MICROALGUE MODIFIÉE POUR UNE PRODUCTION ENRICHIE EN TAG DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne une microalgue génétiquement modifiée par inhibition de l'activité de l'enzyme élongase-ΔΟ (ou ΔΟ-ELO), ayant pour substrat l'acide palmitique, un acide gras saturé, et associée à la production de MGDG (Mono-Galactosyl-Diacyl-Glycerol). Elle concerne également un procédé de culture de ladite microalgue pour une production enrichie en TAG (Tri-Acyl-Glycerols) et la récupération desdits TAG.
ETAT DE LA TECHNIQUE
Les voies de synthèse des acides gras à longue chaîne polyinsaturées ont été étudiées et sont connues de l'homme du métier pour les plantes et les microalgues. Elles consistent généralement en la synthèse d'acide oléique, un acide gras en C18 porteur d'une double liaison (18:1 ), et d'acide linoléique (18:2), sous forme de thioesters avec le Coenzyme A, puis, en une série d'élongations avec création d'insaturations par l'action alternée d'élongases et de désaturases. Plusieurs élongases actives sur des acides gras désaturés (contenant des doubles liaisons) ont été décrites dans l'état de la technique (Cook and Hildebrand, 2015; Jung et al., 2007; Kihara, 2012; Lee et al., 2006; Ramakrishnan et al., 2012; Tehlivets et al., 2007). Des élongases de Nannochloropsis, actives sur des acides gras désaturés sont également décrites dans le brevet US 8,809,046.
Agir sur l'expression des enzymes impliquées dans la biosynthèse d'acides gras (poly)insaturés dans les plantes ou les microalgues pour moduler cette biosynthèse est également connu de l'homme du métier. On citera notamment la demande de brevet WO 96/21022 pour la synthèse d'acide gamma-linolénique,
La demande WO 2014/207043 décrit la préparation de microalgues génétiquement modifiées par KO (knock-out) de certains gènes. L'emploi d'une TALE-Nuclease pour la mutagénèse ciblée de gènes dans les microalgues est décrit. Plusieurs exemples de ciblage de gènes sont donnés, notamment le ciblage d'une élongase A6-ELO, active sur un acide gras porteur d'une double liaison en position Δ6.
Dans cette demande, les auteurs affirment obtenir une augmentation des TAG
en inhibant l'expression d'une élongase ΔΘ-ELO mais restent silencieux sur leur capacité à cultiver les clones obtenus dans la durée. L'augmentation des TAG affirmée dans la demande WO 2014/207043 s'accompagne également d'une inhibition de la croissance cellulaire.
Or, pour une exploitation industrielle des microalgues en vue de la production d'acides gras insaturés et de TAG, il faut également pouvoir disposer de souches capables d'assurer une bonne croissance cellulaire pour produire de la biomasse riche en TAG. L'homme du métier cherche donc à disposer de souches génétiquement modifiées qui permettent d'augmenter la production de TAG sans affecter leur croissance.
EXPOSE DE L'INVENTION
La présente invention concerne des microalgues génétiquement modifiées dans lesquelles l'activité élongase ΔΟ-ELO est inhibée.
L'invention concerne en particulier des microalgues génétiquement modifiées choisies parmi les microalgues comprenant des organelles à activité photosynthétique, notamment des genres Crypthecodinium, Chlorella, Cyclotella, Euglena, Haematococcus, Isochrysis, Monodus, Nanochloris, Nannochloropsis, Nitzschia, Odontella, Phaeodactylum, Scenedesmus, Tetraselmis, et Thalassiosira.
De manière préférée, l'invention concerne des microalgues pour lesquelles l'activité élongase ΔΟ-ELO est multigénique, et plus préférentiellement lorsque seule l'activité de l'élongase ΔΟ-ELO associée à la production de MGDG est inhibée.
