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WO2008135561A1 - Particules a base de polyelectrolytes et de principe actif a liberation modifiee et formulations pharmaceutiques contenant ces particules - Google Patents

Particules a base de polyelectrolytes et de principe actif a liberation modifiee et formulations pharmaceutiques contenant ces particules Download PDF

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WO2008135561A1
WO2008135561A1 PCT/EP2008/055505 EP2008055505W WO2008135561A1 WO 2008135561 A1 WO2008135561 A1 WO 2008135561A1 EP 2008055505 W EP2008055505 W EP 2008055505W WO 2008135561 A1 WO2008135561 A1 WO 2008135561A1
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WO
WIPO (PCT)
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particles
polymer
polyelectrolyte polymer
polyelectrolyte
colloidal solution
Prior art date
Application number
PCT/EP2008/055505
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English (en)
Inventor
Cécile BONNET GONNET
Frédéric CHECOT
You-Ping Chan
Olivier Breyne
Original Assignee
Flamel Technologies
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to AU2008248602A priority patent/AU2008248602B2/en
Priority to MX2009011815A priority patent/MX2009011815A/es
Priority to EP08750062A priority patent/EP2155173A1/fr
Priority to CN200880014547XA priority patent/CN101674814B/zh
Priority to JP2010504755A priority patent/JP2010526040A/ja
Priority to CA002685855A priority patent/CA2685855A1/fr
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Priority to IL201689A priority patent/IL201689A/en

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Definitions

  • the present invention relates to novel transporters of active (s) -PA-, in particular protein (s) and peptide (s), as well as new modified-release pharmaceutical formulations containing said PA transporters.
  • the application also relates to the applications, particularly therapeutic applications, of these pharmaceutical formulations.
  • These active pharmaceutical formulations concern both human and veterinary therapeutics.
  • PA used throughout this specification is for at least one active ingredient.
  • sustained-release forms of therapeutic protein consisting of suspensions, liquid and low viscosity nanoparticles loaded with therapeutic proteins. These suspensions allowed the easy administration of native therapeutic proteins.
  • Another object of the invention is to propose new particles loaded with PA and stable in freeze-dried form.
  • Another object of the invention is to provide new particles capable of being preserved in freeze-dried form.
  • Another objective of the invention is to propose new easily redispersible particles after lyophilization.
  • Another object of the invention is to propose new particles releasing a protein that has preserved its biological activity. Another object of the invention is to propose a new process for the preparation of these microparticles.
  • Another object of the invention is to provide a solid pharmaceutical formulation for the sustained release of PA, in particular a dry powder form for inhalation and pulmonary administration.
  • the inventors have had the merit of discovering, after long and painstaking researches, that, quite surprisingly and unexpectedly, the mixing under specific conditions of two polymers (for example copolyamino acids) polyelectrolytes of opposite polarity, at least one carrying hydrophobic groups, associated with at least one PA, leads to particles of size between 1 and 100 microns capable of releasing in vitro or in vivo a protein or a peptide over an extended period.
  • the invention relates firstly to particles for the sustained release of at least one active ingredient (AP), characterized in that they comprise: a) a first polyelectrolyte polymer (PEI) , preferably a linear alpha-polyamino acid, in a charged state, carrying hydrophobic groups (GH) on the side, said first polyelectrolyte polymer (PE1) spontaneously forming in water a colloidal solution of particles at at least a pHm value of pH inclusive between 3 and 8; b) a second polyelectrolyte polymer (PE2), preferably a linear alpha-polyamino acid, of opposite polarity to that of the first polyelectrolyte polymer (PE1), said second polyelectrolyte polymer (PE2) forming a solution or a colloidal solution in water; minus said pHm value of the pH; at the condition that, if the first electrolyte polymer (PE1) is a polyamino acid, then the second
  • the invention also relates to a method for preparing particles for the sustained release of at least one active principle (AP), these particles being in particular those described above, comprising the following steps:
  • the invention also relates to particles for the sustained release of at least one active principle (AP), characterized in that they comprise: a) a first polyelectrolyte polymer (PE1), preferably a linear alpha-polyamino acid, in a charged state, bearing hydrophobic groups (GH) on the side, said first polyelectrolyte polymer (PE1) forming spontaneously in water a colloidal solution of particles; at least a pHm value of the pH of between 3 and 8; b) a second polyelectrolyte polymer (PE2), preferably a linear alpha-polyamino acid, of opposite polarity to that of the first polyelectrolyte polymer (PE1), carrying hydrophobic groups (GH) on the side, said second polyelectrolyte polymer (PE2) forming in the water a solution or a colloidal solution at at least said pHm value of the pH; c) at least one active ingredient (PA) non-covalently associated with the particles of the coll
  • the invention also relates to a method for preparing particles for the sustained release of at least one active principle (AP), these particles being in particular those described above, comprising the following steps: 1) the preparation, at a value pHm of the pH between 3 and 8, of an aqueous colloidal solution of a first polyelectrolyte polymer (PE1) in the charged state, carrying hydrophobic groups (GH) on the side, said first polyelectrolyte polymer (PEl) being capable of forming spontaneously in water a colloidal solution of particles with at least one pH value, pH of between 3 and 8;
  • the invention also relates to a pharmaceutical formulation for the sustained release of at least one active ingredient (AP), said formulation comprising particles as described above.
  • AP active ingredient
  • the invention also relates to a process for the preparation of medicaments, in particular for parenteral, mucosal, subcutaneous, intramuscular, intradermal, intraperitoneal, intracerebral or tumoral, or even oral, nasal, pulmonary, vaginal, transdermal or ocular administration. , essentially consisting in implementing at least one formulation as described above.
  • a solution is understood to mean a homogeneous solvent and polymer mixture in the form of an individual chain.
  • colloidal solution is understood to mean a suspension of particles whose average diameter measured by the T 'test is less than or equal to 0.5 ⁇ m.
  • pHm means the pH at which the mixing of the first polyelectrolyte polymer (PEI) with which the active ingredient (PA) is associated with the second polyelectrolyte polymer (PE2).
  • the physiological pH is defined as, for example, equal to 7.2 ⁇ 0.4.
  • polyelectrolyte means a polymer carrying groups capable of ionizing in water, which creates a charge on the polymer.
  • polyampholyte is understood to mean a polyelectrolyte carrying at least two types of groups which dissociate respectively into anionic and cationic groups.
  • carrier means that the group carried is pendant, that is to say that said group is a side group with respect to the main chain of the polymer.
  • said pendant group is a side group with respect to the "amino acid” residues and is a substituent of the ⁇ carbonyl function of the "amino acid” residue which door.
  • the polarity of a polyelectrolyte is understood to mean the polarity of the overall charge carried by this polyelectrolyte to the pHm value of the pH.
  • apparent density is meant the volume occupied by 1 g of particles.
  • the apparent density is measured by any method known to those skilled in the art, such as the density gradient method.
  • the term "small molecule” is understood to mean a molecule having a molecular weight of less than 1 kDa.
  • the T test is used.
  • the test T ' is preferably used.
  • the result of the test T is a median diameter D50, such that 50% of particles present in the sample have a size less than or equal to this value (D50).
  • the result of the test T ' is a mean hydrodynamic diameter.
  • Particle solutions are prepared by diluting 400 ⁇ l of the sample to be analyzed in a 5 ml test tube with 600 ⁇ l of deionized water and then vortexing the preparation for 10 s (10 ⁇ 5). These solutions are then introduced drop by drop into the measuring cell until the darkness is between
  • the average hydrodynamic diameter of the polymer particles according to the invention is measured according to the procedure Md defined below:
  • the polymer solutions are prepared at concentrations of 1 or 2 mg / ml in 0.15 M NaCl medium and left stirring for 24 h. These solutions are then filtered on 0.8-0.2 ⁇ m, before analyzing them in dynamic light scattering using a Malvern Compact Goniometer System, operating with a 632 wavelength He-Ne laser beam. , 8 nm and vertically polarized. The diameter The hydrodynamics of the polymer nanoparticles is calculated from the autocorrelation function of the electric field by the cumulant method, as described in "Surfactant Science Series" volume 22, Surfactant Solutions, Ed R. Zana, ch. 3, M. Dekker, 1984.
  • the total mass of released protein can then be plotted by summing the one found in each of the samples and relate it to the total quantity injected.
  • the term "protein” refers to a protein as well as a peptide, whether it be an oligo or a polypeptide. This protein or peptide may or may not be modified, for example, by grafting one or more polyoxyethylene groups.
  • the first and second polyelectrolyte polymers (PEl) and (PE2) are linear, biocompatible and biodegradable polymers bearing anionic and / or cationic ionizable groups, for example amine functions or carboxylic acids.
  • the polymer PE1 or PE2 carries ionizable groups of a given polarity (anionic or cationic).
  • Such polymers are, for example, polyamino acids, anionic polysaccharides such as dextran sulfate, carboxymethylcellulose, gum arabic, hyaluronic acid and its derivatives, polygalacturonic compounds, polyglucuronic agents, or cationic polysaccharides such as chitosan, or also collagen and its gelatin derivatives. It is not excluded that a polymer bearing ionizable groups of a given polarity also carries a small fraction of 1 to 30 mol% of ionizable groups of the opposite polarity.
  • the first or second polyelectrolyte polymer (PE1) or (PE2) may optionally also carry non-ionizable groups, such as radicals chosen from a hydroxyethylamino radical, an alkylene glycol or a polyalkylene glycol;
  • non-ionizable groups such as radicals chosen from a hydroxyethylamino radical, an alkylene glycol or a polyalkylene glycol;
  • the net charge of the polymer depends on the pH value relative to the half-neutralization pH of the polymer.
  • the net charge of the polymer will be close to zero at a pH of two units below the half-neutralization pH. Virtually all anionic functions will be ionized two pH units above the half-neutralization pH.
  • the net charge is canceled when the pH exceeds the half-neutralization pH by about two units.
  • the number of charges borne by the first or second polyelectrolyte polymer (PEl, PE2) under the conditions of mixing at the pHm value of the pH is obtained by the conventional method of acid-base titration:
  • a solution of polyelectrolyte concentrated at 2 mg / ml and containing 0.15 M of sodium chloride is brought to pH 3 by addition of 1 M acetic acid or 1 M sodium hydroxide.
  • This solution is then titrated with a 0.05 M sodium hydroxide solution by recording the evolution of the pH as a function of the volume of sodium hydroxide added.
  • the detection of the equivalence point (volume and pH) makes it possible to detect the pH for which all the ionizable groups are ionized, ie where the degree of ionization is equal to 1. From this point, it is then possible to go back to the degree of ionization of the polyelectrolyte for any pH value.
  • the pH of half-neutralization that is to say the pH for which the degree of ionization is equal to 0.5. It is also possible to define the degree of ionization of the polyelectrolyte for the pHm value of the pH. In the particular case where the equivalence point is outside a pH range between 3 and 9, it is considered that all the ionizable groups are ionized over this pH range, that is to say that the degree of ionization is equal to 1 for pHs between 3 and 9.
  • first and second polyelectrolyte polymers may be linear alpha polyamino acids, recalling that if PE1 is a linear polyamino acid, PE2 is not polylysine or polyethyleneimine.
  • polyamino acid covers both natural polyamino acids and synthetic polyamino acids, as well as oligoamino acids comprising from 2 to 20 "amino acid” residues as well as polyamino acids comprising more than 20 residues "amino acid”.
  • the polyamino acids used in the present invention are oligomers or homopolymers comprising glutamic or aspartic acid repeating units or copolymers comprising a mixture of these two types of "amino acid” residues.
  • the residues considered in these polymers are amino acids having the D or L or D / L configuration and are linked by their alpha or gamma positions for the glutamate or glutamic residue and alpha or beta for the aspartic or aspartate residue.
  • the preferred "amino acid” residues of the main polyamino acid chain are those having the L-configuration and an alpha-type bond.
  • the first and second polyelectrolyte polymers are polyamino acids or a pharmaceutically acceptable salt thereof, the main chain of which is formed by residues chosen from group comprising aspartic residues, glutamic residues and combinations thereof, at least a portion of these residues being modified by grafting at least one hydrophobic group (GH) for at least the first polyelectrolyte polymer (PEI).
  • GH hydrophobic group
  • polymer PE2 also carries pendant hydrophobic groups.
  • these polyamino acids are of the type of those described in patent application PCT WO-A-00/30618, according to which the hydrophobic groups
  • (GH) are identical to or different from one another and are selected from the group consisting of: (i) linear or branched, preferably linear, C 1 -C 20 and even more preferably C 2 -C 1 alkyls, acyls or alkenyls; S ;
  • hydrocarbon groups containing one or more heteroatoms preferably those containing oxygen and / or sulfur and, more preferably, those of the following formula:
  • aryls preferably aryls, aralkyls or alkylaryls, preferably aryls;
  • the hydrophobic derivatives preferably the phosphatidylethanolamino radical or the radicals chosen from octyloxy-, dodecyloxy-, tetradecyloxy-, hexadecyloxy-, octadecyloxy-, 9-octadecenyloxy-, tocopheryloxy- or cholesteryloxy-.
  • hydrocarbon groups means groups comprising, in particular, hydrogen and carbon atoms.
  • the hydrophobic groups are selected from the following group of radicals: methyl, ethyl, propyl, docedyl, hexadecyl, octadecyl.
  • hydrophobic groups are chosen from the following group:
  • Linear or branched C 8 to C 30 alkyls which may optionally comprise at least one unsaturation and / or at least one heteroatom,
  • C 8 -C 30 alkylaryls or arylalkyls which may optionally comprise at least one unsaturation and / or at least one heteroatom,
  • the (poly) cyclic C 8 to C 3 o may optionally include at least one unsaturation and / or at least one heteroatom.
  • At least one of the hydrophobic groups (GH) is obtained by grafting, starting from a precursor chosen from the group comprising: octanol, dodecanol, tetradecanol, hexadecanol, octadecanol, lec oleyl alcohol, tocopherol or cholesterol.
  • one of the polyelectrolyte polymers corresponds to the following formula (I):
  • R 1 is H, C 2 -C 10 linear alkyl, C 3 -C 10 branched alkyl, benzyl, -R - [GH], or R together with NH is a terminal amino acid residue;
  • R is H, linear C 2 -C 10 acyl, branched C 3 -C 10 acyl, pyroglutamate or -R 4 - [GH];
  • R 4 represents a direct bond or a "spacer” based on 1 to 4 amino acid residues
  • a 1 and A 2 independently represent -CH 2 - (aspartic residue) or -CH 2 -CH 2 - (glutamic residue);
  • N / (n + m) is defined as the molar grafting level and its value is sufficiently low for the polymer dissolved in water at pH 7 and at 25 ° C. to form a colloidal suspension of polymer particles.
  • N + m varies from 10 to 1000, preferably from 50 to 300;
  • GH represents a hydrophobic group comprising 6 to 30 carbon atoms or is selected from the group comprising the radicals as defined above in paragraphs (i), (ii), (iii) and (iv).
  • polyelectrolyte polymer PE 2 corresponds to one of the following formulas (II), (III) and (IV):
  • GH represents a hydrophobic group having 6 to 30 carbon atoms
  • R 30 is a linear C 2 -C 6 alkyl group
  • R 50 is alkyl, dialkoxy or C 2 -C 6 diamino
  • R 4 represents a direct bond or a "spacer" based on 1 to 4 amino acid residues
  • a 1 and A 2 independently represent a radical -CH 2 - (aspartic residue) or -CH 2 -CH 2 - (glutamic residue); • n '+ m' or n "is defined as the degree of polymerization and varies from 10 to
  • one of the polyelectrolyte polymers corresponds to the following formula (V):
  • R represents H, a linear C 2 -C 10 alkyl, a branched C 3 -C 10 alkyl or a benzyl, an amino acid residue or a terminal amino acid derivative of formula:
  • R 7 is OH, OR 9 or NHR 10 , and R 8 , R 9 and R 1 independently represent H, linear alkyl in
  • B is a direct bond or a divalent, trivalent or tetravalent linking group, preferably selected from the following radicals:
  • D is H, linear C 2 -C 10 acyl, branched C 3 -C 10 acyl, or pyroglutamate;
  • GH represents a hydrophobic group having 6 to 30 carbon atoms
  • R 70 represents a radical chosen from the following group:
  • X is an oxygen atom or -NH-
  • R 1 is H, linear C 2 -C 10 alkyl, branched C 3 -C 10 alkyl or benzyl,
  • R 70 is a chloride, a sulfate, a phosphate or an acetate, preferably a chloride;
  • R represents a hydroxyethylamino-, an alkylene glycol residue or a polyoxyalkylene; • p, q, r and s are positive integers;
  • (P) / (p + q + r + s) is defined as the molar grafting ratio of the hydrophobic groups GH varies from 2 to 99 mol%, and preferably between 5 and 50%, provided that each copolymer chain has on average at least 3 hydrophobic grafts;
  • the derivatives of lysine, ornithine, and arginine may be, for example, ethyl and methyl esters, amides, and methylated amides.
  • the hydrophobic groups GH and the cationic groups are randomly arranged in pendant groups.
  • the hydrophobic mole ratio of the polyglutamate is between 2 and 99%, and preferably between 5 and 50% provided that each polymer chain has on average at least 3 hydrophobic grafts.
  • the ratio (q) / (p + q + r + s) of the polyglutamates means that they may contain from 1 to about 97 mole percent of cationic charge containing groups.
  • the ratio (s) / (p + q + r + s) of polyglutamates means that they can be anionic, neutral or cationic at neutral pH.
  • the group R 4 or B represented in the preceding formulas represents a direct bond.
  • one of the polyelectrolyte polymers comprises hydroxyalkyl (preferably ethyl) glutamine residues and a multiplicity of hydrophobic groups (GH) pendant and identical or different from each other.
  • the hydroxyalkylglutamine residues also carry hydroxyalkylamine groups. These hydroxyalkylamine groups are preferably bonded to the copolymer via an amide bond.
  • hydroxyalkylamine groups that can be used to functionalize the glutamate residues of these hydroxyalkylglutamine residues are identical or different from each other and are for example chosen from the following groups: 2-hydroxyethylamino, 3-hydroxypropylamino, 2,3-dihydroxypropylamino, tris (hydroxymethyl) methylamino and 6-hydroxyhexylamino.
  • at least one of the hydrophobic groups GH used in the present invention is included in a hydrophobic graft comprising at least one spacer (or "spacer") to connect the hydrophobic group GH to a chain of copolyglutamates (eg a main chain - skeleton-copolyglutamates).
  • This patella may comprise, eg at least one direct covalent bond and / or at least one amide bond and / or at least one ester bond.
  • the patella may be of the type belonging to the group comprising in particular: the "amino acid" residues different from the constituent monomeric unit of the copolyglutamate, the aminoalcohol derivatives, the polyamine derivatives (for example the diamines), the derivatives of polyols (for example diols) and derivatives of hydroxy acids.
  • the grafting of the GH on the copolyglutamate or polyalkylglutamine chain may involve the use of GH precursors that are capable of binding to the copolyglutamate chain or the hydroxyalkylglutamine residues.
  • the precursors of GH are, in practice and without being limited to, selected from the group comprising alcohols and amines, these compounds being easily functionalized by those skilled in the art.
  • hydroxyalkyl (preferably hydroxyethyl) glutamine residues reference is made to FR 2,881,140.
