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WO2007007014A2 - Nouveau procede de preparation de nanoparticules de chitine - Google Patents

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WO2007007014A2
WO2007007014A2 PCT/FR2006/050712 FR2006050712W WO2007007014A2 WO 2007007014 A2 WO2007007014 A2 WO 2007007014A2 FR 2006050712 W FR2006050712 W FR 2006050712W WO 2007007014 A2 WO2007007014 A2 WO 2007007014A2
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WO
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acid
nanoparticles
concentration
process according
salt
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PCT/FR2006/050712
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WO2007007014A3 (fr
Inventor
Alain Domard
Christophe Viton
Guillaume Lamarque
Original Assignee
Universite Claude Bernard Lyon I
Centre National De La Recherche Scientique (C.N.R.S.)
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Filing date
Publication date
Application filed by Universite Claude Bernard Lyon I, Centre National De La Recherche Scientique (C.N.R.S.) filed Critical Universite Claude Bernard Lyon I
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Publication of WO2007007014A3 publication Critical patent/WO2007007014A3/fr

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
    • C08J3/12—Powdering or granulating
    • C08J3/14—Powdering or granulating by precipitation from solutions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2305/00—Characterised by the use of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08J2301/00 or C08J2303/00
    • C08J2305/08—Chitin; Chondroitin sulfate; Hyaluronic acid; Derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to a new process for preparing nanoparticles of chitin, as well as nanoparticles that can be obtained by such a process.
  • the vectorisation of active principles is a technique that has grown considerably and has been the subject of much research in recent years, culminating in the design of various forms of colloidal particles, associating an active molecule and a support.
  • the use of drug vectors has the advantage of being able to intervene in the process of distribution of the active ingredient in the body and to increase its effectiveness.
  • the molecule with pharmaceutical activity carried by the support material can be oriented specifically towards the target to be treated or its concentration is then locally high. Efficiency is thus increased, while reducing the necessary doses and also the risk of side effects by impregnation of other organs.
  • colloidal vectors Different types have been developed, mention may be made of nanoparticles, nanocapsules, liposomes, etc.
  • Biopolymers such as chitosan have interesting biological properties and are used in various applications, such as encapsulation of active ingredient to achieve controlled release, and also improve the bioavailability of certain drugs.
  • chitosan Tumor targeted delivery of encapsulated dextran-doxorubicin conjugate using chitosan nanoparticles as carrier, Journal of controlled release 72, 317-323, 2001; CL Bell and NA Peppas, Modulation of drug permeation through interpolymer complexed hydrogels for drug delivery applications, Journal of controlled release 39, 201-207, 1996).
  • Chitosan is a biodegradable and bioabsorbable natural fiber obtained after deacetylation of chitin.
  • Chitin is a biopolymer of high molecular weight, non-toxic, biodegradable and bioabsorbable, and it is with cellulose, the most common polysaccharide in nature.
  • Chitin consists of a linear co-polymer chain whose structure contains glucosamine-type monomers (GIcN) and N-acetyl-D-glucosamine (GIcNAc) monomers linked by a ⁇ (1 ⁇ 4) bond.
  • GcN glucosamine-type monomers
  • GIcNAc N-acetyl-D-glucosamine
  • chitosan is defined as a copolymer of GIcNAc and GIcN repeating units soluble in aqueous solutions under stoichiometric conditions or with a slight excess of acid (eg, an excess of 10% acid over to GIcN units is used) when chitin will only be soluble in dimethylacetamide (DMAc) containing 5 or 8% LiCl (Terbojevich M. et al in Carbohydr Res 1988, 180, 73-86 or in Adv Chitin Sci Domard A.
  • DMAc dimethylacetamide
  • NMP N-methylpyrrolidone
  • the deacetylation reaction of the chitin in chitosan makes it possible to solubilize the copolymer for a DA less than or equal to about 40%
  • the reacetylation (reverse reaction of the previous one) of chitosan to chitin reprecipitates the copolymer only for a DA greater than 77%.
  • This difference in solubility comes, inter alia, from the fact that the deacetylation of chitin, prepared in a heterogeneous medium, leads to a copolymer with long sequences of GIcNAc and GIcN units, whereas the reacetylation of chitosan results in a random copolymer.
  • chitin or chitosan will be indifferently referred to as a copolymer of glucosamine and N-acetyl-D-glucosamine linked by a ⁇ (1 ⁇ 4) bond.
  • a chitin-based nanoparticle Due to its intrinsic chemical structure, a chitin-based nanoparticle is perfectly compatible with biological media and its high biological tolerance has been known for a long time, making it a favorite material for the constitution of vectors of active principles, in particular in the therapeutic, diagnostic, agri-food and cosmetic fields.
  • chitin nanoparticles There are different processes for preparing chitin nanoparticles. These methods generally involve the use of a coreactant. There may be mentioned methods of ionic gelation with TPP, complexation with a polyanion such as DNA or metals. It is also possible to operate by crosslinking with the aid of a synthetic polymer. In addition, some recent publications have studied the formation of chitosan aggregates with chitosan alone.
  • the solution is then neutralized with a base to a critical pH at which the solution begins to precipitate to form coacervates which are stable only for a very small pH window. Moreover, with this method, it is impossible to concentrate the solutions obtained, in order to achieve high solid rates.
