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WO2018001679A1 - Contamination prevention device for a laser microdissection system, and laser microdissection system - Google Patents

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Publication number
WO2018001679A1
WO2018001679A1 PCT/EP2017/063572 EP2017063572W WO2018001679A1 WO 2018001679 A1 WO2018001679 A1 WO 2018001679A1 EP 2017063572 W EP2017063572 W EP 2017063572W WO 2018001679 A1 WO2018001679 A1 WO 2018001679A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
contamination protection
laser
protection plate
contamination
laser microdissection
Prior art date
Application number
PCT/EP2017/063572
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Dr. Falk SCHLAUDRAFF
Manfred Gilbert
Original Assignee
Leica Microsystems Cms Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Leica Microsystems Cms Gmbh filed Critical Leica Microsystems Cms Gmbh
Publication of WO2018001679A1 publication Critical patent/WO2018001679A1/en

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/286—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q involving mechanical work, e.g. chopping, disintegrating, compacting, homogenising
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/32—Micromanipulators structurally combined with microscopes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/34—Microscope slides, e.g. mounting specimens on microscope slides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/286—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q involving mechanical work, e.g. chopping, disintegrating, compacting, homogenising
    • G01N2001/2873—Cutting or cleaving
    • G01N2001/2886—Laser cutting, e.g. tissue catapult

Definitions

  • Contamination protection device for a laser microdissection system and laser microdissection system
  • the present invention relates to a contamination protection device for a laser microdissection system, wherein the contamination protection device has a contamination protection plate with an opening. Furthermore, the invention relates to a laser microdissection system with such a contamination protection device, which is designed such that the contamination protection plate between a sample holder for receiving a sample to be dissected and a collecting holder for receiving a Lasermikrodissektat- collecting container can be arranged such that the opening of the contamination protection plate in the Opening of the collection container is located.
  • a dissectate can be isolated from a sample by means of an infrared or ultraviolet laser beam which falls under the influence of gravity into a suitable dissektate collection container. The dissecting can thereby also be cut out of the sample together with a membrane attached to the sample.
  • a thermoplastic membrane is heated by means of a corresponding laser beam. The membrane fuses with the desired area of the sample and can be removed by tearing in a subsequent step.
  • Another alternative is to attach the dissectate by means of the laser beam to a lid of a Dissektatauffang practicers.
  • upwardly transported dissectates may also be attached to the bottom of a dissectate collection container provided with an adhesive coating.
  • laser microdissection systems which have laser deflection or laser scanning devices which are set up to move the laser beam or its point of impact on the stationary sample to be dissected are more advantageous.
  • Such laser microdissection systems which are also to be used in the context of the present invention and offer special advantages there, are explained in detail below.
  • a particularly advantageous laser microscope system which has a laser deflection device with mutually adjustable glass wedges in the laser beam path is described, for example, in EP 1 276 586 B1.
  • each hole by a laser pulse or a depression is created in the sample.
  • a cutting line is created by a juxtaposition of such holes or depressions, optionally with overlap.
  • the laser microdissection can be used to obtain single cells or defined areas of tissue with diameters of typically less than 250 ⁇ , but usually only about 20 ⁇ or less, which are separated by a laser beam from the surrounding tissue and subsequently subjected to different diagnostic analysis methods, for example.
  • laser microdissection can be used to isolate specific (tumor) cells from a microscopic section and to examine them for specific metabolites or proteins.
  • integrated contamination protection devices exist in known laser microdissection systems.
  • the contamination protection device is laterally rigidly screwed to the microscope of the laser microdissection system and has a Kontaminationstikblech, which separates the sample holder and the collection holder of the laser microdissection system from each other.
  • the Kontaminationstikblech has an opening or a hole through which or cut the dissected material can enter the collection container.
  • a disadvantage of the known contamination protection devices is that the contamination protection plates are not adjustable after attachment of the contamination protection device.
  • the contamination guard may bend and sag under the influence of its own weight. Due to this change in shape, a much larger opening must always be left in the contamination protection plate to ensure the widest field of view (FOV) of the available objectives without shading and for the passage of the laser microdissectates than actually necessary.
  • FOV field of view
  • the distance between the sample holder and collector can be difficult to minimize or even changed in the existing facilities.
  • the present invention therefore has as its object to provide an improved contamination protection device for a laser microdissection system, which avoids in particular the disadvantages mentioned above.
  • the present invention provides a contamination protection device for a laser microdissection system and a laser microdissection system with such a contamination protection device according to the independent patent claims.
  • Advantageous embodiments are the subject of the respective subclaims and the following description.
  • the contamination protection device has at least one tensioning device for tensioning the contamination protection plate, and the contamination protection device is designed to arrange the contamination protection plate between the sample holder and a collection holder for the laser microdissection collection container of the laser microdissection system such that the opening of the contamination protection plate in the region of the opening of the collection container lies.
  • the tensioning device can tension the contamination protection plate in one or more extension directions of this plate so that bending or sagging of the plate is prevented.
  • a clamping device may be arranged on one side of the plate, wherein the plate on the other opposite side is rigidly connected to the contamination protection device or with a corresponding suspension for the plate.
  • the plate can be tensioned in a first direction of extension (x-direction). If necessary, the plate can be in one vertical direction (y-direction) are additionally tensioned by a second clamping device.
  • the invention further relates to a laser microdissection system comprising a sample holder for receiving a sample to be dissected and a collection holder for receiving a laser microdissection collection container which excises a laser microdissectate from the sample with a laser beam and traps it in the laser microdissectate collection container.
  • a contamination prevention device is provided, which comprises a contamination protection plate with an opening.
  • the contamination protection device has at least one tensioning device for tensioning the contamination protection plate, and the contamination protection device is designed to arrange the contamination protection plate between the sample holder and a collection holder for the laser microdissection collection container of the laser microdissection system such that the opening of the contamination protection plate in the region of the opening of the collection container lies.
  • the contamination protection device it is possible, for example, to cover unused collecting containers for the laser microdissection during the laser microdissection process and at the same time to produce a minimum distance between the sample to be dissected and the corresponding active collecting container. Due to the clamping device, the thickness of the contamination protection plate can be chosen lower than before. At the same time a sagging of the plate is avoided. The opening in the plate ensures the unimpeded transfer of microdissectates into the selected active collection container in the receiver. Since sagging of the contamination protection plate is avoided, the minimum necessary diameter of the opening in the plate can be selected. It corresponds to the widest field of view (FOV) of the lenses available in the laser microdissection system.
  • FOV widest field of view
  • the opening must be aligned in such a way that no shading by the contamination protection plate is visible when looking through all available lenses. Due to the tensioning device, the contamination protection plate can not push through, so that compared with the prior art, no greater distance to the collecting container must be selected to prevent wedging of collecting containers or the active collecting container with the opening edge of Kontaminationstikplatte. Consequently, it is always possible to maintain the minimum necessary distance between the collecting container and the sample, which is advantageous, in particular in the case of microdissect collection by gravity, in order to minimize the dropping distance and to make the protection against contamination even more effective.
  • the contamination protection device has at least one adjusting device for adjusting the contamination protection plate in at least one spatial direction.
  • the at least one adjusting device makes it possible to optimally adjust the contamination protection plate in at least one spatial direction.
  • the plate in one or both of the main directions of extension of the plate can be adjusted, whereby the position of the opening in the plate can be adjusted relative to the opening of the collecting container.
  • the position of the plate in the direction perpendicular to this plate spatial direction z-direction
  • the position of the plate between the collecting holder and the sample holder of the laser microdissection system can be optimally adjusted by an adjusting device.
  • the diameter of the opening in the contamination protection plate can be chosen as low as possible without running the risk of shading caused by the edge of the opening at a rigid attachment.
  • this smallest possible diameter is the one which ensures the largest possible field of view (FOV) in accordance with the available objectives.
  • the clamping device comprises a resilient element.
  • the spring force of the resilient element acts in at least one extension direction of the contamination protection plate such that the plate is tensioned at least in this direction in order to prevent sagging.
  • the Plate on two opposite sides of the plate suspended or clamped so that one side of the plate is firmly connected to the suspension, while the suspension of the plate is supported on the other side against a resilient element such as a spring, wherein the voltage of the Spring is set or adjusted so that sagging of the plate is prevented at any time.
  • the adjusting device comprises a screw adjustment which is set up such that the contamination protection plate is displaced in at least one spatial direction by an adjustment of the screw adjustment.
  • screw adjustments are known per se to the person skilled in the art.
  • Such a screw adjustment can for example be realized in that the contamination protection plate is suspended on two opposite sides, the suspensions are movably mounted on both sides and one of the two bearings contains a screw adjustment, via which the position of the plate can be changed by adjusting the screw can.
  • a similar adjustment by means of screw adjustment for the z-direction can be realized.
  • the contamination protection plate is a thin sheet or a thin plastic plate or a thin but stable foil.
  • the thickness of the plate can be between 0, 1 and 2 mm. Due to the voltage of the contamination protection plate whose thickness can be selected smaller than usual in the prior art. As a result, in turn, the distance of the sample or of the sample holder to the collecting holder or to the opening of the collecting container of the laser microdissection system can be selected to be lower than in the prior art. As a result, possible contaminations are even better avoided and at the same time the smallest possible (drop) distance between the sample and collecting container.
  • the contamination protection device is advantageously designed such that the contamination protection plate is to be arranged between a sample holder and a collection holder for a laser microdissection collection container of the laser microdissection system such that the opening of the contamination protection plate lies in the region of the opening of the (active) collection container.
  • the opening must be adjusted in such a way that no visible field shading is generated for all available lenses.
  • the invention further relates to a laser microdissection system with a contamination protection device according to the invention. Reference is made to the above explanations.
  • a laser microdissection system is based, in particular, on a laser microdissection device known per se with a microscope comprising a laser light source for generating a laser beam, a deflection device for deflecting the laser beam, an incident light device for focusing the laser beam through a microscope objective onto a sample, a microscope stage for receiving a sample holder for holding the sample to be dissected and a collecting holder for receiving a laser microdissection collecting container.
  • the laser beam from a laser light source is coupled into the observation beam path of the microscope in such a laser microdissection system.
  • the laser beam is transmitted through the microscope objective, which is also used for viewing the sample, to these foils. kussiert.
  • the laser microdissection system used in the context of the present invention is used with samples which have already been prepared for microscopy. These may be, for example, tissue thin sections which have been separated out of a larger tissue block by means of a microtome. Such a tissue block may be, for example, a fixed organ or a biopsy of a corresponding organ.
  • the laser microdissection system according to the invention therefore does not serve to obtain samples but to process them and to isolate certain areas thereof.
  • the present invention may also be used with samples that are not obtained by means of a microtome, e.g. with smears, macerates, etc. As mentioned, however, the invention is also suitable for processing thicker samples which have not been prepared by means of a microtome.
  • Microtomes are used exclusively in the preparation of microscopic samples. Microtomes can also have lasers for this purpose. The sections obtained by means of a microtome are applied to a microscope slide as mentioned above, optionally attached there, stained, etc. Only then are these available for use in the laser microdissection system.
  • a microtome differs fundamentally in its operation from a laser microdissection system in that it produces cuts with as homogeneous a cutting thickness as possible. Microtomes are therefore designed to produce a large number of identical sections with parallel cut surfaces, whereas laser microdissection systems are set up for separating dissectates according to sample-dependent criteria, for example according to visual morphological criteria.
  • the laser microdissection system is used in particular for separating out sample parts , which are subsequently taken up in a suspending fluid.
