+

WO2009010661A2 - Reacteur pour la mise en oeuvre d'un procede de culture de tissus osseux - Google Patents

Reacteur pour la mise en oeuvre d'un procede de culture de tissus osseux Download PDF

Info

Publication number
WO2009010661A2
WO2009010661A2 PCT/FR2008/000846 FR2008000846W WO2009010661A2 WO 2009010661 A2 WO2009010661 A2 WO 2009010661A2 FR 2008000846 W FR2008000846 W FR 2008000846W WO 2009010661 A2 WO2009010661 A2 WO 2009010661A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
particles
bone
flow
cells
reactor
Prior art date
Application number
PCT/FR2008/000846
Other languages
English (en)
Other versions
WO2009010661A3 (fr
Inventor
Bertrand David
Hervé Petite
Valentin Myrtil
Original Assignee
Universite Paris Diderot - Paris 7
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universite Paris Diderot - Paris 7, Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) filed Critical Universite Paris Diderot - Paris 7
Publication of WO2009010661A2 publication Critical patent/WO2009010661A2/fr
Publication of WO2009010661A3 publication Critical patent/WO2009010661A3/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3821—Bone-forming cells, e.g. osteoblasts, osteocytes, osteoprogenitor cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3843—Connective tissue
    • A61L27/3847—Bones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/06—Tubular
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/02—Membranes; Filters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/04—Mechanical means, e.g. sonic waves, stretching forces, pressure or shear stimuli
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants

Definitions

  • the present invention relates to a method and a device for culturing bone tissue.
  • the bone graft is widely practiced, for example when following the removal of tumors or infected bone tissue, it is necessary to fill this loss of bone tissue, sometimes important, by bone transplantation. Also, an autologous bone graft is transplanted to fill the bone space left free by excision.
  • the graft is taken from another healthy bone of said patient taking into account the morphological parameters mentioned above. Then, the graft is implanted in a massive form in said space to be filled so as to obtain a mechanical continuity in said bone part reached.
  • the removal of a graft on the patient already weakened by his pathology is not always desirable nor possible.
  • a problem that arises and that aims to solve the present invention is to provide a device for implementing a bone tissue culture method, which allows to quickly produce a bone tissue ready to be implanted and also that is relatively simple to implement.
  • the present invention provides a method for culturing bone tissue, said method being of the type in which particles of a material compatible with bone tissue and stem cells are provided. bone cells; then said particles are seeded with said bone cell stem cells; also, a nutritional fluid containing nutritional elements for proliferating bone cells is provided and said nutritional elements are delivered to said bone cell stem cells through a flow of said nutritional fluid; according to the invention, particles comprising calcium carbonate are provided and said stem cells of bone cells are maintained within said flow so that said flow exerts mechanical stresses on said cells and said bone cells proliferate on said particles to form implantable bone tissue granules; and finally, said granules of implantable bone tissue are recovered for transplanting.
  • a mineral material calcium carbonate
  • the density of which is much greater than the density of the water.
  • a coral-based natural osteoconductive ceramic is a preferred material for forming these particles because it is particularly inexpensive.
  • it is relatively easy to produce particles calibrated in this material.
  • a feature of the invention lies in the way of producing bone tissue by proliferating mesenchymal stem cells on particles independent of each other thanks to the flow of a nutritional fluid that not only allows the supply of nutritional elements, but also exerts mechanical stresses on the cells, which further stimulates their proliferation.
  • said flow of nutritional fluid to the wall of said particles forming a parietal boundary layer forms a flow able to exert parietal shear stresses of between 10 ⁇ 4 and 10 '2 Pa in said parietal boundary layer.
  • These parietal shear stresses are for example of the order of 10 3 Pa.
  • individualized bone tissue granules are obtained which can then be transplanted into the bone space to be filled.
  • there is no need to predict in advance, or even to measure beforehand the volume of the bone space to be filled since the granules of bone tissue are produced in relatively large numbers, and they are then inserted per pack into the bone space until it is completely filled. Then, these granules of bone tissue transform very quickly into a solid bone implant that extends into the bone space to be filled.
  • porous particles are provided to allow the cells to proliferate within these particles, as will be explained in the detailed description, which allows faster reconstitution of healthy bone tissue after transplantation.
  • coral-based material has the advantage of being itself porous.
  • resorbable particles are provided, that is to say particles whose material disappears little by little after implantation of the graft to disappear completely eventually.
  • the above-mentioned coral-based particles have this quality.
  • particles having a size of between 0.8 and 5 mm are provided, and for example particles of substantially cubic shape with sides of 3 mm are provided.
  • the aforementioned mineral material is easily packaged into cubic particles of this size.
  • the pH of the nutritional fluid which flows between the seeded particles and in which the cells are immersed is maintained at a value of between 7 and 8, for example 7.4.
  • the present invention provides a bone tissue culture reactor, said reactor comprising a longitudinal culture chamber in which particles of a bone-compatible material are maintained, said particles being intended to be seeded with bone tissue.
  • bone cell stem cells said reactor comprising means for delivering nutritional elements to the seeded particles via a nutritional fluid flow;
  • the reactor comprises a cylindrical tube having a filling chamber and a culture chamber and a support grid mounted between said culture chamber and said filling chamber for holding said bone cell stem cells within said flow so as to said flow exerts mechanical stresses on said cells and said bone cells proliferate on said particles to form implantable bone tissue granules.
  • the reactor according to the invention makes it possible to maintain the bone cells at the heart of the flow of nutritional fluid, which not only enables the nutritional elements to be delivered to the cells so that they proliferate, but also to exert constraints on these cells that promote their proliferation.
  • the reactor comprises injection means for injecting the nutritional fluid inside said filling chamber in a direction substantially transverse to said filling chamber.
  • the interior of the filling chamber forms a recirculation zone.
  • a laminar flow is obtained in the filling chamber and in the culture chamber, the Reynolds number of which is relatively small and less than 25. than for the same injection rate, and for the same reactor geometry but in a longitudinal direction inside the filling chamber, directly to the support grid, non-creeping laminar flows are obtained whose Reynolds number is greater than 25.
  • the reactor comprises a base for sealing said cylindrical tube and said base has an inlet opening opening into said filling chamber, said inlet opening being extended by a T-tube located inside.
  • said filling chamber (12) so as to inject the nutritional fluid from the center to the periphery of the chamber in a substantially transverse direction.
  • said T-tube has, for example, two opposite openings oriented transversely in a direction substantially perpendicular to the cylindrical tube, and a flow is obtained in the filling chamber whose Reynolds number is close to 10.
  • said culture chamber is a cylindrical tube with a circular director, having a dimer D and a length L, the ratio of length L and diameter D being between 10 and 15.
  • This cylindrical tube is for example made of plastic, ideally transparent, at an advantageous cost, so that it can be discarded after a culture cycle, for example 21 days.
  • the particles are introduced and placed in the reactor so as to occupy a circular cylindrical space with a height h and a diameter d, the ratio of the height h and the diameter d being preferably between 4 and 6, Example 5, so as to obtain optimum flow characteristics around the particles.
  • said culture chamber is oriented vertically and said particles are held in said culture chamber resting on a retaining grid, so that the nutritional fluid flows upwardly through said grid and into the culture chamber.
  • said means for delivering nutritional elements to said seeded particles comprises pumping means for pumping a nutritional fluid into a reservoir at a predefined rate to produce said flow of nutritional fluid in the culture chamber.
  • said pumping means can create a flow whose flow rate is between 8 and 15 ml / min, so as to create a substantially laminar flow to the wall of said seeded particles without causing them to be suspended in the nutritional fluid.
  • the particles remain in abutment on each other, retained by said grid.
  • Figure 1 is a schematic view of a reactor for carrying out a bone tissue culture method according to the invention
  • Figure 2A is a schematic view of a portion of a reactor as shown in Figure 1;
  • Figure 2B is a numbering diagram relating to the reactor portion shown in Figure 2A.
  • Figure 1 illustrates a reactor for culturing bone tissue according to the invention.
  • the reactor comprises a cylindrical tube 10 plastic material with circular director, with an outside diameter of about 33 mm, and a total height H of 215 mm.
  • the inside diameter of the cylindrical tube 10 is however between 10 and 15 mm, for example 12 mm.
  • the cylindrical tube 10 defines a culture chamber 11 with a height close to 160 mm. Note that the drawings of Figure 1 are not reproduced in the proportions of the dimensions given above for the sake of clarity.
  • a filling chamber 12 is formed at the base of the cylindrical tube 10 and has a height of 40 mm for a diameter of 26 mm.