  • the subject of the present invention is a process for the preparation of chitin nanoparticles in which glucosamine and N-acetyl-D-glucosamine copolymer chains linked by a ⁇ (1 ⁇ 4) bond, which have a degree of acetylation means DA greater than or equal to 50% and a degree of polymerization by weight DP W greater than or equal to 1500, are dispersed at a concentration C at least equal to the concentration C * of entanglement of the copolymer chains, in a aqueous solution whose pH is between 1 and 8, said aqueous solution being obtained by mixing in an aqueous solution of an acid and a salt.
  • said method has one or more of the following technical characteristics taken in combination, when they do not exclude each other:
  • the acid is chosen from hydrochloric acid, perchloric acid, acetic acid, formic acid, chloroacetic acid, citric acid, picric acid, ascorbic acid and fatty acids; comprising up to 12 carbon atoms; acetic acid is preferably used,
  • the salt is chosen from the salts of the acids stated above; ammonium acetate is preferably used,
  • the aqueous solution contains from 0.05 to 5 mol / L of salt, preferably from 0.1 to 0.5 mol / L of salt,
  • the aqueous solution has a pH in the range from 2 to 7.5, preferably in the range of 4.5 to 7.5, the copolymer chains are random,
  • the copolymer chains have a polymolecularity index Ip of less than 2, preferably less than 1.6 and preferably less than 1.3,
  • the concentration C is in the range from 5 times C * to 10 times C *
  • the concentration C is in the range of 6 times C * to 7 times C *
  • the concentration C is less than or equal to 7 times C *, the appearance of nanoparticles then taking place spontaneously; after the appearance of nanoparticles, the concentration C of the copolymer is lowered by dilution,
  • the concentration C is greater than 7 times C * and after appearance of a gel or nanoparticles, the concentration C of the copolymer is lowered by dilution, the dilution is chosen so as to adjust the size of the nanoparticles, the nanoparticles formed have a mean diameter of between 50 nm and 1 ⁇ m.
  • the subject of the present invention is also nanoparticles that can be obtained according to the method defined above, as well as vectors of molecules of biological interest comprising such nanoparticles in association with at least one molecule of biological interest.
  • nanoparticles of chitin will be called spherical objects of nanometric size formed by a combination of glucosamine and N-acetyl-D-glucosamine copolymer chains linked by a ⁇ -linkage, (1 ⁇ 4). .
  • These nanoparticles are solvated in aqueous solution and have a mean diameter, for example, between 50 nanometers and 1 micrometer, and preferably between 200 and 400 nanometers.
  • the degree of acetylation of a chitin copolymer is the molar fraction x 100 of the GIcNAc units over the total number of GIcN and GIcNAc units.
  • the DA may be determined by 1 H NMR spectroscopy as described by Hirai et al. Polym. Bull. 1991, 26, 87.
  • the weight average polymerization degrees DP W of the chitin copolymers are determined by light scattering in batch mode as described in Biomacromolecules, 2005, 6 (1), page 133, using the values of the ratio dn / dc as described by Schatz et al. Biomacromolecules, 2003, 4, 641.
  • the entanglement concentration C * of the copolymer chains can be defined as the concentration from which the copolymer chains are no longer isolated in solution. This concentration is determined according to the method described in the publication Biomacromolecules, 2005, 6 (1) 133, using a capillary viscometer (of the automatic Ubellohde type having an internal diameter of 0.53 mm) or a dynamic viscometer, considering that C * corresponds to 1 / intrinsic viscosity.
  • FIGS. 1 to 3 are nanoparticle transmission electron microscope views obtained according to the method of the invention.
  • Figure 3 shows the influence of concentration C in chitin copolymer.
  • the image on the left shows the nanoparticles obtained with a concentration C greater than C *.
  • the following images show the evolution of the nanoparticles when, once the nanoparticles of the image on the left obtained, the concentration C is lowered by addition of solvent, to obtain a concentration lower than C *.
  • the chitin copolymer must be dispersed at a concentration greater than its entangling concentration C *. Once the nanoparticles are formed, it is then possible to reduce this concentration.
  • the process according to the invention is extremely simple since it consists in dispersing glucosamine and N-acetyl-D-glucosamine copolymer chains linked by a ⁇ , (1 ⁇ 4) linkage of DA and DP in an aqueous solution. in particular in a buffered aqueous solution of acetic acid and ammonium acetate, for example consisting of 0.2 M acetic acid and 0.15 M ammonium acetate. In contrast to the techniques of the prior art no co-reagent is used for the formation of nanoparticles.
  • the chitin copolymer used must fulfill the following conditions: it must have a mean degree of acetylation DA greater than or equal to 50%. This parameter plays not only on the sphericity of particles that lose their sphericity for weaker DAs, but also, on a smaller scale, on the size of nanoparticles that are smaller for weaker DAs, as shown in Figure
  • the average degree of polymerization DP W of the copolymer chains must be greater than or equal to 1500, and preferably greater than or equal to 1600. This parameter not only affects the sphericity of the particles, which are less spherical for more DPs. weak, but also, on a smaller scale, on their size which decreases for weak DP as illustrated in FIG. 2,
  • the copolymer used is preferably random, which promotes the solubility of the copolymers for high DAs and DPs as defined above.
  • the concentration of copolymers within the solution is also an extremely important parameter.
  • the polymer must be highly concentrated during the solubilization / dispersion, and it is introduced into the aqueous solution with a concentration greater than its critical concentration of C * entanglement.