  • hydrophobic groups (GH) used in the present invention are independently selected from the group of radicals comprising:
  • a linear or branched alkoxy having from 6 to 30 carbon atoms and which may comprise at least one heteroatom (preferably O and / or N and / or S) and / or at least one unsaturation,
  • the hydrophobic group (GH) is derived from an alcoholic precursor chosen from the group comprising: octanol, dodecanol, tetradecanol, hexadecanol, octadecanol, oleyl alcohol, tocopherol or cholesterol, and R represents a direct linkage.
  • hydrophobic groups (GH) in particular according to at least one of the various abovementioned possibilities, each independently represent a monovalent radical of the following formula:
  • R represents a methyl (alanine), isopropyl (valine), isobutyl (leucine), secbutyl (isoleucine), benzyl (phenylalanine);
  • R 6 represents a hydrophobic radical containing from 6 to 30 carbon atoms
  • - 1 varies from 0 to 6.
  • hydrophobic radicals R 6 of the hydrophobic groups (GH) are independently selected from the group of radicals comprising:
  • said hydrophobic radical R 6 is derived from an alcoholic precursor chosen from the group comprising: octanol, dodecanol, tetradecanol, hexadecanol, octadecanol, oleyl alcohol, tocopherol or cholesterol.
  • the main chain of the polyelectrolyte polyamino acids (PE1, PE2) used in the invention is chosen from the group comprising alpha-L-glutamate homopolymers, alpha-L-glutamic homopolymers, alpha-L-glutamic homopolymers and L-aspartate, alpha-L-aspartic homopolymers, alpha-L-aspartate / alpha-L-glutamate copolymers and alpha-L-aspartic / alpha-L-glutamic copolymers.
  • the distribution of the aspartic and / or glutamic residues of the main polyamino acid chain of the polyelectrolyte polymer PE1 or PE2 is such that the polymer thus formed is either random, either of the block type or of the multiblock type.
  • the polyelectrolyte polymer PE1 or PE2 has a molar mass which is between 2,000 and 100,000 g / mol, and preferably between 5,000 and 40,000 g / mol.
  • the degree of polymerization of the first and second polyelectrolyte polymers is between 50 and 500, preferably between 70 and 300.
  • the mole fraction of the chain members of the main chain substituted with hydrophobic groups is between 1 and 40 mol%, preferably between 3 and 30 mol%.
  • the polymers used in the present invention are chosen from the various families described above so that they are globally cationic or anionic at the pH value equal to pHm.
  • An essential characteristic of the first polyelectrolyte polymer (PEl) bearing lateral hydrophobic groups is to be able to spontaneously form in water a colloidal solution.
  • each nanoparticle consists of one or more polymer chains PEl more or less condensed around its hydrophobic domains.
  • the polymers used in the invention contain ionizable functions which are, depending on the pH and the composition, either neutral
  • aqueous solution in the case of carboxylic functions, the counter-ion may be a metal cation such as sodium, calcium or magnesium, or an organic cation such as triethanolamine, tris (hydroxymethyl) -aminomethane or a polyamine such as
  • the counteranion of the cationic groups is preferably selected from the group comprising a chloride, a sulfate, a phosphate or an acetate.
  • the polyelectrolytes of the polyamino acid type which can be used in the present invention are obtained, for example, by methods known to those skilled in the art.
  • the random polyamino acids can be obtained by grafting the hydrophobic graft, previously functionalized by the "spacer", directly onto the polymer. by a conventional coupling reaction.
  • the block or multiblock polyamino acid polyelectrolytes can be obtained by sequential polymerization of the corresponding N-carboxy-amino acid anhydrides (NCA).
  • a polyamino acid, homopolyglutamate, homopolyaspartate or a glutamate / aspartate, block, multiblock or random copolymer is prepared according to conventional methods.
  • NCA N-carboxy-amino acid anhydrides
  • the coupling of the hydrophobic graft GH with an acidic function of the polymer is easily achieved by reacting the polyamino acid in the presence of a carbodiimide as a coupling agent and optionally a catalyst such as 4-dimethylaminopyridine and in a suitable solvent such as dimethylformamide ( DMF), N-methylpyrrolidone (NMP) or dimethylsulfoxide (DMSO).
  • a carbodiimide is, for example, dicyclohexylcarbodiimide or diisopropylcarbodiimide.
  • the degree of grafting is chemically controlled by the stoichiometry of the constituents and reactants or the reaction time.
  • Hydrophobic grafts functionalized by a "spacer” are obtained by conventional peptide coupling or by direct condensation by acid catalysis.
  • the coupling of the cationic and optionally neutral groups with an acid function of the polymer is carried out simultaneously in a second step in the presence of a chloroformate as coupling agent and in a suitable solvent such as dimethylformamide, N-methylpyrrolidone (NMP) or dimethylsulfoxide (DMSO).
  • the cationic group contains two chemically undifferentiated amino functions (eg linear diamine), it can be introduced in a form in which one of the two functions is protected. A last step of cleavage of the protecting group is then added.
  • the polymerization chemistry and coupling reactions of the groups are conventional and well known to those skilled in the art (see for example the patents or patent applications of the applicant mentioned above).
  • NCA derivatives previously synthesized with the hydrophobic graft are used.
  • the NCA-hydrophobic derivative is copolymerized with the NCA-O-Benzyl and then the benzyl groups are selectively removed by hydrolysis.
  • PE1 and PE2 examples of particularly preferred combinations of polyelectrolyte polymers (PE1 and PE2) according to the invention are described in the examples hereinafter.
  • the first polyelectrolyte polymer (PE1) is in the form of a colloidal solution
  • the second polyelectrolyte polymer (PE2) is in the form of a solution or colloidal solution for at least one value, pHm, the pH between 3 and 8.
  • the half-neutralization pH of the cationic polymer will be sufficiently high, for example greater than 5.5, preferably greater than 6, or even greater than 8
  • the half-neutralization pH of the anionic polymer will be sufficiently low, for example less than 6.5, preferably less than 6.0 or even less than 5.5.
  • the first polyelectrolyte polymer (PEI) is anionic
  • the latter is chosen so that it has a half-neutralization pH of between 3 and 6.5, and preferably between 4.5 and 6.5.
  • the first polyelectrolyte polymer (PE1) forms a colloidal solution for a pHm value of the pH of between 6 and 8.
  • Such a PEl polymer is described in particular in Example 1a).
  • the second electrolyte polymer (PE2) is cationic and forms a colloidal solution with a pH of less than 8.
  • the second polyelectrolyte polymer (PE2) is chosen so that its pH of half neutralization is greater than 8.
  • Such a polymer PE2 is in particular described in Example Id).
  • the first polyelectrolyte polymer (PE1) forms a colloidal solution
  • the second polyelectrolyte polymer (PE2) forms a solution or a colloidal solution for the pHm value of the pH between 6 and 8.
  • the ratio of the mass of the first polyelectrolyte polymer (PEl) to the mass of the second polyelectrolyte polymer (PE2) is chosen so that the load ratio Z, ratio of the number of moles cationic ionized groups to the number of moles of anionic ionized groups, measured at pHm, between 0.25 and 3, and preferably between 0.25 and 1.5.
  • the second polyelectrolyte polymer (PE2) is cationic and forms a colloidal solution with a pH below 6 and a precipitate with a pH greater than 6.5.
  • the second polyelectrolyte polymer (PE2) is chosen so that its pH of half-neutralization is between 5.5 and 7.
  • a polymer PE2 is described in particular in Example Ic).
  • the first polyelectrolyte polymer (PE1) forms a colloidal solution
  • the second polyelectrolyte polymer (PE2) forms a solution or a colloidal solution for a pH value, pHm, of between 3 and 6.
  • the ratio of the mass of the first polyelectrolyte polymer (PEl) to the mass of the second polyelectrolyte polymer (P E2) is chosen so that the charge ratio Z, measured at pHm, is between 3.5 and 30, of preferably between 5 and 15, and even more preferably between 8 and 12.
  • the first polyelectrolyte polymer (PEI) is cationic
  • the latter is chosen so that its pH of half-neutralization is greater than 5.
  • the second electrolyte polymer (PE2) is anionic and is chosen so that its pH of half-neutralization is between 3 and 6.5, and preferably between
  • the particles according to the invention have, at physiological pH, a size, measured in a T test, of between 1 and 100 ⁇ m.
  • the particles according to the invention are not chemically crosslinked.
  • the particles have, at physiological pH, an apparent density in high polymer, of between 0.15 and 1.1, preferably of between 0.3 and 1.0, and even more preferentially between 0.5 and 1.0.
  • a high polymer density reflects the existence within the particles of a dense network of polymer chains. Without wishing to be bound by the theory, it can be supposed that this dense network slows the diffusion of the active ingredient (PA) contained in the particles according to the invention to the external environment and thus contributes to slowing down its release.
  • PA active ingredient
  • a surprising aspect of the dense particles according to the invention is that the network of polymer chains which constitutes them makes it possible to slow the release of the AP without trapping this same PA in the heart of the particles.
  • the carrier according to the invention makes it possible to obtain both prolonged release of the AP and good bioavailability.
  • the release of the protein or peptide can be facilitated when the polymer PE1 or PE2, of a given polarity, is also a carrier of ionizable groups of the opposite polarity and / or nonionizable groups such as groups substituted by a hydroxyethylamino radical.
  • one of the two PEl or PE2 polymers simultaneously comprises: from 15 to 50 mol% of glutamate monomers;
  • nonionizable monomers such as groups substituted with a hydroxyethylamino radical
  • from 3 to 15 mol% of nonionizable monomers substituted with a hydrophobic group from 20 to 55 mol% of nonionizable monomers such as groups substituted with a hydroxyethylamino radical
  • the polymer PE1 or PE2 is cationic and simultaneously comprises: from 0 to 5 mol% of glutamate monomers; from 50 to 85 mol% of nonionizable monomers such as groups substituted with a hydroxyethylamino radical; from 10 to 40 mol% of monomers carrying cationic groups of neutralization pH greater than 8; from 3 to 15 mol% of nonionizable monomers substituted with a hydrophobic group.
  • the total concentration of polymer (PE1 + PE2) contained in the formulation is between 4 and 15 mg / ml, especially when the active ingredient is a therapeutic protein.
  • the formulation is easily injectable by a small diameter needle, for example a Gauge 27, even 29, and even 31 needle. Examples 3 and 4 describe in detail such formulations.
  • the active principle it is preferably chosen from the group comprising: proteins, glycoproteins, proteins linked to one or more polyalkylene glycol chains [preferably polyethylene glycol (PEG): “PEGylated proteins”], peptides, polysaccharides liposaccharides, oligonucleotides, polynucleotides and mixtures thereof, and more preferably still in the erythropro-retin subgroup, such as epoetin alpha, epoetin beta, darbepoetin, hemoglobin, and the like.
  • PEG polyethylene glycol
  • oxytocin vasopressin, adrenocorticotropic hormone, epidermal growth factor, platelet growth factor (PDGF), stimulatory factors of hematopoiesis and mixtures thereof, blood factors, such as alteplase, tenecteplase, factor V ⁇ I (a), factor VII; hemoglobin, cytochromes, prolactin albumins, luliberin (luteinizing hormone releasing hormone or LHRH) or the like, such as leuprolide, goserelin, triptorelin, buserelin, nafarelin; LHRH antagonists, competitors of LHRH, human growth hormones (GH), porcine or bovine hormones, growth hormone releasing hormone, insulin, somatostatin, glucagon, interleukins or their mixtures (IL-2, IL-1, IL-12), interferons, such as interferon alpha, alpha-2b, beta, beta, or ⁇ ; gastrin, t
  • active ingredients are polysaccharides (eg, heparin) and oligo- or polynucleotides, DNA, RNA, iRNA, antibiotics, and living cells.
  • Another class of active ingredients includes pharmaceutical substances acting on the central nervous system, for example, risperidone, zuclopenthixol, fluphenazine, perphenazine, flupentixol, haloperidol, fluspirilene, quetiapine, clozapine, amisulprid, sulpirid, ziprasidone, etc.
  • the active ingredient is a small hydrophobic, hydrophilic or amphiphilic organic molecule of the type belonging to the family of anthracyclines, taxoids or camptothecins or of the type belonging to the family of peptides such as leuprolide or cyclosporin and mixtures thereof.
  • a small molecule is especially a small non-protein molecule, for example, free of amino acids.
  • the active ingredient is advantageously chosen from at least one of the following families of active substances: alcohol abuse treatment agents, agents for treating Alzheimer's disease, anesthetics, Pacromegaly treatment agents, analgesics, antiasthmatics, allergy treatment agents, anticancer agents, anti-inflammatories, anticoagulants and antithrombotics, anticonvulsants, anti-epileptics, antidiabetics, antiemetics, antiglaucoma , antihistamines, antihistamines infections, antibiotics, antifungals, antivirals, antiparkinsonians, anti-cholinergics, antitussives, carbonic anhydrase inhibitors, cardiovascular agents, lipid-lowering agents, anti-arrhythmics, vasodilators, anti-angines, antihypertensives , vasoprotectants, cholinesterase inhibitors, central nervous system treatment agents, central nervous system stimulants, contraceptives, fertility promoters, uterine labor inducers and inhibitors,
  • step 2 adding at least one active ingredient (AP) to the first polyelectrolyte polymer (PEI) obtained in step 1, said active ingredient non-covalently associating with the particles of the colloidal solution of said first polyelectrolyte polymer ( PEI);
  • the subject of the invention is also a method for preparing particles for the sustained release of at least one active principle (AP), these particles corresponding in particular to certain ones described above, comprising the following steps:
  • step 2 adding at least one active ingredient (AP) to the first polyelectrolyte polymer (PEI) obtained in step 1, said active ingredient non-covalently associating with the particles of the colloidal solution of said first polyelectrolyte polymer ( PEI);
  • An essential characteristic of the process according to the invention is to form particles, spontaneously, by simple mixing at pH m of a colloidal solution of particles of the first polyelectrolyte polymer (PEI) loaded with active ingredient (PA) and a solution or d a colloidal solution of the second polyelectrolyte polymer (PE2) of opposite polarity.
  • the active ingredients such as proteins, peptides or small molecules can spontaneously associate with the first polymer (PE1) of polyamino acid type.
  • the loading the nanoparticles of the first polyelectrolyte polymer (PEI) with the active ingredient (PA) is carried out by simple mixing of a solution of active principle (PA) with a colloidal solution of the first polyelectrolyte polymer (PEI).
  • PA active principle
  • PEI colloidal solution of the first polyelectrolyte polymer
  • This association is purely physical and does not imply the creation of a co-valent bond between the active ingredient (PA) and the polymer (PEI). Without being bound by theory, it can be assumed that this non-specific association is effected by hydrophobic and / or electrostatic interaction between the polymer (PEl) and the active ingredient (PA).
  • the process according to the invention comprises a step of dehydration of the suspension of particles obtained (for example by lyophilization or atomization), in order to obtain them in the form of a dry powder.
  • the subject of the invention is a pharmaceutical formulation for the sustained release of at least one active ingredient (AP), comprising an aqueous suspension of particles as described above or those obtained by the process described above.
  • AP active ingredient
  • the present invention also relates to a solid pharmaceutical formulation for the sustained release of at least one active ingredient (AP), comprising a dry powder form:
  • such a solid pharmaceutical formulation is used for inhalation and pulmonary administration.
  • the subject of the invention is a process for preparing medicaments, in particular for parenteral, mucosal, subcutaneous, intramuscular, intradermal, transdermal, intraperitoneal, intracerebral or tumor administration, or even orally. , nasal, pulmonary, vaginal or ocular, said method essentially consisting in implementing at least one of the formulations described above.
  • FIG. 1 in vitro release of IFN- ⁇ from the particle formulations of Example 2 (white circles), Example 3.1 (black triangles), Example 3.2 (black diamonds), the Example 3.3 (black squares), Example 4 (black circles) and Example 5 (lines).
  • 15 g of an alpha-L-polyglutamic acid are solubilized with respect to a polyoxyethylene standard and obtained by polymerization of NCA-GIuOMe followed by hydrolysis as described in the FR-patent application.
  • the solution is cooled to 15 ° C. and 2.5 g of D, L-alpha-tocopherol (> 98% obtained from Fluka®) preliminarily solubilized in 8 ml of DMF, 280 mg of 4-dimethylaminopyridine, which has been solubilized beforehand, is added successively.
  • the solution of activated polymer is then added to the suspension of histidinamide.
  • the reaction medium is stirred for 2 h at 0 ° C. and then overnight at 20 ° C. 0.62 ml of 35% HCl are then added, followed by 83 ml of water.
  • the solution obtained is then poured into 500 ml of water at a pH of between 3 and 4.
  • the solution is then diafiltered against 8 volumes of salt water (0.9% NaCl) and 4 volumes of water.
  • the polymer solution is then concentrated to a volume of 300 mL (the polymer concentration is 18 mg / g).
  • the percentage of grafted histidinamide determined by 1 H NMR in D 2 O is 95%.
  • Example 1 preparation of particles with polyelectrolytes having no hydrophobic group (1) Preparation of a colloidal solution of PEl-B polymer:
  • the PEl-B polymer obtained according to the synthesis b) above is used.
  • This polymer has a half-neutralization pH equal to 5.985.
  • a colloidal solution of polymer PE1-B is obtained by solubilizing it in water by adjusting the pH to 7.63 by adding a solution of NaOH.
  • the osmolarity of the solution is adjusted to 100 mOsm by introducing the necessary amount of an aqueous solution of NaCl.
  • the polymer concentration PE1-B is adjusted to 8.38 mg / g.
  • the combination is carried out overnight at 25 0 C with stirring.
  • This polymer has a pH of half-neutralization greater than 9.
  • a colloidal solution of poly-L-arginine is obtained by solubilizing it in water by first adjusting the pH to 0.92 with a solution of HCl, then back at pH equal to 6.91 with a solution of NaOH and heating the solution at 45 0 C for 15 min.
  • the poly-L-arginine polymer concentration is adjusted to 5.13 mg / g.
  • the charge ratio Z is the ratio of the number of moles of cationic ionized groups to the number of moles of anionic ionized groups, measured at pHm equal to 6.95.
  • the particle size is measured according to the T test. Table I
  • the suspension is centrifuged for 15 min at 8000 rpm and the IFN- ⁇ is assayed in the supernatant by the method described in the European Pharmacopoeia (colorimetric assay by UV absorbance).
  • a colloidal solution of PEI-A polymer is obtained by solubilizing it in water by adjusting the pH to 7.53 by adding a solution of NaOH.
  • the osmolarity of the solution is adjusted to 101 mOsm by introducing the necessary amount of an aqueous solution of NaCl.
  • the polymer concentration PEI-B is adjusted to 8.41 mg / g.
  • the combination is carried out overnight at 25 ° C with stirring.
  • the charge ratio Z is measured at pHm equal to 6.88.
  • the particle size is measured according to the T test.
  • the suspension is centrifuged for 15 min at 8000 rpm and PIFN- ⁇ is assayed in the supernatant by the method described in the European Pharmacopoeia (colorimetric assay by UV absorbance).
  • All of the introduced protein is encapsulated in the formed microparticles.
  • Example 3 Preparation of particles based on PEI-A and PE2-A, containing IFN-a 4.1)
  • the PEI-A polymer obtained according to the synthesis a) above is used. This polymer has a half-neutralization pH equal to 5.445.
