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WO2008034876A1 - Verfahren zur erhöhung der pathogenresistenz in transgenen pflanzen - Google Patents

Verfahren zur erhöhung der pathogenresistenz in transgenen pflanzen Download PDF

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Publication number
WO2008034876A1
WO2008034876A1 PCT/EP2007/059961 EP2007059961W WO2008034876A1 WO 2008034876 A1 WO2008034876 A1 WO 2008034876A1 EP 2007059961 W EP2007059961 W EP 2007059961W WO 2008034876 A1 WO2008034876 A1 WO 2008034876A1
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WO
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nucleic acid
sequence
plant
sequences
seq
Prior art date
Application number
PCT/EP2007/059961
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Markus Frank
John-Bryan Speakman
Maria Scherer
Margareta Melander
Original Assignee
Basf Plant Science Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Basf Plant Science Gmbh filed Critical Basf Plant Science Gmbh
Publication of WO2008034876A1 publication Critical patent/WO2008034876A1/de

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance

Definitions

  • the present invention relates to a method for increasing the pathogen resistance in plants and / or plant cells, wherein the content of Rpi-blbl and Rpi-blb2 in the plants and / or plant cells is increased compared to the starting plants.
  • Plant diseases caused by various pathogens e.g. Viruses, bacteria and fungi can be, when cultivating crops to considerable
  • A represents the potato (Sdanum tuberosum) with an annual production of over 310 million tons on an acreage of more than 19 million hectares. This puts the potato fourth after wheat, rice and maize, and plays an extremely important role in the world Nutrition of the population Like all other crops, eg barley (H ⁇ rdeum vulgare), corn (Zea mays L. subsp. Mays) or wheat (Triticum L.), the potato plants are threatened by a variety of pathogens, such as viruses (including potato leaf virus, potato). Virus Y, potato virus A, TMV), bacteria (including Erwinia, Ralstcnia) and fungi (including Rhizoctcnia, Fusarium, Alternaria, Botryris).
  • the pathogen causing the most prevalent and serious disease of potato plants is the Oomycet Phytophthcra infestans
  • P. infestans causes the so-called late blight, a disease that is widespread worldwide and in some areas is considered a limiting factor in potato production.
  • an annual occurrence of the disease can be expected.
  • the average annual losses are estimated at 8% - 10% of the total harvest.
  • In the UK in wet years, even a crop loss of up to 16% occur.
  • Undisturbed epidemic spread of P. infestans can result in crop reductions of up to 70%.
  • Such losses have led to devastating famines in the past, such as in the middle of the nineteenth century to the famine in Ireland, which claimed over one million lives, or to the "turnip winter" of 1916/1917 in Germany.
  • the first symptoms of P. infestans infection are small yellowish or dark green hedges, especially on the leaf margin, which turn dark brown to black during the course of the disease and spread over the entire plant.
  • whitish gray mycelium fluff forms in the further course of the disease, a dry rot occurs, which can ultimately lead to the death of the entire potato plant.
  • fungicides are used extensively in agriculture to control fungal diseases.
  • the control of P. infestansrr ⁇ t chemical fungicides, eg with protective dithiocarbamates or organotin fentin hydroxide, or the heavy metal copper in organic farming is complex and expensive and can be a burden on the environment
  • Resistance is the ability of a plant to prevent or at least limit infestation and colonization by a pest
  • race-specific resistance which is also called host resistance
  • incompatible interaction leads to the interaction of a virulent pathogen with a susceptible plant.
  • the pathogen survives and can form propagation structures, while the host dies.
  • an incompatible interaction is said to be when the pathogen infects the plant, but is inhibited in its growth before or after a weak symptom severity. In this case, the plant is resistant to the pathogen in question.
  • a host defense response to the pathogen occurs.
  • Non-host resistance refers to the phenomenon that a pathogen in a particular plant species can cause disease in one However, other genetically similar plant species do not (Heath (2002) Can. J. Plant Pathol. 24: 259-264).
  • nonspecifically induced or preformed resistance can also be a barrier Preventing Infection by a Pathogen Preventing the Formation of Infectious Structures This resistance is called basic resistance or race-nonspecific resistance and is maintained by passive and active mechanisms of defense.
  • R genes resistance genes
  • Rpi-blbl resistance gene
  • Rpi-blb2 resistance gene that conferring resistance to fungal pathogens.
  • Rpi-blb2 the positional cloning of the resistance gene Rpi-blbl
  • Rpi-blb2 another resistance gene, Rpi-blb2 was cloned, which, like Rpi-blbl, mediates broad resistance to P. infestans (van der Vossen et al. (2005) The Plant Journal 44 (2): 208-222).
  • Rpi-blbl and Rpi-blb2 racial specificity has not yet been observed.
  • the present invention therefore relates to a method for increasing the pathogen resistance, in particular fungal resistance, in transgenic plants, in particular potato plants, wherein the content of the proteins encoded by the R genes Rpi-blbl and Rpi-blb2 proteins is increased compared to the corresponding starting plant.
  • the present invention is therefore a method for increasing the pathogen resistance in plants and / or plant cells, wherein in the
  • Plant / plant cells the content of Rpi-blbl, encoded by a nucleic acid sequence selected from the group consisting of a) nucleic acid sequences comprising nucleotide sequences, the sequence according to
  • SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 1 or fragments of these sequences
  • SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 1 have a sequence identity of at least 60%, and / or d) nucleic acid sequences comprising nucleotide sequences which are under stringent
  • SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 3 or fragments of these sequences include b) nucleic acid sequences comprising nucleotide sequences which code for a protein having the amino acid sequence or fragments thereof given in SEQ ID NO: 4, c) nucleic acid sequences comprising nucleotide sequences which have a sequence identity to the nucleotide sequence given in SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 3 have at least 60%, and / or d) nucleic acid sequences comprising nucleotide sequences which hybridize under stringent conditions with a complementary strand of a nucleotide sequence of a) to c) is increased compared to the starting plant
  • “Resistance” means preventing, repressing, attenuating or attenuating disease symptoms of a plant that occur as a result of infestation by a pathogen.
  • the symptoms may be of a variety of types, but preferably include those directly or indirectly affecting the quality of the plant , the quantity of yield, the suitability for use as feed or food or even make sowing, cultivation, harvesting or processing of the crop more difficult
  • the following disease symptoms are attenuated, reduced or prevented: formation of pustules and spore beds on the surfaces of the affected tissues, maceration of the tissues, spreading necrosis of the tissue and / or accumulation of mycotoxins
  • An “increased pathogen resistance” means that the defense mechanisms of a particular plant or in a part of a plant, eg in an organ, a tissue, a cell or an organelle, by applying the method according to the invention compared to a suitable control, for example the wild type of the plant ( “control plant” “Starting plant”), to which the erfindmgsdorfe method was not applied under otherwise identical conditions (such as climatic or growing conditions, pathogen species, etc.) has increased resistance to one or more pathogens.
  • the term “increased resistance” or “increase in resistance” means that the plants or plant cells according to the invention are less frequently and / or less frequently attacked by pathogens.
  • the infestation with pathogens is preferably at least a factor of 2, particularly preferred reduced by at least a factor of 3, particularly preferably at least by a factor of 5 and most preferably by at least a factor of 10.
  • the term “increased resistance” also includes a so-called transient resistance, ie that the transgenic plants or Plant cells have increased resistance to the corresponding wild type only for a limited period of time.
  • pathogens may be any pathogen that usually infests plants, eg viruses, bacteria and / or fungi, and whose interactions with a plant lead to the symptoms of the illness described above.
  • the pathogens are preferably fungal pathogens ,
  • the fungal pathogens, fungal pathogens or fungal pathogens may be any fungal pathogen normally affecting the wild type plant, preferably the infestator of the late blight P. infestans, Phytophthara sojae, Phytophthara erythrospetica, Phytcphthora racreum, Phytophthora paraätica or Percncsp ⁇ ra tabaciana or Hyalopercnospcra paraätica.
  • Rpi-blbl nucleic acid sequence or "Rpi-blbl gene”, as used herein, is understood as meaning a nucleic acid sequence selected from the group consisting of a) nucleic acid sequences comprising nucleotide sequences which have the sequence according to SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 1 or fragments of these sequences, b) nucleic acid sequences comprising nucleotide sequences which code for a protein having the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 2, or fragments thereof, c) nucleic acid sequences comprising nucleotide sequences which correspond to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 1 have a sequence identity of at least 60%, and / or d) nucleic acid sequences comprising nucleotide sequences which hybridize under stringent conditions with a complementary strand of a nucleotide sequence of a) to c).
  • nucleic acid molecules used in the method for example a nucleic acid molecule having a nucleotide sequence of SEQ ID no. 1, 3, 5 or 6 or a part thereof, can be isolated using standard molecular biology techniques and the sequence information provided here. Also, by means of Vergldchsalgorithmen, as for example on the NCBI homepage at http: //www.ncbi.nlm For example, a homologous sequence or homologous, conserved sequence regions may be identified at the DNA or amino acid level.
  • Essential portions of this sequence or the entire homologous sequence may be used as a hybridization probe using standard hybridization techniques (such as described in Sambrook et al ., vide supra) to isolate further nucleic acid sequences from other organisms useful in the method of screening of cDNA and / or genonic libraries. 1, 3, 5 or 6 or a part thereof, by polymerase chain reaction using oligonucleotide primers based on the sequences given herein or parts thereof (eg, a nucleic acid molecule comprising the complete or part thereof by polymerase chain reaction using isolated from OKgonukleotidprimern, which have been created on the basis of this same sequence).
  • mRNA can be isolated from cells (eg, by the guanidinium-thccyanate extraction method of Chirgwin et al., (1979) Biochemistry 18: 5294-5299) and recovered therefrom by reverse transcriptase (eg, Moloney's method).
  • reverse transcriptase eg, Moloney's method.
  • MLV reverse transcriptase available from Gibco / BRL, Bethesda, MD or AMV reverse transcriptase, available from SeLkagaku America, Inc., St. Russia FL).
  • Synthetic OKgpnukleotidprimer for amplification by means of polymerase chain reaction can be based on the in SEQ ID NO. 1, 3, 5 or 6, or with the aid of the amino acid sequence shown in SEQ ID No.2 or 4.
  • a nucleic acid of the invention may be amplified using cDNA or alternatively genomic DNA as template and appropriate OHgonuldeotidprimern by standard PCR amplification techniques.
  • the thus amplified nucleic acid can be cloned into a suitable vector and characterized by DNA sequence analysis.
  • Oligonucleotides corresponding to a nucleotide sequence encoding a protein of the invention may be prepared by standard synthetic methods, for example, with an automated DNA synthesizer.
  • sequence identity between two nucleic acid sequences means the identity of the nucleic acid sequence over the respective entire sequence length, in a preferred embodiment over the entire expressed sequence length, preferably cDNA, even more preferably the coding sequence, preferably CDS, understood by comparison using the program guide GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA; Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res.25: 3389a) using the following parameters
  • Gap W ⁇ ght 50 Length W ⁇ ght: 3
  • Average Match 10 Average Mismatch: 0
  • the present invention relates to nucleic acid sequences corresponding to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 1, 3, 5 or 6, a sequence identity of at least 60%, preferably at least 65, 70, 75 or 80%, more preferably at least 82, 84, 86, 88 or 90% and most preferably at least 92, 94 , 96, 98 or 99%
  • identity between two proteins is meant the identity of the amino acids over a particular protein region, preferably the entire protein length, in particular the identity, by comparison with the aid of software, eg the Lasergene software from DNA Star Inc., Madison, Wisconsin (USA) using the CLUST AL method (Higgins et al., (1989) Comput. Appl. Biosci 5 (2): 151).) Homologies can also be calculated using the laser gene software of DNA Star Inc., Madison , Wisconsin (USA) using the CLUST AL method (Higgins et al., (1989) Comput. Appl. Biosci.5 (2): 151)
  • the term "identity between two proteins” is understood to mean the identity of the amino acid sequence over the entire sequence length as determined by comparison with the aid of the program algorithm GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) Setting the following parameters is calculated Gap Weight: 8 Length Weight: 2
  • Another object of the present invention nucleic acid molecules which hybridize under stringent conditions with a complementary strand of a nucleic acid sequence encoding Rpl-blbl or Rpi-blb2 or functionally equivalent parts thereof.
  • stringent conditions thus refers to conditions under which a nucleic acid sequence prefentially binds to a target sequence, but not or at least substantially reduced to other sequences.
  • stringent conditions depend on circumstances Longer sequences hybridize specifically at higher temperatures Generally, stringent conditions are chosen such that the hybridization temperature is about 5X1 below the melting point (Tm) for the specific sequence at a defined ionic strength and pH. Tm is the temperature (at a defined pH, defined ionic strength and nucleic acid concentration) at which 50% of the molecules complementary to a target sequence are with it Target sequence hybridizes Typically, stringent conditions comprise salt concentrations between 0.01 and 1.0 M sodium ions (or other salt) and a pH between 7.0 and 83-, the temperature is at least 30 9 C for short molecules (for example, those between 10 to 50 nucleotides). In addition, stringent conditions may include the addition of destabilizing agents such as formamide. Typical hybridization and washing buffers have the following composition
  • Nucleic acid sequences which deviate from the nucleic acid sequence given in SEQ ID No. 3, 5 or 6 can be prepared, for example, by introducing one or more nucleotide substitutions, additions or deletions into a nucleotide sequence of SEQ ID No.1, 3, 5 or 6 are produced, so that proteins are formed, in which one or more amino acid substitutions, additions or deletions have been introduced in relation to the sequence indicated in SEQ ID No.2 or 4. Mutations can be inserted into the sequence of SEQ ID no. 1, 3, 5 or 6 are introduced by standard techniques, such as site-directed mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis.
  • nucleic acid sequences for Rpi-blbl or Rpi-blb2 with the SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 3, meaning the expression of which leads to proteins having the resistance-conferring properties of the proteins Rpi-blbl and Rpi-blb2, as well as protein fragments which have the resistance-conferring properties of the complete Rpi-blbl and Rpi-blb2 proteins according to SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4, respectively
  • the above-mentioned nucleic acid sequences coding for Rpi-blbl or Rpi-blb2 or functionally equivalent parts or fragments thereof can be used to produce transgenic plants with an increased content of Rp-blbl and Rpi-blb
  • the increase of the pathogen resistance according to the invention can also be achieved by manipulating the expression of the plant's own endogenous proteins which are correspondingly manipulated to the proteins used according to the invention.
  • This manipulation of protein expression can be achieved, for example, by altering the promoter-DNA sequence of one or both proteins
  • Such a change, which results in an altered, preferably increased expression rate of the endogenous gene according to the invention can be achieved by deletion or insertion of DNA sequences.
  • a change in the promoter sequence of endogenous genes according to the invention generally leads to a Alteration, preferably increase, of the expressed amount of the gene and thus to a preferably increased, content of the protein (s).
  • a further possibility for increasing the activity and the content of the endogenous proteins according to the invention consists in transcription factors involved in the transcription of the corresponding endogenous gene, eg by overexpression.
  • the measures for the overexpression of transcription factors are known to the person skilled in the art and are also within the scope of the present invention Invention for proteins of the invention.
  • an increased expression of an endogenous gene according to the invention can be achieved in that a regulatory protein which does not occur in the non-transformed organism interacts with the promoter of these genes.
  • a regulator may be a chimeric protein consisting of a DNA binding domain and a transcriptional activator domain, such as
  • a genetic control sequence functionally linked to the rri-blbl and / or the rpi-blb2 nucleic acid sequence, for example a promoter, or
  • Natural genetic environment means the natural chromosomal locus in the source organism or presence in a genomic library.
  • the natural genetic environment of the nucleic acid sequence is preferably at least partially conserved.
  • the environment flanks the Nucleic acid sequence at least on one side and has a sequence length of at least 50 bp, preferably at least 500 bp, more preferably at least 1000 bp, most preferably at least 5000 bp.
  • the present invention thus generally relates to methods for increasing the pathogen resistance in plants or plant cells, in which the content of Rpi-blbl and at the same time Rpi-blb2 is increased in the plants compared to the starting plant.
  • all the above-mentioned nucleic acid sequences and fragments thereof can be used, which for Rpi-blbl proteins or Rpi-blb2 proteins that confer increased pathogen resistance when overexpressed in transgenic potato plants
  • a significant increase in the content of both Rpi-blbl and Rpi-blb2 in the plant or plant cell is brought about compared to the wild-type plant.
  • the content of the plant or plant cells to Rpi-blbl and Rpi-blb2 may be determined by molecular biology techniques known to those skilled in the art. These include, but are not limited to, Northern blot or RT-PCR analyzes for specific detection of the RNA or Western Blot analyzes for detection of the protein.
  • an "initial plant or plant cell” is understood to mean an organism to which the method according to the invention has not been applied and which therefore contains an unincorporated content of rpi-blbl and / or rpi-blb2.
  • the starting plant is a non-genetically modified organism.
  • the method according to the invention comprises the production of transgenic plants and / or plant cells by the following steps:
  • A) preparing a recombinant nucleic acid molecule comprising i) a plant-functional promoter sequence and operably linked thereto a first nucleic acid sequence selected from the group consisting of a) nucleic acid sequences comprising nucleotide sequences comprising the sequence according to SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 1 or fragments b) nucleic acid sequences comprising nucleotide sequences which code for a protein having the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 2 or fragments thereof, c) nucleic acid sequences comprising nucleotide sequences which correspond to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 1 and / or d) nucleic acid sequences comprising nucleotide sequences which hybridize under stringent conditions with a complementary strand of a nucleotide sequence of a) to c), and functionally linked thereto a plant-functional termination sequence, and ii) a plant-functional promoter sequence and functional
  • step B) transferring the vector from step A) to a plant cell and optionally integration into the plant genome
  • first and second nucleic acid sequences used in the method above under points i) and ii) do not necessarily have to be on the same vector in order to be expressed together in the plant cell. They can also be present on different vectors Constructs may also be introduced into the plant cell either simultaneously or one after the other. It is of course also possible that first transgenic plants are generated, each containing and expressing only the first or the second nucleic acid sequence Single trans were allowed to cross each other in the next step, to then produce double transgene, in which both nucleic acid sequences are contained and expressed.
  • the nucleic acids used in the process can after introduction into a
  • Plant cell or plant are either on a separate plasmid or advantageously integrated into the genome of the host cell. When integrated into the genome, integration may be at random or by such recombination as to replace the native gene with the incorporated copy.
  • step A The person skilled in the art knows how a vector from step A) can be transferred to plant cells and what features the vector must possess in order to be able to integrate into the plant genome.
  • the present invention is also a recombinant nucleic acid molecule comprising i) a promoter sequence which is functional in plant cells and functionally linked thereto a first nucleic acid sequence selected from the group consisting of a) nucleic acid sequences comprising nucleotide sequences which comprise the sequence according to SEQ ID NO: 5 or fragments thereof, b) nucleic acid sequences comprising nucleotide sequences which code for a protein having the amino acid sequence or fragments thereof given in SEQ ID NO: 2, c) nucleic acid sequences comprising nucleotide sequences which have a sequence identity of at least 60% to the nucleotide sequence given in SEQ ID NO: 5, and d) nucleic acid sequences comprising nucleotide sequences that hybridize under non-stringent conditions with a complementary strand of a nucleotide sequence of a) to c) and functionally linked to a plant cell-functional terrrination sequence, and ii) a promoter
  • the recombinant nucleic acid molecules also called constructs or vectors, which are used for the expression of Rpi-blbl and Rpi-blb2, may comprise, besides the nucleic acid sequence of Rpi-blbl and Rpi-blb2 to be transferred, further regulatory elements. Which specific regulatory elements these vectors must contain depends in each case on the method which is to be carried out with these vectors. Which regulatory elements and also other elements these vectors must have is those skilled in the art with the various mentioned above Methods for producing transgenic plants in which the expression of a protein is increased, is known.
  • the regulatory elements that contain the vectors are those that ensure transcription and, if desired, translation in the plant cell. This may mean, for example, depending on the selected plant, that the gene is expressed and / or overexpressed only after induction, or that it is expressed and / or overexpressed immediately.
  • these regulatory sequences are sequences to which inducers or repressors bind and thus regulate the expression of the nucleic acid sequence.
  • the natural regulation of the sequences may still be present before the actual structural genes and possibly genetically have been changed so that the natural regulation is switched off and the expression of genes is increased.
  • the recombinant nucleic acid molecule can also be constructed more simply, ie no additional regulatory signals are inserted in front of the nucleic acid sequence and the natural promoter with its regulation has not been removed.
  • the natural regulatory sequence can be mutated so that no more regulation takes place and / or gene expression is increased.
  • These altered promoters can also be brought in the form of partial sequences before the natural gene to increase the activity.
  • the gene construct may also advantageously contain one or more so-called “enhancer” sequences operably linked to the promoter, which will increase expression of the nucleic acid sequence
  • additional advantageous sequences may be inserted, such as other regulatory elements or terminators
  • all natural promoters with their regulatory sequences can be used.
  • synthetic promoters or heterologous promoters in addition or alone.
  • heterologous promoter refers to a promoter that does not control expression of the subject gene (ORFs) in the parent organism.
  • the promoters may be constitutive as well as inducible or tissue- or development-specific promoters.
  • the selection of the promoter as well as other regulatory sequences determines the spatial and temporal expression pattern and thus the expression of the R genes in transgenic plants
  • Constant promoter means those promoters that express in numerous, preferably all, tissues via a larger period of plant development. preferably at all times of plant development, ensure.
  • Promoter or a promoter derived from a plant virus Particularly preferred is the promoter of the 35S transcript of the CaMV (cauliflower mosaic virus) (Franck et al., (1980) Cell 21: 285-294; Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812;
  • Synthase promoter from Agrobacterium, the ubiquitin promoter (Holtorf S et al., (1995) Plant Mol Biol 29: 637-649), the Ubiqiitin 1 promoter (Christensen et al., (1992) Plant Mol Biol 18: 675-689, Bruce et al., (1989) Proc Natl Acad Sd., USA 86: 9692-9696), the Smas promoter, the cinnamyl alcohol dehydrogenase promoter (US 5,683,439), the ATPase vacuolar subunit promoters or the wheat proline-rich protein (WO 91/13991), as well as other promoters of genes whose constitutive expression in plants is known to the person skilled in the art.
