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WO2007018238A1 - アポトーシス促進性化合物又は抗アポトーシス性化合物をスクリーニングする方法及び神経変性疾患の悪性度の判定方法 - Google Patents

アポトーシス促進性化合物又は抗アポトーシス性化合物をスクリーニングする方法及び神経変性疾患の悪性度の判定方法 Download PDF

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WO2007018238A1
WO2007018238A1 PCT/JP2006/315749 JP2006315749W WO2007018238A1 WO 2007018238 A1 WO2007018238 A1 WO 2007018238A1 JP 2006315749 W JP2006315749 W JP 2006315749W WO 2007018238 A1 WO2007018238 A1 WO 2007018238A1
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nedl1
interaction
test compound
compound
cells
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PCT/JP2006/315749
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Inventor
Akira Nakagawara
Toshinori Ozaki
Original Assignee
Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc.
Chiba-Prefecture
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Publication date
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2510/00—Detection of programmed cell death, i.e. apoptosis

Definitions

  • the present invention relates to a method for screening a pro-apoptotic compound or an anti-apoptotic compound.
  • the present invention also relates to a method for determining the degree of malignancy of a neurodegenerative disease.
  • ALS myotrophic Lateral Sclerosis is a neurodegenerative disease with a poor prognosis that causes muscle atrophy due to degeneration or loss of motor neurons in the spinal cord, motor cortex, or brainstem.
  • familial ALS FALS; Familial Amyotrophic Lateral Sclerosis
  • SOD1 CuZZn superoxide dismutase
  • Non-patent Document 1 SOD1 inactivates superoxide, which is a kind of active oxygen generated in cells during aerobic metabolism.
  • superoxide which is a kind of active oxygen generated in cells during aerobic metabolism.
  • mutant SOD1 forms aggregates in cells and exerts cytotoxicity is becoming the most effective cause of FALS (Non-patent Document 1).
  • the inventors of the present invention have compared E3 ubiquitin ligase having a HECT domain as one of the novel genes that are highly expressed in the group with good prognosis that spontaneously regresses compared to the group with poor prognosis of human neuroblastoma.
  • the encoding NEDL1 was identified.
  • NEDL1 has been found to have a function of promoting the degradation of mutant SOD1 by physically binding to mutant SOD1, which is one of the causative gene products of FALS, and inducing its ubiquitination.
  • the strength of binding between NEDL1 and mutant SOD1 depends on the severity of the pathological condition from which it is derived, and binding with wild-type SOD1 is not detected.
  • Non-Patent Document 2 The detailed molecular mechanism of neuronal cell death (apoptosis) by NEDL1 is unknown (Patent Document 1, Non-Patent Document 2) .
  • Patent Document 1 International Publication No. 03Z018842 Pamphlet
  • Non-Patent Document 1 Rosen DR et al, Nature, 364: 59-62 (1993)
  • Non-Patent Document 2 Miyazaki K et al "J. Biol. Chem., 279: 11327-11335 (2004) Disclosure of the Invention
  • NE DL1 which catalyzes the degradation of the target protein via ubiquitin
  • p53 which catalyzes the degradation of the target protein via ubiquitin
  • activation of p53 by NEDL1 may be one of the molecular mechanisms that control neuronal cell death not only in ALS but also in general neurodegenerative diseases including Alzheimer's disease and Parkinson's disease. From the above knowledge, the present inventors have completed the present invention.
  • the present invention includes a step of measuring the interaction between p53 and NEDL1 under the presence and absence of a test compound, and in the presence of the test compound.
  • the ability to interact with p53 and NEDL1 When the test compound is stronger than the interaction between p53 and NEDL1 in the absence of the test compound, the step of determining the test compound as an apoptosis-promoting compound is provided.
  • a screening method for sex compounds is provided. This screening method is that the P 53 and NEDL1 interact to form a complex directly, by applying the molecular mechanisms that induce ⁇ apoptosis. Since the present inventors have found a new molecular mechanism, it is possible to obtain pro-apoptotic compounds with completely different mechanism of action by this screening method. . Such compounds can be applied to apoptosis promoters and anticancer agents.
  • the present invention also includes a step of culturing cells expressing p53 and NEDL1 under the respective conditions in the presence and absence of a test compound, and p53 and NEDL1 in each cultured cell. And the interaction between P53 and NEDL1 in cells cultured in the presence of the test compound Interaction between p53 and NEDL1 in cells cultured in the absence of the test compound
  • a method for screening a pro-apoptotic compound comprising the step of determining the test compound as a pro-apoptotic compound when the test compound is stronger. By this screening method, it is possible to obtain a pro-apoptotic compound having a completely different mechanism of action from the past, and a powerful compound can be applied to an apoptosis promoting agent or an anticancer agent.
  • the present invention also includes a step of measuring the interaction between p53 and NEDL1 under the respective conditions in the presence and absence of the test compound, and p53 in the presence of the test compound. And the step of determining the test compound as an anti-apoptotic compound when the interaction with NEDL 1 is weaker than the interaction between p53 and NEDL 1 in the absence of the test compound. Methods of screening for anti-apoptotic compounds are provided. This subscription one - ing method is where the P 53 and NEDL1 interact to form a complex directly, by applying the molecular mechanisms that induce apoptosis.
  • the present invention also includes a step of culturing cells expressing p53 and NEDL1 in the presence and absence of a test compound, and p53 and NEDL1 in each cultured cell.
  • a method for screening an anti-apoptotic compound comprising the step of determining the test compound as an anti-apoptotic compound when the interaction between p53 and NEDL1 in cells cultured below is weaker . With this screening method, it is possible to obtain anti-apoptotic compounds with completely different mechanisms of action, and such compounds can be applied to apoptosis inhibitors and therapeutic agents for neurodegenerative diseases. Is possible
  • the invention further patient force neurodegenerative disease in even nerve cells taken, a step of measuring the interaction between P 53 and N EDL1, neurodegenerative diseases stronger the interaction between p53 and NEDL1 And a method for determining the degree of malignancy of a neurodegenerative disease.
  • This determination method is based on a molecular mechanism in which p53 and NEDL1 directly interact to form a complex and induce apoptosis.
  • Such a molecular mechanism has been newly found by the present inventors, and therefore, it is possible to determine the malignancy of a neurodegenerative disease based on a different criterion, and this determination method is based on the patient's malignancy. It can be used for prognosis.
  • the screening method of the present invention it is possible to obtain an apoptosis promoting compound and an anti-apoptotic compound having completely different mechanisms of action. By finding such compounds, it will be possible to develop drugs that are effective in the treatment and prevention of cancer and neurodegenerative diseases (ALS, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, etc.).
  • cancer and neurodegenerative diseases ALS, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, etc.
