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WO2003012102A2 - Acides nucleiques codant des proteines a domaine hect - Google Patents

Acides nucleiques codant des proteines a domaine hect Download PDF

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Publication number
WO2003012102A2
WO2003012102A2 PCT/FR2002/002782 FR0202782W WO03012102A2 WO 2003012102 A2 WO2003012102 A2 WO 2003012102A2 FR 0202782 W FR0202782 W FR 0202782W WO 03012102 A2 WO03012102 A2 WO 03012102A2
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WO
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polypeptide
amino acid
seq
nucleic acid
hect domain
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Application number
PCT/FR2002/002782
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English (en)
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WO2003012102A3 (fr
Inventor
Dominique Thomas
Bruno Sargueil
Frédéric SCAEROU
Original Assignee
Cytomics Systems
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Filing date
Publication date
Application filed by Cytomics Systems filed Critical Cytomics Systems
Publication of WO2003012102A2 publication Critical patent/WO2003012102A2/fr
Publication of WO2003012102A3 publication Critical patent/WO2003012102A3/fr

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals

Definitions

  • the invention relates to the field of protein ubiquitination, and more particularly to the field of control and diagnosis of protein ubiquitination.
  • a large number of proteins whose stability is regulated by the ubiquitin-proteasome pathway provide regulatory functions in the cell (regulators of the cell cycle, such as cyclins, for example, transcription factors, receptors, etc.) .
  • the ubiquitin-proteasome system is therefore an important regulatory system for eukaryotic cells which controls the cellular concentration of key proteins by their selective degradation.
  • proteins involved in ubiquitination there are in particular p27, p53, p300, cyclins, E2F, STAT-1, c-Myc, c-Jun, IKB, NFKB and ⁇ -catenin.
  • the ubiquitin pathway leads to the covalent attachment of a chain of ubiquitin to target substrates which are then degraded by a multiprotein complex, the proteasome, within which numerous protease activities are associated.
  • Ubiquitination of the target protein is a three-step mechanism that generally involves three classes of enzymes. Ubiquitin is first activated in its C-terminal part by the formation of a thioester link with an ubiquitin activating enzyme, the enzyme E1. Next, ubiquitin is transferred to the active cysteine residues of one of the many ubiquitin conjugation enzymes (Ubc or E2).
  • E3 protein ligase The main function of E3 enzymes is to recognize the substrate, but these enzymes sometimes catalyze the formation of a peptide link between ubiquitin and a lysine residue on the substrate. The repetition of the action of these three enzymes leads to the formation of a polyubiquitin chain. The polyubiquitinated protein is then addressed to the proteasome where it is degraded.
  • Ubiquitin ligases HECT domain enzymes
  • Ubiquitin ligases or E3 are the central determinants of the specificity of ubiquitination. Although this property is clearly established, it has proven difficult to understand the E3-dependent catalysis at the molecular level. In most cases, the substrate, ubiquitin and the enzyme that carries ubiquitin (E2) must all be present at the reaction center. Consequently, in addition to contributing to the chemical transfer of ubiquitin to lysine residues, the E3 enzyme must also coordinate the positioning of the various protein actors at its active site.
  • the E3 enzymes currently known are members of two protein families: the HECT domain E3 and the RING finger E3.
  • the catalytic domains of these two families are not related either in sequence or in structure (nevertheless certain E2 interact well with E3 of the two families).
  • the 70 amino acids of the RING finger have a distinct spacing from the cysteine and histidine residues whose role is to ensure the fixation of two zinc ions which stabilize the characteristic globular structure (Borden KLB, 2000).
  • the RING domain E3 is a subunit of a multiprotein complex. This is particularly the case for the SCF, APC and VCB complexes (Deshaies RJ, 1999; Tyers M and Jorgensen P, 2000).
  • the SCF and VCB complexes contain a RING domain protein designated Rbx1, and the APC contains the APC11 protein.
  • the E3 enzymes do not seem to play a role in the recognition of the substrate, this role being ensured by other proteins of the multiprotein complex, such as the F-box proteins in the SCF complexes (S: Skp1; C: Cdc53 or culline; F: protein containing a box F).
  • Certain RING finger proteins also function autonomously, such as the c-Cbl protein involved in the degradation of EGF (epidermal growth factor) or PDGF (platelet derived growth factor) receptors (Joazeiro CAP and Weissman AM, 2000) or the Mdm2 protein mainly responsible for the degradation of p53 by the proteasome (Haupt Y et al., 1997).
  • HECT domain proteins are characterized by a motif of approximately 350 amino acids containing a very conserved cysteine residue which forms an essential thiol ester intermediate during catalysis. Structurally, HECT domain proteins are large proteins made up of many binding domains. Some have C2 domains (Ca2 + / lipid binding domain) and WW domains (repetition of 35-40 amino acids of two tryptophan residues) in addition to the HECT domain. WW domains are believed to be involved in substrate recognition (Pirozzi G. et al., 1997). Many HECT proteins contain WW domains.
  • E6 and E6-AP form a complex which functions as an E3 specific for p53 (Scheffner M., 1993).
  • the terminal third of the E6-AP sequence is 35-45% identical to many other proteins in databases (Huibregtse JM, 1995).
  • Rhoplasminogen activator protein In mammalian databases in particular, many potential HECT proteins can be found, but the vast majority of them are not functionally characterized. Apart from E6-AP, the best characterized protein E3 with a HECT domain is the yeast enzyme Rsp5. Rsp5 has been implicated in the ubiquitination of various types of very different substrates. Rsp5 recognizes a set of permeases and membrane receptors whose ubiquitination depends in some cases on a signal produced by the phosphorylation of the substrate. These substrates are then endocyted. Rsp5 also has soluble substrates including Rpb1, the large RNA polymerase II subunit. Ubiquitination in this case leads to proteolysis. The properties of Rsp5 are preserved in higher eukaryotes. The human protein Rpb1 is recognized by Nedd4, the murine / human ortholog of Rsp5 (Beaudenon SL et al., 1999).
  • HECT domain proteins are probably E3 or components of multiprotein complexes containing E3-like activities. At present, little information is available on the possible functions of the E3s with HECT domain. These findings suggest that a large repertoire of E3 has been established by bringing together various domains of protein interaction with only two catalytic motifs. Despite this progress, however, and despite the recent determination of the structure of two E2- E3 complexes (Huang L et al., 1999; Zheng N et al., 2000) which show how the different stakeholders can in certain cases align at the active site of E3, many questions, especially mechanics, remain.
  • the ubiquitin system is involved in the pathology of many human genetic diseases including the Angelman and Liddle syndromes.
  • Angelman syndrome is a rare and hereditary defect resulting in mental retardation associated with a mutation in the HECT domain protein, E3 (Kishino, T et al;, 1997; Matsuura, T. et al., 1997).
  • Liddle syndrome involving the HECT domain ubiquitin ligase, Nedd4 is a rare and hereditary form of hypertension caused by the deletion of regions of the epithelial sodium channel (ENaC) which target it for ubiquitin dependent degradation (Staub O et al., 1996). This results in hyperactivity of this channel.
  • E3 epithelial sodium channel
  • Cancers develop when cells multiply too quickly.
  • Cell proliferation depends on a balance between negative signals and positive signals. When the positive signals are higher or the negative signals are absent, the cells multiply too quickly and the cancer develops.
  • cells precisely control the amount of a given protein and eliminate excess or any unnecessary protein. To do this, the cell specifically marks these unwanted proteins with a long chain of ubiquitin. These molecules are then recognized and destroyed by the proteasome.
  • this machinery becomes entangled in tumors leading to the excessive accumulation of positive signals (oncogenic proteins), or to the abnormal degradation of negative regulators (tumor suppressors). Consequently, in the absence of tumor suppressors or in the presence of an excess of oncogenes, the cells multiply constantly, forming tumors (for review, see Ciechanover, 1998).
  • the present invention relates to new proteins with HECT domain and new substrates for proteins with HECT domain. It relates to the screening methods developed to identify the substrates of new HECT domain proteins and to identify the small molecules and drugs that modulate the interaction and / or activity of HECT domain proteins and their substrates.
  • the screening methods of this invention can be used to identify therapeutic agents that could be used in protocols and for the treatment of various conditions, including cancer, inflammation, cardiovascular disease, neurodegenerative disease, viral, bacterial and fungal.
  • This invention encompasses the use of the nucleotides encoding these new HECT domain proteins, the HECT domain proteins and peptides derived from these proteins, the vectors allowing the expression of these proteins in bacteria, fungi, insects, plants and mammalian organisms. as well as animals in which the genes encoding these HECT domain proteins have been inactivated.
  • a first subject of the invention consists of a nucleic acid coding for a polypeptide with an HECT domain chosen from the amino acid sequences comprising the sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 11, or for a fragment or a variant of the polypeptide chosen from the amino acid sequences comprising the sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 11.
  • the fragment of the HECT domain polypeptide comprises or consists of the peptide defining the HECT domain stricto sensu of a polypeptide chosen from the amino acid sequences comprising the sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 1 1.
  • a fragment of the HECT domain polypeptide comprises or consists of a polypeptide chosen from the amino acid sequences comprising the sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 11 in which the amino acid sequence has been deleted. from the HECT domain stricto sensu.
  • a nucleic acid as defined above can further be characterized in that the HECT domain polypeptide, a fragment or a variant of this polypeptide is fused with a heterologous polypeptide, for example a detectable marker or the GAL4 protein.
  • the invention also relates to recombinant vectors, for cloning or expression, containing a nucleic acid according to the invention, where appropriate under the control of a regulatory sequence allowing its expression in a chosen host cell.
  • the subject of the invention is also a polypeptide with a domain
  • HECT comprising an amino acid sequence chosen from sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 11, a fragment or variant of this polypeptide, as well as antibodies directed against this polypeptide or else the fragment or variant of that -ci .. It also relates to methods of cell or cell screening of candidate compounds interacting with a polypeptide with HECT domain as defined above.
  • It also relates to methods of screening for candidate compounds modulating the strength of the interaction between an HECT domain polypeptide according to the invention and a substrate protein, as well as to methods of screening for candidate compounds capable of inhibiting or activating the ubiquitin ligase activity of the HECT domain protein specified by the polypeptide under consideration.
  • composition comprising a therapeutically effective amount of a nucleic acid or of a recombinant vector as defined above, in combination with one or more physiologically compatible excipients.
  • composition comprising a therapeutically effective amount of a polypeptide according to the invention, in combination with one or more physiologically compatible excipients.
  • any conventional technique of molecular biology, microbiology and recombinant DNA known to those skilled in the art can be used. Such techniques are described for example by SAMBROOK et al. (1989), GLOVER (1985), GAIT (1984),
  • any nucleic acid and any polypeptide according to the invention are in an isolated or purified form.
  • isolated in the sense of the present invention designates a biological material which has been removed from its original environment (the environment in which it is naturally located).
  • a naturally occurring polynucleotide in a plant is not isolated.
  • the same polynucleotide separated from the adjacent nucleic acids within which it is naturally inserted into the genome of the plant is isolated.
  • Such a polynucleotide may be included in a vector and / or such a polynucleotide may be included in a composition and nevertheless remain in an isolated state since the vector or the composition does not constitute its natural environment.
  • purified does not require that the material be present in a form of absolute purity, exclusive of the presence of other compounds. Rather, it is a relative definition.
  • a polynucleotide or a polypeptide is in the purified state after purification of the starting material or the natural material of at least one order of magnitude, preferably 2 or 3 and preferably four or five orders of magnitude.
  • nucleotide sequence can be used to denote either a polynucleotide or a nucleic acid.
  • nucleotide sequence encompasses the genetic material itself and is therefore not limited to information regarding its sequence.
  • nucleic acid refers to any organic acid
  • polynucleotide refers to any organic compound
  • oligonucleotide or “nucleotide sequence” includes RNA, DNA, cDNA or hybrid sequences
  • nucleotide designates both natural nucleotides (A, T, G, C) as well as modified nucleotides which comprise at least one modification such as (i) an analog of a purine, (ii) an analog of d 'a pyrimidine, or (iii) a similar sugar, such modified nucleotides being described for example in PCT application No. WO 95/04064.
  • a first polynucleotide is considered to be "complementary" to a second polynucleotide when each base of the first nucleotide is paired with the base complementary to the second polynucleotide whose orientation is reversed.
  • the complementary bases are A and T (or A and U), and C and G.
  • a first nucleic acid having at least 95% identity with a second reference nucleic acid will have at least 95%, preferably at least 96%, 97%, 98%, 98.5%, 99 %, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% or 99.9% identity nucleotides with this second reference polynucleotide, the percentage of identity between two sequences being determined as described below.
  • the "percentage of identity" between two nucleotide or amino acid sequences can be determined by comparing two optimally aligned sequences, through a comparison window.
  • the part of the nucleotide or polypeptide sequence in the comparison window can thus include additions or deletions (for example "gaps") with respect to the reference sequence (which does not include these additions or these deletions) so as to obtain an optimal alignment of the two sequences.
  • the percentage is calculated by determining the number of positions at which an identical nucleic base or amino acid residue is observed for the two sequences (nucleic or peptide) compared, then by dividing the number of positions at which there is identity between the two bases or amino acid residues compared, by the total number of positions in the comparison window, then multiplying the result by one hundred to obtain the percentage of sequence identity.
  • the optimal alignment of the sequences for the comparison can be carried out by computer using known algorithms.
  • the percentage of sequence identity is determined using the BLAST software (BLAST version 2.06 of September 1998), using exclusively the default parameters.
  • a nucleic acid having at least 95% nucleotide identity with a nucleic acid according to the invention includes the "variants" of a nucleic acid according to the invention.
  • variant of a nucleic acid according to the invention is meant a nucleic acid which differs from the reference nucleic acid by one or more substitutions, additions or deletions of a nucleotide, relative to the nucleic acid of reference.
  • a variant of a nucleic acid according to the invention can be of natural origin, such as an allelic variant which exists naturally. Such a variant nucleic acid can also be an unnatural nucleic acid obtained, for example, by mutagenesis techniques.
  • the differences between the reference nucleic acid and the "variant" nucleic acid are reduced so that the reference nucleic acid and the variant nucleic acid have very similar nucleotide sequences and, in many regions , identical.
  • the nucleotide modifications present in a variant nucleic acid can be silent, which means that they do not affect the amino acid sequence which can be encoded by this variant nucleic acid.
  • Changes in nucleotides in the variant nucleic acid can also result in substitutions, additions or deletions of one or more amino acids in the sequence of the polypeptide which can be encoded by this variant nucleic acid.
  • a variant nucleic acid according to the invention comprising an open reading phase, code for a polypeptide which retains the same function or the same biological activity as the polypeptide coded by the reference nucleic acid.
  • a variant nucleic acid according to the invention and which comprises an open reading phase code for a polypeptide which retains the ability to be recognized by antibodies directed against the polypeptide encoded by the reference nucleic acid.
  • fragment of a nucleic acid according to the invention is meant a nucleotide sequence of a reduced length compared to the reference nucleic acid, the nucleic acid fragment having a nucleotide sequence identical to the nucleotide sequence of the reference nucleic acid on the common part.
  • Such fragments of a nucleic acid according to the invention have at least 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000 , 2000 or 3000 consecutive nucleotides of the reference nucleic acid, the maximum length in nucleotides of a fragment of a nucleic acid according to the invention being of course limited by the maximum length in nucleotides of the reference nucleic acid.
  • fragment of a polypeptide with an HECT domain means a polypeptide fragment of reduced length compared to the reference polypeptide, the polypeptide fragment having an amino acid sequence identical to the amino acid sequence of reference polypeptide on the common part.
  • Such fragments of a HECT domain polypeptide according to the invention have at least 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180 , 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, or 390 consecutive amino acids of a polypeptide with reference HECT domain
  • hybridization conditions within the meaning of the invention, is meant the following hybridization conditions:
  • Pre-hybridization same conditions as for hybridization duration: 1 night.
  • the parameters defining the stringency conditions depend on the temperature at which 50% of the paired strands separate (Tm).
  • Tm is defined by the relation:
  • Tm 81.5 + 0.41 (% G + C) +16.6 Log (cation concentration) - 0.63 (% formamide) - (600 / number of bases) (SAMBROOK et al., (1989) , pages 9.54-9.62).
  • Tm 4 (G + C) + 2 (A + T).
  • the hybridization temperature is approximately 5 to 30 ° C, preferably 5 to 10 ° C below Tm.
  • hybridization conditions described above are used for the hybridization of a nucleic acid 20 bases in length and can be adapted as a function of the length of the nucleic acid whose hybridization is sought or of the type chosen marking, according to techniques known to those skilled in the art.
  • the suitable hybridization conditions can for example be adapted according to the teaching contained in the work of HAMES and HIGGINS (1985) or also in the work of AUSUBEL et al. (1989).
  • the level and the specificity of hybridization depend on different parameters, such as: a) the purity of the preparation of the nucleic acid on which the probe or the primer is to hybridize; b) the base composition of the probe or of the primer, the GC base pairs having greater thermal stability than the A-T or AU base pairs; c) the length of the homologous base sequence between the probe or the primer and the nucleic acid; d) ionic strength: the rate of hybridization increases with increasing ionic strength and the duration of the incubation time; e) the incubation temperature; f) the concentration of the nucleic acid on which the probe or the primer is to hybridize; g) the presence of denaturing agents, such as agents promoting the breaking of hydrogen bonds, such as formamide or urea, which
  • Figure 1 illustrates the alignment of the amino acid sequences corresponding to the HECT domain of the various proteins according to the invention.
  • FIG. 2 is a schematic representation of proteins with an HECT domain. The putative protein-protein interaction domains are shown. The double slash indicates that the corresponding complementary DNAs are incomplete in 5 'and / or in 3'.
  • HECT means Homologous to E6-AP Carboxyl-Terminus
  • WW means domain with two conserved Trp residues
  • C2 means binding motif of Ca 2+ or certain types of lipids
  • RC1 means Regulator of Chromosome Condensation
  • IQ means small motif of binding of calmodulin with Ile and Gin residues
  • RING means a zinc finger-like motif.
  • HECT domain polypeptides involved in the ubiquitination of cellular proteins, an important step in the protein degradation pathway.
  • the characterization of these new HECT domain polypeptides according to the invention makes it possible to develop new diagnostic tools for the detection of alterations in the biological activity of ubiquitin ligase with HECT domain and new therapeutic tools intended to prevent or correct these alterations in the biological activity of ubiquitin ligases with a HECT domain.
  • the new HECT domain polypeptides according to the invention are the following polypeptides:
  • the HECT9 polypeptide has sequence homology with the Pub1 protein of S. pombe.
  • a first subject of the invention consists of a nucleic acid coding for a polypeptide with an HECT domain chosen from the amino acid sequences comprising the sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 11, or for a fragment or a variant of the polypeptide chosen from the amino acid sequences comprising the sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 11.
  • the HECT domain polypeptide encoded by a nucleic acid as defined above consists of an amino acid sequence chosen from the sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 11 , or for a variant or fragment of this polypeptide.
  • a nucleic acid coding for a polypeptide with an HECT domain comprises a polynucleotide chosen from the nucleotide sequences SEQ ID No. 12 to SEQ ID No. 22, as well as the nucleotide sequences which are derived therefrom and which comprise the open reading frame contained in the sequences SEQ ID N ° 12 to SEQ ID N ° 22.
  • Another object of the invention therefore consists of a nucleic acid comprising a nucleotide sequence chosen from the following sequences:
  • nucleotide sequence going from the nucleotide at position 184 to the nucleotide at position 4899 of the sequence SEQ ID No. 21 (hect25);
  • nucleic acids also form part of the invention: a) a nucleic acid coding for a polypeptide having an amino acid sequence chosen from the group of sequences SEQ
  • nucleic acid comprising a polynucleotide chosen from the sequences SEQ ID No. 12 to SEQ ID No. 22, or a fragment or a variant thereof; c) a nucleic acid having at least 95% nucleotide identity with a nucleic acid chosen from the group consisting of sequences SEQ ID No. 12 to SEQ ID No. 22 or a fragment or a variant thereof; d) a nucleic acid hybridizing, under high stringency hybridization conditions, with a nucleic acid of sequences SEQ ID No. 12 to SEQ ID No. 22, or a fragment or a variant thereof.