  • promoters having specificities for the anthers may also be used.
  • Seed-specific promoters such as the promoter of phaseolin (US 5,504,200, Bustos et al. (1989) Plant Cell 1 (9): 839-53), of the S2 albumin gene
  • HMWG High Molecular Worth Glutenin
  • AGPase ADP glucose pyrophosphatase
  • starch synthase ADP glucose pyrophosphatase
  • promoters which permit seed-specific expression in monocots such as maize, barley, wheat, rye, rice and the like can be employed advantageously: the promoter of the Ipt2 or lptl-gene (WO 95/15389, WO 95/23230) or in WO 99/16890 described promoters (promoters of the hordein gene, the glutelin gene, the oryzin gene, the prolamin gene, the gliadin gene, the zein gene, the Kasirin gene or the Secalin gene).
  • Tuber, storage-root or root-specific promoters are, for example, the patatin promoter class I (B33) and the promoter of the cathepsin D inhibitor from potato.
  • Leaf-specific promoters are, for example, the potato cytosolic FBPase promoter (WO 97/05900), the Rubisco (ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase) SSU promoter (small subunit) or the ST-LSI promoter from potato (Stockhaus et al ) EMBO J.8: 2445-2451).
  • Epidermis-specific promoters are, for example, the promoter of the OXLP gene ("oxalate oxidase-like protein"; Wei et al. (1998) Plant Mol. Biol.
  • tissue-specific promoters and eg flower-specific promoters such as the phytoene synthase promoter (WO 92/16635) or the promoter of the P-rr gene (WO 98/22 593) and anther-specific promoters such as the 5126 promoter (US 5,689,049; 5,689,051), the globl promoter and the? -Zine promoter.
  • the expression cassettes may also contain a chemically inducible promoter (reviewed in: Gatz et al., (1997) Annu Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 89-108), which controls the expression of the exogenous gene in the plant at a particular time
  • a chemically inducible promoter such as Biol. 22: 361-366
  • a salicylic acid-inducible promoter WO 95/19443
  • a benzenesulfonamide-inducible promoter EP 0 388 186
  • a tetracycline-derived promoter Ward et al. (1993) Plant Mol inducible promoter (Gatz et al. (1992) Plant J. 2: 397-404
  • a scisinic acid-inducible promoter EP 0335528) or an ethanol or cyclohexanone inducible promoter (WO 93/21334)
  • WO 93/21334 may also be used
  • Pathogen-inducible promoters include the promoters of genes induced as a result of pathogen attack, such as genes of PR proteins, SAR proteins, ⁇ -13-glucanase, chitinase, etc. (for example, Redolfi et al., (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89: 245-254; Uknes et al. (1992) Plant Cell 4: 645-656; Van Loon (1985). Plant Mol. Viral.4: 111-116; Marineau et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9: 335-342; Matton et al. (1987) Molecular Plant Microbial Counterparts 2: 325-342; Somssich et al.
  • wound-inducible promoters such as the pinll gene (Ryan (1990) Ann Rev. Phytopath. 28: 425-449; Duan et al. (1996) Nat. Biotech. 14: 494-498), of Wunl and wun2 gene (US 5,428,148), the winl and win2 genes (Stanford et al. (1989) Mol. Gen Genet. 215: 200-208), the systemin gene (McGurl et al., (1992) Science 225 Biol.22: 783-792; Eckelkamp et al.
  • a source of further pathogen-inducible promoters is the PR gene amily.
  • a number of elements in these promoters have proven advantageous.
  • the nucleotide range from nucleotide 364 to nucleotide 288 in the promoter mediates PR-2d salicylate specificity (Buchel et al (1996) Plant Mol. Biol. 30: 493-504).
  • This region binds to tobacco a nuclear protein whose amount is increased by salicylate
  • the PR-I promoters from tobacco and Arabidopsis are also suitable as pathogen-inducible promoters induced by pathogens, the "aeid PR-5" (aPR5) promoters are from barley (Schweizer et al. (1997) Plant Physiol. 114: 79-88) and wheat (Rebmann et al. (1991) Plant Mol. Biol 16: 329-331).
  • aPR5 proteins accumulate in about 4 to 6 hours after pathogen attack and show only a very low background expression (WO 99/66057).
  • pathogen-induced specificity is the production of synthetic promoters from combinations of known pathogen-responsive elements (Rushton et al., (2002) Plant Cell 14: 749-762, WO 00/01830, WO 99/66057 ). Further pathogen-inducible promoters of various types are known to the person skilled in the art (EP-A 1 165794, EP-A 1 062356, EP-A 1 041 148, EP-A 1 032684).
  • pathogen-inducible promoters include the flax Fisl promoter (WO 96/34949), the VstI promoter (Schubert et al. (1997) Plant Mol. Biol. 34: 417-426) and the EAS4 sesquiiterpene cydase promoter Tobacco (US 6,100,451).
  • promoters which are induced by biotic or abiotic stress are preferred gstl promoter), eg from potato (WO 96/28561, Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 361-366), the heat-inducible tomato hsp70 or hspSO promoter (US 5,187,267), the cold-inducible alpha Potato amylase promoter (WO 96/12814), the light-inducible PPDK promoter or the wound-induced pinII promoter (EP-AO 375091).
  • JVlesophyll tissue “means the bilayered leaf tissue between the epidermis layers, consisting of the palisade tissue, the sponge tissue and the leaf veins.
  • HvPRIA acc. X74939
  • HvPRIb acc. X74940
  • HvBl 3gluc acc. AF479647
  • HvPrx ⁇ acc. AJ276227
  • Epidermis tissue or epidermis means can be one to several layers; there is epidermis “teaser” gene expression, such as Cer3, which can serve as a marker (Hannoufa (1996) Plant J. 10 (3): 459-467).
  • tissue of above-ground plant parts eg the shoot, the leaves, flowers, fruits and seeds.
  • Prx7 acc. AJ003141 (Kristensen (2001) Molecular Plant Pathology 2 (6): 311-317); GerA, acc. AF250933 (Wu (2000) Plant Phys. Biochem 38: 685-698); OsROCl, acc.
  • Further promoters are, for example, fruiting promoter-specific promoters. EP 409625).
  • Degradation-dependent promoters include, in part, the tissue-specific promoters, since the formation of individual tissues is inherently development-dependent.
  • pathogen-inducible promoters and constitutive promoters are particularly preferred.
  • the native promoters of the Rpi-blbl and Rpi-blb-2 genes are used, ie. the promoters which are linked in the original organism alone or together with other elements to the coding sequence of Rpi-blbl or Rpirb2 and regulate their expression.
  • the promoters as described in the genomic sequences according to SEQ ID NO: 1 for Rpi-blbl and SEQ ID NO: 3 are included for Rpi-blb2
  • promoters may be functionally linked to the nucleic acid sequence to be expressed, which allow expression in other plant tissues or in other organisms, such as E .odi bacteria.
  • promoters functional in plants in principle, all promoters described above
  • the average skilled worker is able to isolate new promoters by means of routine methods molecular biological methods, eg hybridization experiments or DNA-protein binding studies, eg B. identify further tuberous and / or eridermis-specific regulatory nucleic acid elements.
  • a first step the desired tissue from the desired organism, from which the regulatory sequences are to be isolated, isolated and isolated from the entire poly (A) + RNA and created a cDNA library.
  • a second step by means of cDNA clones based on poly (A) + RNA molecules from another tissue, from the first bank by hybridization those clones are identified, the corresponding poly (A) + RNA molecules accumulate only in the desired tissue. Subsequently, with the help of these so identified cDNAs
  • tissue-specific regulatory elements that have tissue-specific regulatory elements.
  • the skilled person is also available further PCR-based methods for the isolation of suitable tissue-specific promoters
  • Nucleic acid sequences may be functionally linked to further genetic control sequences besides a promoter.
  • the term "genetic control sequences" is to be understood broadly and means all those sequences which have an influence on the production or the function of the expression cassette according to the invention. Genetic control sequences modify, for example, transcription and
  • the expression cassettes according to the invention 5'-upstream of the respective transgenic nucleic acid sequence comprise a plant-functional promoter with a specificity as described above and 3'-downstream a plant functional terminator sequence as additional genetic control sequence, and optionally further usual regulatory elements, in each case functionally linked to the transgene to be expressed nucleic acid sequence.
  • Genetic control sequences also include other promoters, promoter elements or minimal promoters, which could modify the expression-controlling properties.
  • genetic control sequences may additionally be used for gene-specific expression depending on specific stress factors.
  • Corresponding elements are the Bdspid for water stress, abscisic acid (LamE and ChuaNH (1991) J. Biol. Chem 266 (26): 17131-17135) and heat stress (Schoffl F et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 217 (2-3 ): 246-53).
  • Genetic control sequences also include the 5 'untranslated regions, introns or the non-coding 3' region of genes such as the actin-1 intron, or the Adhl-S introns 1, 2 and 6 (commonly: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994)). It has been shown that these can play a significant role in the regulation of gene expression. Thus, 5'-untranslated sequences have been shown to enhance the transient expression of heterologous genes. Exemplary of translation enhancers is the 5'-leader sequence from the tobacco mosaic virus (Gallie et al., (1987) Nud. Adds. Res. 15: 8693-8711). They may further promote tissue specificity (Rousterj et al., (1998) Plant J. 15: 435-440).
  • the expression cassette may advantageously contain one or more so-called “enhancer” sequences functionally linked to the promoter, which allow increased transgene expression of the nucleic acid sequence. Additional advantageous sequences may also be present at the 3 'end of the nucleic acid sequences to be transgene be advertised, like other regulatory elements or terminators.
  • the transgenic nucleic acid sequences to be expressed can be contained in one or more copies in the gene construct.
  • the natural promoter of a particular gene may be substituted for a promoter of a different tissue specificity
  • an expression cassette and the vectors derived from it can contain further functional elements.
  • the term functional element is to be understood broadly and means all those elements which have an influence on production. Propagation or function of the expression cassettes, vectors or transgenic organisms according to the invention have to be mentioned by way of example but not by way of limitation:
  • Gox gene glyphosate oxidoreductase
  • glyphosate oxidoreductase encoding glyphosate ® degrading enzymes
  • the deh gene encoding a dehalogenase that inactivates dalapon
  • bxn genes encoding bromoxynil-degrading nitrilase enzymes
  • the aasa gene conferring resistance to the antibiotic apectinomycin
  • the neomycin phosphotransferase (NPTII) gene which is resistant to
  • Kanamycin or Genetiddin the hygromycin phosphotransferase (HPT) gene conferring resistance to hygromycin, confers the acetolactate synthase gene (ALS), which confers resistance to sulfonylurea f-herbicides (eg, mutated ALS variants with, for example, S4 and / or hra mutation) and the mutant AHAS (acetohycloxyadd synthase) gene (S653N), which has increased resistance to
  • HPT hygromycin phosphotransferase
  • ALS acetolactate synthase gene
  • S653N mutant AHAS (acetohycloxyadd synthase) gene
  • reporter genes which code for easily quantifiable proteins and which, via intrinsic color or enzyme activity, ensure an evaluation of the transformation efficiency or of the expression site or time point Very particular preference is given to reporter proteins (Schenborn and Groskreutz (1999) Mol. Biotechnol. 13 (1): 29-44).
  • reporter proteins such as the "green fluorescence protein” (GFP) (Sheen et al., (1995) Plant Journal 8 (5): 777-784; Haseloff et al. (1997) Proc. Natl. Acad Sd., USA 94 (6): 2122 Rachel et al (1996) Proc Natl Acad Sd., USA 93 (12): 5888-5893; Tianet al. (1997) Plant Cell Rep. 16: 267-271; WO 97/41228; Chui et al (1996) Curr Biol 6:
  • GFP green fluorescence protein
  • Anthocyanin pigments (red coloring) regulated in plant tissue and so on allows direct analysis of the promoter activity without the addition of additional auxiliary substances or chromogenic substrates; Dellaporta et al., In: Chromosomal Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11: 263-282, 1988), most preferably ⁇ -glucuronidase (Jefferson et al. (1987) EMBOJ.6: 3901-3907).
  • a selectable marker can additionally be introduced which confers on the successfully transformed cells resistance to a biocide (for example a herbicide), a MetaboK smusin inhibitor such as 2-deoxyglucose-6-phosphate (WO 98/45456) or an antibiotic gives.
  • a biocide for example a herbicide
  • a MetaboK smusin inhibitor such as 2-deoxyglucose-6-phosphate (WO 98/45456) or an antibiotic gives.
  • the selection marker allows selection of the transformed cells for untransformed (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84).
  • molecular biological methods such as PCR or Southern blotting.
  • Polyadenylation signals which are suitable as control sequences are plant polyadenylation signals, preferably those which essentially correspond to T-DNA polyadenylation signals from Agrcbaderiumtumefaciens, in particular gene 3 of the T-DNA (octopine synthase) of the Ti plasmid PITiACHS (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3: 835 ff) or functional equivalents thereof.
  • particularly suitable terminator sequences are the OCS (octopine synthase) terminator and the NOS (nopaline synthase) terminator.
  • vector refers to a nucleic acid molecule that can transport another nucleic acid to which it is bound into a cell.
  • a 'plasmid' represents a circular double-stranded DNA loop into which additional DNA segments can be ligated.
  • viral vector Another type of vector is a viral vector, where additional DNA segments can be ligated into the viral genome.
  • Certain vectors can autonomously replicate in a host cell into which they have been introduced (eg bacterial vectors with bacterial origin of origin). Other vectors are advantageously integrated into the genome of a host cell upon introduction into the host cell and thereby replicated together with the host genome.
  • certain vectors may direct the expression of genes to which they are operably linked.
  • expression vectors suitable for recombinant DNA techniques are in the form of plasmids.
  • plasmid and “vector” can be used interchangeably since the plasmid is the most commonly used vector form, but the invention is also intended to be other expression vector vectors, such as viral vectors that perform similar functions, include.
  • vector is intended to include other vectors known to those skilled in the art, such as phages, viruses such as SV40, CMV, TMV, transposons, IS elements, phasmids, phagemids, cosmids, linear or circular DNA.
  • Enhancer sequences can also perform their function from more distant positions or even from other DNA molecules on the target sequence. Preference is given to arrangements in which the nucleic acid sequence to be transgenically expressed is positioned behind the sequence which functions as promoter, so that both sequences are covalently linked to one another. Preference is given to the distance between the nucleic acid sequence to be transgenically expressed.
  • Promoter sequence and the nucleic acid sequence to be expressed transgene less than 200 base pairs, more preferably less than 100 base pairs, and most preferably less than 50 base pairs.
  • the promoter and the nucleic acid sequence to be expressed it is also possible to position further sequences which, for example, have the function of a linker with particular restriction enzyme cleavage sites or a signal peptide. Also, insertion of sequences may result in the expression of fusion proteins.
  • regulatory sequence is intended to include promoters, enhancers and other expression control elements (eg Polyadenyk ' mecanicssignale). These regulatory sequences are described, for example, in Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), or in Gruber and Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Raton, Florida, Ed .: Glick and Thompson, chapter 7, 89-108. Regulatory sequences include those that direct the constitutive expression of a nucleotide sequence in many types of host cells, and those that direct the direct expression of the nucleotide sequence only in certain host cells under certain conditions.
  • the design of the expression vector may depend on factors such as the size of the host cell to be transformed, the level of expression of the desired protein, etc.
  • the recombinant expression vectors used for expression of the R genes may be suitable for the transformation of both prokaryotic and eukaryotic cells. This is advantageous because intervening steps of vector construction are often carried out in microorganisms for convenience. These cloning vectors contain a signal for expression of the corresponding microorganism and a marker gene for selection of successfully transformed bacterial cells.
  • suitable vectors for prokaryotic organisms include, for example, in E. cdipLG338, pACYC184, the pBR series, such as e.g. pBR322, the pUC series, such as.
  • pUC18 or pUC19 the M113mp series, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-111113-Bl, ⁇ gt11 or pBdCl, in StreptomycesAspIJlOI, pIJ364, pIJ702 or pIJ361, in Baculus pUBIIO, pC194 or pBD214 , in C ⁇ rynebaderium pSA77 or pAJ667.
  • the gene to be expressed must, as described above, be operably linked to a suitable promoter that performs gene expression in a timely, cell or tissue-specific manner. Suitable promoters have already been described above.
  • telomeres are preferred sequences for use in the operable linkage in gene expression cassettes.
  • targeting sequences used to direct the gene product for example, in the vacuole, the nucleus, all kinds of plastids, such as Amytoplasts, chloroplasts, chromoplasts, extracellular space, mtochondria, endoplasmic reticulum, oil bodies, peroxisomes and other compartments of plant cells.
  • the nucleic acid sequences of Rpl-blbl or Rpi-blb2 are advantageously subjected to amplification and ligation in a known manner.
  • the amplificate is expediently analyzed. For example, the analysis can be done after gel electrophoretic separation for quality and quantity.
  • the amplificate can be purified according to a standard protocol (e.g., Qiagen). An aliquot of the purified amplificate is then available for subsequent cloning
  • Suitable cloning vectors are well known to those skilled in the art. These include, in particular, vectors that are replicable in microbial systems, ie in particular vectors that ensure efficient cloning in bacteria, yeasts or fungi, and that enable the stable transformation of plants. Particular mention may be made of various T-DNA-mediated transformations , binary and co-integrated vector systems. Such vector systems are generally characterized in that they contain at least the vir genes required for the Agrobacterium-mediated transformation as well as the T-DNA limiting sequences (T-DNA border). Preferably, these vector systems also comprise further ds-regulatory regions such as promoters and terminators and / or selection markers with which appropriately transformed organisms can be identified.
  • binary systems are based on at least two vectors, one carrying vir genes but no T-DNA and a second T-DNA, but no vir gene , As a result, the latter vectors are relatively small, easy to manipulate and both in E. cdi as well as in Agrobacterium.
  • These binary vectors include vectors of the series pBIB-HYG, pPZP, pBecks, pGreen. Binl9, pBIlOl, pBinAR, pGPTV and pCAMBIA are preferably used according to the invention.
  • An overview of binary vectors and their use is given by Hellens et al. (2000) Trends in Plant Science 5, 446-451.
  • the vectors can first be linearized with restriction endonuclease (s) and then enzymatically modified in a suitable manner. The vector is then purified and an aliquot used for cloning. In cloning, the enzymatically cut and, if necessary, purified amplicon are linked to similarly prepared vector fragments by ligase. It can be a specific
  • Nucleic acid construct or vector or plasmid construct have one or more codogenic gene segments.
  • the codogenic gene segments in these constructs are functionally linked to regulatory sequences.
  • the regulatory sequences include, in particular, plant sequences such as the promoters and terminators described above.
  • the constructs can advantageously be grown in microorganisms, in particular E. cdi and Agrobacterium tumefa ⁇ ens, in a suitable medium and stably propagated under selection conditions. Subsequently, the cells are harvested and lysed and the plasmid obtained therefrom. This allows for transfer of heterologous DNA into plants or microorganisms.
  • the nucleic acids used in the method of the invention can be introduced into organisms such as microorganisms or preferably plants and used for plant transformation, such as those published in and cited by Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Chapter 6/7, pp. 71-119 (1993); FF White, Vectorsfor Gene Transfer to Higher Plants; in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, Hrsgo .: KungundR. Wu, Academic Press, 1993, 15-38; Techniques for Gene Transfer, Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, Hrsgo: Kung and R.
  • nucleic acids used in the method, the inventive nucleic acid constructs and / or vectors can thus be used for the genetic engineering modification of a broad spectrum of organisms, preferably of plants
  • the DNA to be introduced must, as already explained above, be cloned into specific plasmids, either into an intermediate or into a binary vector.
  • the intermediate vectors can be integrated by homologous recombination into the Ti or Ri plasmid of the Agrobacteria due to sequences homologous to sequences in the T-DNA. This also contains the vir region intermediate vectors necessary for the transfer of the T-DNA can not replicate in agrobacteria.
  • the intermediate vector can be grown on Agrobacterium tumefaciens be transferred (conjugation).
  • Binary vectors can be found in E.
  • Agrobacterium should contain a plasmid carrying a vir region The vir region is necessary for the transfer of T-DNA into the plant cell. In addition, T-DNA may be present. The thus transformed Agrobacterium is used to transform plant cells.
  • plant explants can be cultivated expediently with Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes.
  • Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes From the infected plant material (for example leaf pieces, stalk segments, roots, but also protoplasts or Suspenäons-cultured plant cells) can then be grown in one plant suitable medium, which may contain antibiotics or biocides for the selection of transformed cells, whole plants are regenerated again.
  • the regeneration of the plants is carried out according to customary
  • the plants or plant cells thus obtained may then be assayed for the presence of the introduced DNA by established methods, e.g. Southern blot or PCR are examined
  • the transformed cells grow within the plant in the usual way (see also McCormick et al. (1986), Plant Cell Reports 5, 81-84).
  • the resulting plants can be grown normally and crossed with plants having the same transformed genetic material or other genetic material.
  • the resulting hybrid individuals have the corresponding phenotypic properties.
  • transgenic plants can be determined by conventional methods, which are homozygous for the new nucleic acid molecules and their phenotypic behavior in terms of existing or non-existent pathogen responsiveness investigated and compared with that of hemizygpten plants
  • plant cells containing the nucleic acid molecules of the invention may also be further cultured in the form of a cell culture (including protoplasts, KaUi, suspension cultures and the like)
  • transgenic plant encompasses both the plant in its entirety and all plant parts in which the expression of R proteins according to the invention is increased, including all plant parts and plant organs such as leaf, stalk, seeds, root, tubers, Anthers, fibers, root hairs, stems, embryos, calli, kotelydons, petioles, crops, plant tissue, reproductive tissue, cell cultures derived from the transgenic plant and / or used to produce the transgenic plant.
  • transgenic plants in which the nucleic acids to be transferred are contained in the plant cell or plant as a self-replicating system. Diezur
  • Transfer vectors used in the plants must then have correspondingly DNA sequences that allow the replication of plasmids used for transfer within the cell.
  • the specific expression of the resistance proteins in the plants according to the invention or in the plant cells according to the invention can be detected and monitored by means of conventional molecular biological and biochemical methods.