L'invention concerne également un procédé de production d'une biomasse enrichie en TAG qui comprend la culture de microalgues génétiquement modifiées selon l'invention sur un milieu de culture approprié pour favoriser la croissance et la multiplication des cellules des microorganismes. L'invention concerne aussi un procédé de production de TAG qui comprend l'obtention de la biomasse enrichie en TAG et l'isolation des TAG ainsi produits. DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 représente la voie reconstruite de biosynthèse des acides gras polyinsaturés à très longue chaîne chez Nannochloropsis gaditana. La synthèse des acides gras dans le chloroplaste peut générer des précurseurs 16:0 (acide
palmitique), 18:0 (acide stéarique) et 18:1 (acide oléique) qui sont exportés dans le cytosol. La désaturation du 18:0 en 18:1 peut se faire soit par une désaturase chloroplastique stearoyl-acp A9-desaturase (SAD) ou une A9-désaturase du réticulum endoplasmique (ERA9FAD). Huit gènes candidats codant pour des élongases et six gènes codant pour des désaturases ont été identifiés dans le génome de N. gaditana. Les élongases identifiées comme capables de transformer un substrat saturé 16:0 sont désignées ΔΟ-ELO. Les élongases identifiées comme capables de transformer un substrat insaturé avec une double liaison en position Δ6 (18:3) sont désignées ΔΘ-ELO. Celles identifiées comme capables de transformer un substrat insaturé avec une double liaison en position Δ5 (20:5) sont désignées Δ5- ELO.
La Figure 2 représente les séquences de six élongases d'acides gras saturés ΔΟ-ELO de Nannochloropsis gaditana : Naga_100083g23 (SEQ ID NO 1 ), Naga_100162g4 (SEQ ID NO 2), Naga_100004g 102 (SEQ ID NO 3), Naga_100399g1 (SEQ ID NO 4), Naga_100162g5 (SEQ ID NO 5) et Naga_100017g49 (SEQ ID NO 6).
La Figure 3 représente l'arbre phylogénétique d'élongases d'acides gras putatives ou identifiées dans la littérature comme telles de groupes représentatifs des eukaryotes. Les séquences sélectionnées couvrent la biodiversité des eukaryotes, dont les Opisthokontes, e.g. Fungi (Saccharomyces) et Metazoa (Drosophila, Musca, Apis, Bombus, Caenorhabditis, Homo, Mus, Gallus), Heterokontes (Phaeodactylum, Thalassiosira, Ectocarpus, Phytophthora, Albugo, Saprolegnia, Aphanomyces), Apicomplexa (Toxoplasma, Neospora, Eimeria, Cryptosporidium, Plasmodium, Gregarina), Haptophytes (Emiliania), Cryptomonads (Guillardia) et Kinetoplastida (Trypanosoma, Leishmania). Les séquences d'acides aminés ont été alignées avec le programme MUSCLE et l'arbre phylogénétique construit par la method Neighbor-Joining. Une étoile indique les séquences caractérisées ou proposées comme élongases dans la littérature (Cook and Hildebrand, 2015; Jung et al., 2007; Kihara, 2012; Lee et al., 2006; Ramakrishnan et al., 2012; Tehlivets et al., 2007).
La Figure 4 représente la séquence en acides aminés de l'élongase NgAO- ELO1 (Naga_100083g23). Les motifs caractéristiques des élongases ont été identifiés suivant (Dénie and Weissman, 2007) et (Hashimoto et al., 2008) : un motif
HxxHH dans un environnement riche en arginines (R) et lysines (K) est essentiel à l'activité 3-ketoacyl-CoA synthase pour l'élongation des acides gras saturés ou monoinsaturés ; un motif LYF présent également dans les séquences d'élongases de levures de la superfamille Fenl p qui accepte des acides gras avec une chaîne acyle de 18 à 24 atomes de carbone comme substrats ; un signal de rétention dans le réticulum endoplasmique associée à un motif riche en K dans la partie C-terminale (Jackson et al., 1990) ; sept domaines transmembranaires (PM) prédits avec le serveur TMHMM Server v. 2.0 (www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM).