  • the person skilled in the art would therefore find technical solutions used in microtomes. Because of the completely different objectives, they are not transferred to such laser microdissection systems.
  • Figure 1 shows a laser microdissection system, which is preferably the starting point of the present invention, in a schematic representation.
  • FIG. 2 schematically shows parts of the laser microdissection system shown in FIG. 1 together with an embodiment of the contamination protection device according to the invention.
  • a laser microdissection system or an abovementioned laser microdissection device which can be used for carrying out the invention, is shown schematically and designated by 100 as a whole.
  • the laser microdissection system 100 corresponds in substantial parts to that disclosed in EP 1 276 586 B1, to which reference is expressly made.
  • the laser microdissection system 100 comprises a microscope 10.
  • an illumination device 12 which is only partially illustrated here, can be provided.
  • This may, for example, comprise a light source (not shown) and suitable means for influencing the illumination light provided by the light source, for example filters and / or diaphragms.
  • a condenser unit 90 can be provided for transmitted light illumination and for setting suitable contrast or observation methods.
  • a user input and / or user information unit 13 may be arranged, which may be formed, for example, as a touch screen, and via which the user can enter and / or read, for example, viewing and / or processing parameters.
  • a drive knob 14 is provided. This serves to operate a coarse and a fine drive for adjusting a height of a microscope stage 30.
  • a sample 51 for example a tissue sample attached in a corresponding slide or a sample holder 52, can thereby be brought into an object plane of an objective 41.
  • the objective 41 is fastened next to other objectives 42 in a nosepiece 40.
  • a protective cover 15 may be provided.
  • Observation light emanating from the sample 51 runs along an observation beam path a.
  • a preferably variable portion of the observation light for example by 60 °, can be coupled out and presented to a user by means of an eyepiece pair 62.
  • Another portion of the observation light can be coupled into a digital image acquisition unit 63 and detected by imaging.
  • the image acquisition unit 63 may be associated with an image evaluation module 64, which is spatially arranged in a control unit 82 or a control computer 81 (see below) or elsewhere.
  • the necessary connections to the control computer are designated by 83.
  • the laser microdissection system 100 has a laser unit 70 with a laser light source 75.
  • a by the laser light source 75 which is for example a Provided laser beam 77 with laser beam axis b is deflected in a incident light device, which is indicated here at 76 as a whole, at a first deflection mirror 71 and a second deflection mirror 72 and focused by the objective 41 on the sample 51.
  • the location at which the laser beam 77 impinges on the sample 51 in the object plane, and thus also in the sample area, can basically be set in different ways.
  • a manual adjusting device 31 may be provided by means of which the microscope stage 30 designed as a cross table can be adjusted in the x and y directions (that is to say, perpendicularly or parallel to the plane of the paper).
  • electromechanical adjusting means can also be provided which can be activated, for example, by a control unit 82 or whose position can be detected by the control unit 82.
  • the control unit 82 may also control any other motorized functions of the laser microdissection system 100, and in particular provide an interface to an external control computer 81, which may be connected via corresponding connections 83.
  • the control unit 82 or the control computer 81 can also evaluate data obtained, for example, by the image evaluation module 64. By way of example, a sequence of tissue layers or other structures of the sample 51 can thereby be recognized.
  • a laser deflection device 73 can be provided.
  • the laser beam 77 can be deflected relative to an optical axis c extending between the first deflection mirror 71 and the second deflection mirror 72.
  • the laser beam can therefore impinge on the second deflection mirror 72 at different positions, which can be embodied, for example, as a dichromatic divider, and is therefore also focused at different positions on the sample 51 in the object plane.
  • a deflection by means of a laser deflection device 73 is shown in detail in EP 1 276 586 B1. It should be emphasized that here different possibilities for deflecting a laser beam 77 or for positioning the sample 51 in the object plane relative to the Laser beam 77 can be used. The invention is not limited to the illustrated example.
  • the laser deflection device 73 has two solid glass wedge plates 731, which are inclined relative to the optical axis c and are rotatable independently of each other about the optical axis c.
  • the wedge plates 731 are mounted with ball bearings 732.
  • Each of the wedge plates is connected to a gear 733.
  • the gears 733 can each be rotated by means of actuators 734 was-the, which can be acted upon with corresponding drive signals and drive the gears 733 accordingly.
  • the rotators may have position sensors 735 (shown here only on the right actuator 734). A position detected by the position sensors 735 may be transmitted to the control unit 82.
  • At least part of a sample 51 located on the object carrier 52 can be cut out by means of a laser microdissection method.
  • the sample 51 is visualized or the corresponding image of the sample 51 is fed to an image processing system for automatic processing.
  • a sample region of interest may be made visible for example by staining or made usable for image processing.
  • This sample area should be made available as a dissectate for further analysis.
  • the sample area is surrounded, for example, with an individual cutting line, this cutting line imaging the object contour of the sample area.
  • the cutting line may be chosen to be spaced apart from the actual sample area by a certain amount in order not to destroy the sample area in the edge region due to the finite diameter of the laser focus during cutting.
  • the laser beam 77 is displaced by means of the deflection device 73 in accordance with the predetermined individual cutting line by means of the laser dissection device 100 shown in FIG. 1, so that the laser beam focus describes the section line.
  • the Laserablenkvor-direction 73 by means of Controlled accordingly control unit 82 (see the above explanations).
  • the cut microdissect falls by gravity into a laser microdissection collecting tank 53 (not shown in FIG. 1).
  • FIG. 2 very schematically shows only the essential components of the laser microdissection system 100 from FIG. 1, namely the microscope objective 41 used to focus the laser beam 77 and the focused laser beam 77, the focus of which is directed essentially onto the sample 51.
  • the sample holder is designated 52.
  • the laser microdissection collecting container is arranged below the sample 51 and denoted by 53. Also, this collecting container 53 is shown only very schematically in order to illustrate the basic principles of the present invention.
  • the sample 51 is usually located on a support membrane 54, which in turn is held by the sample holder 52.
  • the contamination protection device is designated 500 in this exemplary embodiment. It has a contamination protection plate 550 with an opening 551.
  • the plate is, for example, a 2 mm thick plastic plate or a correspondingly thin sheet metal.
  • the tensioning device for tensioning the contamination protection plate 550 is generally designated 510.
  • the contamination protection plate 550 is attached to two suspensions 560 and 570.
  • an adjustment device generally indicated 540, the contamination protection plate 550 can be adjusted in a (for example, x-direction) main direction of extension of the plate 550, i. be moved in this direction.
  • the clamping device 510 the plate 550 is tensioned in the same direction in this embodiment.
  • adjusting devices 540 and clamping device 510 are combined with one another.
  • the suspension 560 is mounted on a screw adjustment 580 and the suspension 570 on a screw adjustment 590.
  • the contamination protection plate 550 can be moved and adjusted in said extension or spatial direction.
  • This adjusting device allows the opening 551 of the contamination protection plate relative to the position of a collecting container. ters 53 to align exactly.
  • the part 590 of the screw adjustment is based on a resilient element 520, here a spring, the tensioning device 510, so that in each selected position of the plate 550, the spring force of the spring 520 spans this plate 550 in said direction of extent.
  • the embodiment of a contamination protection device 500 shown in FIG. 2 makes it possible to minimize the distance between collecting container 53, more precisely between collecting holder 530, and sample holder 52 in order to even better prevent possible contamination and to further increase the drop height of the laser microdissection into collecting container 53 to reduce.
  • non-active collecting container which are located next to the active collecting container 53, optimally covered.
  • the diameter of the opening 551 can be limited to the minimum necessary diameter, which corresponds to the maximum field of view of the available lenses 41, 42.

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Abstract

A contamination prevention device (500) for a laser microdissection system (100) uses a laser beam (77) to cut out a laser microdissectate from a specimen (51) held on a specimen holder (52), and it collects this laser microdissectate in a laser microdissectate collection receptacle (53). The contamination prevention device (500) comprises a contamination prevention plate (550) with an opening (551) and has at least one clamping mechanism (510) for clamping the contamination prevention plate (550). The contamination prevention device (500) is designed in such a way as to arrange the contamination prevention plate (550) between the specimen holder (52) and a collection holder (530) for the laser microdissectate collection receptacle (53) of the laser microdissection system (100) in such a way that the opening (551) of the contamination prevention plate (550) lies in the region of the opening of the collection receptacle (53). A corresponding laser microdissection system (100) having such a contamination prevention device (500) with at least one clamping mechanism (510) for clamping the contamination prevention plate (550) is likewise specified.

Description

Kontaminationsschutzeinrichtung für ein Lasermikrodissektionssystem und La- sermikrodissektionssystem  Contamination protection device for a laser microdissection system and laser microdissection system
Beschreibung description
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Kontaminationsschutzeinrichtung für ein Lasermikrodissektionssystem, wobei die Kontaminationsschutzeinrichtung eine Kontaminationsschutzplatte mit einer Öffnung aufweist. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Lasermikrodissektionssystem mit einer solchen Kontaminationsschutzeinrichtung, die derart ausgebildet ist, dass die Kontaminationsschutzplatte zwischen einem Probenhalter zur Aufnahme einer zu dissektierenden Probe und einem Auffanghalter zur Aufnahme eines Lasermikrodissektat- Auffangbehälters derart angeordnet werden kann, dass die Öffnung der Kontaminationsschutzplatte im Bereich der Öffnung des Auffangbehälters liegt. The present invention relates to a contamination protection device for a laser microdissection system, wherein the contamination protection device has a contamination protection plate with an opening. Furthermore, the invention relates to a laser microdissection system with such a contamination protection device, which is designed such that the contamination protection plate between a sample holder for receiving a sample to be dissected and a collecting holder for receiving a Lasermikrodissektat- collecting container can be arranged such that the opening of the contamination protection plate in the Opening of the collection container is located.
Stand der Technik State of the art
Verfahren zur Bearbeitung biologischer Proben durch Lasermikrodissektion existieren bereits seit Mitte der 1970er Jahre und wurden seitdem kontinuierlich weiterentwickelt. Bei der Lasermikrodissektion können Zellen, Geweberegionen usw. aus einer biologischen Probe ("Objekt") isoliert und als sogenannte Dissektate gewonnen werden. Ein besonderer Vorteil der Lasermikrodissektion ist der kurze Kontakt der Probe mit dem Laserstrahl, durch den diese kaum verändert wird. Die Gewinnung der Dissektate kann auf unterschiedliche Weise erfolgen. Methods for processing biological samples by laser microdissection have existed since the mid-1970s and have been continuously developed since then. In laser microdissection, cells, tissue regions, etc., can be isolated from a biological sample ("object") and recovered as so-called dissectates. A particular advantage of laser microdissection is the short contact of the sample with the laser beam, by which it is hardly changed. The recovery of the dissectates can be done in different ways.