  • the invention also relates to a polypeptide comprising the HECT domain of a HECT domain polypeptide as defined above. It also relates to a polypeptide consisting of the HECT domain of a polypeptide according to the invention.
  • polypeptide comprising or consisting of an amino acid sequence chosen from the following sequences: a) the sequence going from the amino acid in position 1248 to the amino acid in position 1585 SEQ ID NO: 1; b) the sequence extending from amino acid at position 1259 to amino acid at position 1624 of the sequence SEQ ID No. 2; c) the sequence extending from the amino acid in position 230 to the amino acid in position 567 of the sequence SEQ ID No. 3; d) the sequence going from the amino acid at position 1153 to the amino acid at position 1620 of the sequence SEQ ID No.
  • a person skilled in the art can, for example, carry out an enzymatic digestion of the nucleic acid coding for the polypeptide considered using the flanking restriction sites, for example according to the technique described by MRGOTTIN et al. (Margottin F. et al., 1998, Molecular cell, 1: 565-574).
  • nucleic acids encoding a HECT domain polypeptide as defined above can be easily obtained by a person skilled in the art, for example from a sample of human DNA or also from from a human DNA library, using primers specific for one of the sequences SEQ ID No. 12 to SEQ ID No. 22, for example by PCR amplification.
  • a variant of a polypeptide with an HECT domain according to the invention in which the HECT domain has been completely or partially deleted, or mutated can be sought in the case where it is desired to obtain a reduction or a blocking of the degradation of the specific substrate.
  • Such a variant of a HECT domain polypeptide according to the invention can retain its capacity to interact specifically with the substrate, but is no longer capable of ubiquitinating this substrate.
  • the invention therefore also relates to a nucleic acid coding for a variant of a polypeptide with an HECT domain as defined above, in the sequence of which all or part of the sequence of the HECT domain has been deleted .
  • partial deletion of the HECT domain is meant the deletion of at least 2, preferably at least 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 , 26, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340 or 350 consecutive amino acids of the sequence of the HECT domain of a polypeptide according to the invention, the length of the deletion being limited by the length in amino acids of an HECT domain in each of the HECT domain polypeptides according to the invention.
  • the nucleic acid coding for a variant of a HECT domain polypeptide in the sequence of which the sequence of the HECT domain has been completely or partially deleted is chosen from the following nucleic acids: a) a polypeptide comprising the sequence SEQ ID No. 12 in which the sequence from the amino acid in position 1248 to the amino acid in position 1585 of the sequence SEQ ID No. 12 has been totally or partially deleted; b) a polypeptide comprising the sequence SEQ ID No. 13 in which the sequence ranging from the amino acid in position 1259 to the amino acid in position 1624 of the sequence SEQ ID No. 13; c) a polypeptide comprising the sequence SEQ ID No.
  • sequence SEQ ID No. 14 in which the sequence extending from the amino acid in position 230 to the amino acid in position 567 of the sequence SEQ ID No. 14 has been totally or partially deleted; d) a polypeptide comprising the sequence SEQ ID No. 15 in which the sequence from the amino acid at position 1153 to the amino acid at position 1620 of the sequence SEQ ID No. 15 has been totally or partially deleted; e) a polypeptide comprising the sequence SEQ ID No. 16 in which the sequence from amino acid at position 742 to amino acid at position 1083 of sequence SEQ ID No. 16 has been totally or partially deleted; f) a polypeptide comprising the sequence SEQ ID No. 17 in which the sequence from the amino acid at position 481 to the amino acid at position 823 of the sequence SEQ ID No.
  • this nucleic acid is characterized in that it codes for a polypeptide with an HECT domain, or a variant or a fragment of this polypeptide, which is fused with a polypeptide heterologous.
  • heterologous polypeptide is meant an amino acid sequence which is not naturally expressed by the cell in a form chemically linked to a polypeptide with an HECT domain as defined above.
  • the heterologous polypeptide consists of a polypeptide capable of binding selectively to a support, such as glutathione S transferase or GST, bine known to those skilled in the art.
  • the heterologous polypeptide consists of a detectable polypeptide, for example a fluorescent polypeptide such as the GFP and YFP proteins, well known to those skilled in the art.
  • the heterologous polypeptide consists of a fluorescence acceptor or donor polypeptide usable in systems for detecting interactions by fluorescence energy transfer (or FRET for “Fluorescence Resonance Energy Transfer”).
  • the heterologous polypeptide consists of a first protein partner which, when it interacts specifically with a second protein partner, has the capacity to bind to a nucleic acid motif regulating the transcription of a reporter gene.
  • a polypeptide can be, for example, the GAL4 protein or the LexA protein.
  • this nucleic acid comprises a regulatory polynucleotide controlling the expression of the HECT domain polypeptide or of its fragment or variant, optionally fused to a heterologous polypeptide, in a host cell.
  • Illustrative examples of preferred regulatory polynucleotides according to the invention are listed below in the descriptive part of the preferred recombinant vectors.
  • nucleic acid whose sequence is complementary to one of the nucleic acids as defined in the present description.
  • nucleic acid according to the invention can be inserted into a vector for cloning purposes or for expression purposes.
  • the invention also relates to a recombinant vector comprising a nucleic acid coding for a HECT domain polypeptide, a fragment or a variant of this polypeptide, optionally fused with a heterologous polypeptide and for which said nucleic acid has been artificially inserted into the vector.
  • a recombinant vector will comprise a nucleic acid chosen from the following nucleic acids: a) a nucleic acid coding for a polypeptide having an amino acid sequence chosen from the group of sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No.
  • nucleic acid comprising a polynucleotide chosen from the sequences SEQ ID No. 12 to SEQ ID No. 22, or a fragment or variant thereof c) a nucleic acid having at least 95% identity in nucleotides with a nucleic acid chosen from the group consisting of sequences SEQ ID No. 12 to SEQ ID No. 22 or a fragment or a variant thereof; d) a nucleic acid hybridizing, under high stringency hybridization conditions, with a nucleic acid of sequences SEQ ID No. 12 to SEQ ID No. 22, or a fragment or a variant thereof.
  • vector within the meaning of the present invention is meant a circular or linear DNA or RNA molecule which is either in the form of single strand or double strand.
  • a recombinant vector according to the invention is used in order to amplify the nucleic acid which is inserted therein after transformation or transfection of the desired cellular host.
  • these are expression vectors comprising, in addition to a nucleic acid according to the invention, regulatory sequences making it possible to direct their transcription and / or translation.
  • a recombinant vector according to the invention will notably comprise the following elements:
  • elements for regulating the expression of the nucleic acid to be inserted such as promoters and enhancers;
  • the recombinant vectors according to the invention may include one or more origins of replication in cellular hosts in which their amplification or expression is sought, markers or selection markers.
  • the bacterial promoters may be the Lad, LacZ promoters, the promoters of the RNA polymerase of bacteriophage T3 or T7, the PR or PL promoters of phage lambda.
  • Promoters for eukaryotic cells will include the HSV virus thymidine kinase promoter or the mouse metallothionein-L promoter.
  • the preferred bacterial vectors according to the invention are for example the vectors pBR322 (ATCC37017) or also vectors such as pAA223-3 (Pharmacia, Uppsala, Sweden), and pGEMI (Promega Biotech, Madison. WI, UNITED STATES).
  • baculovirus type vectors such as the vector pVL1392 / 1393 (Pharmingen) used to transfect cells of the Sf9 line (ATCC No. CRL 1711) derived from Spodoptera frugiperda.
  • adenoviral vectors such as human adenovirus type 2 or 5.
  • a recombinant vector according to the invention can also be a retroviral vector or also an adeno-associated vector (AAV).
  • AAV adeno-associated vector
  • Such adeno-associated vectors are for example described by FLOTTE et al.
  • the invention also relates to a recombinant host cell which has been artificially transfected or transformed by a nucleic acid or by a recombinant vector as defined above.
  • a recombinant host cell according to the invention is a eukaryotic cell, and very preferably a recombinant human host cell.
  • the preferred host cells according to the invention are for example the following: a) prokaryotic host cells: strains E'Escherichia coli (strain DH5- ⁇ ), of Bacillus subtilis, of Salmonella typhimurium, or also strains of species such as Pseudomonas , Streptomyces and Staphylococus; b) eukaryotic host cells: HeLa cells (ATCC No. CCL2), Cv 1 cells (ATCC No. CCL70), COS cells (ATCC No. CRL 1650), Sf-9 cells (ATCC No. CRL 1711), CHO cells ( ATCC N ° CCL-61) or 3T3 cells (ATCC NXRL-6361).
  • prokaryotic host cells strains E'Escherichia coli (strain DH5- ⁇ ), of Bacillus subtilis, of Salmonella typhimurium, or also strains of species such as Pseudomonas , Streptomyces and Staphyloc
  • the invention relates to a polypeptide comprising an amino acid sequence chosen from the group consisting of peptides of sequences SEQ ID N c 1 to SEQ ID No 11, or a fragment or a variant of this polypeptide, optionally fused with a heterologous polypeptide .
  • the invention relates to a polypeptide with an HECT domain, a fragment or a variant of this polypeptide, optionally fused with a heterologous polypeptide, characterized in that it is encoded by a nucleic acid as defined in the present description.
  • the invention also relates to a polypeptide comprising at least
  • the invention also relates to a polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 95% amino acid identity with an amino acid sequence chosen from the group consisting of peptides of sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID N ° 11, or a fragment or variant of this polypeptide.
  • polypeptides according to the present invention are in an isolated or purified form.
  • the invention also relates to a polypeptide comprising amino acid modifications of 1, 2, 3, 4, 5, 10 to 20 substitutions, additions or deletions of an amino acid with respect to the amino acid sequence of a polypeptide of sequences SEQ ID N ° 1 to SEQ ID
  • the invention also relates to a process for the production of one of the polypeptides of sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 11 or a peptide fragment or a variant thereof, said method comprising the steps of: a) inserting a nucleic acid encoding said polypeptide into an appropriate vector; b) cultivating, in an appropriate culture medium, a host cell previously transformed or transfected with the recombinant vector of step a); c) recovering the conditioned culture medium or lysing the host cell, for example by sonication or by osmotic shock; d) separating and purifying from said culture medium or also from the cell lysates obtained in step c), said polypeptide; e) where appropriate, characterize the recombinant polypeptide produced.
  • the peptides according to the invention can be characterized by attachment to an immunoaffinity chromatography column on which the antibodies directed against this polypeptide or against a fragment or a variant of the latter have been immobilized beforehand.
  • a recombinant polypeptide according to the invention can be purified by passage through an appropriate series of chromatography columns, according to methods known to those skilled in the art.
  • a polypeptide according to the invention can also be prepared by conventional techniques of chemical synthesis either in homogeneous solution or solid phase.
  • a polypeptide according to the invention can be prepared by the technique or in a homogeneous solution described by HOUBEN WEYL (1974) or also the solid phase synthesis technique described by MERRIFIELD (1965a; 1965b).
  • polypeptides called “homologous” to any of the polypeptides of amino acid sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 11, or their fragments or variants.
  • Such homologous polypeptides have amino acid sequences having one or more substitutions of an amino acid with an equivalent amino acid, relative to the reference polypeptides.
  • the equivalent amino acid according to the present invention will be understood, for example replacement of a residue in the L form with a residue in the D form or alternatively the replacement of a glutamic acid (E) by a pyro-glutamic acid according to techniques well known to those skilled in the art.
  • E glutamic acid
  • two amino acids belonging to the same class are also considered to be equivalent amino acids, that is to say two amino acids, basic, non-polar or even uncharged polar.
  • polypeptides comprising at least one non-peptide bond such as a retro-inverso bond (NHCO), a carba bond (CH 2 CH 2 ) or even a ketomethylene bond (CO-CH 2 ).
  • NHCO retro-inverso bond
  • carba bond CH 2 CH 2
  • CO-CH 2 ketomethylene bond
  • the polypeptides according to the invention comprising one or more additions, deletions, substitutions of at least one amino acid will retain their capacity to be recognized by antibodies directed against the unmodified polypeptides.
  • polypeptides will also retain their ability to recognize their specific substrate and / or potential partners with which they bind.
  • polypeptides according to the invention in particular the polypeptides of amino acid sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 11 or the fragments and variants thereof as well as the homologous peptides can be used for the preparation of antibodies .
  • antibody within the meaning of the present invention, is meant in particular polyclonal or monoclonal antibodies or fragments (for example fragments F (ab) ' 2 , Fab) or any polypeptide comprising a domain of the initial antibody recognizing the polypeptide or the target polypeptide fragment according to the invention.
  • Monoclonal antibodies can be prepared from hybridomas using the technique described by KOHLER and MILSTEIN (1975).
  • the present invention also relates to antibodies directed against a polypeptide as described above or a fragment or a variant thereof, as produced in the trioma technique or also the hybridoma technique described by KOZBOR et al. (1983).
  • the invention also relates to fragments of single chain Fv antibody (ScFv) as described in US Patent No. 4,946,778 or by MARTINEAU et al. (1998).
  • the antibodies according to the invention also include fragments of antibodies obtained using phage banks RIDDER et al., (1995) or even humanized antibodies REIMANN et al. (1997); LEGER et al., (1997).
  • the antibody preparations according to the invention are useful in immunological detection tests intended to identify the presence and / or the quantity of antigens present in a sample.
  • An antibody according to the invention may also comprise an detectable isotopic or non-isotopic marker, for example fluorescent or also be coupled to a molecule such as biotin, according to techniques well known to those skilled in the art.
  • an detectable isotopic or non-isotopic marker for example fluorescent or also be coupled to a molecule such as biotin, according to techniques well known to those skilled in the art.
  • the subject of the mention is furthermore a method for detecting the presence of a polypeptide in accordance with the invention in a sample, said method comprising the steps of: described above; b) detecting the antigen / antibody complex formed.
  • the invention also relates to a kit or kit for diagnosis or for the detection of the presence of a polypeptide according to the invention in a sample, said kit comprising: a) an antibody as defined above; b) a reagent allowing the detection of the antigen / antibody complexes formed.
  • nucleic acid fragments derived from any of the nucleotide sequences SEQ ID No. 12 to SEQ ID No. 22 are useful for detecting the presence of at least one copy of a nucleotide sequence chosen from the sequences SEQ ID No. 12 to SEQ ID No. 22 or a fragment or a variant thereof in a sample.
  • the nucleotide probes or primers according to the invention comprise at least eight consecutive nucleotides of a nucleic acid chosen from the group consisting of sequences SEQ ID No. 12 to SEQ ID No. 22, or of a nucleic acid of complementary sequence.
  • nucleotide probes or primers according to the invention will have a length of 10, 12, 15, 18 or 20 to 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 200, 500, 1000, 1500 consecutive nucleotides d a nucleic acid according to the invention, in particular a nucleic acid of nucleotide sequence chosen from the sequences SEQ ID No. 12 to SEQ ID No. 22 or of a nucleic acid of complementary sequence.
  • a probe or a nucleotide primer according to the invention will consist and / or include fragments with a length of 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 100, 200, 500, 1000, 1500 nucleotides consecutive of a nucleic acid according to the invention, more particularly of a nucleic acid chosen from the sequences SEQ ID No. 12 to SEQ ID No. 22, or of a nucleic acid of complementary sequence.
  • the definition of a probe and of a nucleotide primer according to the invention therefore includes oligonucleotides which hybridize, under the conditions of high stringency hybridization defined above, with a nucleic acid chosen from the sequences SEQ ID No. 12 to SEQ ID No. 22 or with a sequence complementary to these.
  • a primer or a nucleotide probe according to the invention can be prepared by any suitable method well known to those skilled in the art, including by cloning and action of restriction enzymes or also by direct chemical synthesis according to techniques such as the method to the phosphodiester of NARANG et al. (1979) or BROWN et al. (1979), the diethylphosphoramidite method of BEAUCAGE et al. (1980) or still the technique on solid support described in patent EU N ⁇ P 0
  • Each of the nucleic acids according to the invention can be labeled, if desired, by incorporating a label detectable by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or even chemical means.
  • markers can consist of radioactive isotopes ( 32 P, 33 P,, 3 H, 35 S,), fluorescent molecules (5-bromodeoxyuridine, fluorescein, acetylaminofluorene, digoxigenin) or also ligands such as biotin .
  • the labeling of the probes is preferably done by incorporation of labeled molecules within the polynucleotides by extension of primers, or else by addition on the 5 ′ or 3 ′ ends.
  • the oligonucleotide probes according to the invention can be used in particular in hybridizations of Southern type with genomic DNA or in hybridizations with the corresponding messenger RNA when the expression of the corresponding transcript is sought in a sample.
  • the probes according to the invention can also be used for the detection of PCR amplification products or even for the detection of mismatches.
  • Nucleotide probes or primers according to the invention can be immobilized on a solid support.
  • solid supports are well known to those skilled in the art and include surfaces of the wells of microtiter plates, polystyrene beds, magnetic beds, nitrocellulose strips, or even microparticles such as latex particles.
  • the present invention also relates to a method for detecting the presence of a nucleic acid as described above in a sample, said method comprising the steps of:
  • the oligonucleotide probe (s) are immobilized on a support.
  • the oligonucleotide probes include a detectable marker.
  • the invention further relates to a kit or kit for detecting the presence of a nucleic acid according to the invention in a sample, said kit comprising: a) one or more nucleotide probes as described above; b) where appropriate, the reagents necessary for the hybridization reaction.
  • the detection kit or kit is characterized in that the probe or probes are immobilized on a support.
  • the detection kit or kit is characterized in that the oligonucleotide probes comprise a detectable marker.
  • such a kit will comprise a plurality of oligonucleotide probes in accordance with the invention which can be used to detect target sequences of interest or alternatively to detect mutations in the coding regions or the non-coding regions of the nucleic acids according to the invention, more particularly nucleic acids of sequences SEQ ID No. 12 to SEQ ID No. 22 or the nucleic acids of complementary sequence.
  • the probes according to the invention immobilized on a support can be ordered in matrices such as "DNA chips".
  • matrices such as "DNA chips”.
  • nucleotide primers according to the invention can be used to amplify any of the nucleic acids according to the invention, and more particularly all or part of a nucleic acid of sequences SEQ ID No. 12 to SEQ ID No. 22, or again a variant of it.
  • Another subject of the invention relates to a method for the amplification of a nucleic acid according to the invention, and more particularly a nucleic acid of sequences SEQ ID No. 12 to SEQ ID No.
  • said method comprising the steps of: a) bringing the sample into contact in which the presence of the target nucleic acid is suspected with a pair of nucleotide primers whose hybridization position is localized respectively on the 5 ′ side and on the 3 ′ side of the region of the target nucleic acid whose amplification is sought, in the presence of the reagents necessary for the amplification reaction; and b) detection of the amplified nucleic acids.
  • the subject of the invention is also a kit or kit for the amplification of a nucleic acid according to the invention, and more particularly all or part of a nucleic acid of sequences SEQ ID No. 12 to SEQ ID No. 22 , said kit or kit comprising: a) a pair of nucleotide primers in accordance with the invention, the hybridization position of which is located respectively on the 5 ′ side and on the 3 ′ side of the target nucleic acid, the amplification of which is sought; b) where appropriate, the reagents necessary for the amplification reaction.
  • Such an amplification kit or kit will advantageously comprise at least one pair of nucleotide primers as described above. Screening processes
  • the invention also relates to methods of screening for candidate compounds interacting with a HECT domain polypeptide as defined in the present description.