  • FIG. 1 is a graph showing the proportion of tandem staining positive cells in cis-bratin-treated SH-SY5Y cells.
  • FIG. 2 shows the results of RT-PCR analysis of RNA from cisplatin-treated SH-SY5Y cells.
  • FIG. 3 shows the results of Western blot analysis of proteins from cisplatin-treated SH-SY5Y cells.
  • FIG. 4 is a diagram and graph showing the results of colony formation experiments on SH-SY5Y cells.
  • (A) represents the appearance of colonies
  • (b) is a graph showing the number of G418 resistant colonies.
  • FIG. 5 is a diagram and a graph showing the results of colony formation experiments on U20S cells. (a) represents the appearance of colonies, and (b) is a graph representing the number of G418 resistant colonies.
  • FIG. 6 is a diagram and a graph showing the results of a colony formation experiment on H1299 cells. (a) represents the appearance of colonies, and (b) is a graph representing the number of G418 resistant colonies.
  • FIG. 7 is a graph showing the magnification of transcriptional activity of p53. (a) shows the results when p21 WAF1 luciferase reporter is used, and (b) shows the results when Bax luciferase reporter is used.
  • FIG. 8 shows the results of immunoprecipitation and immunoblotting of COS7 cells into which a NEDL1 expression plasmid was introduced.
  • IP represents the antibody used for immunoprecipitation
  • IB represents the antibody used for immunoblotting.
  • FIG. 9 shows the results of immunoblotting of cytoplasmic fraction (C) and nuclear fraction (N) of U20S cells treated or not treated with cisplatin.
  • FIG. 10 is a schematic diagram showing the relationship between NEDL1 and p53.
  • p53 is activated by physically binding to NEDLl in the cell nucleus and induces p53-dependent cell death.
  • the screening method for pro-apoptotic compounds of the present invention comprises a step of measuring the interaction between P53 and NEDL1 in the presence and absence of a test compound, and p53 in the presence of the test compound. And the step of determining that the test compound is an apoptosis-promoting compound when the interaction between P53 and NEDL1 is stronger than the interaction between P53 and NEDL1 in the absence of the test compound. More specifically, the interaction between p53 and NEDL1 refers to the binding and complex formation between the two.
  • a system for measuring protein-protein interaction known to those skilled in the art can be used.
  • the yeast two-hybrid method or the PCA method protein fragment 'complementation • assembly
  • yeast two-hybrid method is a transcriptional regulator composed of an N-terminal DNA-binding domain (DBD) and a C-terminal transcriptional activity domain (AD). Both domains basically function autonomously, and DBD can bind to DNA alone, but cannot activate transcription. AD is the opposite.
  • the yeast two-hybrid method was developed by applying this property. In other words, when a protein (bait) in which the target protein P is fused to the DB4 of Gal4 and a protein (prey) in which another protein Q is fused to the AD of Gal4 are introduced into yeast cells, P and Q are in the nucleus.
  • the transcriptional control complex is reconstituted in yeast cells, and transcription is activated depending on the Gal4 binding site.
  • a reporter gene for example, HIS3, lac Z, URA3 and the like can be used.
  • yeast Gal4 systems using SRF or LexA can also be used.
  • the screening method of the present invention can be performed using a system using p53 as protein P and NE DL1 as protein Q (or vice versa). . That is, one of p53 and NEDL1 as a bait and the other of P53 or NEDL1 as a play are expressed in yeast, and the yeast is cultured under the respective conditions in the presence and absence of the test compound.
  • the transcriptional activity of the reporter gene (representing the strength of the interaction between P53 and NEDL1) was measured, and the transcriptional activity in the presence of the test compound was higher than the transcriptional activity in the absence of the test compound! In the case of speaking, it can be determined that the test compound is a proapoptotic compound.
  • one functional protein A (enzyme, transcription factor, etc.) is divided into two fragments A1 and A2, and each is fused with target proteins P and Q to produce fusion proteins Al-P and A2-Q. To do. When the target proteins P and Q are bound, the function of the functional protein A is restored, and the activity is detected to determine the interaction between P and Q.
  • j8-lactamase can be used as the functional protein. The following describes the PCA method using j8-lactamase.
  • ⁇ -lactamase is a 13-ratatam ring-cleaving enzyme derived from bacteria.
  • ⁇ -lactamase is divided into the oc 197 fragment (25 to 197 residues) on the ⁇ -terminal side and the ⁇ 198 fragment (198 to 288 residues) on the C-terminal side, and each is expressed as a fusion protein with the target protein. Only when the two bind together, the three-dimensional structure of the j8-lactamase protein is restored and exhibits activity.
  • ⁇ -lactamase activity is detected by the cell-permeable fluorescent probe CCF2ZAM (CCF2 acetylmethyl ester).
  • CCF2ZAM has a structure in which two different fluorescent substances, coumarin and fluorescein, are bonded to both ends of the cephalosporin molecule.
  • Intramolecular FRET fluorescence resonance energy transfer
  • coumarin is excited with 409 nm light
  • it will emit 520 nm fluorescence derived from fluorescein.
  • CCF2 undergoes degradation due to j8-latatamase activity
  • the two fluorescent substances dissociate and FRET is no longer observed.
  • excitation of 409 nm light causes the emission of coumarin's natural 447 nm fluorescence. 4
  • By measuring the fluorescence intensity at 47 nm it is possible to measure the activity of j8-lactamase, that is, the strength of interaction of the target protein.
  • a fusion protein in which p53 is fused to one of two fragments of functional protein, A1 and A2, and NEDL1 is fused to the other, is expressed in the cell, and the cell is expressed under each condition in the presence or absence of the test compound.
  • the activity of the functional protein in the cultured cells is measured, and the activity of the functional protein in the cells cultured in the presence of the test compound is greater than the activity of the functional protein in the cells cultured in the absence of the test compound. If it also rises, it can be determined that the test compound is a pro-apoptotic compound.
  • the method for screening pro-apoptotic compounds of the present invention comprises a step of culturing cells expressing p53 and NEDL1 under respective conditions in the presence and absence of a test compound, The step of measuring the interaction between p53 and NEDL1 in each cultured cell and the interaction between P53 and NEDL1 in cells cultured in the presence of the test compound were cultured in the absence of the test compound. And a step of determining the test compound as an apoptosis-promoting compound when the interaction is stronger than the interaction between p53 and NEDL1 in the cell.
  • the measurement of interaction is a Systems for measuring protein-protein interactions are available, and examples include immunoprecipitation. A screening method using the immunoprecipitation method will be described below.
  • cells expressing p53 and NEDL1 are prepared.
  • Such cells include, for example, SH-SY5Y cells, which are human neuroblastoma cells, U20S cells, which are human osteosarcoma cells, and cells that are treated with an anticancer agent such as cisplatin to stress the cells. It can be prepared by inducing DL1.