La Figure 5 représente un alignement de la séquence d'élongase de Nannochloropsis gaditana Naga_100083g23 avec une ΔΟ-élongase de Phaeodactylum (SEQ ID NO 7) avec la méthode Smith-Waterman avec matrice de comparaison Blossum 62 (Rice et al., 2000) : Matrice: EBLOSUM62, "Gap_penalty": 10.0, "Extend_penalty": 0.5, Longueur: 287, Identité: 123/237 (51 ,9%), Similarité: 161/237 (67,9%), Gaps: 2/237 (0,8%), Score: 690,5.
La Figure 6 représente un alignement de la séquence d'élongase de
Nannochloropsis gaditana Naga_100083g23 avec une ΔΟ-élongase de Thalassiosira (SEQ ID NO 8) avec la méthode Smith-Waterman avec matrice de comparaison Blossum 62 (Rice et al., 2000) : Matrice: EBLOSUM62, "Gap_penalty": 10.0, Extend_penalty ": 0.5, Longueur: 237, Identité: 135/287 (47,0%), Similarité: 178/287 (62,0%), Gaps: 16/287 (5,6%), Score: 713,5.
La Figure 7 représente l'analyse globale en acides gras de lignées de Nannochloropsis gaditana sauvage (WT) et transformée par KO du gène de l'élongase NgA0-ELO1 (NgA0-ELO1 -KO).
La Figure 8 représente le profil en glycérolipides de lignées de Nannochloropsis gaditana sauvage (WT) et transformée par KO du gène de l'élongase NgA0-ELO1 (NgA0-ELO1 -KO) : phosphatidylglycerol (PG), monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG), diacylglyceryltrimethylhomoserine (DGTS), lyso-DGTS (LDGTS), (PC), phosphatidylinositol (PI), phosphatidylethanolamine (PE), t acylglycerol (TAG) and diacylglycerol (DAG).
La Figure 9 représente la croissance et la biomasse obtenue par la culture de lignées de Nannochloropsis gaditana sauvage (WT) et transformée par KO du gène de l'élongase NgA0-ELO1 (NgA0-ELO1 -KO).
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention concerne des microalgues génétiquement modifiées dans lesquelles l'activité élongase ΔΟ-ELO est inhibée. Les élongases ΔΟ-ELO sont celles qui acceptent un acide gras saturé comme substrat, particulièrement l'acide palmitique. Les microalgues selon l'invention permettent de produire plus de TAG que les microalgues correspondantes dont l'activité élongase n'est pas inhibée (figure 8) tout en ayant des propriétés de croissance et de production de biomasse qui ne sont pas substantiellement affectées par rapport à la souche correspondante non modifiée (figure 9). Les microalgues selon l'invention sont génétiquement modifiées de manière que l'activité élongase ΔΟ-ELO soit inhibée, plus particulièrement l'activité élongase ΔΟ-ELO associée à la production de MGDG (Mono-Galactosyl-Diacyl-Glycerol). En effet, les inventeurs ont pu constater que malgré l'inhibition de l'activité élongase ΔΟ-ELO associée à la production de MGDG, les souches génétiquement modifiées continuaient à en produire permettant sa croissance et la production de biomasse de manière non altérée par rapport à la même souche non modifiée.
Par « génétiquement modifiée » on entend selon l'invention toute modification du génome des microalgues obtenue par une intervention humaine ou sous contrôle humain consistant à introduire dans le génome des microalgues une séquence d'acide nucléique hétérologue. Cette modification a pour résultat d'enrichir le génome de la microalgue génétiquement modifiée avec l'ajout de nouvelles séquences et/ou de le réduire par élimination de fragments de séquences natives.