  • the first step towards using proteins from the HECT domain as a therapeutic target is the identification of the substrates targeted for degradation by these components.
  • the identification and characterization of these targets can in particular provide essential information on the biological mechanisms in which they intervene.
  • the methods for identifying the polypeptides which interact with the HECT domain proteins of the present invention are varied and include the double hybrid experiments in yeast as well as the phage display methods; these methods have the advantage that the nucleic sequence coding for the interacting peptides is identified simultaneously, unlike other more biochemical methods which require protein sequencing.
  • the double hybrid in yeast can be used to screen a mammalian (human) cDNA expression library, where a cDNA is fused to the DNA binding domain or the activator domain of GAL4, and nucleic acid encoding the peptide of interest, like the target protein, is also fused either to the activator domain or to the DNA binding domain of GAL4 respectively (Gyuris et al., 1993).
  • the double hybrid was developed to detect specific protein-protein interactions.
  • One aspect of the present invention is to use a protein to detect interactants.
  • This protein which can be an HECT domain protein (truncated or not), is used as bait to identify one or more potential target substrates.
  • target substrates of interest can be used to identify the ubiquitin ligase or the ubiquitin ligase complex responsible for its degradation.
  • the target polypeptide (s) can also be identified by "phage display” technology.
  • a phage display bank is a protein expression library constructed in a phage type vector which expresses a collection of cloned protein sequences in fusion with a protein of the phage wall. This particular construction allows expression of the fusion protein outside of the phage particle. This arrangement therefore promotes interaction between the recombinant protein exposed at the level of the wall and an immobilized ligand protein.
  • the HECT domain protein is for example immobilized on a solid matrix and a solution containing the phages is passed over this support. The phages selected and the nature of the protein they express are then analyzed.
  • the target partners of a protein with an HECT domain can also be identified in the following manner.
  • a peptide corresponding to a protein with an HECT domain concerned by the present invention which has undergone or not post-translational modifications is immobilized on a resin, for example an activated resin NHS-sepharose® (pharmacia).
  • a cell lysate, for example of HELA cells or other suitable cells is fractionated on the affinity column prepared according to a standard method. After washing, the proteins retained on the column are eluted by increasing the ionic strength of the washes or by competitive elution with peptides representing the HECT domain in part or in whole.
  • the cellular proteins are then identified by one or other of the combinations of techniques mentioned below: fractionation on SDS PAGE gel, whether or not followed by a western-blot, once purified from the gel and optionally partially hydrolyzed, the proteins may be further characterized using peptide micro-sequencing or MALDI-TOF analysis.
  • the invention also relates to a method for screening candidate compounds binding to a HECT domain polypeptide, characterized in that it comprises the following steps: a) bringing a HECT domain polypeptide into contact as defined above with at least one candidate compound to be tested; b) detecting the complexes possibly formed between said polypeptide and the candidate compound (s).
  • the above screening method can further be characterized in that it comprises the following additional step: c) characterizing the candidate compound (s) having formed a complex with the HECT domain polypeptide.
  • the HECT domain polypeptide is immobilized beforehand on a support.
  • the candidate compound (s) are initially contained in the cell lysate of a culture of eukaryotic cells, preferably human cells.
  • the candidate compound is the expression product of a phage constituting a combinatorial collection of phage clones ("phage display").
  • the invention also relates to a method for screening candidate compounds binding to a polypeptide with an HECT domain, characterized in that it comprises the following steps: a) cultivating a recombinant host cell as defined above in a medium appropriate culture, so that said host cell produces an HECT domain polypeptide according to the invention; b) detecting the complexes possibly formed between the HECT domain polypeptide and other compounds produced by the host cell.
  • said method is characterized in that it is a double-hybrid system in which the host cell transfected in step a) is transfected with an acid nucleic acid coding for an HECT domain polypeptide, a fragment or a variant of this polypeptide which is fused with a heterologous polypeptide, said heterologous polypeptide consisting of a first protein partner which, when it interacts specifically with a second protein partner, has the capacity to bind to a nucleic acid motif regulating the transcription of a reporter gene, for use in systems for detecting interactions of the “double-hybrid” type well known to those skilled in the art job.
  • a polypeptide can be, for example, the GAL4 protein or the LexA protein.
  • the recombinant host cell is also co-transfected with a nucleic acid encoding the candidate compound in a form fused with the second protein partner mentioned above.
  • the interaction between the HECT domain polypeptide, or its fragment or its variant, and the candidate compound is detected by visualization of the activation or on the contrary of the inhibition of the reporter gene also contained in the recombinant host cell. co-transfected.
  • the invention also relates to a compound binding to a polypeptide with an HECT domain as described above, characterized in that it is capable of being obtained by one of the screening methods above.
  • the invention also relates to methods for screening for compounds modulating the interaction between a HECT domain polypeptide and a specific target protein, or alternatively between a HECT domain polypeptide and one or more possible protein partners.
  • the present invention provides methods for identifying drugs that are either agonists or antagonists of normal cellular function of HECT domain proteins, or of the role of HECT domain proteins in the pathogenesis of normal cell proliferation and / or differentiation or abnormal caused by the ubiquitination of a protein by a process dependent on a protein with an HECT domain.
  • the tests assess the ability of a compound to modulate the association and / or ubiquitination of a target protein (cellular or viral) by a protein with an HECT domain.
  • modulators can be used for example in the treatment of proliferative disorders or differentials, to modulate apoptosis and in the treatment of viral infections.
  • Methodologies which allow the ubiquitination of a target protein by a pathway dependent on HECT domain proteins include acellular systems, using for example purified proteins or lysates, as well as cellular systems using intact cells (mammalian cells, human, insect or yeast). Single binding experiments can also be used to detect agents that prevent ubiquitination by binding, for example, to the substrate or to the HECT domain protein.
  • the agents tested to be inhibitors can be produced by bacteria, yeasts or other organisms (natural products) or chemically produced (small nucleic or chemical molecules). In many drug screening programs that test compound banks, high throughput assays are preferred in order to maximize the number of compounds tested in the same experiment.
  • These methods can be used to identify compounds capable of interacting with a HECT domain protein or one of its partners to modify the activity of the HECT domain protein or of its partner.
  • a compound can for example modify the structure of a protein with an HECT domain or of its partner and therefore affect its activity.
  • These tests can also be used to identify compounds which modulate the interaction of the HECT domain protein and a partner of this protein.
  • Such a system has been used to reconstruct, for example, the polyubiquitination of the p53 protein by E6-AP (Yabuki, N. et al., 1999).
  • These tests essentially consist of a reaction mixture comprising the HECT domain protein, the compound to be tested or a library of compounds in the presence or absence of the binding partner.
  • the compounds tested can be a derivative of the HECT domain protein partner, for example an inactive target peptide, or a small chemical or nucleic molecule (aptamers).
  • An example of screening of this invention could consist in detecting the formation of a complex between a protein with HECT domain of the invention and one of its partners in the presence of a compound or of a library of compounds.
  • the molecule can be labeled with a specific marker, and the compound (s) with a different marker.
  • the interaction of the compound with the HECT domain protein or the HECT domain protein partner can be detected by determining the level of the two labels after an incubation and washing step. If the two markings are present this means that there has been interaction.
  • An interaction between two molecules can also be determined using real-time biomolecular interaction analysis (BIA) which detects surface plasmon resonance, an optical phenomenon. Detection depends on changes in the mass concentration of macromolecules on the interface, and does not require any prior labeling.
  • a bank of test compounds can be immobilized on a sensitive surface. A solution containing the HECT domain protein or a partner of this protein is then poured continuously onto this surface. A change in the detectable resonance angle by recording the signals indicates that an interaction has occurred. This technique is described in the BIAtechnology book by Pharmacia.
  • Another example of a screening experiment of the present invention includes the steps of: (a) carrying out a reaction mixture comprising, a protein with HECT domain, a partner for this protein, and a compound to be tested; (b) detecting the interaction between the HECT domain protein and its partner.
  • This HECT domain protein and its partner can be produced by recombinant technology, be purified or chemically synthesized.
  • a significant statistical change (activation or inhibition) in the interaction of the HECT domain protein and its partner in the presence of a compound indicates a potential agonist (mimetic or activator) or antagonist (inhibitor).
  • the effectiveness of the compound can be tested by performing dose-response studies using different concentrations of the compound.
  • the formation of a complex between an HECT domain protein and its partner can be detected by a variety of techniques.
  • the modulation of the formation of the complexes can be quantified using for example labeled proteins detectable by means of radiolabelling, fluorescent or enzymatic labeling.
  • the connection can be carried out in microtitration plates, test tubes, microtubes, any dish making it possible to contain the different reagents.
  • a fusion protein can be produced which allows the protein to bind to a matrix.
  • HECT / GST (glutathione S transferase) fusion proteins can be adsorbed on sepharose beads which are then placed in the presence of the 35 S labeled partner and the test compound.
  • This mixture is incubated under conditions favorable to the formation of the complex, physiological conditions in terms of salt and pH for example. After this incubation, the beads are washed to remove any unbound material, the matrix immobilized and the radioactivity determined directly (the beads are placed in scintillation liquid for example), or in the supernatant after dissociation of the complexes.
  • the complexes can also be dissociated from the matrix, separated by an SDS-PAGE type electrophoresis, and the level of HECT or partner domain protein found in the bead fraction quantified on gel using standard electrophoresis techniques.
  • the interaction between two molecules can also be determined using the FRET (Fluorescence resonance energy transfer) technique.
  • FRET Fluorescence resonance energy transfer
  • the principle is based on the fact that the energy transfer which occurs between two fluorophores when they are close ( ⁇ 10nm), and that the emission spectrum of the first fluorophore (the donor) covers the excitation spectrum of the second (the acceptor).
  • a close association between two adapted fluorophores and the excitation of the donor therefore results in an increase in the fluorescence of the acceptor and / or a decrease donor fluorescence by FRET (Herman, 1989).
  • This technique can in particular be applied to the study of the interaction between HECT domain proteins and their substrates and be used to identify inhibitors or activators of the interaction. Since FRET is a non-destructive spectroscopic method for measuring molecular interactions, it can be performed on living cells.
  • the invention therefore also relates to a method for screening for compounds modulating the interaction between a polypeptide with an HECT domain and a partner, comprising the following steps: a) bringing a polypeptide with an HECT domain as defined above into contact above, a partner protein and the candidate compound to be tested; b) detecting the complexes possibly formed between the HECT domain polypeptide and the partner protein.
  • the invention also provides cellular experimental methods for identifying agonist or antagonist agents modulating the activity of HECT domain proteins.
  • the effect of a compound on the expression of a gene encoding an HECT domain protein can be determined by transfection experiments using a reporter gene.
  • This reporter gene can be any gene encoding a quantifiable protein, for example luciferase or the CAT gene. The level of expression of this reporter gene is then determined in the presence or absence of the compound.
  • Cell tests which can be used to detect inhibitors of ubiquitin ligase activities have already been described which use proteins fused to GFP as substrates (Dantuma, N., 2000).
  • yeast yeast e.g., yeast e.g., yeast e.g., yeast e.g., yeast e.g., yeast e.g., yeast e.g., yeast e.g., yeast e.g., yeast e.g., yeast e.g., yeast e.g., yeast e.g., yeast e.g., yeast e.g., yeast e.g., 1993
  • natural peptides for example from an expression library cDNA
  • synthetic from a random reading frame expression library
  • This interacting polypeptide can then be used to detect an increase or decrease in its interaction with the HECT domain protein, thus allowing the identification of agonists or antagonists.
  • the conjugation system can be performed in whole cells, taking advantage of cell culture techniques.
  • the conjugation system can be formed in a cultured eukaryotic cell system, including mammalian and yeast cells.
  • the advantages of carrying out the experiment in an intact cell include the possibility of detecting inhibitors which are functional in an environment closer to that which the therapeutic use of the inhibitor will require, including the agent's ability to enter the cell.
  • some of the in vivo experiments are compatible with large-scale analysis, as indicated below.
  • the components of the ubiquitin conjugation system can be endogenous to the cell selected to perform the experiment. Otherwise, some or all of the components may come from exogenous sources.
  • fusion proteins can be introduced into the cell by recombinant techniques (such as the use of an expression vector), or by microinjecting into the cell the fusion protein itself or the mRNA encoding it. protein.
  • the cell is only manipulated after incubation with a candidate inhibitor in order to facilitate the detection of ubiquitination or the degradation of the target.
  • the effectiveness of the inhibitor candidate is evaluated by measuring direct characteristics of the target protein, such as the change in molecular weight by electrophoretic methods, or by detection in a binding test.
  • the cell must be lysed at the end of the incubation with the candidate agent, and the lysate manipulated in a detection step in the same manner as above.
  • the use of a reporter gene may also prove to be judicious.
  • a reporter gene includes any gene that expresses a detectable product, in the form of RNA or protein.
  • the preferred reporter genes are those that are directly detectable. This reporter gene can be included in a construct in the form of a fusion gene with the target protein of interest.
  • reporter genes include the CAT (chloramphenicol acetyl transferase) gene (Alton and Vapnek, 1979), luciferase, and other enzyme detection systems such as beta-galactosidase, bacterial luciferase, alkaline phosphatase, etc.
  • the product of the reporter gene is detected by an intrinsic activity associated with this product, for example, the reporter gene can encode the product of a gene with activity detectable by color, fluorescence, or luminescence.
  • the level of expression of the reporter gene is then compared to the level of expression in the same cell in the absence of the test compound. The slightest statistical or other difference indicates that the compound has somehow altered the activity of the ligase.
  • the subject of the invention is also a method for screening for compounds modulating the interaction between a HECT domain polypeptide and a partner protein, comprising the following steps: a) co-transfect or co-transform a recombinant host cell according to one claims 11 or 12 with a vector encoding a partner protein in a double-hybrid system; b) incubating the host cell obtained in step a) with the candidate compound to be tested; c) detecting modifications in the interaction between the HECT domain polypeptide and the partner protein.
  • the invention also relates to a compound modulating the interaction between a HECT domain polypeptide as defined above and a partner protein, characterized in that it is capable of being obtained according to the screening method above .
  • the invention therefore provides means for stabilizing the target of an ubiquitin ligase in vivo by preventing its ubiquitination and therefore its degradation. In other words, these inhibitors prevent the interaction of ubiquitin ligase with a target polypeptide.
  • the inhibitor is a small molecule.
  • the mechanism of inhibition can be competitive or non-competitive, and the target polypeptide can be a cellular protein, a protein encoded by a pathogenic organism.
  • Effective competitive inhibitors can, for example, prevent the interaction between ubiquitin ligase and the target protein.
  • Non-competitive inhibitors may include, for example, compounds which bind to a region of the target polypeptide other than the region of interaction with ubiquitin ligase and alter the structure of the region of interaction.
  • Such allosteric non-competitors have certain advantages, they can in particular provide a very high degree of specificity of inhibition because they will not be able to bind to other targets of ubiquitin ligase.
  • ubiquitin ligase inhibitors can mimic the polypeptide structure of the ubiquitin ligase or target interaction region. Such inhibitors prevent the ubiquitin ligase from recruiting the target polypeptide. Depending on the structure of the inhibitor, the inhibition of recruitment can be very specific for the target or affect the recruitment of other polypeptides which are the target of the same ubiquitin ligase. For example, specific inhibitors can mimic the WW structure of the polypeptide sequence that interacts with the target protein. These competitive inhibitors of WW repeats bind to the target protein, thereby preventing its interaction with the WW repeats of a HECT domain protein.
  • the molecules sought will be molecules capable of inhibiting or activating the ubiquitin ligase activity with respect to its substrates thanks in particular to functional tests making it possible to visualize this ubiquitin ligase activity in vivo or in vitro.
  • HECT domain proteins their derivatives and their modulators
  • compounds or methods which increase the activity of a HECT domain protein can be used in the treatment of proliferative disorders.
  • Symptoms of cancer could be alleviated by the use of a compound that stimulates the activity of a HECT domain protein.
  • a decrease in the activity or expression of a protein with an HECT domain whose substrate is a positive regulator of the cell cycle, like a member of the cyclin family will result in an increase in cell proliferation.
  • an increase in the level of expression or activity of the HECT domain protein could allow the symptoms to be improved.
  • an HECT domain protein can be used in therapy to improve symptoms of a proliferative disease.
  • a protein with an HECT domain normally responsible for the degradation of a cell cycle inhibitor becomes too active following a mutation, the use of a drug which limits its activity could prove useful in limiting certain symptoms. of the disease and in particular cell proliferation.
  • the expression of a so-called " ⁇ HECT” mutant of the protein with an HECT domain is also a strategy of choice for blocking the degradation of the substrate.
  • a “ ⁇ HECT” mutant is a derivative of the HECT domain protein no longer comprising the HECT motif which has been deleted.
  • Such a derivative is capable of interacting with the substrate but is no longer able to ubiquitinate it.
  • the overproduction of the mutant " ⁇ HECT” prevents ubiquitination and the concomitant degradation of this substrate.
  • stabilization by protection (or by "trapping").
  • the therapeutic agents modulating the activity of proteins with an HECT domain may be nucleic acids. They can act either of themselves such as for example aptamers modulating an interaction, even via the protein which they encode such as for example sequences coding for a peptide serving as a competitive inhibitor. They may also be non-natural nucleic acids comprising modified nucleotides. In all cases, they must be brought into the cell by an appropriate vector, the nature of which will depend on the progress of vectorization techniques. They may, for example, be vectors for viral or bacterial expression and penetration, colloidal dispersion system or liposomes. In the case of nucleic acids to be expressed, they must include, in addition to the coding sequence, all the sequences allowing expression in the target host cells.
  • Viral vectors which can be used to introduce a nucleic acid sequence into a patient's target cells include, but are not limited to, vaccinia, herpes or retrovirus or adenovirus derivatives . In all cases, the vectors used will be defective, that is to say non-pathogenic.
  • the other means of introducing the nucleic acids into the patient's cells are the colloidal dispersion systems. These include macromolecular complexes, nanocapsules, microspheres, beads, systems involving emulsions of lipids in water, micelles, and liposomes.
  • the nucleic acids are encapsulated in an artificial membrane vesicle. Introduced into the body, the liposomes fuse with the patient's targets and thus deliver the nucleic acids. Preferably these liposomes will preferentially merge with specific cells.
  • the invention covers transgenic plants or animals containing one or more of the HECT domain proteins presented here. These transgenic organisms can be obtained using the nucleic acid sequence of the invention. These transgenic organisms can be used to express a whole or truncated HECT domain protein, or to inactivate a HECT domain protein (knockout). These latter organisms (foreign mice for example), mutants for a protein with an HECT domain, can in particular be used for the search for drugs which attenuate or suppress the effects of the absence of the protein.
  • Knockout mice are obtained by homologous integration of a construct in a mouse embryonic stem cell (ES cell), a construct which codes for the gene to be inactivated.
  • the construction sequence is modified and ideally allows the joint integration of a positive selection marker (a gene for resistance to neomycin for example) at the locus of the gene to be inactivated.
  • a positive selection marker a gene for resistance to neomycin for example
  • the invention further relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of a nucleic acid according to the invention or of a recombinant vector as defined above, in association with one or more physiologically compatible excipients.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising an effective amount of an HECT domain polypeptide, a fragment or a variant of this polypeptide, in association with one or more physiologically compatible excipients.
  • HECT domain proteins Cell cycle regulators are often the products of oncogenes or tumor suppressors. HECT domain proteins, as ubiquitin ligases, could therefore be the products of oncogenes or tumor suppressor genes, depending on the cell cycle regulatory proteins, the abundance of which they regulate. HECT-domain proteins, its analogs, derivatives and consequently the nucleic sequences of HECT-domain proteins, or anti-HECT-domain antibodies can therefore be useful in diagnostics.
  • the nucleic acid sequences of the new HECT domain proteins can be used to detect, predict or diagnose disorders such as tumorigenesis, carcinomas, adenomas, etc., by looking for possible mutations for example (deletions, changes in the sequence, ).