  • a colloidal solution of PEI-A polymer is obtained by solubilizing it in water by adjusting the pH to 7.45 by adding a solution of NaOH.
  • the osmolarity of the solution is adjusted to 108 mOsm by introducing the necessary amount of an aqueous solution of NaCl.
  • the PEl polymer concentration is adjusted to 23.88 mg / g.
  • the polymer PE2-A obtained according to the synthesis c) above is used. This polymer has a half-neutralization pH of 6.05.
  • a colloidal solution of PE2-A polymer is obtained by solubilizing it in water by adjusting the pH to 5.17.
  • the osmolarity of the solution is adjusted to 289 mOsm and the polymer concentration PE2-A is adjusted to 5.70 mg / g.
  • the charge ratio Z is measured at pHm equal to 5.17.
  • the particle size is measured according to the T test.
  • Example 3.2 final polymer concentration equal to 5 mg / g, Z being equal to about 10
  • the PEI-A polymer obtained according to the synthesis a) above is used.
  • a colloidal solution of PEl polymer is obtained by solubilizing it in water by adjusting the pH to 7.52 by adding a solution of NaOH.
  • the osmolarity of the solution is adjusted to 108 mOsm by introducing the necessary amount of an aqueous solution of NaCl.
  • the PEl polymer concentration is adjusted to 20.21 mg / g.
  • the combination is carried out overnight at 25 0 C with stirring.
  • the association is then adjusted to a pH of 4.88.
  • the charge ratio Z is measured at pHm equal to 4.81.
  • the particle size is measured according to the T test.
  • Example 3.3 final polymer concentration equal to 10 mg / g, Z being equal to about 10
  • a colloidal solution of PEI-A polymer is obtained by solubilizing it in water by adjusting the pH to 7.52 by adding a solution of NaOH.
  • the osmolarity of the solution is adjusted to 108 mOsm by introducing the necessary amount of an aqueous solution of NaCl.
  • the polymer concentration PEI-A is adjusted to 20.21 mg / g.
  • the charge ratio Z is measured at pHm equal to 4.95.
  • the particle size is measured according to the T test.
  • a colloidal solution of PEI-A polymer is obtained by solubilizing it in water by adjusting the pH to 7.52 by adding a solution of NaOH.
  • the osmolarity of the solution is adjusted to 108 mOsm by introducing the necessary amount of an aqueous solution of NaCl.
  • the polymer concentration PEI-A is adjusted to 20.21 mg / g.
  • the PE2-B polymer obtained according to the synthesis d) above is used. This polymer has a neutralization pH greater than 9.
  • a colloidal solution of PE2-B polymer is obtained by solubilizing it in water by adjusting the pH to 6.98.
  • the osmolarity of the solution is adjusted to 288 mOsm and the PE2-B polymer concentration is adjusted to 6.33 mg / g.
  • the charge ratio Z is measured at pHm equal to 6.85.
  • the particle size is measured according to the T test.
  • Example 5 preparation of particles based on PEI-A alone, containing VIFN a
  • the PEI-A polymer obtained according to the synthesis a) above is used.
  • a colloidal solution of PEI-A polymer is obtained by solubilizing it in water by adjusting the pH to 7.52 by adding a solution of NaOH.
  • the osmolarity of the solution is adjusted to 108 mOsm by introducing the necessary amount of an aqueous solution of NaCl.
  • the polymer concentration PEI-A is adjusted to 29.05 mg / g.
  • the release of the active ingredient from the particles according to the invention is measured using the L-test.
  • Figure 1 shows the release in the L-test as the percentage of protein released over time.
  • Comparative Example 2 The formulation of Comparative Example 2 in which only one of the polymers carrying hydrophobic groups has a very low release profile, with 1.6% of the protein released after 23 hours.
  • C max represents the maximum average plasma concentration of protein on all animals.
  • Median T max represents the median time for which the plasma concentration passes through its maximum.
  • AUC represents the mean area under the curve of plasma concentration as a function of time.
  • T50% AUC represents the average time at which the area under the curve reaches 50% of its total value.
  • RBA is the ratio of the area under the curve of the formulation considered to the area under the curve of the IFN IR formulation.
  • PEI-A polymer obtained according to the synthesis a) above is used.
  • a colloidal solution of polymer PEI-A is obtained by solubilizing it in water by adjusting the pH to 7.15 by adding a solution of NaOH.
  • the osmolarity of the solution is adjusted to 145 mOsm by introducing the necessary amount of an aqueous solution of NaCl.
  • the polymer concentration PEI-A is adjusted to 3.10 mg / g.
  • the combination is carried out overnight at 25 ° C with stirring.
  • the association is then adjusted to a pH of 7.0.
  • the PE2-C polymer obtained according to the synthesis e) above is used.
  • a colloidal solution of PE2-C polymer is obtained by diluting and adjusting the PE2-C polymer to pH 7.04, 288 mOsm and 7.96 mg / g in 140 mOsm PBS.
  • the charge ratio Z is measured at pHm equal to 7.
  • the size of the particles is measured according to the T test. The table below groups together the characteristics of the particles obtained:
  • PEl-A polymer obtained according to the synthesis a) above is used.
  • a colloidal solution of polymer PEI-A is obtained by solubilizing it in water by adjusting the pH to 7.02 by addition of a solution of NaOH.
  • the osmolarity of the solution is adjusted to 101 mOsm by introducing the necessary amount of an aqueous solution of NaCl.
  • the polymer concentration PEI-A is adjusted to 2.0 mg / g.
  • the combination is carried out overnight at 25 0 C with stirring.
  • the association is then adjusted to a pH of 7.0.
  • the charge ratio Z is measured at pHm equal to 7.
  • the size of the particles is measured according to the T test. The table below groups together the characteristics of the particles obtained:
  • Example 8 (Comparison) release rate of the PE1-A / PE2-D-based and PE1-A / PE2-C-containing particles containing IFN- ⁇ .
  • this example shows that it is possible, in particular by selecting a cationic polymer containing more or fewer neutral and / or anionic groups, to modulate the release rate of the AP.
  • the release is 9.5% for the microparticles obtained from the PE2-C polymer and 31% for the microparticles obtained from PE2-D.

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Abstract

La présente invention concerne de nouvelles particules de polymères polyélectrolytes transporteurs de principe actif (PA), en particulier protéinique et peptidique, ainsi que de nouvelles formulations pharmaceutiques à libération modifiée contenant lesdites microparticules de PA. Ces nouvelles particules chargées en PA libèrent le PA sur une durée prolongée de plusieurs jours, voire plusieurs semaines. L'invention concerne dans un premier aspect des particules comprenant: a) un premier polymère polyélectrolyte (PE1) à l'état chargé, porteur de groupements hydrophobes (GH) latéraux, ledit premier polymère polyélectrolyte (PE1) formant spontanément dans l'eau une solution colloïdale de particules à au moins une valeur pHm du pH comprise entre 3 et 8; b) un second polymère polyélectrolyte (PE2) de polarité opposée à celle du premier polymère polyélectrolyte (PE1), ledit second polymère polyélectrolyte (PE2) formant dans l'eau une solution ou une solution colloïdale à au moins ladite valeur pHm du pH; c) au moins un principe actif (PA) associé de façon non covalente aux particules de la solution colloïdale du premier polymère polyélectrolyte (PE1); lesdites particules étant obtenues par mélange, à pH égal à pHm, du premier polymère polyélectrolyte (PE1) sous forme de solution colloïdale de particules associées au principe actif (PA) avec le second polymère polyélectrolyte (PE2) sous forme de solution ou de solution colloïdale. L'invention concerne également le procédé de préparation de ces particules, une formulation pharmaceutique comprenant de telles particules et un procédé de préparation de médicaments.

Description

PARTICULES A BASE DE POL YELECTROL YTES ET DE PRINCIPE ACTIF A LIBÉRATION MODIFIEE ET FORMULATIONS PHARMACEUTIQUES CONTENANT CES PARTICULES
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne de nouveaux transporteurs de principe(s) actif(s) -PA-, en particulier protéinique(s) et peptidique(s), ainsi que de nouvelles formulations pharmaceutiques à libération modifiée contenant lesdits transporteurs de PA. La demande concerne également les applications, notamment thérapeutiques, de ces formulations pharmaceutiques. Ces formulations pharmaceutiques actives concernent aussi bien la thérapeutique humaine que vétérinaire.
L'abréviation PA utilisée dans tout le présent exposé vise au moins un principe actif.
ETAT DE LA TECHNIQUE
Dans le domaine de la libération prolongée des PA pharmaceutiques notamment des peptides/protéines thérapeutiques, on cherche très souvent à reproduire au mieux chez le patient une concentration plasmatique en peptide ou en protéine proche de la valeur observée chez le sujet sain.
Cet objectif se heurte à la faible durée de vie des protéines dans le plasma qui conduit à injecter de façon répétée la protéine thérapeutique. La concentration plasmatique en protéine thérapeutique présente alors un profil "en dents de scie" caractérisé par des pics élevés de concentration et des minima de concentration très bas. Les pics de concentration, très supérieurs à la concentration basale chez le sujet sain, ont des effets nocifs très marqués du fait de la toxicité élevée des protéines thérapeutiques telles que certaines cytokines. Par ailleurs, les minima de concentration sont inférieurs à la concentration nécessaire pour avoir un effet thérapeutique, ce qui entraîne une mauvaise couverture thérapeutique du patient et des effets secondaires graves à long terme.
Aussi, pour reproduire chez le patient une concentration plasmatique en protéine thérapeutique proche de la valeur idéale pour le traitement du patient, il importe que la formulation pharmaceutique considérée permette de libérer la protéine thérapeutique sur une durée prolongée, de façon à limiter les variations de concentration plasmatique au cours du temps.
Par ailleurs, cette formulation active doit, de préférence, satisfaire au cahier des charges suivant, déjà connu de l'homme de l'art :
1 - libération prolongée d'une protéine thérapeutique active et non dénaturée, par exemple humaine ou synthétique, de sorte que la concentration plasmatique est maintenue au niveau thérapeutique ;
2 - viscosité à l'injection suffisamment basse pour être aisément injectable;
3 - forme biocompatible et biodégradable présentant un excellent profil de toxicité et de tolérance.
Pour tenter d'atteindre ces objectifs, l'une des meilleures approches proposées dans l'art antérieur fut de développer des formes à libération prolongée de protéine(s) thérapeutique(s) constituées par des suspensions, liquides et peu visqueuses de nanoparticules chargées en protéines thérapeutiques. Ces suspensions ont permis l'administration aisée de protéines thérapeutiques natives.
Ainsi, la société Flamel Technologies a proposé une voie, dans laquelle la protéine thérapeutique est associée à des nanoparticules d'un copolyaminoacide comprenant des groupements hydrophobes et des groupements hydrophiles. La demande de brevet US 2006/0099264 divulgue des polyaminoacides amphiphiles comprenant des résidus acide aspartique et/ou des résidus glutamiques, au moins une partie de ces résidus étant porteuses de greffons comportant au moins un motif alpha-tocophérol, e.g. : (polyglutamate ou polyaspartate greffé par l'alpha tocophérol d'origine synthétique ou naturelle). Ces homopolyaminoacides "modifiés hydrophobes" forment spontanément dans l'eau une suspension colloïdale de nanoparticules, lesquelles sont aptes à s'associer aisément en suspension aqueuse à pH 7,4, avec au moins une protéine active (insuline).
La durée de libération in vivo de la (ou les) protéine(s) active(s) (e.g. insuline) "vectorisée" par les suspensions selon US 2006/0099264 gagnerait à être augmentée.
L'augmentation de la durée de libération a été partiellement obtenue par les formes pharmaceutiques décrites dans la demande PCT WO-A-05/051416. Dans cette demande, est divulguée une suspension colloïdale de nanoparticules (0,001-0,5 μm) de poly(L- glutamate de sodium) modifiée hydrophobe et injectée à une concentration telle qu'après injection sous-cutanée, il se forme in situ chez le patient un gel au contact de l'albumine endogène. La protéine est alors lentement libérée sur une période typique d'une semaine. Cependant, lorsque la concentration en protéine thérapeutique à administrer est relativement élevée, comme c'est le cas par exemple pour l'hormone de croissance humaine, la durée de libération est limitée à quelques jours.
La durée de libération de ces formes gagnerait à être encore augmentée. BREVE DESCRIPTION DE L'INVENTION
L'un des objectifs de l'invention est de proposer de nouvelles particules chargées en PA, libérant le PA sur une durée prolongée de plusieurs jours, voire plusieurs semaines. Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles particules formant une suspension stable en solution aqueuse.
Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles particules chargées en PA et stables sous forme lyophilisée.
Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles particules aptes à être conservées sous forme lyophilisée.
Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles particules facilement redispersibles après lyophilisation.
Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles particules libérant une protéine ayant préservé son activité biologique. Un autre objectif de l'invention est de proposer un nouveau procédé de préparation de ces microparticules.
Un autre objectif de l'invention est de proposer une formulation pharmaceutique solide pour la libération prolongée de PA en particulier une forme poudre sèche pour inhalation et administration pulmonaire. Pour atteindre ces objectifs, parmi d'autres, les inventeurs ont eu le mérite de découvrir, après de longues et laborieuses recherches, que, de façon tout à fait surprenante et inattendue, le mélange dans des conditions spécifiques de deux polymères (par exemple de copolyaminoacides) polyélectrolytes de polarité opposée, l'un au moins étant porteur de groupements hydrophobes, associés à au moins un PA, conduit à des particules de taille comprise entre 1 et 100 μm capables de libérer in vitro ou in vivo une protéine ou un peptide sur une durée prolongée.
D'où il s'ensuit que l'invention concerne tout d'abord des particules pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), caractérisées en ce qu'elles comprennent: a) un premier polymère polyélectrolyte (PEl), de préférence un alpha polyaminoacide linéaire, à l'état chargé, porteur de groupements hydrophobes (GH) latéraux, ledit premier polymère polyélectrolyte (PEl) formant spontanément dans l'eau une solution colloïdale de particules à au moins une valeur pHm du pH comprise entre 3 et 8; b) un second polymère polyélectrolyte (PE2), de préférence un alpha polyaminoacide linéaire, de polarité opposée à celle du premier polymère polyélectrolyte (PEl), ledit second polymère polyélectrolyte (PE2) formant dans l'eau une solution ou une solution colloïdale à au moins ladite valeur pHm du pH; à la condition que, si le premier polymère électrolyte (PEl) est un polyaminoacide, alors le second polymère polyélectrolyte (PE2) n'est ni la polylysine ni la polyéthylène imine; c) au moins un principe actif (PA) associé de façon non covalente aux particules de la solution colloïdale du premier polymère polyélectrolyte (PEl ); lesdites particules pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA) étant obtenues par mélange, à pH égal à pHm, du premier polymère polyélectrolyte (PEl) sous forme de solution colloïdale de particules associées au principe actif (PA) avec le second polymère polyélectrolyte (PE2) sous forme de solution ou de solution colloïdale.
L'invention concerne également un procédé de préparation de particules pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), ces particules étant en particulier celles décrites ci-dessus, comprenant les étapes suivantes:
1) la préparation, à une valeur pHm du pH comprise entre 3 et 8, d'une solution colloïdale aqueuse d'un premier polymère polyélectrolyte (PEl) à l'état chargé, porteur de groupements hydrophobes (GH) latéraux, ledit premier polymère polyélectrolyte (PEl) étant capable de former spontanément dans l'eau une solution colloïdale de particules à au moins une valeur pHm du pH comprise entre 3 et 8; 2) l'ajout d'au moins un principe actif (PA) au premier polymère polyélectrolyte (PEl) obtenu à l'étape 1, ledit principe actif s'associant de façon non covalente aux particules de la solution colloïdale dudit premier polymère polyélectrolyte (PEl);
3) la préparation d'un second polymère polyélectrolyte (P E2) de polarité opposée à celle du premier polymère polyélectrolyte (PEl), ledit second polymère polyélectrolyte (PE2) formant dans l'eau une solution ou une solution colloïdale à au moins ladite valeur pHm du pH; à la condition que, si le premier polymère électrolyte (PEl) est un polyaminoacide, alors le second polymère polyélectrolyte (PE2) n'est ni la polylysine ni la polyéthylène imine;
4) le mélange, à pH égal à pHm, du premier polymère polyélectrolyte (PEl) sous forme de solution colloïdale de particules associées au principe actif (PA) obtenu à l'étape 2) avec le second polymère polyélectrolyte (PE2) sous forme de solution ou de solution colloïdale obtenu à l'étape 3).
L'invention concerne également des particules pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), caractérisées en ce qu'elles comprennent : a) un premier polymère polyélectrolyte (PEl), de préférence un alpha polyaminoacide linéaire, à l'état chargé, porteur de groupements hydrophobes (GH) latéraux, ledit premier polymère polyélectrolyte (PEl) formant spontanément dans l'eau une solution colloïdale de particules à au moins une valeur pHm du pH comprise entre 3 et 8 ; b) un second polymère polyélectrolyte (PE2), de préférence un alpha polyaminoacide linéaire, de polarité opposée à celle du premier polymère polyélectrolyte (PEl), porteur de groupements hydrophobes (GH) latéraux, ledit second polymère polyélectrolyte (PE2) formant dans l'eau une solution ou une solution colloïdale à au moins ladite valeur pHm du pH ; c) au moins un principe actif (PA) associé de façon non covalente aux particules de la solution colloïdale du premier polymère polyélectrolyte (PEl) ; lesdites particules pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA) étant obtenues par mélange à pH égal à pHm du premier polymère polyélectrolyte (PEl) sous forme de solution colloïdale de particules associées au principe actif (PA) avec le second polymère polyélectrolyte (PE2) sous forme de solution ou de solution colloïdale.
L'invention concerne également un procédé de préparation de particules pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), ces particules étant en particulier celles décrites ci-avant, comprenant les étapes suivantes : 1) la préparation, à une valeur pHm du pH comprise entre 3 et 8, d'une solution colloïdale aqueuse d'un premier polymère polyélectrolyte (PEl) à l'état chargé, porteur de groupements hydrophobes (GH) latéraux, ledit premier polymère polyélectrolyte (PEl) étant capable de former spontanément dans l'eau une solution colloïdale de particules à au moins une valeur, pHm, du pH comprise entre 3 et 8 ;
2) l'ajout d'au moins un principe actif (PA) au premier polymère polyélectrolyte (PEl) obtenu à l'étape 1, ledit principe actif s'associant de façon non covalente aux particules de la solution colloïdale dudit premier polymère polyélectrolyte (PEl) ; 3) la préparation d'un second polymère polyélectrolyte (PE2) de polarité opposée à celle du premier polymère polyélectrolyte (PEl), porteur de groupements hydrophobes (GH) latéraux, ledit second polymère polyélectrolyte (PE2) formant dans l'eau une solution ou une solution colloïdale à au moins ladite valeur pHm du pH ; 4) le mélange, à pH égal à pHm, du premier polymère polyélectrolyte (PEl) sous forme de solution colloïdale de particules auxquelles est associé le principe actif (PA) obtenu à l'étape 2) avec le second polymère polyélectrolyte (PE2) sous forme de solution ou de solution colloïdale obtenu à l'étape 3). L'invention concerne également une formulation pharmaceutique pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), ladite formulation comprenant des particules telles que décrites ci-dessus. L'invention concerne également un procédé de préparation de médicaments, en particulier pour administration parentérale, muqueuse, sous-cutanée, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale, intracérébrale ou dans une tumeur, voire par voie orale, nasale, pulmonaire, vaginale, transdermique ou oculaire, consistant essentiellement à mettre en œuvre au moins une formulation telle que décrite ci-dessus.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Définitions
Dans la présente description, on entend par solution un mélange homogène solvant et polymère sous forme de chaîne individuelle.