Par « séquence d'acide nucléique hétérologue » on entend toute séquence synthétique préparée par un humain ou sous son contrôle, notamment par copie d'un gène naturel par toute technique de réplication connue comme la PCR, par assemblage de fragments de gènes naturels, avec introduction ou non de mutations. Il peut s'agir d'une séquence codant pour un gène d'intérêt avec ou sans séquences de régulation de son expression dans un organisme hôte, ou encore des fragments synthétiques sans fonction autre qu'introduire dans un gène cible une mutation destinée à inhiber son expression (KO). La séquence d'acide nucléique hétérologue comprend avantageusement des fragments d'acide nucléique permettant de cibler son introduction dans un gène cible par toute technique connue de recombinaison
homologue ou ciblage de séquence d'ADN.
Les techniques de transformations de microalgues sont bien connues de l'homme du métier. De même que les techniques de ciblage de gènes. On citera en particulier (Kilian et al., 201 1 ) ou la demande WO 2014/207043.
L'invention est particulièrement appropriée pour les microalgues comprenant des organelles à activité photosynthétique comme les chloroplastes. L'effet obtenu a été plus particulièrement identifié pour de telles microalgues qui produisent le précurseur 16:0 (palmitoyl-CoA) dans les chloroplastes.
Ces microalgues sont bien connues de l'homme du métier. On citera en particulier les microalgues des genres Crypthecodinium, Chlorella, Cyclotella, Euglena, Haematococcus, Isochrysis, Monodus, Nanochloris, Nannochloropsis, Nitzschia, Odontella, Phaeodactylum, Scenedesmus, Tetraselmis, et Thalassiosira.
Les inventeurs ont pu mettre en évidence que l'activité élongase ΔΟ-ELO pouvait être multigénique dans les microalgues. L'invention est plus particulièrement adaptée pour inhiber l'activité élongase ΔΟ-ELO dans des microalgues pour lesquelles l'activité élongase ΔΟ-ELO est multigénique, plus particulièrement lorsque seule l'activité de l'élongase ΔΟ-ELO associée à la production de MGDG est inhibée.
L'invention est plus particulièrement adaptée pour des microalgues dont l'activité élongase ΔΟ-ELO inhibée est codée par un gène codant pour une protéine de SEQ ID NO 1 ou une séquence homologue comprenant au moins 40% d'identité, de préférence au moins 45% d'identité avec la SEQ ID NO 1 et comprend un motif HxxHH dans un environnement riche en R- et K-, et un motif riche en K dans sa partie C-terminale.
Ces éléments structurels sont communs aux élongases et ont été identifiées dans la SEQ ID NO 1 codée par le gène Naga_100083g23 (figure 4) et se retrouvent dans les autres séquences d'élongases ΔΟ-ELO de Nannochloropsis gaditana (figure 2) et dans les séquences de Phaeodactylum (figure 5) et de Thalassiosira (figure 6).
Avec ces éléments structurels communs aux élongases, les séquences homologues ont au moins 100 acides aminés identiques à ceux de la SEQ ID NO 1 , de préférence au moins 120 acides aminés identiques.
L'homme du métier saura identifier d'autres séquences homologues de la SEQ ID NO 1 à partir de séquences connues ou obtenues du génome de microalgues et par des méthodes usuelles d'alignement simple ou multiples comme les méthodes
Clustal (Sievers F. et al., 201 1 ) ou basées sur la méthode Smith-Waterman avec matrice de comparaison Blossum 62 (Rice et al., 2000).
De manière avantageuse, les microalgues selon l'invention sont choisies parmi les microalgues des genres Phaeodactylum, Thalassiosira et Nannochloropsis identifiées pour avoir des gènes codant pour des séquences homologues de la SEQ ID NO 1 , notamment les protéines représentées par les SEQ ID NO 7 et SEQ ID NO 8.
Selon un mode plus préférentiel de réalisation de l'invention, les microalgues sont de l'espèce Nannochloropsis gaditana qui comprend un gène codant pour l'élongase représentée par la SEQ ID NO 1 .