  • the activity of these ubiquitin ligases can also be tested in various pathologies in order to detect a possible change in their level of expression and their possible implication in the pathology considered.
  • the molecules of the invention can thus be used in immunological tests using techniques such as immunoblots, radioisotope immunohistochemistry, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) tests, immunoprecipitation, immunodiffusion tests, agglutination to name some.
  • the HECT domain protein genes can also be used in hybridization tests with the aim of detecting, diagnosing disorders or diseases associated with changes in the expression or activity of proteins. at domaine HECT. These hybridization tests are carried out by bringing together a sample containing nucleic acids (such as a tissue section) with a nucleic probe capable of hybridizing to RNA or DNA of protein with HECT domain in favorable conditions for hybridization.
  • a sample containing nucleic acids such as a tissue section
  • HECT or its RNA, or its activity for example, ubiquitin ligase activity
  • RNA, DNA or the protein sequence of a protein with HECT domain for example, deletions , translocations
  • the level of HECT domain protein can be detected by immunochemistry, the level of RNA by hybridization (northern blot, in situ hybridization).
  • the activity of the HECT domain protein can be detected by measuring the ubiquitin ligase E3 activity.
  • Translocations, deletions and point mutations in the nucleic sequences of HECT domain proteins can be detected by Southern blot, FISH, RFLP analysis, SSCP, PCR, sequencing, etc.

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Abstract

La présente invention a pour objet de nouvelles protéines à domaine HECT et de nouveaux substrats des protéines à domaine HECT. Elle a pour objet les méthodes de criblage mises au point pour identifier les substrats des nouvelles protéines à domaine HECT et pour identifier les petites molécules et drogues qui modulent l'interaction et/ou l'activité des protéines à domaine HECT et de leurs substrats.

Description

Acides nucléiques codant de nouvelles protéines à domaine HECT, leurs utilisations en diagnostics et en thérapie
L'invention se rapporte au domaine de l'ubiquitination des protéines, et plus particulièrement au domaine du contrôle et du diagnostic de l'ubiquitination des protéines.
ART ANTERIEUR
Il est depuis longtemps établi que la durée de vie des protéines cellulaires est extrêmement variable. Cette instabilité constitutive ou régulée de certaines protéines (en général des protéines régulatrices), permet aux cellules d'en contrôler étroitement et d'en modifier rapidement les niveaux.
Les mécanismes de dégradation des protéines sont donc extrêmement spécifiques, et le niveau intra-cellulaire d'une protéine donnée peut être ajusté précisément aux besoins de la cellule, par un équilibre entre ses taux de synthèse et de dégradation.
Ce n'est que très récemment par contre qu'il a été établi que la majeure partie de la protéolyse intra-cellulaire est assurée chez les eucaryotes par une machinerie très sophistiquée, le système Ubiquitine (Ub) /protéasome, qui utilise l'Ub pour marquer les protéines à dégrader et le protéasome comme enzyme proteolytique. Cette voie implique une cascade de réactions qui conduisent, dans un premier temps, au marquage des protéines à détruire par un polypeptide, constitué de 76 acides aminés, appelé ubiquitine. L'ajout de plusieurs molécules d'ubiquitine cible alors la protéine ainsi modifiée vers le protéasome où elle est détruite. Cette voie s'avère être la voie privilégiée de la dégradation de la plupart des protéines à courte durée de vie chez l'ensemble des organismes eucaryotes. Un grand nombre des protéines dont la stabilité est régulée par la voie ubiquitine-protéasome assurent des fonctions régulatrices dans la cellule (des régulateurs du cycle cellulaire, comme les cyclines, par exemple, des facteurs de transcription, des récepteurs etc....). Le système ubiquitine-protéasome est donc un système régulateur important des cellules eucaryotes qui contrôle la concentration cellulaire de protéines clés par leur dégradation sélective.
La voie ubiquitine-protéasome L'ubiquitination régule un grand nombre de fonctions cellulaires critiques, le plus fréquemment en déterminant la dégradation sélective de certaines protéines clés par le protéasome. La progression du cycle cellulaire (Koepp DM ét al., 1999), l'induction de la réponse inflammatoire (Ghosh S, et al., 1998), la présentation antigénique (Rock KL et Goldberg AL., 1999) notamment sont quelques uns des nombreux processus régulés par la voie ubiquitine protéasome. Il n'est pas étonnant de constater qu'une dérégulation de la protéolyse dépendante de l'ubiquitine a été identifiée comme une cause du cancer (Joazeiro CAP et al., 1999; Bignell GR et al., 2000) et de plusieurs maladies héréditaires (Shimura H et al., 2000; Matsuura T et al., 1997). La dégradation n'est pas la seule issue possible pour des protéines liées à l'ubiquitine; l'ubiquitination régule aussi certains processus par des mécanismes qui ne semblent pas nécessiter de protéolyse. Ces processus incluent notamment l'initiation de la réponse inflammatoire (Deng L et al., 2000) et le fonctionnement de certains facteurs de transcritption (Kaiser P et al., 2000). Parmi les protéines concernées par l'ubiquitination, on trouve notamment p27, p53, p300, les cyclines, E2F, STAT-1 , c-Myc, c-Jun, IKB, NFKB et la β-caténine.
La voie ubiquitine conduit à l'attachement covalent d'une chaîne d'ubiquitine aux substrats cibles qui sont ensuite dégradés par un complexe multiprotéique, le protéasome, au sein duquel sont associées de nombreuses activités protéasiques. L'ubiquitination de la protéine cible est un mécanisme en trois étapes qui implique en générale trois classes d'enzymes. L'ubiquitine est d'abord activée dans sa partie C- terminale par la formation d'un lien thioester avec une enzyme d'activation de l'ubiquitine, l'enzyme E1. Ensuite, l'ubiquitine est transférée aux résidus cystéine actifs d'une des nombreuses enzymes de conjugaison de l'ubiquitine (Ubc ou E2). Le transfert final de l'ubiquitine aux résidus lysine de la protéine cible se produit par une réaction qui requiert ou non une protéine ligase de l'ubiquitine (E3) (Hochstrasser, 1996). Les enzymes E3 ont pour principale fonction de reconnaître le substrat mais ces enzymes catalysent parfois la formation d'un lien peptidique entre l'ubiquitine et un résidu lysine du substrat. La répétition de l'action de ces trois enzymes conduit à la formation d'une chaîne de polyubiquitine. La protéine polyubiquitinée est alors adressée vers le protéasome où elle est dégradée. Alors que le facteur E1 est commun à toutes les voies de dégradation et ne sert qu'à activer l'ubiquitine, la sélectivité du processus de dégradation est assurée par l'ubiquitine ligase E3, qui interagit à la fois avec E2 et avec le substrat (Hershko A. et al., 1983).
Il existe donc un besoin dans l'état de la technique pour l'isolement et la caractérisation de nouvelles protéines à domaine HECT, qui constituent des cibles privilégiées de composés thérapeutiques utilisables pour la prévention ou le traitement des pathologies dans lesquelles ces protéines sont impliquées, notamment les pathologies qui ont été indiquées ci-dessus.
Les ubiquitine-liqases: les enzymes à domaine HECT Les ubiquitine-ligases ou E3 sont les déterminants centraux de la spécificité de l'ubiquitination. Bien que cette propriété soit clairement établie, il s'est avéré difficile de comprendre la catalyse dépendante des E3 au niveau moléculaire. Dans la plupart des cas, le substrat, l'ubiquitine et l'enzyme qui porte l'ubiquitine (E2) doivent tous être présents au niveau du centre réactionnel. En conséquence, en plus de contribuer au transfert chimique de l'ubiquitine aux résidus lysine, l'enzyme E3 doit également coordonner le positionnement des différents acteurs protéiques au niveau de son site actif.
Les enzymes E3 connues à l'heure actuelle sont des membres de deux familles protéiques: les E3 à domaine HECT et les E3 à RING finger. Les domaines catalytiques de ces deux familles ne sont apparentés ni en séquence ni en structure (néanmoins certaines E2 interagissent bien avec des E3 des deux familles). Récemment, il est devenu clair que la plupart des E3 ont en commun un élément structural particulier, le RING (Really l teresting New Gène) finger (Lorick KL et al., 1999; Deshaies RJ, 1999). Les 70 acides aminés du RING finger présentent un espacement distinct des résidus cystéine et histidine dont le rôle est d'assurer la fixation de deux ions zinc qui stabilisent la structure globulaire caractéristique (Borden KLB, 2000). Dans certains cas bien documentés, l'E3 à domaine RING est une sous-unité d'un complexe multiprotéique. C'est le cas notamment pour les complexes SCF, APC et VCB (Deshaies RJ, 1999; Tyers M et Jorgensen P, 2000). Les complexes SCF et VCB contiennent une protéine à domaine RING désignée Rbx1 , et l'APC contient la protéine APC11. Cependant, dans ces cas particuliers, les enzymes E3 ne semblent pas jouer un rôle dans la reconnaissance du substrat, ce rôle étant assuré par d'autres protéines du complexe multiprotéique, comme les protéines à boîte F dans les complexes SCF (S: Skp1 ; C: Cdc53 ou culline; F: protéine contenant une boîte F). Certaines protéines à RING finger fonctionnent également de manière autonome comme la protéine c-Cbl impliquée dans la dégradation des récepteurs de l'EGF (epidermal growth factor) ou de PDGF (platelet derived growth factor) (Joazeiro CAP and Weissman AM, 2000) ou la protéine Mdm2 responsable principalement de la dégradation de p53 par le protéasome (Haupt Y et al., 1997).
Les protéines à domaine HECT (pour "Homologous to E6-AP Carboxyl-Terminus") sont caractérisées par un motif d'environ 350 acides aminés contenant un résidu cystéine très conservé qui forme un intermédiaire thiol ester essentiel pendant la catalyse. Au niveau structural, les protéines à domaine HECT sont des protéines de grande taille constituées de nombreux domaines de liaison. Certaines comportent des domaines C2 (Ca2+/lipid binding domain) et des domaines WW (répétition de 35-40 acides aminés de deux résidus tryptophane) en plus du domaine HECT. Les domaines WW sont soupçonnés intervenir dans la reconnaissance du substrat (Pirozzi G. et al., 1997). De nombreuses protéines HECT contiennent des domaines WW. Il a été suggéré que in vivo ces protéines peuvent ineragir avec diverses autres protéines par l'intermédiaire de ce domaine (Harvey KF et Kumar S., 1999). Un domaine régulateur de la condensation des chromosomes a également été trouvée dans certaines de ces protéines (RCC). La propriété d'un de ces domaines HECT fut d'abord révélée grâce à l'étude de la dégradation conditionnelle du suppresseur de tumeur p53. Quand les cellules sont infectées par des formes oncogéniques des papillomavirus humains (HPV), p53 est sélectivement dégradée par une protéolyse dépendante de la voie ubiquitine protéasome. Des études biochimiques ont révélées que la reconnaissance de p53 pour une dégradation induite par le virus dépendait du produit du gène E6 de HPV et d'une protéine cellulaire de 100 kDa environ , E6-AP (E6-Associated Protein). E6 et E6-AP forment un complexe qui fonctionne comme une E3 spécifique de p53 (Scheffner M., 1993). Le tiers terminal de la séquence de E6-AP est identique à 35-45% à de nombreuses autres protéines dans les banques de données (Huibregtse JM, 1995).
Dans les bases de données de mammifères notamment, on peut trouver de nombreuses protéines HECT potentielles, mais la grande majorité d'entre elles ne sont pas caractérisées fonctionnellement. A part E6-AP, la protéine E3 à domaine HECT la mieux caractérisée est l'enzyme de levure Rsp5. Rsp5 a été impliquée dans l'ubiquitination de divers types de substrats très différents. Rsp5 reconnaît un ensemble de perméases et récepteurs membranaires dont l'ubiquitination dépend dans certains cas d'un signal produit par la phosphorylation du substrat. Ces substrats sont ensuite endocytés. Rsp5 a aussi des substrats solubles dont Rpb1 , la grande sous-unité de l'ARN polymérase II. L'ubiquitination conduit dans ce cas à la protéolyse. Les propriétés de Rsp5 sont conservées chez les eucaryotes supérieurs. La protéine humaine Rpb1 est reconnue par Nedd4, l'orthologue murin/humain de Rsp5 (Beaudenon SL et al., 1999).
La plupart des protéines a domaine HECT sont vraisemblablement des E3 ou des composants de complexes multiprotéiques contenant des activités de type E3. A l'heure actuelle, peu d'informations sont disponibles sur les fonctions possibles des E3 à domaine HECT. Ces découvertes suggèrent qu'un vaste répertoire de E3 a été établi en rassemblant divers domaines d'interaction protéique avec seulement deux motifs catalytiques. En dépit de ce progrès cependant, et malgré la détermination récente de la structure de deux complexes E2- E3 (Huang L et al., 1999; Zheng N et al., 2000) qui montrent comment les différents intervenants peuvent dans certains cas s'aligner au niveau du site actif de l'E3, de nombreuses questions, mécanistiques notamment, restent posées.
Les pathologies associées aux ubiquitine ligase E3
Le système ubiquitine est impliqué dans la pathologie de nombreuses maladies génétiques humaines dont les syndromes d'Angelman et de Liddle. Le syndrome d'Angelman est un défaut rare et héréditaire se traduisant par un retard mental associé à une mutation de la protéine à domaine HECT, E3 (Kishino, T et al;, 1997; Matsuura, T. et al., 1997). Le syndrome de Liddle impliquant l'ubiquitine ligase à domaine HECT, Nedd4, est une forme rare et héréditaire d'hypertension causée par la délétion de régions du canal sodique épithélial (ENaC) qui le cible pour la dégradation dépendante de l'ubiquitine (Staub O et al., 1996). Cela se traduit par une hyperactivité de ce canal. L'accumulation de produits conjugués à l'ubiquitine est aussi une des caractéristiques de nombreuses maladies neurologiques comme la maladie d'Alzheimer (Checler F et al., 2000). Cette accumulation est en fait une conséquence des tentatives avortées de la cellule pour se débarasser de protéines abimées ou anormales. Une protéolyse accélérée a également été associée à une atrophie des muscles squelettiques (Wing S. et al., 1995).
Les cancers se développent quand les cellules se multiplient trop rapidement. La prolifération cellulaire dépend d'un équilibre entre les signaux négatifs et les signaux positifs. Quand les signaux positifs sont supérieurs ou que les signaux négatifs sont absents, les cellules se multiplient trop rapidement et le cancer se développe. Normalement, les cellules contrôlent précisément la quantité d'une protéine donnée et éliminent l'excès ou toute protéine non requise. Pour ce faire, la cellule marque spécifiquement ces protéines indésirables avec une longue chaîne d'ubiquitine. Ces molécules sont alors reconnues et détruites par le protéasome. Cependant, cette machinerie s'enraille dans les tumeurs conduisant à l'accumulation excessive de signaux positifs (protéines oncogéniques), ou à la dégradation anormale de régulateurs négatifs (suppresseurs de tumeurs). En conséquence, en l'absence de suppresseurs de tumeur ou en présence d'un excès d'oncogènes, les cellules se multiplient sans cesse, formant des tumeurs (pour revue, voir Ciechanover, 1998). Ainsi, les dégradations anormales par la voie ubiquitine du suppresseur de tumeur p53 et de l'oncogène putatif β- caténine ont été corrélées au développement de tumeurs, suggérant que certains gènes codant des enzymes d'ubiquitination pourraient être mutés dans les tumeurs.
La dégradation non contrôlée de certains régulateurs du cycle cellulaire a été observée dans certaines tumeurs, il est donc possible qu'une ubiquitine ligase fonctionnant mal soit la cause de ces dégradations altérées de régulateurs du cycle. Ainsi, la surexpression de Mdm2, une ubiquitine ligase, induit une diminution notable de la quantité de son substrat, le suppresseur de tumeur p53.
Vu l'importance des voies de signalisation auxquelles ils participent, les complexes E3 constituent des cibles attractives de criblage pharmacologique. D'ores et déjà, il a été établi que le disfonctionnement de la voie de dégradation des protéines ubiquitine- protéasome est clairement impliqué dans de nombreuses pathologies de nature extrêmement variée : les cancers, les maladies génétiques, la maladie de parkinson, la maladie d'Alzheimer, les syndromes inflammatoires et les infections virales.
La caractérisation d'agents chimiques capables de moduler l'activité de reconnaissance et d'ubiquitination des ubiquitine-ligases E3 est donc susceptible de permettre la mise au point de nouvelles stratégies thérapeutiques humaines dans de nombreuses aires thérapeutiques comme le cancer, l'inflammation, les infections virales, bactériennes et fongiques, les syndromes inflammatoires, les pathologies cardio-vasculaires et neuro-dégénératives. SOMMAIRE DE L'INVENTION
La présente invention a pour objet de nouvelles protéines à domaine HECT et de nouveaux substrats des protéines à domaine HECT. Elle a pour objet les méthodes de criblage mises au point pour identifier les substrats des nouvelles protéines à domaine HECT et pour identifier les petites molécules et drogues qui modulent l'interaction et/ou l'activité des protéines à domaine HECT et de leurs substrats. Les méthodes de criblage de cette invention peuvent être utilisées pour identifier des agents thérapeutiques qui pourraient être utilisés dans des protocoles et pour le traitement de diverses pathologies, incluant cancer, inflammations, pathologies cardio-vasculaires, maladies neuro- dégénératives, infections virales, bactériennes et fongiques. Cette invention englobe l'utilisation des nucléotides codant ces nouvelles protéines à domaine HECT, les protéines à domaine HECT et les peptides dérivants de ces protéines, les vecteurs permettant l'expression de ces protéines chez des bactéries, champignons, insectes, plantes et organismes mammifères ainsi que les animaux chez lesquels les gènes codant ces protéines à domaine HECT auront été inactivés.
Un premier objet de l'invention consiste en un acide nucléique codant pour un polypeptide à domaine HECT choisi parmi les séquences d'acides aminés comprenant les séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°11 , ou pour un fragment ou un variant du polypeptide choisi parmi les séquences d'acides aminés comprenant les séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°11. Selon l'invention, le fragment du polypeptide à domaine HECT comprend ou consiste en le peptide définissant le domaine HECT stricto sensu d'un polypeptide choisi parmi les séquences d'acides aminés comprenant les séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°1 1.
Selon l'invention, un fragment du polypeptide à domaine HECT comprend ou consiste en un polypeptide choisi parmi les séquences d'acides aminés comprenant les séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°11 dans lequel a été délétée la séquence en acides aminés du domaine HECT stricto sensu.
Un acide nucléique tel que défini ci-dessus peut en outre être caractérisé en ce que le polypeptide à domaine HECT, un fragment ou un variant de ce polypeptide est fusionné avec un polypeptide hétérologue, par exemple un marqueur détectable ou la protéine GAL4. L'invention est également relative à des vecteurs recombinants, de clonage ou d'expression, contenant un acide nucléique selon l'invention, le cas échéant sous le contrôle d'une séquence régulatrice permettant son expression dans une cellule hôte choisie.
Elle concerne aussi des cellules hôtes recombinantes dans lesquelles a été artificiellement inséré un acide nucléique ou un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus. L'invention a également pour objet un polypeptide à domaine
HECT comprenant une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°11 , un fragment ou un variant de ce polypeptide, ainsi que des anticorps dirigés contre ce polypeptide ou encore le fragment ou le variant de celui-ci.. Elle est également relative à des procédés de criblages acellulaires ou cellulaires de composés candidats interagissant avec un polypeptide à domaine HECT tel que défini ci-dessus.
Elle concerne aussi des procédés de criblages de composés candidats modulant la force de l'interaction entre un polypeptide à domaine HECT selon l'invention et une protéine substrat, ainsi que des procédés de criblage de composés candidats capables d'inhiber ou d'activer l'activité ubiquitine ligase de la protéine à domaine HECT spécifiée par le polypeptide considéré.