  • profitable cells may be prepared by introducing the NEDL1 gene into cells expressing p53. Then, the cells are cultured under the respective conditions in the presence and absence of the test compound.
  • the interaction between p53 and NEDL1 in each cultured cell is measured.
  • the cultured cells are crushed to prepare a cell lysate.
  • Cell lysate may be whole cell lysate, but since interaction between p53 and NEDL1 occurs in the nucleus, use cell lysate from the nuclear fraction. Preferred.
  • Immunoprecipitation is performed by adding an antibody against either P53 or NEDL1 to the prepared cell-soluble material.
  • the resulting precipitate (which contains a complex of p53 and NEDL1) was analyzed by immunological technique (such as immunoblotting) using an antibody against the other molecule to form a complex of p53 and ⁇ 01 ⁇ 1.
  • immunological technique such as immunoblotting
  • the interaction between p53 and NEDL1 in cells cultured in the presence of the test compound is stronger than the interaction between P53 and NE DL1 in cells cultured in the absence of the test compound.
  • the compound can be determined to be a pro-apoptotic compound.
  • the screening method for an anti-apoptotic compound of the present invention comprises a step of measuring the interaction between p53 and NEDL1 in each of the presence and absence of a test compound, and in the presence of the test compound. determining that the test compound is an anti-apoptotic compound when the interaction between p53 and NEDL1 is weaker than the interaction between P53 and NEDL1 in the absence of the test compound. .
  • a system for measuring protein-protein interaction known to those skilled in the art can be used.
  • Examples include the yeast two-hybrid method and the PCA method.
  • This screening method using the yeast two-hybrid method is as follows.
  • One of p53 or NEDL1 as bait and the other of p53 or NEDL1 as prey are expressed in yeast, and the yeast is cultured under the respective conditions in the presence and absence of the test compound.
  • the transcriptional activity of the reporter gene (representing the strength of the interaction between P53 and NEDL1) was measured, and the transcriptional activity in the presence of the test compound was lower than the transcriptional activity in the absence of the test compound. In this case, it can be determined that the test compound is an anti-apoptotic compound.
  • This screening method using the PCA method is as follows.
  • a fusion protein in which p53 is fused to one of two functional protein fragments A1 and A2, and NEDL1 is fused to the other is expressed in the cell, and the cell is cultured in the presence or absence of the test compound.
  • the activity of the functional protein in the cultured cells is measured, and the activity of the functional protein in the cells cultured in the presence of the test compound is lower than the activity of the functional protein in the cells cultured in the absence of the test compound. In this case, it can be determined that the test compound is an anti-apoptotic compound.
  • the screening method for an anti-apoptotic compound of the present invention includes a step of culturing cells expressing P53 and NEDL1 under the respective conditions in the presence and absence of a test compound.
  • the step of measuring the interaction between p53 and NEDL1 in each cultured cell and the interaction between P53 and NEDL1 in cells cultured in the presence of the test compound And the step of determining that the test compound is an anti-apoptotic compound when the interaction between p53 and NEDL1 in cells cultured in is weaker.
  • a system for measuring the interaction between proteins known to those skilled in the art can be used, for example, immunoprecipitation
  • the present screening method using immunoprecipitation is as follows. First, cells expressing p53 and NEDL1 are prepared. Preparation of vigorous cells is as described above. Then, the cells are cultured under the respective conditions in the presence and absence of the test compound. Next, the interaction between p53 and NEDL1 in each cultured cell is measured. The measurement of interaction is also as described above. As a result of the measurement, the interaction between P53 and NEDL1 in cells cultured in the presence of the test compound is weaker than the interaction between P53 and NEDL1 in cells cultured in the absence of the test compound (protein When the amount of complex formation is small), the compound can be determined to be an anti-apoptotic compound.
  • the method for determining the degree of malignancy of a neurodegenerative disease comprises a step of measuring an interaction between p53 and NEDL1 in a neuronal cell collected from a patient with a neurodegenerative disease, and a strong interaction between p53 and NEDL 1. And a step of determining that the malignancy of the neurodegenerative disease is high.
  • target neurodegenerative diseases include, but are not limited to, ALS, Arnno's disease, Parkinson's disease, and the like.
  • neuronal cells are also collected from patients with neurodegenerative diseases.
  • p53 and NEDL1 for example, immunoprecipitation
  • the interaction between them corresponding to the amount of protein complex formed in the case of immunoprecipitation
  • the malignancy of neurodegenerative diseases is evaluated according to the strength of the disease. For example, based on the interaction between p53 and NEDL1 in nerve cells collected from healthy individuals, the malignancy of the neurodegenerative disease can be evaluated according to how strong it is.
  • p21 WAF1 and Bax luciferase reporters were obtained from Dr. B. Vogelstein of John's Hopkins University. The Tanel staining system was purchased from Roche. pCDN A3 was purchased from Invitrogen. Luciferase Atsy system was purchased from Promega. Cisplatin (CDDP) and G418 were purchased from Sigma. Anti-p53 antibody, anti-actin antibody, anti-p21 WAF1 antibody and anti-Xpress antibody are respectively available from Oncogene Research Products Sento, Sigma, 3 ⁇ 4anta and ruz Biotechnologies and Invitr. ogen company power purchased. Normal Usagi Serum was purchased from ackson ImmunoResearch.
  • NEDL1 5'- CCGATTTGAGATCACTTCCTCC-3 '(SEQ ID NO: 1)
  • GAPDH 5 -ACCTGACCTGCCGTCTAGAA-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • NEDL2 5'-ACGTGAGTGGGTACCTCCAG-3 '(SEQ ID NO: 9)
  • NEDD4 5 '-TTCCGAAGAAAGTTGAAGAAGC-3' (SEQ ID NO: 11)
  • RT-PCR method Western blot analysis, immunoprecipitation method, luciferase reporter assay and cell fractionation method are the same as those described in Ando et al., J. Biol. Chem., 279: 25549-25561, 2004. Went in the way. Colony formation was performed in the same manner as described in Ozaki et al., Cancer Res., 59: 59 02-5907, 1999.
  • Example 1 Induction of cell death of SH-SY5Y cells by treatment with cisbratin
  • SH—SY5Y cells were cultured in the presence of cisbratin (final concentration 20 M). As for the culture starting force, the cells were fixed with paraformaldehyde at predetermined time intervals, and then Tanel staining was performed to count the number of tunnel positive cells. Figure 1 shows the percentage of cells that are positive for Tanel staining. Induction of cell death by cisplatin was detected.
  • Example 2 shows the results of RT-PCR analysis. Induction of NEDL 1 expression in response to cisplatin was observed.
  • expression plasmids encoding p53 and NEDL1 and a luciferase expression plasmid having a promoter region of p21 WAF1 or Bax gene were introduced into H1299 cells. At 48 hours after gene transfer, cells were collected and their luciferase activity was measured. As shown in FIG. 7, N EDL1 promoted the transcriptional activity of p53.