  • a suitable detection method for example a Northern blot analysis to detect specific RNA from Rp-blbl and RpL-blb2 or to determine the level of accumulation of RpL -blbl and Rpi-blb2-specific RNA or a Southern blot analysis to detect the nucleic acid sequences of Rpi-blbl and Rpi-bM.
  • a real-time PCR is performed for the qualitative and quantitative detection of RpL-blbl and RpL-blb2-encoding DNA sequences.
  • the plants used for the process according to the invention may be any plant which is to be made resistant to attack by pathogens, preferably fungal pathogens.
  • pathogens preferably fungal pathogens.
  • it is a monocot or dicotyledonous crop, forage or forage crop, most preferably a dicotyledonous crop, forage or forage crop.
  • Examples of monocotyledonous plants are plants belonging to the genera Avena (oats), Triticum (wheat), sea ale (rye), Hordeum (barley), Oryza (rice), Panicum, Pennisetum, Setaria, sorghum (millet), Zea (maize ) and the like
  • Dicotyledonous crops include, but are not limited to, cotton, legumes, soybean, rapeseed, sugarbeet, ornamentals, and trees, particularly potato and tomato.
  • crops may include fruits, oil palms, tea, cocoa and coffee bushes, tobacco, sisal and medicinal herbs Rauwolfia and Digitalis, further cereals such as wheat, rye, oats, barley, rice, corn and millet, sugar beet, rapeseed, soybean and Tobacco.
  • crops can be found in US Pat. No. 6,137,030 Preferred plants and plants belonging to the nightshade family (Solanaceae), more preferably plants belonging to the genus of the potato (Solanum), in particular Sdanum tuberosum, Solanum demissum or Solanum bulbocastanum, or tomato (Lycopersiccn) or tobacco (Nicotiana).
  • plants and plant cells with increased pathogen resistance which have an increased content of Rpi-blbl and Rpi-blb2 compared with the starting plant or plant cell.
  • these plants were prepared by the method according to the invention.
  • the specific expression of the protein according to the invention in the plants according to the invention or in the plant cells according to the invention can be detected and monitored by means of conventional molecular biology and biochemical methods.
  • a suitable detection method for example a Northern blot analysis for detecting protein-specific RNA or for determining the level of accumulation of protein-specific RNA or a Southern blot analysis.
  • Blot or PCR analysis to detect DNA sequences encoding a protein of the invention.
  • the probe or primer sequences used for this purpose can either be identical to the sequence given in SEQ ID No.1, 3, 5 or 6 or have a few deviations from this sequence.
  • the method according to the invention can also be combined with other methods for increasing the pathogen resistance in transgenic plants.
  • ROR2 eg from barley (GenBank Acc No .: AY246906)
  • SnAP34 eg from barley (GenBank Acc No: AY247208)
  • / or lumenal binding protein BiP eg from rice (GenBank Acc No. AF006825)
  • ROR2 eg from barley (GenBank Acc No .: AY246906)
  • SnAP34 eg from barley (GenBank Acc No: AY247208)
  • / or lumenal binding protein BiP eg from rice
  • the polypeptide amount, the activity or the function of one or more resistance factors can be selected from the group consisting of RacB (eg from barley (GenBank Acc No: AJ344223)), CSL1 (eg from Arabidopsis (GenBank Acc No .: NM116593) ), HvNaOX (eg from barley (GenBank Acc No: AJ251717), EP 1 525315), MLO (eg from barley (GenBank Acc No. Z83834), WO 98/04586, WO 00/01722, WO 99/47552) ARMl (armadillo repeat protein; EP application number 05110468.5) may be reduced by appropriate procedures
  • RacB eg from barley (GenBank Acc No: AJ344223)
  • CSL1 eg from Arabidopsis (GenBank Acc No .: NM116593)
  • HvNaOX eg from barley (GenBank Acc No: AJ251717), EP
  • Another object of the invention relates to the use of the transgenic organisms according to the invention and derived from them cells, cell cultures, parts - such as in transgenic plant organisms roots, leaves, etc.-, and transgenic propagation material such as seeds or fruits, for the production of food or Feed, pharmaceuticals or fine chemicals
  • the invention further relates to a method for the recombinant production of pharmaceuticals or fine chemicals in host organisms, wherein a host organism or a part thereof is transformed with one of the recombinant nucleic acid molecules described above and this nucleic acid molecule contains one or more structural genes encoding the desired fine chemical or catalyze the biosynthesis of the desired fine chemical, grow the transformed host organism, and isolate the desired fine chemical from the growth medium.
  • This process is useful for fine chemicals such as enzymes, Vitarrrine, amino acids, sugars, fatty acids, natural and synthetic flavorings, flavorings and colorants widely applicable.
  • Particularly preferred is the production of tocopherols and tocotrienols as well as carotenoids.
  • the growth of the transformed host organisms and the isolation from the host organisms or from the culture medium is carried out by methods known to the person skilled in the art.
  • the production of pharmaceuticals such as, for example, antibodies or vaccines is described by Hood and Jilka (1999). Curr. Opin Biotechnol. 10 (4): 382-6; MaundVine (1999) Curr. Top. Mcrobiol. Immunol. 236: 275-92.
  • the cloning methods such as restriction cleavage, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids to nitrocellulose and nylon membranes, linkage of DNA fragments, transformation of E. ⁇ - Cells, bacterial growth and sequence analysis of recombinant DNA were performed as described by Sambrook et al. (2001).
  • Vector VC-PMA16-1 (Fig. 2) A DNA segment with Rpi-blbl was ligated with the binary vector pSUNAH ASmod, which was cut with the restriction enzyme (RE) XbaI. Subsequently, the ligated vector was digested with the RE PstI to generate so-called "Jblunt ends.”
  • the genomic sequence consists of the 3592 bp Rpi-blbl gene, a 1173 bp promoter region, and a 406 bp termination region
  • PSUNAH ASmod was constructed as follows: From the plasmid pGPT VKan (Becker et al., 1992), a 608 bp nos-promoter fragment was excised and ligated after digestion of the plasmid pUC 19 with the REs Hindill and BamHI. Furthermore, a 275 bp nos termination fragment was excised from the plasmid pGPT VKan (Becker et al., 1992) and ligated after digestion of the plasmid pUC 19 with the REs Kpnl and SstI with the plasmid after the promoter sequence.
  • the 2020 bp AHAS gene was excised from pUC19 with KpnI and SstI and ligated with the same REs between the nos promoter and the nos terminator.
  • the altogether 2900 bg AHAS complex consisting of the nos promoter, the AHAS Gene and demnos-terminiriator was excised with HindIII and EcoRI and ligated into the plasmid pUC 19, which was opened with EcoRI and SmaI.
  • Rpi-blb2 segment was ligated into a SalI and EcoRV digested pSUNAHASmod vector and named VC-PMA19-1.
  • the R ⁇ -blb2 segment contains a 3890 bp Rpi-blb2 gene, a 1530 bp b 'promoter region and a 2530 bp 3' terminator region PSUNAHASmod with the Rp-blb2 complex was digested with BamHI and ligated with a Rpi blbl segment.
  • the Rpi-blbl segment contains a 3592 bp Rpi-blbl gene, a 2516 bp 5 'promoter region, and a 669 bp 3' terminator region
  • VC-PMAI 6-1 and VC-PMA19-1 were transfected into the A tumefaciens strains LBA4404, AGLO or AGLl by direct transformation as described in Walkerpeach & Veiten (Agrobacterium mediated gene transfer to plant cells cointegrate and binary vector systems, Gelvin SB, Schilperoot RA (eds), Plant Molecular Biology Manual, 2nd edn, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Netherlands, pp. Bl / 1 - Bl / 19, 1994). Transformed bacteria were selected on YEB plates containing 1 g / ml spectinomycin. Colonies of transformed bacteria were selected for plasmid preparations (Qiagen Mini-Kit, Qiagen, Hilden) and then subjected to digestion by restriction enzymes.
  • Visser Visser RGF, 1991, p.
  • Leaves or stalk segments were blotted for 1-3 days on MC plates (M300 plates (4.4 g / l MS medium, 2 mg / l NAA, 1 mg / l BAP, 30 g / l sucrose, pH 5.2), with 1.5 - 2 ml liquid Ml 00 medium (4.4 g / l MS medium, 30 g / l sucrose, 0.5 mg / ml THarnin hydrochloride, 0.5 mg / ml Pyridoxine hydrochloride, 1 mg / l nicotinic acid, 0.5 mg / l kinetin, 29.8 mg / l FeSO 4 VH 2 O, 1 mg / l 2,4-D, 2 g / l casein hydrolyzate, pH 6 , 5) and covered with a sterile filter paper.
  • M300 plates 4.4 g / l MS medium, 2 mg / l NAA, 1 mg / l BAP, 30
  • tissue segments were removed from the plates and mixed with A tumefaciens containing either VC-PMAl 6-1 or VC-PMA19-1 in MSlO medium (4.4 g / l MS). Medium, 10 g / l sucrose, pH 5.8). After an incubation period of 8 - 10 min. The tissue segments were retransferred to M300 plates and incubated for an additional 1-3 days.
  • tissue segments were on MS400 plates (4.4 g / L MS medium, 2 mg / L zeatin, 0.01 mg / L NAA, 0.1 mg / L GA 3 , 10 g / L sucrose, 400 mg / 1 Claforan or Carbenicillin, pH 5.8) and incubated for 3-5 days.
  • tissue segments were transferred to new plates containing the same medium as the MS400 plates, but to which was additionally added 0.5 ⁇ m of Imazamox for selection of the transformed potato cultivars.
  • the tissue segments were transferred every two weeks to new plates with the same medium.
  • Regenerated putative transgenic sprouts were collected and cultured on MS30 plates (4.4 g / L MS medium, 30 g / L sucrose, 200 mg / L Claforan, pH 5.8).
  • DNA was extracted from the putative transgenic sprouts using the Wizard Magnetic 96 DNA Plant System (Promega, Mannheim) according to the manufacturer's instructions.
  • Rpi-blbl 5'-TGT TGA ACA CTG TAA CAT GCT AAAATG-3 '(Fomard Primer; SEQ ID NO: 7) 5'-AGT TGT GGACAT CCC CGA ATT-3' (back-up Primer; SEQ ID NO: 8)
  • Rp-blb2 5'-TTC AAAACC CCAAAT AAG TTT CAAC-3 '(Fomard Primer, SEQ ID No. 10)
  • the sprouts were after the detection of Rpi-blbl and Rpi-blb2 nucleic acid sequences (see above) transferred to soil and for 2 days in a climatic chamber (Binder KBW 400) at 22 9 C and 12 h alternating light under Hoods on. Thereafter, the plants were propagated for approximately 4 weeks on soil in the greenhouse under similar conditions (22 9 C, 12 h alternating light).
  • a Phytophthora infestans-Gevlambashausmischung was used in some experiments and the highly virulent isolate 2-5-5, which begins with sporulation already after 2.5 days.
  • the greenhouse mixture contains 7 different field isolates (Al, D2, Bl, B2, B3, B4, P4) of P. infestans from 7 different European countries and thus represents the pathogen spectrum in the field.
  • the 7 field isolates representing different types of crosses and showing different colon types were cultivated on pea agar (see below).
  • Pea Agar - 150 g peas (brand Salto from HL-Markt)
  • a spore density of 2.5 ⁇ E05 spores / ml was set in each case by means of a Thoma counting chamber.
  • the inoculation was done with an airbrush spray gun on the whole plant, covering the plant surface with a faint, uniform spray. Thereafter, the inoculated plants were covered and placed in a moist mist chamber. There, the plants were kept at about 92% humidity with constant irrigation at 21 9 C and 12 h alternating light. After 5-6 days (dayspost inoculation, dpi), the first scoring of the caused symptoms. After the first assessment, the plants were re-mixed with the mixture of vegetables. inoculated with the highly virulent isolate 2-5-5 of P. infestans.
  • P698 Parental plant cv. Agria (not transgenic)
  • Plant 2 TS-PH05-041-0002 (Rpi-bll / Rpi-blb2 double transgenic plant)
  • Plant 55 TS-PH05-002-0055 (Rpi-blbl / Rpi-blb2-double-trans plant)
  • Plant 82 TS-PH05-002-0082 (Rp-blbl / Rp-blb2-double trans Plant)
  • FIG. 2 shows the vectors VC-PMAL 6-1 (a) according to the invention and VC-PMA19-1 (b), which were generated on the basis of the vector pSUNAH ASmod

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Pathogenresistenz in Pflanzen und/oder Pflanzenzellen, wobei der Gehalt an Rpi-blb1 und Rpi-blb2 in den Pflanzen und/oder Pflanzenzellen gegenüber den Ausgangspflanzen erhöht wird.

Description

Verfahren zur Erhöhung der Pathoganresistenz in transaanen Pflanzen
Die vorliegende Erfindungbetrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Pathogenresistenz in Pflanzen und/oder Pflanzenzellen, wobei der Gehalt an Rpi-blbl und Rpi-blb2 in den Pflanzen und/oder Pflanzenzellen gegenüber den Ausgangspflanzen erhöht wird.
Pflanzenkrankheiten, die durch verschiedene Pathogene wie z.B. Viren, Bakterien und Pilzen verursacht werden, können beim Anbau von Kulturpflanzen zu erheblichen
Ernteausfällen führen, was zum einen wirtschaftliche Folgen hat, aber auch die Sicherheit der menschlichen Ernährungbedroht. Seit dem letzten Jahrhundert werden zur Kontrolle von Pilzerkrankungen chemische Fungizide eingesetzt. Durch den Einsatz dieser Stoffe konnte zwar das Ausmaß von Pflanzenerkrankungen reduziert werden, es ist allerdings bis heute nicht auszuschließen, dass diese Verbindungen eine schädliche Wirkung auf Mensch, Tier und Umwelt ausüben. Um langfristig den Verbrauch von herkömmlichen Pflanzenschutzmitteln auf ein Minimum zu reduzieren, ist es daher von Bedeutung, die natürliche Pathogenabwehr von verschiedenen Pflanzen gegenüber unterschiedlichen Erregern zu untersuchen und sie sich durch gentechnologische Manipulation, z.B. durch das Einführen externer Resistenzgene oder durch die Manipulation der endogenen
Genexpression in den Pflanzen, zur Herstellung von pathogenresistenten Pflanzen gezielt nutzbar zu machen
Eine
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stellt die Kartoffel (Sdanum tuberosum) mit einer Wdtjahresproduktion von über 310 Millionen Tonnen auf einer Anbaufläche von über 19 Millionen Hektar dar. Damit steht die Kartoffel nach Weizen, Reis und Mais an vierter Stelle der wichtigsten Grundnahrungspflanzen und spielt weltweit eine äußerst wichtige Rolle bei der Ernährung der Bevölkerung Ebenso wie alle anderen Kulturpflanzen, z.B. Gerste (Hαrdeum vulgäre), Mais (Zea maysL. subsp. Mays) oder Weizen (TriticumL.) sind die Kartoffelpflanzen von einer Vielzahl an Pathogenen bedroht, wie z.B. Viren (ua Kartoff elblattroll-Virus, Kartoffel-Virus Y, Kartoffelvirus A, TMV), Bakterien (ua Erwinia, Ralstcnia) und Pilzen (ua Rhizoctcnia, Fusarium, Alternaria, Botryris) .
Das Pathogen, das die am weitesten verbreitete und folgenschwerste Erkrankung von Kartoffelpflanzen hervorruft, ist der Oomycet Phytophthcra infestans P. infestansruft die sog Kraut- und Knollenfäule hervor, eine Krankheit, die weltweit verbreitet ist und in manchen Gebieten als begrenzender Faktor des Kartoffelanbaus angesehen wird. Besonders in den feuchtkühlen Klimazonen Nordamerikas, Nordeuropas und in Deutschland ist mit einem jährlichen Auftreten der Krankheit zu rechnen. Die durchschnittlichen jährlichen Verluste werden dabei auf 8 % - 10 % der Gesamternte geschätzt. In Großbritannien kann in feuchten Jahren sogar ein Ernteverlust von bis zu 16 % eintreten. Bei ungestörter epidemischer Ausbreitung von P. infestans können Ernteminderungen von bis zu 70 % eintreten. Derartige Verluste führten in der Vergangenheit zu verheerenden Hungersnöten, wie z.B. in der Mitte des 19. Jahrhunderts zu der Hungersnot in Irland, die über eine Million Menschenleben forderte, oder zum ^teckrübenwinter" 1916/1917 in Deutschland.
Erste Symptome einer P. infestans-Infektion sind kleine gelbliche oder dunkelgrüne Hecken v.a am Blattrand, die im Laufe der Erkrankung dunkelbraun bis schwarz werden und sich über die gesamte Pflanze verteilen. Zusätzlich bildet sich weißlichgrauer Mycelflaum Im weiteren Krankheitsverlauf tritt eine Trockenfäule auf, die letztendlich zum Absterben der gesamten Kartoffelpflanze führen kann. Heutzutage werden in der Landwirtschaft zur Kontrolle von Pilzerkrankungen intensiv Fungizide verwendet. Allerdings ist die Bekämpfungvon P. infestansrrάt chemischen Fungiziden, z.B. mit protektiven Dithiocarbamaten oder dem Organotin Fentin- Hydroxid, oder dem Schwermetall Kupfer im biologischen Landbau aufwendig und teuer und kann eine Belastung für die Umwelt darstellen
Trotz der o.g. Kontrollmöglichkeiten geht ein beträchtlicher Anteil der möglichen Kartoffelernte infolge von Erkrankungen verloren Um zum einen diese Ernteeinbußen und zum anderen die Verv\endungvonFung^denirnAUgemeinen zureduzieren, gibt es seit längerem Bestrebungen, im Rahmen eines integrierten Pflanzenschutzes
Kulturpflanzen mit einer natürlichen Resistenz gegen wichtige pilzliche Pathogene zu verwenden Neben den klassischen Züchtungsverfahren zur Herstellungvon Pflanzen mit einer natürlichen Resistenz spielen in den letzten Jahren verstärkt gentechnologische Ansätze eine große Rolle, bei denen z.B. durch Einführen externer Resistenzgene oder durch die Manipulation der endogenen Genexpression in den Pflanzen gezielt Resistenzen in wichtige Kulturpflanzen eingeführt werden sollen
Als Resistenz bezeichnet man die Fähigkeit einer Pflanze, Befall und Besiedlung durch einen Schaderreger zu verhindern oder zumindest zu begrenzen
Bei den natürlicherweise auftretenden Resistenzen, mit denen sich die Pflanzen gegen die Besiedelung durch phytopathogene Organismen wehren, können verschiedene Mechanismen unterschieden werden Diese spezifischen Wechselwirkungen zwischen Pathogen und Wirt entscheiden über den Infektionsverlauf.
Im Zusammenhang mit der Rasse-spezifischen Resistenz, die auch Wirtsresistenz genannt wird, unterscheidet man zwischen der kompatiblen und der inkompatiblen Interaktion Bei der kompatiblen Interaktion kommt es zur Wechselwirkung eines virulenten Pathogens mit einer anfälligen Pflanze Das Pathogen überlebt und kann Vermehrungsstrukturen ausbilden, der Wirt dagegen stirbt ab. Von einer inkompatiblen Interaktion spricht man hingegen, wenn das Pathogen die Pflanze zwar infiziert, jedoch vor oder nach schwacher Symptomausprägung in seinem Wachstum gehemmt wird. In diesem Fall ist die Pflanze gegen den betreffenden Erreger resistent. Sowohl bei der kompatiblen als auch bei der inkompatiblen Interaktion findet eine Abwehrreaktion des Wirts gegenüber dem Pathogen statt.
Die genetische Grundlage für die kompatible bzw. inkompatible Wirt /Pathogen-
Interaktion wurde durch die Gen-für-Gen-Hypothese beschrieben. Die Vorraussetzung für die Rasse-spezifische Pathogenerkennungist die direkte oder indirekte Interaktion des Produktes eines dominanten oder semi-dominanten Resistenzgens (R-Gen) der Pflanze mit einem Produkt, welches aus dem komplementären und dominanten Avirulenzgen ( Avr-Gen) des Phytopathogens stammt (Keen (1992) Annu Res. Genet.24: 447 - 463; Staskawiczet al. (1995) Science 268: 661 - 667). Wenn dem Krankheitserreger dagegen das komplementäre Avirulenzgen fehlt, kann es zum Ausbruch der Krankheit kommen. Das Gen-für-Gen-Modell hat sich für viele Rost-, Brand-, Echte- sowie Falsche Mehltaupilzinfektionen bestätigt, ist jedoch nicht auf alle Wirt-Parasit-Interaktionen übertragbar.
In der Natur wird diese Rasse-spezifische Resistenz jedoch aufgrund der schnellen evolutionären Entwicklung der Pathogene häufig überwunden (Neu et al. (2003) American Cytopathol. Society,MPMI 16 Nr.7: 626 - 633). Dagegen bietet dieNicht- Wirts-Resistenz einen starken, breiten und dauerhaften Schutz gegenüber
Phytopathogenen. Unter der Nicht-Wirts-Resistenz versteht man das Phänomen, dass ein Pathogen in einer bestimmten Pflanzenspezies eine Krankheit auslösen kann, in einer anderen, genetisch ähnlichen Pflanzenspeziesjedoch nicht (Heath (2002) Can. J. Plant Pathol.24: 259 -264).
Trotz dieser interessanten Eigenschaft sind die genetischen und molekularbiologischen Grundlagen für die Nicht-Wirts-Resistenz bisher nur wenig verstanden. Es gibt sowohl Anzeichen dafür, dass die Nicht-Wirts-Resistenz durch unspezifische Stoffe induziert wird als auch dafür, dass einzelne Pathogenproteine in der Art der Gen-für-Gen-Interaktion die Nicht-Wirts-Resistenzreaktion auslösen (Heath (1981) Phytopathology71: 1121 - 1123; Heath (2001) Physiol. Mol. Plant Pathol.58: 53 - 54; Kamounet al. (1998) Plant Cell 10: 1413 - 1425; Lauge et al. (2000) Plant J.23: 735 - 745; Whalen et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sd. USA 85: 6743 - 6747).