  • the concentration of solubilization of the polymer When the concentration of solubilization of the polymer is very concentrated, the objects obtained lose sphericity and have large sizes and are dispersed in size. Once the nanoparticles have been formed, it is then possible to lower the concentration, or even below the C * concentration, by adding aqueous solution to then obtain perfectly spherical nanoparticles of smaller size and practically monodisperse. On the other hand, if one operates at initial concentrations lower than the C * concentration, it is almost impossible to form nanoparticles.
  • the influence of the dissolution on the size of the particles obtained is presented in FIG.
  • the solution in which the copolymer is dissolved is an aqueous solution of pH between 1 and 8. This solution may be a buffered solution.
  • the acid which makes it possible to obtain the aqueous solution is, for example, chosen from hydrochloric acid, perchloric acid, acetic acid, formic acid, chloroacetic acid, citric acid and the acid. picric acid, ascorbic acid and fatty acids comprising up to 12 carbon atoms; acetic acid is preferably used.
  • the salt it is possible to use especially the salts of the aforementioned acids, such as ammonium acetate. In particular, a corresponding acid / salt pair will be used.
  • acetic acid and ammonium acetate will preferably be used.
  • the salt is introduced so as to finally obtain in the aqueous solution from 0.05 to 5 mol / l of salt, preferably from 0.1 to 0.5 mol / l of salt.
  • the aqueous solution has a pH in the range of 1 to 8, preferably a pH in the range of 2 to 7.5, preferably in the range of 4.5 to 7.5.
  • a buffer solution of ammonium acetate and acetic acid of approximately pH 4.5 is preferably used.
  • the dispersion of the chitin copolymer chains in the aqueous solution is generally obtained with vigorous stirring, for example by means of any suitable mechanical means, advantageously with a speed of 1000 to 2000 rpm.
  • the nanoparticles have been formed, it is also possible to reduce the ionic strength of the solution, for example up to 0.01 mol / l of salt, with the same salt, or it is also possible to change salt and water.
  • the nanoparticles formed are stable over time, in the formation solvent. It is also possible to concentrate them by ultrafiltration without collapsing and it is also possible to centrifuge and redisperse.
  • the nanoparticles obtained are isodispersed in diameter, that is to say that the size distribution of a set of nanoparticles obtained by dynamic laser scattering is very narrow.
  • a dispersion of nanoparticles will be obtained in which at least 90% of the particles have a diameter between the mean diameter d 5 o (diameter below which it is found
  • the chitin nanoparticles according to the invention may comprise one or more molecules of biological interest.
  • the molecules of biological interest can be complexed on the surface of the nanoparticle or trapped in the latter.
  • the association of the molecule of biological interest with the copolymer chains is, for example, by Van der WaIs force or ionic interaction.
  • the molecule or molecules of biological interest can therefore be introduced either on the nanoparticles already formed, or during their preparation. It is for example possible to disperse the chains of copolymers in a solution already containing a molecule of biological interest.
  • the particles formed can be used in a wide variety of applications in many industrial fields, in particular: human and veterinary medicine, cosmetics, chemistry, agrochemicals and food.
  • the molecule of biological interest will then be chosen according to the application.
  • the desired copolymers of DA and DP are prepared according to method described in the publication Biomacromolecules, 2005, 6, 131-142.
  • 60.1 and 70.5 are dissolved in AcOH (0.2M) / AcONH 4 (0.15M) acetic acid buffer at different concentrations above C *, in particular between 5 and 7 times C *.
  • the pH of the acetic buffer is 4.5. After vigorous stirring, the nanoparticles form spontaneously in the solution.
  • the nanoparticles are characterized in solution by SLS (static light scattering) and by DLS (dynamic light scattering) and after elimination of the solution by transmission electron microscopy (TEM).
  • SLS static light scattering
  • DLS dynamic light scattering
  • TEM transmission electron microscopy
  • C * is prepared from 0.45 g of chitosan of degree of polymerization equal to 2600 and a degree of acetylation equal to 70% introduced into 100 ml of the aqueous solution described above.
  • the assembly is placed under mechanical stirring at 1250 rpm for 8 h.
  • the nanoparticles obtained have a mean diameter of between 450 and 550 nm.
  • EXAMPLE 2 Formation of Chitosan Nanoparticles of Size Between 50 and 100 nm
  • An aqueous solution of acetic acid (CH 3 COOH) and ammonium acetate (CH 3 COONH 4 ) at pH 4.5 is prepared as in Example 1.
  • a solution of chitosan obtained by reacetylation, of equal concentration 9 times C * is obtained starting from 0.58 g of chitosan of degree of polymerization equal to 2600 and degree of acetylation equal to 70% introduced into 100 ml of the aqueous solution of acetic acid and acetate of The mixture is placed under mechanical stirring at 1250 rpm for 8 hours.
  • the size, the dispersion and the shape of the nanoparticles obtained in Examples 1 and 2 were evaluated by transmission electron microscopy, and the data obtained confirm the analyzed size in static and dynamic scattering of light.

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Abstract

Procédé de préparation de nanoparticules de chitine dans lequel des chaînes copolymère de glucosamine et de N-acétyl-D-glucosamine liés par une liaison ß,(l?4), qui présentent un degré moyen d'acétylation DA supérieur ou égal à 50 % et un degré de polymérisation moyen en poids DP<SUB>W</SUB> supérieur ou égal à 1500, sont dispersées à une concentration C au moins égale à la concentration C* d'enchevêtrement des chaînes copolymères, dans une solution aqueuse dont le pH est compris entre 1 et 8, la dite solution étant obtenue par mélange en solution aqueuse d'un acide et d'un sel.