Elle a encore pour objet une composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace d'un acide nucléique ou d'un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles..
Elle concerne aussi une composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace d'un polypeptide selon l'invention, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles. DEFINITIONS GENERALES
Selon l'invention, toute technique classique de biologie moléculaire, de microbiologie et d'ADN recombinant connue de l'homme du métier peut être utilisée. De telles techniques sont décrites par exemple par SAMBROOK et al. (1989), GLOVER (1985), GAIT (1984),
HAMES et HIGGINS (1984) et AUSUBEL et al. (1994) .
De manière préférée, tout acide nucléique et tout polypeptide selon l'invention se présentent sous une forme isolée ou purifiée.
Le terme " isolé " au sens de la présente invention désigne un matériel biologique qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement). Par exemple, un polynucleotide présent à l'état naturel dans une plante n'est pas isolé. Le même polynucleotide séparé des acides nucléiques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de la plante est isolé. Un tel polynucleotide peut être inclus dans un vecteur et/ou un tel polynucleotide peut être inclus dans une composition et demeurer néanmoins à l'état isolé du fait que le vecteur ou la composition ne constitue pas son environnement naturel.
Le terme " purifié " ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusive de la présence d'autres composés. Il s'agit plutôt d'une définition relative.
Un polynucleotide ou un polypeptide est à l'état purifié après purification du matériel de départ ou du matériel naturel d'au moins un ordre de grandeur, de préférence 2 ou 3 et préférentiellement quatre ou cinq ordres de grandeur.
Aux fins de la présente description, l'expression " séquence nucléotidique " peut être employée pour désigner indifféremment un polynucleotide ou un acide nucléique. L'expression " séquence nucléotidique " englobe le matériel génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.
Les termes " acide nucléique ", "polynucleotide ",
" oligonucléotide " ou encore " séquence nucléotidique " englobent des séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc ou encore des séquences hybrides
ARN/ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous la forme simple brin ou sous la forme de duplex. Le terme " nucléotide " désigne à la fois les nucléotides naturels (A, T, G, C) ainsi que des nucléotides modifiés qui comprennent au moins une modification telle que (i) un analogue d'une purine, (ii) un analogue d'une pyrimidine, ou (iii) un sucre analogue, de tels nucléotides modifiés étant décrits par exemple dans la demande PCT N°WO 95/04064.
Aux fins de la présente invention, un premier polynucleotide est considéré comme étant " complémentaire " d'un second polynucleotide lorsque chaque base du premier nucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucleotide dont l'orientation est inversée.
Les bases complémentaires sont A et T (ou A et U), et C et G.
Selon l'invention, un premier acide nucléique ayant au moins 95% d'identité avec un second acide nucléique de référence, possédera au moins 95%, de préférence au moins 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% ou 99,9% d'identité en nucléotides avec ce second polynucleotide de référence, le pourcentage d'identité entre deux séquences étant déterminé comme décrit ci-dessous.
Le " pourcentage d'identité " entre deux séquences de nucléotides ou d'acides aminés, au sens de la présente invention, peut être déterminé en comparant deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.
La partie de la séquence nucléotidique ou polypeptidique dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des " gaps ") par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal des deux séquences.
Le pourcentage est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique ou un résidu d'aminoacide identique est observé pour les deux séquences (nucléique ou peptidique) comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux bases ou résidus d'aminoacides comparés, par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus.
De manière préférée, le pourcentage d'identité de séquences est déterminé à l'aide du logiciel BLAST (version BLAST 2.06 de Septembre 1998), en utilisant exclusivement les paramètres par défaut.
Un acide nucléique possédant au moins 95% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique selon l'invention englobe les " variants " d'un acide nucléique selon l'invention.
Par " variant " d'un acide nucléique selon l'invention, on entend un acide nucléique qui diffère de l'acide nucléique de référence par une ou plusieurs substitutions, additions ou délétions d'un nucléotide, par rapport à l'acide nucléique de référence. Un variant d'un acide nucléique selon l'invention peut être d'origine naturelle, tel qu'un variant allélique qui existe naturellement. Un tel acide nucléique variant peut être également un acide nucléique non naturel obtenu, par exemple, par des techniques de mutagenèse.
En général, les différences entre l'acide nucléique de référence et l'acide nucléique " variant " sont réduites de telle sorte que l'acide nucléique de référence et l'acide nucléique variant ont des séquences nucléotidiques très similaires et, dans de nombreuses régions, identiques. Les modifications nucléotidiques présentes dans un acide nucléique variant peuvent être silencieuses, ce qui signifie qu'elles n'affectent pas la séquence d'acides aminés qui peut être codée par cet acide nucléique variant. Les modifications de nucléotides dans l'acide nucléique variant peuvent aussi résulter en des substitutions, additions ou délétions d'un ou plusieurs acides aminés dans la séquence du polypeptide qui peut être codé par cet acide nucléique variant.
De manière tout à fait préférée, un acide nucléique variant selon l'invention comportant une phase de lecture ouverte, code pour un polypeptide qui conserve la même fonction ou la même activité biologique que le polypeptide codé par l'acide nucléique de référence.
De manière tout à fait préférée, un acide nucléique variant selon l'invention et qui comporte une phase de lecture ouverte, code pour un polypeptide qui conserve la capacité d'être reconnu par des anticorps dirigés contre le polypeptide codé par l'acide nucléique de référence.
Par " fragment " d'un acide nucléique selon l'invention, on entend une séquence nucléotidique d'une longueur réduite par rapport à l'acide nucléique de référence, le fragment d'acide nucléique possédant une séquence nucléotidique identique à la séquence nucléotidique de l'acide nucléique de référence sur la partie commune. De tels fragments d'un acide nucléique selon l'invention possèdent au moins 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 ou 3000 nucléotides consécutifs de l'acide nucléique de référence, la longueur maximale en nucléotides d'un fragment d'un acide nucléique selon l'invention étant bien entendue limitée par la longueur maximale en nucléotides de l'acide nucléique de référence.
Par « fragment » d'un polypeptide à domaine HECT selon l'invention, on entend un fragment polypeptidique d'une longueur réduite par rapport au polypeptide de référence, le fragment polypeptidique possédant une séquence en acides aminés identique à la séquence en acides aminés du polypeptide de référence sur la partie commune. De tels fragments d'un polypeptide à domaine HECT selon l'invention possèdent au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, ou 390 acides aminés consécutifs d'un polypeptide à domaine HECT de référence
Par conditions d'hybridation de forte stringence, au sens de l'invention, on entend les conditions d'hybridation suivantes:
Préhvbridation: mêmes conditions que pour l'hybridation durée: 1 nuit.
Hybridation:
5 x SSPE (0.9 M NaCI, 50 mM phosphate de sodium pH 7.7, 5 mM
EDTA)
5 x Denhardt's (0.2% PVP, 0.2% Ficoll, 0.2% SAB) 100 μg/ml ADN de sperme de saumon 0.1 % SDS durée: 1 nuit. Lavages: 2 x SSC, 0.1 % SDS 10 min 65°C
1 x SSC, 0.1 % SDS 10 min 65°C 0.5 x SSC, 0.1 % SDS 10 min 65°C 0.1 x SSC, 0.1% SDS 10 min 65°C.
Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm).
Pour les séquences comprenant plus de 360 bases, Tm est définie par la relation:
Tm= 81 ,5 + 0,41 (%G+C)+16,6 Log(concentration en cations) - 0,63 (% formamide)-(600/nombre de bases) (SAMBROOK et al., (1989), pages 9.54-9.62).
Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par la relation: Tm= 4(G+C) + 2(A+T).
Dans des conditions de stringence appropriées, dans lesquelles les séquences aspécifiques n'hybrident pas, la température d'hybridation est approximativement de 5 à 30°C, de préférence de 5 à 10°C en- dessous de Tm.
Les conditions d'hybridation ci-dessus décrites sont mises en œuvre pour l'hybridation d'un acide nucléique de 20 bases de longueur et peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon les techniques connues de l'homme du métier.
Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES et HIGGINS (1985) ou encore dans l'ouvrage de AUSUBEL et al. (1989). En particulier, il faut prendre en compte que le niveau et la spécificité d'hybridation dépendent de différents paramètres, tels que : a) la pureté de la préparation de l'acide nucléique sur lequel la sonde ou l'amorce doit s'hybrider ; b) la composition en base de la sonde ou de l'amorce, les paires de bases G-C possédant une plus grande stabilité thermique que les paires de bases A-T ou A-U ; c) la longueur de la séquence de bases homologue entre la sonde ou l'amorce et l'acide nucléique ; d) la force ionique : le taux d'hybridation augmente avec l'accroissement de la force ionique et la durée du temps d'incubation ; e) la température d'incubation ; f) la concentration de l'acide nucléique sur lequel la sonde ou l'amorce doit s'hybrider ; g) la présence d'agents dénaturants, tels que des agents favorisant la rupture de liaisons hydrogène , comme le formamide ou l'urée, qui accroissent la stringence de l'hybridation ; h) le temps d'incubation, le taux d'incubation augmentant avec la durée de l'incubation ; i) la présence d'agents d'exclusion de volume , tels que le dextran ou le sulfate de dextran, qui augmentent le taux d'hybridation du fait qu'ils accroissent les concentrations effectives de la sonde ou de l'amorce et de l'acide nucléique qui doit s'hybrider, au sein de la préparation.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 illustre l'alignement des séquences d'acides aminés correspondant au domaine HECT des différentes protéines selon l'invention.
La figure 2 est une représentation schématique des protéines à domaine HECT. Les domaines putatifs d'interaction protéine-protéine sont représentés. La double barre oblique indique que les ADNs complémentaires correspondant sont incomplets en 5' et/ou en 3'. Dans la légende, « HECT » signifie Homologous to E6-AP Carboxyl-Terminus, « WW » signifie domaine avec deux résidus Trp conservés, « C2 » signifie motif de liaison de Ca2+ ou de certains types de lipides, «RCC1 » signifie Regulator of Chromosome Condensation, « IQ » signifie petit motif de liaison de la calmoduline avec des résidus Ile et Gin et «RING » signifie un motif de type doigt de zinc.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Il est fourni selon l'invention de nouveaux polypeptides à domaine HECT impliqués dans l'ubiquitination des protéines cellulaires, étape importante dans la voie de dégradation des protéines.
La caractérisation de ces nouveaux polypeptides à domaine HECT selon l'invention rend possible la mise au point de nouveaux outils diagnostiques pour la détection d'altérations dans l'activité biologique des ubiquitine ligase à domaine HECT et de nouveaux outils thérapeutiques destinés à prévenir ou corriger ces altérations dans l'activité biologique des ubiquitine ligases à domaine HECT. Les nouveaux polypeptides à domaine HECT selon l'invention sont les polypeptides suivants :
- le polypeptide HECT9 de séquence en acides aminés SEQ ID N°1 ;
- le polypeptide HECT17de séquence en acides aminés SEQ ID N°2 ;
- le polypeptide HECT18 de séquence en acides aminés SEQ ID N°3 - le polypeptide HECT19 de séquence en acides aminés SEQ ID N°4
- le polypeptide HECT20 de séquence en acides aminés SEQ ID N°5
- le polypeptide HECT21 de séquence en acides aminés SEQ ID N°6
- le polypeptide HECT22de séquence en acides aminés SEQ ID N°7 ;
- le polypeptide HECT23 de séquence en acides aminés SEQ ID N°8 ; - le polypeptide HECT24 de séquence en acides aminés SEQ ID N°9 ;
- le polypeptide HECT25 de séquence en acides aminés SEQ ID N°10 ;
- le polypeptide HECT26 de séquence en acides aminés SEQ ID N°11 ;
Le polypeptide HECT9 possède une homologie de séquence avec la protéine Pub1 de S. pombe.
Les polypeptides HECT17, HECT18, HECT19, HECT20, HECT21 , HECT22, HECT23, HECT24, HECT25, HECT26 possèdent des homologies avec des protéines référencées dans la base de données SMART. Un premier objet de l'invention consiste en un acide nucléique codant pour un polypeptide à domaine HECT choisi parmi les séquences d'acides aminés comprenant les séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°11 , ou pour un fragment ou un variant du polypeptide choisi parmi les séquences d'acides aminés comprenant les séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°11.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le polypeptide à domaine HECT codé par un acide nucléique tel que défini ci-dessus consiste en une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°11 , ou pour un variant ou un fragment de ce polypeptide.
De préférence, un acide nucléique codant pour un polypeptide à domaine HECT selon l'invention comprend un polynucleotide choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID N°12 à SEQ ID N°22, ainsi que les séquences nucléotidiques qui en sont dérivées et qui comprennent le cadre de lecture ouvert contenu dans les séquences SEQ ID N°12 à SEQ ID N°22.
Ainsi, un autre objet de l'invention consiste en un acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences suivantes :
- la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 21 jusqu'au nucléotide en position 4775 de la séquence SEQ ID N°12 (hect9);
- la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 4891 de la séquence SEQ ID N°13 (hect17); - la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 2066 jusqu'au nucléotide en position 3754 de la séquence SEQ ID N°14 (hectW);
- la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 4860 de la séquence SEQ ID N°15 (hect19); - la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 304 jusqu'au nucléotide en position 3552 de la séquence SEQ ID N°16 (hect20);
- la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 472 jusqu'au nucléotide en position 2940 de la séquence SEQ ID N°17 (hect21); - la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 172 jusqu'au nucléotide en position 801 de la séquence SEQ ID N°18 (hect22);
- la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 201 jusqu'au nucléotide en position 1337 de la séquence SEQ ID N°19 (hect23); - la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 496 jusqu'au nucléotide en position 3339 de la séquence SEQ ID N°20 (hect24);
- la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 184 jusqu'au nucléotide en position 4899 de la séquence SEQ ID N°21 (hect25);
- la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 120 jusqu'au nucléotide en position 2237 de la séquence SEQ ID N°22 (hect26);
Font également partie de l'invention les acides nucléiques suivants : a) un acide nucléique codant pour un polypeptide ayant une séquence en acides aminés choisie dans le groupe des séquences SEQ
ID N°1 à SEQ ID N°11 ou un fragment ou un variant de ce polypeptide, éventuellement fusionné à un polypeptide hétérologue ; b) un acide nucléique comprenant un polynucleotide choisi parmi les séquences SEQ ID N°12 à SEQ ID N°22, ou un fragment ou un variant de ce dernier ; c) un acide nucléique ayant au moins 95% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des séquences SEQ ID N°12 à SEQ ID N°22 ou un fragment ou un variant de ce dernier ; d) un acide nucléique hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique de séquences SEQ ID N°12 à SEQ ID N°22, ou un fragment ou un variant de ce dernier.
L'invention concerne aussi un polypeptide comprenant le domaine HECT d'un polypeptide à domaine HECT tel que défini ci-dessus. Elle est également relative à un polypeptide consistant en le domaine HECT d'un polypeptide selon l'invention.
Le domaine HECT d'un polypeptide selon l'invention est considéré comme un « fragment » d'un tel polypeptide aux fins de la présente description. Ainsi, fait également partie de l'invention un polypeptide comprenant ou consistant en une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences suivantes : a) la séquence allant de l'acide aminé en position 1248 jusqu'à l'acide aminé en position 1585 de la séquence SEQ ID N°1 ; b) la séquence allant de l'acide aminé en position 1259 jusqu'à l'acide aminé en position 1624 de la séquence SEQ ID N°2 ; c) la séquence allant de l'acide aminé en position 230 jusqu'à l'acide aminé en position 567 de la séquence SEQ ID N°3 ; d) la séquence allant de l'acide aminé en position 1153 jusqu'à l'acide aminé en position 1620 de la séquence SEQ ID N°4 ; e) la séquence allant de l'acide aminé en position 742 jusqu'à l'acide aminé en position 1083 de la séquence SEQ ID N°5 ; f) la séquence allant de l'acide aminé en position 481 jusqu'à l'acide aminé en position 823 de la séquence SEQ ID N°6 ; g) la séquence allant de l'acide aminé en position 1 jusqu'à l'acide aminé en position 206 de la séquence SEQ ID N°7 ; h) la séquence allant de l'acide aminé en position 48 jusqu'à l'acide aminé en position 372 de la séquence SEQ ID N°8 ; i) la séquence allant de l'acide aminé en position 618 jusqu'à l'acide aminé en position 947 de la séquence SEQ ID N°9 ; j) la séquence allant de l'acide aminé en position 1235 jusqu'à l'acide aminé en position 1572 de la séquence SEQ ID N°10 ; k) la séquence allant de l'acide aminé en position 373 jusqu'à l'acide aminé en position 694 de la séquence SEQ ID N°1 1 ;
Pour obtenir une délétion totale ou partielle de la boîte HECT, l'homme du métier peut, par exemple, mettre en œuvre une digestion enzymatique de l'acide nucléique codant le polypeptide considéré en utilisant les sites de restriction flanquants, par exemple selon la technique décrite par MRGOTTIN et al. (Margottin F. et al., 1998, Molecular cell, 1 : 565-574).
Les acides nucléiques codant un polypeptide à domaine HECT tel que défini ci-dessus peuvent être facilement obtenus par l'homme du métier, par exemple à partir d'un échantillon d'ADN humain ou encore à partir d'une banque d'ADN humain, à l'aide d'amorces spécifiques de l'une des séquences SEQ ID N°12 à SEQ ID N°22, par exemple par amplification PCR.
Comme cela sera exposé plus loin dans la description, l'expression d'un variant d'un polypeptide à domaine HECT selon l'invention, dans lequel le domaine HECT a été complètement ou partiellement délétée, ou muté peut être recherchée dans le cas où l'on désire obtenir une diminution ou un blocage de la dégradation du substrat spécifique. Un tel variant d'un polypeptide à domaine HECT selon l'invention peut conserver sa capacité à interagir spécifiquement avec le substrat, mais n'est plus capable d'ubiquitiner ce substrat.
Selon un autre aspect, l'invention est donc aussi relative à un acide nucléique codant pour un variant d'un polypeptide à domaine HECT tel que défini ci-dessus, dans la séquence duquel tout ou partie de la séquence du domaine HECT a été délétée.
