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WO2008135562A1 - Formulations pharmaceutiques auto-precipitantes pour la liberation modifiee de principe actif - Google Patents

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WO2008135562A1
WO2008135562A1 PCT/EP2008/055506 EP2008055506W WO2008135562A1 WO 2008135562 A1 WO2008135562 A1 WO 2008135562A1 EP 2008055506 W EP2008055506 W EP 2008055506W WO 2008135562 A1 WO2008135562 A1 WO 2008135562A1
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WO
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polymer
formulation
groups
formulation according
group
Prior art date
Application number
PCT/EP2008/055506
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English (en)
Inventor
Frédéric CHECOT
Cécile BONNET GONNET
You-Ping Chan
Olivier Breyne
Rémi Meyrueix
Original Assignee
Flamel Technologies
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Publication date
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Priority to AU2008248603A priority patent/AU2008248603A1/en
Priority to BRPI0809288-5A2A priority patent/BRPI0809288A2/pt
Priority to CA002685873A priority patent/CA2685873A1/fr
Priority to EP08750063A priority patent/EP2155164A1/fr
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    • A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/1641—Organic macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, poloxamers

Definitions

  • the present invention relates to novel pharmaceutical formulations for the sustained release of active principle (s) -PA-, in particular protein (s) and peptide (s).
  • the application also relates to the applications, particularly therapeutic applications, of these pharmaceutical formulations.
  • active pharmaceutical formulations concern both human and veterinary therapeutics.
  • PA used throughout this specification is for at least one active ingredient.
  • Another way also followed to extend the in vivo release time of AP after subcutaneous injection is to use a liquid formulation at the injection temperature, but which gels when the temperature rises to 37 ° C.
  • PCT applications WO-A-99/18142 & WO-A-00/18821 relate to aqueous solutions of polymers which contain a PA in dissolved or colloidal form, which are can be administered to warm-blooded animals, in particular by injection, and which form a gelled deposit in vivo, since the physiological temperature is higher than their gelation temperature. The gel thus formed releases the PA for a prolonged period.
  • the liquid transformation temperatures of these triblock polymers are, for example, 36, 34, 30 and 26 ° C.
  • the hydrolysis in In vivo these ABA or BAB triblock polymers lead to acids that may not be well tolerated locally.
  • One of the objectives of the invention is to propose novel formulations based on polyglutamate polymers modified with cationic amino acid derivatives and bearing hydrophobic side groups, loaded with active principle (PA) and releasing the active ingredient (AP). over an extended period of several days or even weeks.
  • PA active principle
  • AP active ingredient
  • Another object of the invention is to propose novel liquid formulations based on polyglutamate polymers modified with cationic amino acid derivatives and carriers of hydrophobic side groups, loaded with active ingredient (AP), the composition and concentration of which maximize the duration of release of the active ingredient (AP) after subcutaneous administration.
  • Another object of the invention is to provide novel liquid formulations based on polyglutamate polymers modified with cationic amino acid derivatives and bearing hydrophobic side groups, loaded with active ingredient (PA), the composition of which is such that it allows to release the active ingredient (AP) over several days, or even weeks, with the lowest possible concentration of polymer.
  • PA active ingredient
  • Another object of the invention is to propose novel liquid formulations based on polyglutamate polymers modified with cationic amino acid derivatives and bearing hydrophobic side groups, loaded with active ingredient (PA), whose composition and concentration make it possible to inject it easily through a small needle.
  • PA active ingredient
  • Another object of the invention is to provide novel liquid formulations, based on polyglutamate polymers modified with cationic amino acid derivatives and bearing hydrophobic side groups, stable in aqueous solution.
  • Another object of the invention is to provide novel formulations, based on polyglutamate polymers modified with cationic amino acid derivatives and bearing hydrophobic side groups, capable of being preserved in freeze-dried form.
  • Another object of the invention is to provide novel formulations, based on polyglutamate polymers modified with cationic amino acid derivatives and bearing hydrophobic side groups, easily redispersible after lyophilization.
  • Another object of the invention is to provide novel formulations, based on polyglutamate polymers modified with cationic amino acid derivatives and bearing hydrophobic side groups, loaded with active ingredient (PA) and stable in freeze-dried form.
  • PA active ingredient
  • Another object of the invention is to provide novel formulations, based on polyglutamate polymers modified with cationic amino acid derivatives and bearing hydrophobic side groups, releasing a protein that has preserved its biological activity.
  • Another object of the invention is to provide a solid pharmaceutical formulation for the sustained release of active ingredient (AP), in particular a dry powder form, for example for inhalation and pulmonary administration.
  • Another object of the invention is to propose a new process for the preparation of a formulation for the sustained release of at least one active principle (AP), this formulation being in particular one of the formulations described above.
  • Another object of the invention is to propose a new process for the preparation of medicaments implementing these pharmaceutical formulations.
  • the invention relates first of all to an aqueous liquid pharmaceutical formulation for the sustained release of at least one active ingredient (AP), which is easily injectable, for example parenterally, comprising at least one principle active ingredient (PA) and an aqueous suspension based on colloidal particles of a polymer (PO) or its pharmaceutically acceptable salts, characterized in that it satisfies the following four conditions:
  • the polymer (PO) is a polyamino acid comprising glutamic residues, - certain glutamic residues being carriers of a pendant cationic group (GC), said cationic groups being identical or different from each other,
  • the pH of said formulation (pHf) is 3.0 to 6.5;
  • the polymer (PO) forms a colloidal solution of particles to which the active ingredient (PA) spontaneously and non-covalently associates;
  • such a formulation has a precipitation factor Fp greater than 200, preferably greater than 400, preferably greater than 800, and even more preferably greater than 1500.
  • the invention therefore also relates to an aqueous liquid pharmaceutical formulation for the sustained release of at least one active ingredient (AP), which is easily injectable, for example parenterally, comprising at least one active ingredient (PA) and an aqueous suspension, colloidal particle base of a polymer (PO) or of its pharmaceutically acceptable salts, characterized in that it satisfies the following four conditions:
  • the polymer (PO) is a polyamino acid comprising glutamic residues, certain glutamic residues bearing a pendant cationic group (GC), said cationic groups being identical or different from each other,
  • hydrophobic groups (GH) being identical to or different from one another
  • the pH of said formulation pHf) is between 3.0 and 6.5;
  • the polymer (PO) forms a colloidal solution of particles to which the active ingredient (PA) spontaneously and non-covalently associates;
  • said formulation has a precipitation factor Fp greater than 200, preferably greater than 400, and preferably greater than 800, and still more preferably greater than 1500.
  • this formulation is preferably characterized in that its retention factor Qr is greater than 5, preferably greater than 10, and preferably greater than 15, and even more preferably greater than 20.
  • PA active ingredient
  • the invention also relates to a process for preparing formulations for the sustained release of at least one active ingredient (AP), these formulations being in particular those described above, comprising the following steps:
  • glutamic residues bearing a pendant cationic group said cationic groups being identical to or different from one another; other glutamic residues carrying a hydrophobic group (GH) during said hydrophobic groups (GH); being identical or different from each other, - optionally other glutamic residues being carriers of a neutral group (GN) pendant, the neutral groups (GN) being identical or different from each other,
  • the invention also relates to a process for the preparation of medicaments, in particular for parenteral, mucosal, subcutaneous, intramuscular, intradermal, transdermal, intraperitoneal, intracerebral or tumor administration, or even orally, nasally, pulmonary, vaginally or ocularly , essentially consisting in implementing at least one formulation as described above.
  • cationic group a covalently grafted group on a glutamic residue, and comprising one or more amino functions or one or more quaternary ammoniums.
  • the group will be mainly ionized at any pH below its pKa, in the case of a quaternary ammonium, the group will be ionized at any pH.
  • the alkyl radicals have 1 to 10 carbon atoms.
  • neutral group means a group bearing no charge for any pH between 3 and 10, for example the groups obtained by condensation on the carboxyl of a glutamic residue of ethanolamine (bound by the nitrogen), an alkylene glycol or a polyoxyalkylene glycol.
  • pharmaceutically acceptable salts of the polymer according to the invention means all the polymers with the counterions associated with the ionized functions of the polymer.
  • a solution is understood to mean a homogeneous solvent and polymer mixture in the form of an individual chain.
  • colloidal solution is understood to mean a suspension of particles whose average diameter measured by the T 'test is less than or equal to 0.5 ⁇ m.
  • the term "easily injectable formulation” (for example parenterally), a formulation having a dynamic viscosity at 20 0 C less than or equal to 1000 mPa.s.
  • the dynamic viscosity of the formulation measured at 20 ° C., for a shear rate of 1000 s -1 , is preferably less than or equal to 500 mPa ⁇ s, preferably between 2 and 200 mPa ⁇ s. for example, between 1.0 and 100 mPa.s, or even between 1.0 and 50 mPa.s.
  • a small molecule is a molecule having a molecular weight of less than 1 kDa, especially a non-protein molecule.
  • pHf is the pH of the formulation according to the invention.
  • pH * the precipitation pH of the polymer-based formulation PO determined according to the P test:
  • a PO polymer solution concentrated to 1 or 2 mg / ml and containing 0.15 M sodium chloride is brought to pH 4 by addition of acetic acid or 1 M sodium hydroxide and is stirred for 24 h.
  • This solution is then filtered on 0.8 - 0.2 ⁇ m.
  • This solution is then titrated with a 0.1 M solution of sodium hydroxide by recording the evolution of the absorbance at 500 nm of the PO polymer solution as a function of the pH of said solution on a UV spectrometer (Lambda type). 35, Perkin Elmer).
  • the pH of precipitation, pH * corresponds to the pH value at which the absorbance increases sharply to a value greater than 1.
  • Tp test buffer solution means an aqueous medium containing 30 mg / g of albumin (BSA fraction V, Aldrich), 0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride, 0.137 M sodium chloride (PBS, Aldrich) and 0.015 M ammonium acetate (Aldrich).
  • ⁇ n is meant the number of moles of sodium hydroxide required to supply 0.5 ml of the colloidal solution containing 1 mg of PO polymer of pHf at pH *, obtained by the conventional method of acid-base titration.
  • a solution of polyelectrolyte concentrated at 2 mg / ml and containing 0.15 M sodium chloride is brought to pH 4 by addition of acetic acid or 1M sodium hydroxide.
  • the solution is then titrated with a solution of , 05 M of soda in recording the evolution of the pH according to the volume of soda added.
  • the determination of ⁇ n is carried out simply by reading the volume of soda added to change from pHf to pH *.
  • physiological pH is defined as being equal to 7.2 ⁇ 0.4.
  • polyelectrolyte means a polymer carrying groups capable of ionizing in water, which creates a charge on the polymer.
  • a volume V of the preparation according to the invention ready to be administered is paid to
  • the T 'test is preferably used.
  • the result of the test T ' is a mean hydrodynamic diameter.
  • Test T for measuring the size of the nanoparticles by quasi-elastic light scattering:
  • the average hydrodynamic diameter of the polymer particles according to the invention is measured according to the procedure Md defined below:
  • the polymer solutions are prepared at concentrations of 1 or 2 mg / ml in 0.15 M NaCl medium and left stirring for 24 h. These solutions are then filtered on 0.8 - 0.2 ⁇ m, before being analyzed by dynamic scattering of light using a Malvern Compact Goniometer System, operating with a 632 wavelength He-Ne laser beam. , 8 nm and vertically polarized.
  • the hydrodynamic diameter of the polymer nanoparticles is calculated from the autocorrelation function of the electric field by the cumulant method, as described in "Surfactant Science Series", Volume 22, Surfactant Solutions, Ed. R. Zana, Chap. 3, Marcel Dekker, 1984. In the present description, nanoparticles are those particles which have a mean diameter of between 2 and 500 nm, according to the T 'test. Test L for measuring the release of the active ingredient:
  • the protein flow can then be plotted by dividing the measured concentration by the imposed flow rate, and the total mass of protein released by summing the one found in each sample.
  • protein refers to a protein as well as a peptide, whether it be an oligo or a polypeptide. This protein or peptide may or may not be modified, for example by grafting one or more polyoxyethylene groups.
  • the expression "to be a carrier” means that the group carried is pendant, that is to say that said group is a side group with respect to the glutamic residues and is a substituent of the carbonyl functional group. ⁇ of the glutamic residue that carries it.
  • Polyglutamate also carries cationic groups. These groups are grafted to glutamic residues, preferably via an amide or ester bond.
  • the polymer PO has a pGlu (X) GH (y) GC (Z) structure GN ( i -xyZ) with a total degree of polymerization (DP) of between 50 and 300, preferably between 100 and 250, and more preferably between 150 and 250.
  • the cationic groups (GC) may be chosen from weak bases whose half-neutralization pH is less than 7.0.
  • Such cationic groups (GC) are for example obtained from precursors derived from histidine chosen from the group comprising histidine esters, preferably methyl and ethyl esters; histidinol, histamine, histidinamide, the N-monomethyl derivative of histidinamide and the N, N'-dimethyl derivative of histidinamide.
  • the x, y and z values may be such that x is between 0 and 45%, y is between 2 and 30%, z is between 40 and 98%, and 1-xyz is between 0 and 45%. and 50%.
  • the polymer PO does not have neutral groups (GN)
  • GN neutral groups
  • the cationic groups (GC) may be chosen from those which comprise at least one quaternary ammonium or at least one strong base whose half-neutralization pH is greater than 8.0.
  • Such cationic groups can be obtained from the following precursor compounds: a linear diamine of 2 to 6 carbons, preferably putrescine, agmatine,
  • oxygen-bound ethanolamine oxygen-bound choline, an ester or amide derivative of an amino acid whose side chain is positively charged at neutral pH, Le. lysine, arginine, ornithine, linked by the amino function in position alpha.
  • the values x, y, and z can be such that:
  • x is between 10 and 55%
  • - is between 2 and 30%
  • - z is greater than or equal to 10% and is between (x-10)% and (x + 15)%, the number of neutral groups corresponding to the complementary percentage to reach 100% , and possibly being equal to 0.
  • - x is between 20 and 55%, - is between 2 and 7.5%,
  • z is greater than or equal to 20% and is between (x-10)% and (x + 15)%, the number of neutral groups corresponding to the complementary percentage to reach 100%, and possibly being equal to 0.
  • y is between 2 and 30%
  • z is between 10 and 55%
  • 1-xyz is between 0 and 60%. It is also possible to have the values x, y and z such that x is between 10 and 20%, y is between 2 and 30%, z is between 10 and 30%, and 1-xyz is between 20 and 78. %.
  • x, y and z are integers such that x is between 10 and 20%, y is between 15 and 30%, z is between 10 and 30%, and 1-xyz is between 20 and 65. %.
  • the polymer PO does not contain neutral groups (GN)
  • GN neutral groups
  • polyamino acids according to the invention are, e.g., homopolymers of alpha-L-glutamate or alpha-L-glutamic acid.
  • the cationic groups that can be used to functionalize the glutamate residues are identical to or different from each other and correspond to: a histidine derivative chosen from the group comprising the histidine esters, preferably the methyl ester and the ethyl ester, histidinol, histamine, histidinamide, the N-monomethyl derivative of histidinamide and the N, N-dimethyl derivative of histidinamide or the following general formula:
  • Y independently H or CH 3
  • Z " chloride, sulfate, phosphate or acetate
  • L linear (C 2 -C 6 ) alkylene and optionally substituted by a carboxyl or derivative functional group.
  • cationic groups that can be used in the present invention are chosen from the group of radicals having the following formulas:
  • R 1 is alkoxy, preferably -OMe or -OEt, or -R 1 is -NH 2 , alkylamino, preferably -NH-CH 3 or -N (CH 3 ) 2 ;
  • the cationic groups may have the following formulas:
  • -Ri represents an alkoxy or alkylamino group, preferably a -OMe, -OEt, -NH 2 , -NHCH 3 or -N (CHs) 2 group , and -R 2 represents hydrogen,
  • the polyamino acids comprise on average at least 3 hydrophobic groups (GH) per polymer chain.
  • At least one of the hydrophobic groups GH is included in a hydrophobic graft comprising at least one spacer (or "spacer") balloon (or pattern) for connecting the hydrophobic group GH to a polyglutamate chain (for example a main chain - skeleton-polyglutamate).
  • This patella may comprise, eg at least one direct covalent bond and / or at least one amide bond and / or at least one ester bond.
  • the patella may be of the type belonging to the group comprising in particular: the "amino acid” residues different from the constituent monomeric unit of the polyglutamate, the aminoalcohol derivatives, the polyamine derivatives (for example the diamines), the polyol derivatives (for example the diols) and the hydroxy acid derivatives .