  • a support grid 14 is mounted between the culture chamber 11 and the filling chamber 12, and extends along a straight section of the cylindrical tube 10. This support grid 14 is formed of a disk pierced with orifices 15 of 1 mm in diameter, which orifices are spaced apart by a distance of 2 mm.
  • the cylindrical tube 10 is mounted substantially vertically on a base 16 to seal it sealingly, and this base 16 has an inlet opening 18 which opens into the filling chamber 12 opposite the support grid 14.
  • This inlet opening 18 is connected to a tank 20 with a capacity of at least 250 ml, via an inlet duct 22, which inlet duct 22 passes through a peristaltic pump 24.
  • the inlet opening 18 is extended by a T-tube 26 located inside the filling chamber 12 and near the inlet opening 18; the T-tube 26 having two opposite openings oriented transversely in a direction substantially perpendicular to the cylindrical tube 10.
  • the reactor has a shutter 28 for sealing the cylindrical tube 10 in its upper part.
  • the shutter 28 has an outlet opening 30 connected to the reservoir 20 via a return conduit 32.
  • the peristaltic pump 24 is adapted to suck in the reservoir 20 a nutritional fluid 31 which will be described below and to push it back into the filling chamber 12 so that it can flow in the culture chamber 11 through the support grid 14, and then escape through the outlet opening 30 to return, in a closed circuit, into the reservoir 20 via the return duct 32.
  • the nutritional fluid flows upwardly into the culture chamber 11.
  • the closed circuit of nutritional fluid is preferably impervious to the external atmosphere.
  • the nutritional fluid is injected transversely inside the filling chamber, from the center to the periphery and thus flows into the filling chamber 12 and through the orifices 15 of the the support grid 14 according to homogeneous flow characteristics for the entire surface of the grid.
  • these flow are the characteristics of this flow which, upstream of the culture chamber 11, are dependent on the peristaltic pump 24, and in particular the instantaneous speed of the flow, are they damped by means of the T-tube 26.
  • the ascensional flow of the nutritional fluid within the culture chamber 11 is homogeneous along a section of this culture chamber 11.
  • the Reynolds number and this flow is between 5 and 15.
  • the bone tissue culture method according to the invention also uses particles of a mineral material, and in this case particles based on coral Porites species.
  • This material consists essentially of calcium carbonate and the particles formed in this material are essentially of cubic geometry with sides of about 3 mm in length. Moreover, this material is porous and it is also absorbable as will be explained below.
  • These particles will then be loaded into the culture chamber 11 bearing on the support grid 14, but before they are seeded with bone cell stem cells.
  • These stem cells mesenchymal stem cells (MSCs) and in this case a murine cell line C3H10T1 / 2 containing 10 6 cells per milliliter and expressing a fluorescent marker, GFP, easily repairable by fluorescence microscopy, are sown on the aforementioned particles.
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • GFP fluorescent marker
  • the seeded seeds, free, are then loaded into the culture chamber 11 and above the support grid 14 to a height of between 40 and 60 mm.
  • the seeded and charged particles form between them interstices through which the nutritional fluid will be able to flow.
  • the nutritional fluid incorporating nutritional elements including BME (Based Medium Eagle) and fetal calf serum (FCS), it is introduced into the reservoir 20 and injected into the filling chamber 12 at a rate of 10. ml per minute.
  • the filling chamber 12 is gradually filled with nutritional fluid, which then flows through the support grid 14 and between the seeded particles of the culture chamber 11.
  • the flow rate of 10 ml per minute is sufficient moderate, and the particles are sufficiently dense relative to the density of the nutritional fluid, so that the flow does not cause the separation of the seeded particles.
  • These seeded particles remain in "packed bed” during the flow, that is to say in support on each other and they are retained by the support grid 14.
  • the surface of a cell on which the nutritional fluid exerts stresses is substantially equivalent to 10 ⁇ 10 m 2 .
  • the cells adhering to the particles they are then subjected to shear stresses of viscous origin from the nutritional fluid, which then appear within the parietal boundary layer or the boundary layer to the wall. These are the stresses that exert forces and forces on these cells.
  • the parietal shear stresses in these channels are then, by applying the conventional laws of the flow of fluids in a tube, about 4 ⁇ 10 -3 Pa. Also, the associated forces related to the surface of a cell are order of 4.10 13 N, or 40 pico Newton (pN).
  • FIG. 2A schematically depicting strata 33 of coral particles 35 on top of one another and of the first 34, in contact with a support grid 14 'at the fourteenth and last, 36, located towards the exit opening 30 ', and then to Figure 2B illustrating the amount of cells present on the granules of the different layers after 21 days of culture.
  • the index and cell proliferation is plotted on the abscissa on a scale from 0 to 10, while the number of each of the strata is plotted on the y-axis on a scale from 1 to 14 and corresponding precisely to the successive strata.
  • the diagram of Figure 2B reports horizontally for each of the strata 33, the proliferation index in the form of a thick line whose end corresponds to this index.
  • the proliferation of the cells varies between 7 and 8 times the number of initial cells after 21 days of culture, regardless of the layer of particles considered between the first 34 and the fourteenth 36. Therefore, it appears that the proliferation of the cells is substantially identical on all the strata of seeded particles, from the first 34 to the fourteenth 36, which means that the nutrient supply conditions are substantially identical, regardless of the position of the particles within of the culture chamber 11. This means that the flow conditions are relatively homogeneous around the seeded particles, from the first 34 to the last layer 36.
  • the biohybrid material ready to be implanted and which comprises a plurality of granules must have a relatively uniform cell concentration for all the granules.
  • all the bone cells cultured for 21 days on 250 particles according to the embodiment described above can fill a bone defect with a volume between 850 and 900 mm 3 .
  • a reactor of a larger size should be provided whose dimensions would be determined by homothety with respect to aforementioned reactor. For example, the dimensions of such a new reactor could be twice that shown in Figure 1.
  • the absence of abrasion of the granules of the biohybrid material is checked throughout the culture, which abrasion could come from the flow of the fluid. nutritional.
  • the calcium level of the nutritional fluid is measured during the 21 days of culture and it is verified that it oscillates between 3 and 4 millimoles per liter.
  • cells that multiply on coral particles do not come off. Indeed, if one initially measures a quantity of one million cells in the nutritional fluid, after six days, there remains only about 250 000 and this number does not evolve until the 21st day.
  • the pH of the nutritional fluid remains constant at around 7.4. It should be noted that the maintenance of the pH at a physiological pH is crucial for the survival and development of the mesenchymal stem cells; and that contrary to the techniques of the prior art, the method according to the invention does not require any particular regulation of this pH.
  • the particles of the material used constitute porous matrices within which the bone cells can also proliferate.
  • the proliferation of bone cells from mesenchymal stem cells is optimal because the transfer of nutrients, oxygen and cellular waste in particular, between the nutritional fluid and the cells operate quickly considering the flow of the nutritional fluid through the particles. Diffusion and convective material transfers are by nature increased relative to cells cultured in a static nutritional fluid.
  • the culture method according to the invention makes it possible to increase very significantly the productivity of the bone cell culture.
  • the reactor implementing the method operates in a closed circuit and only the reservoir of nutritional fluid is changed during a production cycle, which avoids not only the contamination of the bone cell culture, but also the handling times. .
  • the tank change can be automated.
  • the design of the reactor is relatively simple and it can be made in a disposable material at an advantageous cost.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