Ein weiterer Grund, weshalb es nur selten zur Beäedelung von Pflanzen durch Phyto- pathogene kommt, ist, dass das Pathogen aufgrund eines Mangels an Stoffen und Strukturen, die zum Infektionsverlauf benötigt werden, keine Infektionsstrukturen ausbilden kann Außerdem können auch unspezifisch induzierte oder präf ormierte Resistenzbarrieren, die schon vor der Infektion durch ein Pathogen vorliegen, die Bildung von Infektionsstrukturen verhindern Diese Resistenz wird als Basisresistenz oder Rasse- unspezifische Resistenz bezeichnet und durch passive und aktive Abwehjiriechanismen aufrechterhalten.
Bei der Kartoffelpflanze, sind zwei Formen der Resistenz, speziell gegen P. infestans, zu unterscheiden.
Die Basisresistenz (allgemeine oder relative Resistenz) beruht auf einem Zusammenwirken einer Vielzahl von Genen. Diese können Infektionen nicht vollständig verhindern, reduzieren aber die Entwicklungund Ausbreitung des Pathogens. Die allgemeine Resistenz ist weitestgehend Rasse-unspezüisch und äußert ach in verminderten Infektions-, Ausbreitungs- undSporulationsraten. Appressorien (pilzliche Penetrationspflöcke) bilden sich im Stomakomplex, an Epidermis-, Haar- und Drüsenzellen. Die unterschiedliche Anfälligkeit der verschiedenen Rassen kann man anhand der unterschiedlichen Ausbreitung des Hyphenwachstums und dem Ausmaß der Verzweigung ab ca 24 h nach der Infektion feststellen.
Bei der Rasse-spezifischen, auf spezifischen dominant vererbbaren Resistenzgenen beruhenden Überempfindlichkeitsresistenz (Hypersenabilität, HR) wird nach der Infektion bei bestimmten Wirts-Parasit-Beziehungen Inkompatibilität induziert. Die
Wirkung der Major-Gene (Resistenz-Gene) ist wenigumweltabhängig verliert aber durch die Genetik des Erregers spontan ihre Wirksamkeit.
Beide Formen der Resistenzen, die Basisresistenz und die Rasse-spezifische Über- empfindlichkeitsresistenz, können in einem Genotyp nebeneinander vorliegen
In den letzten Jahren konnten bereits Resistenzgene (R-Gene) identifiziert und kloniert werden; ua solche, die Resistenz gegen pilzliche Pathogene vermitteln So wird z.B. die Positionsklonierung des Resistenzgens Rpi-blbl beschrieben (van der Vossen et al. (2003) The Plant Journal 36: 867-882) . Kürzlich wurde ein weiteres Resistenzgen, Rpi-blb2, kloniert, das ebenso wie Rpi-blbl eine breite Resistenz gegenüber P. infestans vermittelt (van der Vossen et al. (2005) The Plant Journal 44(2) : 208-222) . Bei beiden, Rpi-blbl und Rpi-blb2, wurde bisher noch keine Rassenspezifität beobachtet.
Wie bereits oben beschrieben, geht ein beträchtlicher Anteil der möglichen Ernteerträge bei der Kartoffelpflanze infolge von Erkrankungen, besonders durch P. infestans- Inf ektionen, verloren- Um zum einen diese Ausbeuteverluste und zum anderen die Verwendung von Fungiziden im Allgemeinen zu reduzieren, gibt es seit längerem Bestrebungen, im Rahmen eines integrierten Pflanzenschutzes Kulturpflanzen mit einer natürlichen Resistenz gegen wichtige pilzliche Pathogene wie z.B. P. infestanszu verwenden
Durch Introgression verschiedener R-Gene aus Solanum deαissum in Kultur- Kartoffelsorten erzeugte Resistenzen erwiesen sich aufgrund neu auftretender P. infestans- Virulenzen als nicht stabil. Dauerhaftere Resistenzen hingegen, wie sie in einigen ursprünglicheren Solanum- Arten auftreten, sind nur schwierig in Kultur-Kartoffelsorten durch Kreuzung und Selektion nach Phänotyp zu übertragen
Die jahrzehntelangen, intensiven Bemühungen auf dem Gebiet der klassischen Resistenzzüchtunghaben folglich aufgrund mangelnder Stabilität der Resistenz im großflächigen Anbau und aufgrund äußerst schwieriger Übertragung der Resistenz-vermittelnden R-Gene von wilden Kartoffel-Sorten auf die heute gebräuchlichen „kommerziellen" Kartoffel-Sorten nur sehr begrenzte Erfolge erzielt und konnten die in sie gesetzten Erwartungen nicht erfüllen
Es besteht daher ein großer Bedarf an Verfahren, die Alternativen zur Vermittlungvon Rasse-unspezifischen Resistenzen gegen pilzliche Erreger wie P. infestans in Kartoffelpflanzen durch die klassische Resistenzzüchtung darstellen und an Pflanzen und/oder Pflanzenzellen, die eine Rasse-unspezifische Resistenz gegen pilzliche Erreger wie P. infestans zeigen Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Pflanzen bzw. Pflanzenzellen zur Verfügung zu stellen, die eine erhöhte Resistenz gegenüber verschiedenen Pathogenen, bevorzugt püzlichen Pathogenen, aufweisen Es ist weiterhin eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit einer Rasse-unspezifischen Resistenz gegenüber verschiedenen püzlichen Pathogenen wie z.B. P. infestans zur
Verfügung zu stellen Es ist ebenfalls eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, transgene Kartoffelpflanzen bzw. Kartoffelpflanzenzellen zur Verfügung zu stellen, die eine Rasse- unspezifische Sequenz gegenüber püzlichen Pathogenen, wie z.B. P. infestans, aufweisen
Darüber hinaus ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zur Verfügung zu stellen, die die Hersteüungder oben genannten transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzeüen mit einer erhöhten (Rasse-unspezifischen) Resistenz gegenüber Pathogenen, bevorzugt püzlichen Pathogenen, ermöglichen.
Zur Lösung dieser und weiterer Aufgaben, wie sie sich aus der Beschreibung ergeben, dienen die Merkmale der unabhängigen Ansprüche.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind durch die Merkmale der Unteransprüche definiert.
Überraschenderweise konnte im Rahmen der vorliegenden Erfindung gezeigt werden, dass die gleichzeitige Erhöhung des Gehalts der beiden R-Gene Rpi-blbl und Rpi-blb2 in transgenen Kartoffelpflanzen eine Rasse-unspezifische Breitbandresistenz gegenüber P. infestans vermittelt, die gegenüber Pflanzen, die mit nur einem der beiden Gene transformiert wurden, erhöht ist und auch höher als die Summe der durch die einzelnen Gene vermittelte Pathogenresistenz ist. Die beiden Gene scheinen daher synergistisch die Pathogenresistenz zu erhöhen.
Die vorliegende Erfindungbetrifft daher ein Verfahren zur Erhöhung der Pathogenresistenz, insbesondere der Pilzresistenz, in transgenen Pflanzen, insbesondere Kartoffelpflanzen, wobei der Gehalt der von den R-Genen Rpi-blbl und Rpi-blb2 kodierten Proteine gegenüber der entsprechenden Ausgangspflanze erhöht ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Erhöhung der Pathogenresistenz in Pflanzen und/oder Pflanzenzellen, wobei in den
Pflanzen/Pflanzenzellen der Gehalt an Rpi-blbl, kodiert durch eine Nukleinsäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die die Sequenz gemäß
SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 1 oder Fragmente dieser Sequenzen umfassen, b) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die für ein Protein mit der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, c) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die zu der in SEQ ID
NO: 5 oder SEQ ID NO: 1 angegebenen Nukleotidsequenz eine Sequenzidentität von mindestens 60% aufweisen, und/oder d) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die unter stringenten
Bedingungen mit einem komplementären Strang einer Nukleotidsequenz von a) bis c) hybridisieren, und der Gehalt an Rpi-blb2, kodiert durch eine Nukleinsäuresequenz, ausgewählt aus der
Gruppe bestehend aus : a) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die die Sequenz gemäß
SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 3 oder Fragmente dieser Sequenzen umfassen, b) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nuldeotidsequenzen, die für ein Protein mit der in SEQ ID NO: 4 angegebenen Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, c) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die zu der in SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 3 angegebenen Nukleotidsequenz eine Sequenzidentität von mindestens 60% aufweisen, und/oder d) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit einem komplementären Strang einer Nukleotidsequenz von a) bis c) hybridisieren, gegenüber der Ausgangspflanze erhöht wird
"Resistenz" bedeutet das Verhindern, das Reprimieren, das Vermindern oder Abschwächen von Krankhάtssymptomen einer Pflanze, die infolge eines Befalls durch ein Pathogen auftreten Die Symptome können vielfältiger Art sein, umfassen aber bevorzugt solche, die direkt oder indirekt zu einer Beeinträchtigung der Qualität der Pflanze, der Quantität des Ertrages, der Eignungzur VerwendungalsFutter- oder Nahrungsmittel führen oder aber auch Aussaat, Anbau, Ernte oder Prozessierung des Erntegutes erschweren
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die folgenden Krankheitssymptome abgeschwächt, vermindert oder verhindert: Bildung von Pusteln und Sporienlagern auf den Oberflächen der befallenen Gewebe, Mazeration der Gewebe, spreitende Nekrosen des Gewebes und/oder Akkumulation von Mykotoxinen
Eine "erhöhte Pathogenresistenz" bedeutet, dass die Abwehrmechanismen einer bestimmten Pflanze oder in einemTeil einer Pflanze, z.B. in einem Organ, einem Gewebe, einer Zelle oder einem Organell, durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens im Vergleich zu einer geeigneten Kontrolle, z.B. dem Wildtyp der Pflanze („Kontrollpflanze", „Ausgangspflanze") , auf den das erfindmgsgemäße Verfahren nicht angewendet wurde, unter ansonsten gleichen Bedingungen (wie beispielsweise Klima- oder Anbaubedingungen, Pathogenart etc.) eine erhöhte Resistenz gegen ein oder mehr Pathogene aufweist.
Unter dem Begriff „erhöhte Resistenz' ' bzw. „Erhöhung der Resistenz" wird erfindungsgemäß verstanden, dass die erfindungsgemäßen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen durch Pathogene weniger stark und/oder weniger häufigbefallen werden Bevorzugt ist der Befall mit Pathogenen mindestens um den Faktor 2, besonders bevorzugt mindestens um den Faktor 3, insbesondere bevorzugt mindestens um den Faktor 5 und am meisten bevorzugt mindestens um den Faktor 10 gegenüber der Ausgangspflanze reduziert. Der Begriff "erhöhte Resistenz" beinhaltet dabei auch eine so genannte transiente Resistenz, d.h. dass die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen nur für einen begrenzten Zeitraum eine gegenüber dem entsprechenden Wildtyp erhöhte Resistenz aufweisen.
Bei den „Pathogenen" kann es sich um jeden Erreger handeln, der üblicherweise Pflanzen befällt, zB. Viren, Bakterien und/oder Pilze, und dessen Interaktionen mit einer Pflanze zu den oben beschriebenen Krankhdtssymptomen führen Bevorzugt handelt es sich bei den Pathogenen um pilzliche Erreger.
Bei den Tilzpathogenen", „pilzlichen Pathogenen" oder „pilzlichen Erregern" kann es sich um jeden pilzlichen Erreger handeln, der die Wildtyppflanze normalerweise befällt, bevorzugt handelt es sich dabei um den Erreger der Kraut- und Knollenfäule P. infestans, Phytophthαra sojae, Phytophthαra erythrospetica, Phytcphthαra ramourum, Phytophthcra paraätica oder um Percncspαra tabaciana oder Hyalopercnospcra paraätica. Unter dem Begriff „Rpi-blbl -Nukleinsäuresequenz" oder „Rpi-blbl -Gen", wie er hier verwendet wird, wird eine Nukleinsäuresequenz verstanden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 1 oder Fragmente dieser Sequenzen umfassen, b) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die für ein Protein mit der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, c) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die zu der in SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 1 angegebenen Nukleotidsequenz eine Sequenzidentität von mindestens 60% aufweisen, und/oder d) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit einem komplementären Strang einer Nukleotidsequenz von a) bis c) hybridisieren.
Unter dem Begriff JNTukleinsäuresequenz von Rpi-blb2" oder „Rpi-blb2-Gen." wie er hier verwendet wird, wird eine Nukleinsäuresequenz verstanden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 3 oder Fragmente dieser Sequenzen umfassen, b) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die für ein Protein mit der in SEQ ID NO: 4 angegebenen Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, c) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die zu der in SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 3 angegebenen Nukleotidsequenz eine Sequenzidentität von mindestens 60% aufweisen, und/oder d) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit einem komplementären Strang einer Nukleotidsequenz von a) bis c) hybridisieren Der Begriff ' Nukleinsäure(molekül) ' ', wie hier verwendet, umf asst in einer bevorzugten Ausführungsform zudem die am 3'- und am 5'-Ende des kodierenden Genbereichs gelegene untranslatierte Sequenz: mindestens 500, bevorzugt 200, besonders bevorzugt 100 Nukleotide der Sequenz stromaufv\ärts des 5'-Endes des kodierenden Bereichs und mindestens 100, bevorzugt 50, besonders bevorzugt 20 Nukleotide der Sequenz stromabwärts des 3'-Endes des kodierenden Genbereichs.
Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuremoleküle, z.B. ein Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz der SEQ ID No. 1, 3, 5 oder 6 oder einem Teil davon, können unter Verwendung molekularbiologischer Standardtechniken und der hier bereit gestellten Sequenzinformation isoliert werden Auch können mit Hilfe von VergLdchsalgorithmen, wie sie z.B. auf der NCBI-Homepage unter http: //www.ncbi.nlm.nih.gov zu finden sind, beispielsv\eise eine homologe Sequenz oder homologe, konservierte Sequenzbereiche auf DNA- oder Aminosäureebene identifiziert werden Wesentliche Teile dieser Sequenz oder die gesamte homologe Sequenz können als Hybridisierungssonde unter Verwendung von Standardhybridiäerungstechniken (wie z.B. beschrieben in Sambrook et al., vide supra) zur Isolierungweiterer im Verfahren nützlicher Nukleinsäuresequenzen aus anderen Organismen durch das Screening von cDNA- und/oder genonischen Banken verwendet werden Überdies lässt sich ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine vollständige Sequenz gemäß SEQ ID No. 1, 3, 5 oder 6 oder einen Teil davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei Oligonukleotidprimer auf der Basis der hier angegebenen Sequenzen oder von Teilen davon verwendet werden (z.B. kann ein Nukleinsäuremolekül, umfassend die vollständige Sequenz oder einen Teil davon, durch Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von OKgonukleotidprimern isoliert werden, die auf der Basis dieser gleichen Sequenz erstellt worden sind) . Zum Beispiel lässt sich mRNA aus Zellen isolieren (z.B. durch das GuanidiniumtHcicyanat-Extraktionsverfahren von Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18: 5294 - 5299) und daraus mittels reverser Transkriptase (z.B. Moloney- MLV-Reverse Transkriptase, erhältlich von Gibco/BRL, Bethesda, MD oder AMV- Reverse-Transkriptase, erhältlich von SeLkagaku Amerika, Inc., St. Petersburg FL) cDNA herstellen. Synthetische OKgpnukleotidprimer zur AmplifizierungmittelsPolyme- rasekettenreaktion lassen sich auf der Basis der in SEQ ID No. 1, 3, 5 oder 6 dargestellten Nukleinsäuresequenzen oder mit Hilfe der in SEQ ID No.2 oder 4 dargestellten Aminosäuresequenz erstellen. Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kann unter Verwendung von cDNA oder alternativvon genomischer DNA als Matrize und geeigneten OHgonuldeotidprimern mittels Standard-PCR-Amplifikationstechniken amplifiziert werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und mittels DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Oligonukleotide, die einer Nukleotidsequenz entsprechen, welche für ein erfindungsgemäßes Protein kodiert, können durch Standardsyntheseverfahren, beispielsweise mit einem automatischen DNA-Synthesegerät, hergestellt werden.
Unter dem Begriff ' 'Sequenzidentität' ' zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen wird die Identität der Nukleinsäuresequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge verstanden, in einer bevorzugten Ausführungsform über die gesamte exprimierte Sequenzlänge, bevorzugt cDNA, noch mehr bevorzugt über die codierende Sequenz, bevorzugt CDS, verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithrnus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA; Altschul et al. (1997) Nucleic AcidsRes.25: 3389a) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird
Gap Wάght: 50 Length Wάght: 3
Average Match: 10 Average Mismatch: 0 Beispielhaft weist eine Sequenz, die eine Identität von mindestens 80 % auf Nukleinsäure- basis mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 aufweist, bei einem Vergleich mit dieser Sequenz nach obigem Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Identität von mindestens 80 % auf.
In einer Ausführungsforrnbetrifft die vorliegende Erfindung Nukleinsäuresequenzen, die zu der in SEQ ID No. 1, 3, 5 oder 6 angegebenen Sequenz eine Sequenzidentität von mindestens 60%, bevorzugt mindestens 65, 70, 75 oder 80%, besonders bevorzugt von mindestens 82, 84, 86, 88 oder 90% und am meisten bevorzugt von mindestens 92, 94, 96, 98 oder 99% aufweisen
Unter 'Identität zwischen zwei Proteinen" wird die Identität der Aminosäuren über einen bestimmten Proteinbereich verstanden, vorzugsweise die gesamte Proteinlänge, insbesondere die Identität, die durch Vergleich mit Hilfe von Software, z.B. der Lasergene- Software der Firma DNA Star Inc., Madison, Wisconsin (USA) unter Anwendung der CLUST AL-Methode (Higginset al. (1989) Comput. Appl. Biosci.5(2): 151) berechnet wird. Homologien können ebenfalls mit Hilfe der Lasergene-Software der Firma DNA Star Inc., Madison, Wisconsin (USA) unter Anwendung der CLUST AL-Methode (Higginset al. (1989) Comput. Appl. Biosci.5(2): 151) berechnet werden
Bevorzugt wird unter 'Identität zwischen zwei Proteinen" die Identität der Aminosäuresequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird Gap Weight: 8 Length Weight: 2
Average Match 2,912 Average Msmatch-2,003
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung and Nukleinsäuremoleküle, die mit einem komplementären Strang einer Nukleinsäuresequenz, die für Rpl-blbl bzw. Rpi-blb2 oder funktionell äquivalente Teile davon kodiert, unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
Stringente in vitro-Hybridiäerungsbedingungen and dem Fachmann bekannt und können der Literatur entnommen werden (äehe z.B. Sambrook et al., vide supra) . Der Begriff "spezifische Hybridisierung" bezieht ach auf den Umstand, dass ein Molekül unter stringenten Bedingungen präf erentiell an eine bestimmte Nukleinsäuresequenz bindet, wenn diese Nukleinsäuresequenz Teil einer komplexen Mischungvon z.B. DNA- oder RNA-Molekülenist.
Der Begriff "stringente Bedingungen" bezieht sich damit auf Bedingungen, unter denen eine Nukleinsäuresequenz präf erentiell an eine Zielsequenz bindet, aber nicht oder zumindest wesentlich reduziert an andere Sequenzen.
Stringente Bedingungen sind von den Umständen abhängig Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen Generell werden stringente Bedingungen so gewählt, dass die Hybridiäerungstemperatur circa 5X1 unter dem Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer definierten ionischen Stärke und einem definierten pH-Wert liegt. Tm ist die Temperatur (bei einem definierten pH-Wert, einer definierten ionischen Stärke und einer definierten Nukleinsäurekonzentration), bei der 50% der Moleküle, die zu einer Zielsequenz komplementär sind, mit dieser Zielsequenz hybridisieren Typischerweise umfassen stringente Bedingungen Salzkonzentrationen zwischen 0,01 und 1,0 M Natriumionen (oder eines anderen Salzes) und einen pH zwischen 7,0 und 83- Die Temperatur ist mindestens 309C für kurze Moleküle (z.B. für solche, die zwischen 10 bis 50 Nukleotiden umfassen) . Zusätzlich können stringente Bedingungen die Zugabe von destabilisierenden Agenzien wie z.B. Formamid umfassen. Typische Hybridisierungs- und Waschpuffer haben folgende Zusammensetzung
Präliybridisierungslösung 0,5 % SDS
5xSSC
5O mM NaPO4, pH 6,8
0,1% Na-Pyrophosphat
5x Denhardt's Reagenz 100 ug/ml Lachssperma
Hybridisierungslösung Prahybridisierungslsg
IxIO6 cpm/ml Sonde (5-10 min 959C)
2OxSSC: 3 MNaCl
03 M Natriumeitrat adpH 7mit HCl
5Ox Denhardt's Reagenz: 5 gFicoll
5 gPolyvinyipyrrolidon 5 g Bovine Serum Albumine ad500 mlA dest.
Eine typische Verfahrensv\eise für die Hybridisierung sieht folgendermaßen aus
Optional: Blot 30 rrrinin lxSSC/O/L%SDS bei 65X1 waschen
Prähybridisierung mindestens 2 h bei 50-55X1
Hybridisierung über Nacht bei 55-609C
Waschen: 5 min 2xSSC/0,l%SDS Hybridisierungstemp.
30 min 2xSSC/0,l%SDS Hybridiäerungstemp.
30 min lxSSC/O,l%SDS Hybridisierungstemp.
