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WO2007006944A1 - Monomeres electropolymerisables solubles en solution aqueuse et sondes electroactives susceptibles d'etre obtenues avec de tels monomeres - Google Patents

Monomeres electropolymerisables solubles en solution aqueuse et sondes electroactives susceptibles d'etre obtenues avec de tels monomeres Download PDF

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WO2007006944A1
WO2007006944A1 PCT/FR2006/001640 FR2006001640W WO2007006944A1 WO 2007006944 A1 WO2007006944 A1 WO 2007006944A1 FR 2006001640 W FR2006001640 W FR 2006001640W WO 2007006944 A1 WO2007006944 A1 WO 2007006944A1
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sequence
monomer according
monomer
monomers
formula
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Application number
PCT/FR2006/001640
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Inventor
Aurélie BOUCHET
Carole Chaix
Bernard Mandrand
Original Assignee
Biomerieux
Centre National De La Recherche Scientifique
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Publication date
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    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G73/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing nitrogen with or without oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule, not provided for in groups C08G12/00 - C08G71/00
    • C08G73/06—Polycondensates having nitrogen-containing heterocyclic rings in the main chain of the macromolecule
    • C08G73/0605—Polycondensates containing five-membered rings, not condensed with other rings, with nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C08G73/0611—Polycondensates containing five-membered rings, not condensed with other rings, with nitrogen atoms as the only ring hetero atoms with only one nitrogen atom in the ring, e.g. polypyrroles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F17/00—Metallocenes
    • C07F17/02—Metallocenes of metals of Groups 8, 9 or 10 of the Periodic Table
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C08F2/04—Polymerisation in solution
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
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    • C08F2/16—Aqueous medium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
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    • C08G61/12—Macromolecular compounds containing atoms other than carbon in the main chain of the macromolecule
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    • C08G61/123—Macromolecular compounds containing atoms other than carbon in the main chain of the macromolecule derived from five- or six-membered heterocyclic compounds, other than imides derived from five-membered heterocyclic compounds
    • C08G61/124—Macromolecular compounds containing atoms other than carbon in the main chain of the macromolecule derived from five- or six-membered heterocyclic compounds, other than imides derived from five-membered heterocyclic compounds with a five-membered ring containing one nitrogen atom in the ring

Definitions

  • the invention relates to the technical field of electropolymerization.
  • the present invention relates to soluble electropolymerizable monomers in aqueous solution.
  • Electroactive polymers are used in many fields of application. For example, it is possible to use electroactive polymers to detect the interaction of a probe biological ligand with a target biological ligand.
  • the specific interaction of a probe ligand with a target ligand results in a substantial and selective variation of the electrochemical properties of the electroactive polymer, such as a decrease in the electroactivity of said polymer.
  • This variation which depends on the concentration of target ligand bound on a probe ligand, is observed, possibly measured, and directly correlated to the amount of bound ligand target.
  • One of the essential applications of this technique lies in the detection, identification, and possibly the determination of a ligand, present in a biological sample.
  • the aforementioned variation is of the potentiometric type, and corresponds, for example, to a variation of the oxidation potential of the electroactive polymer before and after interaction, or of amperometric type, and corresponds, for example, to a variation of the oxidation current or of reducing the polymer before and after hybridization, determined at a determined potential.
  • To precisely characterize the electrochemical response of the polymer it must have high electroactivity.
  • Polymers obtained by electropolymerization for example in the form of a homopolymer or copolymer of pyrroles and comprising an electron-donor group, such as a ferrocene, making it possible to improve its electroactivity and its conductivity have therefore been developed and described in particular in the application for WO 01/81446.
  • the electropolymerization reactions are generally carried out in organic solvent, the monomers used being hydrophobic.
  • the systems used up to now require electrolytic polymerization in an organic solvent because the monomers used, for example ferrocenylated, are rather hydrophobic (Synthetic Metals, 2001, 119, 265-266).
  • manipulations in the middle organic are not compatible with the use of biomolecules. The latter are not soluble in such media and / or, very often, are denatured and their properties are altered. In the case of proteins, there is most often a loss of active conformation.
  • Polymers that can be used in this strategy are, for example, described in WO 95/29199 and in WO 01/81446 which describes polymers having improved electroactivity, obtained by electropolymerization, for example in the form of a homopolymer or copolymer of pyrroles and comprising an electron-donating group, such as a ferrocene.