Beispielsweise kann in bekannten Verfahren aus einer Probe mittels eines Infrarotoder Ultraviolettlaserstrahls ein Dissektat isoliert werden, das unter dem Ein-fluss der Schwerkraft in einen geeigneten Dissektatauffangbehälter fällt. Das Dissektat kann dabei aus der Probe auch zusammen mit einer an der Probe anheftenden Membran ausgeschnitten werden. Bei der sogenannten "Laser Capture Microdissektion" wird hingegen eine thermoplastische Membran mittels eines entsprechenden Laserstrahls erwärmt. Dabei verschmilzt die Membran mit dem gewünschten Bereich der Probe und kann in einem darauffolgenden Schritt durch Reißen entfernt werden. Eine weitere Alternative besteht darin, das Dissektat mittels des Laserstrahls an einen Deckel eines Dissektatauffangbehälters anzuheften. Bei bekannten inversen Mikroskopsystemen zur Lasermikrodissektion können nach oben transportierte Dissektate auch an den Boden eines Dissektatauffangbehälters, der mit einer adhäsiven Beschichtung versehen ist, angeheftet werden. For example, in known methods, a dissectate can be isolated from a sample by means of an infrared or ultraviolet laser beam which falls under the influence of gravity into a suitable dissektate collection container. The dissecting can thereby also be cut out of the sample together with a membrane attached to the sample. In the so-called "laser capture microdissection", however, a thermoplastic membrane is heated by means of a corresponding laser beam. The membrane fuses with the desired area of the sample and can be removed by tearing in a subsequent step. Another alternative is to attach the dissectate by means of the laser beam to a lid of a Dissektatauffangbehälters. In known inverse microscopy systems for laser microdissection, upwardly transported dissectates may also be attached to the bottom of a dissectate collection container provided with an adhesive coating.
Bekannte Mikroskopsysteme zur Lasermikrodissektion weisen eine Auflichtein-richtung auf, in deren Strahlengang ein Laserstrahl eingekoppelt wird. Der Laser-strahl wird durch das jeweils verwendete Mikroskopobjektiv auf die Probe fokussiert, die auf einem motorisch-automatisch verfahrbaren Mikroskoptisch aufliegt. Eine Schnittlinie kann dadurch erzeugt werden, dass der Mikroskoptisch beim Schneiden verfahren wird, um die Probe relativ zu dem feststehenden Laserstrahl zu bewegen. Dies hat jedoch unter Anderem den Nachteil, dass die Probe während des Erzeugens der Schnittlinie nicht ohne weiteres betrachtet werden kann, da sich die Probe im Gesichtsfeld bewegt und das Bild ohne weitere Kompensationsmaßnahmen verschwommen bzw. verschmiert erscheint. Known microscope systems for laser microdissection have a Auflichtein direction, in the beam path of a laser beam is coupled. The laser beam is focused by the respective microscope objective used on the sample, which rests on a motor-automatically movable microscope stage. A cutting line can be created by moving the microscope stage during cutting to move the sample relative to the fixed laser beam. However, this has, inter alia, the disadvantage that the sample can not be readily observed during the generation of the cutting line, since the sample moves in the field of vision and the image appears blurred or blurred without further compensation measures.
Vorteilhafter sind daher Lasermikrodissektionssysteme, die Laserablenk- bzw. Laserscaneinrichtungen aufweisen, die dazu eingerichtet sind, den Laserstrahl bzw. dessen Auftreffpunkt auf der zu dissektierenden feststehenden Probe zu bewegen. Derartige Lasermikrodissektionssysteme, die auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung zum Einsatz kommen sollen und dort besondere Vorteile bieten, werden unten im Detail erläutert. Ein besonders vorteilhaftes Lasermikroskopsystem, das eine Laserablenkeinrichtung mit gegeneinander verstellbaren Glaskeilen im Laserstrahlengang aufweist, ist beispielsweise in der EP 1 276 586 B1 beschrieben. Therefore, laser microdissection systems which have laser deflection or laser scanning devices which are set up to move the laser beam or its point of impact on the stationary sample to be dissected are more advantageous. Such laser microdissection systems, which are also to be used in the context of the present invention and offer special advantages there, are explained in detail below. A particularly advantageous laser microscope system which has a laser deflection device with mutually adjustable glass wedges in the laser beam path is described, for example, in EP 1 276 586 B1.
In beiden Fällen, also in Systemen mit bewegter oder feststehender Probe, wird in der Regel mit gepulsten Lasern gearbeitet, wobei durch jeden Laserpuls ein Loch bzw. eine Vertiefung in der Probe erzeugt wird. Eine Schnittlinie entsteht durch eine Aneinanderreihung derartiger Löcher bzw. Vertiefungen, gegebenenfalls mit Überlappung. In both cases, so in systems with moving or fixed sample, is usually worked with pulsed lasers, each hole by a laser pulse or a depression is created in the sample. A cutting line is created by a juxtaposition of such holes or depressions, optionally with overlap.
Die Lasermikrodissektion kann zur Gewinnung von Einzelzellen oder definierten Gewebebereichen mit Durchmessern von typischerweise unter 250 μηη, in der Regel jedoch nur um die 20 μηη oder darunter, verwendet werden, die mit einem Laserstrahl vom umliegenden Gewebe separiert und anschließend beispielsweise unterschiedlichen diagnostischen Analyseverfahren unterworfen werden. In der Onkologie kann die Lasermikrodissektion beispielsweise dafür eingesetzt werden, um spezifisch (Tumor-) Zellen aus einem mikroskopischen Schnitt zu isolieren und diese auf spezifische Metaboliten oder Proteine zu untersuchen. The laser microdissection can be used to obtain single cells or defined areas of tissue with diameters of typically less than 250 μηη, but usually only about 20 μηη or less, which are separated by a laser beam from the surrounding tissue and subsequently subjected to different diagnostic analysis methods, for example. In oncology, for example, laser microdissection can be used to isolate specific (tumor) cells from a microscopic section and to examine them for specific metabolites or proteins.
Eine Kontamination der in einem Auffangbehälter aufgefangenen Dissektate ist soweit als möglich zu vermeiden, um die Ergebnisse der sich anschließenden Analyseverfahren, beispielsweise PCR (= Polymerase Chain Reaction) und Sequenzierung, nicht zu verfälschen. Zu diesem Zweck existieren bei bekannten Lasermikrodissektionssyste- men integrierte Kontaminationsschutzeinrichtungen. Die Kontaminationsschutzeinrichtung ist dabei an das Mikroskop des Lasermikrodissektionssystems seitlich starr angeschraubt und weist ein Kontaminationsschutzblech auf, das den Probenhalter und den Auffanghalter des Lasermikrodissektionssystems voneinander trennt. Das Kontaminationsschutzblech weist eine Öffnung bzw. ein Loch auf, durch die bzw. das ausgeschnittene Dissektat in den Auffangbehälter treten kann. Contamination of the dissectates collected in a collecting container should be avoided as far as possible in order not to falsify the results of the subsequent analytical methods, for example PCR (= Polymerase Chain Reaction) and sequencing. For this purpose integrated contamination protection devices exist in known laser microdissection systems. The contamination protection device is laterally rigidly screwed to the microscope of the laser microdissection system and has a Kontaminationsschutzblech, which separates the sample holder and the collection holder of the laser microdissection system from each other. The Kontaminationsschutzblech has an opening or a hole through which or cut the dissected material can enter the collection container.
Nachteilig bei den bekannten Kontaminationsschutzeinrichtungen ist, dass die Kontaminationsschutzbleche nach Anbringung der Kontaminationsschutzeinrichtung nicht weiter justierbar sind. Zudem kann sich mit der Zeit das Kontaminationsschutzblech unter dem Einfluss des eigenen Gewichts verbiegen und durchhängen. Aufgrund dieser Formveränderung muss in dem Kontaminationsschutzblech immer eine deutlich größere Öffnung zur Gewährleistung des größtmöglichen Sichtfelds (FOV) der verfügbaren Objektive ohne Abschattung und zum Durchtritt der Lasermikrodissektate gelassen werden als eigentlich notwendig. Auch der Abstand von Probenhalter und Auffanghalter kann bei den bestehenden Einrichtungen nur schwierig minimiert oder überhaupt verändert werden. Die vorliegende Erfindung stellt sich daher die Aufgabe, eine verbesserte Kontaminationsschutzeinrichtung für ein Lasermikrodissektionssystem anzugeben, welche insbesondere die oben genannten Nachteile vermeidet. A disadvantage of the known contamination protection devices is that the contamination protection plates are not adjustable after attachment of the contamination protection device. In addition, over time, the contamination guard may bend and sag under the influence of its own weight. Due to this change in shape, a much larger opening must always be left in the contamination protection plate to ensure the widest field of view (FOV) of the available objectives without shading and for the passage of the laser microdissectates than actually necessary. The distance between the sample holder and collector can be difficult to minimize or even changed in the existing facilities. The present invention therefore has as its object to provide an improved contamination protection device for a laser microdissection system, which avoids in particular the disadvantages mentioned above.
Offenbarung der Erfindung Disclosure of the invention
Zur Lösung der genannten Aufgabe stellt die vorliegende Erfindung eine Kontaminationsschutzeinrichtung für ein Lasermikrodissektionssystem sowie ein Lasermikrodissektionssystem mit einer solchen Kontaminationsschutzeinrichtung gemäß den unabhängigen Patentansprüchen vor. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der jeweiligen Unteransprüche sowie der nachfolgenden Beschreibung. In order to achieve the stated object, the present invention provides a contamination protection device for a laser microdissection system and a laser microdissection system with such a contamination protection device according to the independent patent claims. Advantageous embodiments are the subject of the respective subclaims and the following description.
Eine erfindungsgemäße Kontaminationsschutzeinrichtung für ein Lasermikrodissektionssystem, welches aus einer auf einem Probenhalter gehaltenen Probe mit einem Laserstrahl ein Lasermikrodissektat ausschneidet und in einem Lasermikrodissektat- Auffangbehälter auffängt, umfasst eine Kontaminationsschutzplatte mit einer Öffnung. Dabei weist die Kontaminationsschutzeinrichtung zumindest eine Spanneinrichtung zum Spannen der Kontaminationsschutzplatte auf, und die Kontaminationsschutzeinrichtung ist derart ausgebildet, um die Kontaminationsschutzplatte zwischen dem Probenhalter und einem Auffanghalter für den Lasermikrodissektat-Auffangbehälter des Lasermikrodissektionssystems derart anzuordnen, dass die Öffnung der Kontaminationsschutzplatte im Bereich der Öffnung des Auffangbehälters liegt. A contamination protection device according to the invention for a laser microdissection system which uses a laser beam to cut a laser microdissection out of a sample held on a sample holder and collect it in a laser microdissectate collection container comprises a contamination protection plate having an opening. In this case, the contamination protection device has at least one tensioning device for tensioning the contamination protection plate, and the contamination protection device is designed to arrange the contamination protection plate between the sample holder and a collection holder for the laser microdissection collection container of the laser microdissection system such that the opening of the contamination protection plate in the region of the opening of the collection container lies.
