造方法。
  10. 前記脂肪酸代謝工程を、Ｍｇ、Ｐ、ＮａおよびＫから選ばれる少なくとも１種以上のミネラルの存在下で実施する請求項８または９記載の殺虫剤の製造方法。
  11. 前記プロテオバクテリアが、前培養されたプロテオバクテリアである請求項８～１０のいずれか１項に記載の殺虫剤の製造方法。
  12. 前記前培養されたプロテオバクテリアが、菌数１×１０8～９×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌに前培養されたプロテオバクテリアである請求項１１記載の殺虫剤の製造方法。
  13. バイオサーファクタントを含む殺虫剤の製造方法である請求項８～１２のいずれか１項に記載の殺虫剤の製造方法。
  14. 前記脂肪酸代謝工程を、２０～３０℃の条件下で実施する請求項８～１３のいずれか１項に記載の殺虫剤の製造方法。
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