Description

NOUVEAU PROCEDE DE PREPARATION DE NANOPARTICULES DE CHITINE
La présente invention a pour objet un nouveau procédé de préparation de nanoparticules de chitine, ainsi que les nanoparticules susceptibles d'être obtenues par un tel procédé.
La vectorisation de principes actifs est une technique qui a pris un essor considérable et fait l'objet de nombreuses recherches ces dernières années, aboutissant à la conception de diverses formes de particules colloïdales, associant une molécule active et un support. Dans le domaine médical, l'utilisation de vecteurs médicamenteux présente l'avantage de pouvoir intervenir sur le processus de distribution du principe actif dans l'organisme et d'en augmenter l'efficacité. La molécule à activité pharmaceutique portée par le matériau support peut être orientée spécifiquement vers la cible à traiter ou sa concentration est alors localement élevée. L'efficacité est ainsi accrue, tout en diminuant les doses nécessaires et par là aussi les risques d'effet secondaire par imprégnation d'autres organes.
Différents types de vecteurs colloïdaux ont été développés, on peut citer les nanoparticules, les nanocapsules, les liposomes...
Les biopolymères, tel que le chitosane, présentent des propriétés biologiques intéressantes et sont utilisés dans diverses applications, comme l'encapsulation de principe actif permettant d'obtenir une libération contrôlée, et également d'améliorer la biodisponibilité de certaines drogues. (U. Ga u r et al. Tumour targeted delivery of encapsulated dextran-doxorubicin conjugate using chitosan nanoparticules as carrier, Journal of controlled release 72, 317-323, 2001; C. L. Bell et N. A. Peppas, Modulation of drug permeation through interpolymer complexed hydrogels for drug delivery applications, Journal of controlled release 39, 201-207, 1996).
Le chitosane est une fibre d'origine naturelle biodégradable et biorésorbable, obtenue après désacétylation de la chitine. La chitine est un biopolymère de haut poids moléculaire, non toxique, biodégradable et biorésorbable, et c'est avec la cellulose, le polysaccharide le plus répandu dans la nature.
La chitine est constituée d'une chaîne co-polymère linéaire dont la structure contient des monomères de type glucosamine (GIcN) et des monomères N-acétyl-D-glucosamine (GIcNAc) liés par une liaison β,(l→ 4). L'extraction de la chitine à partir de carapace de crustacés et/ou d'endosquelettes de calamars, se fait usuellement par voie chimique, puis la transformation par désacétylation de la chitine dans de la soude concentrée permet d'obtenir du chitosane. Le chitosane est donc obtenu en enlevant suffisamment de groupements acétyles pour permettre à la macromolécule d'être soluble dans la plupart des acides dilués.
Il n'existe pas, à ce jour, de nomenclature officielle différenciant la chitine du chitosane en fonction de son DA. Il est cependant admis que le chitosane est défini comme un copolymère d'unités de répétition GIcNAc et GIcN soluble dans des solutions aqueuses dans des conditions stoechiométriques ou avec un léger excès d'acide (par exemple, un excès de 10 % en acide par rapport aux unités GIcN est utilisé) lorsque la chitine ne sera soluble que dans le diméthylacétamide (DMAc) contenant 5 ou 8 % de LiCI (Terbojevich M. et al. dans Carbohydr. Res. 1988, 180, 73-86 ou dans Adv. Chitin Sci. Domard A. ét al. - G.A.F. Eds. 1996, 1, 333-339). ou la N- méthylpyrrolidone (NMP) (Austin P.R. et al. Chitin and Chitosan, Skjak-Braek et al. - P. Eds. 1989, 749-755). La condition de solubilité du chitosane est satisfaite dans la plupart des cas pour des DA < 40 %. Cependant, le DA critique où le chitosane devient soluble dans l'eau faiblement acide dépend de nombreux paramètres comme son degré de polymérisation moyen en masse (DPW), son pK intrinsèque (pK0) (Sorlier P. et al. Biomacromol. 2001, 2, 765-772) le pH et la force ionique (Anthonsen M. ét al. Carbohydr. Polym. 1994, 25, 13-23) de la solution, mais surtout du procédé d'obtention du copolymère (Sannan T. et al. dans Makromol. Chem. 1975, 176, 1191-1195 ou dans Makromol. Chem. 1976, 177, 3589-3600 ; Ottoy M. H. et al. Carbohydr. Polym. 1996, 29, 17-24). Si la réaction de désacétylation de la chitine en chitosane permet de solubiliser le copolymère pour un DA inférieur ou égal à 40 % environ, la réacétylation (réaction inverse de la précédente) du chitosane en chitine ne reprécipite le copolymère que pour un DA supérieur à 77%. Cette différence de solubilité vient, entre autre, du fait que la désacétylation de la chitine, préparée en milieu hétérogène, mène à un copolymère à longues séquences d'unités GIcNAc et GIcN, alors que la réacétylation du chitosane aboutit à un copolymère statistique.
Dans la suite de la description, on nommera indifféremment chitine ou chitosane un copolymère de glucosamine et de N-acétyl-D-glucosamine liées par une liaison β, (1→4).