L'invention concerne un procédé de culture de tissus osseux. Ledit procédé étant du type selon lequel : on fournit des particules d'un matériau compatible avec le tissu osseux; on fournit des cellules souches de cellules osseuses; on ensemence lesdites particules avec lesdites cellules souches de cellules osseuses; on fournit un fluide nutritionnel (31) contenant des éléments nutritionnels destinés à faire proliférer des cellules osseuses; on délivre lesdits éléments nutritionnels auxdites cellules souches de cellules osseuses par l'intermédiaire d'un écoulement dudit fluide nutritionnel (31); et, selon l'invention on maintient lesdites cellules souches de cellules osseuses à l'intérieur dudit écoulement de façon que ledit écoulement exerce des contraintes mécaniques sur lesdites cellules et que lesdites cellules osseuses prolifèrent sur lesdites particules (35) pour former des granules de tissu osseux implantables. On récupère ensuite lesdits granules de tissus osseux implantables pour les transplanter.

Description

Réacteur pour la mise en oeuyre d'un procédé de culture de tissus osseux
La présente invention se rapporte à un procédé et un dispositif permettant de cultiver du tissu osseux.
La greffe osseuse est largement pratiquée, par exemple lorsque à la suite d'exérèse de tumeurs ou encore de tissus osseux infectés, il est nécessaire de combler cette perte de tissus osseux, parfois importante, par une transplantation osseuse. Aussi, un greffon osseux autologue est-il transplanté pour combler l'espace osseux laissé libre par l'exérèse.
Par conséquent, il est tout d'abord nécessaire de déterminer sur le patient par imagerie de la partie osseuse atteinte, les paramètres morphologiques de l'espace osseux à combler, soit sa forme et ses dimensions. Ensuite, le greffon est prélevé sur une autre partie osseuse saine dudit patient en tenant compte des paramètres morphologiques précités. Puis, le greffon est implanté sous une forme massive dans ledit espace à combler de manière à obtenir une continuité mécanique dans ladite partie osseuse atteinte. Cependant, le prélèvement d'un greffon sur le patient déjà affaibli par sa pathologie, n'est pas toujours souhaitable ni possible.
Aussi, il a été imaginé de reproduire artificiellement des greffons osseux à la dimension désirée pour ensuite les transplanter dans l'espace osseux à combler. On pourra notamment se référer au document américain US 2005/002910, dans lequel il est décrit un réacteur permettant de produire des greffons osseux de grande taille, par exemple la tête d'un fémur.
Cependant, non seulement le temps nécessaire à la production de tels greffons osseux est relativement long mais au surplus, il doit être conformé à l'espace osseux à résorber, ce qui requiert des moyens supplémentaires relativement complexes, et notamment des parois de réacteur déformables. Aussi, un problème qui se pose et que vise à résoudre la présente invention est de fournir un dispositif pour mettre en oeuvre un procédé de culture de tissus osseux, qui permette de produire rapidement un tissu osseux prêt à être implanté et aussi qui soit relativement simple à mettre en oeuvre.
Dans le but de résoudre ce problème, selon un premier aspect, la présente invention propose un procédé de culture de tissus osseux, ledit procédé étant du type selon lequel, on fournit des particules d'un matériau compatible avec le tissu osseux et des cellules souches de cellules osseuses ; puis on ensemence lesdites particules avec lesdites cellules souches de cellules osseuses ; aussi, on fournit un fluide nutritionnel contenant des éléments nutritionnels destinés à faire proliférer des cellules osseuses et on délivre lesdits éléments nutritionnels auxdites cellules souches de cellules osseuses par l'intermédiaire d'un écoulement dudit fluide nutritionnel ; selon l'invention, on fournit des particules comprenant du carbonate de calcium et on maintient lesdites cellules souches de cellules osseuses à l'intérieur dudit écoulement de façon que ledit écoulement exerce des contraintes mécaniques sur lesdites cellules et que lesdites cellules osseuses prolifèrent sur lesdites particules pour former des granules de tissu osseux implantables ; et enfin, on récupère lesdits granules de tissus osseux implantables pour les transplanter.
Et selon un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, on fournit avantageusement un matériau minéral, du carbonate de calcium, dont la densité est bien supérieure à la densité de l'eau. On expliquera plus en détail dans la suite de la description, l'avantage de cette densité. Une céramique naturelle ostéo-conductrice à base de corail constitue un matériau privilégié pour former ces particules, car il est particulièrement peu coûteux. En outre, il est relativement aisé de produire des particules calibrées dans ce matériau. Ainsi, une caractéristique de l'invention réside dans le mode de production de tissus osseux en faisant proliférer des cellules souches mésenchymateuses sur des particules indépendantes les unes des autres grâce à l'écoulement d'un fluide nutritionnel qui non seulement permet l'apport des éléments nutritionnels, mais aussi exerce des contraintes mécaniques sur les cellules, ce qui stimule plus encore leur prolifération. Avantageusement, ledit écoulement de fluide nutritionnel à la paroi desdites particules formant une couche limite pariétale, on forme un écoulement apte à exercer des contraintes de cisaillement pariétal comprises entre 10~4 et 10'2 Pa dans ladite couche limite pariétale. Ces contraintes de cisaillement pariétal sont par exemple de l'ordre de 103 Pa. De la sorte, on obtient des granules de tissus osseux individualisées que l'on peut ensuite transplanter dans l'espace osseux à combler. Ainsi, dans une certaine mesure, il n'est nul besoin de prévoir à l'avance, ni même de mesurer au préalable le volume de l'espace osseux à combler, puisque les granules de tissus osseux sont produites en relativement grand nombre, et elles sont ensuite insérées par paquet dans l'espace osseux jusqu'à ce qu'il soit entièrement comblé. Ensuite, ces granules de tissus osseux se transforment très rapidement en un implant osseux solide qui s'étend dans l'espace osseux à combler.
Préférentiellement, on fournit des particules poreuses pour permettre aux cellules de proliférer à l'intérieur de ces particules, comme on l'expliquera dans la description détaillée, ce qui permet une reconstitution plus rapide de tissus osseux sains après transplantation. Et le matériau précité à base de corail présente l'avantage d'être lui-même poreux.
Avantageusement, on fournit des particules résorbables c'est-à-dire des particules dont le matériau disparaît peu à peu après l'implantation du greffon pour disparaître complètement à terme. Les particules à base de corail précitées présentent cette qualité. De manière préférée, on fournit des particules dont les dimensions sont comprises entre 0,8 et 5 mm, et par exemple on fournit des particules de formes sensiblement cubiques avec des côtés de 3 mm. Le matériau minéral précité est aisément conditionné en particules cubiques de cette dimension.
Selon un autre mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, le pH du fluide nutritionnel qui s'écoule entre les particules ensemencées et dans lequel baignent les cellules, est maintenu à une valeur comprise entre 7 et 8, par exemple 7,4.
Selon un autre aspect, la présente invention propose un réacteur pour culture de tissus osseux, ledit réacteur comprenant une chambre de culture longitudinale dans laquelle sont maintenues des particules d'un matériau compatible avec le tissu osseux, lesdites particules étant destinées à être ensemencées avec des cellules souches de cellules osseuses, ledit réacteur comprenant des moyens pour délivrer des éléments nutritionnels aux particules ensemencées par l'intermédiaire d'un écoulement de fluide nutritionnel ; le réacteur comprend un tube cylindrique présentant une chambre de remplissage et une chambre de culture et, une grille d'appui montée entre ladite chambre de culture et ladite chambre de remplissage pour maintenir lesdites cellules souches de cellules osseuses à l'intérieur dudit écoulement de façon que ledit écoulement exerce des contraintes mécaniques sur lesdites cellules et que lesdites cellules osseuses prolifèrent sur lesdites particules pour former des granules de tissu osseux implantables.