  • This "multi-layer" strategy is not entirely satisfactory because it is tedious because of the implementation of several organic solvent-aqueous medium transitions with the need each time to flush the chip several times.
  • post-functionalization it consists in the covalent post-polymerization fixation of biomolecules, in aqueous medium, thanks to reactive functions located on the polymer layer.
  • This post-functionalization strategy does not allow, for its part, the addressing of biomolecules.
  • it has a lack of stud plot reproducibility related to the variability of the coupling efficiency of the biomolecule on the polymer.
  • biomolecule electrochemically is a promising principle of detection whose main advantage is the absence of prior labeling of biomolecules, which is mandatory for fluorescence detection, for example.
  • equipment needed for a measurement of electrochemical potential are compact and suggest a great practicality of use.
  • the inventors propose to provide new monomers which are perfectly compatible with an electropolymerization reaction in an aqueous medium and which thus make it possible to dispense with the use of organic solvent.
  • the monomers according to the invention are perfectly compatible for carrying biological ligands.
  • the subject of the present invention is firstly an electropolymerizable monomer, intended to be polymerized in aqueous solution, comprising a single electropolymerizable unit and an electron-donor group, as well as at least one ionizable arm in aqueous solution.
  • the electropolymerizable monomer as defined above has one or more of the following characteristics: it is soluble in distilled water, at least up to a concentration of 1 mM, preferably at least up to at a concentration of 10 mM, and preferably at least up to a concentration of 30 mM,
  • the ionizable linker comprises an ionizable function in aqueous solution chosen from the functions: amine, carboxylic acid and phosphate,
  • the biological ligand is a polynucleotide
  • the electropolymerizable unit is chosen from acetylene, pyrroles, thiophenes, indoles, anilines, azines, p-phenylenevinylenes, p-phenylenes, pyrenes, furans, selenophenes, pyrridazines and carbazoles; , acrylates, methacrylates and their derivatives; preferably the electropolymerizable unit is a pyrrole, the linkage to the ionizable link is preferably provided in position 3 of the pyrrole,
  • the electron-donor group is chosen from metallocenes, quinone and their derivatives; preferably the electron donor group is a ferroocene.
  • the monomers according to the invention because of the presence of an ionizable arm in aqueous solution, will be soluble in aqueous solution, thus allowing their polymerization in such aqueous media.
  • electropolymerizable monomer a monomer having a single electropolymerizable unit, said monomer being capable of reacting by electrochemical polymerization with other monomers to form a polymer.
  • An electropolymerizable pattern has alternating single bonds and double bonds.
  • an electropolymerizable unit mention may be made of acetylene, pyrroles, thiophenes, indoles, anilines, azines, p-phenylenevinylenes, p-phenylenes, pyrenes, furans and selenophenes. pyridazines, carbazoles, acrylates, methacrylates and their derivatives.
  • the monomers comprising a single electropolymerizable unit chosen from acetylene, pyrroles, thiophenes, indoles, anilines, azines, p-phenylenevinylenes, p-phenylenes, pyrenes, furans, selenophenes, pyridazines, carbazoles and their derivatives which lead to a conductive polymer will be preferred.
  • ionizable arm in aqueous solution is meant a hydrophilic chemical group capable of forming a cation or anion in aqueous solution.
  • the ionized form in aqueous solution is obtained according to a first embodiment without carrying out a chemical reaction, hydrolysis or degradation type.
  • the ionized form is, for example, obtained by exchange of a proton or in the form of a pair of ions in solution from a salt.
  • Such ionizable arms include in particular a amino group, polyamine, carboxylic acid (-COOH) or phosphate or sulfonate.
  • An ionizable arm is in ionic form when it is placed in an aqueous solution which has a pH of between 5 and 8.
  • the ionizable arm is in ionized form in distilled water.
  • the ionized form in aqueous solution is obtained by a chemical reaction.
  • the ionized monomer is obtained by an alkylation reaction starting from the monomer Ia, Ha or IHa, according to the scheme below: Ia
  • a 2 , A 3 , Li, R, R 6 , R 7 , Z 1 are as defined below.
  • the alkylation reaction is a bis-methylation reaction.
  • soluble monomer in aqueous solution is meant a soluble monomer in aqueous solution under the polymerization conditions, namely under the conditions of temperature, pH and ionic strength used during its implementation in an electrochemical polymerization reaction. .
  • the electropolymerization will, in general, be carried out in an aqueous solution whose pH is between 3 and 8 and at a temperature of the order of 20 to 30 ° C.