Die Spanneinrichtung kann beispielsweise die Kontaminationsschutzplatte in einer o- der in mehreren Ausdehnungsrichtungen dieser Platte spannen, so dass ein Durchbiegen bzw. Durchhängen der Platte verhindert ist. Bei einer rechteckigen Grundform der Platte kann beispielsweise eine Spanneinrichtung an einer Seite der Platte angeordnet sein, wobei die Platte an der anderen gegenüberliegenden Seite fest bzw. starr mit der Kontaminationsschutzeinrichtung bzw. mit einer entsprechenden Aufhängung für die Platte verbunden ist. Auf diese Weise kann die Platte in einer ersten Ausdehnungsrichtung (x-Richtung) gespannt werden. Falls erforderlich kann die Platte in einer hierzu senkrechten Richtung (y-Richtung) durch eine zweite Spanneinrichtung zusätzlich gespannt werden. For example, the tensioning device can tension the contamination protection plate in one or more extension directions of this plate so that bending or sagging of the plate is prevented. In a rectangular basic shape of the plate, for example, a clamping device may be arranged on one side of the plate, wherein the plate on the other opposite side is rigidly connected to the contamination protection device or with a corresponding suspension for the plate. In this way, the plate can be tensioned in a first direction of extension (x-direction). If necessary, the plate can be in one vertical direction (y-direction) are additionally tensioned by a second clamping device.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Lasermikrodissektionssystem mit einem Probenhalter zur Aufnahme einer zu dissektierenden Probe und einem Auffanghalter zur Aufnahme eines Lasermikrodissektat- Auffangbehälters, welches aus der Probe mit einem Laserstrahl ein Lasermikrodissektat ausschneidet und in dem Lasermikrodissektat- Auffangbehälter auffängt. In dem Lasermikrodissektionssystems ist eine Kontaminationsschutzeinrichtung vorgesehen ist, die eine Kontaminationsschutzplatte mit einer Öffnung umfasst. Dabei weist die Kontaminationsschutzeinrichtung zumindest eine Spanneinrichtung zum Spannen der Kontaminationsschutzplatte auf, und die Kontaminationsschutzeinrichtung ist derart ausgebildet, um die Kontaminationsschutzplatte zwischen dem Probenhalter und einem Auffanghalter für den Lasermikrodissektat- Auffangbehälter des Lasermikrodissektionssystems derart anzuordnen, dass die Öffnung der Kontaminationsschutzplatte im Bereich der Öffnung des Auffangbehälters liegt. The invention further relates to a laser microdissection system comprising a sample holder for receiving a sample to be dissected and a collection holder for receiving a laser microdissection collection container which excises a laser microdissectate from the sample with a laser beam and traps it in the laser microdissectate collection container. In the laser microdissection system, a contamination prevention device is provided, which comprises a contamination protection plate with an opening. In this case, the contamination protection device has at least one tensioning device for tensioning the contamination protection plate, and the contamination protection device is designed to arrange the contamination protection plate between the sample holder and a collection holder for the laser microdissection collection container of the laser microdissection system such that the opening of the contamination protection plate in the region of the opening of the collection container lies.
Vorteile der Erfindung Advantages of the invention
Mit der erfindungsgemäßen Kontaminationsschutzeinrichtung ist es möglich, beispielsweise ungenutzte Auffangbehälter für die Lasermikrodissektion während des La- sermikrodissektionsprozesses abzudecken und gleichzeitig einen minimalen Abstand zwischen zu dissektierender Probe und dem entsprechenden aktiven Auffangbehälter herzustellen. Aufgrund der Spanneinrichtung kann die Dicke der Kontaminationsschutzplatte geringer gewählt werden als bisher. Gleichzeitig wird ein Durchhängen der Platte vermieden. Die Öffnung in der Platte gewährleistet den ungehinderten Transfer von Mikrodissektaten in den ausgewählten aktiven Auffangbehälter in dem Auffanghal- ter. Da ein Durchhängen der Kontaminationsschutzplatte vermieden ist, kann der minimale notwendige Durchmesser der Öffnung in der Platte gewählt werden. Er entspricht dem größtmöglichen Sichtfeld (FOV) der im Lasermikrodissektionssystem verfügbaren Objektive. Die Öffnung ist derart auszurichten, dass beim Blick durch alle verfügbaren Objektive keine Abschattung durch die Kontaminationsschutzplatte sichtbar wird. Aufgrund der Spanneinrichtung kann die Kontaminationsschutzplatte nicht durchrängen, so dass gegenüber dem Stand der Technik kein größerer Abstand zum Auffangbehälter gewählt werden muss, um ein Verkeilen von Auffangbehältern oder des aktiven Auffangbehälters mit dem Öffnungsrand der Kontaminationsschutzplatte zu verhindern. Folglich kann immer der minimal notwendige Abstand von Auffangbehälter zur Probe eingehalten werden, was insbesondere im Fall der Mikrodissektat-Sammlung durch Gravitation vorteilhaft ist, um eine möglichst geringe Falldistanz zu wahren und um den Schutz vor Kontaminationen noch wirksamer zu gestalten. With the contamination protection device according to the invention, it is possible, for example, to cover unused collecting containers for the laser microdissection during the laser microdissection process and at the same time to produce a minimum distance between the sample to be dissected and the corresponding active collecting container. Due to the clamping device, the thickness of the contamination protection plate can be chosen lower than before. At the same time a sagging of the plate is avoided. The opening in the plate ensures the unimpeded transfer of microdissectates into the selected active collection container in the receiver. Since sagging of the contamination protection plate is avoided, the minimum necessary diameter of the opening in the plate can be selected. It corresponds to the widest field of view (FOV) of the lenses available in the laser microdissection system. The opening must be aligned in such a way that no shading by the contamination protection plate is visible when looking through all available lenses. Due to the tensioning device, the contamination protection plate can not push through, so that compared with the prior art, no greater distance to the collecting container must be selected to prevent wedging of collecting containers or the active collecting container with the opening edge of Kontaminationsschutzplatte. Consequently, it is always possible to maintain the minimum necessary distance between the collecting container and the sample, which is advantageous, in particular in the case of microdissect collection by gravity, in order to minimize the dropping distance and to make the protection against contamination even more effective.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung weist die Kontaminationsschutzeinrichtung zumindest eine Justiereinrichtung zum Justieren der Kontaminationsschutzplatte in zumindest einer Raumrichtung auf. In an advantageous embodiment, the contamination protection device has at least one adjusting device for adjusting the contamination protection plate in at least one spatial direction.
Die zumindest eine Justiereinrichtung erlaubt es, die Kontaminationsschutzplatte in zumindest einer Raumrichtung optimal zu justieren. Auf diese Weise kann beispielsweise die Platte in einer oder in beiden der Haupterstreckungsrichtungen der Platte (x- und/oder y-Richtung) justiert werden, wodurch die Lage der Öffnung in der Platte relativ zu der Öffnung des Auffangbehälters eingestellt werden kann. Zusätzlich oder alternativ kann durch eine Justiereinrichtung die Lage der Platte in der auf diese Platte senkrecht stehenden Raumrichtung (z-Richtung) und somit die Lage der Platte zwischen dem Auffanghalter und dem Probenhalter des Lasermikrodissektionssystems optimal eingestellt werden. Besonders vorteilhaft ist die Justierung in x- und/oder y- Richtung, da hierdurch der Durchmesser der Öffnung in der Kontaminationsschutzplatte geringstmöglich gewählt werden kann, ohne Gefahr zu laufen, dass bei einer starren Anbringung Abschattungen durch den Rand der Öffnung entstehen. Dieser geringstmögliche Durchmesser ist - wie bereits oben erwähnt - derjenige, der entsprechend den verfügbaren Objektiven das größtmögliche Sichtfeld (FOV) gewährleistet. The at least one adjusting device makes it possible to optimally adjust the contamination protection plate in at least one spatial direction. In this way, for example, the plate in one or both of the main directions of extension of the plate (x and / or y-direction) can be adjusted, whereby the position of the opening in the plate can be adjusted relative to the opening of the collecting container. Additionally or alternatively, the position of the plate in the direction perpendicular to this plate spatial direction (z-direction) and thus the position of the plate between the collecting holder and the sample holder of the laser microdissection system can be optimally adjusted by an adjusting device. Particularly advantageous is the adjustment in the x and / or y direction, as a result, the diameter of the opening in the contamination protection plate can be chosen as low as possible without running the risk of shading caused by the edge of the opening at a rigid attachment. As already mentioned above, this smallest possible diameter is the one which ensures the largest possible field of view (FOV) in accordance with the available objectives.
In einer konkreten Ausgestaltung umfasst die Spanneinrichtung ein federndes Element. Die Federkraft des federnden Elements wirkt hierbei in zumindest einer Erstreckungs- richtung der Kontaminationsschutzplatte derart, dass die Platte zumindest in dieser Richtung gespannt wird, um ein Durchhängen zu verhindern. Beispielsweise ist die Platte an zwei sich gegenüberliegenden Seiten der Platte derart aufgehängt bzw. eingespannt, dass die eine Seite der Platte fest mit der Aufhängung verbunden ist, während sich die Aufhängung der Platte auf der anderen Seite gegen ein federndes Element wie eine Sprungfeder abstützt, wobei die Spannung der Sprungfeder derart eingestellt ist oder eingestellt wird, dass ein Durchhängen der Platte zu jedem Zeitpunkt verhindert ist. In a specific embodiment, the clamping device comprises a resilient element. The spring force of the resilient element acts in at least one extension direction of the contamination protection plate such that the plate is tensioned at least in this direction in order to prevent sagging. For example, the Plate on two opposite sides of the plate suspended or clamped so that one side of the plate is firmly connected to the suspension, while the suspension of the plate is supported on the other side against a resilient element such as a spring, wherein the voltage of the Spring is set or adjusted so that sagging of the plate is prevented at any time.
Es ist weiterhin vorteilhaft, wenn die Justiereinrichtung eine Schraubverstellung um- fasst, die derart eingerichtet ist, dass durch eine Verstellung der Schraubverstellung die Kontaminationsschutzplatte in zumindest einer Raumrichtung verschoben wird. Solche Schraubverstellungen sind an sich dem Fachmann bekannt. Eine solche Schraubverstellung kann beispielsweise dadurch realisiert werden, dass die Kontaminationsschutzplatte an zwei sich gegenüberliegenden Seiten aufgehängt ist, wobei die Aufhängungen auf beiden Seiten beweglich gelagert sind und eine der beiden Lagerungen eine Schraubverstellung enthält, über die die Lage der Platte durch Verstellung der Schraube verändert werden kann. Hierdurch kann insbesondere eine Justierung in oben angesprochenen x- und/oder y-Richtungen realisiert werden. Prinzipiell ist eine ähnliche Justierung mittels Schraubverstellung auch für die z-Richtung realisierbar. It is furthermore advantageous if the adjusting device comprises a screw adjustment which is set up such that the contamination protection plate is displaced in at least one spatial direction by an adjustment of the screw adjustment. Such screw adjustments are known per se to the person skilled in the art. Such a screw adjustment can for example be realized in that the contamination protection plate is suspended on two opposite sides, the suspensions are movably mounted on both sides and one of the two bearings contains a screw adjustment, via which the position of the plate can be changed by adjusting the screw can. As a result, in particular an adjustment in the above-mentioned x and / or y directions can be realized. In principle, a similar adjustment by means of screw adjustment for the z-direction can be realized.
Es hat sich als besonders vorteilhaft herausgestellt, die Spannung- und Justiereinrichtung für die x- und/oder y-Richtung zu kombinieren. Dies kann insbesondere dadurch erfolgen, dass ein Teil der Schraubverstellung der Justiereinrichtung auf dem federnden Element der Spanneinrichtung abgestützt ist. Mittels der Schraubverstellung kann dann eine Justierung der Platte in x- und/oder y-Richtung vorgenommen werden, wobei in jeder Position der Platte die Sprungfederkraft für die notwendige Spannung der Platte sorgt. Bezüglich dieser Ausführungsform sei auf das unten diskutierte Ausführungsbeispiel verwiesen. It has been found to be particularly advantageous to combine the voltage and adjustment device for the x and / or y direction. This can in particular take place in that a part of the screw adjustment of the adjusting device is supported on the resilient element of the clamping device. By means of the screw adjustment can then be made an adjustment of the plate in the x and / or y-direction, wherein in each position of the plate, the spring force provides the necessary tension of the plate. With respect to this embodiment, reference is made to the embodiment discussed below.