Ainsi, le réacteur conforme à l'invention permet de maintenir les cellules osseuses au coeur de l'écoulement de fluide nutritionnel, ce qui permet non seulement de délivrer les éléments nutritionnels aux cellules afin qu'elles prolifèrent, mais aussi d'exercer des contraintes mécaniques sur ces cellules qui promeuvent leur prolifération.
En outre, et selon un mode de mise en œuvre de l'invention particulièrement avantageux, le réacteur comprend des moyens d'injection pour injecter le fluide nutritionnel à l'intérieur de ladite chambre de remplissage selon une direction sensiblement transversale à ladite chambre de remplissage. Ainsi, l'intérieur de la chambre de remplissage forme-t-elle une zone de recirculation. De la sorte, et ainsi qu'on l'expliquera ci-après plus en détail, on obtient un écoulement laminaire dans la chambre de remplissage et dans la chambre de culture dont le nombre de Reynolds est relativement faible et inférieure à 25. On observera que pour un même débit d'injection, et pour une même géométrie de réacteur mais selon une direction longitudinale à l'intérieur de la chambre de remplissage, directement vers la grille support, on obtient des écoulements laminaires non rampants dont le nombre de Reynolds est supérieur à 25. Ces écoulements alors dominés par des effets visqueux, sont bien évidemment non turbulents mais ils peuvent présenter cependant, des instabilités. Et par conséquent ces instabilités sont préjudiciables à la prolifération des cellules.
Selon un mode de réalisation particulier, lesdits moyens d'injection permettent d'injecter le fluide nutritionnel du centre de ladite chambre de remplissage vers la périphérie de ladite chambre. Ainsi, préférentiellement, le réacteur comprend une embase pour obturer de manière étanche ledit tube cylindrique et ladite embase présente une ouverture d'entrée débouchant dans ladite chambre de remplissage, ladite ouverture d'entrée étant prolongée par un tube en T situé à l'intérieur de ladite chambre de remplissage (12) de manière à pouvoir injecter le fluide nutritionnel du centre vers la périphérie de la chambre selon une direction sensiblement transversale. Plus précisément, ledit tube en T présente par exemple, deux ouvertures opposées orientées transversalement dans une direction sensiblement perpendiculaire au tube cylindrique, et on obtient alors un écoulement dans la chambre de remplissage dont le nombre de Reynolds est voisin de 10.
Selon un mode de mise en oeuvre du réacteur particulièrement avantageux, ladite chambre de culture est un tube cylindrique à directrice circulaire, présentant un dimère D et une longueur L, le rapport de la longueur L et du diamètre D étant compris entre 10 et 15. Ce tube cylindrique est par exemple réalisé en matière plastique, idéalement transparente, à un coût avantageux, de manière à pouvoir être jeté après un cycle de culture, par exemple de 21 jours. Les particules sont introduites et placées dans le réacteur de manière à occuper un espace cylindrique circulaire d'une hauteur h et d'un diamètre d, le rapport de la hauteur h et du diamètre d étant compris de préférence entre 4 et 6, par exemple 5, de façon à obtenir des caractéristiques d'écoulement optimales autour des particules.
Avantageusement, ladite chambre de culture est orientée verticalement et lesdites particules sont maintenues dans ladite chambre de culture en appui sur une grille de retenue, de sorte que le fluide nutritionnel s'écoule de manière ascensionnelle à travers ladite grille puis dans la chambre de culture. Ainsi, toutes les particules, dans la chambre de culture, subissent-elles un écoulement à leurs parois, sensiblement identique. En outre, lesdits moyens pour délivrer des éléments nutritionnels auxdites particules ensemencées, comprennent des moyens de pompage destinés à pomper un fluide nutritionnel dans un réservoir selon un débit prédéfini, pour produire ledit écoulement de fluide nutritionnel dans la chambre de culture. Avantageusement, lesdits moyens de pompage permettent de créer un écoulement dont le débit est compris entre 8 et 15 ml/min, de manière à créer un écoulement sensiblement laminaire à la paroi desdites particules ensemencées sans pour autant les entraîner en suspension dans le fluide nutritionnel. Ainsi, durant l'écoulement, les particules demeurent en appui les unes sur les autres, retenues par ladite grille.
D'autres particularités et avantages de l'invention ressortiront à la lecture de la description faite ci-après d'un mode de réalisation particulier de l'invention, donné à titre indicatif mais non limitatif, en référence aux dessins annexés sur lesquels : - la Figure 1 est une vue schématique d'un réacteur pour la mise en œuvre d'un procédé de culture de tissus osseux conformes à l'invention ;
- la Figure 2A est une vue schématique d'une partie d'un réacteur tel qu'illustrée sur la Figure 1 ; et,
- la Figure 2B est un diagramme de numération se rapportant à la partie de réacteur représenté sur la Figure 2A.
La Figure 1 illustre un réacteur pour culture de tissus osseux conforme à l'invention. Le réacteur comprend un tube cylindrique 10 en matière plastique à directrice circulaire, d'un diamètre extérieur voisin de 33 mm, et d'une hauteur totale H de 215 mm. Le diamètre intérieur du tube cylindrique 10 est cependant compris entre 10 et 15 mm, par exemple 12 mm. Le tube cylindrique 10 définit une chambre de culture 11 d'une hauteur voisine de 160 mm. On notera que les dessins de la Figure 1 ne sont pas reproduits dans les proportions des dimensions données ci- dessus pour des raisons de clarté.
Une chambre de remplissage 12 est formée à la base du tube cylindrique 10 et elle présente une hauteur de 40 mm pour un diamètre de 26 mm. Une grille d'appui 14 est montée entre la chambre de culture 11 et la chambre de remplissage 12, et elle s'étend selon une section droite du tube cylindrique 10. Cette grille d'appui 14 est formée d'un disque percé d'orifices 15 de 1 mm de diamètre, lesquels orifices sont espacés entre eux d'une distance de 2 mm. Le tube cylindrique 10 est monté sensiblement verticalement sur une embase 16 permettant de l'obturer de manière étanche, et cette embase 16 présente une ouverture d'entrée 18 qui débouche dans la chambre de remplissage 12 à l'opposé de la grille d'appui 14. Cette ouverture d'entrée 18 est reliée à un réservoir 20 d'une capacité d'au moins 250 ml, par l'intermédiaire d'un conduit d'arrivée 22, lequel conduit d'arrivée 22 traverse une pompe péristaltique 24. Par ailleurs, l'ouverture d'entrée 18 est prolongée d'un tube en T 26 situé à l'intérieur de la chambre de remplissage 12 et près de l'ouverture d'entrée 18 ; le tube en T 26 présentant deux ouvertures opposées orientées transversalement dans une direction sensiblement perpendiculaire au tube cylindrique 10.
Au surplus, le réacteur présente un obturateur 28 permettant d'obturer hermétiquement le tube cylindrique 10 dans sa partie supérieure. Et l'obturateur 28 présente une ouverture de sortie 30 reliée au réservoir 20 par l'intermédiaire d'un conduit de retour 32. Ainsi, la pompe péristaltique 24 est adaptée pour aspirer dans le réservoir 20 un fluide nutritionnel 31 que l'on décrira ci-après et pour le refouler dans la chambre de remplissage 12 afin qu'il puisse s'écouler dans la chambre de culture 11 à travers la grille d'appui 14, puis ensuite s'échapper par l'ouverture de sortie 30 pour revenir, selon un circuit fermé, dans le réservoir 20 par l'intermédiaire du conduit de retour 32. De la sorte, le fluide nutritionnel s'écoule de manière ascensionnelle dans la chambre de culture 11. On notera que le circuit fermé de fluide nutritionnel est de préférence étanche vis-à-vis de l'atmosphère extérieure.
Par ailleurs, grâce au tube en T 26, le fluide nutritionnel est injecté transversalement à l'intérieur de la chambre de remplissage, du centre vers la périphérie et il s'écoule ainsi dans la chambre de remplissage 12 et à travers les orifices 15 de la grille d'appui 14 selon des caractéristiques d'écoulement homogènes pour toute la surface de la grille. En réalité, les caractéristiques de cet écoulement qui, en amont de la chambre de culture 11 , sont tributaires de la pompe péristaltique 24, et notamment la vitesse instantanée du flux, sont-elles amorties grâce au tube en T 26. Ainsi, l'écoulement ascensionnel du fluide nutritionnel à l'intérieur de la chambre de culture 11 est-il homogène selon une section de cette chambre de culture 11. En outre, le nombre de Reynolds et de cet écoulement est compris entre 5 et 15.