Dans la présente description, on entend par solution colloïdale une suspension de particules dont le diamètre moyen mesuré par le test T' est inférieur ou égal à 0,5 μm.
Dans la présente description, on entend par pH de demi-neutralisation, le pH auquel la moitié des groupements ionisables est ionisée. Dans la présente description, on entend par pHm le pH auquel s'effectue le mélange du premier polymère polyélectrolyte (PEl) auquel est associé le principe actif (PA) avec le second polymère polyélectrolyte (PE2).
Dans la présente description, on définit le pH physiologique comme étant par exemple égal à 7,2 ± 0,4. Dans la présente description, on entend par polyélectrolyte un polymère porteur de groupements capables de s'ioniser dans l'eau, ce qui crée une charge sur le polymère.
Dans la présente description, on entend par polyampholyte un polyélectrolyte porteur d'au moins deux types de groupements qui se dissocient respectivement en groupements anioniques et cationiques. Dans la présente description, l'expression « être porteur » signifie que le groupement porté est pendant, c'est-à-dire que ledit groupement est un groupement latéral par rapport à la chaîne principale du polymère. En particulier, lorsque le polymère est un polyaminoacide comprenant des résidus "acide aminé", ledit groupement pendant est un groupement latéral par rapport aux résidus "acide aminé" et est un substituant de la fonction carbonyle en γ du résidu "acide aminé" qui le porte.
Dans la présente description, on entend par polarité d'un polyélectrolyte, la polarité de la charge globale portée par ce polyélectrolyte à la valeur pHm du pH.
Dans la présente description, on entend par densité apparente le volume occupé par 1 g de particules. La densité apparente est mesurée par toute méthode connue de l'homme du métier, telle que la méthode de gradient de densité.
Dans la présente description, on entend par petite molécule, une molécule ayant un poids moléculaire inférieur à 1 kDa. Pour mesurer la taille des particules selon l'invention, résultant de l'association du premier polymère polyélectrolyte (PEl) et du second polymère polyélectrolyte (PE2), on utilise le test T. Pour évaluer la taille des particules de la solution colloïdale du premier polymère polyélectrolyte (PEl), on utilise de préférence le test T'.
Le résultat du test T est un diamètre médian D50, tel que 50% de particules présentes dans l'échantillon ont une taille inférieure ou égale à cette valeur (D50). Le résultat du test T' est un diamètre hydrodynamique moyen.
Test T de mesure de la taille des microparticules par diffraction laser:
On obtient les données relatives au D50 qui est le diamètre en dessous duquel se trouvent 50 % des objets analysés. Ce diamètre des particules selon l'invention est mesuré selon le mode opératoire défini ci-après :
Les solutions de particules sont préparées en diluant 400 μl de l'échantillon à analyser dans un tube à essai de 5 ml avec 600 μl d'eau déminéralisée, puis en passant la préparation au vortex pendant 10 s (10 ± 5). Ces solutions sont ensuite introduites au goutte à goutte dans la cellule de mesure jusqu'à ce que l'obscuration soit comprise entre
5 % et 20 %, puis elles sont analysées par diffraction de la lumière grâce à un appareil de type Malvern Mastersizer 2000, fonctionnant avec deux longueurs d'onde 466 et 632 nm.
Le D50 des particules est calculé à partir de la théorie de Mie en utilisant les indices de réfraction suivants : nflu,de = 1.33 + i.0, npolymere ≈ 1.59 + i.O et les approximations de Fraunhofer, comme décrit dans la norme ISO 13320.
Test T' de mesure de la taille des nanoparticules par diffusion quasi-élastique de la lumière:
Le diamètre hydrodynamique moyen des particules de polymère selon l'invention est mesuré selon le mode opératoire Md défini ci-après :
Les solutions de polymère sont préparées à des concentrations de 1 ou 2 mg/ml en milieu NaCl 0,15 M et laissées sous agitation pendant 24 h. Ces solutions sont ensuite filtrées sur 0,8-0,2 μm, avant de les analyser en diffusion dynamique de la lumière grâce à un appareil de type Malvern Compact Goniometer System, fonctionnant avec un faisceau laser He-Ne de longueur d'onde 632,8 nm et polarisé verticalement. Le diamètre hydrodynamique des nanoparticules de polymère est calculé à partir de la fonction d'autocorrélation du champ électrique par la méthode des cumulants, comme décrit dans l'ouvrage « Surfactant Science Séries » volume 22, Surfactant Solutions, Ed. R. Zana, chap. 3, M. Dekker, 1984.
Test L de mesure de la libération du principe actif:
On injecte 50 μl de formulation dans un cube de 1,5 cm de côté de mousse polyuréthane-polyéther (PU-PE) baigné par un flux de 2,83 ml/h d'un milieu aqueux contenant 30 mg/g d'albumine bovine fraction V (Aldrich), 0,01 M de tampon phosphate, 0,0027 M de chlorure de potassium, 0,137 M de chlorure de sodium (PBS de Aldrich) et 0,015 M d'acétate d'ammonium (Aldrich). On prélève régulièrement de la phase continue dont la teneur en protéine est analysée par ELISA (kit Immunotech IM3193).
On peut alors tracer la masse totale de protéine libérée en sommant celle trouvée dans chacun des prélèvements et la rapporter à la quantité totale injectée.
Au sens de l'invention, le terme "protéine" désigne aussi bien une protéine qu'un peptide, qu'il s'agisse d'un oligo ou d'un polypeptide. Cette protéine ou ce peptide peuvent être modifiés ou non, par exemple, par greffage d'un ou de plusieurs groupements polyoxyéthyléniques. Les premier et second polymères polyélectrolytes (PEl) et (PE2) sont des polymères linéaires, biocompatibles et biodégradables, porteurs de groupements ionisables anioniques et/ou cationiques, par exemple des fonctions aminés ou acides carboxyliques. De préférence, le polymère PEl ou PE2 est porteur de groupements ionisables d'une polarité donnée (anionique ou cationique). De tels polymères sont par exemples des polyaminoacides, des polysaccharides anioniques tels que le sulfate de dextran, la carboxyméthylcellulose, la gomme arabique, l'acide hyaluronique et ses dérivés, les polygalacturoniques, les polyglucuroniques, ou des polysaccharides cationiques tels que le chitosan, ou également du collagène et ses dérivés de type gélatine. II n'est pas exclu qu'un polymère porteur de groupements ionisables d'une polarité donnée, soit également porteur d'une petite fraction de 1 à 30 % molaire de groupements ionisables de la polarité opposée. En plus des groupements ionisables anioniques ou cationiques et des groupements hydrophobes, le premier ou second polymère polyélectrolyte (PEl) ou (PE2) peut éventuellement être également porteur de groupements non ionisables, tels que des radicaux choisis parmi un radical hydroxyéthylamino-, un alkylène glycol ou un polyalkylène glycol; La charge nette du polymère dépend de la valeur du pH par rapport au pH de demi- neutralisation du polymère. Ainsi pour un polyélectrolyte porteur de fonctions anioniques carboxyliques, la charge nette du polymère sera voisine de zéro à un pH deux unités au dessous du pH de demi-neutralisation. Quasiment toutes les fonctions anioniques seront ionisées deux unités de pH au dessus du pH de demi-neutralisation. Inversement, pour un polymère porteur de fonctions cationiques, la charge nette s'annule lorsque le pH dépasse de deux unités environ le pH de demi-neutralisation.
Dans la présente invention, le nombre de charges portées par le premier ou second polymère polyélectrolyte (PEl, PE2) dans les conditions de mélange à la valeur pHm du pH, est obtenue par la méthode classique de titration acido-basique :
Une solution de polyélectrolyte concentrée à 2 mg/ml et contenant 0,15 M de chlorure de sodium est portée à pH 3 par ajout d'acide acétique 1 M ou de soude 1 M. On procède ensuite à la titration de cette solution par une solution de soude 0,05 M en enregistrant l'évolution du pH en fonction du volume de soude ajouté. La détection du point d'équivalence (volume et pH), par exemple par la méthode de la double tangente, permet de détecter le pH pour lequel tous les groupements ionisables sont ionisés, c'est-à dire où le degré d'ionisation est égal à 1. On peut alors, à partir de ce point remonter au degré d'ionisation du polyélectrolyte pour toute valeur du pH. On peut alors définir le pH de demi-neutralisation, c'est-à-dire le pH pour lequel le degré d'ionisation est égal à 0,5. On peut aussi définir le degré d'ionisation du polyélectrolyte pour la valeur pHm du pH. Dans le cas particulier où le point d'équivalence est hors d'une gamme de pH compris entre 3 et 9, on considère que tous les groupements ionisables sont ionisés sur cette gamme de pH, c'est-à dire que le degré d'ionisation est égal à 1 pour des pH compris entre 3 et 9.
D'une manière avantageuse, les premier et second polymères polyélectrolytes (PEl, PE2) peuvent être des alpha polyaminoacides linéaires, en rappelant que si PEl est un polyaminoacide linéaire, PE2 n'est pas la polylysine ni la polyéthylène imine.
Au sens de l'invention et dans tout le présent exposé, le terme « polyaminoacide » couvre aussi bien les polyaminoacides naturels que les polyaminoacides synthétiques, ainsi que les oligoaminoacides comprenant de 2 à 20 résidus "acide aminé" au même titre que les polyaminoacides comprenant plus de 20 résidus "acide aminé".
De préférence, les polyaminoacides utilisés dans la présente invention sont des oligomères ou des homopolymères comprenant des unités récurrentes acide glutamique ou aspartique ou des copolymères comprenant un mélange de ces deux types de résidus "acide aminé". Les résidus considérés dans ces polymères sont des acides aminés ayant la configuration D ou L ou D/L et sont liées par leurs positions alpha ou gamma pour le résidu glutamate ou glutamique et alpha ou bêta pour le résidu aspartique ou aspartate. Les résidus "acide aminé" préférées de la chaîne polyaminoacide principale sont celles ayant la configuration L et une liaison de type alpha.
Suivant un mode encore plus préféré de réalisation de l'invention, les premier et second polymères polyélectrolytes (PEl, PE2) sont des polyaminoacides, ou l'un de leurs sels pharmaceutiquement acceptables, dont la chaîne principale est formée par des résidus choisis dans le groupe comprenant les résidus aspartiques, les résidus glutamiques et leurs combinaisons, au moins une partie de ces résidus étant modifiée par greffage d'au moins un groupement hydrophobe (GH) pour au moins le premier polymère polyélectrolyte (PEl).
Il est possible que le polymère PE2 soit également porteur de groupes hydrophobes latéraux.
Selon une première variante, ces polyaminoacides sont du type de ceux décrits dans la demande de brevet PCT WO-A-00/30618, selon laquelle les groupements hydrophobes
(GH) sont identiques ou différents entre eux et sont sélectionnés dans le groupe comprenant : (i) les alkyles, les acyles ou les alcényles linéaires ou ramifiés, de préférence linéaires en Ci-C20 et, plus préférentiellement encore en C2-CiS ;
(ii) les groupements hydrocarbonés contenant un ou plusieurs hétéroatomes, de préférence ceux contenant de l'oxygène et/ou du soufre et, plus préférentiellement encore, ceux de formule suivante:
Figure imgf000012_0001
dans laquelle:
- R6O est un radical alkyle, acyle ou alcényle linéaire ou ramifié, de préférence linéaire en Ci -C20 et, plus préférentiellement encore en C2-CiS, - R6] et R62 sont identiques ou différents entre eux et correspondent à l'hydrogène ou à un radical alkyle, acyle ou alcényle linéaire ou ramifié, de préférence linéaire en C1-C20 et, plus préférentiellement encore en C2-CiS, - q= l à 100 ;
(iii) les aryles, les aralkyles ou les alkylaryles, de préférence les aryles ; (iv) les dérivés hydrophobes, de préférence, le radical phosphatidyléthanolamino- ou les radicaux choisis parmi octyloxy-, dodécyloxy-, tétradécyloxy-, hexadécyloxy-, octadécyloxy-, 9-octadecenyloxy-, tocophéryloxy- ou cholestéryloxy-.
Par "groupements hydrocarbonés", on entend au sens de la présente invention, des groupements comprenant notamment des atomes d'hydrogène et de carbone. De préférence, dans cette variante, les groupements hydrophobes sont sélectionnés dans le groupe de radicaux suivants : méthyle, éthyle, propyle, docédyle, hexadécyle, octadécyle.
D'une manière particulièrement préférée, les groupements hydrophobes (GH) sont choisis dans le groupe suivant :
• les alkyles linéaires ou ramifiés en Cs à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome,
• les alkylaryles ou arylalkyles en C8 à C30 pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome,
• et les (poly)cycliques en C8 à C3o pouvant comporter éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome.
Plus précisément, au moins l'un des groupements hydrophobes (GH) est obtenu par greffage, à partir d'un précurseur choisi dans le groupe comprenant: l'octanol, le dodécanol, le tétradécanol, l'héxadécanol, l'octadécanol, l'oléylalcool, le tocophérol ou le cholestérol.
Selon une variante de l'invention, l'un des polymères polyélectrolytes (PEl, PE2), ou l'un de leurs sels pharmaceutiquement acceptables, répond à la formule (I) suivante :
Figure imgf000013_0001
(I) dans laquelle :
R1 représente H, un alkyle linéaire en C2 à Cio, un alkyle ramifié en C3 à Cio, un benzyle, -R -[GH], ou R forme avec NH un résidu acide aminé terminal;
R représente H, un acyle linéaire en C2 à Cio, un acyle ramifié en C3 à Cio, un pyroglutamate ou -R4-[GH] ;
R4 représente une liaison directe ou un "espaceur" à base de 1 à 4 résidus acide aminé ;
A1 et A2 représentent indépendamment -CH2- (résidu aspartique) ou -CH2- CH2- (résidu glutamique) ; • n/(n+m) est défini comme le taux de greffage molaire et sa valeur est suffisamment basse pour que le polymère mis en solution dans l'eau à pH 7 et à 25 0C, forme une suspension colloïdale de particules de polymère;
• n + m varie de 10 à 1000, de préférence entre 50 et 300 ;
• GH représente un groupement hydrophobe comportant 6 à 30 atomes de carbone ou est choisi dans le groupe comprenant les radicaux tels que définis ci-dessus dans les paragraphes (i), (ii), (iii) et (iv).
Pour plus de détails sur la préparation et la synthèse de polyaminoacides de formule (I), on se reportera utilement aux demandes de brevet FR 02 07008 et FR 03 50190.
Selon une autre possibilité, le polymère polyélectrolyte PE2, ou l'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables, répond à l'une des formules (II), (III) et (IV) suivantes :
Figure imgf000014_0001
dans lesquelles :
GH représente un groupement hydrophobe comportant 6 à 30 atomes de carbone ;
R30 est un groupement alkyle linéaire en C2 à C6 ; R50 est un alkyle, un dialcoxy ou un diamino en C2 à C6 ; R4 représente une liaison directe ou un "espaceur" à base de 1 à 4 résidus acide aminé ;
A1 et A2 représentent indépendamment un radical -CH2- (résidu aspartique) ou -CH2-CH2- (résidu glutamique) ; • n' + m' ou n"est défini comme le degré de polymérisation et varie de 10 à
1000, de préférence entre 50 et 300.
Pour plus de détails sur la préparation et la synthèse de polyaminoacides de formule (I), (II) et (IV), on se reportera utilement à la demande de brevet FR 03 50641.
Selon une autre possibilité, l'un des polymères polyélectrolytes (PEl, PE2), ou l'un de leurs sels pharmaceutiquement acceptables, répond à la formule (V) suivante :
Figure imgf000015_0001
dans laquelle :
" E- représente indépendamment :
- un -NHR dans lequel R représente H, un alkyle linéaire en C2 à Ci0, un alkyle ramifié en C3 à Cio ou un benzyle, un résidu acide aminé ou un dérivé d'acide aminé terminal de formule :
H 7
-NH — C COR7
dans laquelle
R7 est OH, OR9 ou NHR10, et R8, R9 et R1 représentent indépendamment H, un alkyle linéaire en
C2 à Cio, un alkyle ramifié en C3 à C]0 ou un benzyle; B est une liaison directe ou un groupement de liaison divalent, trivalent ou tétravalent, de préférence choisi parmi les radicaux suivants :
-O— , -NH-, — N(-Ci-5 alkyle)- , un résidu d'acide aminé (de préférence naturel), de diol, de triol, de diamine, de triamine, d'aminoalcool ou d'hydroxyacide comportant de 1 à 6 atomes de carbone, D représente H, un acyle linéaire en C2 à Cio, un acyle ramifié en C3 à C1O, ou un pyroglutamate;
GH représente un groupement hydrophobe comportant 6 à 30 atomes de carbone; R70 représente un radical choisi dans le groupe suivant :
-NH-(CH2)W-NH3 + avec w compris entre 2 et 6, et de préférence w est égal à 4,
- -NH-(CH2)4-NH-C(=NH)-NH3 +,
- -O-(CH2)2-NH3 +,
- -O-(CH2)2-N+(CH3)3,
où
Figure imgf000016_0001
un ester d' alkyle (de préférence -COOMe et -COOEt), -CH2OH, -Q=O)-NH2, -C(=0)-NH-CH3 ou -C(=O)-N(CH3)2 ; un résidu d'acide aminé ou dérivé d'acide aminé de formule :
Figure imgf000016_0002
dans laquelle :
X est un atome d'oxygène ou -NH-,
R1 est H, alkyle linéaire en C2 à Ci0, alkyle ramifié en C3 à Cio ou benzyle,
-R13 est -(CH2)4NH3 +, -(CH2)3-NH-C(=NH)-NH3 +, -{CH2)3NH3 +; le contre-anion de R70 est un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate, de préférence un chlorure;
R représente un hydroxyéthylamino-, un résidu d'alkylène glycol ou un polyoxyalkylène ; • p, q, r et s sont des entiers positifs;
• (p)/(p+q+r+s) est défini comme le taux de greffage molaire des groupements hydrophobes GH varie de 2 à 99 % molaire, et de préférence entre 5 et 50 % sous condition que chaque chaîne de copolymère possède en moyenne au moins 3 greffons hydrophobes;
• (q)/(p+q+r+s) est défini comme le taux de greffage molaire des groupements cationiques et varie de 1 à 99 % molaire;
" (p+q+r+s) varie de 10 à 1000, de préférence entre 30 et 500 ;
• (r)/(p+q+r+s) varie de 0 à 98 % molaire; " (s)/(p+q+r+s) varie de 0 à 98 % molaire.
Les dérivés de la lysine, de l'ornithine, et de l'arginine peuvent être par exemple des esters éthyliques et méthyliques, des amides, et des amides méthylés.
De préférence selon cette variante, les groupements hydrophobes GH et les groupements cationiques sont disposés de façon aléatoire en groupements pendants.
Il est par ailleurs préférable que le taux de greffage molaire en motif hydrophobe des polyglutamates soit compris entre 2 et 99 %, et de préférence entre 5 et 50 % sous condition que chaque chaîne de polymère possède en moyenne au moins 3 greffons hydrophobes. Le rapport (q)/(p+q+r+s) des polyglutamates signifie qu'ils peuvent contenir de 1 à environ 97 % molaire de groupements contenant une charge cationique.