  • the solubility of a monomer according to the invention such that the introduction of said monomer into the distilled water at a temperature of 25 ° C, at least up to a concentration of 1 mM, preferably at least up to a concentration of 10 mM, and preferably at least up to a concentration of 30mM, lead to a homogeneous solution and transparent to the naked eye, without precipitation.
  • Polymerization is understood to mean a reaction by chemical or electrochemical means of units of the same chemical nature allowing the assembly of a certain number of monomers to form a polymer ( r ⁇ M ⁇ (M) r with r greater than or equal to 2 ).
  • the term “polymerization” embraces copolymerization and homopolymerization. This is advantageously in the context of the invention of the condensation of pyrrole units to form a polypyrrole.
  • copolymerization means the simultaneous polymerization of different monomers, such as, for example, the simultaneous polymerization of a mixture of a substituted monomer carrying a biological ligand and a soluble monomer containing no biological ligand.
  • electrochemical polymerization denotes an electrochemical polymerization.
  • Electropolymerization processes are well known to those skilled in the art. Examples include cyclic voltammetric techniques, chronopotentiometry (imposed current) and chronoamperometry (imposed potential). In a particular embodiment of the invention, the polymerization will be carried out by chronoamperometry deposition or controlled potential deposition. This method consists of imposing a potential jump from the equilibrium potential (zero current) to a fixed value at which the reaction to the electrode takes place and the current is measured as a function of time.
  • Polymerization conditions refer to the pH, temperature, and ionic strength of the aqueous solution used in the polymerization.
  • the electropolymerization is carried out by the Diaz mechanism (Sadki et al., Chem Soc Rev., 29: 283-293, 2000) leads to the formation of polypyrrole.
  • This polymerization takes place at the 2 and 5 positions of the pyrrole monomers.
  • a pyrrole substituted at the 3 or 4 position of the pyrrole ring is therefore capable of polymerizing or copolymerizing with other pyrroles at the 2 and 5 positions.
  • the 3-substituted pyrrole units are preferred.
  • conducting polymer is understood to mean a polymer whose electrons are strongly delocalised, most often along a sequence of single and double bonds (conjugated bonds), which leads it to behave as a micro-semiconductor. electronic.
  • Electrode group means a chemical group corresponding to a redox couple having a narrow oxidation wave, rapid and reversible, such as metallocenes such as ferrocene, quinone and their derivatives.
  • acyl As a group protecting the alcohols, there may be mentioned, by way of example, the acyl, trityl, silyl and tetrahydrofuranyl groups.
  • esters in particular alkyl esters, acyl esters, silyl esters or thioesters.
  • a protective group of amines there may be mentioned, for example, trifluoroacetyl, te / t-butoxycarbonyl and 9-fluorenylmethoxycarbonyl groups.
  • activating group of carboxylic acids there may be mentioned, for example, succinimidyl or phthalimidyl groups, or any other group for forming an activated ester.
  • an activating group for alcohols or amines mention may be made, by way of example, of the groups which, in the case of alcohols, lead to a phosphodiester, phosphotriester, H-phosphonate or phosphoramidite and, in the case of amines, to a phosphoramidate monoester, phosphoramidate diester, H-phosphoramidate or phosphoramidite.
  • groups are in particular chosen from:
  • biological ligand is meant a compound which has at least one recognition site allowing it to react with a target molecule of biological interest.
  • ligands polynucleotides, antigens, antibodies, polypeptides, proteins, haptens, biotin, oligosaccharides ...
  • a ligand / anti-ligand pair capable of interacting specifically to form a conjugate is also named, in the present invention probe ligand / target ligand.
  • polynucleotide means a sequence of at least 2 deoxyribonucleotides or ribonucleotides optionally comprising at least one modified nudeotide, for example at least one nucleotide comprising a modified base such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, dimethylamino- 5-deoxyuridine, deoxyuridine, diamino-2,6-purine, bromo-5-deoxyuridine or any other modified base for hybridization.
  • a modified base such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, dimethylamino- 5-deoxyuridine, deoxyuridine, diamino-2,6-purine, bromo-5-deoxyuridine or any other modified base for hybridization.
  • This polynucleotide can also be modified at the level of the internucleotide linkage, for example phosphorothioates, H phosphonates, alkylphosphonates, at the backbone level, for example alpha-oligonucleotides (FR 2 607 507), or NAPs (Egholm). M. et al., J. Am. Chem., Soc., 1992, 114, 1895-1897), or 2-O-alkyl ribose, or LNA (Loked Nucleic Acids), described in particular in US Pat. published patent application WO 00/66604). Each of these modifications can be taken in combination.