Par « délétion partielle » du domaine HECT, on entend la suppression d'au moins 2, de préférence d'au moins 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340 ou 350 acides aminés consécutifs de la séquence du domaine HECT d'un polypeptide selon l'invention, la longueur de la délétion étant limitée par la longueur en acides aminés d'un domaine HECT dans chacun des polypeptides à domaine HECT selon l'invention. Dans un mode de réalisation préféré, l'acide nucléique codant pour un variant d'un polypeptide à domaine HECT dans la séquence duquel la séquence du domaine HECT a été complètement ou partiellement délétée est choisi parmi les acides nucléiques suivants : a) un polypeptide comprenant la séquence SEQ ID N°12 dans lequel a été totalement ou partiellement délétée la séquence allant de l'acide aminé en position 1248 jusqu'à l'acide aminé en position 1585 de la séquence SEQ ID N°12 ; b) un polypeptide comprenant la séquence SEQ ID N°13 dans lequel a été totalement ou partiellement délétée la séquence allant de l'acide aminé en position 1259 jusqu'à l'acide aminé en position 1624 de la séquence SEQ ID N°13 ; c) un polypeptide comprenant la séquence SEQ ID N°14 dans lequel a été totalement ou partiellement délétée la séquence allant de l'acide aminé en position 230 jusqu'à l'acide aminé en position 567 de la séquence SEQ ID N°14 ; d) un polypeptide comprenant la séquence SEQ ID N°15 dans lequel a été totalement ou partiellement délétée la séquence allant de l'acide aminé en position 1153 jusqu'à l'acide aminé en position 1620 de la séquence SEQ ID N°15 ; e) un polypeptide comprenant la séquence SEQ ID N°16 dans lequel a été totalement ou partiellement délétée la séquence allant de l'acide aminé en position 742 jusqu'à l'acide aminé en position 1083 de la séquence SEQ ID N°16 ; f) un polypeptide comprenant la séquence SEQ ID N°17 dans lequel a été totalement ou partiellement délétée la séquence allant de l'acide aminé en position 481 jusqu'à l'acide aminé en position 823 de la séquence SEQ ID N°17 ; g) un polypeptide comprenant la séquence SEQ ID N°18 dans lequel a été totalement ou partiellement délétée la séquence allant de l'acide aminé en position 1 jusqu'à l'acide aminé en position 206 de la séquence SEQ ID N°18 ; h) un polypeptide comprenant la séquence SEQ ID N°19 dans lequel a été totalement ou partiellement délétée la séquence allant de l'acide aminé en position 48 jusqu'à l'acide aminé en position 372 de la séquence SEQ ID N°19 ; i) un polypeptide comprenant la séquence SEQ ID N°20 dans lequel a été totalement ou partiellement délétée la séquence allant de l'acide aminé en position 618 jusqu'à l'acide aminé en position 947 de la séquence SEQ ID N°20 ; j) un polypeptide comprenant la séquence SEQ ID Nc21 dans lequel a été totalement ou partiellement délétée la séquence allant de l'acide aminé en position 1235 jusqu'à l'acide aminé en position 1572 de la séquence SEQ ID N°21 ; k) un polypeptide comprenant la séquence SEQ ID N°22 dans lequel a été totalement ou partiellement délétée la séquence allant de l'acide aminé en position 373 jusqu'à l'acide aminé en position 694 de la séquence SEQ ID N°22 ; Selon un autre mode de réalisation d'un acide nucléique selon l'invention, cet acide nucléique est caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide à domaine HECT, ou un variant ou un fragment de ce polypeptide, qui est fusionné avec un polypeptide hétérologue.
Par « polypeptide hétérologue », on entend une séquence d'acides aminés qui n'est pas exprimée naturellement par la cellule sous une forme chimiquement liée à un polypeptide à domaine HECT tel que défini ci-dessus.
Selon un premier mode de réalisation, le polypeptide hétérologue consiste en un polypeptide capable de se fixer sélectivement sur un support, tel que la glutathione S transferase ou GST, bine connue de l'homme du métier.
Selon un second mode de réalisation, le polypeptide hétérologue consiste en un polypeptide détectable, par exemple un polypeptide fluorescent comme les protéines GFP et YFP, bien connues de l'homme du métier.
Selon un troisième mode de réalisation, le polypeptide hétérologue consiste en un polypeptide accepteur ou donneur de fluorescence utilisable dans des systèmes de détection d'interactions par transfert d'énergie de fluorescence (ou FRET pour « Fluorescence Résonance Energy Transfer »).
Selon un quatrième mode de réalisation, le polypeptide hétérologue consiste en un premier partenaire protéique lequel, lorsqu'il interagit spécifiquement avec un second partenaire protéique, a la capacité de se fixer sur un motif d'acide nucléique régulant la transcription d'un gène rapporteur, pour une utilisation dans des systèmes de détection d'interactions du type « double-hybride » bien connus de l'homme du métier. Un tel polypeptide peut être, par exemple, la protéine GAL4 ou la protéine LexA. Selon encore un autre aspect d'un acide nucléique selon l'invention, cet acide nucléique comprend un polynucleotide régulateur contrôlant l'expression du polypeptide à domaine HECT ou de son fragment ou variant, éventuellement fusionné à un polypeptide hétérologue, dans une cellule hôte. Des exemples illustratifs de polynucléotides régulateurs préférés selon l'invention sont listés ci- dessous dans la partie descriptive des vecteurs recombinants préférés.
Fait aussi partie de l'invention tout acide nucléique dont la séquence est complémentaire à l'un des acides nucléiques tels que définis dans la présente description.
Vecteurs recombinants
Tout acide nucléique selon l'invention peut être inséré dans un vecteur à des fins de clonage ou à des fins d'expression. L'invention est également relative à un vecteur recombinant comprenant un acide nucléique codant pur un polypeptide à domaine HECT, un fragment ou un variant de ce polypeptide, éventuellement fusionné avec un polypeptide hétérologue et pour lequel ledit acide nucléique a été artificiellement inséré dans le vecteur. Avantageusement, un tel vecteur recombinant comprendra un acide nucléique choisi parmi les acides nucléiques suivants : a) un acide nucléique codant pour un polypeptide ayant une séquence en acides aminés choisie dans le groupe des séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°11 ou un fragment ou un variant de ce polypeptide, éventuellement fusionné à un polypeptide hétérologue ; b) un acide nucléique comprenant un polynucleotide choisi parmi les séquences SEQ ID N°12 à SEQ ID N°22, ou un fragment ou un variant de ce dernier c) un acide nucléique ayant au moins 95% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des séquences SEQ ID N°12 à SEQ ID N°22 ou un fragment ou un variant de ce dernier ; d) un acide nucléique hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique de séquences SEQ ID N°12 à SEQ ID N°22, ou un fragment ou un variant de ce dernier.
Par " vecteur " au sens de la présente invention on entendra une molécule d'ADN ou d'ARN circulaire ou linéaire qui est indifféremment sous forme de simple brin ou double brin.
Selon un premier mode de réalisation, un vecteur recombinant selon l'invention est utilisé afin d'amplifier l'acide nucléique qui y est inséré après transformation ou transfection de l'hôte cellulaire désiré. Selon un second mode de réalisation, il s'agit de vecteurs d'expression comprenant, outre un acide nucléique conforme à l'invention, des séquences régulatrices permettant d'en diriger la transcription et/ou la traduction.
Selon un mode de réalisation avantageux, un vecteur recombinant selon l'invention comprendra notamment les éléments suivants :
(1 ) des éléments de régulation de l'expression de l'acide nucléique à insérer, tels que des promoteurs et des enhanceurs ;
(2) la séquence codante comprise dans l'acide nucléique conforme à l'invention à insérer dans un tel vecteur, ladite séquence codante étant placée en phase avec les signaux de régulation décrits aux (1) ; et
(3) des séquences d'initiation et d'arrêt de la transcription appropriées.
En outre, les vecteurs recombinants selon l'invention pourront inclure une ou plusieurs origines de réplication chez les hôtes cellulaires dans lesquels leur amplification ou leur expression est recherchée, des marqueurs ou des marqueurs de sélection.
A titre d'exemples, les promoteurs bactériens pourront être les promoteurs Lad, LacZ, les promoteurs de l'ARN polymérase du bactériophage T3 ou T7, les promoteurs PR, ou PL du phage lambda.
Les promoteurs pour cellules eucaryotes comprendront le promoteur de la thymidine kinase du virus HSV ou encore le promoteur de la métallothionéine-L de souris.
De manière générale, pour le choix d'un promoteur adapté, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de SAMBROOK et al. (1989) précité ou encore aux techniques décrites par FULLER et al. (1996).
Les vecteurs bactériens préférés selon l'invention sont par exemple les vecteurs pBR322(ATCC37017) ou encore des vecteurs tels que pAA223-3 (Pharmacia, Uppsala, Suède), et pGEMI (Promega Biotech, Madison. WI, ETATS-UNIS).
On peut encore citer d'autres vecteurs commercialisés tels que les vecteurs pQE70, pQE60, pQE9 (Qiagen), psiX174, pBluescript SA, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI, pSG(Stratagene).
Il peut s'agir également de vecteurs de type baculovirus tel que le vecteur pVL1392/1393 (Pharmingen) utilisé pour transfecter les cellules de la lignée Sf9 (ATCC N°CRL 1711 ) dérivées de Spodoptera frugiperda.
Il peut encore s'agir de vecteurs adénoviraux tels que l'adénovirus humain de type 2 ou 5.
Un vecteur recombinant selon l'invention peut aussi être un vecteur rétroviral ou encore un vecteur adéno-associé (AAV). De tels vecteurs adéno-associés sont par exemple décrits par FLOTTE et al.
(1992), SAMULSKI et al. (1989), ou encore McLAUGHLIN BA et al. (1996).
Cellules hôtes recombinantes
L'invention concerne aussi une cellule hôte recombinante qui a été artificiellement transfectée ou transformée par un acide nucléique ou par un vecteur recombinant tels que définis ci-dessus.
De préférence, une cellule hôte recombinante selon l'invention est une cellule eucaryote, et de manière tout à fait préférée une cellule hôte recombinante humaine.
Les cellules hôtes préférées selon l'invention sont par exemple les suivantes : a) cellules hôtes procaryotes: souches ά'Escherichia coli (souche DH5-α), de Bacillus subtilis, de Salmonella typhimurium, ou encore des souches d'espèces telles que Pseudomonas, Streptomyces et Staphylococus ; b) cellules hôtes eucaryotes: cellules HeLa (ATCC N°CCL2), cellules Cv 1 (ATCC N°CCL70), cellules COS (ATCC N°CRL 1650), cellules Sf-9 (ATCC N°CRL 1711 ), cellules CHO (ATCC N°CCL-61 ) ou encore cellules 3T3 (ATCC NXRL-6361 ).
Polypeptides de l'invention
Selon un autre aspect, l'invention concerne un polypeptide comprenant une séquence en acides aminés choisie dans le groupe constitué des peptides de séquences SEQ ID Nc1 à SEQ ID N°11 , ou un fragment ou un variant de ce polypeptide, éventuellement fusionné avec un polypeptide hétérologue..
L'invention est relative à un polypeptide à domaine HECT, un fragment ou un variant de ce polypeptide, éventuellement fusionné avec un polypeptide hétérologue, caractérisé en ce qu'il est codé par un acide nucléique tel que défini dans la présente description.
L'invention concerne aussi un polypeptide comprenant au moins
15 acides aminés consécutifs d'une séquence en acides aminés choisie dans le groupe constitué des peptides de séquences SEQ ID N°1 à SEQ
ID N°11 , ou un fragment ou un variant de ce polypeptide, éventuellement fusionné avec un polypeptide hétérologue.
L'invention est également relative à un polypeptide comprenant une séquence en acides aminés ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec une séquence en acides aminés choisie dans le groupe constitué des peptides de séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°11 , ou un fragment ou un variant de ce polypeptide.
De manière générale, les polypeptides selon la présente invention se présentent sous une forme isolée ou purifiée.
L'invention concerne aussi un polypeptide comprenant des modifications d'acides aminés de 1 , 2, 3, 4, 5, 10 à 20 substitutions, additions ou délétions d'un acide aminé par rapport à la séquence en acides aminés d'un polypeptide de séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID
N°11 , ou encore d'un fragment ou d'un variant de ce dernier.
L'invention est également relative à un procédé pour la production de l'un des polypeptides de séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°11 ou d'un fragment peptidique ou d'un variant de ce dernier, ladite méthode comprenant les étapes de : a) insérer un acide nucléique codant pour ledit polypeptide dans un vecteur approprié ; b) cultiver, dans un milieu de culture approprié, une cellule hôte préalablement transformée ou transfecter avec le vecteur recombinant de l'étape a) ; c) récupérer le milieu de culture conditionné ou lyser la cellule hôte, par exemple par sonication ou par choc osmotique ; d) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir des lysats cellulaires obtenus à l'étape c), ledit polypeptide ; e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant produit.
Les peptides selon l'invention peuvent être caractérisés par fixation sur une colonne de chromatographie d'immunoaffinité sur laquelle les anticorps dirigés contre ce polypeptide ou contre un fragment ou un variant de ce dernier ont été préalablement immobilisés.
Selon un autre aspect, un polypeptide recombinant selon l'invention peut être purifié par passage sur une série appropriée de colonnes de chromatographie, selon les méthodes connues de l'homme de l'art.
Un polypeptide selon l'invention peut être également préparé par les techniques classiques de synthèse chimique indifféremment en solution homogène ou phase solide.
A titre illustratif, un polypeptide selon l'invention pourra être préparé par la technique ou en solution homogène décrite par HOUBEN WEYL (1974) ou encore la technique de synthèse en phase solide décrite par MERRIFIELD (1965a; 1965b).
Font également partie de l'invention des polypeptides dits " homologues " à l'un quelconque des polypeptides de séquences d'acides aminés SEQ ID N°1 à SEQ ID N°11 , ou de leurs fragments ou variants.
De tels polypeptides homologues ont des séquences d'acides aminés possédant une ou plusieurs substitutions d'un acide aminé par un acide aminé équivalent, par rapport aux polypeptides de référence. On entendra par acide aminé équivalent selon la présente invention, par exemple remplacement d'un résidu sous la forme L par un résidu sous la forme D ou encore le remplacement d'un acide glutamique (E) par un acide pyro-glutamique selon des techniques bien connues de l'homme du métier. A titre illustratif, la synthèse de peptide contenant au moins un résidu sous la forme D est décrite par KOCH (1977).
Selon un autre aspect, sont également considérés comme des acides aminés équivalents deux acides aminés appartenant à la même classe, c'est-à-dire deux acides aminés acide, basique, non polaire ou encore polaire non chargé.
Font également partie de l'invention des polypeptides comprenant au moins une liaison non peptidique telle qu'une liaison rétro-inverso (NHCO), une liaison carba (CH2CH2) ou encore une liaison cétométhylène (CO-CH2). De préférence, les polypeptides selon l'invention comprenant une ou plusieurs additions, délétions, substitutions d'au moins un acide aminé conserveront leur capacité à être reconnus par des anticorps dirigés contre les polypeptides non modifiés. Ces polypeptides conserveront également leur capacité à reconnaître leur substrat spécifique et/ou partenaires potentiels avec lesquels ils se lient.
Anticorps
Les polypeptides selon l'invention, en particulier les polypeptides de séquences en acides aminés SEQ ID N°1 à SEQ ID N°11 ou les fragments et les variants de ces derniers ainsi que les peptides homologues peuvent être utilisés pour la préparation d'anticorps.
Par " anticorps " au sens de la présente invention, on entendra notamment des anticorps polyclonaux ou monoclonaux ou des fragments (par exemple les fragments F (ab)'2, Fab) ou encore tout polypeptide comprenant un domaine de l'anticorps initial reconnaissant le polypeptide ou le fragment de polypeptide cible selon l'invention .
Des anticorps monoclonaux peuvent être préparés à partir d'hybridomes selon la technique décrite par KOHLER et MILSTEIN (1975). La présente invention concerne également des anticorps dirigés contre un polypeptide tel que décrit ci-dessus ou un fragment ou un variant de ce dernier, tels que produits dans la technique du trioma ou encore la technique d'hybridome décrite par KOZBOR et al. (1983).
L'invention a également trait à des fragments d'anticorps simple chaîne Fv (ScFv) tels que décrits dans le brevet US N° 4,946,778 ou encore par MARTINEAU et al. (1998).
Les anticorps selon l'invention comprennent également des fragments d'anticorps obtenus à l'aide de banques de phages RIDDER et al., (1995) ou encore des anticorps humanisés REIMANN et al. (1997); LEGER et al., (1997).
Les préparations d'anticorps selon l'invention sont utiles dans des tests de détection immunologiques destinés à l'identification de la présence et/ou de la quantité d'antigènes présents dans un échantillon.
Un anticorps selon l'invention pourra comprendre en outre un marqueur détectable isotopique ou non-isotopique, par exemple fluorescent ou encore être couplé à une molécule telle que la biotine, selon des techniques bien connues de l'homme du métier. Ainsi, la mention a en outre pour objet un procédé pour détecter la présence d'un polypeptide conforme à l'invention dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de : a) mettre en contact l'échantillon à tester avec un anticorps tel que décrit ci-dessus ; b) détecter le complexe antigène/anticorps formé.
L'invention est également relative à un nécessaire ou kit de diagnostic ou pour la détection de la présence d'un polypeptide conforme à l'invention dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant : a) un anticorps tel que défini ci-dessus ; b) un réactif permettant la détection des complexes antigène/anticorps formés. Sondes et amorces nucléotidiques
Les fragments d'acides nucléiques dérivés de l'une quelconque des séquences nucléotidiques SEQ ID N°12 à SEQ ID N°22 sont utiles pour la détection de la présence d'au moins une copie d'une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID N°12 à SEQ ID N°22 ou encore d'un fragment ou d'un variant de cette dernière dans un échantillon.
Les sondes ou les amorces nucléotidiques selon l'invention comprennent au moins huit nucléotides consécutifs d'un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des séquences SEQ ID N°12 à SEQ ID N°22, ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire.
De préférence, des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention auront une longueur de 10, 12, 15, 18 ou 20 à 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 200, 500, 1000, 1500 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, en particulier un acide nucléique de séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID N°12 à SEQ ID N°22 ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire.
Alternativement, une sonde ou une amorce nucléotidique selon l'invention consistera et/ou comprendra les fragments d'une longueur de 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 100, 200, 500, 1000, 1500 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, plus particulièrement d'un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID N°12 à SEQ ID N°22, ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire.
La définition d'une sonde et d'une amorce nucléotidique selon l'invention englobe donc des oligonucléotides qui hybrident, dans les conditions d'hybridation de forte stringence définies ci-avant, avec un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID N°12 à SEQ ID N°22 ou avec une séquence complémentaire de ces derniers.
Une amorce ou une sonde nucléotidique selon l'invention peut être préparée par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du métier, y compris par clonage et action d'enzymes de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon des techniques telles que la méthode au phosphodiester de NARANG et al. (1979) ou de BROWN et al. (1979), la méthode aux diéthylphosphoramidites de BEAUCAGE et al. (1980) ou encore la technique sur support solide décrite dans le brevet EU NΕP 0
707 592.
Chacun des acides nucléiques selon l'invention, y compris les sondes et amorces oligonucléotidiques décrites ci-dessus, peuvent être marqués, si désiré, en incorporant un marqueur détectable par des moyens spectroscopiques, photochimiques, biochimiques, immunochimiques ou encore chimiques.
Par exemple, de tels marqueurs peuvent consister en des isotopes radioactifs (32P, 33P, , 3H, 35S, ), des molécules fluorescentes (5- bromodeoxyuridine, fluorescéine , acétylaminofluorène, digoxigénine) ou encore des ligands tels que la biotine.
Le marquage des sondes est fait de préférence par incorporation de molécules marquées au sein des polynucléotides par extension d'amorces, ou bien par rajout sur les extrémités 5' ou 3' Les sondes oligonucléotides selon l'invention peuvent être utilisées notamment dans des hybridations de type Southern à l'ADN génomique ou encore dans des hybridations à l'ARN messager correspondant lorsque l'expression du transcrit correspondant est recherchée dans un échantillon. Les sondes selon l'invention peuvent aussi être utilisées pour la détection de produits d'amplification PCR ou encore pour la détection de mésappariements.
Des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être immobilisées sur un support solide. De tels supports solides sont bien connus de l'homme du métier et comprennent des surfaces des puits de plaques de microtitration, des lits de polystyrène, des lits magnétiques, des bandes de nitrocellulose, ou encore des microparticules telles que des particules de latex.
En conséquence, la présente invention concerne également un procédé de détection de la présence d'un acide nucléique tel que décrit ci-avant dans un échantillon, ladite méthode comprenant les étapes de :
1 ) mettre en contact une ou plusieurs sondes nucléotidiques selon l'invention avec l'échantillon à tester ;
2) détecter le complexe éventuellement formé entre la ou les sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon. Selon un mode de réalisation particulier du procédé de détection selon l'invention, la ou les sondes oligonucléotidiques sont immobilisées sur un support. Selon un autre aspect, les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.
L'invention concerne en outre un nécessaire ou kit pour la détection de la présence d'un acide nucléique selon l'invention dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant : a) une ou plusieurs sondes nucléotidiques telles que décrites ci- dessus ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'hybridation.
Selon un premier aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support. Selon un second aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.