Es ist vorteilhaft, wenn die Kontaminationsschutzplatte ein dünnes Blech oder eine dünne Plastikplatte oder eine dünne, jedoch stabile Folie darstellt. Insbesondere kann die Dicke der Platte zwischen 0, 1 und 2 mm liegen. Aufgrund der Spannung der Kontaminationsschutzplatte kann deren Dicke geringer gewählt werden als im Stand der Technik üblich. Hierdurch wiederum kann der Abstand der Probe bzw. des Probenhalters zum Auffanghalter bzw. zur Öffnung des Auffangbehälters des Lasermikrodissektionssystems geringer gewählt werden als im Stand der Technik. Hierdurch werden mögliche Kontaminationen noch besser vermieden und gleichzeitig eine möglichst geringe (Fall-) Distanz zwischen Probe und Auffangbehälter gewahrt. It is advantageous if the contamination protection plate is a thin sheet or a thin plastic plate or a thin but stable foil. In particular, the thickness of the plate can be between 0, 1 and 2 mm. Due to the voltage of the contamination protection plate whose thickness can be selected smaller than usual in the prior art. As a result, in turn, the distance of the sample or of the sample holder to the collecting holder or to the opening of the collecting container of the laser microdissection system can be selected to be lower than in the prior art. As a result, possible contaminations are even better avoided and at the same time the smallest possible (drop) distance between the sample and collecting container.
Wie bereits erläutert, ist die Kontaminationsschutzeinrichtung vorteilhafterweise derart ausgebildet, dass die Kontaminationsschutzplatte zwischen einem Probenhalter und einem Auffanghalter für einen Lasermikrodissektat- Auffangbehälter des Lasermikrodissektionssystems derart anzuordnen ist, dass die Öffnung der Kontaminationsschutzplatte im Bereich der Öffnung des (aktiven) Auffangbehälters liegt. Insbesondere ist die Öffnung derart zu justieren, dass bei allen verfügbaren Objektiven keine Sicht- feldabschattungen erzeugt werden. As already explained, the contamination protection device is advantageously designed such that the contamination protection plate is to be arranged between a sample holder and a collection holder for a laser microdissection collection container of the laser microdissection system such that the opening of the contamination protection plate lies in the region of the opening of the (active) collection container. In particular, the opening must be adjusted in such a way that no visible field shading is generated for all available lenses.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Lasermikrodissektionssystem mit einer erfindungsgemäßen Kontaminationsschutzeinrichtung. Hierzu wird auf die obigen Erläuterungen verwiesen. The invention further relates to a laser microdissection system with a contamination protection device according to the invention. Reference is made to the above explanations.
Ein erfindungsgemäßes Lasermikrodissektionssystem geht insbesondere von einer an sich bekannten Lasermikrodissektionseinrichtung mit einem Mikroskop aus, das eine Laserlichtquelle zur Erzeugung eines Laserstrahls, eine Ablenkvorrichtung zur Ablenkung des Laserstrahls, eine Auflichteinrichtung zum Fokussieren des Laserstrahls durch ein Mikroskopobjektiv auf eine Probe, einen Mikroskoptisch zur Aufnahme eines Probenhalters zur Halterung der zu dissektierenden Probe und einen Auffanghalter zur Aufnahme eines Lasermikrodissektat- Auffangbehälters umfasst. A laser microdissection system according to the invention is based, in particular, on a laser microdissection device known per se with a microscope comprising a laser light source for generating a laser beam, a deflection device for deflecting the laser beam, an incident light device for focusing the laser beam through a microscope objective onto a sample, a microscope stage for receiving a sample holder for holding the sample to be dissected and a collecting holder for receiving a laser microdissection collecting container.
Ein entsprechendes Lasermikrodissektionssystem ist unten ausführlich unter Bezugnahme auf die Figur 1 erläutert. Mittels der Auflichteinrichtung wird in einem solchen Lasermikrodissektionssystem der Laserstrahl aus einer Laserlichtquelle in den Beobachtungsstrahlengang des Mikroskops eingekoppelt. Der Laserstrahl wird durch das Mikroskopobjektiv, das auch zum Betrachten der Probe verwendet wird, auf diese fo- kussiert. Somit verläuft, mit anderen Worten, der Strahlengang des Laserstrahls der Lasereinheit durch die Auflichteinrichtung und durch das Mikroskopobjektiv und schneidet eine Objektebene des Mikroskopobjektivs an einem einstellbaren Schnittpunkt, der mittels Ansteuersignalen an die Laserablenkeinrichtung vorgegeben wird. A corresponding laser microdissection system is explained in detail below with reference to FIG. By means of the incident light device, the laser beam from a laser light source is coupled into the observation beam path of the microscope in such a laser microdissection system. The laser beam is transmitted through the microscope objective, which is also used for viewing the sample, to these foils. kussiert. Thus, in other words, runs the beam path of the laser beam of the laser unit through the Auflichteinrichtung and through the microscope objective and intersects an object plane of the microscope objective at an adjustable intersection, which is predetermined by means of control signals to the laser deflection.
Zur Vermeidung von Missverständnissen sei an dieser Stelle betont, dass das im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzte Lasermikrodissektionssystem mit Proben verwendet wird, die bereits Mikroskopie tauglich vorbereitet sind. Hierbei kann es sich beispielsweise um Gewebe-Dünnschnitte handeln, die mittels eines Mikrotoms aus einem größeren Gewebeblock herausgetrennt wurden. Bei einem solchen Gewebeblock kann es sich beispielsweise um ein fixiertes Organ oder eine Biopsie eines entsprechenden Organs handeln. Das erfindungsgemäße Lasermikrodissektionssystem dient daher nicht zur Gewinnung von Proben, sondern zu deren Bearbeitung sowie zur Isolation von bestimmten Bereichen hiervon. Es versteht sich, dass die vorliegende Erfindung auch mit Proben, die nicht mittels eines Mikrotoms gewonnen werden, zum Einsatz kommen kann, z.B. mit Ausstrichen, Mazeraten usw. Wie erwähnt, eignet sich die Erfindung jedoch auch zur Verarbeitung dickerer Proben, die nicht mittels eines Mikrotoms vorbereitet wurden. To avoid misunderstandings, it should be emphasized here that the laser microdissection system used in the context of the present invention is used with samples which have already been prepared for microscopy. These may be, for example, tissue thin sections which have been separated out of a larger tissue block by means of a microtome. Such a tissue block may be, for example, a fixed organ or a biopsy of a corresponding organ. The laser microdissection system according to the invention therefore does not serve to obtain samples but to process them and to isolate certain areas thereof. It is understood that the present invention may also be used with samples that are not obtained by means of a microtome, e.g. with smears, macerates, etc. As mentioned, however, the invention is also suitable for processing thicker samples which have not been prepared by means of a microtome.
Mikrotome werden ausschließlich bei der Vorbereitung von mikroskopischen Proben eingesetzt. Mikrotome können hierzu auch Laser aufweisen. Die mittels eines Mikrotoms erhaltenen Schnitte werden auf einen Objektträger, wie oben erwähnt, aufgebracht, gegebenenfalls dort befestigt, angefärbt usw. Erst dann stehen diese für einen Einsatz in dem Lasermikrodissektionssystem zur Verfügung. Ein Mikrotom unterscheidet sich in seinem Betrieb unter anderem dadurch fundamental von einem Lasermikrodissektionssystem, dass dort Schnitte mit möglichst homogener Schnittstärke gewonnen werden. Mikrotome sind daher dazu ausgebildet, eine große Anzahl an identischen Schnitten mit parallelen Schnittflächen zu erzeugen, wohingegen Lasermikrodissekti- onssysteme zum Heraustrennen von Dissektaten nach probenabhängigen Kriterien, beispielsweise nach visuellen morphologischen Kriterien, eingerichtet sind, im vorliegenden Fall dient das Lasermikrodissektionssystem insbesondere zum Heraustrennen von Probenteilen, die anschließend in einem Suspendierfluid aufgenommen werden. Der Fachmann würde daher bei Mikrotomen eingesetzte technische Lösungen auf- grund der völlig unterschiedlichen Zielsetzung nicht auf derartige Lasermikrodissekti- onssysteme übertragen. Microtomes are used exclusively in the preparation of microscopic samples. Microtomes can also have lasers for this purpose. The sections obtained by means of a microtome are applied to a microscope slide as mentioned above, optionally attached there, stained, etc. Only then are these available for use in the laser microdissection system. Among other things, a microtome differs fundamentally in its operation from a laser microdissection system in that it produces cuts with as homogeneous a cutting thickness as possible. Microtomes are therefore designed to produce a large number of identical sections with parallel cut surfaces, whereas laser microdissection systems are set up for separating dissectates according to sample-dependent criteria, for example according to visual morphological criteria. In the present case, the laser microdissection system is used in particular for separating out sample parts , which are subsequently taken up in a suspending fluid. The person skilled in the art would therefore find technical solutions used in microtomes. Because of the completely different objectives, they are not transferred to such laser microdissection systems.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachfolgend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen. It is understood that the features mentioned above and those yet to be explained below can be used not only in the particular combination indicated, but also in other combinations or in isolation, without departing from the scope of the present invention.
Die Erfindung ist anhand eines Ausführungsbeispiels in der Zeichnung schematisch dargestellt und wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnung ausführlich beschrieben. The invention is illustrated schematically with reference to an embodiment in the drawing and will be described in detail below with reference to the drawing.
Figurenbeschreibung figure description
Figur 1 zeigt ein Lasermikrodissektionssystem, das vorzugsweise den Ausgangspunkt der vorliegenden Erfindung darstellt, in schematischer Darstellung. Figure 1 shows a laser microdissection system, which is preferably the starting point of the present invention, in a schematic representation.
Figur 2 zeigt schematisch Teile des in Figur 1 dargestellten Lasermikrodissekti- onssystems zusammen mit einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Kontaminationsschutzeinrichtung. FIG. 2 schematically shows parts of the laser microdissection system shown in FIG. 1 together with an embodiment of the contamination protection device according to the invention.
In den Figuren sind einander entsprechende Elemente mit identischen Bezugszeichen angegeben und werden nicht wiederholt erläutert. In the figures, corresponding elements are given identical reference numerals and will not be explained repeatedly.
In Figur 1 ist ein Lasermikrodissektionssystem bzw. eine oben genannte Laser- mikrodissektionseinrichtung, das bzw. die zur Durchführung der Erfindung verwendet werden kann, schematisch dargestellt und insgesamt mit 100 bezeichnet. Das Lasermikrodissektionssystem 100 entspricht in wesentlichen Teilen jenem, das in der EP 1 276 586 B1 offenbart ist, auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird. Ein Koordinatensystem, anhand dessen die nachfolgend erwähnten Achsen bzw. Richtungen x, y und z veranschaulicht sind, ist in der Figur 1 mit 200 bezeichnet. Das Lasermikrodissektionssystem 100 umfasst ein Mikroskop 10. In einem Mikroskopfuß 1 1 des Mikroskops 10 kann eine hier nur teilweise dargestellte Beleuchtungseinrichtung 12 vorgesehen sein. Diese kann beispielsweise eine (nicht dargestellte) Lichtquelle und geeignete Mittel zur Beeinflussung des durch die Lichtquelle bereitgestellten Beleuchtungslichts umfassen, beispielsweise Filter und/oder Blenden. Zur Durchlichtbeleuchtung und zur Einstellung geeigneter Kontrast- bzw. Beobachtungsverfahren kann eine Kondensoreinheit 90 vorgesehen sein. In FIG. 1, a laser microdissection system or an abovementioned laser microdissection device, which can be used for carrying out the invention, is shown schematically and designated by 100 as a whole. The laser microdissection system 100 corresponds in substantial parts to that disclosed in EP 1 276 586 B1, to which reference is expressly made. A coordinate system, by means of which the axes or directions x, y and z mentioned below are illustrated, is denoted by 200 in FIG. The laser microdissection system 100 comprises a microscope 10. In a microscope head 1 1 of the microscope 10, an illumination device 12, which is only partially illustrated here, can be provided. This may, for example, comprise a light source (not shown) and suitable means for influencing the illumination light provided by the light source, for example filters and / or diaphragms. For transmitted light illumination and for setting suitable contrast or observation methods, a condenser unit 90 can be provided.