  • An expression plasmid encoding NEDL1 was introduced into COS7 cells expressing endogenous p53. At 48 hours after gene transfer, collect cells, extract total protein, Immunoprecipitation was performed with normal rabbit antibody (NRS) or anti-NEDL1 antibody, and the immunoprecipitated product was analyzed by Western plotting. The results are shown in Fig. 8. Complex formation between NEDL1 and endogenous p53 was confirmed.
  • An expression plasmid encoding NEDL1 with Xpress tag! was introduced into U20S cells. At 24 hours after gene transfer, the cells were divided into a cisbratin-treated group and an untreated group and cultured for another 24 hours in the presence or absence of cisbratin. Cells were collected, fractionated into cytoplasmic fraction (C) and nuclear fraction (N), immunoprecipitated with anti-NEDL1 antibody, and immunoprecipitation products were analyzed by Western plotting. Tubulin alpha and lamin B were used as cell fractionation markers. The results are shown in FIG. Complex formation between ⁇ 53 and NEDL1 in the cell nucleus was confirmed.
  • the screening method of the present invention provides pro-apoptotic compounds and anti-apoptotic compounds that have completely different mechanisms of action. Such compounds can be effective drugs for the treatment and prevention of cancer and neurodegenerative diseases.
  • the method for determining the degree of malignancy of a neurodegenerative disease of the present invention provides a method for determining the degree of malignancy of a neurodegenerative disease based on a different criterion.

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Abstract

　被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、ｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用を測定し、被検化合物の存在下及び非存在下におけるｐ５３とＮＥＤＬ１との相互作用の強さを比較することにより、アポトーシス促進性化合物又は抗アポトーシス性化合物であるかを判断するスクリーニング方法。

Description

明 細 書
アポトーシス促進性ィ匕合物又は抗アポトーシス性ィ匕合物をスクリーニング する方法及び神経変性疾患の悪性度の判定方法
技術分野
[0001] 本発明は、アポトーシス促進性ィ匕合物又は抗アポトーシス性ィ匕合物をスクリーニン グする方法に関する。本発明は、また、神経変性疾患の悪性度の判定方法に関する 背景技術
[0002] 筋萎縮性側索硬化症 (ALS myotrophic Lateral Sclerosis)は、脊髄、運動皮質、 脳幹の運動ニューロンの変性、脱落により筋萎縮を生じる、予後不良の神経変性疾 患である。現在、家族性の ALS (FALS ; Familial Amyotrophic Lateral Sclerosis)は、 ALS全体の 5〜10%の頻度で認められる。 FALSの一部の家系の原因遺伝子は、 CuZZnスーパーォキシドジスムターゼ（SOD1)遺伝子であることが判明しており、 F ALSの約 20%が SOD1遺伝子変異を原因としている。
[0003] SOD1は、好気性代謝の過程で細胞内に生じる活性酸素の一種であるスーパーォ キシドを不活性ィ匕する。変異型 SOD1が細胞内で凝集体を形成し、細胞毒性を発揮 するという凝集体仮説が、近年、 FALSの病因として最も有力なものとされつつある（ 非特許文献 1)。
[0004] 本発明者らは、ヒト神経芽腫の予後不良群に比べて、自然退縮する予後良好群に ぉ ヽて高発現する新規遺伝子の一つとして、 HECTドメインを持つ E3ュビキチンリガ ーゼをコードする NEDL1を同定した。 NEDL1は FALSの原因遺伝子産物の一つ である変異型 SOD 1と物理的に結合し、そのュビキチン化を誘導することにより、変 異型 SOD1の分解を促進する機能を持つことが判明している。また、 NEDL1と変異 型 SOD1との結合の強度は、由来する病態の重症度に依存しており、野生型 SOD1 との結合は検出されない。さらに、モデルマウス及び実際の症例における免疫染色 実験から、ュビキチン化された変異型 SOD1及び NEDL1は凝集体内で蓄積してい ることが観察された。したがって、 NEDL1と変異型 SOD 1との相互作用が FALSの 発症及び進行に重要な役割を担っていることが強く示唆される力 NEDL1による神 経細胞死 (アポトーシス）の詳細な分子機構にっ ヽては不明である（特許文献 1、非 特許文献 2)。
[0005] 特許文献 1：国際公開第 03Z018842号パンフレット
非特許文献 1 : Rosen DR et al, Nature, 364: 59-62 (1993)
非特許文献 2 :Miyazaki K et al" J. Biol. Chem., 279: 11327-11335 (2004) 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] NEDL1による神経細胞死の分子機構を解明し、アポトーシスを増強又は抑制する 化合物を見出すことは、癌や神経変性疾患の治療 ·予防薬の開発につながる。した がって、本発明の目的の一つは、 NEDL1によるアポトーシスの分子機構を解明する ことである。本発明の別の目的は、解明された分子機構力も導きだされるアポトーシ スを促進又は抑制する化合物のスクリーニング方法を提供することである。本発明の さらに別の目的は、解明された分子機構に基づいた、神経変性疾患の悪性度の判 定方法を提供することである。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは、シスブラチン処理による細胞死誘導における各種遺伝子の発現解 析などの実験結果から、ュビキチンィ匕を介して標的タンパク質の分解を触媒する NE DL1は、 p53に対しては分解を促進せずにむしろその活性を昂進することを見出し た。このことは、 NEDL1による p53の新たな制御機構の存在を示唆している。また、 NEDL1による p53の活性化は、 ALSのみならずアルツハイマー病やパーキンソン 病を含めた神経変性疾患一般における神経細胞死を制御する分子機構の一つであ る可能性も考えられる。以上の知見から、本発明者らは本発明を完成するに至った。