Selon un mode de réalisation particulier du kit de détection décrit ci-dessus, un tel kit comprendra une pluralité de sondes oligonucléotidiques conformes à l'invention qui pourront être utilisées pour détecter des séquences cibles d'intérêt ou alternativement détecter des mutations dans les régions codantes ou les régions non codantes des acides nucléiques selon l'invention, plus particulièrement des acides nucléiques de séquences SEQ ID N°12 à SEQ ID N°22 ou les acides nucléiques de séquence complémentaire.
Ainsi, les sondes selon l'invention immobilisées sur un support peuvent être ordonnées en matrices telles que les " puces à ADN ". De telles matrices ordonnées ont été en particulier décrites dans le brevet US N° 5,143,854, dans les demandes PCT N° WO 90/150 70 et
92/10092.
Des matrices supports sur lesquelles des sondes oligonucléotidiques ont été immobilisées à une haute densité sont par exemple décrites dans les brevets US N°5,412,087 et dans la demande PCT N°WO 95/11995. Les amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées pour amplifier l'un quelconque des acides nucléiques selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquences SEQ ID N°12 à SEQ ID N°22, ou encore un variant de celui-ci. Un autre objet de l'invention concerne un procédé pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement un acide nucléique de séquences SEQ ID N°12 à SEQ ID N°22 ou un fragment ou un variant de celui-ci contenu dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de : a) mettre en contact l'échantillon dans lequel la présence de l'acide nucléique cible est suspectée avec une paire d'amorces nucléotidiques dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de la région de l'acide nucléique cible dont l'amplification est recherchée, en présence des réactifs nécessaires à la réaction d'amplification ; et b) détection des acides nucléiques amplifiés.
Pour mettre en oeuvre le procédé d'amplification tel que défini ci- dessus, on aura avantageusement recours à l'une quelconque des amorces nucléotidiques décrites ci-avant.
L'invention a en outre pour objet un nécessaire ou kit pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquences SEQ ID N°12 à SEQ ID N°22, ledit nécessaire ou kit comprenant : a) un couple d'amorces nucléotidiques conformes à l'invention, dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de l'acide nucléique cible dont l'amplification est recherchée ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification.
Un tel nécessaire ou kit d'amplification comprendra avantageusement au moins une paire d'amorces nucléotidiques telles que décrites ci-dessus. Procédés de criblages
Identification des partenaires ou des cibles des protéines à domaine HECT L'invention concerne aussi des procédés de criblage de composés candidats interagissant avec un polypeptide à domaine HECT tel que défini dans la présente description.
La première étape vers l'utilisation des protéines à domaine HECT comme cible thérapeutique est l'identification des substrats ciblés pour la dégradation par ces composants. L'identification et la caracterisation de ces cibles peuvent notamment apporter des informations essentielles sur les mécanismes biologiques dans lesquels elles interviennent.
Les méthodes pour identifier les polypeptides qui interagissent avec les protéines à domaine HECT de la présente invention sont variées et comprennent les expériences de double hybride chez la levure ainsi que les méthodes de phage display; ces méthodes présentent l'avantage que la séquence nucléique codant les peptides interactant est identifiée simultanément, au contraire d'autres méthodes plus biochimiques qui nécessitent un séquençage protéique. Le double hybride chez la levure peut être utilisé pour cribler une banque d'expression d'ADNc de mammifères (humaines), où un ADNc est fusionné au domaine de liaison à l'ADN ou au domaine activateur de GAL4, et l'acide nucléique codant le peptide d'intérêt, comme la protéine cible, est fusionné également soit au domaine activateur soit au domaine de liaison a l'ADN de GAL4 respectivement (Gyuris et al., 1993). Le double hybride a été développé afin de détecter des interactions protéine-protéine spécifiques. Un des aspects de la présente invention est d'utiliser une protéine pour détecter des interactants. Cette protéine, qui peut être une protéine à domaine HECT (tronquée ou non), est utilisée comme appât pour identifier un ou des substrats cible potentiels. Alternativement, des substrats cibles d'intérêt peuvent être utilisés pour identifier l'ubiquitine ligase ou le complexe ubiquitine ligase responsable de sa dégradation.
Le ou les polypeptides cibles peuvent également être identifiés par la technologie de "phage display". Une banque de "phage display" est une banque d'expression protéique construite dans un vecteur de type phagique qui exprime une collection de séquences protéiques clonées en fusion avec une protéine de la paroi du phage. Cette construction particulière permet l'expression da la protéine de fusion à l'extérieur de la particule phagique. Cette disposition favorise donc l'interaction entre la protéine recombinante exposée au niveau de la paroi et une protéine ligand immobilisée. La protéine à domaine HECT est par exemple immobilisée sur une matrice solide et une solution contenant les phages est passée sur ce support. On analyse alors les phages retenus et la nature de la protéine qu'ils expriment.
Les partenaires cible d'une protéine à domaine HECT pourront également être identifiés de la manière suivante. Un peptide correspondant à une protéine à domaine HECT concernée par la présente invention ayant subi ou non des modifications post- traductionnelles est immobilisé sur une résine, par exemple une résine activée NHS-sepharose® (pharmacia). Un lysat cellulaire, par exemple de cellules HELA ou d'autres cellules appropriées est fractionné sur la colonne d'affinité préparée selon une méthode standard. Après lavage, les protéines retenues sur la colonne sont éluées en augmentant la force ionique des lavages ou par élution compétitive avec des peptides représentant le domaine HECT en partie ou dans son intégralité. Les protéines cellulaires sont ensuite identifiées par une ou l'autre des combinaisons de techniques mentionnées ci-dessous : fractionnement sur gel SDS PAGE, suivi ou non d'un western-blot, une fois purifiées du gel et éventuellement hydrolysées partiellement les protéines pourront être caractérisées plus avant en utilisant le micro-séquencage peptidique ou l'analyse par MALDI-TOF.
Selon un autre aspect, l'invention concerne aussi un procédé pour cribler des composés candidats se liant à un polypeptide à domaine HECT, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact un polypeptide à domaine HECT tel que défini ci- dessus avec au moins un composé candidat à tester ; b) détecter les complexes éventuellement formés entre ledit polypeptide et le ou les composé(s) candidat(s) . Le procédé de criblage ci-dessus peut en outre être caractérisé en ce qu'il comprend l'étape additionnelle suivante : c) caractériser le ou les composé(s) candidat(s) ayant formé un complexe avec le polypeptide à domaine HECT. Selon un premier mode de réalisation particulier du procédé ci- dessus, le polypeptide à domaine HECT est préalablement immobilisé sur un support.
Selon un second mode de réalisation particulier, le ou les composé(s) candidat(s) sont initialement contenus dans le lysat cellulaire d'une culture de cellules eucaryotes, de préférence des cellules humaines.
Selon un troisième mode de réalisation, le composé candidat est le produit d'expression d'un phage constitutif d'une collection combinatoire de clones de phages (« phage display »). L'invention est également relative à un procédé pour cribler des composés candidats se liant à un polypeptide à domaine HECT, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) cultiver une cellule hôte recombinante telle que définie ci-dessus dans un milieu de culture approprié, de telle manière à ce que ladite cellule hôte produise un polypeptide à domaine HECT selon l'invention; b) détecter les complexes éventuellement formés entre le polypeptide à domaine HECT et d'autres composés produits par la cellule hôte.
Selon un mode particulier de réalisation du procédé de criblage ci- dessus, ledit procédé est caractérisé en ce qu'il s'agit d'un système double-hybride dans lequel la cellule hôte transfectée à l'étape a) est transfectée avec un acide nucléique codant pour un polypeptide à domaine HECT, un fragment ou un variant de ce polypeptide qui est fusionné avec un polypeptide hétérologue, ledit polypeptide hétérologue consistant en un premier partenaire protéique lequel, lorsqu'il interagit spécifiquement avec un second partenaire protéique, a la capacité de se fixer sur un motif d'acide nucléique régulant la transcription d'un gène rapporteur, pour une utilisation dans des systèmes de détection d'interactions du type « double-hybride » bien connus de l'homme du métier. Un tel polypeptide peut être, par exemple, la protéine GAL4 ou la protéine LexA.
Selon ce même mode de réalisation particulier du procédé de criblage ci-dessus, la cellule hôte recombinante est en outre co- transfectée avec un acide nucléique codant le composé candidat sous une forme fusionnée avec le second partenaire protéique mentionné ci- dessus. De cette manière, l'interaction entre le polypeptide à domaine HECT, ou son fragment ou son variant, et le composé candidat est détecté par visualisation de l'activation ou au contraire de l'inhibition du gène rapporteur également contenu dans la cellule hôte recombinante co-transfectée.
L'invention concerne aussi un composé se liant à un polypeptide à domaine HECT tel que décrit ci-dessus, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par l'un des procédés de criblages ci-dessus.
Identification de composés qui modulent l'interaction des protéines à domaine HECT avec d'autres protéines
L'invention est également relative à des procédés de criblage de composés modulant l'interaction entre un polypeptide à domaine HECT et une protéine cible spécifique, ou alternativement entre un polypeptide à domaine HECT et un ou plusieurs partenaires protéiques éventuels.
Une fois qu'un substrat d'une protéine à domaine HECT ou qu'une protéine capable d'interagir avec cette protéine à domaine HECT est identifiée, la recherche de modulateurs de l'interaction peut alors être entreprise. La présente invention présente des méthodes pour identifier des drogues qui sont soit des agonistes soit des antagonistes de la fonction cellulaire normale des protéines à domaine HECT, ou du rôle des protéines à domaine HECT dans la pathogenèse de la prolifération et/ou différenciation cellulaire normale ou anormale provoquée par l'ubiquitination d'une protéine par un processus dépendant d'une protéine à domaine HECT. Les tests évaluent l'habilité d'un composé à moduler l'association et/ou l'ubiquitination d'une protéine cible (cellulaire ou virale) par une protéine à domaine HECT. De tels modulateurs peuvent être utilisés par exemple dans le traitement de désordres prolifératifs ou différenciatifs, pour moduler l'apoptose et dans le traitement d'infections virales.
Une variété de méthodologies est applicable à ces études. Les méthodologies qui permettent l'ubiquitination d'une protéine cible par une voie dépendante des protéines à domaine HECT incluent les systèmes acellulaires, utilisant par exemple des protéines purifiées ou des lysats, ainsi que des systèmes cellulaires utilisant des cellules intactes (cellules de mammifères, humaines, d'insecte ou de levure). Des expériences de simple liaison peuvent aussi être utilisées pour détecter les agents qui empêchent l'ubiquitination en se liant par exemple au substrat ou à la protéine à domaine HECT. Les agents testés pour être des inhibiteurs peuvent être produits par des bactéries, des levures ou d'autres organismes (produits naturels) ou produits chimiquement (petites molécules nucléiques ou chimiques). Dans de nombreux programmes de criblage de drogues qui testent des banques de composés, des criblages à haut débit (high throughput assays) sont préférables afin de maximiser le nombre de composés testés dans une même expérience.
Tests dans des systèmes acellulaires
Ces méthodes peuvent être utilisées pour identifier des composés capables d'interagir avec une protéine à domaine HECT ou un de ses partenaires pour modifier l'activité de la protéine à domaine HECT ou de son partenaire. Un tel composé peut par exemple modifier la structure d'une protéine à domaine HECT ou de son partenaire et donc en affecter l'activité. Ces tests peuvent également être utilisés pour identifier des composés qui modulent l'interaction de la protéine à domaine HECT et d'un partenaire de cette protéine. Un tel système a été utilisé pour reconstituer, par exemple, la polyubiquitination de la protéine p53 par E6- AP (Yabuki, N. et al., 1999).
Ces tests consistent essentiellement en un mélange réactionnel comprenant la protéine à domaine HECT, le composé à tester ou une banque de composés en présence ou non du partenaire de liaison. Les composés testés peuvent être un dérivé du partenaire de la protéine à domaine HECT, par exemple un peptide cible inactif, ou une petite molécule chimique ou nucléique (aptamères). Un exemple de criblage de cette invention pourrait consister à détecter la formation d'un complexe entre une protéine à domaine HECT de l'invention et un de ses partenaires en présence d'un composé ou d'une banque de composés. Pour la détection, la molécule peut être marquée avec un marqueur spécifique, et le ou les composés(s) par un marqueur différent. L'interaction du composé avec la protéine à domaine HECT ou le partenaire de la protéine à domaine HECT peut être détecté en déterminant le niveau des deux marquages après une étape d'incubation et de lavage. Si les deux marquages sont présents cela signifie qu'il y a eu interaction.
Une interaction entre deux molécules peut également être déterminée en utilisant l'analyse d'interaction biomoléculaire (BIA) en temps réel qui détecte la résonance plasmonique de surface, un phénomène optique. La détection dépend des changements dans la concentration de masse des macromolécules sur l'interface, et ne requiert aucun marquage préalable. Une banque de composés à tester peut être immobilisée sur une surface sensible. Une solution contenant la protéine à domaine HECT ou un partenaire de cette protéine est alors versée en continue sur cette surface. Un changement dans l'angle de résonance détectable grâce à un enregistrement des signaux indique qu'une interaction s'est produite. Cette technique est décrite dans le livre BIAtechnology de Pharmacia.
Un autre exemple d'expérience de criblage de la présente invention inclut les étapes de: (a) réaliser un mélange réactionnel comprenant, une protéine à domaine HECT, un partenaire de cette protéine, et un composé à tester; (b) détecter l'interaction entre la protéine à domaine HECT et son partenaire. Cette protéine à domaine HECT et son partenaire peuvent être produites par une technologie recombinante, être purifiées ou synthétisées chimiquement. Un changement statistique significatif (activation ou inhibition) dans l'interaction de la protéine à domaine HECT et de son partenaire en présence d'un composé indique un agoniste potentiel (mimétique ou activateur) ou antagoniste (inhibiteur). L'efficacité du composé peut être testée en effectuant des études de dose-réponse en utilisant différentes concentrations du composé.
La formation d'un complexe entre une protéine à domaine HECT et son partenaire peut être détectée par une variété de techniques. La modulation de la formation des complexes peut être quantifiée en utilisant par exemple des protéines marquées détectables grâce à un radiomarquage, un marquage fluorescent ou enzymatique. Typiquement, il est souhaitable d'immobiliser la protéine à domaine HECT ou son partenaire pour faciliter la séparation des complexes des formes non complexées et faciliter l'automatisation de l'expérience. La liaison peut être réalisée dans des plaques de microtitration, des tubes à essais, des microtubes, toute vaisselle permettant de contenir les différents réactifs. Une protéine de fusion peut être produite qui permet la liaison de la, protéine à une matrice. Par exemple, des protéines de fusion à domaine HECT/GST (glutathione S transferase) peuvent être adsorbées sur des billes de sépharose qui sont ensuite mis en présence du partenaire marqué au 35S et du composé testé. Ce mélange est incubé dans des conditions favorables à la formation du complexe, des conditions physiologiques en terme de sel et de pH par exemple. Apres cette incubation, les billes sont lavées pour retirer tout matériel non fixé, la matrice immobilisée et la radioactivité déterminée directement (les billes sont placées dans du liquide à scintillation par exemple), ou dans le surnageant après dissociation des complexes. Les complexes peuvent également être dissociés de la matrice, séparés par une électrophorèse de type SDS-PAGE, et le niveau de protéine à domaine HECT ou de partenaire trouvé dans la fraction de bille quantifié sur gel en utilisant les techniques d'électrophorèse standard.
L'interaction entre deux molécules peut également être déterminée en utilisant la technique de FRET (Fluorescence résonance energy transfer). Le principe est basé sur le fait que le transfert d'énergie qui se produit entre deux fluorophores quand ils sont proches (<10nm), et que le spectre d'émission du premier fluorophore (le donneur) recouvre le spectre d'excitation du second (l'accepteur). Une association étroite entre deux fluorophores adaptés et l'excitation du donneur, se traduit donc par une augmentation de la fluorescence de l'accepteur et/ou une diminution de la fluorescence du donneur par FRET (Herman, 1989). Cette technique peut notamment être appliquée à l'étude de l'interaction entre des protéines à domaine HECT et leurs substrats et être utilisée pour identifier des inhibiteurs ou des activateurs de l'interaction. Comme le FRET est une méthode spectroscopique non destructive pour mesurer les interactions moléculaires, elle peut se faire sur des cellules vivantes.
L'invention est donc aussi relative à un procédé pour cribler des composés modulant l'interaction entre un polypeptide à boîte à domaine HECT et un partenaire, comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un polypeptide à domaine HECT tel que défini ci- dessus, une protéine partenaire et le composé candidat à tester ; b) détecter les complexes éventuellement formés entre le polypeptide à domaine HECT et la protéine partenaire.
Test dans des systèmes cellulaires
L'invention fournit également des méthodes expérimentales cellulaires pour identifier des agents agonistes ou antagonistes modulant l'activité des protéines à domaine HECT. L'effet d'un composé sur l'expression d'un gène codant une protéine à domaine HECT peut être déterminé par des expériences de transfection en utilisant un gène rapporteur. Ce gène rapporteur peut être n'importe quel gène codant une protéine quantifiable, par exemple la luciférase ou le gène CAT. Le niveau d'expression de ce gène rapporteur est alors déterminé en présence ou en l'absence du composé. Des tests cellulaires utilisables pour détecter des inhibiteurs des activités ubiquitine ligase ont déjà été décrits qui utilisent des protéines fusionnées à la GFP comme substrats (Dantuma, N., 2000). Une approche similaire a également été utilisée pour étudier l'ubiquitination de c-jun en utilisant une protéine de fusion c- jun-β-galactosidase (Treier, M. et al., 1994). Le même principe pourra être utilisé pour étudier la protéolyse dépendante de l'ubiquitine de n'importe quelle protéine cellulaire en construisant la fusion appropriée.
Une autre application des méthodes cellulaires est le double hybride chez la levure (Gyuris et al., 1993), adapté à l'isolement de peptides naturels (provenant par exemple d'une banque d'expression d'ADNc), ou synthétiques(d'une banque d'expression de cadres de lecture au hasard), interagissant avec un polypeptide de l'invention. Ce polypeptide interactant peut ensuite être utilisé pour détecter une augmentation ou une diminution de son interaction avec la protéine à domaine HECT, permettant donc l'identification d'agonistes ou d'antagonistes.
Le système de conjugaison peut être effectué dans des cellules entières, tirant avantage des techniques de culture cellulaire. Par exemple, le système de conjugaison peut être constitué dans un système de cellules eucaryotes en culture, y compris les cellules de mammifères et de levure. Les avantages d'effectuer l'expérimentation dans une cellule intacte incluent la possibilité de détecter des inhibiteurs qui sont fonctionnels dans un environnement plus proche de celui que l'utilisation thérapeutique de l'inhibiteur nécessitera, incluant la capacité de l'agent de rentrer dans la cellule. De plus, certaines des expériences in vivo sont compatibles avec une analyse à grande échelle, comme cela est indiqué plus bas.
Les composants du système de conjugaison de l'ubiquitine peuvent être endogènes à la cellule sélectionnée pour effectuer l'expérience. Autrement, certains ou tous les composants peuvent provenir de sources exogènes. Par exemple, des protéines de fusion peuvent être introduites dans la cellule par des techniques recombinantes (comme l'utilisation d'un vecteur d'expression), ou en microinjectant dans la cellule la protéine de fusion elle-même ou l'ARNm codant cette protéine.