  • the polynucleotide may be an oligonucleotide, a natural nucleic acid or its fragment such as a DNA, a ribosomal RNA, a messenger RNA, a transfer RNA, a nucleic acid obtained by an enzymatic amplification technique.
  • polypeptide is meant a sequence of at least two amino acids.
  • amino acids we mean the primary amino acids that code for proteins, amino acids derived after enzymatic action such as and natural amino acids but not present in proteins such as norvaline, N-methyl-L-leucine, Stalin (Hunt S. in Chemistry and Biochemistry of amino acids, Barett GC, ed., Chapman and Hall, London, 1985), amino acids protected by chemical functions that can be used in solid or liquid phase synthesis and non-natural amino acids.
  • hapten refers to non-immunogenic compounds, i.e. incapable by themselves of promoting an immune reaction by production of antibodies, but capable of being recognized by antibodies obtained by immunizing animals in animals.
  • hapten-protein conjugate generally have a molecular mass of less than 3000 Da, and most often less than 2000 Da and may be, for example, glycosylated peptides, metabolites, vitamins, hormones, prostaglandins, toxins, antibiotics or various medicaments, nucleosides and nucleotides.
  • antibodies includes polyclonal or monoclonal antibodies, antibodies obtained by genetic recombination and antibody fragments.
  • antigen refers to a compound capable of being recognized by an antibody for which it has induced synthesis by an immune response.
  • protein includes holoproteins and heteroproteins such as nucleoproteins, lipoproteins, phosphoproteins, metalloproteins and both fibrous and globular glycoproteins.
  • the subject of the present invention is the different series of monomers comprising a pyrrole unit and a metallocene unit as defined hereinafter: a) firstly the monomers of formula (I):
  • - M is a transition metal, preferably Fe, Ru or Os
  • - Ai is a sequence:
  • (Ci-C 4) alkyl eg methyl or ethyl
  • R 6 , R 7, which independently of one another represents a (C 1 -C 4 ) alkyl group
  • R represents a hydrogen atom or a group protecting the amine function, for example chosen from monomethoxytrityl, dimethoxytrityl, tosyl, triisopopylsilyl, tert-butoxycarbonyl, 9-fluorenyloxycarbonyl, benzyloxycarbonyl, triphenylmethanesulfenyl and acetyl groups, and b) then monomers of formula (II):
  • a ⁇ represents a spacer arm defined as follows: o when Ai is a sequence -A 2 -NR ⁇ A 3 - or -A 2 -N + R 6 R 7 -A 3 -, in which R 1 , A 2 , A 3 , R 6 and R 7 are as defined for the monomers of formula (I) and
  • a 2 represents - (GH 2 ) m i- or - (CH 2 ) m 2 -O- [(CH 2 ) 2 O] m 3 - (CH 2 ) 2 - and A 3 represents - (CH 2 ) n i - or - [(CH 2 ) 2 O] n 2 - (CH 2 ) n 3 -
  • Ae represents a sequence -A 2 -NR 1 -, with ml, m2, m3, ni, n2, n3 and
  • a 2 represents - (CH 2 ) m 4 -C (O) -NR 3 - [(CH 2 ) 2 O] m 5 - (CH 2 ) 2 - and A 3 represents - (CH 2 ) n i- or - [(CH 2 ) 2 O] n 2 - (CH 2 ) n 3 -
  • a 6 represents a sequence - (CH 2 ) m 4 -C (O) O-, or -A 2 -NR 1 -, with m 4, R 3 , m5, ni, n2, n3 and R 1 as defined for the monomers of formula (I),
  • a 2 represents - (CH 2 ) m 4 -C (O) -NR 3 - [(CH 2 ) 2 O] m 5 - (CH 2 ) 2 - and A 3 represents - [(CH 2 ) 2 O] n 4 - (CH 2 ) 2 -