De par sa structure chimique intrinsèque, une nanoparticule à base de chitine est parfaitement compatible avec les milieux biologiques et sa haute tolérance biologique est connue depuis longtemps, ce qui en fait donc un matériau de prédilection pour la constitution de vecteurs de principes actifs, notamment, dans le domaine thérapeutique, diagnostique, agroalimentaire et cosmétique.
Il existe différents procédés de préparation de nanoparticules de chitine. Ces procédés font généralement appel à l'utilisation d'un coréactif. On peut citer des procédés de gélification ionique avec du TPP, de complexation avec un polyanion comme l'ADN ou des métaux. Il est également possible d'opérer par réticulation à l'aide d'un polymère synthétique. Par ailleurs, quelques publications récentes ont étudié la formation d'agrégats de chitosane avec le chitosane seul.
Tout d'abord, la conformation des agrégats formés avec le chitosane seul en solution, par microscopie électronique à transmission (MET) et diffusion de la lumière statique a été étudiée dans une publication de Carbohydr.Polym. 1994, 25, 13-23. Les objets formés sont en forme de bâtonnets et sont très disperses en taille. Plus récemment, les inventeurs de la présente demande de brevet se sont intéressés dans Biomacromol. 2003, 4, 641-648 au comportement en solution du chitosane en fonction de son DA et pour un DP unique de 1000. Dans Langmuir, 2003, 19(23), 9896-9903, les inventeurs ont utilisé différents chitosanes de DPW = 1 000 et de DA différents, qui sont solubilisés en solution dans des conditions légèrement acides. La solution est ensuite neutralisée à l'aide d'une base jusqu'à un pH critique par lequel la solution commence à précipiter, pour former des coacervats qui ne sont stables que pour une fenêtre de pH très restreint. De plus, avec cette méthode, il est impossible de concentrer les solutions obtenues, afin d'atteindre des taux de solide importants.
Enfin, les inventeurs ont étudié dans Biomacromolecules 2005, 6, 131- 142, dans un tampon d'acétate de sodium à pH = 4,5, les propriétés physicochimiques de 4 séries différentes de chitosane avec des degrés d'acétylation (DA) et des degrés de polymérisation moyen en poids (DPW) variant respectivement entre 0 et 70 % et entre 650 et 2600.
Jusqu'à présent, aucun de ces travaux n'a permis d'aboutir à un procédé de préparation de nanoparticules de chitine sphériques qui soit simple, économique et facilement industrialisable et qui, de plus, conduise à une stabilité améliorée des nanoparticules formées, et ce sans ajout de co- réactif.
C'est justement un des objectifs que se propose d'atteindre la présente invention.
Dans ce contexte, la présente invention a pour objet un procédé de préparation de nanoparticules de chitine dans lequel des chaînes copolymère de glucosamine et de N-acétyl-D-glucosamine liées par une liaison β,(l→ 4), qui présentent un degré moyen d'acétylation DA supérieur ou égal à 50 % et un degré de polymérisation moyen en poids DPW supérieur ou égal à 1500, sont dispersées à une concentration C au moins égale à la concentration C* d'enchevêtrement des chaînes copolymères, dans une solution aqueuse dont le pH est compris entre 1 et 8, ladite solution aqueuse étant obtenue par mélange en solution aqueuse d'un acide et d'un sel. Selon des variantes préférées de l'invention, le dit procédé présente une ou plusieurs des caractéristiques techniques suivantes prises en combinaison, lorsqu'elles ne s'excluent pas l'une l'autre :
- l'acide est choisi parmi l'acide chlorhydrique, l'acide perchlorique, l'acide acétique, l'acide formique, l'acide chloroacétique, l'acide citrique, l'acide picrique, l'acide ascorbique et les acides gras comprenant jusqu'à 12 atomes de carbone ; l'acide acétique est préférentiellement utilisé,
- le sel est choisi parmi les sels des acides énoncés ci-dessus ; l'acétate d'ammonium est préférentiellement utilisé,
- la solution aqueuse contient de 0,05 à 5 mol/L de sel, de préférence de 0,1 à 0,5 mol/L de sel,
- la solution aqueuse présente un pH compris dans la gamme allant de 2 à 7,5, de préférence dans la gamme allant de 4,5 à 7,5, - les chaînes de copolymères sont statistiques,
- les chaînes de copolymères présentent un indice de polymolécularité Ip inférieur à 2, de préférence inférieur à 1,6 et préférentiellement inférieur à 1,3,
- la concentration C est comprise dans la gamme allant de 5 fois C* à 10 fois C*,
- la concentration C est comprise dans la gamme allant de 6 fois C* à 7 fois C*,
- la concentration C est inférieure ou égale à 7 fois C*, l'apparition de nanoparticules se faisant alors spontanément, - après apparition de nanoparticules, la concentration C en copolymère est abaissée par dilution,
- la concentration C est supérieure à 7 fois C* et après apparition d'un gel ou de nanoparticules, la concentration C en copolymère est abaissée par dilution, - la dilution est choisie de façon à ajuster la taille des nanoparticules, - les nanoparticules formées présentent un diamètre moyen compris entre 50 nm et 1 μm.
La présente invention a également pour objet des nanoparticules susceptibles d'être obtenues selon le procédé ci-dessus défini, ainsi que des vecteurs de molécules d'intérêt biologique comportant de telles nanoparticules en association avec au moins une molécule d'intérêt biologique.