L'homme du métier connaît plusieurs moyens d'inhiber l'activité ΔΟ-ELO. On peut par exemple modifier le microorganisme pour favoriser la production d'un substrat qui vient se lier à l'enzyme en compétition avec l'acide gras 16:0. On peut aussi modifier le microorganisme pour exprimer un acide nucléique qui va inhiber la traduction du gène codant pour l'élongase ΔΟ-ELO. On peut également modifier le microorganisme pour exprimer un acide nucléique qui va inhiber la transcription du gène codant pour l'élongase ΔΟ-ELO. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, les microalgues sont transformées par l'introduction d'une mutation dans le gène codant pour l'élongase ΔΟ-ELO. Cette mutation a pour effet d'inhiber l'expression du gène (KO). La mutation peut consister en l'ajout d'un acide nucléique ou d'un fragment d'acide nucléique de manière à insérer un codon « stop » dans la partie codante du gène. La mutation peut aussi consister en une suppression de fragments d'acide nucléique dans le gène, dans la séquence de régulation promotrice et/ou dans la séquence codante. La mutation peut consister en une suppression complète du gène ciblé du génome des microalgues génétiquement modifiées.
Les méthodes permettant la transformation des microalgues pour introduire un KO d'un gène cible sont connues de l'homme du métier qui saura les adapter pour cibler le gène codant pour l'élongase ΔΟ-ELO. On citera notamment (Kilian et al., 201 1 ) ou la demande WO 2014/207043.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, les microalgues génétiquement modifiées sont des Nannochloropsis gaditana modifiées par KO du gène Naga_100083g23 codant pour l'élongase ΔΟ-ELOI de SEQ ID NO 1 .
L'invention concerne également la production d'une biomasse enrichie en TAG (Tri-Acyl-Glycerols), comprenant la culture de microalgues génétiquement modifiées selon l'invention dans un milieu de culture approprié pour favoriser leur croissance et leur multiplication cellulaire.
Les méthodes de culture des microalgues sont bien connues de l'homme du métier, qu'elles soient en mode autotrophe, hétérotrophe ou mixotrophe. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la culture est réalisée avec apport de lumière en mode autotrophe ou mixotrophe. On citera en particulier les méthodes de culture décrites dans les demandes WO 2012/035262 et WO 2015/004403. Bien entendu, l'homme du métier pourra adapter les conditions de culture, notamment la composition du milieu, les conditions d'ajout de nutriments au cours de la culture, les cycles de température, d'oxygénation et les conditions d'éclairage pour favoriser la production de biomasse.
L'invention concerne également un procédé de production de TAG (Tri-Acyl- Glycerols), comprenant l'obtention d'une biomasse enrichie en TAG selon l'invention et l'isolation des TAG de la biomasse. Les méthodes d'isolation des TAG à partir d'une biomasse sont bien connues de l'homme du métier. On citera notamment des procédés comprenant des étapes de récupération de la biomasse à partir du milieu de culture, par exemple par filtration ou centrifugation, puis son séchage avant d'en extraire les matières grasses, dont les TAG par pressage. On citera notamment les méthodes décrites par décrites par Bligh, E.G. et Dyer, W.J. (1959) ou dans la demande WO 1997/037032.
Les TAG isolés peuvent aussi être purifiés par des méthodes connues de purification comme l'extraction liquide/liquide ou la distillation sous pression réduite.
L'invention concerne aussi une biomasse enrichie en TAG obtenue par le procédé selon l'invention.
On entend avantageusement par "biomasse" selon l'invention un ensemble de cellules de microalgues produites par leur culture, cellules qui peuvent avoir conservé ou non leur intégrité physique. On comprend donc que ladite biomasse peut comprendre une quantité de cellules de microalgues dégradées allant de 0% à 100%. Par "dégradée" on entend que l'intégrité physique desdites cellules de microalgues a pu être altérée comme par exemple des microalgues lysées, résultant par exemple d'un procédé d'homogénéisation. Une fois produite, cette biomasse pourra être brute, dans son milieu de culture ou isolée de ce dernier, séchée ou non,
dégradée ou non.