  • a 6 represents a sequence - (CH 2 WC (O) O-, -A 2 -NR 1 - or
  • a 2 represents - (CH 2 ) m r or - (CH 2 ) m 2 -O- [(CH 2 ) 2 O] m 3 - (CH 2 ) 2 - and A 3 represents - (CH 2 ) n i- or
  • a 6 represents a sequence -A 2 -Y-, with ml, m2, m3, n, n 2, n 3 and Y as defined for the monomers of formula (I),
  • a 2 represents - (CH 2 ) m 4 -C (O) -NR 3 - [(CH 2 ) 2 O] m 5 - (CH 2 ) 2 - and A 3 represents - (CH 2 ) n - or
  • a 6 represents a sequence - (CH 2 ) m 4 -C (O) O- or - A 2 -Y-, with m 4, R 3 , m5, n1, n2, n3 and Y as defined for the monomers of formula (I),
  • a 6 represents a sequence -A 2 -Y- or -A 2 -YP (O) (OR 2 ) -O - [(CH 2 ) 2 O ] n 4 - (CH 2 ) 2 -NR 4 -, with ml, m 2, m 3, n 4, n 5, Y, R 4 and R 2 as defined for the monomers of formula (I),
  • a 6 represents a sequence
  • a 4 represents - (CH 2 ) p 2 -C (O) -
  • a 5 represents - (CH 2 ) q i-
  • a 6 represents a - (GH 2 ) p 2 - C (O) O- or -A 4 - [NH (CH 2 ) 2 ] n '-NH-
  • a 5 represents -NR 5 -C (O) - (CH 2 ) q 2 -
  • a 6 represents a sequence
  • a 6 represents a sequence - (G ⁇ b) p i- [NH (CH 2 ) 2 ] n -NH- with n 'an integer in the range from 1 to n -1, and if A 5 represents -NR 5 -C (O) - (CH 2 ) q 2 -, then A 6 represents a sequence - (CH 2 ) p i- [NH (CH 2 ) 2 ] n - NR 5 or - (CH 2 ) p i- [NH (CH 2 ) 2 ] n '-NH-, with pi, ql, q2, n and R 5 as defined for the monomers of formula (I) and n' integer in the range of 1 to n-1,
  • Z 1 represents a hydrogen atom, or a protecting group or activator of the alcohols, amines or carboxylic acids, as a function respectively of the amine, alkoxy or carboxy terminal function of the spacer arm A 6 to which Z 1 is bonded, the monomers of formula (III): in which :
  • a 6 represents a spacer arm defined as follows: where A 1 is a sequence -A 2 -NR 3 -A 3 or -A 2 -N + R 6 R 7 -A 3 -, in which R 1 , A 2 , A 3 , R 6 and R 7 are as defined for the monomers of formula (I) and
  • a 2 represents - (CH 2 ) m i- or - (CH 2 ) m 2 -O- [(CH 2 ) 2 O] m 3 - (CH 2 ) 2 - and A 3 represents - (CH 2 ) n i - or
  • a 6 represents a sequence -A 2 -NR 1 -, with ml, m2, m3, n, n 2, n 3 and R 1 as defined for the monomers of formula (I),
  • a 2 represents - (CH 2 ) m 4 -C (O) -NR 3 - [(CH 2 ) 2 O] m 5 - (CH 2 ) 2 - and A 3 represents - (CH 2 ) n i-, or
  • a 6 represents a sequence - (CH 2 ) m 4 -C (O) O-, or -A 2 -NR 1 -, with m 4, R 3 , m 5 , n 1 , n 2 , n 3 and R 1 as defined for the monomers of formula (I), when A 2 represents - (CH 2 ) m i- or - (CH 2 ) m 2 -O-
  • a 6 represents a sequence -A 2 -NR 1 - or -A 2 -NR 1 - [(CH 2 ) 2 O] n 4 - (CH 2 ) 2 -NR 4 -, with ml, m2, m3, n4, n5, R 4 and R 1 as defined for the monomers of formula (I),
  • a 2 represents - (CH 2 WC (O) -NR 3 - [(CH 2 ) 2 O] m 5 - (CH 2 ) r and A 3 represents - [(CH 2 ) 2 O] n 4 - (CH 2 ) 2 - NR 4 -C (O) - (CH 2) n 5 -
  • a 6 represents a
  • a 6 represents a sequence -A 2 -Y-, with ml, m2, m3, ni, n2, n3 and Y as defined for the monomers of formula (I), • when A 2 represents - (CH 2 WC (O) - NR 3 -
  • a 6 represents a sequence - (CH 2 WC (O) O- or - A 2 -Y-, with m 4, R 3 , m 5, n, n 2, n 3 and Y as defined for the monomers of formula (I),
  • a 2 represents - (CH 2 ) m i- or - (CH 2 ) m 2 -O-