Avant de décrire plus en détails l'invention, certaines définitions des termes employés vont être rappelées. Dans le cadre de l'invention, on nommera nanoparticules de chitine, des objets sphériques de taille nanométrique formés d'une association de chaînes copolymères de glucosamine et de N-acétyl-D-glucosamine liés par une liaison β, (1→4). Ces nanoparticules sont solvatées en solution aqueuse et présentent un diamètre moyen, par exemple, compris entre 50 nanomètres et 1 micromètre, et de préférence compris entre 200 et 400 nanomètres.
Le degré d'acétylation d'un copolymère de chitine est la fraction molaire x 100 des unités GIcNAc sur le nombre total d'unités GIcN et GIcNAc. Les DA peuvent être déterminés par spectroscopie RMN1H comme décrit par Hirai et al. Polym. Bull. 1991, 26, 87. Les degrés moyens de polymérisation en poids DPW des copolymères de chitine sont déterminés par diffusion de la lumière en mode batch comme décrit dans Biomacromolecules, 2005, 6(1), page 133, en utilisant les valeurs du rapport dn/dc comme décrit par Schatz et al. Biomacromolecules, 2003, 4, 641. La concentration C* d'enchevêtrement des chaînes copolymères peut être définie comme la concentration à partir de laquelle les chaînes copolymères ne sont plus isolées en solution. Cette concentration est déterminée selon la méthode décrite dans la publication Biomacromolecules, 2005, 6(1) 133, à l'aide d'un viscosimètre capillaire (du type Ubellohde automatique présentant un diamètre interne de 0,53 mm) ou un viscosimètre dynamique, en considérant que C* correspond à 1/viscosité intrinsèque. La description qui suit, en référence aux figures annexées, permet de mieux comprendre l'invention.
Les figures 1 à 3 sont des vues au microscope électronique à transmission de nanoparticules obtenues selon le procédé de l'invention. La figure 1 montre des vues de nanoparticules obtenues dans les mêmes conditions, avec un copolymère de chitine de DA = 50% et de DPW = 2600 (image de gauche), et avec un copolymère de chitine de DA = 70% et de DPW = 2600 (image de droite).
La figure 2 montre, des vues de nanoparticules obtenues dans les mêmes conditions, avec un copolymère de chitine de DA = 70% et de DPW = 2200 (image de gauche), et avec un copolymère de chitine de DA = 70% et de DPW = 2600 (image de droite).
La figure 3 montre l'influence de la concentration C en copolymère de chitine. L'image de gauche montre les nanoparticules obtenues avec une concentration C supérieure à C*. Les images suivantes montrent l'évolution des nanoparticules quand, une fois les nanoparticules de l'image de gauche obtenue, on abaisse la concentration C, par addition de solvant, pour obtenir une concentration inférieure à C*.
Selon une des caractéristiques essentielles de l'invention, le copolymère de chitine doit être dispersé à une concentration supérieure à sa concentration C* d'enchevêtrement. Une fois les nanoparticules formées, il est alors possible de diminuer cette concentration.
Le procédé selon l'invention est extrêmement simple puisqu'il consiste à disperser des chaînes copolymère de glucosamine et de N-acétyl-D- glucosamine liés par une liaison β,(l→4) de DA et DP particulier dans une solution aqueuse, en particulier dans une solution aqueuse tamponnée d'acide acétique et d'acétate d'ammonium, par exemple constituée d'acide acétique 0,2 M et d'acétate d'ammonium 0,15 M. Contrairement aux techniques de l'art antérieur, aucun co-réactif n'est utilisé pour la formation des nanoparticules. Le copolymère de chitine mis en œuvre doit remplir les conditions suivantes : - il doit présenter un degré moyen d'acétylation DA supérieur ou égal à 50 %. Ce paramètre joue non seulement sur la sphéricité des particules qui perdent de leur sphéricité pour des DA plus faibles, mais également, à moindre échelle, sur la taille des nanoparticules qui sont plus petites pour des DA plus faibles, comme illustré figure
1,
- Le degré de polymérisation moyen DPW des chaînes de copolymère doit être supérieur ou égal à 1 500, et de préférence supérieur ou égal à 1 600. Ce paramètre joue non seulement sur la sphéricité des particules, qui sont moins sphériques pour des DP plus faibles, mais également, à moindre échelle, sur leur taille qui diminue pour des DP faibles comme illustré figure 2,
- Le copolymère utilisé est de préférence statistique, ce qui favorise la solubilité des copolymères pour les DA et DP élevés tels que définis ci-dessus.
La concentration en copolymères au sein de la solution est également un paramètre extrêmement important. Le polymère doit être très concentré lors de la solubilisation/dispersion, et il est introduit dans la solution aqueuse avec une concentration supérieure à sa concentration critique d'enchevêtrement C*.