[0008] すなわち、本発明は、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下に おいて、 p53と NEDL1との相互作用を測定する工程と、被検化合物の存在下にお ける p53と NEDL1との相互作用力 被検化合物の非存在下における p53と NEDL1 との相互作用よりも強 ヽ場合に、当該被検化合物をアポトーシス促進性化合物と判 定する工程と、を備えるアポトーシス促進性ィ匕合物のスクリーニング方法を提供する。 本スクリーニング方法は、 P53と NEDL1とが直接相互作用して複合体を形成し、ァ ポトーシスを誘導するという分子機構を応用したものである。カゝかる分子機構は、本 発明者らが新たに見出したものであり、したがって、今までとは作用機序が全く異なる アポトーシス促進性ィ匕合物を本スクリーニング方法により得ることが可能である。かか る化合物は、アポトーシス促進剤ゃ抗癌剤に応用することが可能である。
[0009] 本発明は、また、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下におい て、 p53及び NEDL1を発現した細胞を培養する工程と、培養したそれぞれの細胞 における、 p53と NEDL1との相互作用を測定する工程と、被検化合物の存在下に おいて培養した細胞における P53と NEDL1との相互作用力 被検化合物の非存在 下において培養した細胞における p53と NEDL1との相互作用よりも強い場合に、当 該被検化合物をアポトーシス促進性化合物と判定する工程と、を備えるアポトーシス 促進性ィ匕合物のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法により、今まで とは作用機序が全く異なるアポトーシス促進性ィ匕合物を得ることが可能であり、また、 力かる化合物はアポトーシス促進剤ゃ抗癌剤に応用することが可能である。
[0010] 本発明は、また、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下におい て、 p53と NEDL1との相互作用を測定する工程と、被検化合物の存在下における p 53と NEDL 1との相互作用が、被検化合物の非存在下における p 53と NEDL 1との 相互作用よりも弱!ヽ場合に、当該被検化合物を抗アポトーシス性化合物と判定する 工程と、を備える抗アポトーシス性化合物のスクリーニング方法を提供する。本スクリ 一-ング方法は、 P53と NEDL1とが直接相互作用して複合体を形成し、アポトーシ スを誘導するという分子機構を応用したものである。カゝかる分子機構は、本発明者ら が新たに見出したものであり、したがって、今までとは作用機序が全く異なる抗アポト 一シス性ィ匕合物を本スクリーニング方法により得ることが可能である。かかる化合物は 、アポトーシス抑制剤や神経変性疾患の治療薬に応用することが可能である。
[0011] 本発明は、また、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下におい て、 p53及び NEDL1を発現した細胞を培養する工程と、培養したそれぞれの細胞 における、 p53と NEDL1との相互作用を測定する工程と、被検化合物の存在下に おいて培養した細胞における P53と NEDL1との相互作用力 被検化合物の非存在 下において培養した細胞における p53と NEDL1との相互作用よりも弱い場合に、当 該被検化合物を抗アポトーシス性化合物と判定する工程と、を備える抗アポトーシス 性ィ匕合物のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法により、今までとは 作用機序が全く異なる抗アポトーシス性ィ匕合物を得ることが可能であり、また、かかる 化合物はアポトーシス抑制剤や神経変性疾患の治療薬に応用することが可能である
[0012] 本発明は、さらに、神経変性疾患の患者力も採取した神経細胞における、 P53と N EDL1との相互作用を測定する工程と、 p53と NEDL1との相互作用が強いほど神 経変性疾患の悪性度が高いと判定する工程と、を備える、神経変性疾患の悪性度の 判定方法を提供する。この判定方法は、 p53と NEDL1とが直接相互作用して複合 体を形成し、アポトーシスを誘導するという分子機構に基づくものである。かかる分子 機構は、本発明者らが新たに見出したものであり、したがって、今までとは異なる判定 基準により神経変性疾患の悪性度を判定することが可能であり、この判定方法は患 者の予後診断等に利用できる。
発明の効果
[0013] 本発明のスクリーニング方法によれば、今までとは作用機序が全く異なるアポトーシ ス促進性ィ匕合物及び抗アポトーシス性ィ匕合物を得ることが可能である。このような化 合物を見出すことで、癌や神経変性疾患 (ALS、アルツハイマー病、パーキンソン病 など)の治療 *予防に有効な薬を開発することが可能となる。
[0014] また、本発明の神経変性疾患の悪性度の判定方法により、今までとは異なる判定 基準により神経変性疾患の悪性度を判定することが可能である。
図面の簡単な説明
[0015] [図 1]シスブラチン処理した SH— SY5Y細胞の、タネル染色陽性細胞の割合を表す グラフである。
[図 2]シスプラチン処理した SH— SY5Y細胞からの RNAを RT—PCR解析した結果 を表す図である。
[図 3]シスプラチン処理した SH— SY5Y細胞からのタンパク質をウェスタンブロット解 祈した結果を表す図である。 [図 4]SH— SY5Y細胞に対するコロニー形成実験の結果を表す図及びグラフである
。 （a)はコロニーの外観を表し、（b)は G418耐性コロニーの数を表すグラフである。
[図 5]U20S細胞に対するコロニー形成実験の結果を表す図及びグラフである。 (a) はコロニーの外観を表し、 (b)は G418耐性コロニーの数を表すグラフである。
[図 6]H1299細胞に対するコロニー形成実験の結果を表す図及びグラフである。 (a) はコロニーの外観を表し、 (b)は G418耐性コロニーの数を表すグラフである。
[図 7]p53の転写活性ィ匕の倍率を表すグラフである。 (a)は p21WAF1ルシフェラーゼレ ポーターを、（b)は Baxルシフェラーゼレポーターを用いたときの結果を表す。
[図 8]NEDL1発現プラスミドを導入した COS7細胞を、免疫沈降及びィムノブロットし た結果を表す図である。 IPは免疫沈降に用いた抗体を、 IBはィムノブロットに用いた 抗体を、それぞれ表す。
[図 9]シスプラチンで処理した又は処理しなかった U20S細胞の細胞質画分 (C)及 び細胞核画分 (N)のィムノブロットの結果を表す図である。
[図 10]NEDL1と p53の関係を表す模式図である。様々なストレスに応答して、 p53 は細胞核内で NEDLlと物理的に結合することによって活性ィ匕され、 p53依存性の 細胞死が誘導される。
発明を実施するための最良の形態