  • the grafting of GH on the polyglutamate chain may involve the use of precursors of GH, able to bind to the polyglutamate chain.
  • the precursors of GH are, in practice and without being limited to, selected from the group comprising alcohols and amines, these compounds being easily functionalized by those skilled in the art.
  • the hydrophobic group GH of the hydrophobic graft comprises from 8 to 30 carbon atoms.
  • Linear or branched C 8 to C 30 alkyls which may optionally comprise at least one unsaturation and / or at least one heteroatom, C 8 to C 30 alkylaryls or arylalkyls possibly comprising at least one unsaturation and / or at least one a heteroatom,
  • the (poly) cyclic C 8 to C 30 may optionally comprise at least one unsaturation and / or at least one heteroatom.
  • the GH-forming patellae of the hydrophobic grafts may be di-, tri- or tetravalent (or even pentavalent and more).
  • a divalent patella the hydrophobic graft comprises a single GH group, while a trivalent patella gives the hydrophobic graft a bifid character, that is to say that the graft has two "legs" GH.
  • a trivalent patella mention may be made, inter alia, of "amino acid” residues, for example "glutamic acid” or polyol residues, for example glycerol.
  • two advantageous but non-limiting examples of hydrophobic grafts comprising bifid GHs are dialkylglycerols and dialkylglutamates.
  • the hydrophobic groups GH can be, for example, derived from precursors chosen from the following group: octanol, dodecanol, tetradecanol, hexadecanol, octadecanol, oleyl alcohol, tocopherol or cholesterol.
  • the neutral groups (GN) may be selected from the following group: a hydroxyethylamino-, hydroxyalkyloxy- or polyoxyalkylene radical
  • the polyglutamates used in the present invention may also carry at least one graft of polyalkylene (preferably ethylene) glycol type bonded to a glutamate residue.
  • the backbone of the polyglutamate according to the present invention comprises L-glutamate and / or L-glutamic acid residues; preferably these residues are bound in the polypeptide by their carboxyl in position alpha.
  • polyglutamates used in the present invention have the following formula (I):
  • A is independently: NHR wherein R is H, linear C 2 -C 10 alkyl, branched C 3 -C 10 alkyl or benzyl, amino acid residue or terminal amino acid derivative of formula :
  • R 7 is OH, OR 9 or NHR 10
  • R 8 , R 9 and R 10 independently represent H, linear C 2 -C 10 alkyl, branched C 3 -C 10 alkyl or benzyl;
  • B is a direct bond or a divalent, trivalent or tetravalent linking group, preferably chosen from the following radicals:
  • D is H, a linear acyl, C 2 to Cio, acyl branched C 3 to Ci 0, or a pyroglutamate;
  • hydrophobic groups (GH) each independently represent a radical chosen from:
  • Linear or branched C 8 -C 20 alkyls which may optionally comprise at least one unsaturation and / or at least one heteroatom (preferably O and / or N and / or S), or
  • alkylaryl or arylalkyl Cs -C 3 o can optionally comprise at least one unsaturation and / or at least one heteroatom (preferably O and / or N and / or S), or
  • the (poly) cyclic C 8 to C 30 may optionally comprise at least one unsaturation and / or at least one heteroatom (preferably O and / or N and / or S); and preferably at least one of the hydrophobic groups (GH) being obtained by grafting, from a precursor chosen from the following group: octanol, dodecanol, tetradecanol, hexadecanol, octadecanol, oleyl alcohol, tocopherol or cholesterol, and B representing then a direct connection;
  • GH hydrophobic groups
  • R 70 represents a radical chosen from the following group: -NH- (CH 2 ) W -NH 3 + with w between 2 and 6, and preferably w is equal to 4,
  • X is -O- or -NH-
  • R 12 is H, C 2 -C 10 linear alkyl, branched C 3 -C 10 alkyl or benzyl,
  • R 70 is a suitable anion, especially chosen from a chloride, a sulfate, a phosphate or an acetate, preferably a chloride; R is hydroxyethylamino, hydroxyalkyloxy or polyoxyalkylene;
  • (p) / (p + q + r + s) is defined as the molar grafting ratio of the hydrophobic groups GH varies from 2 to 30 mol%, provided that each copolymer chain has on average at least 3 hydrophobic grafts;
  • (p + q + r + s) varies from 50 to 300, preferably from 100 to 250;
  • the hydrophobic groups GH and the cationic groups are randomly arranged in pendant groups.
  • the concentration of polymer (PO) in the formulation according to the invention may be between 4 and 50 mg / ml, in particular when the active ingredient
  • PA is a therapeutic protein.
  • the formulation is easily injectable by a small diameter needle, for example a Gauge 27, and even 29. Examples 2, 3 and 4 describe in detail such formulations.
  • the concentration of polymer (PO) in the formulation according to the invention may be between 5 and 30 mg / ml, and more preferably between 5 and 15 mg / ml.
  • the ratio R of the concentration of active ingredient (PA) to the polymer concentration (PO) can be between 0.0001 and 1.5.
  • This ratio R may also be between 0.01 and 1.2.
  • the formulation according to the invention may contain divalent Zn ++ cations in a proportion of between 0.05 and 2 molar equivalents relative to the molar concentration of cationic groups (GC).
  • the formulation according to the invention may contain divalent cations
  • Zn ++ added in the proportion of between 0.25 and 0.75 molar equivalents relative to the molar concentration of cationic groups (GC), and preferably equal to 0.5 eq, especially when the cationic groups (GC) are obtained from histidine derivatives selected from the group consisting of histidine esters, preferably the methyl ester and the ethyl ester; histidinol, histamine, histidinamide, the ⁇ -monomethyl derivative of histidinamide and the ⁇ -D-dimethyl derivative of histidinamide.
  • histidine derivatives selected from the group consisting of histidine esters, preferably the methyl ester and the ethyl ester; histidinol, histamine, histidinamide, the ⁇ -monomethyl derivative of histidinamide and the ⁇ -D-dimethyl derivative of histidinamide.
  • the formulation according to the invention does not contain a cation di valent added.
  • the polymers used in the present invention have a molar mass which is between 2000 and 200000 g / mol, and preferably between 5000 and 100000 g / mol.
  • the polymers (PO) used in the invention have a structure pGl ⁇ t (X) GH (y) GC (Z) GN (i -xyz) such that x is between 0 and 20%, y is between 2 and 30%, z is between 60 and 95%, and 1 - xyz is between 0 and 15%.
  • x, y and z are integers such that x is between 0 and 20%, y is between 2 and 10%, z is between 75 and 95%, and 1 -xyz is between 0 and 15. %.
  • x, y and z are integers such that x is between 0 and 20%, y is between 15 and 25%, z is between 60 and 80%, and 1 -xyz is between 0 and 15. %.
  • the polymer PO does not contain neutral groups (GN)
  • GN neutral groups
  • GC quaternary ammoniums or at least one strong base whose half-neutralization pH is greater than 8.0
  • the x, y and z values may be such that x is between 15 and 50 %, y is 2 to 30%, z is 10 to 50%, and 1 -xyz is 10 to 55%.
  • x, y and z are integers such that x is between 25 and 50%, y is between 2 and 30%, z is between 25 and 50%, and 1 -xyz is between 10 and 30%. %.
  • the polymer PO does not contain neutral groups (GN)
  • GN neutral groups
  • the PO polymer used in the invention is cationic and soluble at the pH value of the pH of the formulation. This charge is partially or completely neutralized at neutral pH so that the polymer precipitates. Without being bound by the theory, it can be supposed that this precipitation phenomenon induced by an increase in pH results from the reduction of the overall polymer load between the formulation pH and the physiological pH, and the presence of the hydrophobic side groups. It should be understood that the modified polyglutamate of carboxylic residual functions are either neutral (COOH form) or ionized (anion COO "), depending on pH and composition.
  • the counter-cation may be a metal cation such as sodium, calcium or magnesium, or an organic cation such as triethanolamine, tris (hydroxymethyl) aminomethane or a polyamine such as polyethyleneimine. If it is divalent, a countercation can salify two nearby monovalent cationic groups.
  • the counter anion of the cationic groups is preferably chosen from the group comprising a chloride, a sulfate, a phosphate or an acetate.
  • a counteranion can salt two nearby monovalent cationic groups.
  • the term "pharmaceutically acceptable salts" of the polymer according to the invention all of the polymers with the counter-ions associated with the ionized functions of the polymer.
  • polyamino acids that may be used in the present invention are obtained, for example, by methods known to those skilled in the art.
  • NCA ⁇ -carboxy-amino acid anhydrides
  • R 3 methyl, ethyl or benzyl.
  • polymers that can be used according to the invention, for example of the poly (alpha-L-glutamic), poly (alpha-D-glutamic), poly (alpha-D, L-glutamate) and poly (gamma-L) type can be used.
  • -glutamic) of variable masses are commercially available.
  • Coupling of the GH graft with an acid function of the polymer is easily achieved by reaction of the polyamino acid in the presence of a carbodiimide as coupling agent and optionally a catalyst such as 4-dimethylaminopyridine and in a suitable solvent such as dimethylformamide (DMF). ), TV-methylpyrrolidone (NMP) or dimethylsulfoxide (DMSO).
  • the carbodiimide is, for example, dicyclohexylcarbodiimide or diisopropylcarbodiimide.
  • the degree of grafting is chemically controlled by the stoichiometry of the constituents and reactants or the reaction time. Hydroponic grafts Phobes functionalized by a "spacer" are obtained by conventional peptide coupling or by direct condensation by acid catalysis.
  • the coupling of the cationic and optionally neutral groups with an acid function of the polymer is carried out simultaneously in a second step in the presence of a chloroformate as coupling agent and in a suitable solvent such as dimethylformamide, N-methylpyrrolidone (NMP) or dimethylsulfoxide (DMSO).
  • a chloroformate as coupling agent and in a suitable solvent such as dimethylformamide, N-methylpyrrolidone (NMP) or dimethylsulfoxide (DMSO).
  • the cationic group contains two chemically undifferentiated amino functions (e.g. linear diamine), it can be introduced in a form in which one of the two functions is protected. A last step of cleavage of the protecting group is then added.
  • two chemically undifferentiated amino functions e.g. linear diamine
  • Conditions (c) and (d) are particularly selective. If the formulation does not form a colloidal solution at pHF, those skilled in the art will select a polymer having a higher number of non-ionized monomers at this pH value. If, on the contrary, the polymer precipitates, it will be necessary to increase the number of monomers ionized at this pH.
  • condition (d) is a convenient way for those skilled in the art to select formulations according to the invention.
  • condition (d) implies that the formulation according to the invention precipitates for a pH value lower than or equal to the physiological pH. Indeed, after mixing 1 ml of the acid formulation according to the invention and 1 ml of the buffer solution Tp, precipitation must be observed at a pH value less than or equal to the pH of the buffer solution, that is say ⁇ 7.2.
  • a second mode of selection of the formulations according to the invention is to select them according to their precipitation factor, Fp.
  • Fp precipitation factor
  • the PA-loaded colloidal solution is a clear liquid containing nanoparticles whose average hydrodynamic diameter, measured by dynamic light scattering, according to the T 'test, is less than or equal to equal to 0.5 ⁇ m, preferably between 5 and 500 nm, more preferably between 10 and 80 nm.
  • the solution according to the invention must precipitate for a pH value less than or equal to the physiological pH. This value is measured according to the P test.
  • PH * is the pH value at which the solution precipitates under these conditions.
  • ⁇ n is measured, number of moles of sodium hydroxide necessary to bring 0.5 ml of the colloidal solution containing 1 mg of PO polymer of pHf at pH * according to the MT method.
  • the precipitation factor, Fp, of the formulation is defined by the formula:
  • Fp - * - ⁇ n.C in which: C is the PO polymer concentration in the formulation (expressed in mg / g), y is the molar fraction of monomers of PO carrying a hydrophobic graft. Examples of calculation of the precipitation factor Fp are reported in the examples.
  • the formulations according to the invention are characterized by a precipitation factor Fp greater than 200, preferably greater than 400, and more preferably greater than 800, and even more preferably greater than 1500.
  • a surprising aspect of the formulations according to the invention is that the network of polymer chains formed during the precipitation at physiological pH makes it possible to slow the release of the active principle (PA) without trapping the same active ingredient (PA) in the heart of the particles.
  • PA active principle
  • the formulations according to the invention make it possible to obtain both a prolonged release of the active ingredient (AP) and a good bioavailability.
  • PA active principle
  • it is preferably chosen from the group comprising: proteins, glycoproteins, proteins linked to one or more polyalkylene glycol chains [preferably polyethylene glycol (PEG): “PEGylated proteins”], peptides, polysaccharides, liposaccharides, oligonucleotides, polynucleotides and mixtures thereof, and more preferably still in the erythropoietin subgroup, such as epoetin alpha, epoetin beta, darbepoetin, hemoglobin, their analogues or derivatives; oxytocin, vasopressin, adrenocorticotropic hormone, epidermal growth factor, platelet derived growth factor (PDGF), stimulating factors of hematopoiesis and their mixtures, blood factors, such as alteplase, tenecteplase, factor V ⁇ I (a), factor VII; hemoglobin, cytochromes, albumin, prol
  • active ingredients are polysaccharides (eg, heparin) and oligo- or polynucleotides, DNA, RNA, iRNA, antibiotics, and living cells.
  • Another class of active ingredients includes pharmaceutical substances acting on the central nervous system, for example, risperidone, zuclopenthixol, fluphenazine, perphenazine, flupentixol, haloperidol, fluspirilene, quetiapine, clozapine, amisulprid, sulpiride, ziprasidone, etc.
  • the active principle is a small hydrophobic, hydrophilic or amphiphilic organic molecule of the type belonging to the family of anthracyclines, taxoids or camptothecins or of the type belonging to the family of peptides such as leuprolide or cyclosporine and mixtures thereof.
  • the active ingredient is advantageously chosen from at least one of the following families of active substances: alcohol abuse treatment agents, agents for treating Alzheimer's disease, anesthetics, acromegaly treatment agents, analgesics, antiasthmatics, allergy agents, anti-cancer agents, anti-inflammatories, anticoagulants and antithrombotics, anticonvulsants, antiepileptics, antidiabetics, antiemetics, antiglaucoma , antihistamines, antiparasitics, antibiotics, antifungals, antivirals, antiparkinsonians, anti-cholinergics, antitussives, carbonic anhydrase inhibitors, cardiovascular agents, lipid-lowering agents, anti-arrhythmics, vasodilators, antianginal agents, antihypertensives, vasoprotective agents, cholinesterase inhibitors, tr central nervous system (CNS) stimulants, contraceptives, fertility promoters, uterine labor inducers and inhibitors
  • the formulation according to the invention can be administered orally, parenterally, nasally, topically, vaginally, ocularly, subcutaneously, intravenously, intramuscularly, intradermally, transdermally, intratumorally, intraperitoneally, intrathecally, intracerebrally or buccally.
  • the subject of the invention is a method for preparing polymer-based formulations PO for the sustained release of at least one active principle, these formulations being in particular those described above, said process comprising the following steps:
  • step 2 2) adding at least one active ingredient (AP) to the polymer (PO) obtained in step 1, said active ingredient associating non-covalently with the particles of the colloidal solution of said polymer (PO).
  • An essential characteristic of the process according to the invention is to form charged particles with pHf values of between 3 and 6.5, spontaneously, by simple mixing of a colloidal solution of particles of the polyelectrolyte polymer (PO) and of the active principle (PA).
  • the active ingredients such as proteins, peptides or small molecules can spontaneously associate with the polyamino acid polymer (PO).
  • the loading of the nanoparticles of the polyelectrolyte polymer (PO) by the active principle (PA) is carried out by simple mixing of a solution of active principle (PA) with a colloidal solution of the polyelectrolyte polymer ( PO).
  • This association is purely physical and does not involve the creation of a covalent bond between the active ingredient (PA) and the polymer (PO). Without being bound by theory, it can be assumed that this non-specific association is effected by hydrophobic and / or electrostatic interaction between the polymer (PO) and the active ingredient (PA). It should be noted that it is not necessary, and often even undesirable, to bind the PA to the nanoparticles of PO with specific receptors of a peptide nature or of antigen / antibody or enzyme / substrate type.
  • Such chemical crosslinking is generally carried out by activating polymerizable entities and involves potentially denaturing agents such as UV radiation or glutaraldehyde.
  • the process according to the invention comprises a step of dehydration, for example by lyophilization, of the liquid formulation, in order to obtain a formulation in the form of a dry powder.
  • the present invention also relates to a solid pharmaceutical formulation for the sustained release of at least one active ingredient (AP), comprising a dry powder form obtained from the liquid formulation comprising an aqueous suspension described above.