Lorsque la concentration de solubilisation du polymère est très concentrée, les objets obtenus perdent en sphéricité et présentent des tailles importantes et sont disperses en taille. Une fois les nanoparticules formées, il est alors possible d'abaisser la concentration, voire en dessous de la concentration C*, en ajoutant de la solution aqueuse pour obtenir alors des nanoparticules parfaitement sphériques de plus petite taille et pratiquement monodisperses. Par contre, si l'on opère à des concentrations initiales inférieures à la concentration C*, il est quasi impossible de former des nanoparticules. L'influence de la dissolution sur la taille des particules obtenues est présentée figure 3. La solution dans laquelle le copolymère est dissout est une solution aqueuse de pH compris entre 1 et 8. Cette solution pourra être une solution tamponnée. L'acide permettant d'obtenir la solution aqueuse est, par exemple, choisi parmi l'acide chlorhydrique, l'acide perchlorique, l'acide acétique, l'acide formique, l'acide chloroacétique, l'acide citrique, l'acide picrique, l'acide ascorbique et les acides gras comprenant jusqu'à 12 atomes de carbone ; l'acide acétique est préférentiellement utilisé. En tant que sel, on peut notamment utiliser les sels des acides susmentionnés, tel que l'acétate d'ammonium. En particulier, on utilisera un couple acide/sel correspondant. Avantageusement, l'acide acétique et l'acétate d'ammonium seront préférentiellement utilisés. Le sel est introduit de façon à obtenir au final dans la solution aqueuse de 0,05 à 5 mol/L de sel, de préférence de 0,1 à 0,5 mol/L de sel. Par ailleurs, la solution aqueuse présente un pH compris dans la gamme allant de 1 à 8, avantageusement, un pH compris dans la gamme allant de 2 à 7,5, de préférence dans la gamme allant de 4,5 à 7,5. Une solution tampon d'acétate d'ammonium et d'acide acétique de pH 4,5 environ est préférentiellement mise en œuvre.
La dispersion des chaînes de copolymères de chitine dans la solution aqueuse est généralement obtenue sous agitation vive, par exemple, au moyen de tout moyen mécanique approprié, avantageusement avec une vitesse de 1000 à 2000 rpm.
On assiste, tout d' abord à une solubilisation des chaînes de copolymère, mais très rapidement, les nanoparticules se forment, le plus souvent, de manière spontanée. Pour les concentrations très élevées en copolymère, un gel est formé au lieu des nanoparticules, notamment pour des systèmes très concentrés dont la concentration est supérieure à 7 fois C*. Il est alors possible de diluer l'échantillon à des concentrations plus faibles, de façon à former des nanoparticules. Une fois le gel ou les nanoparticules formées, la concentration en polymère ne joue un rôle que sur la taille, la forme et le nombre des nanoparticules formées. Par conséquent, il est possible de solubiliser un chitosane de DA 70 %, de DP de 1 600 à une concentration de 9C* pour former un gel, puis de le diluer pour former des nanoparticules, par exemple à une concentration égale à 5 fois C*, puis de redescendre encore cette concentration pour arriver à former des nanoparticules plus petites, plus sphériques et moins disperses en taille jusqu'à une concentration inférieure à C*. Pour des concentrations finales correspondant à 0,1 C*, on peut atteindre des particules de taille très petites, par exemple de l'ordre de 50 nm.
Une fois les nanoparticules formées, il est également possible de diminuer la force ionique de la solution, par exemple jusqu'à 0,01 mol/L de sel, avec le même sel, ou bien il est également possible de changer de sel et d'utiliser du NaCI par exemple, notamment par transfert de solvant avec une cellule d'ultrafiltration. Ces variations ont une influence sur la taille, le nombre et la forme des nanoparticules finales obtenues.
Par ailleurs, les nanoparticules formées sont stables dans le temps, dans le solvant de formation. Il est possible également de les concentrer par ultrafiltration sans qu'elles collapsent et il est également possible de les centrifuger et de les redisperser. De façon avantageuse, les nanoparticules obtenues sont isodisperses en diamètre, c'est-à-dire que la distribution en taille d'un ensemble de nanoparticules obtenue par diffusion laser dynamique est très resserrée. Notamment, on obtiendra une dispersion de nanoparticules dans laquelle au moins 90% des particules ont un diamètre compris entre le diamètre moyen d5o (diamètre en dessous duquel on trouve
50% de la masse des particules) de la dispersion, plus ou moins 20% du d50.
Les nanoparticules de chitine selon l'invention peuvent comporter une ou plusieurs molécules d'intérêt biologique. Les molécules d'intérêt biologique peuvent être complexées en surface de la nanoparticule ou piégées dans cette dernière. L'association de la molécule d'intérêt biologique aux chaînes copolymères se fait, par exemple, par force de Van der WaIs ou interaction ionique. La ou les molécules d'intérêt biologique peuvent donc être introduites soit sur les nanoparticules déjà formées, soit lors de leur préparation. Il est par exemple possible de disperser les chaînes de copolymères dans une solution contenant déjà une molécule d'intérêt biologique.
Les particules formées pourront être utilisées dans des applications très variées dans de nombreux domaines industriels notamment : en médecine humaine et vétérinaire, cosmétique, chimie, agrochimie, alimentaire. La molécule d'intérêt biologique sera alors choisie en fonction de l'application. A titre d'exemple, on peut citer, les protéines, ADN, fragments d'ADN, antibiotiques, hormones, oligoéléments de nature organique ou sous forme d'ions métalliques ... Les copolymères de DA et de DP désirés sont préparés selon la méthode décrite dans la publication Biomacromolecules, 2005, 6, 131-142.
Les lots présentés au tableau I (lot 114 présentant un DA de 59,9 et de 66, lot 124 présentant un DA de 59,7 et de 71 et lot 154 présentant un DA de
60,1 et de 70,5 sont dissous dans un tampon acétique AcOH(0,2M)/AcONH4(0,15M) à différentes concentrations supérieures à C*, notamment comprises entre 5 et 7 fois C*.