45 min 0,2xSSC/0,l%SDS 65X2
5 min 0,IxSSC Raumtemperatur
Nukleinsäuresequenzen, die von der in SEQ ID No.l, 3, 5 oder 6 angegebenen Nukleinsäuresequenz abweichen, können z.B. durch Einbringen einer oder mehrerer Nukleotidsubstitutionen, -additionen oder -deletionen in eine Nukleotidsequenz der SEQ ID No.1, 3, 5 oder 6 erzeugt werden, so dass Proteine entstehen, in die gegenüber der in SEQ ID No.2 oder 4 angegebenen Sequenz eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder -deletionen eingebracht wurden Mutationen können in die Sequenz der SEQ ID No. 1, 3, 5 oder 6 durch Standardtechniken, wie z.B. stellenspezifische Mutagenese und PCR-vermittelte Mutagenese, eingebracht werden Vorzugsv\eise werden konservative Aminosäuresubstitutionen an einem oder mehreren der vorhergesagten nicht-essentiellen Aminosäurereste, also an Aminosäureresten, die die Kinaseaktivität und/oder die LRR-Domäne nicht beeinflussen, hergestellt. Bei einer "konservativen Arrrinosäuresubstitutiori" wird ein Aminosäurerest gegen einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette ausgetauscht. Im Fachgebiet sind Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten definiert worden Diese Familien umfassen Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z.B. Lysin, Argjnin, Histidin), sauren Seitenketten (z.B. Asparagjnsäure und Glutaminsäure), ungeladenen polaren Seitenketten (z.B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), unpolaren Seitenketten (z.B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), betaverzweigten Seitenketten (z.B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (z.B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan) . Ein vorhergesagter nicht-essentieller Aminosäurerest in dem erfindungsgemäß verwendeten Protein wird somit vorzugsweise durch einen anderen Aminosäurerest aus der gleichen Seitenkettenf amüie ausgetauscht. Alternativ können bei einer anderen Ausführungsform die Mutationen zufallsgemäß über die gesamte oder einen Teil der für das erfindungsgemäße Protein kodierenden Sequenz eingebracht werden, z.B. hinsichtlich ihrer Fähigkeit, Pathogenresistenz zu vermitteln, durchmustert werden
Wenn im Rahmen der Erfindung von „funktionell äquivalenten Teilen", „im Wesentlichen funktionell homologen Teilen" oder Fragmenten" gesprochen wird, dann sind damit Fragmente der Nukleinsäuresequenzen, die für Rpi-blbl bzw. Rpi-blb2 mit der SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 1 bzw. SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 3 kodieren, gemeint, deren Expression zu Proteinen mit den Resistenz-vermittelnden Eigenschaften der Proteine Rpi-blbl bzw. Rpi-blb2 führen. Ebenso werden mit diesen Begriffen Proteinfragmente bezeichnet, die die Resistenz-vermittelnden Hgenschaften der vollständigen Rpi-blbl- und Rpi-blb2-Proteine gemäß SEQ ID NO: 2 bzw. SEQ ID NO: 4 aufweisen Wie bereits oben erwähnt wurde, können die oben genannten Nukleinsäuresequenzen, die für Rpi-blbl bzw. Rpi-blb2 oder funktionell äquivalente Teile oder Fragmente davon kodieren, benutzt werden, um transgene Pflanzen mit einem erhöhten Gehalt an Rp-blbl und Rpi-blb2 herzustellen, was zur Folge hat, dass diese Pflanzen über eine erhöhte Pathogenresistenz, bevorzugt gegenüber dem Erreger der Kraut- und Knollenfäule P. infestans, verfügen
Die erfindungsgemäße Erhöhung der Pathogenresistenz kann auch dadurch erreicht werden, dass die Expression der Pflanzen-eigenen endogenen Proteine, die den erfindungs- gemäß verwendeten Proteinen entsprecherv manipuliert wird Diese Manipulation der Proteinexpression kann beispielsweise durch eine Veränderung der Promotor-DNA- Sequenz eines oder beider Protein-kodierenden Gene erreicht werden Eine solche Veränderung, die eine veränderte, vorzugsweise erhöhte Expressionsrate des endogenen erfindungsgemäßen Gens zur Folge hat, kann durch Deletion oder Insertion von DNA- Sequenzen erfolgen Eine Veränderung der Promotor-Sequenz von endogenen erfindungsgemäßen Genen führt in der Regel zu einer Veränderung, bevorzugt Erhöhung, der exprimierten Menge des Gens und damit zu einem veränderterv bevorzugt erhöhten, Gehalt des bzw. der Proteine.
Eine weitere Möglichkeit zur Erhöhung der Aktivität und des Gehalts der erfindungsgemäßen endogenen Proteine besteht darin, Transkriptionsfaktoren, die in die Transkription des entsprechenden endogenen Genes involviert sind, z.B. durch Uberexpression hochzureguliererL Die Maßnahmen zur Uberexpression von Transkriptionsfaktoren sind demFachmann bekannt und werden ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindungfür erfindungsgemäße Proteine offenbart. Des Weiteren kann eine erhöhte Expression eines endogenen erfindungsgemäßen Gens dadurch erzielt werden, dass ein im nicht-transformierten Organismus nicht vorkommendes Regulatorprotein mit dem Promotor dieser Gene in Wechselwirkung tritt. Bei einem solchen Regulator kann es sich um ein chimäres Protein handeln, welches aus einer DNA-Bindedomäne und einer Transkriptionsaktivator-Domäne besteht, wie
Figure imgf000022_0001
"Tranken" meint zum Beispiel bezüglich einer Nukleinsäuresequenz, einer Expressionskassette oder einem Vektor enthaltend besagte Nukleinsäuresequenz oder einem Organismus transformiert mit besagter Nukleinsäuresequenz, Expressionskassette oder Vektor, alle solche durch gentechnische Methoden zustande gekommenen Konstruktionen oder Organismen, in denen sich entweder
a) die rri-blbl- und/oder die rpi-blb2-Nukleinsäuresequenz, oder
b) eine mit der rri-blbl- und/oder der rpi-blb2-Nukleinsäuresequenz funktionell verknüpfte genetische Kontrollsequenz, zum Beispiel ein Promotor, oder
c) (a) und(b)
nicht in ihrer natürlichen, genetischen Umgebungbefinden oder durch gentechnische Methoden modifiziert wurden, wobei die Modifikation beispielhaft eine Substitution, Addition, Deletion, oder Insertion eines oder mehrerer Nukleotidreste sein kann ' Natürliche genetische Umgebung' ' meint den natürlichen chromosomalen Locus in dem Herkunftsorganismus oder das Vorliegen in einer genomischen Bibliothek. ImFaIl einer genomischen Bibliothek ist die natürliche, genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz bevorzugt zumindest noch teilweise erhalten Die Umgebungflankiert die Nukleinsäuresequenz zumindest an einer Seite und hat eine Sequenzlänge von mindestens 50 bp, bevorzugt mindestens 500 bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 5000 bp. Eine natürlich vorkommende Expressionskassette - beispielsweise die natürlich vorkommende Kombination des rpi- blbl- und/oder des rpi-blb2-Promotors mit dem entsprechenden rpl-blbl- und/oder rpl- blb2-Gen - wird zu einer transgenen Expressionskassette, wenn diese durch nicht- natürliche, synthetische ("künstliche") Verfahren wie beispielsweise eine Mutagenisierung verändert wird. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (US 5,565,350; WO 00/15815).
Die vorliegende Erfindungbetrifft damit generell Verfahren zur Erhöhung der Pathogenresistenz in Pflanzen bzw. Pflanzenzellen , wobei in den Pflanzen im Vergleich zur Ausgangspflanze der Gehalt von Rpi-blbl und zugleich Rpi-blb2 erhöht ist. Bei den im Folgenden beschriebenen Verfahren zur Erhöhung der Pathogenresistenz in transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen und Erhöhung des Gehalts an Rpi-blbl und zugleich RpI- blb2 können sämtliche oben erwähnten Nukleinsäuresequenzen und Fragmente davon zum Einsatz kommen, die für Rpi-blbl -Proteine bzw. Rpi-blb2-Proteine kodieren, die bei Uberexpression in transgenen Kartoffelpflanzen eine erhöhte Pathogenresistenz vermitteln
Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird gegenüber der Wildtyp-Pflanze eine deutliche Erhöhung des Gehalts sowohl an Rpi-blbl als auch an Rpi-blb2 in der Pflanze bzw. Pflanzenzelle herbeigeführt.
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diese Erhöhung des Gehalts mindestens 20%, bevorzugt mindestens 50%, besonders bevorzugt mindestens 100, 150 oder 200%, md am meisten bevorzugt mindestens 300%, 400,500, 600 oder 700% gegenüber der Ausgangspflanze. Der Gehalt der Pflanze bzw. Pflanzenzellen an Rpi-blbl und Rpi-blb2 kann durch molekularbiologische Verfahren, die dem Fachmann geläufig and, bestimmt werden Dazu gehören ua Northern-Blot- oder RT-PCR-Analysen zum spezifischen Nachweis der RNA oder Western-Blot- Analysen zum Nachweis des Proteins.
Unter einer ' Ausgangspflanze bzw. -pflanzenzelle' ' wird erfindungsgemäß ein Organismus verstanden, auf den das erfindungsgemäße Verfahren nicht angewendet wurde und der dadurch einen nicht erhöhten Gehalt an rpi-blbl und/oder rpi-blb2 enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Ausgangspflanze um einen nicht genetisch veränderten Organismus.
In einer Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren die Herstellung transgener Pflanzen und/oder Pflanzenzellen die folgenden Schritte:
A) Herstellen eines rekombinantenNukleinsäuremoleküls umfassend i) eine in Pflanzen funktionelle Promotorsequenz und funktionell damit verknüpft eine erste Nukleinsäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 1 oder Fragmente dieser Sequenzen umfassen, b) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die für ein Protein mit der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, c) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die zu der in SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 1 angegebenen Nukleotidsequenz eine Sequenzidentität von mindestens 60% aufweisen, und/oder d) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit einem komplementären Strang einer Nukleotidsequenz von a) bisc) hybridisieren, und funktionell damit verknüpft eine in Pflanzen funktionelle Terminationssequenz, und ii) eine in Pflanzen funktionelle Promotorsequenz und funktionell damit verknüpft eine zweite Nukleinsäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzerv die die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 3 oder Fragmente dieser Sequenzen umfassen, b) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzerv die für ein Protein mit der in SEQ ID NO: 4 angegebenen Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, c) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die zu der in SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 3 angegebenen Nukleotidsequenz eine Sequenzidentität von mindestens 60% aufweisen, und/oder d) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit einem komplementären Strang einer Nukleotidsequenz von a) bis c) hybridisieren, und funktionell damit verknüpft eine in Pflanzen funktionelle Terminationssequenz,
B) Übertragen des Vektors aus Schritt A) auf eine Pflanzenzelle und gegebenenfalls Integration in das pflanzliche Genom,
C ) gegebenenfalls Regenerieren von Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen
Die im Verfahren verwendeten, oben unter den Punkten i) bzw. ii) genannten ersten und zweiten Nukleinsäuresequenzen müssen nicht unbedingt auf ein und demselben Vektor liegen, um gemeinsam in der Pflanzenzelle exprimiert zu werden Sie können auch auf verschiedenen Vektoren vorliegen In diesem Falle können die Konstrukte entweder gleichzeitig oder nacheinander in die Pflanzenzelle eingebracht werden Auch ist es selbstverständlich möglich, dass zunächst transgene Pflanzen erzeugt werden, die jeweils nur die erste oder die zweite Nukleinsäuresequenz enthalten und exprimieren, um diese Einzdtransf ormanten im nächsten Schritt miteinander zu kreuzen, um dann Doppdtransf ormanten, in denen beide Nukleinsäuresequenzen enthalten sind und exprimiert werden, herzustellen.
Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren können nach dem Einbringen in eine
Pflanzenzelle bzw. Pflanze entweder auf einem separaten Plasmid liegen oder vorteilhaft in das Genom der Wirtszelle integriert sein. Bei Integration in das Genom kann die Integration zufallsgemäß sein oder durch derartige Rekombination erfolgen, dass das native Gen durch die eingebrachte Kopie ersetzt wird.
Der Fachmann weiß, wie ein Vektor aus Schritt A) auf Pflanzenzellen übertragen werden kann und welche Merkmale der Vektor besitzen muss, um ins pflanzliche Genom integrieren zu können.
Gegenstand der vorliegenden Erfindungist auch ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül umfassend i) eine in Pflanzenzellen funktionelle Promotorsequenz und funktionell damit verknüpft eine erste Nukleinsäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 5 oder Fragmente davon umfassen, b) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die für ein Protein mit der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, c) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die zu der in SEQ ID NO: 5 angegebenen Nukleotidsequenz eine Sequenzidentität von mindestens 60% aufweisen, und d) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die untar stringenten Bedingungen mit einem komplementären Strang einer Nukleotidsequenz von a) bis c) hybridisieren, und funktionell damit verknüpft eine in Pflanzenzellen funktionelle Terrrinationssequenz, und ii) eine in Pflanzenzellen funktionelle Promotorsequenz und funktionell damit verknüpft eine zweite Nukleinsäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 6 oder Fragmente davon umfassen, b) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die für ein Protein mit der in SEQ ID NO: 4 angegebenen Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, c) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die zu der in SEQ ID NO: 6 angegebenen Nukleotidsequenz eine Sequenzidentität von mindestens 60% aufweisen, und d) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit einem komplementären Strang einer Nukleotidsequenz von a) bis c) hybridisieren, und funktionell damit verknüpft eine in Pflanzenzellen funktionelle Terminationssequenz.
Die rekombinanten Nukleinsäuremoleküle, auch Konstrukte oder Vektoren genannt, die zur Expression von Rpi-blbl und Rpi-blb2 verwendet werden, können neben der zu übertragenden Nukleinsäuresequenz von Rpi-blbl und Rpi-blb2 weitere regulatorische Elemente umf assen. Welche konkreten regulatorischen Elemente diese Vektoren enthalten müssen, hängt dabei jeweils von dem Verfahren ab, das mit diesen Vektoren durchgeführt werden soll. Über welche regulatorischen Elemente und auch anderen Elemente diese Vektoren verfügen müssen, ist dem Fachmann, der mit den verschiedenen oben erwähnten Verf ahren zum Herstellen von transgenen Pflanzen, in denen die Expression eines Proteins gesteigert wird, vertraut ist, bekannt.
Typischerweise handelt es sich bei den regulatorischen Elementen, die die Vektoren enthalten, um solche, die die Transkription und, falls erwünscht, Translation in der Pflanzenzelle gewahrleisten. Dies kann beispielsweise je nach ausgewählter Pflanze bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert und/oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen, an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nukleinsäuresequenz regulieren Zusätzlich zu diesen neuen Regulationssequenzen oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation der Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und ggf. genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wird. Das rekombinante Nukleinsäuremolekül kann aber auch einfacher aufgebaut sein, dh es sind keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Nukleinsäuresequenz inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Des Weiteren kann auch die natürliche Regulationssequenz so mutiert werden, dass keine Regulation mehr erfolgt und/oder die Genexpression gesteigert wird. Diese veränderten Promotoren können in Form von Teilsequenzen auch allein vor das natürliche Gen zur Steigerung der Aktivität gebracht werden Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise auch eine oder mehrere so genannte "Enhancer' '-Sequenzen funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren Für das erfindungsgemäße Verfahren können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen verwendet werden. Es ist jedoch auch möglich und vorteilhaft, zusätzlich oder alleine synthetische Promotoren bzw. heterologe Promotoren zu verwenden.
Der Ausdruck ' heterologer Promotor' ', wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Promotor, der ini Ursprungsorganismus nicht die Expression des betreffenden Gens (ORFs) kontrolliert.
Bei den Promotoren kann es sich sowohl um konstitutive als auch um induzierbare oder gewebe- bzw. entwicklungsspezifische Promotoren handeln Die Auswahl des Promotors wie auch anderer regulatorischer Sequenzen bestimmt dabei das räumliche und zeitliche Expressionsmuster und damit die Expresson der R-Gene in transgenen Pflanzen
Der Begriff „pflanzenspezifische Promotoren" bzw. „in Pflanzen funktionelle
Promotorsequenzen" meint grundsätzlich jeden Promotor, der die Expression von Genen, insbesondere Fremdgenen, in Pflanzen oder Pflanzenteilen, -zellen, -geweben, -kulturen steuern kann Dabei kann die Expression beispielsweise konstitutiv, induzierbar, gewebespezifisch oder entwicklungsabhängig sein
Bevorzugt sind
a) Konstitutive Promotoren
Bevorzugt sind Vektoren, die eine konstitutive Expression in Pflanzen ermöglichen (Benfeyet al.(1989) EMBOJ.8: 2195-2202). "Konstitutiver" Promotor meint solche Promotoren, die eine Expression in zahlreichen, bevorzugt allen, Geweben über einen größeren Zeitraum der Pflanzmentwicklung. bevorzugt zu allen Zeitpunkten der Pflanzenentwicklung, gewahrleisten.
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Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvirus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der Promotor des 35S-TranskriptesdesCaMV (Blumenkohlmosaikvirus) (Franck et al. (1980) Cell 21: 285-294; Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812;
Shewmaker et al. (1985) Virology 140: 281-288; Gardner et al. (1986) Plant Mol. Biol.6: 221- 228) oder der 19S CaMV Promotor (US 5,352,605; WO 84/02913; Benfey et al. (1989) EMBO J.8: 2195-2202). Ein weiterer geeigneter konstitutiver Promotor ist der "Rubisco small subunit (SSU) "-Promotor (US 4,962,028), der Promotor der Nopalinsynthase aus Agrobacterium, der TR-Doppelpromotor, der OCS (Octopin
Synthase) Promotor aus Agrobacterium, der Ubiquitin Promotor (Holtorf S et al. (1995) Plant Mol Biol 29: 637-649), der Ubiqiitin 1 Promotor (Christensen et al. (1992) Plant Mol Biol 18: 675-689; Bruce et al. (1989) Proc. Natl. Acad Sd. USA 86: 9692-9696), der Smas Promotor, der Cinnamylalkoholdehydrogenase-Promotor (US 5,683,439), die Promotoren der vakuolärer ATPase Untereinheiten oder der Promotor eines prolinreichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991), sowie weitere Promotoren von Genen, deren konstitutrve Expression in Pflanzen dem Fachmann bekannt ist.
b) Gewebespezifische Promotoren
Des Weiteren können auch Promotoren mit Spezifitäten für die Antheren, Ovarien, Blüten, Blätter, Stengel, Wurzeln und Samen verwendet werden.
Samenspezifische Promotoren wie zum Beispiel der Promotor des Phaseolins (US 5,504,200; Bustoset al. (1989) Plant Cell 1(9): 839-53), des2S Albumingens
(Joseffsonet al. (1987) J. Biol. Chem 262: 12196-12201), desLegumins(Shirsat et al. (1989) Mol. Gen Genet.215(2): 326-331), des USP (unknownseed protein; Bäumleinet al. (1991) Mol. Gen Genet.225(3): 459-67), desNapinGens(US 5,608,152; Stalberget al. (1996) L. Planta 199: 515-519), des Saccharosebindeproteins (WO 00/26388) oder der LegurrrinM-Promotor (LeB4; Bäumleinet al. (1991) Mol. Gen Genet.225: 121-128; Bäumleinet al. (1992) Plant Journal 2(2): 233-9; Fiedler et al. (1995) Biotechnology(NY) 13(10): 109Of), der Oleosin-Promotor aus Arabidopsis (WO 98/45461), der Bce4-
Promotor aus Brassica (WO 91 /13980) . Weitere geeignete samenspezifische Promotoren sind die der Gene kodierend für das "High Molecular Wάght Glutenin" (HMWG), Gliadin, Verzwdgungsenzym, ADP Glucose Pyrophosphatase ( AGPase) oder die Stärkesynthase. Bevorzugt sind ferner Promotoren, die eine samenspezifische Expression in Monokotyledonen wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis etc. erlauben Vorteilhaft eingesetzt werden können der Promotor des lpt2 oder lptl-Gen (WO 95 /15389, WO 95/23230) oder die in WO 99/16890 beschriebenen Promotoren (Promotoren des Hordein-Gens, des Glutelin-Gens, des Oryzin-Gens, des Prolamin-Gens, des Gliadin- Gens, des Zein-Gens, des Kasirin-Gens oder des Secalin-Gens) .
Knollen-, Speicherwurzel- oder Wurzel-spezifische Promotoren sind beispielsweise der Patatin-Promotor Klasse I (B33) und der Promotor des Cathepsin D-Inhibitors aus Kartoffel.
Blattspezifische Promotoren sind beispielsweise der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel (WO 97/05900), der SSU Promotor (small subunit) der Rubisco (Ribulose- 1,5-bisphosphatcarboxylase) oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhauset al. (1989) EMBO J.8: 2445-2451) . Epidermis-spezifische Promotoren sind beispielsweise der Promotor des OXLP-Gens ("Oxalat-Oxidase like protein"; Wei et al. (1998) Plant Mol. Biol.36: 101-112),einPromotorbestehendausdemGSTAl-Promotorunddem WIRIa- Intron (WO 2005 /035766) und der GLP4-Promotor (PCT /EP 2006 /062747) . Andere Gewebespezifische Promotoren and z.B. blütenspezifische Promotoren wie beispielsweise der Phytoen-Synthase-Promotor (WO 92 /16635) oder der Promotor des P-rr Gens (WO 98 /22593) und Antheren-spezifische Promotoren wie der 5126-Promotor (US 5,689,049; US 5,689,051), der globl-Promotor und der ?-Zein Promotor.
c) Chemisch induzierbare Promotoren
Die Expressionskassetten können auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten (Übersichtsartikel: Gatzet al. (1997) Annu Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.48: 89- 108) , durch den die Expression des exogenen Gens in der Pflanze zu einembestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann Derartige Promotoren, wie z.B. der PRPl Promotor (Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol.22: 361-366), ein durch Salicylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzolsulf onamid induzierbarer Promotor (EP 0388 186), ein durch Tetrazyklin induzierbarer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J. 2: 397-404), ein durch Abscisinsäure induzierbarer Promotor (EP 0335528) bzw. ein durch Ethanol oder Cydohexanon induzierbarer Promotor (WO 93/21334) können ebenfalls verwendet werden
d) Stress- oder Pathogen-induzierbare Promotoren
Vorteilhaft ist die Verwendung von pathogen-induzierbaren Promotoren, da diese eine Expression nur im Bedarfsfall (dh. Pathogenbefall) ermöglichen
Pathogen-induzierbare Promotoren umfassen die Promotoren von Genen, die infolge eines Pathogenbef alls induziert werden, wie beispielsweise Gene von PR-Proteinen, SAR- Proteinen, ß-13-Glucanase, Chitinase usw. (beispielsweise Redolfi et al. (1983) Neth. J. Plant Pathol.89: 245-254; Ukneset al. (1992) Plant Cell 4: 645-656; VanLoon (1985) Plant Mol. Viral.4: 111-116; Marineauet al. (1987) Plant Mol. Biol.9: 335-342; Matton et al. (1987) Molecular Plant-Microbelnteractions2: 325-342; Somssichet al. (1986) Proc. Natl. Acad Sei. USA 83: 2427-2430; Somssichet al. (1988) Mol. Gen. Genetics2: 93-98; Chenet al. (1996) Plant J. 10: 955-966; ZhangandSing(1994) Proc. Natl. Acad Sd. USA91: 2507-2511; Warner et al. (1993) Plant J.3: 191-201; Siebertzet al. (1989) Plant CeU 1: 961-968).