Le procédé de culture de tissus osseux conforme à l'invention fait aussi appel à des particules d'un matériau minéral, et en l'espèce de particules à base de corail d'espèce Porites. Ce matériau est essentiellement constitué de carbonate de calcium et les particules formées dans ce matériau sont essentiellement de géométrie cubique avec des côtés d'environ 3 mm de longueur. Par ailleurs, ce matériau est poreux et il est également résorbable comme on expliquera ci-après.
Ces particules vont alors être chargées dans la chambre de culture 11 en appui sur la grille d'appui 14, mais auparavant, elles sont ensemencées avec des cellules souches de cellules osseuses. Ces cellules souches, des cellules souches mésenchymateuses (CSMs) et en l'espèce une lignée cellulaire murine C3H10T1/2 contenant 106 cellules par millilitre et, exprimant un marqueur fluorescent, GFP, facilement réparable en microscopie à fluorescence, sont semées sur les particules précitées.
Les particules ensemencées, libres, sont alors chargées dans la chambre de culture 11 et au-dessus de la grille d'appui 14 sur une hauteur comprise entre 40 et 60 mm. Les particules ensemencées et chargées forment entre elles des interstices à travers lesquels le fluide nutritionnel va pouvoir s'écouler.
S'agissant précisément du fluide nutritionnel, incorporant des éléments nutritionnels et notamment du BME (Based Médium Eagle) et du sérum de veau fœtal (SVF), il est introduit dans le réservoir 20 et injecté dans la chambre de remplissage 12 à raison de 10 ml par minute. De la sorte, la chambre de remplissage 12 se remplit progressivement de fluide nutritionnel, lequel s'écoule ensuite à travers la grille d'appui 14 puis entre les particules ensemencées de la chambre de culture 11. Le débit de 10 ml par minute est suffisamment modéré, et les particules sont suffisamment denses par rapport à la densité du fluide nutritionnel, pour que l'écoulement ne provoque pas le décollement des particules ensemencées. Ces particules ensemencées demeurent en « lit tassé» durant l'écoulement, c'est-à-dire en appui les unes sur les autres et elles sont retenues par la grille d'appui 14. On suppose alors en première approximation, que la porosité de l'ensemble des particules ensemencées en « lit tassé», qui équivaut au volume de l'espace occupé par les particules moins le volume total des particules, divisé par ledit volume de l'espace qu'elles occupent, est voisin de 0,5. Ainsi, après avoir chargé 250 particules du type précitées, préalablement ensemencées d'un nombre total de 236 millions de cellules souches, après 15 jours de culture, pour un débit de fluide nutritionnel de 10 ml par minute, on obtient 1 500 millions de cellules, soit plus de six fois plus. Le fluide nutritionnel du réservoir 20 est toutefois remplacé tous les trois jours, car il s'épuise en éléments nutritionnels du fait de la prolifération des cellules et aussi il contient des déchets cellulaires. Par ailleurs, la surface d'une cellule sur laquelle le fluide nutritionnel exerce des contraintes est sensiblement équivalente à 10~10 m2. Les cellules adhérant aux particules, elles sont alors soumises à des contraintes de cisaillement d'origine visqueuse de la part du fluide nutritionnel, qui apparaissent alors au sein de la couche limite pariétale ou la couche limite à la paroi. Ce sont ces contraintes, qui exercent des efforts et des forces sur ces cellules.
Compte tenu des dimensions du bioréacteur et d'un débit d'écoulement en fluide nutritionnel de 10 ml par minute, on obtient un nombre de Reynolds caractéristique de l'écoulement, voisin de 10. Ce nombre, est caractéristique d'un écoulement de Poiseuille dominé par la viscosité, il est en outre largement inférieur à 2000, valeur du nombre de Reynolds à partir de laquelle l'écoulement n'est plus laminaire et devient turbulent. Par ailleurs, en considérant que l'ensemble des particules en « lit tassé » constitue un milieu poreux au travers duquel s'écoule le fluide nutritionnel, on peut alors définir des canaux ou pores équivalents à travers lesquels s'écoule le fluide. Le nombre de Reynolds, caractéristique de l'écoulement dans ces canaux, est alors sensiblement divisé par deux, soit voisin de 5. A fortiori, l'écoulement du fluide nutritionnel à travers ces canaux ou pores est caractéristique des écoulements laminaires.
Les contraintes de cisaillement pariétal dans ces canaux sont alors, en appliquant les lois classiques de l'écoulement des fluides dans un tube, d'environ 4.10"3 Pa. Aussi, les forces associées rapportées à la surface d'une cellule sont de l'ordre de 4.10 13 N, soit de 40 pico Newton (pN).
On obtient alors des granules d'un matériau biohybride osseux constitué respectivement d'une particule de corail enduite de colonies cellulaires de types cellules osseuses. On se reportera d'abord à la Figure 2A sur laquelle sont représentées schématiquement des strates 33 de particules de corail 35, les unes sur les autres et de la première 34, au contact d'une grille d'appui 14' à la quatorzième et dernière, 36, située vers l'ouverture de sortie 30', puis ensuite à la Figure 2B illustrant la quantité de cellules présente sur les granules des différentes strates après 21 jours de culture. Cette quantité de cellules est comptabilisée par l'index de prolifération cellulaire qui est le rapport du nombre de cellules à l'instant t = 21 jours et du nombre de cellules initialement ensemencées. L'index et de prolifération cellulaire est porté en abscisse sur une échelle allant de 0 à 10, tandis que le numéro de chacune des strates est reporté en ordonnée sur une échelle allant de 1 à 14 et correspondant précisément aux strates successives. Ainsi, sous la forme d'un histogramme, le diagramme de la Figure 2B, reporte horizontalement pour chacune des strates 33, l'index de prolifération sous la forme d'un trait épais dont l'extrémité correspond à cet index.
Ainsi, on observe que la prolifération des cellules varie entre 7 et 8 fois le nombre de cellules initiales après 21 jours de culture et ce, quelle que soit la strate de particules considérées entre la première 34 et la quatorzième 36. Par conséquent, il apparaît que la prolifération des cellules est sensiblement identique sur toutes les strates de particules ensemencées, de la première 34 à la quatorzième 36, ce qui signifie que les conditions d'apport en éléments nutritionnels sont sensiblement identiques, quelle que soit la position des particules au sein de la chambre de culture 11. Cela signifie que les conditions d'écoulement sont relativement homogènes autour des particules ensemencées, de la première 34 à la dernière strate 36.
Cette caractéristique est déterminante puisque le matériau biohybride prêt à être implanté et qui comporte une pluralité de granules doit présenter une concentration cellulaire relativement homogène pour toutes les granules. On notera que la totalité des cellules osseuses cultivées durant 21 jours sur 250 particules selon le mode de mise en oeuvre décrit ci-dessus, permettent de combler un défaut osseux d'un volume compris entre 850 et 900 mm3. Toutefois, si l'on souhaite combler un espace osseux plus important, il est possible dans une certaine mesure d'augmenter le nombre de particules ensemencées initialement chargées dans la chambre de culture 11. Si l'espace osseux à combler est très important, ou si plusieurs espaces osseux doivent être comblés simultanément, il convient de prévoir un réacteur d'une taille supérieure dont les dimensions seraient déterminées par homothétie par rapport au réacteur précité. Par exemple, les dimensions d'un tel nouveau réacteur pourraient être du double de celui qui est illustré sur la figure 1. Moyennant un ajustement du débit en fluide nutritionnel, on obtiendrait alors des conditions d'écoulement de ce fluide nutritionnel, entre les particules ensemencées, totalement analogues à celles que l'on obtient dans le réacteur ici décrit.