[0016] 以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
[0017] (アポトーシス促進性ィ匕合物のスクリーニング方法）
本発明のアポトーシス促進性化合物のスクリーニング方法は、被検化合物の存在 下及び非存在下のそれぞれの条件下において、 P53と NEDL1との相互作用を測定 する工程と、被検化合物の存在下における p53と NEDL1との相互作用が、被検化 合物の非存在下における P53と NEDL1との相互作用よりも強い場合に、当該被検 化合物をアポトーシス促進性化合物と判定する工程と、を備える。 p53と NEDL1との 相互作用とは、より具体的には両者の結合、複合体形成を指す。相互作用の測定は 、当業者とつて公知のタンパク質間相互作用を測定する系が利用可能であり、例え ば、酵母ツーハイブリッド法や PCA法（プロテイン ·フラグメント 'コンプリメンテーシヨン •アツセィ）が挙げられる。酵母ツーハイブリッド法及び PCA法の概要を以下に説明 する。
[0018] まず、酵母ツーハイブリッド法を説明する。酵母 Gal4は、 N末端側の DNA結合ドメ イン (DBD)と C末端側の転写活性ィ匕ドメイン (AD)とからなる転写制御因子である。 両ドメインは基本的には自律的に機能し、 DBDは単独で DNAに結合できるが転写 の活性化は起こせない。 ADはその反対である。この性質を応用して開発されたのが 酵母ツーハイブリッド法である。つまり、 Gal4の DBDに目的のタンパク質 Pを融合し たタンパク質 (ベイト）と、 Gal4の ADに別のタンパク質 Qを融合したタンパク質 (プレイ )を酵母細胞に導入した場合、 Pと Qとが核内で相互作用すれば、酵母細胞内で転 写制御複合体が再構成され、 Gal4結合部位依存的に転写が活性化されることにな る。この活性をレポーター遺伝子を用いて検出することにより、タンパク質 P及び Qの 間の相互作用が容易に評価できる。レポーター遺伝子としては、例えば、 HIS3、 lac Z、 URA3などを利用することができる。また、酵母 Gal4以外にも、 SRFや LexAを用 いた系も利用することが可能である。
[0019] 酵母ツーハイブリッド法において、タンパク質 Pとして p53を、タンパク質 Qとして NE DL1を用いた系（又はその逆の系でも構わない）によれば、本発明のスクリーニング 方法を行うことが可能である。すなわち、ベイトとして p53又は NEDL1の一方を、プ レイとして P53又は NEDL1の他方を酵母に発現させ、被検化合物の存在下及び非 存在下のそれぞれの条件下で当該酵母を培養し、培養した酵母のレポーター遺伝 子の転写活性 (P53と NEDL1との相互作用の強さを表す)を測定し、被検化合物の 存在下の転写活性が被検化合物非存在下の転写活性よりも上昇して!/ヽる場合、被 検化合物はアポトーシス促進性ィヒ合物であると判定できる。
[0020] 次に、 PCA法について説明する。 PCA法では、一つの機能タンパク質 A (酵素、転 写因子など）を二つの断片 A1及び A2に分割し、それぞれを目的タンパク質 P及び Q と融合し、融合タンパク質 Al— P及び A2— Qを作製する。 目的タンパク質 P及び Q が結合すると、機能タンパク質 Aの機能が回復し、その活性を検出することで、 P及び Qの相互作用を判定する、という原理に基づいている。機能タンパク質としては、例え ば j8—ラクタマーゼを利用することができる。以下では、 j8—ラクタマーゼを利用した PC A法にっ 、て説明する。 [0021] βーラクタマーゼは細菌由来の 13 ラタタム環切断酵素である。 βーラクタマーゼ を、 Ν末端側の oc 197断片（25〜197残基）と C末端側の ω 198断片（198〜288残 基）に分割し、それぞれを目的タンパク質との融合タンパク質として発現させる。両者 が結合する場合にのみ j8—ラクタマーゼタンパク質の立体構造が回復し、活性を示 す。 βーラクタマーゼ活性は細胞透過性の蛍光プローブ CCF2ZAM (CCF2ァセト キシメチルエステル）により検出される。 CCF2ZAMはセファロスポリン分子の両末 端に 2種類の異なる蛍光物質クマリン及びフルォレセインが結合した構造を有してお り、クマリンをドナー、フルォレセインをァクセプターとする分子内 FRET (蛍光共鳴ェ ネルギー転移）を呈する。すなわち、クマリンを 409nmの光で励起すると、フルォレ セイン由来の 520nmの蛍光を発することになる。し力し、 CCF2が j8—ラタタマーゼ 活性による分解を受けると、 2つの蛍光物質は解離し、 FRETは観察されなくなるた め、 409nmの光の励起によってクマリン本来の 447nmの蛍光を発するようになる。 4 47nmの蛍光強度を測定することにより、 j8—ラクタマーゼの活性、すなわち、 目的タ ンパク質の相互作用の強さを測定することが可能となる。
[0022] したがって、 PCA法を利用して本発明のスクリーニング方法を行うには、以下の方 法によればよい。機能タンパク質の二つの断片 A1及び A2の一方に p53を他方に N EDL 1を融合させた融合タンパク質を細胞に発現させ、被検化合物の存在下又は非 存在下のそれぞれの条件下で当該細胞を培養し、培養した細胞における機能タンパ ク質の活性を測定し、被検化合物の存在下で培養した細胞における機能タンパク質 の活性が、被検化合物非存在下で培養した細胞における機能タンパク質の活性より も上昇して 、る場合、被検化合物はアポトーシス促進性ィ匕合物であると判定できる。
[0023] また、本発明のアポトーシス促進性ィ匕合物のスクリーニング方法は、被検化合物の 存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、 p53及び NEDL1を発現した 細胞を培養する工程と、培養したそれぞれの細胞における、 p53と NEDL1との相互 作用を測定する工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞における P53と NEDL1との相互作用が、被検化合物の非存在下において培養した細胞における p 53と NEDL1との相互作用よりも強い場合に、当該被検化合物をアポトーシス促進 性化合物と判定する工程と、を備える。相互作用の測定は、当業者にとって公知のタ ンパク質間相互作用を測定する系が利用可能であり、例えば、免疫沈降法が挙げら れる。免疫沈降法を用いたスクリーニング方法を以下に説明する。
[0024] まず、 p53及び NEDL1を発現した細胞を調製する。かかる細胞は、例えば、ヒト神 経芽腫細胞である SH— SY5Y細胞ゃヒト骨肉種細胞である U20S細胞などの p53 を発現している細胞にシスプラチンなどの抗癌剤処理で細胞にストレスを与えて NE DL1を誘導することにより調製することができる。あるいは、 p53を発現している細胞 に NEDL1遺伝子を導入することにより、カゝかる細胞を調製してもよい。そして、被検 化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下で前記細胞を培養する。
[0025] 次に、培養したそれぞれの細胞における、 p53と NEDL1との相互作用を測定する 。相互作用の測定には、まず、培養した細胞を粉砕して細胞可溶化物を調製する。 細胞可溶化物は、細胞全体の細胞可溶ィ匕物を用いてもよいが、 p53と NEDL1との 相互作用は核内で生じることから、核画分の細胞可溶ィ匕物を用いることが好ま 、。 調製した細胞可溶ィ匕物に、 P53又は NEDL1のいずれか一方の分子に対する抗体 を加えて免疫沈降を行う。得られた沈殿物 (p53及び NEDL1の複合体が含まれて いる）を他方の分子に対する抗体を用いた免疫学的手法 (ィムノブロット等）により、 p 53及ひ^：01^1の複合体を検出、定量することにより、 p53と NEDL1との相互作用 を測定できる。