Le pH du tampon acétique est 4,5. Après agitation vigoureuse, les nanoparticules se forment spontanément dans la solution.
Les nanoparticules sont caractérisées en solution par SLS (diffusion de la lumière statique) et par DLS (diffusion de la lumière dynamique) et après élimination de la solution par microscopie électronique à transmission (MET).
Exemple 1 : Formation de nanoparticules de chitosane de taille comprise entre 450 et 550 nm Une solution aqueuse d'acide acétique (CH3COOH) et d'acétate d'ammonium
(CH3COONH4) est préparée en mélangeant :
11 mL d'acide acétique et 11,6 g d'acétate d'ammonium dans 1 litre d'eau distillée désionisée pendant environ 30 min. Le pH final de la solution obtenue est égal à 4,5. Une solution de chitosane obtenu par réacétylation, de concentration égale à
7 fois C* est préparée à partir 0,45 g de chitosane de degré de polymérisation égal à 2600 et de degré d'acétylation égal à 70% introduit dans 100 ml_ de la solution aqueuse décrite ci-dessus. L'ensemble est placé sous agitation mécanique à 1250 rpm pendant 8 h. Les nanoparticules obtenues ont un diamètre moyen compris entre 450 et 550 nm. Exemple 2 : Formation de nanoparticules de chitosane de taille comprise entre 50 et 100 nm
Une solution aqueuse d'acide acétique (CH3COOH) et d'acétate d'ammonium (CH3COONH4) à pH 4,5 est préparée comme dans l'exemple 1. Une solution de chitosane obtenu par réacétylation, de concentration égale à 9 fois C* est obtenue en partant de 0,58 g de chitosane de degré de polymérisation égal à 2600 et de degré d'acétylation égal à 70% introduit dans 100 mL de la solution aqueuse d'acide acétique et d'acétate d'ammonium décrite dans l'exemple 1. L'ensemble est placé sous agitation mécanique à 1250 rpm pendant 8 h. Cette solution est ensuite diluée en ajoutant 900 mL (C= 0,9 C*) de la solution aqueuse à pH=4,5 à la solution précédente. L'ensemble est agité pendant une heure. On obtient alors des nanoparticules de diamètre moyens compris entre 50 et 100 nm.
La taille, la dispersion et la forme des nanoparticules obtenues aux exemples 1 et 2 ont été appréciées par microscopie électronique à transmission, et les données obtenues confirment la taille analysée en diffusion statique et dynamique de la lumière.

Claims

REVENDICATIONS
1 - Procédé de préparation de nanoparticules de chitine dans lequel des chaînes copolymère de glucosamine et de N-acétyl-D-glucosamine liés par une liaison β,(l-*4), qui présentent un degré moyen d'acétylation DA supérieur ou égal à 50 % et un degré de polymérisation moyen en poids DPW supérieur ou égal à 1500, sont dispersées à une concentration C au moins égale à la concentration C* d'enchevêtrement des chaînes copolymères, dans une solution aqueuse dont le pH est compris entre 1 et 8, la dite solution étant obtenue par mélange en solution aqueuse d'un acide et d'un sel. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'acide est choisi parmi l'acide chlorhydrique, l'acide perchlorique, l'acide acétique, l'acide formique, l'acide chloroacétique, l'acide citrique, l'acide picrique, l'acide ascorbique et les acides gras comprenant jusqu'à 12 atomes de carbone. 3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'acide est l'acide acétique.
4 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le sel est un sel de l'acide chlorhydrique, de l'acide perchlorique, de l'acide acétique, de l'acide formique, de l'acide chloroacétique, de l'acide citrique, de l'acide picrique, de l'acide ascorbique ou d'un acide gras comprenant jusqu'à 12 atomes de carbone.
5 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le sel est l'acétate d'ammonium.
6 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la solution aqueuse contient de 0,05 à 5 mol/L de sel, de préférence de 0,1 à
0,5 mol/L de sel.
7 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la solution aqueuse présente un pH compris dans la gamme allant de 2 à 7,5, de préférence dans la gamme allant de 4,5 à 7,5. 8 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les chaînes de copolymères sont statistiques. 9 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les chaînes de copolymères présentent un indice de polymolécularité Ip inférieur à 2, de préférence inférieur à 1,6 et préférentiellement inférieur à 1,3.
10 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la concentration C est comprise dans la gamme allant de 5 fois C* à 10 fois
C*.
11 - Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la concentration C est comprise dans la gamme allant de 6 fois C* à 7 fois C*.
12 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que la concentration C est inférieure ou égale à 7 fois C*, l'apparition de nanoparticules se faisant alors spontanément.
13 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'après apparition de nanoparticules, la concentration C en copolymère est abaissée par dilution. 14 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la concentration C est supérieure à 7 fois C*, et en ce qu'après apparition d'un gel ou de nanoparticules, la concentration C en copolymère est abaissée par dilution.
15 - Procédé selon la revendication 13 ou 14, caractérisé en ce que la dilution est choisie, de façon à ajuster la taille des nanoparticules.
16 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que les nanoparticules formées présentent un diamètre compris entre 50 nm et 1 μm.
17 - Nanoparticules susceptibles d'être obtenues selon le procédé tel que défini à l'une des revendications 1 à 16.
18 - Vecteurs de molécules d'intérêt biologique comportant des nanoparticules selon la revendication 17 en association avec au moins une molécule d'intérêt biologique.
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