Umf asst sind auch durch Verwundung induzierbare Promotoren wie der des pinll-Gens (Ryan (1990) Ann Rev. Phytopath.28: 425-449; Duan et al. (1996) Nat. Biotech. 14: 494-498), des wunl- und wun2-Gens (US 5,428,148), des winl- undwin2-Gens (Stanford et al. (1989) Mol. Gen Genet.215: 200-208), des Systemin-Gens (McGurl et al. (1992) Science 225: 1570-1573), des WIPl-Gens (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol. Biol.22: 783-792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323: 73-76), des MPI-Gens (Corderok et al. (1994) Plant J.6(2): 141-150) und dergleichen
Eine Quelle für weitere pathogen-induzierbare Promotoren stellt die PR-Genf amilie dar. Eine Reihe von Elementen in diesen Promotoren haben sich als vorteilhaft erwiesen. So vermittelt der NukleotidbereichvonNukleotid-364bisNukleotid-288 imPromotor vonPR-2dSalicylat-Spezifität (Buchelet al. (1996) Plant Mol. Biol.30: 493-504). Die Sequenz 5'-TC ATCTTCTT-3' taucht imPromotor der Gersten ß l/S-Glucanase und in mehr als 30 weiteren stress-induzierten Genen wiederholt auf. Diese Region bindet in Tabak ein nukleares Protein, dessen Menge durch Salicylat erhöht wird Die PR-I- Promotoren aus Tabak und Arabidopsis (EP-AO 332 104, WO 98/03536) eignen sich ebenfalls als pathogen-induzierbare Promotoren Bevorzugt, da besonders spezifisch durch Pathogen induziert, sind die "aeidie PR-5"-(aPR5)-Promotoren aus Gerste (Schweizer et al. (1997) Plant Physiol. 114: 79-88) und Weizen (Rebmannet al. (1991) Plant Mol. Biol. 16: 329-331) . aPR5-Proteine akkumulieren in ca 4 bis 6 Stunden nach Pathogenbefall und zeigen nur eine sehr geringe Hintergrundexpression (WO 99 /66057) . Ein Ansatz, um eine erhöhte pathogen-induzierte Spezifität zu erreichen, bildet die Herstellung synthetischer Promotoren aus Kombinationen von bekannten pathogen-responsiven Elementen (Rushtonet al. (2002) Plant Cell 14: 749-762; WO 00/01830; WO 99/66057). Weitere pathogen-induzierbare Promotoren aus verschiedenen Arten sind dem Fachmann bekannt (EP-A 1 165794; EP-A 1 062356; EP-A 1 041 148; EP-A 1 032684).
Weitere pathogen-induzierbare Promtoren umfassen den Flachs Fisl -Promotor (WO 96/34949), den Vstl-Promotor (Schubert et al. (1997) Plant Mol. Biol.34: 417- 426) sowie den EAS4 Sesqiiterpen-Cydase-Promotor aus Tabak (US 6,100,451) .
Ferner sind Promotoren bevorzugt, die durch biotischen oder abiotischen Stress induziert
Figure imgf000034_0001
gstl Promotor) z.B. aus Kartoffel (WO 96/28561; Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol.22: 361-366), der hitzeinduzierbare hsp70- oder hspSO-Promotor aus Tomate (US 5,187,267), der kälteinduzierbare alpha-Amylase-Promotor aus der Kartoffel (WO 96/12814), der licht-induzierbare PPDK-Promotor oder der verwundungsinduzierte pinll-Promotor (EP-AO 375091).
e) MesophyUgewebe-spezifische Promotoren
JVlesophyllgewebe" meint das zwischen den Epidermisschichten Kegende Blattgewebe, bestehend aus dem Palisadengewebe, dem Schwammgewebe und den Blattadern.
MesophyE-spezifische Promotoren sind PPCZmI (=PEPC; Kausch (2001) Plant Mol. Biol.45: 1-15); OsrbcS (Kyozukaet al. (1993) Plant Phys. 102: 991-1000); OsPPDK, acc. AC099041; TaGF-2.8, acc. M63223 (Schweizer (1999) Plant J.20: 541-552); TaFBPase, acc. X53957;.TaWISl, acc. AF467542 (US 2002/115849); HvBISl, acc. AF467539 (US 2002/115849); ZmMISl, acc. AF467514 (US 2002/115849); HvPRIa, acc. X74939 (Bryngelssonet al. (1994) Molecular Plant-Microbelnteractions7(2): 267-75; HvPRIb, acc. X74940 (Bryngelssonet al. (1994) Molecular Plant-Microbe Interactions 7(2): 267- 75); HvBl,3gluc; acc. AF479647; HvPrxδ, acc. AJ276227 (Kristensen et al (2001)
Molecular Plant Pathology2(6): 311-317; undHvPAL, acc. X97313 (Wei (1998) Plant Molecular Biology 36: 101-112).
f) Epidermis-spezifische Promotoren
„Epiderrrάsgewebe" oder Epidermis meint
Figure imgf000035_0001
kann ein- bis mehrschichtig sein; es gibt epidermis-„angerdcherte" Genexpression, wie z.B. von Cer3 , die als Marker dienen kann (Hannoufa (1996) Plant J. 10 (3) : 459-467) .
Unter „Epidermis" versteht
Figure imgf000035_0002
gewebe primärer oberirdischer Pflanzenteile, z.B. des Sprosses, der Blätter, Blüten, Früchte und Samen.
Epidermisspezifische Promotoren sindbeispielsv\eise WIR5 (=GstAl), acc. X56012 (Dudler & Schweizer, unveröff.); GLP4, acc. AJ310534 (Wei (1998) Plant Molecular
Biology 36: 101-112); GLP2a, acc. AJ237942 (Schweizer (1999). Plant J 20: 541-552);
Prx7, acc. AJ003141 (Kristensen (2001) Molecular Plant Pathology2(6): 311-317); GerA, acc. AF250933 (Wu (2000) Plant Phys. Biochem 38: 685-698); OsROCl, acc.
AP004656; RTBV, acc. AAV62708, AAV62707 (Klöti (1999) PMB 40: 249-266) und Cer3 (Hannoufa (1996) Plant J. 10 (3) : 459-467) . g) Entwicklungsabhängige Promotoren
Weitere gedgnete Promotoren sindbeispielsι\eise fruchtreifungs-spezifische Promotoren,
Figure imgf000036_0001
EP 409625) . Entwiddungsabhängige Promotoren schließen zum Teil die gewebespezifischen Promotoren ein, da die Ausbildung einzelner Gewebe naturgemäß entwiddungsabnängig erfolgt.
Besonders bevorzugt sindpathogen-induzierbare Promotoren sowie konstitutive Promotoren Am meisten bevorzugt werden die nativen Promotoren der Rpi-blbl- und Rpi-blb-2-Gene verwendet, dh. die Promotoren, die im Ursprungsorganismus alleine oder zusammen mit anderen Elementen mit der kodierenden Sequenz von Rpi-blbl oder Rpi- blb2 verknüpft sind und deren Expression regulieren Hier eignen sich insbesondere die Promotoren, wie sie in den genomischen Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 für Rpi-blbl bzw. SEQ ID NO: 3 für Rpi-blb2 enthalten sind
Es können ferner solche Promotoren funktionell mit der zu exprimierenden Nuklein- säuresequenz verknüpft sein, die eine Expression in weiteren Pflanzengeweben oder in anderen Organismen, wie zum Beispiel E .odi-Bakterien ermöglichen Als in Pflanzen funktionelle Promotoren kommen im Prinzip alle oben beschriebenen Promotoren in
Frage. Weitere zur Expression in Pflanzen geeignete Promotoren sind beschrieben (Rogers et al. (1987) Meth. inEnzymol. 153: 253-277; Schardlet al. (1987) Gene 61: 1-11; Berger et al. (1989) Proc. Natl. Acad Sd. USA 86: 8402-8406).
Darüber hinaus ist der Durchschnittsf achmann in der Lage, mittels Routinemethoden wdtere gedgnete Promotoren zu isolieren So kann der Fachmann mit Hilfe gängiger molekularbiologischer Methoden, z.B. Hybriclisierungsexperimenten oder DNA-Protein- Bindungsstudien z. B. weitere knollen- und/oder eridermis-spezifische regulatorische Nukleinsäuredemente identifizieren. Dabei wird z.B. in einem ersten Schritt das gewünschte Gewebe aus dem gewünschten Organismus, aus dem die regulatorischen Sequenzen isoliert werden sollen, isoliert und daraus die gesamte poly( A) +-RNA isoliert und eine cDNA-Bank angelegt. In einem zweiten Schritt werden mit Hilfe von cDNA- Klonen, die auf poly( A) +-RNA-Molekülen aus einem anderen Gewebe basieren, aus der ersten Bank mittels Hybridisierung diejenigen Klone identifiziert, deren korrespondierende poly( A) +-RNA-Moleküle lediglich im gewünschten Gewebe akkumulieren. Anschließend werden mit Hilfe dieser so identifizierten cDNAs
Promotoren isoliert, die über Gewebe-spezifische regulatorische Elemente verfügen. Dem Fachmann stehen darüber hinaus weitere auf PCR basierende Methoden für die Isolierung geeigneter Gewebe-spezifischer Promotoren zur Verfügung
Die in den erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Vektoren enthaltenen
Nukleinsäuresequenzen können mit weiteren genetischen Kontrollsequenzen neben einem Promotor funktionell verknüpft sein Der Begriff der genetischen Kontrollsequenzen ist breit zu verstehen und meint all solche Sequenzen, die einen Einfluss auf das Zustandekommen oder die Funktion der erfindungsgemäßen Expressionskassette haben Genetische Kontrollsequenzen modifizieren zum Beispiel die Transkription und
Translation in prokaryotischen oder eukaryotischen Organismen Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Expressionskassetten 5'-stromaufwärts von der jeweiligen transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz einen in Pflanzen funktionellen Promotor mit einer vorab beschriebenenen Spezifität und 3'-stromabwärts eine in Pflanzen funktionelle Terminatorsequenz als zusätzliche genetische Kontrollsequenz, sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils funktionell verknüpft mit der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz. Genetische Kontrollsequenzen umfassen auch weitere Promotoren, Promotordemente oder Minimalpromotoren, die die expressionssteuernden Eigenschaften modifizieren könneα So kann durch genetische Kontrollsequenzen zum Beispiel die gev\ebespezifische Expression zusätzlich abhängig von bestimmten Stressfaktoren erfolgen. Entsprechende Elemente sind zum Bdspid für Wasserstress, Abscisinsäure (LamE undChuaNH (1991) J. Biol. Chem 266(26): 17131 -17135) undHitzestress (Schoffl F et al. (1989) Mol. Gen. Genet.217(2-3): 246-53) beschrieben.
Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die oben genannten für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden Darüberhinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden
Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5'-untranslatierten Regionen, Introns oder die nicht-kodierende 3'-Region von Genen wie beipielsι\eise das Actin-1 Intron, oder die Adhl-S Introns 1, 2 und 6 (allgemein: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994)). Es ist gezeigt worden, dass diese eine signifikante Rolle bei der Regulation der Genexpression spielen können So wurde gezeigt, dass 5'-untranslatierte Sequenzen die transiente Expression heterologer Gene verstärken können Beispielhaft für Translationsverstärker sei die 5'-Leadersequenz aus demTabak-Mosaik-Virus zunennen (Gallie et al. (1987) Nud. AddsRes. 15: 8693- 8711). Sie können ferner die Gewebsspezifität fördern (Rousterj et al. (1998) Plant J. 15: 435-440).
Die Expressionskassette kann vorteühafterweise eine oder mehrere sogenannte "enhancer"- Sequenzen funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte transgene Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen Auch am 3'-Ende der transgen zu exprirnierenden Nukleinsäuresequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die transgen zu exprinierenden Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.
Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu \erstehen, die eine homologe
Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom erlauben Bei der homologen Rekombination kann zum Beispiel der natürliche Promotor eines bestimmten Gens gegen einen Promotor mit einer anderen Gewebsspezifität ausgetauscht werden
Eine Expressionskassette und die von ihr abgeleiteten Vektoren können weitere Funktionselemente enthalten Der Begriff Funktionselement ist breit zu verstehen und meint all solche Elemente, die einen Einfluss auf Herstellung. Vermehrung oder Funktion der erfindungsgemäßen Expressionskassetten, Vektoren oder transgenen Organismen haben Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen:
a) Sdektionsmarker, die eine Resistenz gegen einen MetaboK smusinhibitor wie 2- DesoxygLucose-6-phosphat (WO 98/45456), Antibiotika oder Biozide, bevorzugt Herbizide, wie zum Beispiel Kanarnycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin, oder Phosphinotricin verleihen Besonders bevorzugte Sdektionsmarker sind solche die eine Resistenz gegen Herbizide verleihen Beispielhaft seien genannt: DNA- Sequenzen, die für Phosphinothricinacetyltransferasen (PAT) kodieren und Glutaminsynthaseinhibitoren inaktivieren (bar undpat Gen), 5- Enolpyruv}dshikimat-3-phosphatsynthasegene (EPSP-Synthasegene), die eine Resistenz gegen Glyphosat®(N-(phosphonomethyl)glycin) verleihen, das für das
Glyphosat®degradierende Enzyme kodierende gox-Gen (Glyphosatoxidoreduktase), das deh-Gen (kodierend für eine Dehalogenase, die Dalapon inaktiviert), SuIf onylharnstof f- und Imidazolinon inaktivierende Acetolactatsynthasen sowie bxn- Gene, die für Bromoxynil degradierende Nitrilaseenzyme kodieren, das aasa-Gen, das eine Resistenz gegen das Antibiotikum Apectinomycin verleiht, das Streptomydn- phosphotransf erase (SPT ) -Gen, das eine Resistenz gegen Streptomydn vermittelt, das Neomycinphosphotransferase (NPTII)-Gen, das eine Resistenz gegen
Kanamycin oder Genetiddin verleiht, das Hygromydnphosphotransf erase (HPT)- Gen, das eine Resistenz gegen Hygromycin vermittelt, das Acetolactatsynthase-Gen (ALS), das eine Resistenz gegen SuIf onylharnstof f-Herbizide verleiht (z.B. mutierte ALS-Varianten mit z.B. der S4 und/oder Hra Mutation) und das mutierte AHAS (Acetohyclroxyadd-Synthase)-Gen (S653N), das eine erhöhte Resistenz gegenüber
Imiclazolinon-Herbizidenwiez.B. Imazamox verleiht .
Reportergene, die für leicht quantifizierbare Proteine kodieren und über Eigenfarbe oder Enzymaktivität eine Bewertung der Transformationseffizienz oder des Expressionsortes oder -Zeitpunktes gewährleisten Ganz besonders bevorzugt sind dabei Reporter-Proteine (SchenbornundGroskreutz (1999) Mol. Biotechnol. 13(1): 29-44) wie das "green fluorescence protein" (GFP) (Sheen et al. (1995) Plant Journal 8(5): 777-784; Haseloff et al. (1997) Proc. Natl. Acad Sd. USA 94(6): 2122-2127; Rachel et al.(1996) Proc. Natl. Acad Sd. USA 93(12): 5888-5893; Tianet al. (1997) Plant Cell Rep. 16: 267-271; WO 97/41228; Chui et al. (1996) Curr Biol 6:
325-330; Leffelet al. (1997) Biotechniques23(5): 912-8), die Chloramphenicoltransferase, eine Luziferase (Ow et al. (1986) Sdence 234: 856-859; Miliar et al. (1992) Plant Mol. Biol. Rep. 10: 324-414), das Aequoringen (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys. Res. Commun 126(3): 1259-1268), die ß- Galaktosidase, R-Locus Gen (kodiert ein Protein, das die Produktion von
Anthocyaninpigmenten (rote Färbung) in pflanzlichen Gewebe reguliert und so eine direkte Analyse der Promotorakti\ität ohne Zugabe zusätzlicher Hilf Stoffe oder chromogener Substrate ermöglicht; Dellaporta et al., In: Chromosome Structure and Function: Impact of NewConcepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11:263-282, 1988), ganz besonders bevorzugt ist die ß-Glukuronidase (Jefferson et al. (1987) EMBOJ.6: 3901-3907).
c) Rφlikationsursprünge, die eine Vermehrung der erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Vektoren in zum Beispiel E.cdi gewahrleisten Beispielhaft seien genannt ORI (origjn of DNA replication), der pBR322 ori oder der P15A ori (Sambrook und Russell, \idesupra).
d) Elemente, die für eine Agrobakterium-vermittelte Pflanzentransformation erforderlich sind, wie zum Beispiel die rechte oder linke Begrenzung der T-DNA oder die \ir-Region
Zur Selektion erfolgreich transformierter Zellen kann zusätzlich ein selektionierbarer Marker eingeführt werden, der den erfolgreich transformierten Zellen eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herbizid) , einen MetaboK smusinhibitor wie 2- DesoxygLucose-6-phosphat (WO 98/45456) oder ein Antibiotikum verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion der transformierten Zellen gegenüber untransformierten (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84) . Ebenso ist es aber natürlich auch möglich, erfolgreich transformierte Zellen mit Hilfe molekularbiologischer Methoden wie etwa PCR oder Southern Blot zu identifizieren.
Bei den so genannten funktionellen Terminationssequenzen handelt es sich um
Sequenzen, die sicherstellen, dass die Transkription bzw. die Translation ordnungsgemäß beendet wird. Sollen die übertragenen Nukleinsäuren translatiert werden, handelt es sich bei den Terminationssequenzen typischerweise um Stopcodons und entsprechende regulatorische Sequenzen; sollen die übertragenen Nukleinsäuren nur transkribiert werden, handelt es sich in der Regel umpoly-A-Sequenzen.
Als Kontrollsequenzen geeignete Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylie- rungssignale, vorzugsι\eise solche, die im wesentlichen T-DNA Polyadenylierungssignalen aus Agrcbaderiumtumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) desTi-PlasmidspTiACHS entsprechen (Gielenet al. (1984) EMBO J.3: 835 ff) oder funktionelle Äquivalente davon. Beispiele für besonders geeignete Terminatorsequenzen sind der OCS (Octopin-Synthase)-Terminator und der NOS (Nopalin-Synthase)- Terminator.
Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "Vektor" ein Nukleinsäuremolekül, das eine andere Nukleinsäure, an welche es gebunden ist, in eine Zelle transportieren kann. Ein Vektortyp ist ein ' Plasmid' ', was für eine zirkuläre doppelsträngige DNA-Schleife darstellt, in die zusätzliche DNA-Segmente ligiert werden können. Ein weiterer Vektortyp ist ein viraler Vektor, wobei zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte Vektoren können in einer Wirtszelle, in die sie eingebracht worden sind, autonom replizieren (z.B. Bakterienvektoren mit bakteriellem Rφlikationsursprung). Andere Vektoren werden vorteilhaft beim Einbringen in die Wirtszelle in das Genom einer Wirtszelle integriert und dadurch zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Zudem können bestimmte Vektoren die Expression von Genen, mit denen sie funktionsfähig verbunden sind, steuern. Diese Vektoren werden hier als "Expressionsvektoren" bezeichnet. Gewöhnlich haben Expressionsvektoren, die für DNA- Rekombinationstechniken geeignet sind, die Form von Plasmiden. In der vorliegenden Beschreibung können 'Plasmid" und "Vektor" austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die amhäufigsten verwendete Vektorform ist. Die Erfindung soll jedoch auch andere Expresäonsvektorf ormen, wie virale Vektoren, die ähnliche Funktionen ausüben, umfassen. Ferner soll der Begriff "Vektor" auch andere Vektoren, die demFachmann bekannt sind, wie Phagen, Viren, wie SV40, CMV, TMV, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA, umfassen.
' "Funktionell daran gebunden' ' bedeutet, dass ein Promotor und die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz und ggf. weitere regulatorische Elemente derart angeordnet sind, dass jedes der regulatorischen Elemente seine Funktion bei der Expression der Nukleinsäuresequenz ausüben kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel
Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz hinter der als Promotor fungierenden Sequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der
Promotorsequenz und der transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare und am meisten bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare.
Die Herstellung einer funktionellen Verknüpfung und die Herstellungeines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls kann mittels gängiger Rekombinations- und (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CoId SpringHarbor Laboratory, CoId Spring Harbor (NY), inSilhavyTJ, BermanML undEnquist LW (1984) Experiments with Gene Fusions, CoId SpringHarbor Laboratory, CoId SpringHarbor (NY), in Ausubel FM et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology Greene Publishing Assoc. andWiley Interscience und bei Gelvin et al. (1990) In: Plant Molecular Biology Manual beschrieben änd Zwischen Promotor und der zu exprirrάerenden Nukleinsäuresequenz können aber auch weitere Sequenzen positioniert werden, die zum Beispiel die Funktion eines Linkers mit bestimmten Restriktionsenzymschnittstellen oder eines Signalpeptides haben. Auch kann die Insertion von Sequenzen zur Expression von Fusionsproteinen führen. Bevorzugt kann das rekombinanten Nukleinsäuremolekül, mindestens umfassend einen Promotor und die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz in operativer Verknüpfung, integriert in einem Vektor vorliegen und durch zum Beispiel Transformation in ein pflanzliches Genom insertiert werden.