  • a 6 represents a sequence -A 2 -Y- or -A 2 -YP (O) (OR 2 ) -O- [(CH 2 ) 2 O] n 4 - (CH 2 ) 2 -NR 4 -, with ml, m 2, m 3, n 4, n 5, Y, R 4 and R 2 as defined for the monomers of formula (I),
  • a 6 represents a sequence - (CH 2 WC (O) O-, -A 2 -Y- or -ArY-P (O) (OR 2 ) -O - [(CH 2 ) 2 O] n 4 - (CH 2 ) 2 -NR 4 -, with m 4, R 3 , m 5, n 4, n 5, R 2 , R 4 and Y as defined for the monomers of formula (I), when A 1 is a sequence -A 4 - [NH (CH 2 ) Z] n -A 5 -, in which A 4 , n and A 5 as defined for the monomers of formula (I), when A 1 is a sequence -A 4 - [NH (CH 2 ) Z] n -A 5 -, in which A 4 , n and A 5 as defined for the monomers of formula (I), when A 1 is a sequence -A 4 - [NH (CH 2 ) Z] n -A 5 -, in which A 4
  • a 6 represents a sequence - (CH 2 ) p 2 -C (O) O-, -A 4 - [NH (CH 2 ) 2 ] n -NR 5 - or
  • a 6 represents a sequence - (CH 2 ) p i-
  • n ' is an integer in the range of 1 to n-1, and if A 5 is -NR 5 -C (O) - (CH 2 ) q 2 -, then
  • a 6 represents a sequence - (CH 2 ) pI- [NH (CH 2 ) 2 ] n -NR 5 - or -A 4 - (CH 2 ) P i- [NH (CH 2 ) J n -NH-, with pi, ql, q2, n and R 5 as defined for the monomers of formula (I) and n 'an integer in the range 1 to n-1 - a 7 represents a linker arm, such that a polymer or an alkyl chain, or a direct bond, and
  • Li represents a biological ligand.
  • the ionizable arms (binding or free) present on these monomers make it possible to obtain a soluble monomer in aqueous solution, despite the presence of a metallocene group, typically a ferrocene group, with a hydrophobic nature.
  • the presence of this ionizable arm does not alter the properties of the electropolymerizable monomer present, the polymerization can be carried out in the aqueous phase to form polymer layers which will preferably be conductive.
  • the sequence A 6 corresponds partially to the arm A 1, that is why the value that A 6 takes is directly related to the value of A 2 and A 3 in particular.
  • a 2 In order not to weigh down the definition of the A ⁇ arms, in the monomers (II) and (III), although it is specified at each point at which A 2 corresponds, the name A 2 has been kept to define A ⁇ . For example, even if it is specified that A 2 represents - (CH 2 ) m 4 -C (O) -NR 3 - [(CH 2 ) 2 O] m 5 - (CH 2 ) 2 -, we will have kept for A 6 the definition -A 2 -Y-, while of course this corresponds to - (CH 2 ) m 4 -C (O) -NR 3 - [(CH 2 ) 2 O] m 5 - (CH 2 ) 2 -Y. It is the same for A 4 .
  • the monomers (Ia) have the following formula (Ia):
  • the monomers (Ic) correspond to the following formula (Ic):
  • the monomers (Ib) correspond to the following formula (Ib)
  • the monomers (Ib) have one or more of the following characteristics:
  • - R 2 represents a hydrogen atom
  • the monomers of formula (II) are preferred.
  • These monomers of formula (II), (IIa), (IIc) and (IIb) correspond to the monomers of formula (I), (Ia), (Ic) and (Ib) respectively, modified to bear on the other cyclopentadiene metallocene, an ionizable free arm.
  • the latter may carry a reactive function (F) of the hydroxyl amine or carboxylic acid type, optionally in protected or activated form, for the subsequent fixation of a biological ligand in particular.