  • a dry powder can be obtained by bringing the liquid formulation according to the invention to a pH of 7 to precipitate it in vitro and then by dehydrating it, for example by lyophilization.
  • such a solid pharmaceutical formulation is used for inhalation and pulmonary administration.
  • the subject of the invention is a process for preparing medicaments, in particular for parenteral, mucosal, subcutaneous, intramuscular, intradermal, transdermal, intraperitoneal, intracerebral or intratumoral administration, or even orally.
  • Nasal, pulmonary, vaginal or ocular said method consisting essentially of implementing at least one of the formulations described above.
  • FIG. 1 in vitro release of IFN- ⁇ from the formulations of Example 2.1 (black triangles), Example 2.3 (black diamonds), Example 3 (black squares), and the example 5 (solid line).
  • reaction medium is poured into 1200 ml of water containing 15% of sodium chloride and hydrochloric acid (pH T).
  • the precipitated polymer is then recovered by filtration, washed with 0.1 N hydrochloric acid, water and with diisopropyl ether.
  • the polymer is then dried in an oven under vacuum at 40 ° C. A yield of the order of 90% is obtained.
  • the molar mass measured by steric exclusion chromatography is of 15500 compared to a polyoxyethylene standard.
  • the grafted tocopherol level, estimated by proton NMR spectroscopy, is 5.1 mol%.
  • the activated polymer solution is then added to the suspension of histidinamide.
  • the reaction medium is stirred for 2 h at 0 ° C. and then overnight at 20 ° C. Then 1.46 ml of 35% HCl and then 200 ml of water are added. Another 20O mL of water is added, then 65O mL of ethanol, and then poured into 650 mL of water at pH 3-4. The solution is then diafiltered against 8 volumes of saline (0.9% NaCl). and 4 volumes of water. The polymer solution is finally concentrated to a volume of 250 mL (the polymer concentration is 50 mg / g). The percentage of grafted histidinamide, determined by 1 H NMR in D 2 O, is 70%.
  • EXAMPLE 1 Polymer-based Formulation PO Not Carrying a Canonical Derivative (Synthesis a)
  • the polymer PO obtained according to the synthesis a) above is used.
  • a colloidal solution of PO polymer at 24 mg / g is obtained by diluting 12.64 g of PO solution with 2.19 g of water.
  • the osmolarity of the PO colloidal solution and its pH are then adjusted to 290 mOsm and pH 6.95 by introducing respectively the necessary amounts of an aqueous solution of NaCl and a solution of NaOH.
  • the table below groups together the characteristics of the formulation obtained:
  • the particle size is measured according to the test T '.
  • the polymer-based formulation PO described above does not precipitate upon the addition of 1 ml of the latter to 1 ml of Tp buffer solution.
  • Example 2.1 PO-Al concentration equal to 10 mg / g, containing IFN-alpha
  • PO-Al polymer obtained according to synthesis b) above is used. PO-Al is diluted in water, and pH (appropriate NaOH solution) and osmolarity (appropriate NaCl solution) are adjusted.
  • the PO-Al polymer-based colloidal solution obtained precipitates upon the addition of 1 ml of the latter to 1 ml of Tp buffer solution, and is characterized by a precipitation factor Fp equal to 860.
  • the PO-Al polymer is characterized by a pH * of 6.5.
  • the table below groups together the characteristics of the final formulation: The particle size is measured according to the T 'test.
  • Example 2.2 concentration of PO-Al equal to 45 mg / g
  • PO-Al polymer obtained according to synthesis b) above is used. PO-Al is diluted in water, and pH (appropriate NaOH solution) and osmolarity (appropriate NaCl solution) are adjusted.
  • the colloidal solution based on PO-Al polymer obtained does not precipitate when adding 1 ml of the latter to 1 ml of Tp buffer solution, and is characterized by a precipitation factor Fp equal to 166.
  • Example 2.3 concentration of PO-Al equal to 10 mg / g, containing IFN-alpha and Zn ++ cations
  • the table below groups together the characteristics of the final formulation: The particle size is measured according to the test T '.
  • the PO-Al polymer-based colloidal solution obtained precipitates upon the addition of 1 ml of the latter to 1 ml of Tp buffer solution, and is characterized by a precipitation factor Fp equal to 860.
  • the PO-Al polymer containing 0.5 molar equivalent of Zn ++ cations per cationic derivative is characterized by a pH * equal to 4.8.
  • Example 3 formulation based on polymer PO-A2 at 30 mg / g containing VIFN-alpha
  • PO-A2 polymer obtained according to the synthesis c) above is used. PO-A2 is diluted in water, and pH (appropriate NaOH solution) and osmolarity (appropriate NaCl solution) are adjusted.
  • the PO-A2 polymer-based colloidal solution obtained precipitates upon the addition of 1 ml of the latter to 1 ml of Tp buffer solution, and is characterized by a precipitation factor Fp equal to 840.
  • the PO-A2 polymer is characterized by a pH * of 6.5.
  • IFN- ⁇ protein at 2.4 mg / g is added 8 g of colloidal solution of PO-A2, and the final concentration is adjusted by dilution with an appropriate solution of NaCl (0.18 g).
  • the table below groups together the characteristics of the final formulation.
  • the particle size is measured according to the T 'test.
  • Example 4.1 Polymer formulation PO-B 10 mg / g containing IFN-a a) Preparation of a colloidal solution of PO-B
  • PO-B polymer obtained according to the synthesis d) above is used. PO-B is diluted in water, and the pH (appropriate NaOH solution) and the osolarity (appropriate NaCl solution) are adjusted.
  • the PO-B polymer-based colloidal solution obtained precipitates when 1 ml of the latter is added to 1 ml of Tp buffer solution, and is characterized by a precipitation factor Fp equal to 1150.
  • the PO-B polymer is characterized by a pH * of 5.
  • Example 4.2 concentration of PO-B equal to 45 mg / g
  • PO-B polymer obtained according to the synthesis d) above is used. PO-B is diluted in water, and pH (appropriate NaOH solution) and osmolarity (appropriate NaCl solution) are adjusted.
  • the PO-B polymer-based colloidal solution obtained precipitates when 1 ml of the latter is added to 1 ml of Tp buffer solution and is characterized by a precipitation factor Fp equal to 256.
  • PO-B polymer is characterized by a pH * equal to 5.
  • the polymer PO obtained according to the synthesis a) above is used.
  • a colloidal solution of PO polymer is obtained by solubilizing it in water by adjusting the pH to 7.52 by adding a solution of NaOH.
  • the osmolarity of the solution is adjusted to 108 mOsm by introducing the necessary amount of an aqueous solution of NaCl.
  • the PO polymer concentration is adjusted to 29.05 mg / g.
  • To the above colloidal PO polymer solution was added concentrated IFN- ⁇ protein at 2.4 mg / g. The association is carried out overnight at 25 ° C.
  • the particle size is measured according to the T 'test.
  • the table below groups together the characteristics of the particles obtained:
  • the release of the active ingredient from the formulations according to the invention is measured using the L-test.
  • Figure 1 shows the release of the active ingredient in the L-test as the percentage of protein released over time.
  • Comparative Example 5 The formulation of Comparative Example 5, containing 23 mg / g of PO particles, has a release profile characterized by 93% protein released in 10 hours.
  • Example 2.1 and 3 show delayed release profiles with releases of 67 and 65%, respectively, of the injected protein in 48 hours.
  • the creation of a release flux which is not zero at the end of the experiment is observed, with a release of 59% of the injected protein in 48 hours.
  • C max represents the maximum average plasma concentration of protein on all animals.
  • Median T max represents the median time for which the plasma concentration passes through its maximum.
  • AUC represents the mean area under the curve of plasma concentration as a function of time.
  • T50% AUC represents the average time at which the area under the curve reaches 50% of its total value.
  • RBA is the ratio of the area under the curve of the formulation considered to the area under the curve of the IFN IR formulation.

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Abstract

La présente invention concerne de nouvelles formulations pharmaceutiques pour la libération prolongée de principe actif (PA), permettant de libérer le PA sur une durée prolongée de plusieurs jours, voire plusieurs semaines. L'invention concerne dans un premier aspect une formulation liquide, comprenant au moins un principe actif (PA) et une suspension aqueuse, à base de particules colloïdales d'un polymère (PO), caractérisée en ce qu'elle satisfait aux quatre conditions suivantes: (a) le polymère (PO) est un polyaminoacide comprenant des résidus glutamiques, - certains résidus glutamiques étant porteurs d'un groupement cationique (GC) pendant, les groupements cationiques étant identiques ou différents entre eux, - d'autres résidus glutamiques étant porteurs d'un groupement hydrophobe (GH) pendant, lesdits groupements hydrophobes (GH) étant identiques ou différents entre eux; (b) la valeur pHf du pH de ladite formulation est comprise entre 3,0 et 6,5; (c) pour la valeur pHf du pH, le polymère (PO) forme une solution colloïdale qui associe spontanément et de façon non covalente le principe actif (PA); (d) 1 ml de ladite formulation précipite lors d'un mélange avec un volume de 1 ml d'une solution tampon test Tp. L'invention concerne également le procédé de préparation de cette formulation et un procédé de préparation de médicaments.

Description

FORMULATIONS PHARMACEUTIQUES AUTO-PRECIPITANTES POUR LA LIBÉRATION MODIFIEE DE PRINCIPE ACTIF
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne de nouvelles formulations pharmaceutiques pour la libération prolongée de principe(s) actif(s) -PA-, en particulier protéinique(s) et peptidique(s). La demande concerne également les applications, notamment thérapeutiques, de ces formulations pharmaceutiques. Ces formulations pharmaceutiques actives concernent aussi bien la thérapeutique humaine que vétérinaire.
L'abréviation PA utilisée dans tout le présent exposé vise au moins un principe actif.
ETAT DE LA TECHNIQUE
Dans le domaine de la libération prolongée des PA pharmaceutiques, notamment des peptides/protéines thérapeutiques, on cherche très souvent à reproduire au mieux chez le patient une concentration plasmatique en peptide ou en protéine proche de la valeur observée chez le sujet sain. Cet objectif se heurte à la faible durée de vie des protéines dans le plasma, qui conduit à injecter de façon répétée la protéine thérapeutique. La concentration plasmatique en protéine thérapeutique présente alors un profil "en dents de scie" caractérisé par des pics élevés de concentration et des minima de concentration très bas. Les pics de concentration, très supérieurs à la concentration basale chez le sujet sain, ont des effets nocifs très marqués du fait de la toxicité élevée des protéines thérapeutiques telles que certaines cytokines. Par ailleurs, les minima de concentration sont inférieurs à la concentration nécessaire pour avoir un effet thérapeutique, ce qui entraîne une mauvaise couverture thérapeutique du patient et des conséquences graves à long terme.
Aussi, pour reproduire chez le patient une concentration plasmatique en protéine thérapeutique proche de la valeur idéale pour le traitement du patient, il importe que la formulation pharmaceutique considérée permette de libérer la protéine thérapeutique sur une durée prolongée, de façon à limiter les variations de concentration plasmatique au cours du temps.
Par ailleurs, cette formulation active doit, de préférence, satisfaire au cahier des charges suivant, déjà connu de l'homme de l'art :
1 - libération prolongée d'une protéine thérapeutique active et non dénaturée, par exemple humaine ou synthétique, de sorte que la concentration plasmatique est maintenue au niveau thérapeutique ; 2 - viscosité à l'injection suffisamment basse pour être aisément injectable ;
3 - forme biocompatible et biodégradable présentant un excellent profil de toxicité et de tolérance.
Pour tenter d'atteindre ces objectifs, l'une des meilleures approches proposées dans l'art antérieur fut de développer des formes à libération prolongée de protéine(s) thérapeutique(s) constituées par des suspensions, liquides et peu visqueuses de nanoparticules chargées en protéines thérapeutiques. Ces suspensions ont permis l'administration aisée de protéines thérapeutiques natives. Ainsi, la société Flamel Technologies a proposé une voie, dans laquelle la protéine thérapeutique est associée à des nanoparticules d'un copolyaminoacide comprenant des groupements hydrophobes et des groupements hydrophiles.
La demande de brevet US 2006/0099264 divulgue des polyaminoacides amphiphiles comprenant des résidus aspartiques et/ou des résidus glutamiques, au moins une partie de ces résidus étant porteuse de greffons comportant au moins un motif alpha-tocophérol, e.g. polyglutamate ou polyaspartate greffé par l'alpha tocophérol d'origine synthétique ou naturelle. Ces homopolyaminoacides "modifiés hydrophobes" forment spontanément dans l'eau une suspension colloïdale de nanoparticules, lesquelles sont aptes à s'associer aisément en suspension aqueuse à pH 7,4, avec au moins une protéine active (insuline). La durée de libération in vivo de la (ou des) protéine(s) active(s) (e.g. insuline)
"vectorisée" par les suspensions selon US 2006/0099264 gagnerait à être augmentée.
L'augmentation de la durée de libération a été partiellement obtenue par les formes pharmaceutiques décrites dans la demande PCT WO-A-05/051416. Dans cette demande, est divulguée une suspension colloïdale de nanoparticules (0,001 - 0,5 μm) de poly(L- glutamate de sodium) modifié hydrophobe auxquelles est associé un PA, par exemple une protéine thérapeutique ; cette suspension, injectée par voie sous-cutanée à une concentration suffisamment élevée, forme in situ chez le patient un gel au contact de l'albumine endogène. La protéine thérapeutique est alors lentement libérée sur une période typique d'une semaine. Cependant, lorsque la concentration en protéine thérapeutique à administrer est relativement élevée, comme c'est le cas par exemple pour l'hormone de croissance humaine, la durée de libération est limitée à quelques jours.
La durée de libération de ces formes gagnerait à être encore augmentée.
Une autre voie également suivie pour prolonger la durée de libération in vivo du PA après injection sous-cutanée est d'utiliser une formulation liquide à la température d'injection, mais qui gélifie lorsque la température s'élève à 37 0C.
Ainsi les demandes PCT WO-A-99/18142 & WO-A-00/18821 concernent des solutions aqueuses de polymères qui contiennent un PA sous forme dissoute ou colloïdale, qui sont administrables à des animaux à sang chaud, notamment par injection, et qui forment un dépôt gélifié in vivo, car la température physiologique est supérieure à leur température de gélification. Le gel ainsi formé libère le PA de façon prolongée. Ces polymères biodégradables particuliers sont des triblocs ABA ou BAB avec A = polylactique- coglycolique (PLAGA) ou polylactique (PLA) et B = PolyEthylèneGlycol. Les températures de transformation liquide => gel de ces polymères triblocs sont par exemple de 36, 34, 30 et 26 0C. A l'instar des polymères (A) selon l'US-B-6 143 314, l'hydrolyse in vivo de ces polymères triblocs ABA ou BAB conduit à des acides qui peuvent ne pas être bien tolérés localement.
La demande de brevet PCT/FR2006/002443, de la demanderesse, décrit des polyglutamates modifiés par des dérivés de l'histidine et par des groupements hydrophobes, et leurs applications. Notamment, il est décrit que ces polymères sont solubles à pH acide et précipitent à pH neutre. Ils permettent de préparer des formulations pour la libération d'un principe actif tel qu'une protéine thérapeutique. Dans le cadre de la mise au point d'une formulation liquide aqueuse auto-précipitante pour la libération prolongée utilisant de tels polymères, il a été trouvé de façon inattendue qu'une formulation satisfaisant le cahier des charges exigeant ne peut être obtenue que sous certaines conditions particulières. Par exemple, le polymère pGluHisOEt alpha-tocophérol décrit dans la demande PCT/FR2006/002443, formulé à pH 5,5 et à 45 mg/mL de polymère, ne conduit pas au résultat attendu.
Ce n'est qu'après de longues études que la demanderesse a eu le mérite i) d'identifier des formulations de polymères cationiques (PO) qui permettent de satisfaire au cahier des charges d'un système auto-précipitant et ii) de proposer des conditions particulières pour les sélectionner. Ces polymères (PO) sont sélectionnés soit parmi les polymères décrits dans la demande PCT/FR2006/002443, soit parmi une nouvelle famille de polymères comportant des groupements cationiques et porteurs de groupements hydrophobes.
BREVE DESCRIPTION DE L'INVENTION
L'un des objectifs de l'invention est de proposer de nouvelles formulations à base de polymères polyglutamates modifiés par des dérivés d'aminoacides cationiques et porteurs de groupements latéraux hydrophobes, chargées en principe actif (PA) et libérant le principe actif (PA) sur une durée prolongée de plusieurs jours, voire plusieurs semaines.
Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles formulations liquides à base de polymères polyglutamates modifiés par des dérivés d'aminoacides cationiques et porteurs de groupements latéraux hydrophobes, chargées en principe actif (PA), dont la composition et la concentration permettent de maximiser la durée de libération du principe actif (PA) après administration sous-cutanée.
Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles formulations liquides à base de polymères polyglutamates modifiés par des dérivés d'aminoacides cationiques et porteurs de groupements latéraux hydrophobes, chargées en principe actif (PA), dont la composition est telle qu'elle permet de libérer le principe actif (PA) sur plusieurs jours, voire plusieurs semaines, avec la concentration la plus faible possible en polymère.
Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles formulations liquides à base de polymères polyglutamates modifiés par des dérivés d'aminoacides cationiques et porteurs de groupements latéraux hydrophobes, chargées en principe actif (PA), dont la composition et la concentration permettent de l'injecter facilement à travers une aiguille de petite dimension.
Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles formulations liquides, à base de polymères polyglutamates modifiés par des dérivés d'aminoacides cationiques et porteurs de groupements latéraux hydrophobes, stables en solution aqueuse.
Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles formulations, à base de polymères polyglutamates modifiés par des dérivés d'aminoacides cationiques et porteurs de groupements latéraux hydrophobes, aptes à être conservées sous forme lyophilisée.
Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles formulations, à base de polymères polyglutamates modifiés par des dérivés d'aminoacides cationiques et porteurs de groupements latéraux hydrophobes, facilement redispersibles après lyophilisation.
Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles formulations, à base de polymères polyglutamates modifiés par des dérivés d'aminoacides cationiques et porteurs de groupements latéraux hydrophobes, chargées en principe actif (PA) et stables sous forme lyophilisée.
Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles formulations, à base de polymères polyglutamates modifiés par des dérivés d'aminoacides cationiques et porteurs de groupements latéraux hydrophobes, libérant une protéine ayant préservé son activité biologique.
Un autre objectif de l'invention est de proposer une formulation pharmaceutique solide pour la libération prolongée de principe actif (PA), en particulier une forme poudre sèche, par exemple pour inhalation et administration pulmonaire. Un autre objectif de l'invention est de proposer un nouveau procédé de préparation d'une formulation pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), cette formulation étant en particulier une des formulations décrites ci-dessus. Un autre objectif de l'invention est de proposer un nouveau procédé de préparation de médicaments mettant en œuvre ces formulations pharmaceutiques.
Pour atteindre ces objectifs, il est du mérite de la demanderesse d'avoir su, après de longues et coûteuses recherches, identifier les formulations, à base de polymères polyglutamates modifiés par des dérivés d'aminoacides cationiques et porteurs de groupements latéraux hydrophobes, qui optimisent la libération prolongée de protéines et de peptides thérapeutiques.
D'où il s'ensuit que l'invention concerne tout d'abord une formulation pharmaceutique liquide aqueuse pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), aisément injectable, par exemple par voie parentérale, comprenant au moins un principe actif (PA) et une suspension aqueuse, à base de particules colloïdales d'un polymère (PO) ou de ses sels pharmaceutiquement acceptables, caractérisée en ce qu'elle satisfait aux quatre conditions suivantes :
(a) le polymère (PO) est un polyaminoacide comprenant des résidus glutamiques, - certains résidus glutamiques étant porteurs d'un groupement cationique (GC) pendant, lesdits groupements cationiques étant identiques ou différents entre eux,
- d'autres résidus glutamiques étant porteurs d'un groupement hydrophobe (GH) pendant, lesdits groupements hydrophobes (GH) étant identiques ou différents entre eux, - éventuellement d'autres résidus glutamiques étant porteurs d'un groupement neutre
(GN) pendant, les groupements neutres (GN) étant identiques ou différents entre eux,
- éventuellement d'autres résidus glutamiques étant non modifiés ;
(b) le pH de ladite formulation (pHf) est compris entre 3,0 et 6,5 ; (c) pour la valeur pHf du pH, le polymère (PO) forme une solution colloïdale de particules auxquelles s'associe spontanément et de façon non covalente le principe actif (PA) ;
(d) 1 ml de ladite formulation précipite lors d'un mélange avec un volume de 1 ml d'une solution tampon test Tp.
De préférence, une telle formulation présente un facteur de précipitation Fp supérieur à 200, de préférence supérieur à 400, de préférence supérieur à 800, et plus préférentiellement encore, supérieur à 1500.
L'invention concerne donc également une formulation pharmaceutique liquide aqueuse pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), aisément injectable, par exemple par voie parentérale, comprenant au moins un principe actif (PA) et une suspension aqueuse, à base de particules colloïdales d'un polymère (PO) ou de ses sels pharmaceutiquement acceptables, caractérisée en ce qu'elle satisfait aux quatre conditions suivantes:
(a) le polymère (PO) est un polyaminoacide comprenant des résidus glutamiques, - certains résidus glutamiques étant porteurs d'un groupement cationique (GC) pendant, lesdits groupements cationiques étant identiques ou différents entre eux,
- d'autres résidus glutamiques étant porteurs d'un groupement hydrophobe (GH) pendant, lesdits groupements hydrophobes (GH) étant identiques ou différents entre eux,
- éventuellement d'autres résidus glutamiques étant porteurs d'un groupement neutre (GN) pendant, les groupements neutres (GN) étant identiques ou différents entre eux,
- éventuellement d'autres résidus glutamiques étant non modifiés ; (b) le pH de ladite formulation pHf) est compris entre 3,0 et 6,5 ;
(c) pour la valeur pHf du pH, le polymère (PO) forme une solution colloïdale de particules auxquelles s'associe spontanément et de façon non covalente le principe actif (PA) ;
(d) ladite formulation présente un facteur de précipitation Fp supérieur à 200, de préférence supérieur à 400, et de préférence supérieur à 800, et plus préférentiellement encore, supérieur à 1500.
De plus, cette formulation est de préférence caractérisée en ce que son facteur de rétention Qr est supérieur à 5, de préférence supérieur à 10, et de préférence supérieur à 15, et plus préférentiellement encore, supérieur à 20.
II a été montré que pour une concentration donnée en polymère, la cinétique de libération du principe actif (PA) dépend de façon notable de la composition du polymère, c'est-à-dire des fractions molaires respectives en groupements cationiques, en greffons latéraux hydrophobes, et éventuellement en groupements neutres et en groupements glutamates.
L'invention concerne également un procédé de préparation de formulations pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), ces formulations étant en particulier celles décrites ci-dessus, comprenant les étapes suivantes :
1) la préparation d'une solution colloïdale aqueuse, de pH compris entre 3 et 6,5, d'un polymère (PO) polyaminoacide comprenant des résidus glutamiques,
- certains résidus glutamiques étant porteurs d'un groupement cationique (GC) pendant, lesdits groupements cationiques étant identiques ou différents entre eux, - d'autres résidus glutamiques étant porteurs d'un groupement hydrophobe (GH) pendant, lesdits groupements hydrophobes (GH) étant identiques ou différents entre eux, - éventuellement d'autres résidus glutamiques étant porteurs d'un groupement neutre (GN) pendant, les groupements neutres (GN) étant identiques ou différents entre eux,
- éventuellement d'autres résidus glutamiques étant non modifiés ; les fractions molaires respectives en groupement cationique (GC), en groupements hydrophobes (GH), éventuellement en groupements neutres (GN) et éventuellement en glutamate, étant telles que 1 ml de ladite formulation précipite lors d'un mélange avec un volume de 1 ml d'une solution tampon test Tp ; et 2) l'ajout d'au moins un principe actif (PA) au polymère (PO) obtenu à l'étape 1, ledit principe actif s'associant de façon non covalente aux particules de la solution colloïdale dudit polymère, ledit ajout pouvant être réalisé juste avant l'utilisation thérapeutique finale de la formulation (30 min avant par exemple). L'invention concerne également un procédé de préparation de médicaments, en particulier pour administration parentérale, muqueuse, sous-cutanée, intramusculaire, intradermique, transdermique, intrapéritonéale, intracérébrale ou dans une tumeur, voire par voie orale, nasale, pulmonaire, vaginale ou oculaire, consistant essentiellement à mettre en œuvre au moins une formulation telle que décrite ci-dessus.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Définitions
Dans la présente description, on entend par "groupement cationique" (GC) un groupement greffé de façon covalente sur un résidu glutamique, et comprenant une ou plusieurs fonctions aminés ou un ou plusieurs ammoniums quaternaires. Dans le cas d'une fonction aminé, le groupement sera principalement ionisé à tout pH au-dessous de son pKa, dans le cas d'un ammonium quaternaire, le groupement sera ionisé à tout pH. Sauf mention contraire, les radicaux alkyles ont de 1 à 10 atomes de carbone. Dans la présente description, on entend par "groupement neutre" un groupement ne portant pas de charge pour tout pH compris entre 3 et 10, par exemple les groupements obtenus par condensation sur le carboxyle d'un résidu glutamique de Péthanolamine (liée par l'azote), d'un alkylène glycol ou d'un polyoxyalkylène glycol.
On entend par "sels pharmaceutiquement acceptables" du polymère selon l'invention l'ensemble des polymères avec les contre- ions associés aux fonctions ionisées du polymère.
Dans la présente description, on entend par solution un mélange homogène solvant et polymère sous forme de chaîne individuelle. Dans la présente description, on entend par solution colloïdale une suspension de particules dont le diamètre moyen mesuré par le test T' est inférieur ou égal à 0,5 μm.
Dans la présente description, on entend par "formulation aisément injectable" (par exemple par voie parentérale), une formulation présentant une viscosité dynamique à 20 0C inférieure ou égale à 1000 mPa.s. De préférence, la viscosité dynamique de la formulation, mesurée à 20 0C, pour un gradient de cisaillement de 1000 s"1, est préférablement inférieure ou égale à 500 mPa.s., de préférence comprise entre 2 et 200 mPa.s. par exemple, comprise entre 1,0 et 100 mPa.s, voire entre 1,0 et 50 mPa.s.
Dans la présente description, une petite molécule est une molécule ayant un poids moléculaire inférieur à 1 kDa, notamment une molécule non protéinique.
Dans la présente description, on entend par pHf le pH de la formulation selon l'invention.
Dans la présente description, on entend par pH*, le pH de précipitation de la formulation à base de polymère PO déterminé selon le test P :
Test P de mesure du pH de précipitation pH* par mesure de l'absorbance à 500 nm :
Une solution de polymère PO concentrée à 1 ou 2 mg/ml et contenant 0, 15 M de chlorure de sodium est portée à pH 4 par ajout d'acide acétique ou de soude 1 M et est laissée sous agitation pendant 24 h. Cette solution est ensuite filtrée sur 0,8 - 0,2 μm. On procède ensuite à la titration de cette solution par une solution 0,1 M de soude en enregistrant l'évolution de l'absorbance à 500 nm de la solution de polymère PO en fonction du pH de ladite solution sur un spectromètre UV (type Lambda 35, Perkin Elmer). Le pH de précipitation, pH*, correspond à la valeur du pH pour laquelle l'absorbance augmente brutalement pour atteindre une valeur supérieure à 1.
Dans la présente description, on entend par « solution tampon test Tp » un milieu aqueux contenant 30 mg/g d'albumine (BSA fraction V, Aldrich), 0,01 M de tampon phosphate, 0,0027 M de chlorure de potassium, 0,137 M de chlorure de sodium (PBS, Aldrich) et 0,015 M d'acétate d'ammonium (Aldrich).
Dans la présente description, on entend par Δn, le nombre de moles de soude, nécessaires pour amener 0,5 ml de la solution colloïdale contenant 1 mg de polymère PO de pHf à pH*, obtenu par la méthode classique de titration acido-basique MT :
Une solution de polyélectrolyte concentrée à 2 mg/ml et contenant 0,15 M de chlorure de sodium est portée à pH 4 par ajout d'acide acétique ou de soude 1 M. On procède ensuite à la titration de cette solution par une solution 0,05 M de soude en enregistrant l'évolution du pH en fonction du volume de soude ajouté. La détermination de Δn s'effectue par simple lecture du volume de soude ajouté pour passer de pHf à pH*.
Dans la présente description, on définit le pH physiologique comme étant égal à 7,2 ± 0,4.
Dans la présente description, on entend par polyélectrolyte un polymère porteur de groupements capables de s'ioniser dans l'eau, ce qui crée une charge sur le polymère.
Test Q de mesure du facteur de rétention Qr :
Un volume V de la préparation selon l'invention prête à être administrée est versé à
25 0C dans 200 μl d'un pool de sérum de rat. Après précipitation des nanoparticules, la concentration en protéine libre dans le surnageant est mesurée par test ELISA. En reprenant le même essai pour des valeurs croissantes du volume V, on détermine la valeur V* du volume de préparation pour laquelle on trouve une fraction molaire de protéine libre dans le surnageant égale à 10 %. Le facteur de rétention, Qr, est donné par le rapport du volume V* aux 200 μl de sérum de rat. Par exemple, pour V* = 1 ml, on a : Qr = 5
Pour évaluer la taille des particules de la solution colloïdale du polymère PO on utilise de préférence le test T'. Le résultat du test T' est un diamètre hydrodynamique moyen.
Test T' de mesure de Ia taille des nanoparticules par diffusion quasi-élastique de la lumière :
Le diamètre hydrodynamique moyen des particules de polymère selon l'invention est mesuré selon le mode opératoire Md défini ci-après :
Les solutions de polymère sont préparées à des concentrations de 1 ou 2 mg/ml en milieu NaCl 0,15 M et laissées sous agitation pendant 24 h. Ces solutions sont ensuite filtrées sur 0,8 - 0,2 μm, avant de les analyser en diffusion dynamique de la lumière grâce à un appareil de type Malvern Compact Goniometer System, fonctionnant avec un faisceau laser He-Ne de longueur d'onde 632,8 nm et polarisé verticalement. Le diamètre hydrodynamique des nanoparticules de polymère est calculé à partir de la fonction d'autocorrélation du champ électrique par la méthode des cumulants, comme décrit dans « Surfactant Science Séries » volume 22, Surfactant Solutions, Ed. R. Zana, chap. 3, Marcel Dekker, 1984. Dans la présente description, on appelle nanoparticules les particules qui ont un diamètre moyen compris entre 2 et 500 nm, selon le test T'. Test L de mesure de Ia libération du principe actif :
Injecter 50 μl de formulation dans un cube de 1,5 cm de côté de mousse polyuréthane- polyéther baigné par un flux de 2,83 ml/h d'un milieu aqueux contenant 30 mg/g d'albumine (BSA fraction V, Aldrich), 0,01 M de tampon phosphate, 0,0027 M de chlorure de potassium, 0,137 M de chlorure de sodium (PBS, Aldrich) et 0,015 M d'acétate d'ammonium (Aldrich). On prélève régulièrement de la phase continue dont la teneur en protéine est analysée par ELISA.
On peut alors tracer le flux de protéine en divisant la concentration mesurée par le débit imposé, et la masse totale de protéine libérée en sommant celle trouvée dans chacun des prélèvements.
Au sens de l'invention, le terme "protéine" désigne aussi bien une protéine qu'un peptide, qu'il s'agisse d'un oligo ou d'un polypeptide. Cette protéine ou ce peptide peuvent être modifié ou non, par exemple, par greffage d'un ou de plusieurs groupements polyoxyéthyléniques.
Au sens de l'invention, l'expression « être porteur » signifie que le groupement porté est pendant, c'est-à-dire que ledit groupement est un groupement latéral par rapport aux résidus glutamiques et est un substituant de la fonction carbonyle en γ du résidu glutamique qui le porte.
Le polyglutamate est également porteur de groupements cationiques. Ces groupements sont greffés aux résidus glutamiques, de préférence par l'intermédiaire d'une liaison amide ou ester. De préférence, le polymère PO présente une structure pGlu(X)GH(y)GC(Z)GN(i-x-y-Z) avec un degré de polymérisation totale (DP) compris entre 50 et 300, de préférence compris entre 100 et 250, et plus préférentiellement encore compris entre 150 et 250.
Selon une variante de l'invention, les groupements cationiques (GC) peuvent être choisis parmi les bases faibles dont le pH de demi-neutralisation est inférieur à 7,0. De tels groupements cationiques (GC) sont par exemple obtenus à partir de précurseurs dérivés de l'histidine choisis dans le groupe comprenant les esters d'histidine, de préférence esters méthylique et éthylique ; l'histidinol, l'histamine, l'histidinamide, le dérivé N-monométhyle de l'histidinamide et le dérivé N.jV'-diméthyle de l'histidinamide.