Au surplus, selon le mode de mise en œuvre de l'invention illustré sur la Figure 1 , on vérifie l'absence d'abrasion des granules du matériau biohybride tout au long de la culture, laquelle abrasion pourrait provenir de l'écoulement du fluide nutritionnel. Pour cela, on mesure le taux de calcium du fluide nutritionnel durant les 21 jours de culture et on vérifie qu'il oscille entre 3 et 4 millimoles par litre. Par ailleurs, les cellules qui se multiplient sur les particules de corail ne se détachent pas. Car en effet, si on mesure initialement une quantité de un million de cellules dans le fluide nutritionnel, au bout de six jours, il n'en reste plus que 250 000 environ et ce nombre n'évolue plus jusqu'au 21e jour.
En outre, durant les 21 jours de culture, le pH du fluide nutritionnel demeure constant au voisinage de 7,4. On notera que le maintien du pH à un pH physiologique est déterminant pour la survie et le développement des cellules souches mésenchymateuses ; et que contrairement aux techniques de l'art antérieur, le procédé selon l'invention ne nécessite aucune régulation particulière de ce pH.
Par ailleurs, les particules du matériau utilisé, à base de corail d'espèce Porites, constitue des matrices poreuses à l'intérieur desquels les cellules osseuses peuvent également proliférer. Ainsi, grâce au procédé de culture de tissus osseux conforme à l'invention et au réacteur permettant sa mise en œuvre, la prolifération des cellules osseuses à partir de cellules souches mésenchymateuses, est optimal car les transferts d'éléments nutritionnels, d'oxygène et de déchets cellulaires notamment, entre le fluide nutritionnel et les cellules s'opèrent de manière rapide compte tenu de l'écoulement du fluide nutritionnel à travers les particules. Les transferts de matière par diffusion et par convection sont par nature augmentés, par rapport à des cellules cultivées dans un fluide nutritionnel statique.
Outre les transferts de matière, qui permettent de nourrir les cellules, les contraintes mécaniques, notamment de pression et de cisaillement, exercées sur les cellules par le fluide nutritionnel qui s'écoule entre les particules, permettent d'augmenter la prolifération et la différenciation des cellules souches. Ainsi, le procédé de culture selon l'invention, permet d'augmenter de façon très significative la productivité de la culture de cellules osseuses.
Au surplus, le réacteur mettant en œuvre le procédé, fonctionne en circuit fermé et seul le réservoir de fluide nutritionnel est changé durant un cycle de production, ce qui évite non seulement les contaminations de la culture de cellules osseuses, mais aussi les temps de manipulations. D'ailleurs, le changement de réservoir peut être automatisé.
Par ailleurs, la conception du réacteur est relativement simple et il peut être réalisé dans un matériau jetable à un coût avantageux.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de culture de tissus osseux, ledit procédé étant du type selon lequel : - on fournit des particules (35) d'un matériau compatible avec le tissu osseux ;
- on fournit des cellules souches de cellules osseuses ;
- on ensemence lesdites particules avec lesdites cellules souches de cellules osseuses ; - on fournit un fluide nutritionnel (31) contenant des éléments nutritionnels destinés à faire proliférer des cellules osseuses ;
- on délivre lesdits éléments nutritionnels auxdites cellules souches de cellules osseuses par l'intermédiaire d'un écoulement dudit fluide nutritionnel (31) ; caractérisé en ce qu'on fournit des particules (35) comprenant du carbonate de calcium ; et en ce que :
- on maintient lesdites cellules souches de cellules osseuses à l'intérieur dudit écoulement de façon que ledit écoulement exerce des contraintes mécaniques sur lesdites cellules et que lesdites cellules osseuses prolifèrent sur lesdites particules (35) pour former des granules de tissu osseux implantables ; et,
- on récupère lesdits granules de tissus osseux implantables pour les transplanter.
2. Procédé de culture selon la revendication 1 , caractérisé en ce que, ledit écoulement de fluide nutritionnel à la paroi desdites particules formant une couche limite pariétale, on forme un écoulement apte à exercer des contraintes de cisaillement pariétal comprise entre 10'4 et 10~2 Pa dans ladite couche limite pariétale.
3. Procédé de culture selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit écoulement présente un nombre de Reynolds voisin de 10.
4. Procédé de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on fournit des particules calibrées.
5. Procédé de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on fournit des particules poreuses.
6. Procédé de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on fournit des particules résorbables.
7. Procédé de culture selon l'une quelconque des revendications
1 à 6, caractérisé en ce lesdites particules (35) présentent des dimensions comprises entre 0,8 et 5 millimètres.
8. Procédé de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'on fournit des particules (35) présentant une forme sensiblement cubique.
9. Procédé de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'on maintien le pH dudit fluide nutritionnel (31) entre 7 et 8.
10. Réacteur pour culture de tissus osseux, ledit réacteur comprenant une chambre de culture (11) longitudinale dans laquelle sont maintenues des particules (35) d'un matériau compatible avec le tissu osseux, lesdites particules étant destinées à être ensemencées avec des cellules souches de cellules osseuses, ledit réacteur comprenant des moyens pour délivrer des éléments nutritionnels aux particules ensemencées par l'intermédiaire d'un écoulement de fluide nutritionnel (31) ; caractérisé en ce qu'il comprend :
- un tube cylindrique (10) présentant une chambre de remplissage (12) et une chambre de culture (11), et,
- une grille d'appui (14) montée entre ladite chambre de culture (11) et ladite chambre de remplissage (12) pour maintenir lesdites cellules souches de cellules osseuses à l'intérieur dudit écoulement de façon que ledit écoulement exerce des contraintes mécaniques sur lesdites cellules et que lesdites cellules osseuses prolifèrent sur lesdites particules pour former des granules de tissu osseux implantables.
11. Réacteur selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens d'injection pour injecter le fluide nutritionnel à l'intérieur de ladite chambre de remplissage selon une direction sensiblement transversale à ladite chambre de remplissage.
12. Réacteur selon la revendication 11 , caractérisé en ce lesdits moyens d'injection permettent d'injecter le fluide nutritionnel du centre de ladite chambre de remplissage vers la périphérie de ladite chambre.
13. Réacteur selon la revendication 11 ou 12, caractérisé en ce qu'il comprend une embase (16) pour obturer de manière étanche ledit tube cylindrique (10), et en ce que ladite embase présente une ouverture d'entrée (18) débouchant dans ladite chambre de remplissage (12), ladite ouverture d'entrée (18) étant prolongée par un tube en T (26) situé à l'intérieur de ladite chambre de remplissage (12).
14. Réacteur selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que ledit tube en T (26) présente deux ouvertures opposées orientées transversalement dans une direction sensiblement perpendiculaire au tube cylindrique (10).
15. Réacteur selon l'une quelconque des revendications 11 à 14, caractérisé en ce que ladite chambre de culture (11) est un tube cylindrique à directrice circulaire, présentant un dimère D et une longueur L, le rapport de la longueur L et du diamètre D étant compris entre 10 et 15.
16. Réacteur selon l'une quelconque des revendications 11 à 15, caractérisé en ce que ladite chambre de culture est orientée verticalement.
17. Réacteur selon l'une quelconque des revendications 11 à 16, caractérisé en ce que ledit écoulement de fluide nutritionnel est produit à travers ladite grille (14).
18. Réacteur selon l'une quelconque des revendications 11 à 17, caractérisé en ce que lesdits moyens pour délivrer des éléments nutritionnels auxdites particules ensemencées, comprennent des moyens de pompage (24) pour produire ledit écoulement de fluide nutritionnel (31).
19. Réacteur selon la revendication 18, caractérisé en ce que lesdits moyens de pompage (24) permettent de créer un écoulement dont le débit est compris entre 8 et 15 ml/min.
PCT/FR2008/000846 2007-06-18 2008-06-18 Reacteur pour la mise en oeuvre d'un procede de culture de tissus osseux WO2009010661A2 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0704319 2007-06-18
FR0704319A FR2917426B1 (fr) 2007-06-18 2007-06-18 Reacteur pour la mise en oeuvre d'un procede de culture de tissus osseux