Le rapport (s)/(p+q+r+s) des polyglutamates signifie qu'ils peuvent être anioniques, neutres ou cationiques à pH neutre.
Pour plus de détails sur la préparation et la synthèse de polyaminoacides de formule
(V) dérivés de lliistidine, on se reportera utilement à la demande de brevet FR 05 53302. Pour plus de détails sur la préparation et la synthèse de polyaminoacides de formule (V) autres que ceux dérivés de l'histidine, on se reportera utilement à la demande de brevet FR 07 03185.
Suivant une variante intéressante, le groupement R4 ou B représenté dans les formules précédentes représente une liaison directe.
Selon une autre possibilité, l'un des polymères polyélectrolytes (PEl, PE2) comprend des résidus hydroxyalkyl (de préférence éthyl) glutamine et une multiplicité de groupements hydrophobes (GH) pendants et identiques ou différents entre eux. Les résidus hydroxyalkylglutamine sont également porteurs de groupements hydroxyalkylamine. Ces groupements hydroxyalkylamine sont, de préférence, liés au copolymère par l'intermédiaire d'une liaison amide. Les groupements hydroxyalkylamine utilisables pour fonctionnaliser les résidus glutamates de ces résidus hydroxyalkylglutamine sont identiques ou différents entre eux et sont par exemple choisis parmi les groupements suivants: 2-hydroxyéthylamino, 3-hydroxypropylamino, 2,3-dihydroxypropylamino, tris(hydroxyméthyl)méthylamino et 6-hydroxyhexylamino. Avantageusement, au moins l'un des groupements hydrophobes GH utilisé dans la présente invention est inclus dans un greffon hydrophobe comprenant au moins une rotule (ou motif) d'espacement ("spacer") permettant de relier le groupement hydrophobe GH à une chaîne de copolyglutamates (par exemple une chaîne principale - squelette- copolyglutamates). Cette rotule peut comprendre, e.g. au moins une liaison covalente directe et/ou au moins une liaison amide et/ou au moins une liaison ester. Par exemple, la rotule peut être du type de celles appartenant au groupe comportant notamment: les résidus "acide aminé" différents de l'unité monomérique constitutive du copolyglutamate, les dérivés des aminoalcools, les dérivés des polyamines (par exemple les diamines), les dérivés des polyols (par exemple les diols) et les dérivés des hydroxyacides. Le greffage des GH sur la chaîne copolyglutamate ou polyalkylglutamine peut passer par la mise en œuvre de précurseurs de GH, aptes à se lier à la chaîne copolyglutamates ou aux résidus hydroxyalkylglutamines. Les précurseurs des GH sont, en pratique et sans que cela ne soit limitatif, choisis dans le groupe comprenant les alcools et les aminés, ces composés pouvant être fonctionnalisés facilement par l'homme de l'art. Pour plus de détails sur ces résidus hydroxyalkyl- (de préférence hydroxyéthyl-) glutamine, on se référera au FR 2.881.140.
Suivant une variante avantageuse, notamment selon au moins l'une des différentes possibilités susvisées, tout ou partie des groupements hydrophobes (GH) utilisés dans la présente invention sont choisis de façon indépendante dans le groupe de radicaux comportant :
" un alcoxy linéaire ou ramifié comportant de 6 à 30 atomes de carbone et pouvant comporter au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S) et/ou au moins une insaturation,
• un alcoxy comportant 6 à 30 atomes de carbone et ayant un ou plusieurs carbocycles annelés et contenant éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S), " un alcoxyaryle ou un aryloxyalkyle de 7 à 30 atomes de carbone et pouvant comporter au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S).
Suivant une autre variante avantageuse, notamment selon au moins l'une des différentes possibilités susvisées, le groupement hydrophobe (GH) est issu d'un précurseur alcoolique choisi dans le groupe comprenant: l'octanol, le dodécanol, le tétradécanol, l'hexadécanol, l'octadécanol, l'oléylalcool, le tocophérol ou le cholestérol, et R représente une liaison directe.
Suivant une autre variante avantageuse, les groupements hydrophobes (GH), notamment selon au moins l'une des différentes possibilités susvisées, représentent chacun indépendamment les uns des autres un radical monovalent de formule suivante :
Figure imgf000019_0001
(GH) dans laquelle :
- R représente un méthyle (alanine), isopropyle (valine), isobutyle (leucine), secbutyle (isoleucine), benzyle (phénylalanine) ;
- R6 représente un radical hydrophobe comportant de 6 à 30 atomes de carbone;
- 1 varie de 0 à 6.
Selon une caractéristique remarquable de l'invention, tout ou partie des radicaux hydrophobes R6 des groupements hydrophobes (GH) sont choisis de façon indépendante dans le groupe de radicaux comportant :
• un alcoxy linéaire ou ramifié comportant de 6 à 30 atomes de carbone et pouvant comporter au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S) et/ou au moins une insaturation, " un alcoxy comportant 6 à 30 atomes de carbone et ayant un ou plusieurs carbocycles annelés et contenant éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S),
• un alcoxyaryle ou un aryloxyalkyle de 7 à 30 atomes de carbone et pouvant comporter au moins une insaturation et/ou au moins un hétéro- atome (de préférence O et/ou N et/ou S).
En pratique et sans que cela ne soit limitatif, ledit radical hydrophobe R6 est issu d'un précurseur alcoolique choisi dans le groupe comprenant: l'octanol, le dodécanol, le tétradécanol, l'hexadécanol, l'octadécanol, l'oléylalcool, le tocophérol ou le cholestérol.
Avantageusement, la chaîne principale des polyaminoacides polyélectrolytes (PEl, PE2) utilisés dans l'invention est choisie parmi le groupe comprenant les homopolymères d'alpha-L-glutamate, les homopolymères d'alpha-L-glutamique, les homopolymères d'alpha-L- aspartate, les homopolymères d'alpha-L-aspartique, les copolymères d'alpha-L-aspartate/ alpha-L-glutamate et les copolymères d'alpha-L-aspartique/alpha-L-glutamique. De manière remarquable, la distribution des résidus aspartiques et/ou glutamiques de la chaîne polyaminoacide principale du polymère polyélectrolyte PEl ou PE2 est telle que le polymère ainsi constitué est soit aléatoire, soit de type bloc, soit de type multibloc.
Selon un autre mode de définition, le polymère polyélectrolyte PEl ou PE2 a une masse molaire qui se situe entre 2 000 et 100 000 g/mole, et de préférence entre 5 000 et 40 000 g/mole.
Le degré de polymérisation des premier et second polymères polyélectrolytes (PEl, PE2) est compris entre 50 et 500, de préférence entre 70 et 300.
La fraction molaire des chaînons de la chaîne principale substitués par des groupements hydrophobes est comprise entre 1 et 40 % molaire, de préférence entre 3 et 30 % molaire.
Les polymères utilisés dans la présente invention sont choisis parmi les différentes familles décrites ci-dessus de sorte qu'ils sont globalement cationiques ou anioniques à la valeur de pH égale à pHm. Une caractéristique essentielle du premier polymère polyélectrolyte (PEl) porteur de groupements hydrophobes latéraux, est de pouvoir former spontanément dans l'eau une solution colloïdale.
Sans vouloir être lié par la théorie, on peut avancer que l'association supramoléculaire des groupements hydrophobes pour former des domaines hydrophobes, conduit à la formation de nanoparticules. Chaque nanoparticule est constituée par une ou plusieurs chaînes de polymères PEl plus ou moins condensées autour de ses domaines hydrophobes. Il convient de comprendre que les polymères utilisés dans l'invention contiennent des fonctions ionisables qui sont, selon le pH et la composition, soit neutres
(par exemple -COOH, -NH2), soit ionisées (par exemple -COO", -NH3 +). Pour cette raison, la solubilité dans une phase aqueuse est directement fonction du taux de fonctions ionisées et donc du pH. En solution aqueuse, dans le cas de fonctions carboxyliques, le contre-ion peut être un cation métallique tel que le sodium, le calcium ou le magnésium, ou un cation organique tel que la triéthanolamine, le tris(hydroxyméthyl)-aminométhane ou une polyamine telle que la polyéthylèneimine. Le contre-anion des groupements cationiques est de préférence choisi parmi le groupe comprenant un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate.
Connaissant le pH de demi-neutralisation, l'homme de l'art sait ajuster le pH afin que le degré d'ionisation du polymère soit suffisamment élevé et assure la stabilité de la solution colloïdale. Les polyélectrolytes de type polyaminoacide susceptibles d'être utilisés dans la présente invention sont obtenus, par exemple, par des méthodes connues de l'homme de l'art. Les polyaminoacides statistiques peuvent être obtenus par greffage du greffon hydrophobe, préalablement fonctionnalisé par "l'espaceur", directement sur le polymère par une réaction classique de couplage. Les polyélectrolytes polyaminoacides blocs ou multiblocs peuvent être obtenus par polymérisation séquentielle des anhydrides de N- carboxy-aminoacides (NCA) correspondants.
On prépare par exemple un polyaminoacide, homopolyglutamate, homopolyaspartate ou un copolymère glutamate/aspartate, bloc, multibloc ou aléatoire selon des méthodes classiques.
Pour l'obtention de polyaminoacide de type alpha, la technique la plus courante est basée sur la polymérisation d'anhydrides de N-carboxy-aminoacides (NCA), décrite, par exemple, dans l'article "Biopolymers, 1976, 15, 1869 et dans l'ouvrage de H.R. Kricheldorf "alpha-Aminoacid-N-Carboxy Anhydrides and related Heterocycles" Springer Verlag (1987). Les dérivés de NCA sont de préférence des dérivés NCA-O-Me, NCA-O-Et ou NCA-O-Bz (Me = Méthyl, Et = Ethyle et Bz = Benzyle). Les polymères sont ensuite hydrolyses dans des conditions appropriées pour obtenir le polymère sous sa forme acide. Ces méthodes sont inspirées de la description donnée dans le brevet FR 2 801 226 de la demanderesse. Un certain nombre de polymères utilisables selon l'invention, par exemple, de type poly(alpha-L-aspartique), poly(alpha-L-glutamique), poly(alpha-D-glutamique) et poly(gamma-L-glutamique) de masses variables sont disponibles commercialement. Le polyaspartique de type alpha-bêta est obtenu par condensation de l'acide aspartique (pour obtenir un polysuccinimide) suivie d'une hydrolyse basique (cf. Tomida et al. Polymer 1997, 38, 4733-36).
Le couplage du greffon hydrophobe GH avec une fonction acide du polymère est réalisé aisément par réaction du polyaminoacide en présence d'un carbodiimide comme agent de couplage et optionnellement, un catalyseur tel que la 4-diméthylaminopyridine et dans un solvant approprié tel que le diméthylformamide (DMF), la N-méthylpyrrolidone (NMP) ou le diméthylsulfoxide (DMSO). Le carbodiimide est par exemple, le dicyclohexylcarbodiimide ou le diisopropylcarbodiimide. Le taux de greffage est contrôlé chimiquement par la stœchiométrie des constituants et réactifs ou le temps de réaction. Les greffons hydrophobes fonctionnalisés par un "espaceur" sont obtenus par couplage peptidique classique ou par condensation directe par catalyse acide. Le couplage des groupes cationiques et éventuellement neutres avec une fonction acide du polymère est réalisé simultanément dans une deuxième étape en présence d'un chloroformiate comme agent de couplage et dans un solvant approprié tel que le diméthylformamide, la N-méthylpyrrolidone (NMP) ou le diméthylsulfoxide (DMSO).
Dans le cas où le groupe cationique contient deux fonctions aminés non différenciées chimiquement (e.g. diamine linéaire), il peut être introduit sous une forme dans laquelle une des deux fonctions est protégée. Une dernière étape de clivage du groupement protecteur est alors ajoutée. La chimie de polymérisation et les réactions de couplage des groupements sont classiques et bien connues de l'homme de l'art (voir par exemples les brevets ou demandes de brevet de la demanderesse cités précédemment).
Pour la synthèse de copolymère bloc ou multibloc, on utilise des dérivés NCA préalablement synthétisé avec le greffon hydrophobe. Par exemple, le dérivé NCA- hydrophobe est copolymérisé avec le NCA-O-Benzyl puis on enlève par hydrolyse sélectivement les groupements benzyliques.
Des exemples d'associations particulièrement préférées de polymères polyélectrolytes (PEl et PE2) selon l'invention sont décrits dans les exemples ci-après.
Une caractéristique essentielle des polymères utilisés dans l'invention est que le premier polymère polyélectrolyte (PEl) est sous forme de solution colloïdale, et que le second polymère polyélectrolyte (PE2) est sous forme de solution ou de solution colloïdale pour au moins une valeur, pHm, du pH comprise entre 3 et 8. Afin de remplir cette condition, le pH de demi-neutralisation du polymère cationique sera suffisamment élevé, par exemple supérieur à 5,5, de préférence supérieur à 6, ou encore supérieur à 8 ; et le pH de demi-neutralisation du polymère anionique sera suffisamment faible, par exemple inférieur à 6,5, de préférence inférieur à 6,0 ou encore inférieur à 5,5. Plus particulièrement, dans une variante selon laquelle le premier polymère polyélectrolyte (PEl) est anionique, ce dernier est choisi de sorte qu'il présente un pH de demi-neutralisation compris entre 3 et 6,5, et de préférence entre 4,5 et 6,5. Selon cette variante, le premier polymère polyélectrolyte (PEl) forme une solution colloïdale pour une valeur pHm du pH comprise entre 6 et 8. Un tel polymère PEl est notamment décrit dans l'exemple la).
Dans ce cas, et selon une première possibilité, le second polymère électrolyte (PE2) est cationique et forme une solution colloïdale à pH inférieur à 8. De préférence, le second polymère polyélectrolyte (PE2) est choisi de sorte que son pH de demi-neutralisation est supérieur à 8. Un tel polymère PE2 est notamment décrit dans l'exemple Id). Ainsi selon cette première possibilité, le premier polymère polyélectrolyte (PEl) forme une solution colloïdale et le second polymère polyélectrolyte (PE2) forme une solution ou une solution colloïdale pour la valeur pHm du pH comprise entre 6 et 8.
Dans ce cas, selon une caractéristique importante de l'invention, le rapport de la masse du premier polymère polyélectrolyte (PEl) à la masse du second polymère polyélectrolyte (PE2) est choisi afin que le rapport de charge Z, rapport du nombre de moles de groupements ionisés cationiques au nombre de moles de groupements ionisés anioniques, mesurés à pHm, soit compris entre 0,25 et 3, et de préférence compris entre 0,25 et 1,5. Selon une deuxième possibilité, le second polymère polyélectrolyte (PE2) est cationique et forme une solution colloïdale à pH inférieur à 6 et un précipité à pH supérieur à 6,5. De préférence, le second polymère polyélectrolyte (PE2) est choisi de sorte que son pH de demi-neutralisation est compris entre 5,5 et 7. Un tel polymère PE2 est notamment décrit dans l'exemple Ic). Dans ce cas, selon une caractéristique importante de l'invention, le premier polymère polyélectrolyte (PEl) forme une solution colloïdale et le second polymère polyélectrolyte (PE2) forme une solution ou une solution colloïdale pour une valeur du pH, pHm, comprise entre 3 et 6. Le rapport de la masse du premier polymère polyélectrolyte (PEl) à la masse du second polymère polyélectrolyte (P E2) est choisi afin que le rapport de charge Z, mesuré à pHm, soit compris entre 3,5 et 30, de préférence compris entre 5 et 15, et plus préférentiellement encore compris entre 8 et 12.
Dans une autre variante selon laquelle le premier polymère polyélectrolyte (PEl) est cationique, ce dernier est choisi de sorte que son pH de demi-neutralisation est supérieur à 5. Dans ce cas, le second polymère électrolyte (PE2) est anionique et est choisi de sorte que son pH de demi-neutralisation est compris entre 3 et 6,5, et de préférence entre
4,5 et 6,5.
Les particules selon l'invention présentent, à pH physiologique, une taille, mesurée dans un test T, comprise entre 1 et 100 μm.
D'une manière avantageuse, les particules selon l'invention ne sont pas réticulées chimiquement.
Dans une réalisation particulière de l'invention, les particules ont, à pH physiologique, une densité apparente en polymère élevée, comprise entre 0,15 et 1,1, de préférence comprise entre 0,3 et 1 ,0, et plus préférentiellement encore comprise entre 0,5 et 1,0. Une densité en polymère élevée traduit l'existence au sein des particules d'un réseau dense de chaînes polymères. Sans vouloir être lié par la théorie, on peut supposer que ce réseau dense ralentit la diffusion du principe actif (PA) contenu dans les particules selon l'invention vers le milieu extérieur et contribue ainsi à ralentir sa libération. Un aspect surprenant des particules denses selon l'invention est que le réseau de chaînes de polymères qui les constitue permet de ralentir la libération du PA sans pour autant piéger ce même PA au cœur des particules. Ainsi le transporteur selon l'invention permet d'obtenir à la fois une libération prolongée du PA et une bonne biodisponibilité.
Dans certains cas, et en particulier dans le cas de peptides ou de protéines présentant une forte affinité avec les microparticules selon l'invention, il peut être avantageux de moduler la vitesse de libération du principe actif, pour en accélérer la libération, et/ou afin d'améliorer sa biodisponibilité. Après de nombreux essais, il a été démontré par la Demanderesse que la libération de la protéine ou du peptide peut être facilitée lorsque le polymère PEl ou PE2, d'une polarité donnée, est également porteur de groupements ionisables de la polarité opposée et/ou de groupements non ionisables tels que des groupements substitués par un radical hydroxyéthylamino-.
Ainsi, dans une réalisation particulière de l'invention, l'un des deux polymères PEl ou PE2 comprend simultanément : - de l5 à 50 % molaire de monomères glutamate ;
- de 20 à 55 % molaire de monomères non ionisables tels que des groupements substitués par un radical hydroxyéthylamino- ; de 10 à 40 % molaire de monomères porteurs de groupements cationiques de pH de neutralisation supérieur à 8 ; - de 3 à 15 % molaire de monomères non ionisables substitués par un groupement hydrophobe.
Dans une autre réalisation particulière de l'invention, le polymère PEl ou PE2 est cationique et comprend simultanément : de 0 à 5 % molaire de monomères glutamate ; - de 50 à 85 % molaire de monomères non ionisables tels que des groupements substitués par un radical hydroxyéthylamino- ; de 10 à 40 % molaire de monomères porteurs de groupements cationiques de pH de neutralisation supérieur à 8 ; de 3 à 15 % molaire de monomères non ionisables substitués par un groupement hydrophobe.
Dans une réalisation particulière de l'invention, la concentration totale en polymère (PEl + PE2) contenue dans la formulation est comprise entre 4 et 15 mg/ml, notamment lorsque le principe actif est une protéine thérapeutique. Dans cette gamme de concentration, la formulation est aisément injectable par une aiguille de faible diamètre, par exemple une aiguille de Gauge 27, voire 29, et même 31. Les exemples 3 et 4 décrivent en détails de telles formulations.