L'invention concerne enfin les TAG obtenus par le procédé selon l'invention, en particulier une huile enrichie en TAG qui n'a pas été modifiée de manière substantielle par rapport à l'huile extraite de la biomasse selon l'invention.
EXEMPLES
MATÉRIEL ET MÉTHODES
Souches de N. gaditana et conditions de culture
Les souches sauvages de Nannochloropsis gaditana CCMP526 (NgWT) et les mutants sont maintenus dans un milieu f/2 (Guillard and Ryther, 1962) contenant des sels de mer modifiés (NaCI, 21 ,194 g.L1; Na2SO4, 3,55 g.L1; KCI, 0,599 g.L1;
NaHCOs, 0,174 g.L"1; KBr, 0,0863 g.L"1; H3BO3, 0,023 g.L"1; NaF, 0,0028 g.L"1;
MgCI2.6H2O, 9,592 g.L"1; CaCI2.2H2O, 1 ,344 g.L"1; and SrCI2.6H2O, 0,0218 g.L"1;
NaNO3, 46,67 mg.L"1 et NaH2PO , 3.094 mg,L"1) sous agitation douce à 20°C avec soit un cycle d'éclairage alterné nuit/jour 12h/12h, soit un éclairage continu sous lumière blanche avec un flux de photons de 30 pmol.nn~2s~1. Les cultures en erlenmeyer (50-100 mL) ou sur plaques de 24 puits (2 mL) sont inoculées avec une densité de 206 cellules. mL"1.
Les cellules sont conservées à -80°C dans le DMSO ou peuvent être maintenues sur des boites d'agar à 1 ,5% supplémentées en milieu f/2 et repiquées tous les mois.
Les densités cellulaires sont mesurées par absorbance à 750 nm d'aliquotes de cultures de 300μί (TECAN infinité M1000Pro). Toutes les mesures sont faites sur au moins trois échantillons biologiques, chacun représentant une culture individuelle d'une même souche.
Clonage de la cassette de KO du gène Naga_100083g23 (A0-ELO1) et transformation de N. gaditana CCMP526
Le vecteur de transformation comprend une cassette p35S-LoxP, un gène de résistance à la zéocine (ZEO, CDS 3078-3448) sous le contrôle du promoteur ubiquitine et du terminateur FcpA de Phaeodactylum tricornutum. Deux régions flanquantes contenant les sites de reconnaissance des enzymes de restriction spécifiques du gène ciblé pour permettre le KO par insertion dans l'ADN génomique par recombinaison homologue après transformation (Kilian et al., 201 1 ). Les séquences flanquantes du gène Naga_100083g23 (A0-ELO1 ) sont amplifiés par
PCR avec les paires d'oligonucléotides 5'-gttgggaataatgcgggacc-3' (SEQ ID NO 9) et 5'-ccgctttggtttcacagtca-3' (SEQ ID NO 10) pour le flanc terminal et 5'- acgatgggtatgttgcttgc-3' (SEQ ID NO 1 1 ) et 5'-tgtacagggcggatttcact-3' (SEQ ID NO 12) pour le flanc amont.
La transformation des souches sauvages de Nannochloropsis gaditana
CCMP526 avec le vecteur de transformation est réalisée selon la méthode décrite par Killian et al. avec les modifications suivantes : 108 cellules NgWT sont récoltées pendant la phase de croissance exponentielle) une concentration de 306 cellules. mL-1, lavées deux fois avec 375 mM de D-sorbitol puis remises en suspension dans un volume final de 100 μί. La cassette de recombinaison est digérée du vecteur et 1 μg de produit de digestion est mélangé à la suspension. Après 15 minutes d'incubation sur de la glace, les cellules sont soumises à une électroporation (NEPA21 Type II, Sonidel Ltd ; MicroPulser BioRad). Le mélange de transformation est transféré dans 5 mL de milieu f/2 et incubé pendant 16 heures sous irradiation lumineuse continue. Les cellules sont ensuite ensemencées sur des boites d'agar avec 1 ,5% de milieu f/2 et 7 μg.ml"1 de zeocine. Des colonies sont obtenues après 3 à 4 semaines d'incubation sous lumière continue.