Dans ce cas, les valeurs x, y et z peuvent être telles que x est compris entre 0 et 45 %, y est compris entre 2 et 30 %, z est compris entre 40 et 98 %, et 1-x-y-z est compris entre 0 et 50 %. On peut avoir également les valeurs x, y et z telles que x est compris entre O et 45 %, y est compris entre 2 et 30 %, z est compris entre 40 et 60 %, et 1-x-y-z est compris entre O et 58 %.
On peut avoir également les valeurs x, y et z telles que x est compris entre O et 45 %, y est compris entre 15 et 30 %, z est compris entre 40 et 60 %, et 1-x-y-z est compris entre 0 et 45 %.
Si le polymère PO ne comporte pas de groupements neutres (GN), on peut avoir les valeurs x, y et z telles que x est compris entre O et 45 %, y est compris entre 2 et 30 %, et z est compris entre 40 et 98 %. Selon une autre variante de l'invention, les groupements cationiques (GC) peuvent être choisis parmi ceux qui comprennent au moins un ammonium quaternaire ou au moins une base forte dont le pH de demi-neutralisation est supérieur à 8,0.
De tels groupements cationiques (GC) peuvent être obtenus à partir des composés précurseurs suivants : - une diamine linéaire de 2 à 6 carbones, de préférence la putrescine, l'agmatine,
- l'éthanolamine liée par l'oxygène, la choline liée par l'oxygène, un dérivé ester ou amide d'un acide aminé dont la chaîne latérale est chargée positivement à pH neutre, Le. la lysine, l'arginine, l'ornithine, lié par la fonction aminé en position alpha. Dans ce cas, les valeurs x, y, et z peuvent être telles que :
- x est compris entre 10 et 55 %,
- y est compris entre 2 et 30 %, - z est supérieur ou égal à 10 % et est compris entre (x-10) % et (x+15) %, le nombre de groupements neutres correspondant au pourcentage complémentaire pour atteindre 100 %, et pouvant éventuellement être égal à 0.
On peut également avoir les valeurs x, y et z telles que :
- x est compris entre 20 et 55 %, - y est compris entre 2 et 7,5 %,
- z est supérieur ou égal à 20 % et est compris entre (x-10) % et (x+15) %, le nombre de groupements neutres correspondant au pourcentage complémentaire pour atteindre 100 %, et pouvant éventuellement être égal à 0.
On peut également choisir les valeurs x, y et z telles que x est compris entre 10 et
55 %, y est compris entre 2 et 30 %, z est compris entre 10 et 55 %, et 1-x-y-z est compris entre 0 et 60 %. On peut avoir également les valeurs x, y et z telles que x est compris entre 10 et 20 %, y est compris entre 2 et 30 %, z est compris entre 10 et 30 %, et 1-x-y-z est compris entre 20 et 78 %.
On peut avoir également les valeurs x, y et z telles que x est compris entre 10 et 20 %, y est compris entre 15 et 30 %, z est compris entre 10 et 30 %, et 1-x-y-z est compris entre 20 et 65 %.
Si le polymère PO ne comporte pas de groupements neutres (GN), on peut avoir les valeurs x, y et z telles que x est compris entre 10 et 55 %, y est compris entre 2 et 30 %, et z est compris entre 40 et 60 %.
Avantageusement, les polyaminoacides selon l'invention sont, e.g., des homopolymères d'alpha-L-glutamate ou d'alpha- L-glutamique.
Les groupements cationiques utilisables pour fonctionnaliser les résidus glutamates sont identiques ou différents entre eux et correspondent à : • un dérivé de l'histidine choisis dans le groupe comprenant les esters d'histidine, de préférence l'ester méthylique et l'ester éthylique, l'histidinol, l'histamine, l'histidinamide, le dérivé N-monométhyle de l'histidinamide et le dérivé jV,iV'-diméthyle de l'histidinamide ou à : • la formule générale suivante :
X W3 +Z
dans laquelle :
X = O, NH,
Y = indépendamment un H ou un CH3, Z" = un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate,
L = un alkylène linéaire (C2 à C6) et éventuellement substitué par un groupe fonctionnel de type carboxyle ou dérivé.
Ainsi, les groupements cationiques utilisables dans la présente invention sont choisis dans le groupe de radicaux ayant les formules suivantes :
- -NH-(CH2)W-NH3 +, Z" avec w compris entre 2 et 6, et de préférence w est égal à 4,
- -NH-(CH2)4-NH-C(=NH)-NH3 +, Z",
- -O-(CH2)2-NH3 +, Z , - -O-(CH2)2-N+(CH3)3, Z", un résidu d'acide aminé ou un dérivé d'acide aminé de formule :
Figure imgf000014_0001
dans laquelle :
- R1 est alcoxy, de préférence -OMe ou -OEt, ou -R1 est -NH2 , alkylamino, de préférence -NH-CH3 ou -N(CH3)2 ;
- R13 est -(CH2)4-NH3 +, T , -(CH2)3-NH-C(=NH)-NH3 +, Z" , -(CH2)3-NH3 +, Z" ; où Z' est un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate, de préférence un chlorure.
Par exemple, les groupements cationiques peuvent présenter les formules suivantes :
Figure imgf000015_0001
Ethαnolαmine Choline
Figure imgf000015_0002
H3+,CI-
Putrescine
Figure imgf000015_0003
Figure imgf000015_0004
lysine
Figure imgf000015_0005
ester ou αmide
Arginine ester ou αmide
dans lesquelles -Ri représente un groupement alcoxy ou alkylamino, de préférence un groupement -OMe, -OEt, -NH2, -NHCH3 ou -N(CHs)2, et -R2 représente hydrogène,
Figure imgf000015_0006
Suivant une caractéristique préférée, les polyaminoacides comportent en moyenne au moins 3 groupements hydrophobes (GH) par chaîne de polymère.
Avantageusement, au moins l'un des groupements hydrophobes GH est inclus dans un greffon hydrophobe comprenant au moins une rotule (ou motif) d'espacement ("spacer") permettant de relier le groupement hydrophobe GH à une chaîne de polyglutamate (par exemple une chaîne principale - squelette-polyglutamate). Cette rotule peut comprendre, e.g. au moins une liaison covalente directe et/ou au moins une liaison amide et/ou au moins une liaison ester. Par exemple, la rotule peut être du type de celles appartenant au groupe comportant notamment : les résidus "acide aminé" différents de l'unité monomérique constitutive du polyglutamate, les dérivés des aminoalcools, les dérivés des polyamines (par exemple les diamines), les dérivés des polyols (par exemple les diols) et les dérivés des hydroxyacides.
Le greffage des GH sur la chaîne polyglutamate peut passer par la mise en œuvre de précurseurs de GH, aptes à se lier à la chaîne polyglutamate.
Les précurseurs des GH sont, en pratique et sans que cela ne soit limitatif, choisis dans le groupe comprenant les alcools et les aminés, ces composés pouvant être fonctionnalisés facilement par l'homme de l'art.
Suivant une caractéristique préférée, le groupement hydrophobe GH du greffon hydrophobe comporte de 8 à 30 atomes de carbone.
Ces groupements hydrophobes GH sont avantageusement et judicieusement sélectionnés dans le groupe suivant :
• les alkyles linéaires ou ramifiés en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome, • les alkylaryles ou arylalkyles en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome,
• et les (poly)cycliques en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome.
Les rotules formant avec les GH des greffons hydrophobes, peuvent être di-, tri- ou tétravalentes (voire pentavalentes et plus). Dans le cas d'une rotule divalente, le greffon hydrophobe comporte un seul groupement GH, tandis qu'une rotule trivalente confère au greffon hydrophobe un caractère bifide, c'est-à-dire que le greffon présente deux "pattes" GH. À titre d'exemple de rotule trivalente, on peut citer, entre autres, des résidus "acide aminé", par exemple "acide glutamique" ou des restes polyols, par exemple glycérol. Ainsi, deux exemples avantageux mais non limitatifs de greffons hydrophobes comprenant des GH bifides sont les dialkyl-glycérols et les dialkyl-glutamates.
Les groupements hydrophobes GH peuvent être, par exemple, dérivés de précurseurs choisis dans le groupe suivant : octanol, dodécanol, tétradécanol, hexadécanol, octadécanol, oléylalcool, tocophérol ou cholestérol. Tel que cela a été défini ci-dessus, les groupements neutres (GN) peuvent être choisis dans le groupe suivant : un radical hydroxyéthylamino-, hydroxyalkyloxy- ou polyoxyalkylène
Selon une autre variante, les polyglutamates utilisés dans la présente invention peuvent être également porteurs d'au moins un greffon de type polyalkylène (de préférence éthylène)glycol lié à un résidu glutamate.
De préférence, le squelette du polyglutamate selon la présente invention comprend des résidus L-glutamate et/ou acide L-glutamique ; de préférence ces résidus sont liés dans le polypeptide par leur carboxyle en position alpha.
De manière plus préférée encore, les polyglutamates utilisés dans la présente invention répondent à la formule (I) suivante :
Figure imgf000017_0001
I dans laquelle :
" A représente indépendamment : un NHR dans lequel R représente un H, un alkyle linéaire en C2 à C io, un alkyle ramifié en C3 à C io ou un benzyle, un résidu acide aminé ou un dérivé d'acide aminé terminal de formule :
H
—NH — c- -COR7 dans laquelle
R7 est OH, OR9 ou NHR10, et R8, R9 et R10 représentent indépendamment un H, un alkyle linéaire en C2 à Cio, alkyle ramifié en C3 à Qo ou un benzyle ;
• B est une liaison directe ou un groupement de liaison divalent, trivalent ou tétravalent, de préférence choisi parmi les radicaux suivants :
-O-, -NH-, -N(C i_5 alkyle)-, un résidu d'acide aminé (de préférence naturel), de diol, de triol, de diamine, de triamine, d'aminoalcool ou d'hydroxyacide comportant de 1 à 6 atomes de carbone ; " D représente un H, un acyle linéaire en C2 à Cio, acyle ramifié en C3 à Ci0, ou un pyroglutamate ;
" les groupements hydrophobes (GH) représentent chacun indépendamment les uns des autres un radical choisi parmi :
• les alkyles linéaires ou ramifiés en Cg à C3o pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S), ou
• les alkylaryles ou arylalkyle en Cs à C3o pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S), ou
• les (poly)cycliques en C$ à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S) ; et de préférence au moins l'un des groupements hydrophobes (GH) étant obtenu par greffage, à partir d'un précurseur choisi dans le groupe suivant : octanol, dodécanol, tétradécanol, hexadécanol, octadécanol, oléylalcool, tocophérol ou cholestérol, et B représentant alors une liaison directe ;
• R70 représente un radical choisi dans le groupe suivant : - -NH-(CH2)W-NH3 + avec w compris entre 2 et 6, et de préférence w est égal à 4,
- -NH-(CH2)4-NH-C( NH)-NH3 +,
- -O-(CH2)2-NH3 +,
- -O-(CH2)2-N+(CH3)3, un radical de formule :
Figure imgf000019_0001
où -R représente -H, -CO2H, un ester d'alkyle (de préférence -COOMe et -COOEt), -CH2OH, -C(=O)-NH2, -C(=O)-NH-CH3 ou -C(=O)-N(CH3)2 ; un résidu d'acide aminé ou un dérivé d'acide aminé de formule :
Figure imgf000019_0002
dans laquelle :
X est -O- ou -NH- ,
R12 est H, alkyle linéaire en C2 à Cio, alkyle ramifié en C3 à Cio ou benzyle,
-R13 est -(CH2)4NH3 +, -(CH2)3-NH-C(=NH)-NH3 +, -(CH2)3NH3 + ; le contre-anion de R70 est un anion convenable, notamment choisi parmi un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate, de préférence un chlorure ; " R représente un hydroxyéthylamino-, un hydroxyalkyloxy- ou un polyoxyalkylène ;
" p, q, r et s sont des entiers positifs ;
" (p)/(p+q+r+s) est défini comme le taux de greffage molaire des groupements hydrophobes GH varie de 2 à 30 % molaire, sous condition que chaque chaîne de copolymère possède en moyenne au moins 3 greffons hydrophobes ;
• (q)/(p+q+r+s) est défini comme le taux de greffage molaire des groupements cationiques et varie de 10 à 98 % molaire ;
' (p+q+r+s) varie de 50 à 300, de préférence entre 100 et 250 ;
• (r)/(p+q+r+s) varie de 0 à 78 % molaire ; " (s)/(p+q+r+s) varie de 0 à 55 % molaire. ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
Pour plus de détails sur la préparation et la synthèse de polyaminoacides de formule (I) dérivés de lTiistidine, on se reportera utilement à la demande de brevet FR 05 53302. Pour plus de détails sur la préparation et la synthèse de polyaminoacides de formule (I) autres que ceux dérivés de l'histidine, on se reportera utilement à la demande de brevet FR 07 03185.
De préférence, les groupements hydrophobes GH et les groupements cationiques sont disposés de façon aléatoire en groupements pendants.
D'une manière générale, la formule générale (I) décrite ci-dessus ne doit pas être interprétée comme représentant uniquement des copolymères séquences (ou blocs), mais également des copolymères aléatoires ou des copolymères multiblocs.
De préférence, la concentration en polymère (PO) dans la formulation selon l'invention peut être comprise entre 4 et 50 mg/ml, en particulier lorsque le principe actif
(PA) est une protéine thérapeutique. Dans cette gamme de concentration, la formulation est aisément injectable par une aiguille de faible diamètre, par exemple une aiguille de Gauge 27, et même 29. Les exemples 2, 3 et 4 décrivent en détails de telles formulations.
De préférence, la concentration en polymère (PO) dans la formulation selon l'invention peut être comprise entre 5 et 30 mg/ml, et plus préférentiellement encore comprise entre 5 et 15 mg/ml.
Avantageusement, le rapport R de la concentration en principe actif (PA) à la concentration en polymère (PO) peut être compris entre 0,0001 et 1,5. Ce rapport R peut être également compris entre 0,01 et 1,2.
Selon une variante, la formulation selon l'invention peut contenir des cations divalents Zn++ dans une proportion comprise entre 0,05 et 2 équivalents molaires par rapport à la concentration molaire en groupements cationiques (GC). Notamment, la formulation selon l'invention peut contenir des cations divalents
Zn++ ajoutés dans la proportion comprise entre 0,25 et 0,75 équivalents molaires par rapport à la concentration molaire en groupements cationiques (GC), et de préférence égale à 0,5 éq, plus particulièrement lorsque les groupements cationiques (GC) sont obtenus à partir de dérivés de l'histidine choisis dans le groupe comprenant les esters d'histidine, de préférence l'ester méthylique et l'ester éthylique ; l'histidinol, l'histamine, l'histidinamide, le dérivé jV-monométhyle de l'histidinamide et le dérivé A^TV-diméthyle de l'histidinamide.
Selon une autre variante, la formulation selon l'invention ne contient pas de cation di valent ajouté.
Les polymères utilisés dans la présente invention ont une masse molaire qui se situe entre 2000 et 200000 g/mol, et de préférence entre 5000 et 100000 g/mol. Selon un mode particulièrement préféré de l'invention, lorsque les groupements cationiques (GC) sont choisis parmi les bases faibles dont le pH de demi-neutralisation est inférieur à 7,0, les polymères (PO) utilisés dans l'invention présentent une structure pGlιt(X)GH(y)GC(Z)GN(i-x-y-z) telle que x est compris entre 0 et 20 %, y est compris entre 2 et 30 %, z est compris entre 60 et 95 %, et 1 -x-y-z est compris entre 0 et 15 %.
On peut avoir également les valeurs x, y et z telles que x est compris entre 0 et 20 %, y est compris entre 2 et 10 %, z est compris entre 75 et 95 %, et 1 -x-y-z est compris entre 0 et 15 %.
On peut avoir également les valeurs x, y et z telles que x est compris entre 0 et 20 %, y est compris entre 15 et 25 %, z est compris entre 60 et 80 %, et 1 -x-y-z est compris entre 0 et 15 %.
Si le polymère PO ne comporte pas de groupements neutres (GN), on peut avoir les valeurs x, y et z telles que x est compris entre 0 et 20 %, y est compris entre 2 et 30 %, et z est compris entre 60 et 95 %. Selon un autre mode préféré de l'invention, lorsque les groupements cationiques
(GC) sont choisis parmi ceux qui comprennent des ammoniums quaternaires ou au moins une base forte dont le pH de demi-neutralisation est supérieur à 8,0, les valeurs x, y et z peuvent être telles que x est compris entre 15 et 50 %, y est compris entre 2 et 30 %, z est compris entre 10 et 50 %, et 1 -x-y-z est compris entre 10 et 55 %. On peut avoir également les valeurs x, y et z telles que x est compris entre 15 et
30 %, y est compris entre 2 et 30 %, z est compris entre 15 et 25 %, et 1 -x-y-z est compris entre 40 et 55 %.