Concernant le principe actif, il est de préférence choisi dans le groupe comprenant: les protéines, les glycoprotéines, les protéines liées à une ou plusieurs chaînes polyalkylèneglycol [de préférence polyéthylèneglycol (PEG) : "protéines-PEGylées"], les peptides, les polysaccharides, les liposaccharides, les oligonucléotides, les polynucléotides et leurs mélanges, et, plus préférentiellement encore, dans le sous-groupe des érythroproïétines, telles que l'époétine alpha, l'époétine bêta, la darbépoétine, le raffimère d'hémoglobine, leurs analogues ou leurs dérivés; ocytocine, vasopressine, hormone adrénocorticotropique, facteur de croissance épidermique, facteur de croissance des plaquettes (PDGF), les facteurs stimulants de Phématopoïèse et leurs mélanges, les facteurs sanguins, tels que alteplase, tenecteplase, facteur VΙI(a), facteur VII; hémoglobine, les cytochromes, les albumines prolactine, lulibérine (hormone libération de l'hormone lutéinisante ou LHRH) ou analogues, tels que leuprolide, goséréline, triptoréline, buséréline, nafaréline; antagonistes de la LHRH, les concurrents de la LHRH, les hormones de croissance (GH) humaine, porcine ou bovine, l'hormone de libération de l'hormone de croissance, l'insuline, la somatostatine, le glucagon, les interleukines ou leurs mélanges (IL-2, IL-I l, IL- 12), les interférons, tels que l'interféron alpha, alpha-2b, bêta, bêta- la, ou γ; la gastrine, la tétragastrine, la pentagastrine, l'urogastrone, la sécrétine, la calcitonine, les enképhalines, les endomorphines, les angiotensines, le facteur de libération de la thyrotropine (TRH), le facteur de nécrose tumorale (TNF), le facteur de croissance nerveux (NGF), les facteurs de croissance tels que béclapermine, trafermine, ancestime, le facteur de croissance des kératinocytes, le facteur stimulant les colonies granulocytes (G-CSF), le facteur stimulant les colonies de macrophages granulocytaires (GM-CSF), le facteur stimulant les colonies de macrophages (M-CSF), héparinase, la protéine morphogénique de l'os (BMP), hANP, le peptide ressemblant au glucagon (GLP-I), VEG-F, l'antigène recombinant de l'hépatite B (rHBsAg), la rénine, les cytokines, la bradykinine, les bacitracines, les polymixines, les colistines, la tyrocidine, les gramicidines, l'étanercept, l'imiglucérase, la drotrécogine alpha, les cyclosporines et analogies synthétiques, les modifications et fragments actifs pharmaceutiquement d'enzymes, de cytokines, d'anticorps, d'antigènes et de vaccins, les anticorps tels que rituximab, infiiximab, trastuzumab, adalimumab, omalizumab, tositumomab, efalizumab, et cetuximab. D'autres principes actifs sont les polysaccharides (par exemple, l'héparine) et les oligo- ou polynucléotides, ADN, ARN, iARN, antibiotiques, et cellules vivantes. Une autre classe de principes actifs comprend les substances pharmaceutiques agissant sur le système nerveux central, par exemple, rispéridone, zuclopenthixol, fluphénazine, perphénazine, flupentixol, halopéridol, fluspirilene, quétiapine, clozapine, amisulprid, sulpirid, ziprasidone, etc.
Selon une variante, le principe actif est une petite molécule organique hydrophobe, hydrophile ou amphiphile du type de celles appartenant à la famille des anthracyclines, des taxoïdes ou des camptothécines ou du type de celles appartenant à la famille des peptides telles que la leuprolide ou la cyclosporine et leurs mélanges. Au sens du présent exposé, une petite molécule est notamment une petite molécule non protéinique, par exemple exempte d'acides aminés.
Selon une autre variante, le principe actif est avantageusement choisi parmi au moins l'une des familles de substances actives suivantes : les agents de traitement de l'abus d'alcool, les agents de traitement de la maladie d'Alzheimer, les anesthésiques, les agents de traitement de Pacromégalie, les analgésiques, les antiasthmatiques, les agents de traitement des allergies, les agents anticancéreux, les anti-inflammatoires, les anticoagulants et antithrombotiques, les anti-convulsivants, les antiépileptiques, les antidiabétiques, les antiémétiques, les antiglaucomes, les antihistaminiques, les anti- infectieux, les antibiotiques, les antifongiques, les antiviraux, les antiparkinsoniens, les anti-cholinergiques, les antitussifs, les inhibiteurs de Panhydrase carbonique, les agents cardiovasculaires, les hypolipémiants, les anti-arythmiques, les vasodilatateurs, les antiangineux, les anti-hypertenseurs, les vasoprotecteurs, les inhibiteurs de cholinestérase, les agents de traitement des désordres du système nerveux central, les stimulants du système nerveux central, les contraceptifs, les promoteurs de fécondité, les inducteurs et inhibiteurs du travail utérin, les agents de traitement de la mucoviscidose, les agonistes des récepteurs de la dopamine, les agents de traitement de l'endométriose, les agents de traitement des dysfonctionnements érectiles, les agents de traitement de la fertilité, les agents de traitements des troubles gastro-intestinaux, les immunomodulateurs et les immunosuppresseurs, les agents de traitement des troubles de la mémoire, les antimigraineux, les relaxants des muscles, les analogues de nucléosides, les agents de traitement de l'ostéoporose, les parasympathomimétiques, les prostaglandines, les agents psychothérapeutiques, les sédatifs, les hypnotiques et tranquillisants, les neuroleptiques, les anxiolytiques, les psychostimulants, les antidépresseurs, les agents de traitements dermatologiques, les stéroïdes et les hormones, les amphétamines, les anorexiques, les anti-douleurs non analgésiques, les anti-épileptiques, les barbituriques, les benzodiazépines, les hypnotiques, les laxatifs, les psychotropes et toutes les associations de ces produits. Selon un autre de ses aspects, l'invention a pour objet un procédé de préparation de particules pour la libération prolongée d'au moins un principe actif, ces particules étant en particulier celles décrites ci-dessus, ledit procédé comprenant les étapes suivantes:
1) la préparation, à une valeur pHm du pH comprise entre 3 et 8, d'une solution colloïdale aqueuse d'un premier polymère polyélectrolyte (PEl) à l'état chargé, porteur de groupements hydrophobes (GH) latéraux, ledit premier polymère polyélectrolyte (PEl) étant capable de former spontanément dans l'eau une solution colloïdale de particules à au moins une valeur, pHm, du pH comprise entre 3 et 8;
2) l'ajout d'au moins un principe actif (PA) au premier polymère polyélectrolyte (PEl) obtenu à l'étape 1, ledit principe actif s'associant de façon non covalente aux particules de la solution colloïdale dudit premier polymère polyélectrolyte (PEl);
3) la préparation d'un second polymère polyélectrolyte (PE2) de polarité opposée à celle du premier polymère polyélectrolyte (PEl), ledit second polymère polyélectrolyte (PE2) formant dans l'eau une solution ou une solution colloïdale à au moins ladite valeur, pHm, du pH; à la condition que, si le premier polymère électrolyte (PEl) est un polyaminoacide, alors le second polymère polyélectrolyte (PE2) n'est ni la polylysine ni la polyéthylène imine;
4) le mélange à pH égal à pHm du premier polymère polyélectrolyte (PEl) sous forme de solution colloïdale de particules auxquelles est associé le principe actif (PA) obtenu à l'étape 2) avec le second polymère polyélectrolyte (PE2) sous forme de solution ou de solution colloïdale obtenu à l'étape 3).
L'invention a également pour objet un procédé de préparation de particules pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), ces particules correspondant en particulier à certaines décrites ci-dessus, comprenant les étapes suivantes:
1) la préparation, à une valeur pHm du pH comprise entre 3 et 8, d'une solution colloïdale aqueuse d'un premier polymère polyélectrolyte (PEl) à l'état chargé, porteur de groupements hydrophobes (GH) latéraux, ledit premier polymère polyélectrolyte (PEl) étant capable de former spontanément dans l'eau une solution colloïdale de particules à au moins une valeur, pHm, du pH comprise entre 3 et 8;
2) l'ajout d'au moins un principe actif (PA) au premier polymère polyélectrolyte (PEl) obtenu à l'étape 1, ledit principe actif s'associant de façon non covalente aux particules de la solution colloïdale dudit premier polymère polyélectrolyte (PEl);
3) la préparation d'un second polymère polyélectrolyte (P E2) de polarité opposée à celle du premier polymère polyélectrolyte (PEl), porteur de groupements hydrophobes (GH) latéraux, ledit second polymère polyélectrolyte (PE2) formant dans l'eau une solution ou une solution colloïdale à au moins ladite valeur pHm du pH;
4) le mélange à pH égal à pHm du premier polymère polyélectrolyte (PEl) sous forme de solution colloïdale de particules auxquelles est associé le principe actif (PA) obtenu à l'étape 2) avec le second polymère polyélectrolyte (PE2) sous forme de solution ou de solution colloïdale obtenu à l'étape 3).
Une caractéristique essentielle du procédé selon l'invention est de former des particules, spontanément, par simple mélange à pHm d'une solution colloïdale de particules du premier polymère polyélectrolyte (PEl) chargées en principe actif (PA) et d'une solution ou d'une solution colloïdale du second polymère polyélectrolyte (PE2) de polarité opposée.
Les principes actifs tels que des protéines, des peptides ou des petites molécules, peuvent s'associer spontanément au premier polymère (PEl) de type polyaminoacides. Le chargement des nanoparticules du premier polymère polyélectrolyte (PEl) par le principe actif (PA) s'effectue par simple mélange d'une solution de principe actif (PA) avec une solution colloïdale du premier polymère polyélectrolyte (PEl). Cette association est purement physique et n'implique pas de création de liaison co val ente entre le principe actif (PA) et le polymère (PEl). Sans être lié par la théorie, on peut supposer que cette association non spécifique s'effectue par interaction hydrophobe et/ou électrostatique entre le polymère (PEl) et le principe actif (PA). Il est à noter qu'il n'est pas nécessaire, et souvent même non souhaitable, de lier le PA aux nanoparticules de PEl par des récepteurs spécifiques de nature peptidique ou de type antigène/anticorps ou encore enzyme/substrat. Dans un mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, il n'est pas prévu d'étape de réticulation chimique des particules obtenues. Les particules selon l'invention ne sont donc pas réticulées chimiquement et libèrent néanmoins le principe actif (PA) sur une durée prolongée. Cette absence de réticulation chimique est un avantage décisif des particules selon l'invention. En effet, l'absence de réticulation chimique permet d'éviter la dégradation chimique du principe actif (PA) lors de l'étape de réticulation des particules contenant le principe actif (PA). Une telle réticulation chimique est en effet généralement conduite par activations d'entités polymérisables et met en jeu des agents potentiellement dénaturants tel que les rayonnements UV, ou le glutaraldéhyde.
Avantageusement, le procédé selon l'invention comprend une étape de déshydratation de la suspension de particules obtenues (par exemple par lyophilisation ou atomisation), afin de les obtenir sous forme de poudre sèche.
Selon un autre de ses aspects, l'invention a pour objet une formulation pharmaceutique pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), comprenant une suspension aqueuse de particules telles que décrites ci-dessus ou celles obtenues par le procédé décrit ci-dessus.
La présente invention concerne également une formulation pharmaceutique solide pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), comprenant une forme poudre sèche:
• à base de particules contenant au moins un principe actif (PA), ces particules étant celles décrites ci-dessus ou celles obtenues par le procédé décrit ci-dessus;
• ou obtenue à partir de la formulation comprenant une suspension en solution aqueuse évoquée ci-dessus.
Avantageusement, une telle formulation pharmaceutique solide est utilisée pour inhalation et administration pulmonaire. Selon un autre de ses aspects, l'invention a pour objet un procédé de préparation de médicaments, en particulier pour administration parentérale, muqueuse, sous-cutanée, intramusculaire, intradermique, transdermique, intrapéritonéale, intracérébrale ou dans une tumeur, voire par voie orale, nasale, pulmonaire, vaginale ou oculaire, ledit procédé consistant essentiellement à mettre en œuvre au moins l'une des formulations décrites ci- dessus.
BRÈVE DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1: Libération in vitro d'IFN-α à partir des formulations de particules de l'exemple 2 (ronds blancs), de l'exemple 3.1 (triangles noirs), de l'exemple 3.2 (losanges noirs), de l'exemple 3.3 (carrés noirs), de l'exemple 4 (ronds noirs) et de l'exemple 5 (traits).
EXEMPLES
1) Synthèses:
a) Synthèse d'un polymère polyélectrolyte PEl-A porteur de groupements hydrophobes, anionique (polyglutamate greffé par l'alpha-tocophérol d'origine synthétique)
On solubilise 15 g d'un acide alpha- L-polyglutamique (de masse équivalente à environ 16900 Da par rapport à un standard en polyoxyéthylène et obtenu par polymérisation de NCA-GIuOMe suivie d'une hydrolyse comme décrits dans la demande de brevet FR-A-2 801 226) dans 288 ml de diméthylformamide (DMF) en chauffant à 80 0C jusqu'à solubilisation du polymère. On refroidit la solution à 15 0C et on ajoute successivement 2,5 g de D, L-alpha-tocophérol (> 98 % obtenu de Fluka®) préalablement solubilisé dans 8 ml de DMF, 280 mg de 4-diméthylaminopyridine préalablement solubilisée dans 1 ml de DMF et 1,6 g de diisopropylcarbodiimide préalablement solubilisé dans 6 ml de DMF. Après 3 h sous agitation, le milieu réactionnel est versé dans 1200 ml d'eau contenant 15 % de chlorure de sodium et d'acide chlorhydrique (pH = 2). Le polymère précipité est ensuite récupéré par filtration, lavé par de l'acide chlorhydrique 0,1 N, de l'eau et par de l'éther diisopropylique. Le polymère est ensuite séché à l'étuve sous vide à 40 0C. On obtient un rendement de l'ordre de 90 %. La masse molaire mesurée par la chromatographie d'exclusion stérique est de 15500 par rapport à un standard polyoxyéthylène. Le taux de tocophérol greffé, estimé par la spectroscopie RMN du proton, est de 5,1 % molaire.
b) Synthèse d'un polymère polyélectrolyte PEl-B anionique (polyglutamate de sodium)
On adapte la synthèse d'un acide alpha-L-polyglutamique comme décrit dans la demande de brevet FR- A-2 801 226. La masse molaire mesurée par la chromatographie d'exclusion stérique est de 16900 Da par rapport à un standard en polyoxyéthylène.
c) Synthèse d'un polymère polyélectrolyte PE2-A cationique (polyglutamate greffé par l'alpha-tocophérol d'origine synthétique et par de l'histidinamide)
Figure imgf000030_0001
Indices et groupements : m = 11 , p = 209, q = 0, T = D,L-alpha-tocophéryl (T)
3 g d'un poly(acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'alpha-tocophérol racémique sont solubilisés par chauffage à 80 0C dans 38 ml de NMP. À cette solution refroidie à 0 0C, sont ajoutés 2,74 g d'isobutyl chloroformiate puis 2,2 mL de N-méthyl morpholine. Le milieu réactionnel est agité 10 min en maintenant la température à 0 0C. En parallèle, 8,65 g du dichlorhydrate d'histidinamide sont suspendus dans 108 mL de NMP. 10,6 ml de triéthylamine sont ensuite ajoutés et la suspension obtenue est agitée à 20 0C pendant quelques minutes puis refroidie à 0 0C. On procède ensuite à l'ajout de la solution de polymère activé sur la suspension d'histidinamide. Le milieu réactionnel est agité pendant 2 h à 0 0C, puis 1 nuit à 20 0C. On ajoute ensuite 0,62 mL d'HCl 35 %, puis 83 mL d'eau. On verse ensuite la solution obtenue dans 500 mL d'eau à pH compris entre 3 et 4. La solution est ensuite diafiltrée contre 8 volumes d'eau salée (0,9% NaCl) et 4 volumes d'eau. La solution de polymère est ensuite concentrée jusqu'à un volume de 300 mL (la concentration en polymère est de 18 mg/g). Le pourcentage d'histidinamide greffée, déterminé par RMN 1H dans D2O est de 95 %.
d) Synthèse d'un polymère polyélectrolyte PE2-B cationique (polyglutamate greffé par l'alpha-tocophérol d'origine synthétique et par de l'arginine)
Figure imgf000031_0001
Indices et groupements : T = D,L-α-tocophéryl, p = s = 11 ,q = 198, r = O
Dix grammes d'un poly( acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'α-tocophérol racémique sont solubilisés dans 125 mL de NMP à 80 0C. Cette solution est refroidie à 0 0C, et 8,7 mL de chloroformiate d'ώo-butyle puis 7,35 mL de N-méthyl morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est agité 15 minutes à 0 0C. En parallèle, 24,67 g de dichlorhydrate d'argininamide sont suspendus dans 308 mL de NMP et 14,7 mL de triéthylamine sont ajoutés. La suspension obtenue est agitée quelques minutes à 20 0C puis refroidie à 0 0C. La suspension laiteuse de polymère activé est alors additionnée à cette suspension, et le mélange réactionnel est agité pendant 2 h à 0 0C, puis une nuit à 20 0C. Après ajout de 2,1 mL d'une solution d'HCl 35 % puis 10O mL d'eau, le mélange réactionnel est versé goutte à goutte dans 1,6 L d'eau. La solution obtenue est diafiltrée contre 8 volumes d'eau salée (0,9 %) puis 4 volumes d'eau, et concentrée jusqu'à un volume d'environ 250 mL. Le pourcentage d'argininamide greffée, déterminé par RMN du proton dans D2O, est de 90 %. e) Synthèse d'un polymère polyélectrolyte PE2-C cationique (polyglutamate greffé par l'alpha-tocophérol d'origine synthétique, de l'arginine et de l 'éthanolamine)
Figure imgf000032_0001
Indices et groupements : T = D,L-α-tocophérol, p = 11, q = 88, r = 99, s = 22
Dix grammes d'un poly( acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'α-tocophérol racémique sont solubilisés dans 125 mL de NMP à 80 0C. Cette solution est refroidie à 0 0C, et 9,1 mL de chloroformiate d'/so-butyle puis 7,71 mL de N-méthyl morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est agité 15 min à 0 0C. En parallèle, 8,2 g de dichlorhydrate d'argininamide sont suspendus dans 103 mL de NMP et 9,31 mL de triéthylamine sont ajoutés. On ajoute encore 1,6 mL d'éthanolamine, et la suspension obtenue est agitée quelques minutes à 20 0C puis refroidie à 0 °C. La suspension laiteuse de polymère activé est alors additionnée à cette suspension, et le mélange réactionnel est agité pendant 2 h à 0 0C. On ajoute 1,2 mL d'éthanolamine, puis agite une nuit à 20 0C. Après ajout de 2,1 mL d'une solution d'HCl 35 % puis 200 mL d'eau, le mélange réactionnel est versé goutte à goutte dans 700 mL d'eau, tout en ajustant le pH vers 7,4. La solution obtenue est diafiltrée contre 8 volumes d'eau salée (0,9 %) puis 4 volumes d'eau, et concentrée jusqu'à un volume d'environ 250 mL. Les pourcentages d'argininamide et d'éthanolamine greffées, déterminés par RMN du proton dans D2O, sont respectivement de 40 et 45 %. f) Synthèse d'un polymère polyélectrolyte PE2-D cationique (poly glutamate greffé par l'alpha-tocophérol d'origine synthétique, de l'arginine et de l'éthanolamine)
Figure imgf000033_0001
Indices et groupements : T = D,L-α-tocophérol, p = 11, q = 48, r = 150, s = 11
Dix grammes d'un poly( acide glutamique) de DP 220 greffé à 5 % de façon statistique avec de l'α-tocophérol racémique sont solubilisés dans 125 mL de NMP à 80 0C. Cette solution est refroidie à 0 0C, et 8,7 mL de chloroformiate d'/so-butyle puis 7,3 mL de N-méthyl morpholine sont ajoutés. Ce mélange réactionnel est agité 15 min à 0 0C. En parallèle, 4,61 g de dichlorhydrate d'argininamide sont suspendus dans 58 mL de NMP et 2,9 mL de triéthylamine sont ajoutés. On ajoute encore 2,8 mL d'éthanolamine, et la suspension obtenue est agitée quelques minutes à 20 0C puis refroidie à 0 0C. La suspension laiteuse de polymère activé est alors additionnée à cette suspension, et le mélange réactionnel est agité pendant 4 h à 0 0C. On ajoute 1,2 mL d'éthanolamine, puis agite une nuit à 20 0C. Après ajout de 2,1 mL d'une solution d'HCl 35 %, le mélange réactionnel est versé goutte à goutte dans 730 mL d'eau, tout en ajustant le pH vers 7,4. La solution obtenue est diaflltrée contre 8 volumes d'eau salée (0,9 %) puis 4 volumes d'eau, et concentrée jusqu'à un volume d'environ 300 mL. Les pourcentage d'argininamide et d'éthanolamine greffées, déterminés par RMN du proton dans D2O, sont respectivement de 22 et 68 %
2) Exemple 1 (comparatif): préparation de particules avec des polyélectrolytes ne présentant pas de groupement hydrophobe (1) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PEl-B:
On utilise le polymère PEl-B obtenu selon la synthèse b) ci-dessus. Ce polymère a un pH de demi-neutralisation égal à 5,985. Une solution colloïdale de polymère PEl-B est obtenue en le solubilisant dans l'eau en ajustant le pH à 7,63 par ajout d'une solution de NaOH. L'osmolarité de la solution est ajustée à 100 mOsm en introduisant la quantité nécessaire d'une solution aqueuse de NaCl. La concentration en polymère PEl-B est ajustée à 8,38 mg/g.