Am Mikroskopfuß 1 1 kann beispielsweise auch eine Benutzereingabe- und/oder Benutzerinformationseinheit 13 angeordnet sein, die beispielsweise als Touch-screen ausgebildet sein kann, und über die der Benutzer beispielsweise Betrachtungsund/oder Bearbeitungsparameter eingeben und/oder auslesen kann. At the microscope head 1 1, for example, a user input and / or user information unit 13 may be arranged, which may be formed, for example, as a touch screen, and via which the user can enter and / or read, for example, viewing and / or processing parameters.
Ferner ist ein Triebknopf 14 vorgesehen. Dieser dient zur Bedienung eines Grob- und eines Feintriebs zur Einstellung einer Höhe eines Mikroskoptischs 30. Eine Probe 51 , beispielsweise eine in einem entsprechenden Objektträger bzw. einem Probenhalter 52 angebrachte Gewebeprobe, kann hierdurch in eine Objektebene eines Objektivs 41 gebracht werden. Das Objektiv 41 ist neben weiteren Objektiven 42 in einem Objektivrevolver 40 befestigt. Zum Schutz vor Laserstrahlung kann eine Schutzhaube 15 vorgesehen sein. Furthermore, a drive knob 14 is provided. This serves to operate a coarse and a fine drive for adjusting a height of a microscope stage 30. A sample 51, for example a tissue sample attached in a corresponding slide or a sample holder 52, can thereby be brought into an object plane of an objective 41. The objective 41 is fastened next to other objectives 42 in a nosepiece 40. To protect against laser radiation, a protective cover 15 may be provided.
Von der Probe 51 ausgehendes Beobachtungslicht verläuft entlang eines Beobachtungsstrahlengangs a. In einer Tubuseinheit 60 mit geeigneten Auskoppeleinrichtungen 61 kann ein vorzugsweise variabler Anteil des Beobachtungslichts, beispielsweise um 60°, ausgekoppelt und mittels eines Okularpaars 62 einem Benutzer dargeboten werden. Ein weiterer Anteil des Beobachtungslichts kann in eine digitale Bilderfassungseinheit 63 eingekoppelt und bildgebend erfasst werden. Der Bilderfassungseinheit 63 kann ein Bildauswertungsmodul 64 zugeordnet sein, das in einer Steuereinheit 82 oder einem Steuerrechner 81 (siehe unten) oder an anderer Stelle räumlich angeordnet ist.. Die dazu notwendigen Verbindungen zum Steuerrechner sind mit 83 bezeichnet. Observation light emanating from the sample 51 runs along an observation beam path a. In a tube unit 60 with suitable coupling-out devices 61, a preferably variable portion of the observation light, for example by 60 °, can be coupled out and presented to a user by means of an eyepiece pair 62. Another portion of the observation light can be coupled into a digital image acquisition unit 63 and detected by imaging. The image acquisition unit 63 may be associated with an image evaluation module 64, which is spatially arranged in a control unit 82 or a control computer 81 (see below) or elsewhere. The necessary connections to the control computer are designated by 83.
Das Lasermikrodissektionssystem 100 weist eine Lasereinheit 70 mit einer Laserlichtquelle 75 auf. Ein durch die Laserlichtquelle 75, bei der es sich beispielsweise um eine UV-Laserlichtquelle handeln kann, bereitgestellter Laserstrahl 77 mit Laserstrahlachse b wird in einer Auflichteinrichtung, die hier insgesamt mit 76 angegeben ist, an einem ersten Umlenkspiegel 71 und einem zweiten Umlenkspiegel 72 umgelenkt und durch das Objektiv 41 auf die Probe 51 fokussiert. The laser microdissection system 100 has a laser unit 70 with a laser light source 75. A by the laser light source 75, which is for example a Provided laser beam 77 with laser beam axis b is deflected in a incident light device, which is indicated here at 76 as a whole, at a first deflection mirror 71 and a second deflection mirror 72 and focused by the objective 41 on the sample 51.
Bei dem Lasermikrodissektionssystem 100 kann der Ort, an dem der Laserstrahl 77 auf die Probe 51 in der Objektebene, und damit auch in dem Probenbereich auftrifft, grundsätzlich auf unterschiedliche Weise eingestellt werden. Einerseits kann eine manuelle Versteileinrichtung 31 vorgesehen sein, mittels derer der als Kreuztisch ausgebildete Mikroskoptisch 30 in x- und y-Richtung (also hier senkrecht bzw. parallel zur Papierebene) verstellt werden kann. Neben der VerStelleinrichtung 31 können auch elektromechanische Stellmittel vorgesehen sein, die beispielsweise durch eine Steuereinheit 82 angesteuert bzw. deren Position durch die Steuereinheit 82 erfasst werden kann. In the laser microdissection system 100, the location at which the laser beam 77 impinges on the sample 51 in the object plane, and thus also in the sample area, can basically be set in different ways. On the one hand, a manual adjusting device 31 may be provided by means of which the microscope stage 30 designed as a cross table can be adjusted in the x and y directions (that is to say, perpendicularly or parallel to the plane of the paper). In addition to the adjusting device 31, electromechanical adjusting means can also be provided which can be activated, for example, by a control unit 82 or whose position can be detected by the control unit 82.
Die Steuereinheit 82 kann auch beliebige weitere motorisierte Funktionen des Laser- mikrodissektionssystems 100 steuern und insbesondere eine Schnittstelle zu einem externen Steuerrechner 81 , der über entsprechende Verbindungen 83 angebunden sein kann, bereitstellen. Die Steuereinheit 82 oder der Steuerrechner 81 kann auch beispielsweise mittels des Bildauswertungsmoduls 64 erhaltene Daten auswerten. Beispielsweise kann hierdurch eine Abfolge von Gewebeschichten oder anderer Strukturen der Probe 51 erkannt werden. The control unit 82 may also control any other motorized functions of the laser microdissection system 100, and in particular provide an interface to an external control computer 81, which may be connected via corresponding connections 83. The control unit 82 or the control computer 81 can also evaluate data obtained, for example, by the image evaluation module 64. By way of example, a sequence of tissue layers or other structures of the sample 51 can thereby be recognized.
Für die Lasermikrodissektion kann insbesondere eine Laserablenkvorrichtung 73 vorgesehen sein. Mittels der Laserablenkvorrichtung 73 kann der Laserstrahl 77 gegenüber einer zwischen dem ersten Umlenkspiegel 71 und dem zweiten Umlenkspiegel 72 verlaufenden optischen Achse c abgelenkt werden. Der Laserstrahl kann daher an unterschiedlichen Positionen auf den zweiten Umlenkspiegel 72 auftreffen, der beispielsweise als dichromatischer Teiler ausgebildet sein kann, und wird damit auch an unterschiedlichen Positionen auf die Probe 51 in der Objektebene fokussiert. Eine Ablenkung mittels einer Laserablenkvorrichtung 73 ist im Detail in der EP 1 276 586 B1 gezeigt. Es sei betont, dass hier unterschiedliche Möglichkeiten zur Ablenkung eines Laserstrahls 77 bzw. zur Positionierung der Probe 51 in der Objektebene gegenüber dem Laserstrahl 77 zum Einsatz kommen können. Die Erfindung ist nicht auf das dargestellte Beispiel beschränkt. For laser microdissection, in particular a laser deflection device 73 can be provided. By means of the laser deflection device 73, the laser beam 77 can be deflected relative to an optical axis c extending between the first deflection mirror 71 and the second deflection mirror 72. The laser beam can therefore impinge on the second deflection mirror 72 at different positions, which can be embodied, for example, as a dichromatic divider, and is therefore also focused at different positions on the sample 51 in the object plane. A deflection by means of a laser deflection device 73 is shown in detail in EP 1 276 586 B1. It should be emphasized that here different possibilities for deflecting a laser beam 77 or for positioning the sample 51 in the object plane relative to the Laser beam 77 can be used. The invention is not limited to the illustrated example.
Im dargestellten Beispiel weist die Laserablenkvorrichtung 73 zwei massive gläserne Keilplatten 731 auf, die gegen die optische Achse c geneigt und unabhängig voneinander um die optische Achse c drehbar sind. Hierzu sind die Keilplatten 731 mit Kugellagern 732 gelagert. Jede der Keilplatten ist mit einem Zahnrad 733 verbunden. Die Zahnräder 733 können jeweils mittels Aktoren 734 gedreht wer-den, die mit entsprechenden Ansteuersignalen beaufschlagt werden können und entsprechend die Zahnräder 733 antreiben. Die Rotationseinrichtungen können über Positonsgeber 735 verfügen (hier nur an dem rechten Aktor 734 gezeigt). Eine durch die Positonsgeber 735 erfasste Position kann an die Steuereinheit 82 übermittelt werden. In the example shown, the laser deflection device 73 has two solid glass wedge plates 731, which are inclined relative to the optical axis c and are rotatable independently of each other about the optical axis c. For this purpose, the wedge plates 731 are mounted with ball bearings 732. Each of the wedge plates is connected to a gear 733. The gears 733 can each be rotated by means of actuators 734 wer-the, which can be acted upon with corresponding drive signals and drive the gears 733 accordingly. The rotators may have position sensors 735 (shown here only on the right actuator 734). A position detected by the position sensors 735 may be transmitted to the control unit 82.
Mit der hier beschriebenen Lasermikrodissektionseinrichtung 100 kann mittels eines Lasermikrodissektionsverfahrens zumindest ein Teil einer auf dem Objetträger 52 befindlichen Probe 51 ausgeschnitten werden. With the laser microdissection device 100 described here, at least part of a sample 51 located on the object carrier 52 can be cut out by means of a laser microdissection method.
In an sich bekannter Weise wird beispielsweise die Probe 51 visualisiert oder das entsprechende Bild der Probe 51einem Bildverarbeitungssystem zur automatischen Verarbeitung zugeführt. Ein interessierender Probenbereich kann hierbei beispielsweise durch Färbung sichtbar gemacht oder für die Bildverarbeitung verwertbar gemacht sein. Dieser Probenbereich soll als Dissektat einer weiteren Analyse zur Verfügung gestellt werden. Hierzu wird der Probenbereich beispiels-weise mit einer individuellen Schnittlinie umgeben, wobei diese Schnittlinie die Objektkontur des Probenbereichs abbildet. In der Praxis kann die Schnittlinie vom eigentlichen Probenbereich um einen gewissen Betrag beabstandet gewählt werden, um auf Grund des endlichen Durchmessers des Laserfokus beim Schneiden den Probenbereich im Randbereich nicht zu zerstören. In a manner known per se, for example, the sample 51 is visualized or the corresponding image of the sample 51 is fed to an image processing system for automatic processing. A sample region of interest may be made visible for example by staining or made usable for image processing. This sample area should be made available as a dissectate for further analysis. For this purpose, the sample area is surrounded, for example, with an individual cutting line, this cutting line imaging the object contour of the sample area. In practice, the cutting line may be chosen to be spaced apart from the actual sample area by a certain amount in order not to destroy the sample area in the edge region due to the finite diameter of the laser focus during cutting.