On peut avoir également les valeurs x, y et z telles que x est compris entre 25 et 50 %, y est compris entre 2 et 30 %, z est compris entre 25 et 50 %, et 1 -x-y-z est compris entre 10 et 30 %.
Si le polymère PO ne comporte pas de groupements neutres (GN), on peut avoir les valeurs x, y et z telles que x est compris entre 10 et 55 %, y est compris entre 2 et 30 %, et z est compris entre 40 et 60 %.
Du fait d'un excès de charge cationique, le polymère PO utilisé dans l'invention est cationique et soluble à la valeur pHf du pH de la formulation. Cette charge se trouve partiellement ou totalement neutralisée à pH neutre de sorte que le polymère précipite. Sans être lié par la théorie, on peut supposer que ce phénomène de précipitation induit par une augmentation du pH résulte de la diminution de la charge globale des polymères entre le pH de formulation et le pH physiologique, et de la présence des groupements latéraux hydrophobes. II convient de comprendre que les fonctions résiduelles carboxyliques du polyglutamate modifié sont soit neutres (forme COOH), soit ionisées (anion COO"), selon le pH et la composition. On parlera donc indifféremment i) de résidu glutamate ou de résidu acide glutamique, ii) d'acide polyglutamique ou de polyglutamate. De la même façon, les fonctions aminés seront principalement ionisées à tout pH au-dessous de leur pKa, et les ammoniums quaternaires seront ionisés à tout pH.
En solution aqueuse, le contre-cation peut être un cation métallique tel que le sodium, le calcium ou le magnésium, ou un cation organique tel que la triéthanolamine, le tris(hydroxyméthyl)-aminométhane ou une polyamine telle que la polyéthylèneimine. S'il est divalent, un contre-cation peut salifier deux groupements cationiques monovalents proches.
Le contre-anion des groupements cationiques est de préférence choisi parmi le groupe comprenant un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate.
S'il est divalent, un contre-anion peut salifier deux groupements cationiques monovalents proches.
Par suite, dans la présente description, on entend par "sels pharmaceutiquement acceptables" du polymère selon l'invention l'ensemble des polymères avec les contre-ions associés aux fonctions ionisées du polymère.
Les polyaminoacides susceptibles d'être utilisés dans la présente invention sont obtenus, par exemple, par des méthodes connues de l'homme de l'art. Tout d'abord, rappelons que pour l'obtention de polyaminoacide de type alpha, la technique la plus courante est basée sur la polymérisation d'anhydrides de iV-carboxy-aminoacides (NCA), décrite, par exemple, dans Biopolymers, 1976, 15, 1869 et dans l'ouvrage de H.R.
Kricheldorf "alpha-Aminoacid-N-Carboxy Anhydrides and related Heterocycles" Springer Verlag (1987). Le dérivé de NCA est de préférence NCA-GIu-O-R3 (R3 = méthyle, éthyle ou benzyle). Les polymères sont ensuite hydrolyses dans des conditions appropriées pour obtenir le polymère sous sa forme acide. Ces méthodes sont inspirées de la description donnée dans le brevet FR 2 801 226.
Un certain nombre de polymères utilisables selon l'invention, par exemple, de type poly(alpha-L-glutamique), poly(alpha-D-glutamique), poly(alpha-D,L-glutamate) et poly(gamma-L-glutamique) de masses variables sont disponibles commercialement.
Le couplage du greffon GH avec une fonction acide du polymère est réalisé aisément par réaction du polyaminoacide en présence d'un carbodiimide comme agent de couplage et optionnellement, un catalyseur tel que la 4-diméthylaminopyridine et dans un solvant approprié tel que le diméthylformamide (DMF), la TV-méthylpyrrolidone (NMP) ou le diméthylsulfoxide (DMSO). Le carbodiimide est par exemple, le dicyclohexylcarbo- diimide ou le diisopropylcarbodiimide. Le taux de greffage est contrôlé chimiquement par la stœchiométrie des constituants et réactifs ou le temps de réaction. Les greffons hydro- phobes fonctionnalisés par un "espaceur" sont obtenus par couplage peptidique classique ou par condensation directe par catalyse acide.
Le couplage des groupements cationiques et éventuellement neutres avec une fonction acide du polymère est réalisé simultanément dans une deuxième étape en présence d'un chloroformiate comme agent de couplage et dans un solvant approprié tel que le diméthylformamide, la iV-méthylpyrrolidone (NMP) ou le diméthylsulfoxide (DMSO).
Dans le cas où le groupement cationique contient deux fonctions aminés non différenciées chimiquement (e.g. diamine linéaire), il peut être introduit sous une forme dans laquelle une des deux fonctions est protégée. Une dernière étape de clivage du groupement protecteur est alors ajoutée.
La chimie de polymérisation et les réactions de couplage des groupements sont classiques et bien connues de l'homme de l'art (voir par exemples les brevets ou demandes de brevet de la demanderesse cités ci-dessus).
Des exemples de préparation de formulations selon l'invention sont détaillés dans les exemples auxquels on se reportera.
Les caractéristiques de la formulation selon l'invention énoncées ci-dessus permettent à l'homme de l'art de sélectionner parmi toutes les formulations à base de polymère PO, celles qui satisfont simultanément aux conditions (a) ; (b) ; (c) et (d) et qui de ce fait répondent au mieux au cahier des charges défini en préambule.
Les conditions (c) et (d) sont particulièrement sélectives. Si la formulation ne forme pas de solution colloïdale à pHf, l'homme de l'art sélectionnera un polymère présentant à cette valeur du pH un nombre de monomères non ionisés plus important. Si, au contraire, le polymère précipite, il conviendra d'augmenter le nombre de monomères ionisés à ce pH.
Il est important de remarquer que, de façon contre-intuitive, certaines formulations conduisant à des solutions colloïdales à pHf et précipitant à pH physiologique devront cependant être écartées car ne satisfaisant pas à la condition (d). Ainsi la condition (d) est un moyen commode pour l'homme de l'art de sélectionner les formulations selon l'invention.
Il est important de remarquer que la condition (d) implique que la formulation selon l'invention précipite pour une valeur du pH inférieure ou égale au pH physiologique. En effet, après mélange de 1 ml de la formulation acide selon l'invention et de 1 ml de la solution tampon Tp, on doit observer une précipitation à une valeur du pH inférieure ou égale au pH de la solution tampon c'est-à-dire < 7,2.
Un deuxième mode de sélection des formulations selon l'invention est de les sélectionner selon leur facteur de précipitation, Fp. Ce facteur est défini expérimentalement de la façon suivante :
a) mesure du pH de précipitation, noté pH*
À pHf acide compris entre 3 et 6,5, la solution colloïdale chargée en PA se présente comme un liquide limpide contenant des nanoparticules, dont le diamètre hydrodynamique moyen, mesuré par diffusion dynamique de la lumière, selon le test T', est inférieur ou égale à 0,5 μm, de préférence compris entre 5 et 500 nm, de préférence encore, compris entre 10 et 80 nm. Lorsque l'on élève le pH, la solution selon l'invention doit précipiter pour une valeur de pH inférieure ou égale au pH physiologique. Cette valeur est mesurée selon le test P. pH* est la valeur de pH auquel la solution précipite dans ces conditions.
b) détermination de Fp
On mesure Δn, nombre de moles de soude nécessaires pour amener 0,5 ml de la solution colloïdale contenant 1 mg de polymère PO de pHf à pH* selon la méthode MT.
Le facteur de précipitation, Fp, de la formulation est défini par la formule :
Fp = -*- Δn.C dans laquelle : C est la concentration en polymère PO dans la formulation (exprimée en mg/g), y est la fraction molaire de monomères de PO portant un greffon hydrophobe. Des exemples de calcul du facteur de précipitation Fp sont reportés dans les exemples.
Dans une réalisation particulière de l'invention, les formulations selon l'invention sont caractérisées par un facteur de précipitation Fp supérieur à 200, de préférence supérieur à 400, et de préférence encore, supérieur à 800, et plus préférentiellement encore supérieur à 1500.
Un aspect surprenant des formulations selon l'invention est que le réseau de chaînes de polymères formé lors de la précipitation à pH physiologique permet de ralentir la libération du principe actif (PA) sans pour autant piéger ce même principe actif (PA) au cœur des particules. Ainsi les formulations selon l'invention permettent d'obtenir à la fois une libération prolongée du principe actif (PA) et une bonne biodisponibilité.
Concernant le principe actif (PA), il est de préférence choisi dans le groupe comprenant: les protéines, les glycoprotéines, les protéines liées à une ou plusieurs chaînes polyalkylèneglycol [de préférence polyéthylèneglycol (PEG) : "protéines-PEGylées"], les peptides, les polysaccharides, les liposaccharides, les oligonucléotides, les polynucléotides et leurs mélanges, et, plus préférentiellement encore, dans le sous-groupe des érythropoïétines, telles que l'époétine alpha, l'époétine bêta, la darbépoétine, le raffimère d'hémoglobine, leurs analogues ou leurs dérivés ; ocytocine, vasopressine, hormone adrénocorticotropique, facteur de croissance épidermique, facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF), les facteurs stimulants de l'hématopoïèse et leurs mélanges, les facteurs sanguins, tels que alteplase, tenecteplase, facteur VΙI(a), facteur VII ; hémoglobine, les cytochromes, les albumines, prolactine, lulibérine, hormone de libération de l'hormone lutéinisante (LHRH) et analogues, tels que leuprolide, goséréline, triptoréline, buseréline, nafaréline ; antagonistes de la LHRH, les agonistes de la LHRH, les hormones de croissance (GH) humaine, porcine ou bovine, le facteur de libération de l'hormone de croissance, l'insuline, la somatostatine, le glucagon, les interleukines ou leurs mélanges (IL-2, IL-I l, IL- 12), les interférons, tels que l'interféron alpha, alpha-2b, bêta, bêta- la, ou γ; la gastrine, la tétragastrine, la pentagastrine, l'urogastrone, la sécrétine, la calcitonine, les enképhalines, les endomorphines, les angiotensines, l'hormone de libération de la thyrotropine (TRH), le facteur de nécrose tumorale (TNF), le facteur de croissance des nerfs (NGF), les facteurs de croissance tels que beclapermine, trafermine, ancestime, le facteur de croissance des kératinocytes, le facteur de croissance hématopoïétique des granulocytes (G-CSF), le facteur de croissance hématopoïétique des granulocytes macrophages (GM-CSF), le facteur de croissance hématopoïétique des macrophages (M-CSF), l'héparinase, les protéines morphogéniques de l'os (BMP), le facteur natriurétique auriculaire humain (hANP), le peptide ressemblant au glucagon (GLP-I), le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), l'antigène recombinant de l'hépatite B (rHBsAg), la rénine, les cytokines, la bradykinine, les bacitracines, les polymyxines, les colistines, la tyrocidine, les gramicidines, l'étanercept, l'imiglucérase, la drotrécogine alpha, les cyclosporines et analogues synthétiques, les modifications et fragments actifs pharmaceutiquement d'enzymes, de cytokines, d'anticorps, d'antigènes et de vaccins, les anticorps tels que rituximab, infliximab, trastuzumab, adalimumab, omalizumab, tositumomab, efalizumab, et cetuximab.
D'autres principes actifs sont les polysaccharides (par exemple, l'héparine) et les oligo- ou polynucléotides, ADN, ARN, iARN, antibiotiques, et cellules vivantes. Une autre classe de principes actifs comprend les substances pharmaceutiques agissant sur le système nerveux central, par exemple, rispéridone, zuclopenthixol, fluphénazine, perphénazine, flupentixol, halopéridol, fluspirilène, quétiapine, clozapine, amisulprid, sulpiride, ziprasidone, etc.
Selon une variante, le principe actif est une petite molécule organique hydrophobe, hydrophile ou amphiphile du type de celles appartenant à la famille des anthracyclines, des taxoïdes ou des camptothécines ou du type de celles appartenant à la famille des peptides telles que la leuprolide ou la cyclosporine et leurs mélanges.
Selon une autre variante, le principe actif est avantageusement choisi parmi au moins l'une des familles de substances actives suivantes : les agents de traitement de l'abus d'alcool, les agents de traitement de la maladie d'Alzheimer, les anesthésiques, les agents de traitement de l'acromégalie, les analgésiques, les antiasthmatiques, les agents de traitement des allergies, les agents anticancéreux, les anti-inflammatoires, les anticoagulants et antithrombotiques, les anticonvulsivants, les antiépileptiques, les antidiabétiques, les antiémétiques, les antiglaucomes, les antihistaminiques, les anti- parasitaires, les antibiotiques, les antifongiques, les antiviraux, les antiparkinsoniens, les anti-cholinergiques, les antitussifs, les inhibiteurs de l'anhydrase carbonique, les agents cardiovasculaires, les hypolipémiants, les anti-arythmiques, les vasodilatateurs, les antiangineux, les anti-hypertenseurs, les vasoprotecteurs, les inhibiteurs de cholinestérase, les agents de traitement des désordres du système nerveux central, les stimulants du système nerveux central, les contraceptifs, les promoteurs de fécondité, les inducteurs et inhibiteurs du travail utérin, les agents de traitement de la mucoviscidose, les agonistes des récepteurs de la dopamine, les agents de traitement de l'endométriose, les agents de traitement des dysfonctionnements érectiles, les agents de traitement de la fertilité, les agents de traitement des troubles gastro-intestinaux, les immunomodulateurs et les immunosuppresseurs, les agents de traitement des troubles de la mémoire, les antimigraineux, les myorelaxants, les analogues de nucléosides, les agents de traitement de l'ostéoporose, les parasympathomimétiques, les prostaglandines, les agents psychothérapeutiques, les sédatifs, les hypnotiques et tranquillisants, les neuroleptiques, les anxiolytiques, les psychostimulants, les antidépresseurs, les agents de traitements dermatologiques, les stéroïdes et les hormones, les amphétamines, les anorexiques, les antidouleurs non analgésiques, les antiépileptiques, les barbituriques, les benzodiazépines, les hypnotiques, les laxatifs, les psychotropes et toutes les associations de ces produits.
La formulation selon l'invention peut être administrée par voie orale, parentérale, nasale, topique, vaginale, oculaire, sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intra- dermique, transdermique, intra-tumorale, intrapéritonéale, intrathécale, intracérébrale ou buccale.
Selon un autre de ses aspects, l'invention a pour objet un procédé de préparation de formulations à base de polymère PO pour la libération prolongée d'au moins un principe actif, ces formulations étant en particulier celles décrites ci-dessus, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
1) la préparation, à une valeur du pH comprise entre 3 et 6,5, d'une solution colloïdale aqueuse d'un polymère (PO) polyaminoacide tel que défini ci-dessus, les fractions molaires respectives en groupements cationiques (GC), en groupements hydrophobes (GH), éventuellement en groupements neutres (GN) et éventuellement en glutamate, étant telles que 1 ml de ladite formulation précipite lors d'un mélange avec un volume de 1 ml d'une solution tampon test Tp ; et
2) l'ajout d'au moins un principe actif (PA) au polymère (PO) obtenu à l'étape 1 , ledit principe actif s'associant de façon non covalente aux particules de la solution colloïdale dudit polymère (PO).
Une caractéristique essentielle du procédé selon l'invention est de former des particules chargées d'actif à pHf compris en 3 et 6,5, spontanément, par simple mélange d'une solution colloïdale de particules du polymère polyélectrolyte (PO) et du principe actif (PA).
Les principes actifs tels que des protéines, des peptides ou des petites molécules, peuvent s'associer spontanément au polymère (PO) de type polyaminoacide.
Dans une réalisation particulière de l'invention, le chargement des nanoparticules du polymère polyélectrolyte (PO) par le principe actif (PA) s'effectue par simple mélange d'une solution de principe actif (PA) avec une solution colloïdale du polymère polyélectrolyte (PO). Cette association est purement physique et n'implique pas de création de liaison covalente entre le principe actif (PA) et le polymère (PO). Sans être lié par la théorie, on peut supposer que cette association non spécifique s'effectue par interaction hydrophobe et/ou électrostatique entre le polymère (PO) et le principe actif (PA). Il est à noter qu'il n'est pas nécessaire, et souvent même non souhaitable, de lier le PA aux nanoparticules de PO par des récepteurs spécifiques de nature peptidique ou de type antigène/anticorps ou encore enzyme/substrat.