(2) Association de la protéine au polymère PEl-B:
On ajoute à la solution colloïdale de polymère PEl-B précédente de la protéine IFN-α concentrée à 2,4 mg/g. On obtient l'association ayant les caractéristiques suivantes :
Figure imgf000034_0001
L'association est réalisée pendant une nuit à 25 0C, sous agitation.
(3) Préparation d'une solution colloïdale de poly-L-arginine (Aldrich P7637):
Ce polymère a un pH de demi-neutralisation supérieur à 9. Une solution colloïdale de poly-L-arginine est obtenue en le solubilisant dans l'eau en ajustant premièrement le pH à 0,92 avec une solution de HCl, puis en le remontant à pH égal à 6,91 avec une solution de NaOH et en chauffant la solution à 45 0C pendant 15 min. La concentration en polymère poly-L-arginine est ajustée à 5,13 mg/g.
(4) Mélange pour obtenir les particules
On ajoute goutte à goutte sous agitation 1,37 g de la solution de poly-L-arginine sur 1,06 g de la solution de IFN-α/PEl-B, à 45 0C. On agite 15 min à 45 0C. Puis, on agite une nuit à 4 0C.
Le tableau I ci-dessous regroupe les caractéristiques des particules obtenues:
Le rapport de charge Z est le rapport du nombre de moles de groupements ionisés cationiques au nombre de moles de groupements ionisés anioniques, mesurés à pHm égal à 6,95. La taille des particules est mesurée selon le test T. Tableau I
Figure imgf000035_0001
(5) Quantification de l'encapsulation de la protéine
On centrifuge la suspension 15 min à 8000 rpm et on dose l'IFN-α dans le surnageant par la méthode décrite dans la Pharmacopée européenne (dosage colorimétrique par absorbance UV).
Figure imgf000035_0002
Presque un tiers de la protéine introduite n'est pas encapsulé dans les microparticules formées. Cette proportion ne peut conduire à une libération contrôlée.
3) Exemple 2 : préparation de particules avec un seul polyélectrolyte (PEl) présentant des groupements hydrophobes
(1) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PEl-A: On utilise le polymère PEl-A obtenu selon la synthèse a) ci-dessus. Ce polymère a un pH de demi-neutralisation égal à 5,445.
Une solution colloïdale de polymère PEl-A est obtenue en le solubilisant dans l'eau en ajustant le pH à 7,53 par ajout d'une solution de NaOH. L'osmolarité de la solution est ajustée à 101 mOsm en introduisant la quantité nécessaire d'une solution aqueuse de NaCl. La concentration en polymère PEl-B est ajustée à 8,41 mg/g.
(2) Association de la protéine au polymère PEl-A:
On ajoute à la solution colloïdale de polymère PEl-A précédente de la protéine IFN-α concentrée à 2,4 mg/g. On obtient l'association ayant les caractéristiques suivantes :
Figure imgf000035_0003
Figure imgf000036_0001
L'association est réalisée pendant une nuit à 25°C, sous agitation.
(3) Préparation d'une solution colloïdale de poly-L-arginine (Aldrich P7637): On prépare la solution de façon identique à celle décrite dans l'exemple 1.
(4) Mélange pour obtenir les particules
On ajoute goutte à goutte sous agitation 1,24 g de la solution de poly-L-arginine sur 1,07 g de la solution de IFN-α/PEl-A, à 45 0C. On agite 15 min à 45°C. Puis, on agite une nuit à 4 0C.
Le tableau II ci-dessous regroupe les caractéristiques des particules obtenues:
Le rapport de charge Z est mesuré à pHm égal à 6,88. La taille des particules est mesurée selon le test T.
Tableau II
Figure imgf000036_0002
(5) Quantification de Pencapsulation de la protéine
On centrifuge la suspension 15 min à 8000 rpm et on dose PIFN-α dans le surnageant par la méthode décrite dans la Pharmacopée européenne (dosage colorimétrique par absorbance UV).
Figure imgf000036_0003
La totalité de la protéine introduite est encapsulée dans les microparticules formées.
4) Exemple 3: préparation de particules à base de PEl-A et de PE2-A, contenant de l'IFN-a 4.1) Exemple 3.1 : concentration finale en polymère environ égale à 10 mg/g, Z étant égal à 1 environ
(1) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PEl-A:
On utilise le polymère PEl-A obtenu selon la synthèse a) ci-dessus. Ce polymère a un pH de demi-neutralisation égal à 5,445.
Une solution colloïdale de polymère PEl-A est obtenue en le solubilisant dans l'eau en ajustant le pH à 7,45 par ajout d'une solution de NaOH. L'osmolarité de la solution est ajustée à 108 mOsm en introduisant la quantité nécessaire d'une solution aqueuse de NaCl. La concentration en polymère PEl est ajustée à 23,88 mg/g.
(2) Association de la protéine au polymère PEl-A:
On ajoute à la solution colloïdale de polymère PEl-A précédente de la protéine IFN-α concentrée à 2,4 mg/g et du NaCl à 89 mOsm. On obtient l'association ayant les caractéristiques suivantes :
Figure imgf000037_0001
L'association est réalisée pendant une nuit à 25 0C, sous agitation. L'association est ensuite ajustée à pH égal à 5,07.
(3) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PE2-A:
On utilise le polymère PE2-A obtenu selon la synthèse c) ci-dessus. Ce polymère a un pH de demi-neutralisation égal à 6,05.
Une solution colloïdale de polymère PE2-A est obtenue en le solubilisant dans l'eau en ajustant le pH à 5,17. L'osmolarité de la solution est ajustée à 289 mOsm et la concentration en polymère PE2-A est ajustée à 5,70 mg/g.
(4) Mélange pour obtenir les particules
On ajoute goutte à goutte sous agitation 4,98 g de la solution de PE2-A sur 4,61 g de la solution de IFN-α/PEl-A. On agite une nuit à 4 0C.
Le tableau III ci-dessous regroupe les caractéristiques des particules obtenues:
Le rapport de charge Z est mesuré à pHm égal à 5,17. La taille des particules est mesurée selon le test T.
Tableau III
Figure imgf000038_0001
4.2) Exemple 3.2: concentration finale en polymère égale à 5 mg/g, Z étant égal à 10 environ
(1) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PEl-A :
On utilise le polymère PEl-A obtenu selon la synthèse a) ci-dessus. Une solution colloïdale de polymère PEl est obtenue en le solubilisant dans l'eau en ajustant le pH à 7,52 par ajout d'une solution de NaOH. L'osmolarité de la solution est ajustée à 108 mOsm en introduisant la quantité nécessaire d'une solution aqueuse de NaCl. La concentration en polymère PEl est ajustée à 20,21 mg/g.
(2) Association de la protéine au polymère PEl-A :
On ajoute à la solution colloïdale de polymère PEl-A précédente de la protéine IFN-α concentrée à 2,4 mg/g et du NaCl à 89 mOsm. On obtient l'association ayant les caractéristiques suivantes :
Figure imgf000038_0002
L'association est réalisée pendant une nuit à 25 0C, sous agitation. L'association est ensuite ajustée à pH égal à 4,88.
(3) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PE2-A : On utilise le polymère PE2-A obtenu selon la synthèse c) ci-dessus. Une solution colloïdale de polymère PE2-A est obtenue en le solubilisant dans l'eau en ajustant le pH à 5,07. L'osmolarité de la solution est ajustée à 287 mOsm et la concentration en polymère PE2-A est ajustée à 8,11 mg/g.
(4) Mélange pour obtenir les particules : On ajoute goutte à goutte sous agitation 5,19 g de la solution de PE2-A sur 5,02 g de la solution de IFN-α/PEl-A. On agite une nuit à 4 0C.
Le tableau IV ci-dessous regroupe les caractéristiques des particules obtenues:
Le rapport de charge Z est mesuré à pHm égal à 4,81. La taille des particules est mesurée selon le test T.
Tableau IV
Figure imgf000039_0001
4.3) Exemple 3.3: concentration finale en polymère égale à 10 mg/g, Z étant égal à 10 environ
(1) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PEl-A : On utilise le polymère PEl-A obtenu selon la synthèse a) ci-dessus.
Une solution colloïdale de polymère PEl-A est obtenue en le solubilisant dans l'eau en ajustant le pH à 7,52 par ajout d'une solution de NaOH. L'osmolarité de la solution est ajustée à 108 mOsm en introduisant la quantité nécessaire d'une solution aqueuse de NaCl. La concentration en polymère PEl-A est ajustée à 20,21 mg/g.
(2) Association de la protéine au polymère PEl-A :
On ajoute à la solution colloïdale de polymère PEl-A précédente de la protéine IFN-α concentrée à 2,4 mg/g et du NaCl à 89 mOsm. On obtient l'association ayant les caractéristiques suivantes :
Figure imgf000039_0002
L'association est réalisée pendant une nuit à 25 0C, sous agitation. L'association est ensuite ajustée à pH égal à 5,07.
(3) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PE2-A : On utilise le polymère PE2-A obtenu selon la synthèse c) ci-dessus. Une solution colloïdale de polymère PE2-A est obtenue en le solubilisant dans l'eau en ajustant le pH à 5,08. L'osmolarité de la solution est ajustée à 288 mOsm et la concentration en polymère PE2-A est ajustée à 16,37 mg/g.
(4) Mélange pour obtenir les particules :
On ajoute goutte à goutte sous agitation 5,25 g de la solution de PE2-A sur 5,19 g de la solution de IFN-α/PEl-A. On agite une nuit à 4 0C.
Le tableau V ci-dessous regroupe les caractéristiques des particules obtenues:
Le rapport de charge Z est mesuré à pHm égal à 4,95. La taille des particules est mesurée selon le test T.
Tableau V
Figure imgf000040_0001
S) Exemple 4 : préparation de particules à base de PEl-A et de PE2-B, contenant de
I 'IFN- a, concentration finale en polymère égale à 5 mg/g, Z = I
(1) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PEl-A : On utilise le polymère PEl-A obtenu selon la synthèse a) ci-dessus.
Une solution colloïdale de polymère PEl-A est obtenue en le solubilisant dans l'eau en ajustant le pH à 7,52 par ajout d'une solution de NaOH. L'osmolarité de la solution est ajustée à 108 mOsm en introduisant la quantité nécessaire d'une solution aqueuse de NaCl. La concentration en polymère PEl-A est ajustée à 20,21 mg/g.
(2) Association de la protéine au polymère PEl-A :
On ajoute à la solution colloïdale de polymère PEl-A précédente de la protéine IFN-α concentrée à 2,4 mg/g et du NaCl à 89 mOsm. On obtient l'association ayant les caractéristiques suivantes :
Figure imgf000040_0002
Figure imgf000041_0001
L'association est réalisée pendant une nuit à 25 0C, sous agitation. L'association est ensuite ajustée à pH égal à 6,89.
(3) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PE2-B :
On utilise le polymère PE2-B obtenu selon la synthèse d) ci-dessus. Ce polymère a un pH de neutralisation supérieur à 9.
Une solution colloïdale de polymère PE2-B est obtenue en le solubilisant dans l'eau en ajustant le pH à 6,98. L'osmolarité de la solution est ajustée à 288 mOsm et la concentration en polymère PE2-B est ajustée à 6,33 mg/g.
(4) Mélange pour obtenir les particules :
On ajoute goutte à goutte sous agitation 4,06 g de la solution de PE2-B sur 4,59 g de la solution de IFN-α/PEl-A. On agite une nuit à 4 0C.
Le tableau VI ci-dessous regroupe les caractéristiques des particules obtenues:
Le rapport de charge Z est mesuré à pHm égal à 6,85. La taille des particules est mesurée selon le test T.
Tableau VI
Figure imgf000041_0002
6) Exemple 5 (comparatif) : préparation de particules à base de PEl-A seul, contenant de VIFN a
On utilise le polymère PEl-A obtenu selon la synthèse a) ci-dessus. Une solution colloïdale de polymère PEl-A est obtenue en le solubilisant dans l'eau en ajustant le pH à 7,52 par ajout d'une solution de NaOH. L'osmolarité de la solution est ajustée à 108 mOsm en introduisant la quantité nécessaire d'une solution aqueuse de NaCl. La concentration en polymère PEl-A est ajustée à 29,05 mg/g.
On ajoute à la solution colloïdale de polymère PEl précédente de la protéine IFN-α concentrée à 2,4 mg/g. L'association est réalisée pendant une nuit à 25 0C, sous agitation. Le tableau VII ci-dessous regroupe les caractéristiques des particules obtenues: La taille des particules est mesurée selon le test T'.
Tableau VII
Figure imgf000042_0001
7) Résultats in vitro pour les exemples 2, 3, 4 et 5
Pour cela, on mesure la libération du principe actif à partir des particules selon l'invention en utilisant le test L.
La figure 1 montre la libération dans le test L sous la forme du pourcentage de protéine libérée au cours du temps.
La formulation de l'exemple comparatif 2 où un seul des polymères est porteur de groupements hydrophobes présente un profil de libération très faible, avec 1 ,6 % de la protéine libérée au bout de 23 h.
La formulation de l'exemple comparatif 5, contenant 23 mg/g de particules de PEl présente un profil similaire aux particules de l'exemple 3.1 (PE1/PE2-A, Z=I à 10 mg/g)
(respectivement 93 % en 10 h et 72 % en 48 h).
Dans le cas des particules des exemples 3.2 (PE1/PE2-A, Z = 10 et 5 mg/g) et 3.3
(PE1/PE2-A, Z = 10 et 10 mg/g), on observe la création d'un flux constant de libération, qui n'est pas nul à la fin de l'expérience : respectivement 65 et 19 % de la protéine injectée en 48 h.
Dans le cas des particules de l'exemple 4 (PE1/PE2-B, Z = 1 et 5 mg/g), on observe la création d'un flux constant de libération, qui n'est pas nul à la fin de l'expérience, avec une libération de 7 % de la protéine injectée en 48 h.
8) Résultats in vivo pour les exemples 3, 4 et 5
44 rats ont été séparés en 5 groupes de 8 ou 12 animaux et ont reçu en parallèle une formulation à libération immédiate IR ou une formulation à libération prolongée correspondant à l'exemple comparatif 5 ou une des formulations des exemples de l'invention 3 et 4, à la dose de 300 μg/kg. Les résultats pharmacocinétiques sont regroupés dans le tableau VIII ci-dessous:
Tableau VIII
Figure imgf000043_0001
Cmax représente la concentration plasmatique maximale moyenne en protéine sur l'ensemble des animaux.
Tmax médian représente la médiane du temps pour lequel la concentration plasmatique passe par son maximum. AUC représente l'aire moyenne sous la courbe de la concentration plasmatique en fonction du temps.
T50%AUC représente le temps moyen au bout duquel l'aire sous la courbe atteint 50 % de sa valeur totale.
RBA représente le rapport de l'aire sous la courbe de la formulation considérée à l'aire sous la courbe de la formulation IFN IR.
Toutes les formulations présentent un profil de libération prolongée accompagné d'une baisse du Cmax par rapport à l'IR.
A l'exception de la formulation de l'exemple 3.1 (PE1/PE2-A, Z=I à 10 mg/g) dont le profil de libération est proche de celle de la formulation de l'exemple comparatif 5, la pente terminale est plus faible, ce qui indique une absorption résiduelle prolongée.
On notera pour la formulation de l'exemple 3.3 (PE1/PE2-A, Z = 10 et 10 mg/g) une libération jusqu'à plus d'une semaine.
9) Exemple 6 : préparation de particules à base de PEl-A et de PE2-C, contenant de l'IFN-a, concentration finale en polymère égale à 5 mg/g, Z = I
(1) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PEl-A On utilise le polymère PEl-A obtenu selon la synthèse a) ci-dessus. Une solution colloïdale de polymère PEl-A est obtenue en le solubilisant dans l'eau en ajustant le pH à 7,15 par ajout d'une solution de NaOH. L'osmolarité de la solution est ajustée à 145 mOsm en introduisant la quantité nécessaire d'une solution aqueuse de NaCl. La concentration en polymère PEl-A est ajustée à 3,10 mg/g.
(2) Association de la protéine thérapeutique au polymère PEl-A : On ajoute à la solution colloïdale de polymère PEl-A précédente de la protéine IFN-α concentrée à 2,7 mg/g. On obtient l'association ayant les caractéristiques suivantes :
Figure imgf000044_0001
L'association est réalisée pendant une nuit à 25°C, sous agitation. L'association est ensuite ajustée à pH égal à 7,0.
(3) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PE2-C:
On utilise le polymère PE2-C obtenu selon la synthèse e) ci-dessus. Une solution colloïdale de polymère PE2-C est obtenue en diluant et en ajustant le polymère PE2-C à pH 7,04, 288 mOsm et 7,96 mg/g dans du PBS 140 mOsm.
(4) Mélange pour obtenir les particules :
On ajoute goutte à goutte sous agitation 15,147 g de la solution de PE2-C sur 16,374 g de la solution de IFN-α/PEl-A. On agite une nuit à 4 0C.