Génotypage des mutants KO Naga_100083g23 (NgA0-elo1 KO)
Le génotypage des mutants KO Naga_100083g23 a été réalisé par PCR en cherchant la présence des séquences flanquantes du gène de résistance à la zéocine et par l'absence du gène Naga_100083g23 avec les paires d'oligonuclotides suivantes : 5'-gaggaatgtgtgtggttggg-3' (SEQ ID NO 13) pour le promoteur du gène de résistance à la zéocine et 5'-gccgtattgttggagtggac-3' (SEQ ID NO 14) pour la séquence terminatrice ; 5'-gacacttctctgcctttgcc-3' (SEQ ID NO 15) et 5'- atggtggtaccagtggagga-3' (SEQ ID NO 16) pour le gène Naga_100083g23.
Le nombre de cassettes insérées dans le génome de N. gaditana dans trois clones indépendants a été quantifié par qPCR sur de l'ADN extrait selon la méthode au chloroforme-phénol (Pacific Biosciences of California, Inc, 2012 ; Cao et. Al., 2012) et en utilisant les oligonucléotides suivants : Naga_100083g23F 5'- gtgggcaccaaggttatgga-3' (SEQ ID NO 17); Naga_100083g23R 5'- gaaggaggtgtggtacggtg-3' (SEQ ID NO 18); papF 5'-aagtggtacctttgctccgt-3' (SEQ ID NO 19); papR 5'-aaggtagccgagtagccaaa-3' (SEQ ID NO 20); tubF 5'- ttgagcataccgacgtgact-3' (SEQ ID NO 21 ) ; tubR 5'-gcgatgagcctgttcagatt-3' (SEQ ID
NO 22); zeoF 5'-tgtgccaaaatcatacagcagg-3' (SEQ ID NO 23); zeoR 5'- cgaagtcgtcctccacgaag-3' (SEQ ID NO 24).
Extraction et analyse des lipides
L'extraction et l'analyse des lipides ont été réalisées selon les méthodes décrites par Simionato et al. (2013). L'analyse par spectrométrie de masse a été réalisée par comparaison avec des standards décrits par Abida et al. (2015).
RÉSULTATS
Les résultats obtenus sont représentés sur les figures 7 à 9. On n'observe pas de différence statistiquement notable des quantités de lipides produites entre les souches sauvages (WT) et les mutants NgA0-elo1 KO (figure 7.A). On observe en revanche une modification du type d'acides gras produits (figure 7.B), avec une baisse de 8% de la quantité d'acide éicosapentaénoique, ou EPA (20:5), produite.
Lorsque l'on compare les différents glycérolipides produits, (figure 8) on constate une différence marquée entre les souches WT et les mutants NgA0-elo1 KO avec chez les mutants une baisse de la production de MGDG (-43,8 %) et une augmentation de la production de TAG (+71 %).
Enfin, lorsque l'on compare les courbes de croissances (figure 9A) et la production de biomasse (figure 9B), on constate que l'inhibition de l'expression du gène Naga_100083g23 chez les mutants ne modifie pas ces propriétés.
Les analyses des glycérolipides montrent une relation entre le KO du gène
Naga_100083g23 codant pour l'élongase ΔΟ-ELOI et une baisse de la synthèse d'EPA et une baisse de la synthèse de MGDG concomitante à une augmentation de la synthèse de TAG. La biomasse produite étant la même, on obtient une augmentation de la production de TAG d'un facteur 1 ,7 à 2.