Dans un mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, il n'est pas prévu d'étape de réticulation chimique des particules obtenues. Les particules obtenues ne sont donc pas réticulées chimiquement et libèrent néanmoins le principe actif (PA) sur une durée prolongée. Cette absence de réticulation chimique est un avantage décisif. En effet, l'absence de réticulation chimique permet d'éviter la dégradation chimique du principe actif (PA) lors de l'étape de réticulation des particules contenant le principe actif (PA).
Une telle réticulation chimique est en effet généralement conduite par activation d'entités polymérisables et met en jeu des agents potentiellement dénaturants tels que les rayonnements UV, ou le glutaraldéhyde.
Avantageusement, le procédé selon l'invention comprend une étape de déshydratation, par exemple par lyophilisation, de la formulation liquide, afin d'obtenir une formulation sous forme de poudre sèche. La présente invention concerne également une formulation pharmaceutique solide pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), comprenant une forme poudre sèche obtenue à partir de la formulation liquide comprenant une suspension aqueuse décrite ci-dessus. Une poudre sèche peut être obtenue en amenant la formulation liquide selon l'invention à pH égal à 7 pour la faire précipiter in vitro, puis en la déshydratant, par exemple par lyophilisation.
Avantageusement, une telle formulation pharmaceutique solide est utilisée pour inhalation et administration pulmonaire.
Selon un autre de ses aspects, l'invention a pour objet un procédé de préparation de médicaments, en particulier pour administration parentérale, muqueuse, sous-cutanée, intramusculaire, intradermique, transdermique, intrapéritonéale, intracérébrale ou intra- tumorale, voire par voie orale, nasale, pulmonaire, vaginale ou oculaire, ledit procédé consistant essentiellement à mettre en œuvre au moins l'une des formulations décrites ci- dessus.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : Libération in vitro d'IFN-α à partir des formulations de l'exemple 2.1 (triangles noirs), de l'exemple 2.3 (losanges noirs), de l'exemple 3 (carrés noirs), et de l'exemple 5 (trait plein).
EXEMPLES
1) Synthèses :
a) Comparatif : Synthèse d'un polymère polyélectrolyte PO porteur de groupements hvdrophobes, anionique (polyglutamate greffé par l'alpha-tocophérol d'origine synthétique)
On solubilise 15 g d'un acide alpha-L-polyglutamique de masse équivalente à environ 16900 Da par rapport à un standard en polyoxyéthylène dans 288 ml de diméthylformamide (DMF) en chauffant à 80 0C jusqu'à solubilisation du polymère. On refroidit la solution à 15 0C et on ajoute successivement 2,5 g de D,L-alpha-tocophérol (> 98 %, Fluka®) préalablement solubilisé dans 8 ml de DMF, 280 mg de 4- diméthylaminopyridine préalablement solubilisée dans 1 ml de DMF et 1,6 g de diisopropylcarbodiimide préalablement solubilisé dans 6 ml de DMF. Après 3 h sous agitation, le milieu réactionnel est versé dans 1200 ml d'eau contenant 15 % de chlorure de sodium et d'acide chlorhydrique (pH T). Le polymère précipité est ensuite récupéré par filtration, lavé par de l'acide chlorhydrique 0,1 N, de l'eau et par de l'éther diisopropylique. Le polymère est ensuite séché à l'étuve sous vide à 40 0C. On obtient un rendement de l'ordre de 90 %. La masse molaire mesurée par chromatographie d'exclusion stérique est de 15500 par rapport à un standard polyoxyéthylène. Le taux de tocophérol greffé, estimé par spectroscopie RMN du proton, est de 5,1 % molaire.
b) Synthèse d'un polymère polyélectrolyte PO-Al cationique (polyglutamate greffé par l'alpha-tocophérol d'origine synthétique et par de l'histidinamide)
Figure imgf000029_0001
Indices et groupements : m = 11 , p = 209, q = 0, T = D,L-alpha-tocophérol (T)
3 g d'un poly(acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'alpha-tocophérol racémique sont solubilisés par chauffage à 80 0C dans 38 ml de NMP. À cette solution refroidie à 0 0C sont ajoutés 2,74 g d'isobutyl chloroformiate puis 2,2 mL de iV-méthyl-morpholine. Le milieu réactionnel est agité 10 min en maintenant la température à 0 0C. En parallèle, 8,65 g de di chlorhydrate d'histidinamide sont suspendus dans 108 mL de NMP. 10,6 ml de triéthylamine sont ensuite ajoutés et la suspension obtenue est agitée à 20 0C pendant quelques minutes puis refroidie à 0 0C. On procède ensuite à l'ajout de la solution de polymère activé sur la suspension d'histidinamide. Le milieu réactionnel est agité pendant 2 h à 0 0C, puis 1 nuit à 20 0C. On ajoute ensuite 0,62 mL d'HCl 35 %, puis 83 mL d'eau. On verse ensuite la solution obtenue dans 500 mL d'eau à pH 3 - 4. La solution est ensuite diafiltrée contre 8 volumes d'eau salée (0,9 % NaCl) et 4 volumes d'eau. La solution de polymère est ensuite concentrée jusqu'à un volume de 300 mL (la concentration en polymère est de 18 rng/g). Le pourcentage d'histidinamide greffée, déterminé par RMN 1H dans D2O, est de 95 %. c) Synthèse d'un polymère polyélectrolyte PO-A2 cationique (polyglutamate greffé par l'alpha-tocophérol d'origine synthétique et par de l'histidinamide)
Figure imgf000030_0001
Indices et groupements : m = 44, p = 154, q = 22, T = D,L-alpha-tocophérol (T)
10 g d'un poly( acide glutamique) de DP 220 greffé à 20 % de façon statistique avec de l'alpha-tocophérol racémique sont solubilisés par chauffage à 80 0C dans 125 ml de NMP. À cette solution refroidie à 0 0C sont ajoutés 5,5 g d'isobutyl chloroformiate puis 4,4 mL de iV-méthyl-morpholine. Le milieu réactionnel est agité 10 min en maintenant la température à 0 0C. En parallèle, 12,9 g de di chlorhydrate d'histidinamide sont suspendus dans 161 mL de NMP. 15,8 ml de triéthylamine sont ensuite ajoutés et la suspension obtenue est agitée à 20 0C pendant quelques minutes puis refroidie à 0 0C. On procède ensuite à l'ajout de la solution de polymère activé sur la suspension d'histidinamide. Le milieu réactionnel est agité pendant 2 h à 00C, puis 1 nuit à 20 0C. On ajoute ensuite 1,46 mL d'HCl 35 %, puis 200 mL d'eau. On ajoute encore 20O mL d'eau, puis 65O mL d'éthanol, et verse ensuite dans 650 mL d'eau à pH 3 - 4. La solution est ensuite diafïltrée contre 8 volumes d'eau salée (0,9 % NaCl) et 4 volumes d'eau. La solution de polymère est enfin concentrée jusqu'à un volume de 250 mL (la concentration en polymère est de 50 mg/g). Le pourcentage d'histidinamide greffée, déterminé par RMN 1H dans D2O, est de 70 %.
d) Synthèse d'un polymère polyélectrolyte PO-B cationique (polyglutamate greffé par l'alpha-tocophérol d'origine synthétique, par l'éthanolamine, et par de l'argininamide)
Figure imgf000031_0001
Indices et groupements : T = D,L-α-tocophérol, p = 11, q = 88, r = 48, s = 73
Dix grammes d'un poly( acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'α-tocophérol racémique sont solubilisés dans 125 mL de NMP à 80 0C. Cette solution est refroidie à 0 0C, et 5,6 mL de chloroformiate d'ώo-butyle puis 4,8 mL de 7V-méthyl- morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est agité 15 min à 0 0C. En parallèle, 7,4 g de dichlorhydrate d'argininamide sont suspendus dans 93 mL de NMP, puis 4,7 mL de triéthylamine et 1,2 mL d'éthanolamine sont ajoutés. La suspension obtenue est agitée quelques minutes à 20 0C puis refroidie à 0 0C. La suspension laiteuse de polymère activé est alors additionnée à cette suspension, et le mélange réactionnel est agité pendant 2 h à 0 0C, puis une nuit à 20 0C. Après ajout de 2,07 mL d'une solution d'HCl 35 % puis 200 mL d'eau, le mélange réactionnel est versé goutte à goutte dans 670 mL d'eau acidifiée à pH = 3 avec HCl, en maintenant le pH vers 3 avec une solution d'HCl 1 N. La solution obtenue est diafiltrée contre 8 volumes d'eau salée (0,9 %) puis 4 volumes d'eau, et concentrée jusqu'à un volume d'environ 250 mL. Les pourcentages d'argininamide et d'éthanolamine greffés, déterminés par RMN du proton dans D2O, sont respectivement de 40 et 22 %.
2) Exemple 1 (comparatif): formulation à base de polymère PO ne portant pas de dérivé canonique (synthèse a) On utilise le polymère PO obtenu selon la synthèse a) ci-dessus. Une solution colloïdale de polymère PO à 24 mg/g est obtenue en diluant 12,64 g de solution de PO avec 2,19 g d'eau. L'osmolarité de la solution colloïdale de PO ainsi que son pH sont ensuite ajustés à 290 mOsm et pH 6,95 en introduisant respectivement les quantités nécessaires d'une solution aqueuse de NaCl et d'une solution de NaOH.
Le tableau ci-dessous regroupe les caractéristiques de la formulation obtenue: La taille des particules est mesurée selon le test T'.
Figure imgf000032_0001
La formulation à base de polymère PO décrite ci-dessus ne précipite pas lors de l'ajout de 1 ml de cette dernière sur 1 ml de solution tampon Tp.
3) Exemple 2: formulation à base de polymère PO-Al
3.1) Exemple 2.1: concentration en PO-Al égale à 10 mg/g, contenant de l'IFN-alpha
a) Préparation d'une solution colloïdale de PO-Al
On utilise le polymère PO-Al obtenu selon la synthèse b) ci-dessus. On dilue le PO-Al dans l'eau, et on ajuste le pH (solution appropriée de NaOH) et l'osmolarité (solution appropriée de NaCl).
Figure imgf000032_0002
La solution colloïdale à base de polymère PO-Al obtenue précipite lors de l'ajout de 1 ml de cette dernière sur 1 ml de solution tampon Tp, et est caractérisée par un facteur de précipitation Fp égal à 860. Le polymère PO-Al est caractérisé par un pH* égal à 6,5.
b) Association de la protéine au polymère PO-Al
On ajoute 2,18 g de la protéine IFN-α à 2,4 mg/g à 8 g de solution colloïdale de PO-Al, et on ajuste la concentration finale par dilution avec une solution de NaCl appropriée (0,18g).
c) Association une nuit à 25°C.
Le tableau ci-dessous regroupe les caractéristiques de la formulation finale : La taille des particules est mesurée selon le test T'.
Figure imgf000033_0001
3.2) Exemple 2.2: concentration en PO-Al égale à 45 mg/g
On utilise le polymère PO-Al obtenu selon la synthèse b) ci-dessus. On dilue le PO-Al dans l'eau, et on ajuste le pH (solution appropriée de NaOH) et l'osmolarité (solution appropriée de NaCl).
Figure imgf000033_0002
La solution colloïdale à base de polymère PO-Al obtenue ne précipite pas lors de l'ajout de 1 ml de cette dernière sur 1 ml de solution tampon Tp, et est caractérisée par un facteur de précipitation Fp égal à 166.
3.3) Exemple 2.3: concentration en PO-Al égale à 10 mg/g , contenant de l'IFN-alpha et des cations Zn++
a) Préparation d'une solution colloïdale de PO-Al contenant 0,5 éq. Zn++ On utilise le polymère PO-Al obtenu selon la synthèse b) ci-dessus. On dilue le PO-Al dans l'eau, et on ajuste le pH (solution appropriée de NaOH) et l'osmolarité (solution appropriée de NaCl).
Figure imgf000033_0003
b) Association de la protéine au polymère PO-Al
À 2,17 g de protéine IFN-α à 2,4 mg/g on ajoute 7,96 g de solution colloïdale de PO-Al préparée à l'étape a), et on ajuste la concentration finale par dilution avec une solution de NaCl appropriée (0,18 g).
c) Association une nuit à 25 0C
d) Ajout des cations Zn+ + La quantité nécessaire de solution de ZnCl2 concentrée à 204 mg/g est ajoutée à la formulation précédente pour atteindre 0,5 équivalents molaires de cations Zn++ par dérivé cationique présent en solution.
Le tableau ci-dessous regroupe les caractéristiques de la formulation finale : La taille des particules est mesurée selon le test T'.
Figure imgf000034_0001
La solution colloïdale à base de polymère PO-Al obtenue précipite lors de l'ajout de 1 ml de cette dernière sur 1 ml de solution tampon Tp, et est caractérisée par un facteur de précipitation Fp égal à 860. Le polymère PO-Al contenant 0,5 équivalent molaire de cations Zn++ par dérivé cationique est caractérisé par un pH* égal à 4,8.
4) Exemple 3: formulation à base de polymère PO-A2 à 30 mg/g contenant de VIFN- alpha
a) Préparation d'une solution colloïdale de PO-A2
On utilise le polymère PO-A2 obtenu selon la synthèse c) ci-dessus. On dilue le PO-A2 dans l'eau, et on ajuste le pH (solution appropriée de NaOH) et l'osmolarité (solution appropriée de NaCl).
Figure imgf000034_0002
La solution colloïdale à base de polymère PO- A2 obtenue précipite lors de l'ajout de 1 ml de cette dernière sur 1 ml de solution tampon Tp, et est caractérisée par un facteur de précipitation Fp égal à 840. Le polymère PO- A2 est caractérisé par un pH* égal à 6,5.
b) Association de la protéine au polymère PO-A2
À 2,18 g de protéine IFN-α à 2,4 mg/g on ajoute 8 g de solution colloïdale de PO- A2, et on ajuste la concentration finale par dilution avec une solution de NaCl appropriée (0,18 g).
c) Association une nuit à 25 0C.
Le tableau ci-dessous regroupe les caractéristiques de la formulation finale La taille des particules est mesurée selon le test T'.
Figure imgf000035_0001
S) Exemple 4: formulation à base de polymère PO-B contenant ou non de l'IFN-a
5.1) Exemple 4.1: formulation à base de polymère PO-B à 10 mg/g contenant de l'IFN-a a) Préparation d'une solution colloïdale de PO-B
On utilise le polymère PO-B obtenu selon la synthèse d) ci-dessus. On dilue PO-B dans l'eau, et on ajuste le pH (solution appropriée de NaOH) et lOsmolarité (solution appropriée de NaCl).
Figure imgf000035_0002
La solution colloïdale à base de polymère PO-B obtenue précipite lors de l'ajout de 1 ml de cette dernière sur 1 ml de solution tampon Tp, et est caractérisée par un facteur de précipitation Fp égal à 1150. Le polymère PO-B est caractérisé par un pH* égal à 5.
b) Association de la protéine au polymère PO-B
À 1,8 g de protéine IFN-α à 2,7 mg/g on ajoute 8,6 g de solution colloïdale de PO-B, et on ajuste la concentration finale par dilution avec une solution de NaCl appropriée.
c) Association une nuit à 25 0C La taille des particules est mesurée selon le test T'. Le tableau ci-dessous regroupe les caractéristiques de la formulation finale :
Figure imgf000035_0003
La formulation ainsi constituée est caractérisée dans le test Q par un facteur de rétention Qr supérieur à 5 (dosage ELISA du % d'IFN-α libre pour Qr = 5 : 8 %).
5.2) Exemple 4.2 : concentration en PO-B égale à 45 mg/g
On utilise le polymère PO-B obtenu selon la synthèse d) ci-dessus. On dilue PO-B dans l'eau, et on ajuste le pH (solution appropriée de NaOH) et l'osmolarité (solution appropriée de NaCl).
Figure imgf000036_0001
La solution colloïdale à base de polymère PO-B obtenue précipite lors de l'ajout de 1 ml de cette dernière sur 1 ml de solution tampon Tp, et elle est caractérisée par un facteur de précipitation Fp égal à 256. Le polymère PO-B est caractérisé par un pH* égal à 5.
6) Exemple 5 (comparatif) : préparation de particules à base de PO contenant de l'IFN-a
On utilise le polymère PO obtenu selon la synthèse a) ci-dessus. Une solution colloïdale de polymère PO est obtenue en le solubilisant dans l'eau en ajustant le pH à 7,52 par ajout d'une solution de NaOH. L'osmolarité de la solution est ajustée à 108 mOsm en introduisant la quantité nécessaire d'une solution aqueuse de NaCl. La concentration en polymère PO est ajustée à 29,05 mg/g. On ajoute à la solution colloïdale de polymère PO précédente de la protéine IFN-α concentrée à 2,4 mg/g. L'association est réalisée pendant une nuit à 25 0C.