Le rapport de charge Z est mesuré à pHm égal à 7. La taille des particules est mesurée selon le test T. Le tableau ci-dessous regroupe les caractéristiques des particules obtenues :
Figure imgf000044_0002
10) Exemple 7 : préparation de particules à base de PEl-A et de PE2-D, contenant de l'IFN-a, concentration finale en polymère égale à 5 mg/g, Z = 1
(1) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PEl-A : On utilise le polymère PEl-A obtenu selon la synthèse a) ci-dessus. Une solution colloïdale de polymère PEl-A est obtenue en le solubilisant dans l'eau en ajustant le pH à 7,02 par ajout d'une solution de NaOH. L'osmolarité de la solution est ajustée à 101 mOsm en introduisant la quantité nécessaire d'une solution aqueuse de NaCl. La concentration en polymère PEl-A est ajustée à 2.0 mg/g.
(2) Association de la protéine au polymère PEl-A :
On ajoute à la solution colloïdale de polymère PEl-A précédente de la protéine IFN-α concentrée à 2,7 mg/g. On obtient l'association ayant les caractéristiques suivantes :
Figure imgf000045_0001
L'association est réalisée pendant une nuit à 25 0C, sous agitation. L'association est ensuite ajustée à pH égal à 7,0.
(3) Préparation d'une solution colloïdale de polymère PE2-D: On utilise le polymère PE2-D obtenu selon la synthèse f) ci-dessus. Une solution colloïdale de polymère PE2-D est obtenue en diluant le polymère PE2-D dans de l'eau et en ajustant à pH 7avec HCl 0,1 N ou NaOH 0,1 N. La concentration en polymère PE2-D est ajustée 8,82 mg/g.
(4) Mélange pour obtenir les particules :
On ajoute goutte à goutte sous agitation 1,2 g de la solution de PE2-D sur 1,2 g de la solution de IFN-α/PEl-A. On agite une nuit à 4 0C.
Le rapport de charge Z est mesuré à pHm égal à 7. La taille des particules est mesurée selon le test T. Le tableau ci-dessous regroupe les caractéristiques des particules obtenues :
Figure imgf000046_0001
11) Exemple 8 : (comparaison) vitesse de libération des particules à base PE1-A/PE2-D et de PE1-A/PE2-C contenant de l'IFN-a.
Les particules obtenues par les préparations décrites dans les exemples 6 et 7 ci-dessus sont comparées dans le test L de libération en cellule à flux continu décrit plus haut. Le tableau ci-dessous regroupe les résultats obtenus :
Figure imgf000046_0002
En conclusion, cet exemple montre qu'il est possible, notamment en sélectionnant un polymère cationique contenant plus ou moins de groupements neutres et/ou anioniques, de moduler la vitesse de libération du PA. Ainsi, à 12 h, la libération est de 9,5 % pour les microparticules obtenues à partir du polymère PE2-C et de 31 % pour les microparticules obtenues à partir du PE2-D.

Claims

REVENDICATIONS
1. Particules pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), caractérisées en ce qu'elles comprennent : a) un premier polymère polyélectrolyte (PEl), de préférence un alpha polyaminoacide linéaire, à l'état chargé, porteur de groupements hydrophobes (GH) latéraux, ledit premier polymère polyélectrolyte (PEl) formant spontanément dans l'eau une solution colloïdale de particules à au moins une valeur pHm du pH comprise entre 3 et 8 ; b) un second polymère polyélectrolyte (PE2), de préférence un alpha polyaminoacide linéaire, de polarité opposée à celle du premier polymère polyélectrolyte (PEl), ledit second polymère polyélectrolyte (PE2) formant dans l'eau une solution ou une solution colloïdale à au moins ladite valeur pHm du pH; à la condition que, si le premier polymère électrolyte (PEl) est un polyaminoacide, alors le second polymère polyélectrolyte (PE2) n'est ni la polylysine ni la polyéthylène imine ; c) au moins un principe actif (PA) associé de façon non covalente aux particules de la solution colloïdale du premier polymère polyélectrolyte (PEl) ; lesdites particules pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA) étant obtenues par mélange, à pH égal à pHm, du premier polymère polyélectrolyte (PEl) sous forme de solution colloïdale de particules associées au principe actif (PA) avec le second polymère polyélectrolyte (PE2) sous forme de solution ou de solution colloïdale.
2. Particules pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), caractérisées en ce qu'elles comprennent : a) un premier polymère polyélectrolyte (PEl), de préférence un alpha polyaminoacide linéaire, à l'état chargé, porteur de groupements hydrophobes (GH) latéraux, ledit premier polymère polyélectrolyte (PEl) formant spontanément dans l'eau une solution colloïdale de particules à au moins une valeur pHm du pH comprise entre 3 et 8 ; b) un second polymère polyélectrolyte (PE2), de préférence un alpha polyaminoacide linéaire, de polarité opposée à celle du premier polymère polyélectrolyte (PEl), porteur de groupements hydrophobes (GH) latéraux, ledit second polymère polyélectrolyte (PE2) formant dans l'eau une solution ou une solution colloïdale à au moins ladite valeur pHm du pH ; c) au moins un principe actif (PA) associé de façon non covalente aux particules de la solution colloïdale du premier polymère polyélectrolyte (PEl) ; lesdites particules pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA) étant obtenues par mélange, à pH égal à pHm, du premier polymère polyélectrolyte (PEl) sous forme de solution colloïdale de particules associées au principe actif (PA) avec le second polymère polyélectrolyte (PE2) sous forme de solution ou de solution colloïdale.
3. Particules selon la revendication 1 ou 2, caractérisées en ce que les premier et second polymères polyélectrolytes (PEl, PE2) sont des polyaminoacides, ou l'un de leurs sels pharmaceutiquement acceptables, dont la chaîne principale est formée par des résidus choisis dans le groupe des résidus aspartiques, des résidus glutamiques et de leurs combinaisons, au moins une partie de ces résidus étant modifiée par greffage d'au moins un groupement hydrophobe (GH) pour au moins le premier polymère polyélectrolyte (PEl).
4. Particules selon la revendication 3, caractérisées en ce que l'un des polymères polyélectrolytes (PEl, PE2), ou l'un de leurs sels pharmaceutiquement acceptables, répond à la formule (I) suivante :
[G
Figure imgf000048_0001
(I) dans laquelle :
R1 représente H, un alkyle linéaire en C2 à Cio ou ramifié en C3 à Qo, un benzyle, -R4-[GH], ou R1 forme avec NH un résidu acide aminé terminal; R2 représente H, un acyle linéaire en C2 à Qo ou ramifié en C3 à C1O, un pyroglutamate ou -R4-[GH] ;
R4 représente une liaison directe ou un "espaceur" à base de 1 à 4 résidus acide aminé ;
A et A représentent indépendamment -CH2- ou -CH2-CH2-; n/(n+m) est défini comme le taux de greffage molaire et sa valeur est suffisamment basse pour que le polymère mis en solution dans l'eau à pH 7 et à 25 0C, forme une suspension colloïdale de particules de polymère; n + m varie de 10 à 1000, de préférence entre 50 et 300 ; GH représente un groupement hydrophobe comportant 6 à 30 atomes de carbone ou est sélectionné dans le groupe de radicaux suivants : (i) les alkyles, les acyles ou les alcényles linéaires ou ramifiés, de préférence linéaires en C1-C20 et, plus préférentiellement encore en C2-C 18 ;
(ii) les groupements hydrocarbonés contenant un ou plusieurs hétéroatomes, de préférence ceux contenant de l'oxygène et/ou du soufre et, plus préférentiellement encore, ceux de formule suivante:
H . H
-^C- -^CHI-I20CCH*- Ç— CH2OR1
R 60 R, 61
dans laquelle:
R6O est un radical alkyle, acyle ou alcényle linéaire ou ramifié, de préférence linéaire en C1-C20 et, plus préférentiellement encore en C2-CiS,
R6I et R62 sont identiques ou différents entre eux et correspondent à l'hydrogène ou à un radical alkyle, acyle ou alcényle linéaire ou ramifié, de préférence linéaire en Ci-C20 et, plus préférentiellement encore en C2-Ci8, - q= l à lOO ;
(iii) les aryles, les aralkyles ou les alkylaryles, de préférence les aryles;
(iv) les dérivés hydrophobes, de préférence, le radical phosphatidyl-éthanolamino- ou les radicaux choisis parmi octyloxy-, dodécyloxy-, tétradécyloxy-, hexadécyloxy-, octadécyloxy-, 9- octadecenyloxy-, tocophéryloxy- ou cholestéryloxy-.
5. Particules selon la revendication 3, caractérisées en ce que le polymère polyélectrolyte PE2, ou l'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables, répond à l'une des formules (II), (III) et (IV) suivantes :
Figure imgf000049_0001
Figure imgf000050_0001
dans lesquelles :
• GH représente un groupement hydrophobe comportant 6 à 30 atomes de carbone;
• R30 est un alkyle linéaire en C2 à C6 ;
" R50 est un alkyle, un dialcoxy ou un diamino en C2 à C6 ;
• R4 représente une liaison directe ou un "espaceur" à base de 1 à 4 résidus acide aminé ;
" A1 et A2 représentent indépendamment un -CH2- ou -CH2-CH2- ;
• n' + m' ou n"est défini comme le degré de polymérisation et varie de 10 à 1000, de préférence entre 50 et 300.
6. Particules selon la revendication 3, caractérisées en ce que l'un des polymères polyélectrolytes (PEl, PE2), ou l'un de leurs sels pharmaceutiquement acceptables, répond à la formule (V) suivante :
Figure imgf000050_0002
dans laquelle :
" E- représente indépendamment : un -NHR dans lequel R représente un H, un alkyle linéaire en C2 à C 10 ou ramifié en C3 à C 10 ou un benzyle, un résidu acide aminé ou un dérivé d'acide aminé terminal de formule :
H -NH — C COR7
dans laquelle R7 est OH, OR9 ou NHR10, et R8, R9 et R10 représentent indépendamment H, un alkyle linéaire en C2 à Cio ou ramifié en C3 à C io ou un benzyle;
• B est une liaison directe ou un groupement de liaison divalent, trivalent ou tétravalent, de préférence choisi parmi les radicaux suivants :
-O-, -NH-, -N(C i_5 alkyle)-, un résidu d'acide aminé (de préférence naturel), de diol, de triol, de diamine, de triamine, d'aminoalcool ou d'hydroxyacide comportant de 1 à 6 atomes de carbone ;
• D représente un H, un acyle linéaire en C2 à C io, un acyle ramifié en C3 à Cio, ou un pyroglutamate ;
" GH représente un groupement hydrophobe comportant 6 à 30 atomes de carbone ;
• R70 représente un radical choisi dans le groupe suivant :
-NH-(CH2)W-NH3 + avec w compris entre 2 et 6, et de préférence w est égal à 4,
- -NH-(CH2)4-NH-C(=NH)-NH3 +,
- -O-(CH2)2-NH3 +,
- -O-(CH2)2-N+(CH3)3,
où
Figure imgf000051_0001
un ester d'alkyle (de préférence -COOMe et -COOEt), -CH2OH, -C(≈O)-NH2, -C(=O)-NH-CH3 ou -C(=O)-N(CH3)2 ; un résidu d'acide aminé ou dérivé d'acide aminé de formule :
Figure imgf000052_0001
dans laquelle :
X est un atome d'oxygène ou -NH-, R12 est H, alkyle linéaire en C2 à Cio, alkyle ramifié en C3 à C1O ou benzyle,
R13 est -(CH2)4NH3 +, -(CH2)3NH-C(=NH)-NH3 +, -(CH2)3NH3 +; le contre-anion de R est un chlorure, un sulfate, un phosphate ou un acétate, de préférence un chlorure ; " R90 représente un hydroxyéthylamino-, un résidu d'alkylène glycol ou un polyoxyalkylène ;
• p, q, r et s sont des entiers positifs ;
" (p)/(p+cl+r+s) est défini comme le taux de greffage molaire des groupements hydrophobes GH varie de 2 à 99 % molaire, et de préférence entre 5 et 50 % sous condition que chaque chaîne de copolymère possède en moyenne au moins 3 greffons hydrophobes;
• (q)/(p+q+r+s) est défini comme le taux de greffage molaire des groupements cationiques et varie de 1 à 99 % molaire ;
" (p+q+r+s) varie de 10 à 1000, de préférence entre 30 et 500 ; " (r)/(p+q+r+s) varie de 0 à 98 % molaire;
• (s)/(p+q+r+s) varie de 0 à 98 % molaire.
7. Particules selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisées en ce qquuee lle R ou B représentent une liaison directe.
8. Particules selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisées en ce que tout ou partie des groupements hydrophobes (GH) sont choisis de façon indépendante dans le groupe de radicaux suivant :
" un alcoxy linéaire ou ramifié comportant de 6 à 30 atomes de carbone et pouvant comporter au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S) et/ou au moins une insaturation,
• un alcoxy comportant 6 à 30 atomes de carbone et ayant un ou plusieurs carbocycles annelés et contenant éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S), • un alcoxyaryle ou un aryloxyalkyle de 7 à 30 atomes de carbone et pouvant comporter au moins une insaturation et/ou au moins un hétéro- atome (de préférence O et/ou N et/ou S).
9. Particules selon l'une quelconque des revendications 4 à 8, caractérisées en ce que les groupements hydrophobes (GH) représentent chacun indépendamment les uns des autres un radical monovalent de formule suivante :
Figure imgf000053_0001
(GH) dans laquelle :
- R5 représente un méthyle (alanine), isopropyle (valine), isobutyle (leucine), secbutyle (isoleucine), benzyle (phénylalanine) ;
- R6 représente un radical hydrophobe comportant de 6 à 30 atomes de carbone; - 1 varie de 0 à 6.
10. Particules selon la revendication 9, caractérisées en ce que tout ou partie des radicaux hydrophobes R6 des groupements hydrophobes (GH) sont choisis de façon indépendante dans le groupe de radicaux suivant : " un alcoxy linéaire ou ramifié comportant de 6 à 30 atomes de carbone et pouvant comporter au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S) et/ou au moins une insaturation,
" un alcoxy comportant 6 à 30 atomes de carbone et ayant un ou plusieurs carbocycles annelés et contenant éventuellement au moins une insatu- ration et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S),
" un alcoxyaryle ou un aryloxyalkyle de 7 à 30 atomes de carbone et pouvant comporter au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S).
11. Particules selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisées en ce que le polymère PEl ou PE2 comprend simultanément : - de 15 à 50 % molaire de monomères glutamate ; de 20 à 55 % molaire de monomères non ionisables tels que des groupements substitués par un radical hydroxyéthylamino- ; de 10 à 40 % molaire de monomères porteurs de groupements cationiques de pH de neutralisation supérieur à 8 ; de 3 à 15 % molaire de monomères non ionisables substitués par un groupement hydrophobe.
12. Particules selon la revendication 11, caractérisées en ce que le polymère PEl ou PE2 est cationique et comprend simultanément : de 0 à 5 % molaire de monomères glutamate ; de 50 à 85 % molaire de monomères non ionisables tels que des groupements substitués par un radical hydroxyéthylamino- ; de 10 à 40 % molaire de monomères porteurs de groupements cationiques de pH de neutralisation supérieur à 8 ; de 3 à 15 % molaire de monomères non ionisables substitués par un groupement hydrophobe.
13. Particules selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisées en ce qu'elles présentent, à pH physiologique, une taille, mesurée dans un test T, comprise entre 1 et 100 microns.
14. Particules selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisées en ce qu'elles présentent, à pH physiologique, une densité apparente comprise entre 0,15 et 1,1.
15. Procédé de préparation de particules pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), ces particules étant en particulier selon l'une quelconque des revendications 1 et 3 à 14, comprenant les étapes suivantes:
1) la préparation, à une valeur pHm du pH comprise entre 3 et 8, d'une solution colloïdale aqueuse d'un premier polymère polyélectrolyte (PEl) à l'état chargé, porteur de groupements hydrophobes (GH) latéraux, ledit premier polymère polyélectrolyte (PEl) étant capable de former spontanément dans l'eau une solution colloïdale de particules à au moins une valeur, pHm, du pH comprise entre 3 et 8;
2) l'ajout d'au moins un principe actif (PA) au premier polymère polyélectrolyte (PEl) obtenu à l'étape 1, ledit principe actif s'associant de façon non co val ente aux particules de la solution colloïdale dudit premier polymère polyélectrolyte (PEl);
3) la préparation d'un second polymère polyélectrolyte (PE2) de polarité opposée à celle du premier polymère polyélectrolyte (PEl), ledit second polymère polyélectrolyte (PE2) formant dans l'eau une solution ou une solution colloïdale à au moins ladite valeur pHm du pH, à la condition que, si le premier polymère électrolyte (PEl) est un polyaminoacide, alors le second polymère polyélectrolyte (PE2) n'est ni la polylysine ni la polyéthylène imine;
4) le mélange, à pH égal à pHm, du premier polymère polyélectrolyte (PEl) sous forme de solution colloïdale de particules auxquelles est associé le principe actif (PA) obtenu à l'étape 2) avec le second polymère polyélectrolyte (PE2) sous forme de solution ou de solution colloïdale obtenu à l'étape 3).
16. Procédé de préparation de particules pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), ces particules étant en particulier selon l'une quelconque des revendications 2 à 12, comprenant les étapes suivantes: 1) la préparation, à une valeur pHm du pH comprise entre 3 et 8, d'une solution colloïdale aqueuse d'un premier polymère polyélectrolyte (PEl) à l'état chargé, porteur de groupements hydrophobes (GH) latéraux, ledit premier polymère polyélectrolyte (PEl) étant capable de former spontanément dans l'eau une solution colloïdale de particules à au moins une valeur, pHm, du pH comprise entre 3 et 8;
2) l'ajout d'au moins un principe actif (PA) au premier polymère polyélectrolyte (PEl) obtenu à l'étape 1, ledit principe actif s'associant de façon non covalente aux particules de la solution colloïdale dudit premier polymère polyélectrolyte (PEl); 3) la préparation d'un second polymère polyélectrolyte (PE2) de polarité opposée à celle du premier polymère polyélectrolyte (PEl), porteur de groupements hydrophobes (GH) latéraux, ledit second polymère polyélectrolyte (PE2) formant dans l'eau une solution ou une solution colloïdale à au moins ladite valeur pHm du pH; 4) le mélange, à pH égal à pHm, du premier polymère polyélectrolyte (PEl) sous forme de solution colloïdale de particules auxquelles est associé le principe actif (PA) obtenu à l'étape 2) avec le second polymère polyélectrolyte (PE2) sous forme de solution ou de solution colloïdale obtenu à l'étape 3).
17. Formulation pharmaceutique pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), caractérisée en ce qu'elle comprend une suspension aqueuse de particules selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 ou celles obtenues par le procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 16.
18. Formulation pharmaceutique solide pour la libération prolongée d'au moins un principe actif (PA), caractérisée en ce qu'elle comprend une forme poudre sèche:
• à base de particules contenant au moins un principe actif (PA), ces particules étant celles selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 ou celles obtenues par le procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 16 ;
• ou obtenue à partir de la formulation selon la revendication 17.
19. Procédé de préparation de médicaments, en particulier pour administration parentérale, muqueuse, sous-cutanée, intramusculaire, intradermique, transdermique intrapéritonéale, intracérébrale ou dans une tumeur, voire par voie orale, nasale, pulmonaire, vaginale ou oculaire, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à mettre en œuvre au moins une formulation selon l'une quelconque des revendications 17 ou 18.
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