In an sich bekannter Weise wird mittels der in Figur 1 dargestellten Laserdissektions- einrichtung 100 der Laserstrahl 77 mittels der Ablenkungsvorrichtung 73 entsprechend der vorgegebenen individuellen Schnittlinie verschoben, so dass der Laserstrahlfokus die Schnittlinie beschreibt. Hierzu wird die Laserablenkvor-richtung 73 mittels der Steuereinheit 82 entsprechend angesteuert (vergleiche die obigen Erläuterungen). Nach Beschreiben der Schnittlinie durch den Laserstrahl-fokus fällt das ausgeschnittene Mikrodissektat veranlasst durch Schwerkraft in einen (in Figur 1 nicht dargestellten) Lasermikrodissektat- Auffangbehälter 53. In a manner known per se, the laser beam 77 is displaced by means of the deflection device 73 in accordance with the predetermined individual cutting line by means of the laser dissection device 100 shown in FIG. 1, so that the laser beam focus describes the section line. For this purpose, the Laserablenkvor-direction 73 by means of Controlled accordingly control unit 82 (see the above explanations). After describing the cutting line through the laser beam focus, the cut microdissect falls by gravity into a laser microdissection collecting tank 53 (not shown in FIG. 1).
Figur 2 zeigt sehr schematisch nur die wesentlichen Bestandteile des Lasermikro- dissektionssystems 100 aus Figur 1 , nämlich das zum Fokussieren des Laserstrahls 77 verwendete Mikroskopobjetiv 41 und den fokussierten Laserstrahl 77, dessen Fokus im Wesentlichen auf die Probe 51 gerichtet ist. Der Probenhalter ist mit 52 bezeichnet. Der Lasermikrodissektat- Auffangbehälter ist unterhalb der Probe 51 angeordnet und mit 53 bezeichnet. Auch dieser Auffangbehälter 53 ist nur sehr schematisch dargestellt, um die Grundprinzipien der vorliegenden Erfindung zu verdeutlichen. Die Probe 51 befindet sich in der Regel auf einer Trägermembran 54, die ihrerseits von dem Probenhalter 52 gehalten wird. FIG. 2 very schematically shows only the essential components of the laser microdissection system 100 from FIG. 1, namely the microscope objective 41 used to focus the laser beam 77 and the focused laser beam 77, the focus of which is directed essentially onto the sample 51. The sample holder is designated 52. The laser microdissection collecting container is arranged below the sample 51 and denoted by 53. Also, this collecting container 53 is shown only very schematically in order to illustrate the basic principles of the present invention. The sample 51 is usually located on a support membrane 54, which in turn is held by the sample holder 52.
Die Kontaminationsschutzeinrichtung ist in diesem Ausführungsbeispiel mit 500 bezeichnet. Sie weist eine Kontaminationsschutzplatte 550 mit einer Öffnung 551 auf. Bei der Platte handelt es sich beispielsweise um eine 2 mm dicke Plastikplatte oder um ein entsprechend dünnes Blech. Die Spanneinrichtung zum Spannen der Kontaminationsschutzplatte 550 ist mit 510 allgemein bezeichnet. Die Kontaminationsschutzplatte 550 ist an zwei Aufhängungen 560 und 570 befestigt. Mittels einer allgemein mit 540 bezeichneten Justiereinrichtung kann die Kontaminationsschutzplatte 550 in einer (beispielsweise x-Richtung) Haupterstreckungsrichtung der Platte 550 justiert, d.h. in dieser Richtung verschoben werden. Mittels der Spanneinrichtung 510 wird in diesem Ausführungsbeispiel die Platte 550 in derselben Richtung gespannt. The contamination protection device is designated 500 in this exemplary embodiment. It has a contamination protection plate 550 with an opening 551. The plate is, for example, a 2 mm thick plastic plate or a correspondingly thin sheet metal. The tensioning device for tensioning the contamination protection plate 550 is generally designated 510. The contamination protection plate 550 is attached to two suspensions 560 and 570. By means of an adjustment device generally indicated 540, the contamination protection plate 550 can be adjusted in a (for example, x-direction) main direction of extension of the plate 550, i. be moved in this direction. By means of the clamping device 510, the plate 550 is tensioned in the same direction in this embodiment.
In dem in Figur 2 dargestellte Ausführungsbeispiel sind Justiereinrichtungen 540 und Spanneinrichtung 510 miteinander kombiniert. Hierzu ist die Aufhängung 560 an einer Schraubverstellung 580 und die Aufhängung 570 an einer Schraubverstellung 590 gelagert. Über Verstellung der entsprechenden Schrauben (hier nur schematisch dargestellt) kann die Kontaminationsschutzplatte 550 in besagter Erstreckungs- bzw. Raumrichtung verschoben und justiert werden. Diese Justiereinrichtung erlaubt es, die Öffnung 551 der Kontaminationsschutzplatte relativ zu der Position eines Auffangbehäl- ters 53 exakt auszurichten. Gleichzeitig stützt sich der Teil 590 der Schraubverstellung auf ein federndes Element 520, hier eine Sprungfeder, der Spanneinrichtung 510 ab, so dass in jeder gewählten Lage der Platte 550 die Federkraft der Sprungfeder 520 diese Platte 550 in besagter Erstreckungsrichtung spannt. In the exemplary embodiment illustrated in FIG. 2, adjusting devices 540 and clamping device 510 are combined with one another. For this purpose, the suspension 560 is mounted on a screw adjustment 580 and the suspension 570 on a screw adjustment 590. About adjustment of the corresponding screws (shown here only schematically), the contamination protection plate 550 can be moved and adjusted in said extension or spatial direction. This adjusting device allows the opening 551 of the contamination protection plate relative to the position of a collecting container. ters 53 to align exactly. At the same time, the part 590 of the screw adjustment is based on a resilient element 520, here a spring, the tensioning device 510, so that in each selected position of the plate 550, the spring force of the spring 520 spans this plate 550 in said direction of extent.
Die in Figur 2 dargestellte Ausführungsform einer Kontaminationsschutzeinrichtung 500 erlaubt es, den Abstand zwischen Auffangbehälter 53, genauer gesagt zwischen Auffanghalter 530, und dem Probenhalter 52 zu minimieren, um eine mögliche Kontamination noch besser zu verhindern und um die Fallhöhe des Lasermikrodissektats in den Auffangbehälter 53 weiter zu verringern. Hierdurch werden auch nicht aktive Auffangbehälter, die sich neben dem aktiven Auffangbehälter 53 befinden, optimal abgedeckt. Weiterhin kann der Durchmesser der Öffnung 551 auf den minimal notwendigen Durchmesser beschränkt werden, der dem größtmöglichen Sichtfeld der verfügbaren Objektive 41 , 42 entspricht. The embodiment of a contamination protection device 500 shown in FIG. 2 makes it possible to minimize the distance between collecting container 53, more precisely between collecting holder 530, and sample holder 52 in order to even better prevent possible contamination and to further increase the drop height of the laser microdissection into collecting container 53 to reduce. As a result, also non-active collecting container, which are located next to the active collecting container 53, optimally covered. Furthermore, the diameter of the opening 551 can be limited to the minimum necessary diameter, which corresponds to the maximum field of view of the available lenses 41, 42.
Bezugszeichenliste LIST OF REFERENCE NUMBERS
10 Mikroskop 10 microscope
1 1 ikroskopfuß  1 1 ikroskopfuß
12 Beleuchtungseinrichtung  12 lighting device
13 Benutzereingabe-/informationseinheit 13 User input / information unit
14 Triebknopf 14 drive button
15 Schutzhaube  15 protective cover
30 Mikroskoptisch  30 microscope stage
31 manuelle Versteileinrichtung  31 manual adjusting device
40 Objektivrevolver  40 nosepiece
41 Objektiv 41 lens
2 Objektiv  2 lens
51 Probe  51 sample
52 Objektträger, Probenhalter  52 slides, sample holder
53 Auffangbehälter  53 collection container
54 Trägermembran  54 carrier membrane
500 Kontaminationsschutzeinrichtung 500 contamination protection device
510 Spanneinrichtung 510 clamping device
520 Sprungfelder, federndes Element 520 jump fields, springy element
530 Auffang halter530 catcher
40 Justiereinrichtung 40 adjustment device
50 Kontaminationsschutzplatte  50 contamination protection plate
551 Öffnung 551 opening
60 Aufhängung 60 suspension
70 Aufhängung 70 suspension
80 Schraubverstellung 80 screw adjustment
90 Schraubverstellung 60 Tubuseinheit 90 screw adjustment 60 tube unit
61 Auskoppeleinrichtungen  61 decoupling devices
62 Okularpaar  62 eyepiece pair
63 Bilderfassungseinheit  63 image capture unit
64 Bildauswertungsmodul  64 image evaluation module
70 Lasereinheit  70 laser unit
71 Umlenkspiegel  71 deflecting mirror
72 Umlenkspiegel  72 deflection mirror
73 Laserablenkvorrichtung  73 laser deflecting device
75 Laserlichtquelle  75 laser light source
76 Auflichteinrichtung  76 incident light device
77 Laserstrahl  77 laser beam
731 Keilplatten  731 wedge plates
732 Kugellager  732 ball bearings
733 Zahnrad  733 gear
734 Aktor  734 actuator
735 Positionsgeber  735 position transmitter
81 Steuerrechner  81 control computer
82 Steuereinheit  82 control unit
83 Verbindungen  83 connections
90 Kondensoreinheit  90 condenser unit
100 Lasermikrodissektionssystem, -einrichtung 100 laser microdissection system, device
200 Koordinatensystem 200 coordinate system
a Beobachtungsstrahlengangachse b Laserstrahlachse a observation beam axis b laser beam axis
c optische Achse c optical axis

Claims

Patentansprüche claims
1. Kontaminationsschutzeinrichtung (500) für ein Lasermikrodissektionssystem1. Contamination protection device (500) for a laser microdissection system
(100), welches aus einer auf einem Probenhalter (52) gehaltenen Probe (51 ) mit einem Laserstrahl (77) ein Lasermikrodissektat ausschneidet und in einem Lasermikrodissek- tat-Auffangbehälter (53) auffängt, (100) which, using a laser beam (77), cuts out a laser microdissectate from a sample (51) held on a sample holder (52) and traps it in a laser microdissection collecting container (53),
wobei die Kontaminationsschutzeinrichtung (500) eine Kontaminationsschutzplatte (550) mit einer Öffnung (551 )umfasst, wherein the contamination protection device (500) comprises a contamination protection plate (550) having an opening (551),
dadurch gekennzeichnet, characterized,
dass die Kontaminationsschutzeinrichtung (500) zumindest eine Spanneinrichtung (510) zum Spannen der Kontaminationsschutzplatte (550) aufweist und dass die Kontaminationsschutzeinrichtung (500) derart ausgebildet ist, um die Kontaminationsschutzplatte (550) zwischen dem Probenhalter (52) und einem Auffanghalter (530) für den Lasermikrodissektat-Auffangbehälter (53) des Lasermikrodissektionssystems (100) derart anzuordnen, dass die Öffnung (551 ) der Kontaminationsschutzplatte (550) im Bereich der Öffnung des Auffangbehälters (53) liegt. in that the contamination protection device (500) has at least one tensioning device (510) for tensioning the contamination protection plate (550), and that the contamination protection device (500) is designed to separate the contamination protection plate (550) between the sample holder (52) and a collection holder (530) for arrange the laser microdissection collecting container (53) of the laser microdissection system (100) such that the opening (551) of the contamination protection plate (550) lies in the region of the opening of the collecting container (53).