  • the monomers (IIa) have the following formula (IIa):
  • a 2 represents - (CH 2 W-, - (CH 2 ) m2 -O - [(CH 2 ) 2 O] m3 - (CH 2 ) 2 - or - (CH 2 ) m 4 -C (O) -NR 3 - [(CH 2 ) 2 O] m 5 - (CH 2 ) 2 -, with ml to m 5 and R 3 as defined for the monomers of formula (I),
  • a 3 is - (CH 2) n i-, - [(CH 2) 2 O] n2 - (CH 2) n3 - or - [(CH 2) 2 O] n4 - (CH 2) 2 -NR 4 -C (O) - (CH 2 ) n 5 -, with n to n and R 4 as defined for the monomers of formula (I),
  • a 6 represents a spacer arm defined as follows:
  • a 6 represents a linking -A 2 -NH-, with ml, m2, m3, ni, n2 and n3 as defined for the monomers of formula (I),
  • a 2 represents - (CH 2 ) m 4 -C (O) -NR 3 - [(CH 2 ) 2 O] m 5 - (CH 2 ) r and A 3 represents - (CH 2 ) n i-, or - [(CH 2 ) 2 O] n 2 - (CH 2 ) n 3 -
  • a 6 represents a sequence - (CH 2 ) m 4 -C (O) O-, or -A 2 -NH-, with m 4, R 3 , m5, n1, n2 and n3 as defined for the monomers of formula (I),
  • a 2 represents - (CH 2 ) m i- or - (CH 2 ) m 2 -O- [(CH 2 ) 2 O] m 3 - (CH 2 ) 2 - and A 3 represents - [(CH 2 ) 2 O] n4 - (CH 2 ) 2 -
  • a 6 represents a sequence -A 2 -NH- or -A 2 -NH - [(CH 2 ) 2 O] n 4 - (CH 2 ) 2 -NR 4 -, with ml, m 2, m 3, n 4 , R 4 and n 5 as defined for the monomers of formula (I), "when A 2 represents - (CH 2 ) m 4 -C (O) -NR 3 -
  • a 3 represents - [(CH 2 ) 2 O] n 4 - (CH 2 ) 2 - NR 4 -C (O) - (CH 2 ) n 5-
  • a 6 represents a sequence - (CH 2 ) m 4 -C (O) O-, -A 2 -NH- or -A 2 -NH - [(CH 2 ) 2 O] n 4 - (CH 2 ) 2 - NR 4 -, with m 4, R 3 , m 5, n 4, n 5 and R 4, such as for the monomers of formula (I), and
  • Z 1 is a hydrogen atom or a protecting or activating group of the amines or acids as a function respectively of the amine or carboxy terminal function of the spacer arm A 6 to which Z 1 is bonded.
  • These monomers can be used in the supported synthesis oligonucleotides, as described for example in the patent application WO 03/068787.
  • the monomers of formula (Ia) are preferred the monomers of formula (IIa), as defined above, in which at least one of the sequences A 2 and A 3 comprises a unit - [(CH 2 ) 2 O] m with m which represents m3, m5, n2 or n4 as defined for the monomers (I).
  • Z 1 is a hydrogen atom or a protective group of the amines, for example chosen from trifluoroacetyl, tert-butoxycarbonyl and 9-fluorenylmethoxycarbonyl groups, or Z 1 represents an activating group of the amine function forming with the amine function to which it is bound a phosphoramidate monoester, a phosphoramidate diester, an H-phosphoramidate or a phosphoramidite.
  • the monomers (Ile) correspond to the following formula (Ile):
  • a 2 represents - (CH 2 ) m i-, - (CH 2 ) m 2 -O - [(CH 2 ) 2 O] m 3- (CH 2 ) 2 - or - (CH 2 ) m 4 -C (O) - NR 3 - [(CH 2 ) 2 O] m 5 - (CH 2 ) 2-, with ml to m 5 and R 3 as defined for the monomers of formula (I),
  • a 3 is - (CH 2) n R, - [(CH 2) 2 O] n2 - (CH 2) n3 or - [(CH) 2 ISO 4 - (CH 2) 2 -NR 4 -C (O) - (CH 2 ) n 5 -, with n to n and R 4 as defined for the monomers of formula (I),
  • a 6 represents a spacer arm defined as follows:
  • a 6 represents a sequence -A 2 -NH-, with ml, m2, m3, ni, n 2 and n 3 as defined for the monomers of formula (I),
  • a 6 represents a sequence - (CH 2) m 4-C (O) O-, or -A 2 -NH-, with m4 , R 3 , m 5 , n 1, n 2 and n 3 as defined for the monomers of formula (I), • when A 2 represents - (CH 2 ) m r or - (CH 2 ) m 2 -O- [(CH 2 ) 2 O] m 3 - (CH 2 ) r and A 3 represents - [(CH 2 ) 2 O] n4- (CH 2 ) 2 -RN 4 -C (O) - (CH 2 ) n 5
  • a 2 represents - (CH 2 ) m 4 -C (O) -NR 3 - [(CH 2 ) 2 O] m 5 - (CH 2 ) 2 - and A 3 represents - [(CH 2 ) 2 O] n 4 - (CH 2 ) 2 - NR 4 -C (O) - (CH 2 ) n 5 -
  • a 6 represents a sequence - (CH 2 ) m 4 -C (O) O-, -A 2 -NH- or -A 2 -NH - [(CH 2 ) 2 O] n 4 - (CH 2 ) 2 -
  • Z 1 is a hydrogen atom or a protecting or activating group of the amines or acids as a function respectively of the amine or carboxy terminal function of the spacer arm A 6 to which Z 1 is bonded.