REFERENCES
BREVETS ET DEMANDES DE BREVETS
US 8,809,046
WO 96/21022
W0 1997/037032
WO 2012/035262
WO 2014/207043
WO 2015/004403 PUBLICATIONS
Abida H, Dolch LJ, Mei C, Villanova V, Conte M, Block MA, Finazzi G, Bastien O, Tirichine L, Bowler C, Rebeille F, Petroutsos D, Jouhet J, Maréchal E (2015) Membrane glycerolipid remodeling triggered by nitrogen and phosphorus starvation in Phaeodactylum tricornutum. Plant Physiol 167: 1 18-136.
Bligh, E.G. et Dyer, W.J. (1959); A rapid method of total lipid extraction and purification, Can. J. Biochem. Physiol., 37:91 1 -917.
Cook O, Hildebrand M (2015) Enhancing LC-PUFA production in Thalassiosira pseudonana by overexpressing the endogenous fatty acid elongase gènes. J Appl Phycol 1 -9.
Cao S, Zhang X, Ye N, Fan X, Mou S, Xu D, Liang C, Wang Y, Wang W (2012) Evaluation of putative internai référence gènes for gene expression normalization in Nannochloropsis sp. by quantitative real-time RT-PCR. Biochem Biophys Res Commun 424: 1 18-123.
Dénie V, Weissman JS (2007) A molecular caliper mechanism for determining very long-chain fatty acid length. Cell 130: 663-677.
Guillard RR, Ryther JH (1962) Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian journal of microbiology 8: 229-239.
Hashimoto K, Yoshizawa AC, Okuda S, Kuma K, Goto S, Kanehisa M (2008) The répertoire of desaturases and elongases reveals fatty acid variations in 56 eukaryotic génomes. J Lipid Res 49: 183-191 .
Jackson MR, Nilsson T, Peterson PA (1990) Identification of a consensus motif for rétention of transmembrane proteins in the endoplasmic reticulum. EMBO J 9: 3153- 3162.
Jung A, Hollmann M, Schafer MA (2007) The fatty acid elongase NOA is necessary for viability and has a somatic rôle in Drosophila sperm development. J Cell Sci 120: 2924-2934.
Kihara A (2012) Very long-chain fatty acids: elongation, physiology and related disorders. J Biochem 152: 387-395.
Kilian O, Benemann CS, Niyogi KK, Vick B (2011) High-efficiency homologous recombination in the oil-producing alga Nannochloropsis sp. Proc Natl Acad Sci U S A 108: 21265-21269.
Lee SH, Stephens JL, Paul KS, Englund PT (2006) Fatty acid synthesis by elongases in trypanosomes. Cell 126: 691 -699.
Ramakrishnan S, Docampo MD, Macrae Jl, Pujol FM, Brooks CF, van Dooren GG, Hiltunen JK, Kastaniotis AJ, McConville MJ, Striepen B (2012) Apicoplast and endoplasmic reticulum cooperate in fatty acid biosynthesis in apicomplexan parasite Toxoplasma gondii. J Biol Chem 287: 4957-4971 .
Sievers F, Wilm A, Dineen D, Gibson TJ, Karplus K, Li W, Lopez R, McWilliam H, Remmert M, Sôding J, Thompson JD, Higgins DG (201 1 ) Fast, scalable génération of high-quality protein multiple séquence alignments using Clustal Oméga. Molecular Systems Biology, 7:539
Simionato D, Block MA, La Rocca N, Jouhet J, Maréchal E, Finazzi G, Morosinotto T (2013) The response of Nannochloropsis gaditana to nitrogen starvation indudes de novo biosynthesis of triacylglycerols, a decrease of chloroplast galactolipids, and reorganization of the photosynthetic apparatus. Eukaryot Cell 12: 665-676.
Rice P., Longden I., Bleasby A. (2000) EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite. Trends in Genetics, 16(6):276-277
Tehlivets O, Scheuringer K, Kohlwein SD (2007) Fatty acid synthesis and elongation in yeast. Biochim Biophys Acta 1771 : 255-270.