[0026] 測定の結果、被検化合物の存在下において培養した細胞における p53と NEDL1 との相互作用が、被検化合物の非存在下において培養した細胞における P53と NE DL1との相互作用よりも強い場合 (タンパク質複合体の形成量が多い場合)に、当該 化合物をアポトーシス促進性ィ匕合物であると判定できる。
[0027] (抗アポトーシス性ィ匕合物のスクリーニング方法）
本発明の抗アポトーシス性化合物のスクリーニング方法は、被検化合物の存在下 及び非存在下のそれぞれの条件下において、 p53と NEDL1との相互作用を測定す る工程と、被検化合物の存在下における p53と NEDL1との相互作用が、被検化合 物の非存在下における P53と NEDL1との相互作用よりも弱い場合に、当該被検化 合物を抗アポトーシス性ィ匕合物と判定する工程と、を備える。相互作用の測定は、当 業者とつて公知のタンパク質間相互作用を測定する系が利用可能であり、例えば、 酵母ツーハイブリッド法や PCA法が挙げられる。
[0028] 酵母ツーハイブリッド法を利用した本スクリーニング方法は以下の通りである。ベイト として p53又は NEDL1の一方を、プレイとして p53又は NEDL1の他方を酵母に発 現させ、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下で当該酵母を培養 し、培養したそれぞれの酵母のレポーター遺伝子の転写活性 (P53と NEDL1との相 互作用の強さを表す)を測定し、被検化合物の存在下の転写活性が被検化合物の 非存在下の転写活性よりも低下して ヽる場合、被検化合物は抗アポトーシス性ィ匕合 物であると判定できる。
[0029] PCA法を利用した本スクリーニング方法は以下の通りである。機能タンパク質の二 つの断片 A1及び A2の一方に p53を他方に NEDL1を融合させた融合タンパク質を 細胞に発現させ、被検化合物の存在下又は非存在下のそれぞれの条件下で当該 細胞を培養し、培養した細胞における機能タンパク質の活性を測定し、被検化合物 の存在下で培養した細胞における機能タンパク質の活性が、被検化合物非存在下 で培養した細胞における機能タンパク質の活性よりも低下して ヽる場合、被検化合物 は抗アポトーシス性ィ匕合物であると判定できる。
[0030] また、本発明の抗アポトーシス性ィ匕合物のスクリーニング方法は、被検化合物の存 在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、 P53及び NEDL1を発現した細 胞を培養する工程と、培養したそれぞれの細胞における、 p53と NEDL1との相互作 用を測定する工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞における P53と N EDL1との相互作用が、被検化合物の非存在下において培養した細胞における p5 3と NEDL1との相互作用よりも弱い場合に、当該被検化合物を抗アポトーシス性ィ匕 合物と判定する工程と、を備える。相互作用の測定は、当業者にとって公知のタンパ ク質間相互作用を測定する系が利用可能であり、例えば、免疫沈降法が挙げられる
[0031] 免疫沈降法を利用した本スクリーニング方法は以下の通りである。まず、 p53及び NEDL1を発現した細胞を調製する。力かる細胞の調製は前述の通りである。そして 、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下で前記細胞を培養する。 次に、培養したそれぞれの細胞における、 p53と NEDL1との相互作用を測定する。 相互作用の測定も前述の通りである。測定の結果、被検化合物の存在下において培 養した細胞における P53と NEDL1との相互作用力 被検化合物の非存在下におい て培養した細胞における P53と NEDL1との相互作用よりも弱い場合 (タンパク質複 合体の形成量が少ない場合）に、当該化合物を抗アポトーシス性ィ匕合物であると判 定できる。
[0032] (神経変性疾患の悪性度の判定方法）
本発明の神経変性疾患の悪性度の判定方法は、神経変性疾患の患者から採取し た神経細胞における、 p53と NEDL1との相互作用を測定する工程と、 p53と NEDL 1との相互作用が強いほど神経変性疾患の悪性度が高いと判定する工程と、を備え る。
[0033] 対象となる神経変性疾患の具体例としては、 ALS、アルッノヽイマ一病、パーキンソ ン病などが挙げられるが、これらに限定されない。当業者にとって公知の方法に従い 、神経変性疾患の患者力も神経細胞を採取する。次に、上述の p53と NEDL1との 相互作用の測定方法 (例えば、免疫沈降法）により両者の相互作用（免疫沈降法の 場合、タンパク質複合体の形成量に相当する）を測定し、相互作用の強さに応じて神 経変性疾患の悪性度を評価する。例えば、健常者力 採取した神経細胞における p 53と NEDL1との相互作用を基準とし、基準よりもどのくらい強いかに応じて、神経変 性疾患の悪性度の評価を行うことができる。
実施例
[0034] 以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施 例に限定されるものではない。
[0035] (実験材料）
p21WAF1及び Baxルシフェラーゼレポーターは、 John' s Hopkins大学の Dr. B . Vogelsteinから入手した。タネル染色システムは Roche社から購入した。 pCDN A3は Invitrogen社から購入した。ルシフェラーゼアツセィシステムは Promega社か ら購入した。シスプラチン（CDDP)及び G418は Sigma社力 購入した。抗 p53抗体 、抗ァクチン抗体、抗 p21WAF1抗体及び抗 Xpress抗体は、それぞれ、 Oncogene R e search Products千土、 Sigma社、 ¾anta し ruz Biotechnologies社及ひ、Invitr ogen社力ら購入した。正常ゥサギ血清 ίお ackson ImmunoResearch社力ら購入 した。
[0036] PCRに用いた各種プライマーは以下の通りである。
NEDL1 : 5'- CCGATTTGAGATCACTTCCTCC- 3' (配列番号 1)
5'- CCGCTTTCCATCAGGTTGTT- 3' (配列番号 2)
GAPDH： 5 -ACCTGACCTGCCGTCTAGAA-3' (配列番号 3)
5'- TCCACCACCCTGTTGCTGTA- 3' (配列番号 4)
ρ53 : 5'- ATTTGATGCTGTCCCCGGACGATATTGAAC- 3' (配列番号 5)
5'- ACCCTTTTTGGACTTCAGGTGGCTGGAGTG- 3' (配列番号 6) ρ21 : 5'- ATGAAATTCACCCCCTTTCC- 3' (配列番号 7)
5'- CCCTAGGCTGTGCTCACTTC- 3' (配列番号 8)
NEDL2： 5'- ACGTGAGTGGGTACCTCCAG- 3' (配列番号 9)
5'- CCTCAGAAACTGGCCCATTA- 3' (配列番号 10)
NEDD4： 5 '-TTCCGAAGAAAGTTGAAGAAGC-3 ' (配列番号 11)
5し CTCTGGCAACTCCTCCATAATC- 3 ' (配列番号 12)
[0037] (実験方法）