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2009010661A2 true WO2009010661A2 (fr) 2009-01-22
WO2009010661A3 WO2009010661A3 (fr) 2009-04-09

Family

ID=38722643

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2008/000846 WO2009010661A2 (fr) 2007-06-18 2008-06-18 Reacteur pour la mise en oeuvre d'un procede de culture de tissus osseux

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR2917426B1 (fr)
WO (1) WO2009010661A2 (fr)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11549090B2 (en) 2016-08-21 2023-01-10 Adva Biotechnology Ltd. Bioreactor and methods of use thereof

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BE1016793A4 (fr) * 2005-10-04 2007-06-05 Artelis Procede de culture de cellules et dispositif permettant sa mise en oeuvre.

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11549090B2 (en) 2016-08-21 2023-01-10 Adva Biotechnology Ltd. Bioreactor and methods of use thereof
US11859163B2 (en) 2016-08-21 2024-01-02 Adva Biotechnology Ltd. Method of using a bioreactor
US12252679B2 (en) 2016-08-21 2025-03-18 Adva Biotechnology Ltd. Method of using a bioreactor

Also Published As

Publication number Publication date
WO2009010661A3 (fr) 2009-04-09
FR2917426B1 (fr) 2013-02-08
FR2917426A1 (fr) 2008-12-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FR2821853A1 (fr) Bioreacteur pour tissu cultive en couche mince et utilisations
EP1174497B1 (fr) Chambre de culture cellulaire et bioréacteur pour la culture extracorporelle de cellules animales
BE1009306A5 (fr) Bioreacteur.
EP1250417B1 (fr) Dispositif de culture cellulaire et tissulaire a circulation de fluide de culture controlee
EP2119503B1 (fr) Système microfluidique et procédé pour le tri d'amas de cellules et pour leur encapsulation en continu suite à leur tri
EP3531972B1 (fr) Dispositif apte a etre implante dans le corps d'un sujet pour former un implant
WO2012104437A1 (fr) Bioreacteur pour la culture cellulaire sur substrat tridimensionnel
EP3475406B1 (fr) Cassette et automate de culture cellulaire
WO2009010661A2 (fr) Reacteur pour la mise en oeuvre d'un procede de culture de tissus osseux
WO2016019476A1 (fr) Procede pour alimenter en gaz un environnement affecte a la culture cellulaire artificielle et dispositif pour la mise en ceuvre de ce procede
EP2119352B1 (fr) Procédé de conservation de cellules sécrétrices d'insuline destinées à être transplantées
EP2705132A1 (fr) Procédé pour la récolte de microalgues et dispositif pour la mise en oeuvre de ce procédé
FR2730743A1 (fr) Recipient de culture in vitro
EP1903101B1 (fr) Procédé de renouvellement d'un milieu biologique dans lequel des cellules sont en suspension
WO2001014514A1 (fr) Dispositif a usage biologique, notamment pour la culture cellulaire
EP1431030B1 (fr) Recipient thermoforme pour la culture de cellules
WO2000073411A1 (fr) Procede et dispositif de culture de cellules a applications multiples
EP3430902B1 (fr) Dispositif de maintien en survie d'un explant
FR2903594A1 (fr) Dispositif de production d'une mousse injectable.
FR2786783A1 (fr) Poche comportant un textile poreux biocompatible pour l'expansion tridimensionnelle in vitro de cellules notamment a usage therapeutique
FR3042944A1 (fr) Element destine a etre place dans un recipient pour la culture de plantes, systeme de culture, et procede de realisation d’un tel element
TWI286158B (en) Siphon bioreactor
FR3101535A1 (fr) Methode de fabrication d’une structure vasculaire
WO2020095005A1 (fr) Dispositif de culture cellulaire
WO2020208309A1 (fr) Dispositif de détermination d'une contamination bactériologique dans un fluide

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 08826421

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 08826421

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

点击 这是indexloc提供的php浏览器服务，不要输入任何密码和下载