Dans tous les cas, la cellule n'est manipulée qu'après incubation avec un inhibiteur candidat afin de faciliter la détection de l'ubiquitination ou la dégradation de la cible. Comme décrit plus haut, pour des expériences réalisées avec des mélanges reconstitués de protéines ou des lysats, l'efficacité du candidat inhibiteur est évaluée en mesurant des caractéristiques directes de la protéine cible, tel que le changement de poids moléculaire par des méthodes électrophorétiques, ou par détection dans un test de liaison. Dans ce cas, la cellule doit être lysée à la fin de l'incubation avec l'agent candidat, et le lysat manipulé dans une étape de détection de la même manière que précédemment. Dans ces expériences utilisant des cellules entières, l'utilisation d'un gène rapporteur peut également s'avérer judicieuse. Un gène rapporteur comprend tout gène qui exprime un produit détectable, sous forme d'ARN ou de protéine. Les gènes rapporteurs privilégiés sont ceux qui sont détectables directement. Ce gène rapporteur peut être inclus dans une construction sous la forme d'un gène de fusion avec la protéine cible d'intérêt.
Parmi les exemples variés de gènes rapporteurs, il y a le gène CAT (chloramphenicol acetyl transferase) (Alton et Vapnek, 1979), la luciferase, et d'autres systèmes de détection enzymatiques telles que la beta-galactosidase, la luciferase bactérienne, la phosphatase alcaline, etc. Le produit du gène rapporteur est détecté par une activité intrinsèque associée avec ce produit, par exemple, le gène rapporteur peut coder le produit d'un gène avec une activité détectable par la couleur, la fluorescence, ou la luminescence. Le niveau d'expression du gène rapporteur est alors comparé au niveau d'expression dans la même cellule en l'absence du composé testé. La moindre différence statistique ou d'un autre ordre indique que le composé a d'une manière ou d'une autre altéré l'activité de la ligase. L'invention a également pour objet un procédé pour cribler des composés modulant l'interaction entre un polypeptide à domaine HECT et une protéine partenaire, comprenant les étapes suivantes : a) co-transfecter ou co-transformer une cellule hôte recombinante selon l'une des revendications 11 ou 12 avec un vecteur codant une protéine partenaire, dans un système double-hybride ; b) incuber la cellule hôte obtenue à l'étape a) avec le composé candidat à tester ; c) détecter les modifications dans l'interaction entre le polypeptide à domaine HECT et la protéine partenaire.
L'invention est également relative à un composé modulant l'interaction entre un polypeptide à domaine HECT tel que défini ci- dessus et une protéine partenaire, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu selon le procédé de criblage ci-dessus. L'invention fournit donc des moyens pour stabiliser la cible d'une ubiquitine ligase in vivo en empêchant son ubiquitination et donc sa dégradation. En d'autres termes, ces inhibiteurs empêchent l'interaction de l'ubiquitine ligase avec un polypeptide cible. L'inhibiteur est une petite molécule. Le mécanisme d'inhibition peut être compétitif ou non compétitif, et le polypeptide cible peut être une protéine cellulaire, une protéine codée par un organisme pathogène.
Des inhibiteurs compétitifs efficaces peuvent par exemple empêcher l'interaction entre l'ubiquitine ligase et la protéine cible. Des inhibiteurs non compétitifs peuvent comprendre par exemple des composés qui se lient à une région du polypeptide cible autre que la région d'interaction avec l'ubiquitine ligase et altèrent la structure de la région d'interaction. De tels non-compétiteurs allostériques présentent certains avantages, ils peuvent notamment fournir un très haut degré de spécificité de l'inhibition car ils ne seront pas capables de se lier à d'autres cibles de l'ubiquitine ligase.
Les inhibiteurs compétitifs des ubiquitine ligase peuvent mimer la structure polypeptidique de la région d'interaction de l'ubiquitine ligase ou de la cible. De tels inhibiteurs empêchent le recrutement du polypeptide cible par l'ubiquitine ligase. En fonction de la structure de l'inhibiteur, l'inhibition du recrutement peut être très spécifique de la cible ou affecter le recrutement d'autres polypeptides qui sont la cible de la même ubiquitine ligase. Par exemple, des inhibiteurs spécifiques peuvent mimer la structure WW de la séquence polypeptidique qui interagit avec la protéine cible. Ces inhibiteurs compétitifs des répétitions WW se lient à la protéine cible, empêchant ainsi son interaction avec les répétitions WW d'une protéine à domaine HECT.
D'une manière générale, les molécules recherchées seront des molécules capables d'inhiber ou d'activer l'activité ubiquitine ligase vis à vis de ses substrats grâce notamment à des essais fonctionnels permettant de visualiser in vivo ou in vitro cette activité ubiquitine ligase. Compositions pharmaceutiques
Utilisation thérapeutique des protéines à domaine HECT, de leurs dérivés et de leurs modulateurs L'utilisation thérapeutique d'une protéine à domaine HECT ou d'un de ses dérivés peptidiques peut également être envisagée. Ainsi, les composés ou les méthodes qui augmentent l'activité d'une protéine à domaine HECT peuvent être utilisés dans le traitement de désordres prolifératifs. Les symptômes d'un cancer pourraient ainsi être atténués par l'utilisation d'un composé qui stimule l'activité d'une protéine à domaine HECT. Ainsi, une baisse de l'activité ou d'expression d'une protéine à domaine HECT dont le substrat est un régulateur positif du cycle cellulaire, comme un membre de la famille des cyclines, se traduira par une augmentation de la prolifération cellulaire. Dans ce cas, une augmentation du niveau d'expression ou d'activité de la protéine à domaine HECT pourrait permettre l'amélioration des symptômes
De la même façon, des composés qui diminuent ou inactivent une protéine à domaine HECT, peuvent être utilisés en thérapie pour améliorer les symptômes d'une maladie proliférative. Ainsi, si une protéine à domaine HECT responsable normalement de la dégradation d'un inhibiteur du cycle cellulaire devient trop active suite à une mutation, l'utilisation d'une drogue qui en limite l'activité pourrait s'avérer utile pour limiter certains symptômes de la maladie et notamment la prolifération cellulaire. Dans les cas ou une diminution de la dégradation du substrat est recherchée, l'expression d'un mutant dit « ΔHECT » de la protéine à domaine HECT est également une stratégie de choix pour bloquer la dégradation du substrat. Un mutant « ΔHECT » est un dérivé de la protéine à domaine HECT ne comprenant plus le motif HECT qui aura été délété. Un tel dérivé est capable d'interagir avec le substrat mais n'est plus capable de l'ubiquitiner. Dans ce cas, la surproduction du mutant « ΔHECT » empêche l'ubiquitination et la dégradation concomitante de ce substrat. On parle de stabilisation par protection (ou par "trapping" ).
Les agents thérapeutiques modulant l'activité des protéines à domaine HECT pourront être des acides nucléiques. Ils pourront agir soit d'eux-mêmes comme par exemple des aptamères modulant une interaction, soir par l'intermédiaire de la protéine qu'ils codent comme par exemple des séquences codant pour un peptide servant d'inhibiteur compétitif. Il pourra également s'agir d'acides nucléiques non naturels comprenant des nucléotides modifiés. Dans tous les cas, ils devront être apportés dans la cellule par un vecteur approprié dont la nature sera fonction des progrès des techniques de vectorisation. Il pourra s'agir par exemple de vecteurs d'expression et de pénétration viraux ou bactériens, de système de dispersion colloïdal ou de liposomes. Dans le cas d'acides nucléiques devant être exprimés, ils devront comprendre outre la séquence codante, toutes les séquences permettant l'expression dans les cellules hôtes visées.
Les vecteurs viraux qui peuvent être utilisés pour introduire une séquence d'acide nucléique dans les cellules cibles d'un patient comprennent, sans y être limité, des dérivés des virus de la vaccine, de l'herpès ou de rétrovirus ou de l'adénovirus. Dans tous les cas, les vecteurs utilisés seront défectifs, c'est à dire non pathogène.
Les autres moyens d'introduire les acides nucléiques dans les cellules du patient sont les systèmes de dispersion colloïdal. Ceux ci incluent des complexes macromoléculaires, des nanocapsules, des microsphères, des billes, des systèmes mettant en jeux des émulsions de lipides dans l'eau, des micelles, et des liposomes. Dans le cas des liposomes par exemple, les acides nucléiques sont encapsulés dans une vésicule de membrane artificielle. Introduits dans l'organisme les liposomes fusionnent avec les cibles du patient et délivrent ainsi les acides nucléiques. Préférablement ces liposomes fusionneront préférentiellement avec des cellules spécifiques.
L'invention couvre les plantes ou animaux transgéniques contenant une ou plusieurs des protéines à domaine HECT présentées ici. Ces organismes transgéniques peuvent être obtenus en utilisant la séquence d'acide nucléique de l'invention. Ces organismes transgéniques peuvent être utilisés pour exprimer une protéine à domaine HECT entière ou tronquée, ou pour inactiver une protéine à domaine HECT (knock-out). Ces derniers organismes (souris trangéniques par exemple), mutants pour une protéine à domaine HECT, peuvent notamment être utilisés pour la recherche de drogues qui atténuent ou suppriment les effets de l'absence de la protéine.
Les méthodes pour obtenir de tels organismes transgéniques sont bien connues. Les souris knock-out par exemple sont obtenues par intégration homologue d'une construction dans une cellule souche embryonnaire de souris (cellule ES), construction qui code le gène à inactiver. La séquence de la construction est modifiée et idéalement permet l'intégration conjointe d'un marqueur de sélection positif (un gène de résistance à la néomycine par exemple)au locus du gène à inactiver. Ces changements peuvent alors être introduits dans la lignée germinale de la souris pour générer des individus chimères, (pour détails voir, Doetschman et al., 1985)
L'invention a en outre pour objet une composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace d'un acide nucléique selon l'invention ou d'un vecteur recombinant tel que défini ci- dessus, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
L'invention est également relative à une composition pharmaceutique comprenant une quantité efficace d'un polypeptide à domaine HECT, un fragment ou un variant de ce polypeptide, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
Utilisation diagnostique des protéines à domaine HECT Les régulateurs du cycle cellulaire sont souvent les produits des oncogènes ou des suppresseurs de tumeur. Les protéines à domaine HECT, en tant qu'ubiquitine ligases, pourraient en conséquence être les produits des oncogènes ou de gènes suppresseurs de tumeurs, en fonction des protéines régulatrices du cycle cellulaire dont elles régulent l'abondance. Les protéines à domaine HECT, ses analogues, dérivés et par voie de conséquence les séquences nucléiques des protéines à domaine HECT, ou les anticorps anti-protéines à domaine HECT peuvent donc avoir leur utilité dans le diagnostique. Les séquences nucléiques des nouvelles protéines à domaine HECT peuvent être utilisées pour détecter, pronostiquer ou diagnostiquer des désordres tels que la tumorigénèse, les carcinomes, les adénomes, etc., par la recherche d'éventuelles mutations par exemple (délétions, changements dans la séquence,...). L'activité des ces ubiquitine ligases peut également être testée dans différentes pathologies afin de détecter un éventuel changement dans leur niveau d'expression et leur possible implication dans la pathologie considérée.
Les molécules de l'invention peuvent ainsi être utilisées dans des tests immunologiques utilisant des techniques tels que les immunoblots, rimmunohistochimie par radioisotope, les test ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), l'immunoprécipitation, les test d'immunodiffusion, les tests d'agglutination pour en nommer certains.
Les gènes des protéines à domaine HECT, leur séquence nucléique directe ou complémentaire peuvent aussi être utilisés dans des tests d'hybridation dans le but de détecter, de diagnostiquer des désordres ou maladies associés avec des changements dans l'expression ou l'activité des protéines à domaine HECT. Ces tests d'hybridation sont effectués en mettent en présence un échantillon contenant des acides nucléiques (comme une coupe de tissu) avec une sonde nucléique capable de s'hybrider à de l'ARN ou de l'ADN de protéine à domaine HECT dans des conditions favorables à l'hybridation.
Des maladies ou des désordres induisant la surprolifération cellulaire peuvent être diagnostiqués ou détectés (ou leur prédisposition) en recherchant des baisses d'expressions d'une protéine à domaine
HECT ou de son ARN, ou de son activité (par exemple, l'activité ubiquitine ligase), ou en détectant des mutations dans l'ARN, l'ADN ou la séquence protéique d'une protéine à domaine HECT (par exemple, délétions, translocations) qui causent une diminution de l'expression ou de l'activité. Le niveau de protéine à domaine HECT peut être détecté par immunochimie, le niveau d'ARN par hybridation (northern blot, hybridation in situ). L'activité de la protéine à domaine HECT, peut être détectée en mesurant l'activité ubiquitine ligase E3. Les translocations, délétions et mutations ponctuelles dans les séquences nucléiques des protéines à domaine HECT peuvent être détectées par Southern blot, FISH, analyse RFLP, SSCP, PCR, séquençage.etc. REFERENCES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Acide nucléique codant pour un polypeptide à domaine HECT choisi parmi les séquences d'acides aminés comprenant les séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°11, ou pour un fragment ou un variant du polypeptide choisi parmi les séquences d'acides aminés comprenant les séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°11.
2. Acide nucléique selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide choisi parmi les séquences d'acides aminés
SEQ ID N°1 à SEQ ID N°11 ou pour un fragment ou un variant de ce polypeptide.
3. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucleotide choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID N° 12 à SEQ ID N°22, ainsi que les séquences nucléotidiques qui en sont dérivées et qui comprennent le cadre de lecture ouvert contenu dans les séquences SEQ ID N°12 à SEQ ID N°22.
4. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le fragment du polypeptide à domaine HECT est choisi parmi les séquences en acides aminés suivantes : a) la séquence allant de l'acide aminé en position 1248 jusqu'à l'acide aminé en position 1585 de la séquence SEQ ID N°1 ; b) la séquence allant de l'acide aminé en position 1259 jusqu'à l'acide aminé en position 1624 de la séquence SEQ ID N°2 ; c) la séquence allant de l'acide aminé en position 230 jusqu'à l'acide aminé en position 567 de la séquence SEQ ID N°3 ; d) la séquence allant de l'acide aminé en position 1 153 jusqu'à l'acide aminé en position 1620 de la séquence SEQ ID N°4 ; e) la séquence allant de l'acide aminé en position 742 jusqu'à l'acide aminé en position 1083 de la séquence SEQ ID N°5 ; f) la séquence allant de l'acide aminé en position 481 jusqu'à l'acide aminé en position 823 de la séquence SEQ ID N°6 ; g) la séquence allant de l'acide aminé en position 1 jusqu'à l'acide aminé en position 206 de la séquence SEQ ID N°7 ; h) la séquence allant de l'acide aminé en position 48 jusqu'à l'acide aminé en position 372 de la séquence SEQ ID N°8 ; i) la séquence allant de l'acide aminé en position 618 jusqu'à l'acide aminé en position 947 de la séquence SEQ ID N°9 ; j) la séquence allant de l'acide aminé en position 1235 jusqu'à l'acide aminé en position 1572 de la séquence SEQ ID N°10 ; k) la séquence allant de l'acide aminé en position 373 jusqu'à l'acide aminé en position 694 de la séquence SEQ ID N°11 ;
5. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le variant du polypeptide à domaine HECT est un polypeptide à domaine HECT comprenant une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°11 et dans la séquence duquel la séquence du domaine HECT est totalement ou partiellement délétée.
6. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le polypeptide à domaine HECT ou le fragment ou le variant du polypeptide à domaine HECT est fusionné avec un polypeptide hétérologue.
7. Acide nucléique selon la revendication 6, caractérisé en ce que le polypeptide hétérologue consiste en un marqueur détectable.
8. Acide nucléique selon la revendication 6, caractérisé en ce que le polypeptide hétérologue consiste en un premier partenaire protéique lequel, lorsqu'il interagit spécifiquement avec un second partenaire protéique, a la capacité de se fixer sur un motif d'acide nucléique régulant la transcription d'un gène rapporteur, pour une utilisation dans des systèmes de détection d'interactions du type « double-hybride ».
9. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucleotide régulateur contrôlant l'expression du polypeptide à domaine HECT ou de son fragment ou variant, éventuellement fusionné à un polypeptide hétérologue, dans une cellule hôte.
10. Vecteur recombinant dans lequel a été artificiellement inséré un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9.
11. Cellule hôte recombinante qui a été artificiellement transfectée ou transformée par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à
9 ou par un vecteur recombinant selon la revendication 10.
12. Cellule hôte selon la revendication 11 , caractérisée en ce qu'elle est une cellule eucaryote.
13. Polypeptide à domaine HECT, ou un fragment ou un variant de ce polypeptide, le cas échéant fusionné avec un polypeptide hétérologue, caractérisé en ce qu'il est codé par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9.
14. Polypeptide selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°11.
15. Procédé pour cribler des composés candidats se liant à un polypeptide à domaine HECT, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact un polypeptide selon l'une des revendications 13 ou 14 avec au moins un composé candidat à tester ; b) détecter les complexes éventuellement formés entre ledit polypeptide et le ou les composé(s) candidat(s) .
16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'étape suivante : c) caractériser le ou les composé(s) candidat(s) ayant formé un complexe avec le polypeptide à domaine HECT.
17. Procédé selon l'une des revendications 15 ou 16, caractérisé en ce que le polypeptide à domaine HECT est immobilisé sur un support.
18. Procédé selon l'une des revendications 15 à 17, caractérisé en ce que le ou les composé(s) candidat(s) sont contenus dans le lysat cellulaire d'une culture de cellules eucaryotes, de préférence de cellules humaines.
19. Procédé selon l'une des revendications 15 à 17, caractérisé en ce que le composé candidat est le produit d'expression d'un phage constitutif d'une collection combinatoire de clones de phages.
20. Procédé pour cribler des composés candidats se liant à un polypeptide à domaine HECT, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) cultiver une cellule hôte recombinante selon l'une des revendications 11 ou 12 dans un milieu de culture approprié, de telle manière à ce que ladite cellule hôte produise un polypeptide à domaine HECT selon l'une des revendications 13 ou 14 ; b) détecter les complexes éventuellement formés entre le polypeptide à domaine HECT et d'autres composés produits par la cellule hôte.
21. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un système double-hybride dans lequel : (i) la cellule hôte cultivée à l'étape a) est transfectée avec un acide nucléique codant pour un polypeptide à domaine HECT, un fragment ou un variant de ce polypeptide qui est fusionné avec un polypeptide hétérologue, ledit polypeptide hétérologue consistant en un premier partenaire protéique lequel, lorsqu'il interagit spécifiquement avec un second partenaire protéique, a la capacité de se fixer sur un motif d'acide nucléique régulant la transcription d'un gène rapporteur, et
(ii) la cellule hôte recombinante est en outre co-transfectée avec un acide nucléique codant le composé candidat sous une forme fusionnée avec le second partenaire protéique mentionné en (i).
22. Procédé pour cribler des composés modulant l'interaction entre un polypeptide à domaine HECT et une protéine cible ou un partenaire, comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un polypeptide à domaine HECT selon l'une des revendications 13 ou 14, une protéine cible ou un partenaire et le composé candidat à tester ; b) détecter les complexes éventuellement formés entre le polypeptide à domaine HECT et la protéine cible ou le partenaire.
23. Procédé pour cribler des composés modulant l'interaction entre un polypeptide à domaine HECT et une protéine cible ou un partenaire, comprenant les étapes suivantes : a) co-transfecter ou co-transformer une cellule hôte recombinante selon l'une des revendications 11 ou 12 avec un vecteur codant une protéine cible ou un partenaire, dans un système double-hybride ; b) incuber la cellule hôte obtenue à l'étape a) avec le composé candidat à tester ; c) détecter les modifications dans l'interaction entre le polypeptide à domaine HECT et la protéine cible ou un partenaire.
24. Anticorps dirigé contre un polypeptide selon l'une des revendications 13 ou 14.
25. Amorce nucléotidique hybridant avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9.
26. Amorce nucléotidique selon la revendication 27, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les séquences SEQ ID N°12 à SEQ ID N°22.
27. Sonde nucléotidique hybridant avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9.
28. Composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9 ou d'un vecteur recombinant selon l'une des revendications 1 1 ou 12, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
29. Composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace d'un polypeptide selon l'une des revendication 13 ou 14, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
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