Der Begriff "Regulationssequenz" soll Promotoren, Enhancer und andere Expressionskontrollelemente (z.B. Polyadenyk'erungssignale) umfassen. Diese Regulationssequenzen sind z.B. beschrieben in Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), oder in Gruber und Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology, CRC Press, BocaRaton, Florida, Hrsgb.: Glick und Thompson, Kapitel 7, 89-108. Regulationssequenzen umfassen solche, welche die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Wirtszelltypen steuern, und solche, die die direkte Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen unter bestimmten Bedingungen steuern. Der Fachmann weiß, dass die Gestaltung des Expressionsvektors von Faktoren wie der Ausv\ahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem Ausmaß der Expression des gewünschten Proteins usw., abhängen kann
Die verwendeten rekombinanten Expressionsvektoren zur Expression der R-Gene können sich für die Transformation sowohl von prokaryotischen als auch von eukaryotischen Zellen eignen. Dies ist vorteilhaft, da häufigZwischenschritte der Vektorkonstruktion der Einfachheit halber in Mikroorganismen durchgeführt werden Diese Klonierungsvektoren enthalten ein Rφlikationssignal für den entsprechenden Mikroorganismus und ein Markergen für Selektion erfolgreich transformierter Bakterienzellen. Für die Expression in prokaryotischen Organismen geeignete Vektoren sind dem Fachmann bekannt, zu diesen gehören z.B. in E. cdipLG338,pACYC184, diepBR-Reihe, wiez.B. pBR322, diepUC- Reihe, wie zB. pUC18 oder pUC19, die M113mp-Reihe, pKC30, pRep4, pHSl, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-111113-Bl, λgtll oder pBdCl, in StreptcmyαEspIJlOl, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in BacüluspUBllO, pC194 oder pBD214, in CαrynebaderiumpSA77 oder pAJ667.
Die oben genannten Vektoren bieten nur einen kleinen Überblick über mögliche geeignete Vektoren. Weitere Plasmide sind dem Fachmann bekannt und sind z.B. beschrieben in: Vectors Cloning Applications Essential Techniques (Hrsg John Wiley & Sons, UK,
1998) . Weitere geeignete Expressionssysteme für prokaryotische und eukaryotische Zellen siehe in den Kapiteln 16 und 17 von Sambrook und Russell, vide supra
Da die Pflanzengenexpression sehr oft nicht auf die Transkriptionsebene beschränkt ist,
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beschriebenen Elemente andere funktionsfähigverbundene Sequenzen, wie
Figure imgf000045_0002
Leader-Sequenz aus T abakmosaikvirus, die das Protein/RNA-Verhältnis erhöht, enthält (Gallie et al. (1987) Nud Acids Research 15:8693-8711).
Das zu exprimierende Gen muss wie oben beschrieben funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sein, der die Genexpression auf rechtzeitige, zell- oder gewebespezifische Weise durchführt. Geeignete Promotoren wurden bereits oben beschrieben.
Andere bevorzugte Sequenzen für die Verwendungzur funktionsfähigen Verbindungin Genexpressionskassetten sind Targeting-Sequenzen, die zur Steuerung des Genproduktes in das entsprechende ZeOkompartiment notwendig sind (siehe eine Übersicht in Kermode (1996) Crit. Rev. Plant Sei. 15 (4): 285-423 und darin zitierte Uteraturstellen), beispielsweise in die Vakuole, den Zellkern, alle Arten von Piastiden, wie Amytoplasten, Chloroplasten, Chromoplasten, den extrazellulären Raum, die Mtochondrien, das Endoplasmatische Retikulum, Ölkörper, Peroxisomen und andere Kompartimente von Pflanzenzellen.
Zum Einbringen der Nukleinsäure-Sequenzen von Rpl-blbl bzw. Rpi-blb2 in die jeweiligen Expressionsvektoren bzw. in den gemeinsamen Expressionsvektor werden diese vorteilhaft einer Amplifikation und Ligation in bekannter Weise unterworfen Im Anschluss an die Amplifikation wird das Amplifikat zweckmäßigerweise analysiert. Beispielsweise kann die Analyse nach gelelektrophoretischer Auftrennunghinsichtlich Qualität und Quantität erfolgen Im Anschluss kann das Amplifikat nach einem Standardprotokoll gereinigt werden (z.B. Qiagen) . Ein Aliquot des gereinigten Amplifikats steht dann für die nachfolgende Klonierung zur Verfügung
Geeignete Klonierungsvektoren sind dem Fachmann allgemein bekannt. Hierzu gehören insbesondere Vektoren, die in mikrobiellen Systemen replizierbar sind, also vor allem Vektoren, die eine effiziente Klonierungin Bakterien, Hefen oder Pilzen gewährleisten, und die die stabile Transformation von Pflanzen ermöglichen Zu nennen sind insbesondere verschiedene für die T-DNA-vermittelte Transformation geeignete, binäre und co-integrierte Vektorsysteme. Derartige Vektorsysteme sind in der Regel dadurch gekennzeichnet, dass sie zumindest die für die Agrobacterium-vermittelte Transformation benötigten vir-Gene sowie die T-DNA begrenzenden Sequenzen (T-DNA-Border) beinhalten Vorzugsweise umfassen diese Vektorsysteme auch weitere ds-regulatorische Regionen wie Promotoren und Terminatoren und/oder Selektionsmarker, mit denen entsprechend transformierte Organismen identifiziert werden können. Wahrend bei co- integrierten Vektorsystemen vir-Gene und T-DNA-Sequenzen auf demselben Vektor angeordnet sind, basieren binäre Systeme auf wenigstens zwei Vektoren, von denen einer vir-Gene, aber keine T-DNA und ein zweiter T-DNA, jedoch kein vir-Gen trägt. Dadurch sind letztere Vektoren relativ klein, leicht zu manipulieren und sowohl in E . cdi als auch in Agrobacterium zu replizieren. Zu diesen binären Vektoren gehören Vektoren der Serien pBIB-HYG, pPZP, pBecks, pGreen. Erfindungsgemäß bevorzugt verwendet werden Binl9, pBIlOl, pBinAR, pGPTV undpCAMBIA Eine Übersicht über binäre Vektoren und ihre Verwendung gibt Hellenset al. (2000) Trends in Plant Science 5, 446-451.
Für die Vektorpräparation können die Vektoren zunächst mit Restriktions- endonuklease(n) linearisiert und dann in geeigneter Weise enzymatisch modifiziert werden. Im Anschluss wird der Vektor gereinigt und ein Aliquot für die Klonierung eingesetzt. Bei der Klonierung werden das enzymatisch geschnittene und erforderlichenfalls gereinigte Amplifikat mit ähnlich präparierten Vektorfragmenten durch eine Ligase miteinander verknüpft. Dabei kann ein bestimmtes
Nukleinsäurekonstrukt bzw. Vektor- oder Plasmidkonstrukt einen oder auch mehrere kodogene Genabschnitte aufweisen. Vorzugsv\eise sind die kodogenen Genabschnitte in diesen Konstrukten mit regulatorischen Sequenzen funktional verknüpft. Zu den regulatorischen Sequenzen gehören insbesondere pflanzliche Sequenzen wie die oben beschriebenen Promotoren und Terminatoren. Die Konstrukte lassen sich vorteilhafterweise in Mikroorganismen, insbesondere E. cdi und Agrobacterium tumefaάens, in einem geeigneten Medium züchten und unter Selektionsbedingungen stabil propagieren. Anschließend werden die Zellen geerntet und lysiert und das Plasmid daraus gewonnen. Dies ermöglicht einen Transfer von heterologer DNA in Pflanzen oder Mikroorganismen. Unter der vorteilhaften Verwendung von Klonierungsvektoren können die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, die erfinderischen Nukleinsäuren und Nukleinsäurekonstrukte in Organismen wie Mikroorganismen oder bevorzugt Pflanzen eingebracht werden und zur Pflanzentransformation verwendet werden, wie diejenigen, die veröffentlicht sind in und dort zitiert sind Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, BocaRaton, Florida), Kapitel 6/7, S.71-119 (1993); F.F. White, Vectorsfor Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgo.: KungundR. Wu, Academic Press, 1993, 15-38; B. Jenes et al., Techniquesfor Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd 1, Engineering and Utilization, Hrsgo.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-143; Potηkus (1991) Annu Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol.42: 205-225. Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, die erfinderischen Nukleinsäurekonstrukte und/oder Vektoren lassen sich damit zur gentechnologischen Veränderung eines breiten Spektrums an Organismen, bevorzugt von Pflanzen, verwenden
Für das Einbringen von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl bekannter Techniken zur Verfügung wobei der Fachmann die jeweils geeignete Methode ohne Schwierigkeiten ermitteln kann Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder AgrcbaderiumrhizcgeπesalsTransformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, den direkten Gentransfer isolierter DNA in Protoplasten, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten Dabei können sowohl stabile als auch transiente Transformanten erzeugt werden
Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden per se keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Ähnliches gut für den direkten Gentransfer. Es können einfache Plasmide wie z.B. pUC -Derivate verwendet werden Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig Dem Fachmann sind die gängigen Selektionsmarker bekannt und es stellt für ihn kein Problem dar, einen geeigneten Marker auszuwählen. Gebräuchliche Selektionsmarker sind solche, die den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem
Antibiotikum wie Kanamycin, G418, Bleomycin, Hygromycin, Methotrexat, Glyphosat, Streptomycin, Spectomycin, Sulfonyl-Harnstoff, Gentamycin oder Phosphinotricin und dergleichen vermitteln Der individuell gewählte Marker sollte die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten. Hierzu sind auch alternative Marker geeignet, wie nutritive Marker oder Screeningmarker (wie GFP, green fluorescent protein) . Selbstverständlich kann auch vollkommen auf Selektionsmarker verzichtet werden, was allerdings mit einem ziemlich hohen Screeningbedarf einhergeht. Falls markerfreie transgene Pflanzen erwünscht sind, stehen dem Fachmann auch Strategien zur Verfügung die eine nachträgliche Entfernung des Markergens erlauben, z. B. C otransf ormation oder Sequenz-spezifische Rekombinasen Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten
Werden für die Transformationen Agrobakterien verwendet, muss die einzuführende DNA, wie oben bereits ausgeführt, in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNAnotwendige vir-Region Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren Mittels eines HeIf erplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation) . Binäre Vektoren können sowohl in E . αü als auch in Agrobakterien replizieren Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA-Grenzregion eingerahmt werden Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al. (1978), Molecular and General Genetics 163, 181-187). Das als Wirtszelle dienende
Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig Zusätzlich kann T-DNA vorhanden sein Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet.
Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120515 beschrieben worden
Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweck- mäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kultiviert werden Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (beispielsv\eise Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspenäons-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeignetem Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden Die Regeneration der Pflanzen erfolgt nach üblichen
Regenerationsmethoden unter Verwendungbekannter Nährmedien Die so erhaltenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA mit etablierten Methoden wie z.B. Southern Blot oder PCR untersucht werden
Andere Möglichkeiten der Einführung fremder DNA unter Verwendung des biolistischen Verfahrens oder durch Protoplasten-Transformation sind dem Fachmann bekannt (vgl. L. Willmitzer (1993) Transgenic Plantsin Biotechnology, AMulti-Volume Comprehensive Treatise (Herausgeber: HJ. Rehmet al.), Band2, 627-659, VCH Weinheim, Deutschland) .
Während die Transformation dikotyler Pflanzen bzw. derer Zellen über Ti-Plasmid- Vektorsysteme mit Hilfe von Agrobaderiumtumefaciens wohl etabliert ist, weisen neuere Arbeiten darauf hin, dass auch monokotyle Pflanzen bzw. deren Zellen der Transformation mittels auf Agrobakterien basierender Vektoren sehr wohl zugänglich sind (siehe ua Chan et al. (1993), Plant Mol. Biol.22, 491-506) .
Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen bzw. deren Zellen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes (Wan und Lemaux (1994) Plant Physiol. 104, 37-48; Vasüet al. (1993) Bio/Technology 11, 1553-1558; Ritalaet al. (1994) Plant Mol. Biol.24, 317-325; Spencer et al. (1990), Theor. Appl. Genet. 79, 625- 631), die Protoplasten-Transformation, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen sowie die Einbringung von DNA mittels Glasfasern.
Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in üblicher Weise (siehe auch McCormick et al. (1986), Plant Cell Reports 5, 81-84) . Die resultierenden Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen besitzen die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.
Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, dass das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, dass der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind Ebenso können nach üblichen Methoden transgene Pflanzen bestimmt werden, die für die neuen Nukleinsäuremoleküle homozygot sind und ihr phänotypisches Verhalten hinsichtlich einer vorhandenen bzw. nicht vorhandenen Pathogen-Responsivität untersucht und mit dem von hemizygpten Pflanzen verglichen werden
Selbstverständlich können die Pflanzenzellen, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle enthalten, auch in Form einer Zellkultur (einschließlich Protoplasten, KaUi, Suspensionskulturen und dergleichen) weiterkultiviert werden
Erfindungsgemäß umf asst der Begriff „transgene Pflanze" sowohl die Pflanze in ihrer Gesamtheit, als auch alle Pflanzenteile, in denen erfindungsgemäß die Expression von R-Proteinen erhöht ist. Dazu gehören alle Pflanzenteile und Pflanzenorgane wie Blatt, Stiel, Samen, Wurzel, Knollen, Antheren, Fasern, Wurzelhaare, Stengel, Embryos, Kalli, Kotelydonen, Petiolen, Erntematerial, pflanzliches Gewebe, reproduktives Gewebe, Zellkulturen, die sich von der transgenen Pflanze ableiten und/oder dazu verwendet werden können, die transgene Pflanze hervorzubringen.
Je nach dem verwendeten Vektorsystem können erfindungsgemäß auch transgene Pflanzen hergestellt werden, bei denen die zu übertragenden Nukleinsäuren in der Pflanzenzelle bzw. der Pflanze als selbstständig replizierendes System enthalten sind. Diezur
Übertragung in die Pflanzen verwendeten Vektoren müssen dann entsprechend über DNA-Sequenzen verfügen, die die Replikation von zur Übertragung verwendeten Plasmiden innerhalb der Zelle ermöglichen.
Die spezifische Expression der Resistenz-Proteine in den erfindungsgemäßen Pflanzen bzw. in den erfindungsgemäßen Pflanzenzellen kann mit Hilfe herkömmlicher molekular- biologischer und biochemischer Methoden nachgewiesen und verfolgt werden. Dem Fachmann and diese Techniken bekannt und er ist problemlos in der Lage, eine geeignete Nachweismethode zu wählen, beispielsι\eise eine Northern-Blot- Analyse zum Nachweis spezifischer RNA von Rp-blbl und RpL-blb2 bzw. zur Bestimmung der Höhe der Akkumulation von RpL-blbl- und Rpi-blb2-spezifischer RNA oder eine Southern-Blot- AnalysezumNachweisderNukleinsäuresequenzenvonRpi-blbl-undRpi-bM. Bevorzugt wird für den qualitativen und quantitativen Nachweis von RpL-blbl- und RpL-blb2- kodierenden DNA-Sequenzen eine real-time PCR durchgeführt.
Bei den für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Pflanzen kann es sich im Prinzip um jede beliebige Pflanze handeln, die resistent gegen den Befall mit Pathogenen, bevorzugt Pilzpathogenen, gemacht werden soll. Vorzugsv\eise ist es eine monokotyle oder dikotyle Nutz-, Nahrungs- oder Futterpflanze, besonders bevorzugt eine dikotyle Nutz-, Nahrungs- oder Futterpflanze.
Beispiele für monokotyle Pflanzen sind Pflanzen, die zu den Gattungen Avena (Hafer) , Triticum (Weizen), Seeale (Roggen), Hordeum (Gerste), Oryza (Reis), Panicum, Pennisetum, Setaria, Sorghum (Hirse), Zea (Mais) und dergleichen gehören
Dikotyle Nutzpflanzen umfassen unter anderem Baumwolle, Leguminosen, Sojabohne, Raps, Zuckerrübe, Zierpflanzen sowie Bäume, insbesondere Kartoffel und Tomate.
Weitere Nutzpflanzen können Obst, Ölpalmen, Tee-, Kakao- und Kaffeesträucher, Tabak, Sisal sowie bei Heilpflanzen Rauwolfia und Digitalis umfassen, des Weiteren Getreide wie Weizen, Roggen, Hafer, Gerste, Reis, Mais und Hirse, Zuckerrübe, Raps, Soja und Tabak. Weitere Nutzpflanzen können dem US-Patent Nr.6,137,030 entnommen werden Bevorzugte Pflanzen and Pflanzen, die zur Familie der Nachtschattengewächse (Solanaceae), besonders bevorzugt Pflanzen, die zu der Gattung der Kartoffel (Solanum) gehören, insbesondere Sdanum tuberosum, Solanum demissum oder Solanum bulbocastanum, oder Tomate (Lycopersiccn) oder Tabak (Nicotiana) .
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind Pflanzen und Pflanzenzellen mit erhöhter Pathogenresistenz, die gegenüber der Ausgangspflanze bzw. -pflanzenzelle einen erhöhten Gehalt an Rpi-blbl und Rpi-blb2 aufweisen. Bevorzugt wurden diese Pflanzen durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt.
Die spezifische Expression des erfindungsgemäßen Proteins in den erfindungsgemäßen Pflanzen bzw. in den erfindungsgemäßen Pflanzenzellen kann mit Hilfe herkömmlicher molekularbiologLScher und biochemischer Methoden nachgewiesen und verfolgt werden. Dem Fachmann sind diese Techniken bekannt und er ist problemlos in der Lage, eine geeignete Nachweismethode zu wählen, beispielsweise eine Northern-Blot- Analyse zum Nachweis Protein-spezifischer RNA bzw. zur Bestimmung der Höhe der Akkumulation von Protein-spezifischer RNA oder eine Southern-Blot- bzw. PCR-Analyse zumNachweis von für ein erfindungsgemäßes Protein kodierenden DNA-Sequenzen. Die dazu verwendeten Sonden- bzw. Primersequenzen können zu der in SEQ ID No.1, 3, 5 oder 6 angegebenen Sequenz entweder identisch sein oder einige wenige Abweichungen von dieser Sequenz aufweisen.
Selbstverständlich kann das erfindungsgemäße Verfahren auch mit anderen Verfahren zur Erhöhung der Pathogenresistenz in transgenen Pflanzen kombiniert werden So kann beispielsweise die Polypeptidmenge, die Aktivität oder die Funktion eines oder mehrerer Resistenzfaktoren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bax Inhibitor 1-Protein aus Hαrdeum vulgäre (GenBank Acc-No.: AJ290421), aus Nicotiana tabacum (GenBank Acc- No.: AF390556), Reis (GenBank Acc-No.: AB025926), Arabidopsis (GenBank Acc-No.: AB025927) bzw. Tabak und Raps (GenBank Acc-No.: AF390555, Bolduc et al. (2003) Planta 216: 377-386), ROR2 (z.B. aus Gerste (GenBank Acc-No.: AY246906)), SnAP34 (z.B. aus Gerste (GenBank Acc-No.: AY247208)) und/oder Lumenal Binding Protein BiP z.B. aus Reis (GenBank Acc-No. AF006825) durch geeignete Verfahren gesteigert werden. Ebenso kann die Polypeptidmenge, die Aktivität oder die Funktion eines oder mehrerer Resistenzfaktoren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus RacB (z.B. aus Gerste (GenBank Acc-No.: AJ344223)),CSL1 (z.B. aus Arabidopsis (GenBank Acc-No.: NM116593)), HvNaOX (z.B. aus Gerste (GenBank Acc-No.: AJ251717); EP 1 525315), MLO (z.B. ausGerste (GenBank Acc-No. Z83834); WO 98/04586, WO 00/01722, WO 99/47552), ARMl (armadülo repeat protein; EP Anmeldenummer 05110468.5) durch geeignete Verfahren vermindert werden
Ein weiterer Gegenstand der Erfindungbetrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen transgenen Organismen und der von ihnen abgeleiteten Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc.-, und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte, zur Herstellung von Nahrungs- oder Futtermitteln, Pharmazeutika oder Feinchemikalien
In einer Ausführungsformbetrifft die Erfindung zudem ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Pharmazeutika oder Feinchemikalien in Wirtsorganismen, wobei ein Wirtsorganismus oder ein Teil davon mit einem der oben beschriebenen rekombinanten Nukleinsäuremoleküle transformiert wird und dieses Nukleinsäuremolekül ein oder mehrere Strukturgene enthält, die für die gewünschte Feinchemikalie kodieren oder die Biosynthese der gewünschten Feinchemikalie katalysieren, der transformierte Wirtsorganismus gezüchtet wird und die gewünschte Feinchemikalie aus dem Züchtungsmedium isoliert wird Dieses Verfahren ist für Feinchemikalien wie Enzyme, Vitarrrine, Aminosäuren, Zucker, Fettsäuren, natürliche und synthetische Geschmacks-, Aroma- und Farbstoffe breit anwendbar. Besonders bevorzugt ist die Produktion von T ocopherolen und T ocotrienolen sowie C arotinoiden. Die Züchtung der transformierten Wirtsorganismen sowie die Isolierung aus den Wirtsorganismen bzw. aus dem Züchtungsmedium erfolgt mit dem Fachmann bekannten Verfahren Die Produktion von Pharmazeutika, wie zum Beispiel Antikörpern oder Vakzinen ist beschrieben bei Hood und Jilka(1999). Curr. Opin Biotechnol.l0(4): 382-6; MaundVine (1999) Curr. Top. Mcrobiol. Immunol.236: 275-92.
Das Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhter Resistenz gegen die Kraut- und Knollenfäule durch die gleichzeitige Expression der R-Gene Rpl-blbl und Rpi-blb2 wird nun im Folgenden exemplarisch dargestellt. Die nachfolgenden Beispiele sollen nicht als beschränkend aufgefasst werden Der Inhalt sämtlicher in dieser Patentanmeldung zitierten Literaturstellen, Patentanmeldungen, Patente und veröffentlichten Patentanmeldungen ist hier durch Bezugnahme aufgenommen
Experimente
1. Allgemeine Klonierungsverf ahren und Klonierung der Vektoren VC-PMAl 6-1 undVC-PMA19-l
Die Klonierungsverf ahren wie z.B. Restriktionsspaltungen, Agarose-Gelelektrophorese, Reinigungvon DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose- und Nylon-Membranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. αü- Zellen, Anzucht von Bakterien und die Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden wie bei Sambrook et al. (2001) beschrieben durchgeführt.