La taille des particules est mesurée selon le test T'. Le tableau ci-dessous regroupe les caractéristiques des particules obtenues :
Figure imgf000036_0002
7) Résultats Ln vitro pour les exemples 2, 3 et 5
Pour cela, on mesure la libération du principe actif à partir des formulations selon l'invention en utilisant le test L.
La figure 1 montre la libération du principe actif dans le test L sous la forme du pourcentage de protéine libérée au cours du temps.
La formulation de l'exemple comparatif 5, contenant 23 mg/g de particules de PO présente un profil de libération caractérisé par 93 % de protéine libérée en 10 h.
Les formulations des exemples 2.1 et 3 présentent des profils de libération retardés avec des libérations respectivement de 67 et 65% de la protéine injectée en 48 h. Dans le cas des particules de l'exemple 2.3, on observe la création d'un flux de libération qui n'est pas nul en fin d'expérience, avec une libération de 59 % de la protéine injectée en 48 h.
8) Résultats in vivo pour les exemples 2, 3 et 5
44 rats ont été séparés en 5 groupes de 8 ou 12 animaux et ont reçu en parallèle :
- une formulation à libération immédiate IR, ou
-la formulation à libération prolongée de l'exemple comparatif 5, ou
- une des formulations des exemples de l'invention 2 et 3, à la dose de 300 μg/kg.
Les résultats pharmacocinétiques sont regroupés dans le tableau ci-dessous :
Figure imgf000037_0001
Cmax représente la concentration plasmatique maximale moyenne en protéine sur l'ensemble des animaux.
Tmax médian représente la médiane du temps pour lequel la concentration plasmatique passe par son maximum.
AUC représente l'aire moyenne sous la courbe de la concentration plasmatique en fonction du temps.
T50%AUC représente le temps moyen au bout duquel l'aire sous la courbe atteint 50% de sa valeur totale.
RBA représente le rapport de l'aire sous la courbe de la formulation considérée à l'aire sous la courbe de la formulation IFN IR.
Par rapport à la formulation IR, toutes les autres formulations ont montré un profil de libération prolongée, accompagné d'une baisse du Cmaχ-
En comparaison avec l'exemple comparatif 5, la pente terminale de toutes les formulations selon la présente invention était plus faible, ce qui indique une absorption résiduelle prolongée. On a noté pour les formulations des exemples 2.1 et 3 (PO-Al à 10 mg/g, et PO- A2 à 30 mg/g) des libérations prolongées sur plus de 5 jours (comparé à environ 3 jours pour la formulation de l'exemple comparatif 5). Ces formulations des exemples 2.1 et 3 présentaient des RBA de 57 % et environ 100 % respectivement.

Claims

REVENDICATIONS
1. Formulation pharmaceutique liquide injectable pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), comprenant au moins un principe actif (PA) et une suspension aqueuse à base de particules colloïdales d'un polymère (PO) ou de ses sels pharmaceutiquement acceptables, caractérisée en ce qu'elle satisfait aux quatre conditions suivantes :
(a) le polymère (PO) est un polyaminoacide comprenant des résidus glutamiques,
- certains résidus glutamiques étant porteurs d'un groupement cationique (GC) pendant, les groupements cationiques étant identiques ou différents entre eux,
- d'autres résidus glutamiques étant porteurs d'un groupement hydrophobe (GH) pendant, lesdits groupements hydrophobes (GH) étant identiques ou différents entre eux,
- éventuellement d'autres résidus glutamiques étant porteurs d'un groupement neutre (GN) pendant, les groupements neutres (GN) étant identiques ou différents entre eux,
- éventuellement d'autres résidus glutamiques étant non modifiés ;
(b) la valeur pHf du pH de ladite formulation est comprise entre 3,0 et 6,5 ;
(c) pour la valeur pHf du pH, le polymère (PO) forme une solution colloïdale qui associe spontanément et de façon non covalente le principe actif (PA) ;
(d) 1 ml de ladite formulation précipite lors d'un mélange avec un volume de 1 ml d'une solution tampon test Tp définie dans la description.
2. Formulation selon la revendication 1, caractérisée en ce que son facteur de précipitation Fp est supérieur à 200, de préférence supérieur à 400, et de préférence supérieur à 800, et plus préférentiellement encore, supérieur à 1500.
3. Formulation selon la revendication 2, caractérisée en ce que son facteur de rétention Qr est supérieur à 5, de préférence supérieur à 10, et de préférence supérieur à 15, et plus préférentiellement encore, supérieur à 20.
4. Formulation selon la revendication 1, 2 ou 3, caractérisée en ce que le polymère (PO) présente une structure pGlu(x)GH(y)GC(z)GN(i-x-y-z) avec un degré de polymérisation totale (DP) compris entre 50 et 300, et de préférence compris entre 100 et 250, structure dans laquelle (x) est compris entre 0 et 0,45, (y) est compris entre 0,02 et 0,3, (z) est compris entre 0,4 et 0,98 et (1-x-y-z) est compris entre 0 et 0,5.
5. Formulation selon la revendication 1, caractérisée en ce que les groupements cationiques (GC) sont choisis parmi les bases faibles dont le pH de demi-neutralisation est inférieur à 7,0.
6. Formulation selon la revendication 1, caractérisée en ce que les groupements cationiques (GC) sont choisis parmi ceux qui comprennent au moins un ammonium quaternaire ou au moins une base forte dont le pH de demi-neutralisation est supérieur à 8,0.
7. Formulation selon la revendication 6, caractérisée en ce que les groupements cationiques (GC) sont choisis dans le groupe de radicaux ayant les formules suivantes :
- -NH-(CH2)W-NH3 +, Z" avec w compris entre 2 et 6, et de préférence w est égal à 4,
- -NH-(CH2)4-NH-C(=NH)-NH3 +, Z", - -O-(CH2)2-NH3 +, Z ,
- -O-(CH2)2-N+(CH3)3, Z", un résidu d'acide aminé ou un dérivé d'acide aminé de formule :
Figure imgf000040_0001
dans laquelle :
R1 est alcoxy, de préférence -OMe ou -OEt, ou -R1 est -NH2 , alkylamino-, de préférence -NH-CH3 ou -N(CH3 )2 ; - R13 est -(CH2)4-NH3 +, Z' , (CH2)3-NH-C(=NH)-NH3 +, Z' , -(CH2)3-NH3 +, Z ; où Z' est un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate, de préférence un chlorure.
8. Formulation selon les revendications 3, 6 et 7, caractérisée en ce que :
- x est compris entre 10 et 55 %,
- y est compris entre 2 et 30 %, - z est supérieur ou égal à 10 % et est compris entre (x-10) % et (x+15) %, le nombre de groupements neutres correspondant au pourcentage complémentaire pour atteindre 100%, et pouvant éventuellement être égal à 0.
9. Formulation selon les revendications 3, 6 et 7, caractérisée en ce que : - x est compris entre 20 et 55 %,
- y est compris entre 2 et 7,5 %,
- z est supérieur ou égal à 20 % et est compris entre (x-10) % et (x+15) %, le nombre de groupements neutres correspondant au pourcentage complémentaire pour atteindre 100 %, et pouvant éventuellement être égal à 0.
10. Formulation selon la revendication 1 ou 4, caractérisée en ce que les groupements hydrophobes (GH) sont sélectionnés dans le groupe suivant:
• les alkyles linéaires ou ramifiés en Cg à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome,
• les alkylaryles ou arylalkyles en Cg à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome,
• et les (poly)cycliques en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome.
11. Formulation selon la revendication 1, caractérisée en ce que les groupements neutres (GN) sont choisis dans le groupe suivant : un radical hydroxyéthylamino-, hydroxyalkyloxy- ou polyoxyalkylène.
12. Formulation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le polymère (PO) est porteur d'au moins un greffon de type polyalkylène (de préférence éthylène) glycol lié à un résidu glutamate.
13. Formulation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le polyaminoacide (PO) répond à la formule (I) suivante :
Figure imgf000041_0001
I dans laquelle :
• A représente indépendamment :
RNH- dans lequel R est H, alkyle linéaire en C2 à Ci0, alkyle ramifié en C3 à Cio ou benzyle, un résidu d'acide aminé ou un dérivé d'acide aminé terminal de formule :
-NH — C COR7
dans laquelle R7 est OH, OR9 ou NHR10, et R8, R9 et R10 représentent indépendamment un H, un alkyle linéaire en C2 à Cio, un alkyle ramifié en C3 à C io ou un benzyle ;
• B est une liaison directe ou un groupement de liaison divalent, trivalent ou tétravalent, de préférence choisi parmi les radicaux suivants : -O-, -NH-, -N(Cj.5 alkyle)-, un résidu d'acide aminé (de préférence naturel), de diol, de triol, de diamine, de triamine, d'aminoalcool ou d'hydroxyacide comportant de 1 à 6 atomes de carbone ;
• D représente un H, un acyle linéaire en C2 à Cio, un acyle ramifié en C3 à Cio, ou un pyroglutamate ;
" les groupements hydrophobes GH représentent chacun indépendamment les uns des autres un radical choisi parmi :
• les alkyles linéaires ou ramifiés en C8 à C3o pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S), ou
• les alkylaryles ou arylalkyle en C8 à C3o pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S), ou
• les (poly)cycliques en C8 à C3o pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence
O et/ou N et/ou S) ; et de préférence au moins l'un des groupements hydrophobes (GH) étant obtenu par greffage, à partir d'un précurseur choisi dans le groupe suivant : octanol, dodécanol, tétradécanol, hexadécanol, octadécanol, oléylalcool, tocophérol ou cholestérol, et B représentant alors une liaison directe ;
" R70 représente un radical choisi dans le groupe suivant : -NH-(CH2)W-NH3 + avec w compris entre 2 et 6, et de préférence w est égal à 4,
-NH-(CH2)4-NH-C(=NH)NH3 +, -O-(CH2)2-NH3 +, -O-(CH2)2-N+(CH3)3, un radical de formule :
Figure imgf000043_0001
où -R11 est -H, -CO2H, ester d'alkyle (de préférence -COOMe et -COOEt), -CH2OH, -C(=O)-NH2, -C(=O)-NH-CH3 ou -C(=O)-N(CH3)2 ; un résidu d'acide aminé ou un dérivé d'acide aminé de formule :
Figure imgf000043_0002
dans laquelle :
X est -O- ou -NH-,
R est H, alkyle linéaire en C2 à Cio, alkyle ramifié en C3 à C10 ou benzyle,
-R13 est -(CH2)4NH3 +, -(CH2)3-NH-C(=NH)-NH3 +, -(CH2)3NH3 + ; le contre-anion de R70 est un anion convenable, de préférence chlorure ; R représente un hydroxyéthylamino-, un hydroxyalkyloxy- ou un polyoxyalkylène ; p, q, r et s sont des entiers positifs ;
(p)/(p+q+r+s) est défini comme le taux de greffage molaire des groupements hydrophobes GH varie de 2 à 30 % molaire, sous condition que chaque chaîne de copolymère possède en moyenne au moins 3 greffons hydrophobes ;
(q)/(p+q+r+s) est défini comme le taux de greffage molaire des groupements cationiques et varie de 10 à 98 % molaire ; (p+q+r+s) varie de 50 à 300, de préférence entre 100 et 250 ; (r)/(p+q+r+s) varie de O à 78 % molaire ; (s)/(p+q+r+s) varie de O à 55 % molaire.
14. Formulation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la concentration en polymère (PO), ou en ses sels pharmaceutiquement acceptables, dans la formulation est comprise entre 4 et 50 mg/ml.
15. Formulation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le rapport R de la concentration en principe actif (PA) à la concentration en polymère (PO), ou en ses sels pharmaceutiquement acceptables, est compris entre 0,0001 et 1,5.
16. Formulation selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient des cations divalents Zn++ dans une proportion comprise entre 0,05 et 2 équivalents molaires par rapport à la concentration molaire en groupements cationiques (GC).
17. Formulation selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle ne contient pas de cation divalent ajouté.
18. Formulation selon la revendication 1, caractérisée en ce le principe actif (PA) est choisi dans le groupe suivant : les protéines, les glycoprotéines, les protéines liées à une ou plusieurs chaînes polyalkylèneglycol [de préférence polyéthylèneglycol (PEG): "protéines- PEGylées"], les peptides, les polysaccharides, les liposaccharides, les oligonucléotides, les polynucléotides et leurs mélanges, et, plus préférentiellement encore, dans le sous-groupe des érythropoïétines, telles que l'époétine alpha, l'époétine bêta, la darbépoétine, le raffimère d'hémoglobine, leurs analogues ou leurs dérivés ; ocytocine, vasopressine, hormone adrénocorticotropique, facteur de croissance épidermique, facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF), les facteurs stimulants de Phématopoïèse et leurs mélanges, les facteurs sanguins, tels que alteplase, tenecteplase, facteur VΙI(a), facteur VII ; hémoglobine, les cytochromes, les albumines, prolactine, lulibérine, hormone de libération de l'hormone lutéinisante (LHRH) et analogues, tels que leuprolide, goséréline, triptoréline, buseréline, nafaréline ; antagonistes de la LHRH, les agonistes de la LHRH, les hormones de croissance (GH) humaine, porcine ou bovine, le facteur de libération de l'hormone de croissance, l'insuline, la somatostatine, le glucagon, les interleukines ou leurs mélanges (IL-2, IL-I l, IL- 12), les interférons, tels que l'interféron alpha, alpha-2b, bêta, bêta- la, ou D D la gastrine, la tétragastrine, la pentagastrine, l'urogastrone, la sécrétine, la calcitonine, les enképhalines, les endomorphines, les angiotensines, l'hormone de libération de la thyrotropine (TRH), le facteur de nécrose tumorale (TNF), le facteur de croissance des nerfs (NGF), les facteurs de croissance tels que beclapermine, trafermine, ancestime, le facteur de croissance des kératinocytes, le facteur de croissance hématopoïétique des granulocytes (G-CSF), le facteur de croissance hématopoïétique des granulocytes macrophages (GM-CSF), le facteur de croissance hématopoïétique des macrophages (M-CSF), l'héparinase, les protéines morphogéniques de l'os (BMP), le facteur natriurétique auriculaire humain (hANP), le peptide ressemblant au glucagon (GLP-I), le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), l'antigène recombinant de l'hépatite B (rHBsAg), la rénine, les cytokines, la bradykinine, les bacitracines, les polymyxines, les colistines, la tyrocidine, les gramicidines, l'étanercept, l'imiglucérase, la drotrécogine alpha, les cyclosporines et analogies synthétiques, les modifications et fragments actifs pharmaceutiquement d'enzymes, de cytokines, d'anticorps, d'antigènes et de vaccins, les anticorps tels que rituximab, infliximab, trastuzumab, adalimumab, omalizumab, tositumomab, efalizumab, et cetuximab.
19. Formulation pharmaceutique solide pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), caractérisée en ce qu'elle comprend une forme poudre sèche obtenue à partir de la formulation liquide selon l'une quelconque des revendications 1 à 18.
20. Procédé de préparation d'une formulation pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), cette formulation étant en particulier selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, comprenant les étapes suivantes :
1) la préparation, d'une solution colloïdale aqueuse de pH compris entre 3,0 et 6,5, d'un polymère polyaminoacide (PO), ledit polymère polyaminoacide (PO) comprenant des résidus glutamiques :
- certains résidus glutamiques étant porteurs d'un groupement cationique (GC) pendant, lesdits groupements cationiques étant identiques ou différents entre eux,
- d'autres résidus glutamiques étant porteurs d'un groupement hydrophobe (GH) pendant, lesdits groupements hydrophobes (GH) étant identiques ou différents entre eux,
- éventuellement d'autres résidus glutamiques étant porteurs d'un groupement neutre (GN) pendant, les groupements neutres (GN) étant identiques ou différents entre eux, - éventuellement d'autres résidus glutamiques étant non modifiées ; les fractions molaires respectives en groupements cationiques (GC), en groupements hydrophobes (GH), éventuellement en groupements neutres (GN) et éventuellement en glutamate, étant telles que 1 ml de ladite formulation précipite lors d'un mélange avec un volume de 1 ml d'une solution tampon test Tp ; et 2) l'ajout d'au moins un principe actif (PA) au polymère (PO) obtenu à l'étape 1, ledit principe actif s'associant de façon non covalente aux particules de la solution colloïdale dudit polymère.
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