RT—PCR法、ウェスタンブロット解析、免疫沈降法、ルシフェラーゼレポーターアツ セィ及び細胞分画法は、 Ando et al., J.Biol.Chem., 279: 25549-25561, 2004に記載 の方法と同様の方法で行った。コロニー形成法は、 Ozaki et al., Cancer Res., 59: 59 02-5907, 1999に記載の方法と同様の方法で行った。
[0038] (実施例 1：シスブラチン処理による SH— SY5Y細胞の細胞死誘導）
SH— SY5Y細胞をシスブラチン (終濃度 20 M)の存在下で培養した。培養開始 力も所定の時間ごとに細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、タネル染色を行い、タ ネル陽性の細胞数をカウントした。図 1にタネル染色陽性細胞の割合を示す。シスプ ラチンによる細胞死の誘導が検出された。
[0039] (実施例 2 :RT— PCR法による発現解析）
実施例 1と同じ条件で、 SH— SY5Y細胞をシスブラチンで処理し、所定の時間ごと に細胞を回収した後、全 RNAを抽出し、 RT— PCR法により NEDL1、 NEDL2、 N EDD4、 p21WAF1及び p53遺伝子の発現解析を行った。発現レベルのコントロールと して、 GAPDHを用いた。図 2に RT— PCR法による解析結果を示す。シスプラチン に応答した NEDL 1の発現誘導が認められた。
[0040] (実施例 3：ウェスタンプロット法による発現解析）
実施例 1と同じ条件で、 SH— SY5Y細胞をシスブラチンで処理し、所定の時間ごと に細胞を回収した後、全タンパク質を抽出し、ウェスタンプロット法により p21WAF1、リ ン酸化p53 (p53 (Serl5) )、p53及びNEDLlの発現解析を行った。発現レベルの コントロールとして、ァクチンを用いた。図 3にウェスタンブロット法による解析結果を 示す。シスブラチンに応答した P21WAF1、リン酸化 P53、 p53及び NEDL1の発現誘 導が認められた。
[0041] (実施例 4 :コロニー形成実験）
NEDL1によって細胞死が誘導されるか否かを検討する目的で、 SH— SY5Y、 U 20S及び H 1299細胞に NEDL 1をコードする発現プラスミドを導入した（コントロー ルとして PCDNA3を使用した)。遺伝子導入の 48時間後の時点で、 G418を含む培 地に細胞を移して 14日間培養し、 G418に耐性を示すコロニーの数を数えた。 SH- SY5Y、 U20S及び H1299細胞の結果を、それぞれ図 4、 5及び 6に示す。 SH— S Y5Y及び U20S細胞においては、 NEDL1によって G418耐性コロニー数の減少が 観察された。一方、 p53力発現していない H1299細胞では、 NEDL1による G418 耐性コ口-一数の減少は認められなかった。
[0042] (実施例 5：ルシフェラーゼレポーターアツセィ）
p53の転写活性ィ匕能に対する NEDL1の効果を検討する目的で、 H1299細胞に p 53及び NEDL1をコードする発現プラスミド並びに p21WAF1又は Bax遺伝子のプロモ 一ター領域を持つルシフェラーゼ発現プラスミドを導入した。遺伝子導入の 48時間 後の時点で細胞を回収し、そのルシフェラーゼ活性を測定した。図 7に示すように、 N EDL1による p53の転写活性ィ匕能の昂進が認められた。
[0043] (実施例 6 :p53と NEDL1との複合体形成の確認）
内在性の p53を発現している COS7細胞に NEDL1をコードする発現プラスミドを 導入した。遺伝子導入の 48時間後の時点で細胞を回収し、全タンパク質を抽出し、 正常ゥサギ抗体 (NRS)又は抗 NEDL1抗体で免疫沈降し、免疫沈降産物をウェス タンプロット法で解析した。その結果を図 8に示す。 NEDL1と内在性の p53との複合 体形成が確認された。
[0044] (実施例 7：細胞核内での p53と NEDL1との複合体形成の確認）
U20S細胞に、 Xpressタグの付!、た NEDL1をコードする発現プラスミドを導入し た。遺伝子導入の 24時間後の時点で、細胞をシスブラチン処理群と無処理群とに分 けて、シスブラチンの存在下又は非存在下でさらに 24時間培養した。細胞を回収し、 細胞質画分 (C)及び細胞核画分 (N)に分画し、抗 NEDL1抗体で免疫沈降し、免 疫沈降産物をウェスタンプロット法で解析した。チューブリン αとラミン Bを、細胞の分 画マーカーとして使用した。結果を図 9に示す。細胞核内での ρ53と NEDL1との複 合体形成が確認された。
産業上の利用可能性
[0045] 本発明のスクリーニング方法は、今までとは作用機序が全く異なるアポトーシス促進 性ィ匕合物及び抗アポトーシス性ィ匕合物を提供する。このような化合物は、癌や神経 変性疾患の治療，予防に有効な薬となり得る。
[0046] また、本発明の神経変性疾患の悪性度の判定方法は、今までとは異なる判定基準 に基づく神経変性疾患の悪性度の判定方法を提供する。

Claims

請求の範囲
[1] 被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、 p53と NEDL 1との相互作用を測定する工程と、
被検化合物の存在下における P53と NEDL1との相互作用力 被検化合物の非存 在下における p53と NEDL1との相互作用よりも強い場合に、当該被検化合物をアポ トーシス促進性化合物と判定する工程と、
を備える、アポトーシス促進性ィ匕合物のスクリーニング方法。
[2] 被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、 p53及び NE DL 1を発現した細胞を培養する工程と、
培養したそれぞれの細胞における、 P53と NEDL1との相互作用を測定する工程と 被検化合物の存在下において培養した細胞における P53と NEDL1との相互作用 力 被検化合物の非存在下において培養した細胞における P53と NEDL1との相互 作用よりも強い場合に、当該被検化合物をアポトーシス促進性化合物と判定するェ 程と、
を備える、アポトーシス促進性ィ匕合物のスクリーニング方法。
[3] 被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、 p53と NEDL
1との相互作用を測定する工程と、
被検化合物の存在下における P53と NEDL1との相互作用力 被検化合物の非存 在下における P53と NEDL1との相互作用よりも弱い場合に、当該被検化合物を抗 アポトーシス性ィ匕合物と判定する工程と、
を備える、抗アポトーシス性ィ匕合物のスクリーニング方法。
[4] 被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、 p53及び NE
DL 1を発現した細胞を培養する工程と、
培養したそれぞれの細胞における、 P53と NEDL1との相互作用を測定する工程と 被検化合物の存在下において培養した細胞における P53と NEDL1との相互作用 力 被検化合物の非存在下において培養した細胞における P53と NEDL1との相互 作用よりも弱い場合に、当該被検化合物を抗アポトーシス性ィ匕合物と判定する工程と を備える、抗アポトーシス性ィ匕合物のスクリーニング方法。
神経変性疾患の患者力も採取した神経細胞における、 P53と NEDL1との相互作 用を測定する工程と、
p53と NEDL1との相互作用が強いほど神経変性疾患の悪性度が高いと判定する 工程と、
を備える、神経変性疾患の悪性度の判定方法。
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