Vektor VC-PMA16-1 (Abb.2) Ein DNA-Segment mit Rpi-blbl wurde mit dembinären Vektor pSUNAH ASmod ligiert, der mit dem Restriktionsenzym (RE) Xbal geschnitten wurde. Anschließend wurde der liglerte Vektor mit dem RE PstI verdaut, wobei sog Jblunt ends" erzeugt wurden. Die genomische Sequenz besteht aus dem 3592 bp langen Rpi-blbl -Gen, einer 1173 bp langen Promotor-Region und einer 406 bp langen TerminationsregLorL
PSUNAHASmodist ein binärer Vektor, der auf dem Plasmid pSUNl (WO 02/00900) beruht und ein mutiertes AHAS (Acetohydroxyadd-Synthase)-Gen (S653N), das eine erhöhte Resistenz gegenüber Irrάdazolinon-Herbiziden wie z.B. Imazamox verleiht, als Selektionsgen ( Andersson et al. (2003) Plant Cell Rep 22:261-267; WO 2004/005516) enthält.
PSUNAH ASmod wurde folgenderweise konstruiert: Aus dem Plasmid pGPT VKan (Becker et al., 1992) wurde ein 608 bp langes nos-Promotor-Fragment herausgeschnitten und nach Verdau des Plasmids pUC 19 mit den REs Hindill und BamHI mit diesem ligiert. Des Weiteren wurde aus dem Plasmid pGPT VKan (Becker et al., 1992) ein 275 bp langes nos-Terminations-Fragment herausgeschnitten und nach Verdau des Plasmids pUC 19 mit den REs Kpnl und SstI mit dem Plasmid nach der Promotor-Sequenz ligiert. Das 2020 bp lange AHAS Gen wurde mit Kpnl und SstI aus pUC19 herausgeschnitten und mit den selben REs zwischen den nos-Promotor und den nos-Terminator ligiert. Der insgesamt 2900 bg lange AHAS-Komplex, bestehend aus dem nos-Promotor, dem AHAS Gen und demnos-Termiriator, wurde mit Hindlll und EcoRI ausschnitten und in das Plasmid pUC 19, das mit EcoRI undSmal geöffnet wurde, ligiert.
In den durch Verdau mit PstI mit sog Jblunt ends" versehenen Vektor pSUNAHASmod mit dem klonierten Rpi-blbl -Komplex wurde ein Segment mit Rpi-blb2 ligiert. Der entstandene Vektor wurde VC -PMAl 6-1 genannt. Das Rpi-blb2 Segment enthält ein 3890 bp langes Rpi-blb2 Gen, eine 1530 bp lange b' -Promotor-Sequenz und eine 2530 bp lange Terminations-Sequenz.
Vektor VC-PMA19-1 (Abb.2)
Ein Rpi-blb2-Segement wurde in einen mit Sali und EcoRV verdauten pSUNAHASmod Vektor ligiert und VC-PMA19-1 genannt. Das Rμ-blb2-Segment enthält ein 3890 bp langes Rpi-blb2 Gen, eine 1530 bp lange b' -Promotor-Region und eine 2530 bp lange 3'-Terminator-Region PSUNAHASmod mit dem Rp-blb2-Komplex wurde mit BamHI verdaut und mit einem Rpi-blbl -Segment ligiert. Das Rpi-blbl -Segment enthält ein 3592 bp langes Rpi-blbl Gen, eine 2516 bp lange 5 '-Promotor-Region und eine 669 bp lange 3'-Terminator-Region
2. Transformation von Agrobacteriumtumefaciens (A tumefaciens) mit den Vektoren VC-PMA16-1 und VC-PMA19-1
Die erhaltenen Konstrukte VC-PMAl 6-1 und VC-PMA19-1 wurden in die A tumefaciens Stämme LBA4404, AGLO oder AGLl durch direkte Transformation wie in Walkerpeach & Veiten (Agrobacterium-mediatedgene transfer to plant cells cointegrate andbinary vector Systems, Gelvin SB, Schilperoot RA (Hrsg), Plant Molecular Biology Manual, 2nd edn, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Netherlands, pp. Bl /1 — Bl /19, 1994) beschrieben eingebracht. Transformierte Bakterien wurden auf YEB- Platten, die 1 g/ml Spectinomycin enthielten, selektioniert. Kolonien transformierter Bakterien wurden für Plasmid-Präparationen (Qiagen Mini-Kit, Qiagen, Hilden) ausgewählt und anschließend einer Analyse mittels Verdau durch Restriktionsenzyme unterzogen.
3. Kultur und Transformation der Kartoffel-Kultivare mit A tumefaciens
Die Kartoffel-Kultivare Agria, Topas und Fontane wurden durch Agcdbacterium- vermittelte Transformation im Wesentlichen wie in Visser (Visser RGF, 1991,
„Regeneration and transformation of potato by Agcobacterium tumefaciens." In Lindsey K (ed), 'Plant Culture Manual", Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Netherlands. Seiten B5 /1 - B5 /9) beschrieben transformiert, aber mit Imazamox selektioniert (WO 2004/005516; Andersson et al., 2003) . Blätter- oder Stängel-Segmente wurden für 1 - 3 Tage auf MC-Platten (M300-Platten (4,4 g/l MS-Medium, 2 mg/l NAA, 1 mg/l BAP, 30 g/l Sucrose, pH 5,2) vorkultiviert, mit 1,5 - 2 ml flüssigem Ml 00-Medium (4,4g/l MS-Medium, 30 g/l Sucrose, 0,5 mg/ml THarnin-Hydrochlorid, 0,5 mg/ml Pyridoxin-Hydrochlorid, 1 mg/l Nikotinsäure, 0,5 mg/l Kinetin, 29,8 mg/l FeSO4VH2O, 1 mg/l 2,4-D, 2 g/l Kasein-Hydrolysat, pH 6,5) überschichtet und mit einem sterilen Filterpapier bedeckt.
Nach 1 - 3 T agen wurden die Gewebs-Segmente von den Platten entfernt und zusammen mit A tumefaciens, die entweder VC-PMAl 6-1 oder VC-PMA19-1 enthielten, in MSlO- Medium (4,4 g/l MS-Medium, 10 g/l Sucrose, pH 5,8) inkubiert. Nach einer Inkubationszeit von 8 - 10 min. wurden die Gewebs-Segmente auf M300-Platten retransferiert und für weitere 1 - 3 T age inkubiert. Danach wurden die Gewebs-Segmente auf MS400-Platten (4,4 g/l MS-Medium, 2 mg/L Zeatin, 0,01 mg/L NAA, 0,1 mg/L GA3, 10 g/l Sucrose, 400 mg/1 Claforan oder Carbenicillin, pH 5,8) transferiert und für 3 - 5 Tage inkubiert.
4. Selektion der transformierten Kartoff el-Kultivare
Im Anschluss daran wurden die Gewebs-Segmente auf neue Platten transferiert, die das selbe Medium wie die MS400-Platten enthielten, aber denen zusätzlich 0,5 um Imazamox zur Selektion der transformierten Kartoff el-Kultivare zugegeben worden war. Die Gewebs- Segmente wurden alle zwei Wochen auf neue Platten mit dem selben Medium transferiert. Regenerierte putative transgene Sprösslinge wurden gesammelt und auf MS30-Platten kultiviert (4,4 g/L MS-Medium, 30 g/L Sucrose, 200 mg/L Claforan, pH 5,8) .
5. DNA-Extraktion aus den transformierten Kartoff el-Kultivaren
Aus den putativen transgenen Sprösslingen wurde unter Verwendung des Wizard Magnetic 96 DNA Plant System (Promega, Mannheim) nach Herstellerangaben DNA extrahiert.
6. Nachweis der Rpi-blbl und Rpl-blb2 Nukleinsäure in den transformierten Pflanzen mittels real-time PCR
Um die Anwesenheit von Rpi-blbl und Rpi-blb2 nachzuweisen, wurde mit der aus den putativen transgenen Sprösslingen gewonnenen DNA eine real-time PCR durchgeführt. Dabei wurden folgende Primer verwendet: Rp-blbl: 5'-TGT TGA ACA CTG TAA CAT GCT AAAATG-3' (fomard Primer; SEQ ID No.7) 5'-AGT TGT GGACAT CCC CGA ATT-3' (backι\ard Primer; SEQ ID
No.8) 5'-AGAGGG ATT GCAGCACCT AAC AAC CCT C-3' (Probe; SEQ ID
No.9)
Rp-blb2: 5'-TTC AAAACC CCAAAT AAG TTT CAAC-3' (fomard Primer; SEQ ID No. 10)
5'-CCATGC TTG CTG TAC TTT GCA-3'
Figure imgf000061_0001
SEQ ID No. 11)
5'-CGT TAC CCAGTC CTT CGG CG-3' (Probe; SEQ ID No. 12)
Positiv getestete Sprösslinge wurden in das Gewächshaus transferiert, wo dann die Beurteilung der Phytophthora-Resistenz durchgeführt wurde.
7. Bestimmung der P. infestans Resistenz der Kartoff el-Kultivare, die bezüglich des Gehalts von Rrj-blbl undRpi-blb2 gegenüber dem Wildtyp verändert sind
Zur Beurteilung der Phytophthora-Resistenz wurden die Sprösslinge nach dem Nachweis der Rpi-blbl- und Rpi-blb2- Nukleinsäuresequenzen (s. o.) auf Erde überführt und für 2 Tage in einem Klimaschrank (Binder KBW 400) bei 229C und 12 h Wechsellicht unter Hauben angezogen. Danach wurden die Pflanzen ca 4 Wochen auf Erde im Gewächshaus unter ähnlichen Bedingungen propagiert (229C; 12 h Wechsellicht) . Als Inokulum diente eine Phytophthora infestans-Gevλächshausmischung in einigen Versuchen auch das hochvirulente Isolat 2-5-5, welches bereits nach 2,5 T agen mit der Sporulation beginnt. Die Gewächshausmischung enthält 7 verschiedene Feldisolate (Al, D2, Bl, B2, B3, B4, P4) von P. infestans aus 7 verschiedenen europäischen Ländern und repräsentiert somit das PathogenspektrumimFeld. Die 7 Feldisolate, die jeweils verschiedene Kreuzungstypen darstellen und unterschiedliche Kolonientypen zeigen, wurden auf Erbsenagar (s. u) kultiviert.
Erbsenagar: - 150 gErbsen (Marke Salto aus HL-Markt)
- 1000 ml Millipore-Wasser
- 75 min. im Dampf kochtopf kochen lassen
- Dampfkochtopf ausschalten und das Medium für eine weitere Stunde darin stehen lassen
- Entnahme des Ansatzes
- Mediumfür 24 hbei RT stehen lassen
- Abseihen des Ansatzes und erneut auf 1 Liter mit Milliporewater auffüllen
- Zugabe von 5g Glukose und 20 g Agar-Agar
- Einstellen des pH- Wertes auf 6,5 - 15 min autoklavieren
- Platten unter der Sterilbank gießen
Für die Inokulation der Pflanzen wurde jeweils eine Sporendichte von 2,5xE05 Sporen/ml mittels einer Thoma-Zählkammer eingestellt. Die Inokulation erfolgte mit einer Airbrush- Sprühpistole an der gesamten Pflanze, wobei die Pflanzenoberfläche mit einem schwachen, gleichmäßigen Sprühnebel bedeckt wurde. Danach wurden die inokulierten Pflanzen abgedeckt und in eine feuchte Nebelkammer gestellt. Dort wurden die Pflanzen bei ca 92% Luftfeuchtigkeit unter ständiger Beregnungbei ca 219C und 12 h Wechsellicht gehalten. Nach 5- 6 Tagen (dayspost inoculation, dpi) wurde die erste Bonitur der entstandenen Symptome vorgenommen. Nach der ersten Bonitur wurden die Pflanzen erneut mit der Gev\ädnshausmischungbzw. dem hochvirulenten Isolat 2-5-5 von P. infestans inokuliert. Nach 5 - 6 Tagen wurde dann die zweite Bonitur der Symptome vorgenommen. Bei den Bonituren wurde die Intensität der makroskopischen Symptome Nekrosenbildung Chlorosenbildung sowie eventuelle Sporulation von P. infestans bezogen auf die gesamte Pflanze bestimmt und in Form eines Wertes zwischen 0 und 100 % (Symptomstärke [%]) dargestellt. Abbildung 1 zeigt einen Vergleich der Intensität der makroskopischen Symptome in Doppeltransf ormanten, Einzeltransf ormanten und Wildtyp-Pflanzen.
Abbüdungslegande
Abb. l:
Vergleich der Intensität makroskopischer Symptome der P. infestans-Infektion in Kartoff el-Kultivaren, die mit einem Rpl-blbl /Rpi-blb2-Doppelgenkonstrukt transformiert wurden (Transformanten 2, 55, 82), sowie in Kontroll-Kartoffel-Kultivaren, die mit einem Rpi-blbl-Einzelgenkonstrukt (Transformante 2 A/36) bzw. mit einem Rpi-blb2- Einzelgenkonstrukt (Transformante T6/3) oder gar nicht (Wildtyppflanzen; Pflanzen P698, P835) transformiert wurden, und anschließend mit einer Mischung von P. infestans- Isolaten infiziert wurden.
P698 = Parentalpflanze cv. Agria (nicht transgen) P835 = Parentalpflanze cv. Topas (nicht transgen) 2A/36 = Rpi-blbl-exprimierende transgene Pflanze T6/3 = Rpi-blb2-exprimierende transgene Pflanze
Pflanze 2 = TS-PH05-041-0002 (Rpi-bll/Rpi-blb2-doppelt-transgene Pflanze) Pflanze 55 = TS-PH05-002-0055 (Rpi-blbl/Rpi-blb2-doppelt-tran^ne Pflanze) Pflanze 82 = TS-PH05-002-0082 (Rp-blbl/Rp-blb2-doppelt-tran^ne Pflanze)
Abb.2: Abb.2 zeigt die erfindungsgemäßen Vektoren VC-PMAL 6-1 (a) sowie VC-PMA19-1 (b), die auf Basis des Vektors pSUNAH ASmod generiert wurden

Claims

PAT E NT ANSPRU C H E
1. Verfahren zur Erhöhung der Pathogenreastenz in Pflanzen und/oder
Pflanzenzellen, wobei in den Pflanzen bzw. Pflanzenzellen der Gehalt an Rpi-blbl, kodiert durch eine Nukleinsäuresequenz, auswählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 5 oder Fragmente davon umfassen, b) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die für ein Protein mit der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, c) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die zu der in SEQ ID NO: 5 angegebenen Nukleotidsequenz eine Sequenzidentität von mindestens 60% aufweisen, und/oder d) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit einem komplementären Strang einer Nukleotidsequenz von a) bis c) hybridisieren, und der Gehalt an Rpi-blb2, kodiert durch eine Nukleinsäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die die Sequenz gern SEQ ID NO: 6 oder Fragmente davon umfassen, b) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die für ein Protein mit der in SEQ ID NO: 4 angegebenen Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, c) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die zu der in SEQ ID NO: 6 angegebenen Nukleotidsequenz eine Sequenzidentität von mindestens 60% aufweisen, und/oder d) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleoticl^^
Bedingungen mit einem komplementären Strang einer Nukleotidsequenz von a) bis c) hybridisieren, gegenüber den Ausgangspflanzen bzw. -pflanzenzellen erhöht wird
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Rpi-blbl -Protein die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 aufweist, und das Rpi-blb2-Protein die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 4 aufweist, oder die Proteine j eweils eine Aminosäuresequenz aufweisen, die im Wesentlichen funktionell homolog dazu ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, umfassend die folgenden Schritte: A) Übertragen eines rekombinantenNukleinsäuremoleküls umfassend i) eine in Pflanzenzellen funktionelle Promotorsequenz und funktionell damit verknüpft eine erste Nukleinsäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 5 oder Fragmente davon umfassen, b) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die für ein Protein mit der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, c) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die zu der in SEQ ID NO: 5 angegebenen Nukleotidsequenz eine Sequenzidentität von mindestens 60% aufweisen, und/oder d) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit einem komplementären Strang einer Nukleotidsequenz von a) bis c) hybridisieren, und funktionell damit verknüpft eine in Pflanzenzellen funktionelle Terminationssequenz, und ii) eine in Pflanzenzellen funktionelle Promotorsequenz und funktionell damit verknüpft eine zweite Nukleinsäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die die Sequenz gemäß
SEQ ID NO: 6 oder Fragmente davon umfassen, b) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die für ein Protein mit der in SEQ ID NO: 4 angegebenen Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, c) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die zu der in SEQ ID
NO: 6 angegebenen Nukleotidsequenz eine Sequenzidentität von mindestens 60% aufweisen, und/oder d) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die unter stringenten
Bedingungen mit einem komplementären Strang einer Nukleotidsequenz von a) bis c) hybridisieren, und funktionell damit verknüpft eine in Pflanzenzellen funktionelle
Terminationssequenz, auf eine Pflanzenzelle und gegebenenfalls Integration in das pflanzliche Genom
B) gegebenenfalls Regenerieren von Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Pflanzen bzw. Pflanzenzellen eine erhöhte Resistenz gegen Pathogene, ausgewählt aus dem Stamm der QαmycEten, bevorzugt Phytophthαra infestans,
Phytophthαra sojae, Phytophthαra erythrospatica, Phytophthαra ramourum, Phytophthcra parasaitica, Percncspαra tabaάna und/oder Hyalopercnospcra parasitica, aufweisen
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei es sich bei den transgenen Pflanzen um monokotyle oder dikotyle Pflanzen, bevorzugt Pflanzen, die zur Familie der Nachtschattengewächse (Sdanaαaae), insbesondere bevorzugt Pflanzen, die zur Gattung der Kartoffel (Solanum), der Tomate (Lyooperäccn) oder des Tabaks (Nicotiana) gehören, handelt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei es sich bei den transgenen Pflanzen um Solanum tuberosum, Solanum derrissum oder Sdanumbulbocastanum handelt.
7. Transgene Pflanze oder Pflanzenzelle mit erhöhter Pathogenresistenz, wobei die Pflanze bzw. Pflanzenzelle einen gegenüber den Ausgangspflanzen bzw. - pflanzenzellen erhöhten Gehalt an Rpi-blbl, kodiert durch eine Nukleinsäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 5 oder Fragmente davon umfassen, b) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die für ein Protein mit der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, c) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die zu der in SEQ ID NO: 5 angegebenen Nukleotidsequenz eine Sequenzidentität von mindestens 60% aufweisen, und/oder d) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit einem komplementären Strang einer Nukleotidsequenz von a) bisc) hybridisieren, und einen gegenüber Wildtyppflanzen erhöhten Gehalt an Rpi-blb2, kodiert durch eine
Nukleinsäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 6 oder Fragmente davon umfassen, b) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die für ein Protein mit der in SEQ ID NO: 4 angegebenen Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, c) Nukleirisäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die zu der in SEQ ID NO: 6 angegebenen Nuldeotidsequenz eine Sequenzidentität von mindestens 60% aufweisen, und/oder d) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit einem komplementären Strang einer Nukleotidsequenz von a) bis c) hybridisieren, aufweist.
8. Transgene Pflanze oder Pflanzenzelle nach Anspruch 7, wobei das Rpi-blbl -Protein die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 aufweist, und das Rpi-blb2-Protein die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 4 aufweist, oder die Proteine jeweils eine Aminosäuresequenz aufweisen, die im Wesentlichen funktionell homolog dazu ist.
9. Transgene Pflanze oder Pflanzenzelle nach Anspruch 7 oder 8, wobei die transgenen Pflanzen bzw. -zellen eine erhöhte Resistenz gegen Pathogene, ausgewählt aus dem Stamm der Qαmyαäen, bevorzugt Phytophthαra infestans, Phytophthαra scjae, Phytophthαra eryfhrospatica, Phytophthαra ramourum, Phytophthcra paraätica, Percnospcra tabaάna und Hyalopercnospcra paraätica aufweisen
10. Transgene Pflanzen oder Pflanzenzellen nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei es sich bei den Pflanzen um monokotyle oder dikotyle Pflanzen, bevorzugt Pflanzen, die zur Familie der Nachtschattengewächse (Sdanaαaae), insbesondere bevorzugt Pflanzen, die zur Gattung der Kartoffel (Solanum), der Tomate (Lycrperäccn) oder des Tabaks (Nicotiana) und gehören, handelt.
11. Transgene Pflanzen oder Pflanzenzellen nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei es sich bei den transgenen Pflanzen um Solanum tuberosum, Sdanum derrissumoder Sdanumbulbocastanumhandelt.
12. Pflanzen oder Pflanzenzellen mit erhöhter Pathogenresistenz, erhalten durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
13. Transgene Pflanze, hergestellt nach einem der Ansprüche 1 bis 6, sowie Teile dieser Pflanze, transgene Ernteprodukte und transgenes Vermehrungsmaterial dieser Pflanzen, wie Protoplasten, Pflanzenzellen, Kalli, Samen, Knollen, Stecklinge, sowie transgene Nachkommen dieser Pflanze.
14. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, umfassend i) eine in Pflanzen funktionelle Promotorsequenz und funktionell damit verknüpft eine erste Nukleinsäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 5 oder Fragmente davon umfassen, b) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die für ein Protein mit der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, c) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die zu der in SEQ ID NO: 5 angegebenen Nukleotidsequenz eine Sequenzidentität von mindestens 60% aufweisen, und/oder d) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit einem komplementären Strang einer Nukleotidsequenz von a) bis c) hybridisieren, und funktionell damit verknüpft eine in Pflanzen funktionelle Terminationssequenz, und ii) eine in Pflanzen funktionelle Promotorsequenz und funktionell damit verknüpft eine zweite Nukleinsäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 6 oder Fragmente davon umfassen, b) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die für ein Protein mit der in SEQ ID NO: 4 angegebenen Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, c) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die zu der in SEQ ID NO: 6 angegebenen Nukleotidsequenz eine Sequenzidentität von mindestens 60% aufweisen, und/oder d) Nukleinsäuresequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit einem komplementären Strang einer Nukleotidsequenz von a) bis c) hybridisieren, und funktionell damit verknüpft eine in Pflanzen funktionelle Terminationssequenz.
15. Verwendung eines rekombinantenNukleinsäuremoleküls nach
Anspruch 14 zur Erhöhung der Pathogenresistenz in transgenen Pflanzen
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