2. Kontaminationsschutzeinrichtung (500) nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Spanneinrichtung (510) an zumindest einer Seite der Kontaminationsschutzplatte (550) angeordnet ist. 2. Contamination protection device (500) according to claim 1, characterized in that the tensioning device (510) is arranged on at least one side of the contamination protection plate (550).
3. Kontaminationsschutzeinrichtung (500) nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Kontaminationsschutzeinrichtung (500) zumindest eine Justiereinrichtung (540) zum Justieren der Kontaminationsschutzplatte (550) in zumindest einer Raumrichtung aufweist, mit welcher die Öffnung (551 ) in der Kontaminationsschutzplatte (550) relativ zu der Öffnung eines ausgewählten Lasermikrodissektat- Auffangbehälters (53) justierbar ist. 3. Contamination protection device (500) according to claim 1 or 2, characterized in that the contamination protection device (500) has at least one adjusting device (540) for adjusting the contamination protection plate (550) in at least one spatial direction, with which the opening (551) in the contamination protection plate (550) is adjustable relative to the aperture of a selected laser microdissection collection container (53).
4. Kontaminationsschutzeinrichtung (500) nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Spanneinrichtung (510) ein federndes Element (520) umfasst, dass derart eingerichtet ist, dass die Federkraft des federnden Elements (520) die Kontaminationsschutzplatte (550) in zumindest einer Erstreckungsrichtung der Kontaminationsschutzplatte (550) spannt. 4. Contamination protection device (500) according to one of claims 1 to 3, characterized in that the tensioning device (510) comprises a resilient element (520), which is arranged such that the spring force of the resilient element (520) biases the contamination protection plate (550) in at least one extension direction of the contamination protection plate (550).
5. Kontaminationsschutzeinrichtung (500) nach Anspruch 3 oder nach Anspruch 4, soweit auf Anspruch 3 zurückbezogen, dadurch gekennzeichnet, dass die Justiereinrichtung (540) eine Schraubverstellung (580, 590) umfasst, die derart eingerichtet ist, dass durch eine Verstellung der Schraubverstellung (580, 590) die Kontaminationsschutzplatte (550) in zumindest einer Raumrichtung verschoben werden kann. 5. Contamination protection device (500) according to claim 3 or claim 4, as far as dependent on claim 3, characterized in that the adjusting device (540) comprises a screw adjustment (580, 590) which is arranged such that by adjusting the Schraubverstellung ( 580, 590) the contamination protection plate (550) can be displaced in at least one spatial direction.
6. Kontaminationsschutzeinrichtung (500) nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein Teil (590) der Schraubverstellung (580, 590) auf das federnde Element (520) abgestützt ist. 6. Contamination protection device (500) according to claim 5, characterized in that a part (590) of the screw adjustment (580, 590) is supported on the resilient element (520).
7. Kontaminationsschutzeinrichtung (500) nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kontaminationsschutzplatte (550) als ein dünnes Blech, eine Plastikplatte oder eine stabile Folie ausgebildet ist. 7. Contamination protection device (500) according to any one of the preceding claims, characterized in that the contamination protection plate (550) is formed as a thin sheet, a plastic plate or a stable film.
8. Kontaminationsschutzeinrichtung (500) nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Dicke der Kontaminationsschutzplatte (550) zwischen 0,1 und 2 mm beträgt. Contamination protection device (500) according to claim 7, characterized in that the thickness of the contamination protection plate (550) is between 0.1 and 2 mm.
9. Lasermikrodissektonssystem (100) mit einem Probenhalter (52) zur Aufnahme einer zu dissektierenden Probe (51 ) und einem Auffanghalter (530) zur Aufnahme eines Lasermikrodissektat- Auffangbehälters (53), welches aus der Probe (51 ) mit einem Laserstrahl (77) ein Lasermikrodissektat ausschneidet und in dem Lasermikrodissek- tat-Auffangbehälter (53) auffängt, 9. laser microdissecton system (100) having a sample holder (52) for receiving a sample (51) to be dissected and a collection holder (530) for receiving a laser microdissectose collection container (53) which is formed from the sample (51) with a laser beam (77) cutting out a laser microdissectate and collecting it in the laser microdissection collecting container (53),
und in dem eine Kontaminationsschutzeinrichtung (500) vorgesehen ist, die eine Kontaminationsschutzplatte (550) mit einer Öffnung (551 ) umfasst, and in which a contamination protection device (500) is provided, which comprises a contamination protection plate (550) with an opening (551),
dadurch gekennzeichnet, characterized,
dass die Kontaminationsschutzeinrichtung (500) zumindest eine Spanneinrichtung (510) zum Spannen der Kontaminationsschutzplatte (550) aufweist und dass die Kontaminationsschutzeinrichtung (500) derart ausgebildet ist, um die Kontaminationsschutzplatte (550) zwischen dem Probenhalter (52) und einem Auffanghalter (530) für den Lasermikrodissektat-Auffangbehälter (53) des Lasermikrodissektionssystems (100) derart anzuordnen, dass die Öffnung (551 ) der Kontaminationsschutzplatte (550) im Bereich der Öffnung des Auffangbehälters (53) liegt. in that the contamination protection device (500) has at least one tensioning device (510) for tensioning the contamination protection plate (550), and that the contamination protection device (500) is designed to separate the contamination protection plate (550) between the sample holder (52) and a collection holder (530) for arrange the laser microdissection collecting container (53) of the laser microdissection system (100) such that the opening (551) of the contamination protection plate (550) lies in the region of the opening of the collecting container (53).
10. Lasermikrodissektionssystem (100) nach Anspruch 9, bei der die Kontaminationsschutzeinrichtung (500) sich dadurch auszeichnet, The laser microdissection system (100) of claim 9, wherein the contamination control device (500) is characterized
dass die Spanneinrichtung (510) an zumindest einer Seite der Kontaminationsschutzplatte (550) angeordnet ist. in that the tensioning device (510) is arranged on at least one side of the contamination protection plate (550).
1 1. Lasermikrodissektionssystem (100) nach einem der Ansprüche 9 bis 10, bei der die Kontaminationsschutzeinrichtung (500) sich dadurch auszeichnet, 1 1. A laser microdissection system (100) according to any one of claims 9 to 10, wherein the contamination protection device (500) characterized thereby,
dass die Kontaminationsschutzeinrichtung (500) zumindest eine Justiereinrichtung (540) zum Justieren der Kontaminationsschutzplatte (550) in zumindest einer Raumrichtung aufweist, mit welcher die Öffnung (551 ) in der Kontaminationsschutzplatte (550) relativ zu der Öffnung eines ausgewählten Lasermikrodissektat-Auffangbehälters (53) justierbar ist. in that the contamination protection device (500) has at least one adjusting device (540) for adjusting the contamination protection plate (550) in at least one spatial direction with which the opening (551) in the contamination protection plate (550) relative to the opening of a selected laser microdissection collecting container (53). is adjustable.
12. Lasermikrodissektionssystem (100) nach einem der Ansprüche 9 bis 10, bei der die Kontaminationsschutzeinrichtung (500) sich dadurch auszeichnet, The laser microdissection system (100) of any one of claims 9 to 10, wherein the contamination control device (500) is characterized
dass die Spanneinrichtung (510) ein federndes Element (520) umfasst, das derart eingerichtet ist, dass die Federkraft des federnden Elements (520) die Kontaminationsschutzplatte (550) in zumindest einer Erstreckungsrichtung der Kontaminationsschutzplatte (550) spannt. in that the tensioning device (510) comprises a resilient element (520) arranged such that the spring force of the resilient element (520) tensions the contamination protection plate (550) in at least one extension direction of the contamination protection plate (550).
13. Lasermikrodissektionssystem (100) nach Anspruch 1 1 , bei der die Kontaminationsschutzeinrichtung (500) sich dadurch auszeichnet, dass die Justiereinrichtung (540) eine Schraubverstellung (580, 590) umfasst, die derart eingerichtet ist, dass durch eine Verstellung der Schraubverstellung (580, 590) die Kontaminationsschutzplatte (550) in zumindest einer Raumrichtung verschoben werden kann. 13. laser microdissection system (100) according to claim 1 1, wherein the contamination protection device (500) is characterized in that the adjusting device (540) comprises a screw adjustment (580, 590) which is arranged such that by an adjustment of the screw adjustment (580 , 590) the contamination protection plate (550) can be displaced in at least one spatial direction.
14. Lasermikrodissektionssystem (100) nach Anspruch 13, bei der die Kontaminationsschutzeinrichtung (500) sich dadurch auszeichnet, dass ein Teil (590) der Schraub- Verstellung (580, 590) auf das federnde Element (520) abgestützt ist. 14. The laser microdissection system (100) according to claim 13, wherein the contamination protection device (500) is characterized in that a part (590) of the screw Adjustment (580, 590) is supported on the resilient element (520).
15. Lasermikrodissektionssystem (100) nach einem der Ansprüche 9 bis 14, bei der die Kontaminationsschutzeinrichtung (500) sich dadurch auszeichnet, dass die Kontaminationsschutzplatte (550) als ein dünnes Blech oder eine Plastikplatte ausgebildet ist. 15. A laser microdissection system (100) according to any one of claims 9 to 14, wherein the contamination protection device (500) is characterized in that the contamination protection plate (550) is formed as a thin sheet or a plastic plate.
16. Lasermikrodissektionssystem (100) nach Anspruch 15, bei der die Kontaminati- onsschutzeinichtung (500) sich dadurch auszeichnet, 16. The laser microdissection system (100) according to claim 15, wherein the contamination protection device (500) is characterized in that
dass die Dicke der Kontaminationsschutzplatte (550) zwischen 0,1 und 2 mm beträgt. the thickness of the contamination protection plate (550) is between 0.1 and 2 mm.
17. Lasermikrodissektionssystem (100) nach einem der Ansprüche 9 bis 16, das einMikroskop (10), eine Laserlichtquelle (75) zur Erzeugung eines Laserstrahls (77), eine Ablenkvorrichtung (73) zur Ablenkung des Laserstrahls (77), eine Auflichteinrichtung (76) zum Fokussieren des Laserstrahls (77) durch ein Mikroskopobjektiv (41 ) auf die Probe (51 ), einen Mikroskoptisch (30) zur Aufnahme des Probenhalters (52) zur Halterung der zu dissektierenden Probe (51 ) und den Auffanghalter (530) zur Aufnahme des Lasermikrodissektat- Auffangbehälters (53) umfasst. 17. A laser microdissection system (100) according to one of claims 9 to 16, comprising a microscope (10), a laser light source (75) for generating a laser beam (77), a deflection device (73) for deflecting the laser beam (77), incident light device (76 ) for focusing the laser beam (77) through a microscope objective (41) onto the sample (51), a microscope stage (30) for receiving the sample holder (52) for holding the sample (51) to be dissected and the collection holder (530) for receiving of the laser microdissection collection container (53).
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