  • a 6 represents a sequence -A 2 -NH- or -A 2 -NH - [(CH 2 ) 2 O] n 4 - (CH 2 ) 2 -NR 4 - and Zi represents an activating group of the amine function forming, with the amine function to which it is bonded, a phosphoramidate monoester, a phosphoramidate diester, an H-phosphoramidate or a phosphoramidite, constitute a particular aspect of the invention.
  • These monomers may be used in the supported synthesis of oligonucleotides, as described for example in the patent application WO 03/068787.
  • the monomers of formula (Ic) preferred are the monomers of formula (IIc), as defined above, in which at least one of the chains A 2 and A 3 comprises a unit - [(CH 2 ) 2 O m with m which represents m3, m5, n2 or n4 as defined for the monomers (I).
  • Particularly preferred are the monomers of formula (IIc) as defined previously in which: - A 2 represents - (CH 2 ) m i-, with ml as defined for the monomers of formula (I), and in particular ml 1,
  • Z 1 is a hydrogen atom or a protective group of the amines, for example chosen from trifluoroacetyl, tert-butoxycarbonyl and 9-fluorenylmethoxycarbonyl groups, or Z 1 represents an activating group of the amine function forming with the amine function to which it is bound a phosphoramidate monoester, a phosphoramidate diester, an H-phosphoramidate or a phosphoramidite.
  • the monomers (Hb) have the following formula (Hb):
  • a 6 represents a spacer arm defined as follows:
  • a 6 represents a sequence -A 2 -Y-, with ml, m2, m3, n, n 2 , and Y as defined for the monomers (I ) - when A 2 is - (CH 2) m4 -C (O) -NR 3 - [(CH 2) 2 ⁇ ] m 5 - (CH 2) 2 - and A 3 is - (CH 2) n or i- - [(CH 2) 2 O] n 2 - (CH 2) n3 -, then a 6 represents a sequence - (CH 2) m4 -C (O) O-, -A 2 -Y-, with m
  • a 6 represents a sequence - A 2 -Y- or -A 2 -YP (O) (OR 2 ) -O- [(CH 2 ) 2 O] n 4 - (CH 2 ) 2 -NR 4 -, with ml, m2, m3, n 4, R 4 , n 5, Y and R 2 as defined for the monomers (I), - when A 2 represents - (CH 2 ) m 4 -C (O) -NR 3 - [(CH 2 ) 2 O] m 5 - ( CH 2 ) 2 - and A 3 represents - [(CH 2 ) 2 O] n 4 - (CH 2 ) 2 -NR 4 -C (O) - (CH 2 ) n 5 -, then A 6
  • the monomers of formula (III) the monomers of formula (HIa), (IHc) and (IHb) as defined below are preferred.
  • monomers of formula (III), (HIa), (IIIc) and (IHb) correspond to the monomers of formula (II), (IIa), (IIc) and (IIb) on which a biological ligand has been covalently coupled , optionally via a spacer arm, on the reactive function (F) present on the ionizable free arm substituting the metallocene.
  • the monomers (HIa) correspond to the formula (HIa):
  • a 7 represents a linking arm or a direct bond
  • Li represents a biological ligand
  • a 2 , A 3 , A 6 and R are as defined for the compounds of formula (IIa) and for which the preferred values indicated during of the definition of compounds of formula (IIa) also apply.
  • the monomers (IIIc) correspond to formula (IIIc): in which A 7 represents a linking arm or a direct bond, U represents a biological ligand and A 2 , A 3 , A 6 , R 6 , R 7 and R are as defined for the compounds of formula (II) and for which preferred values indicated in the definition of the compounds of formula (IIc) also apply.
  • the monomers (HIb) correspond to the formula (HIb):
  • the monomers (I), (Ia), (Ib), (Ic), (II), (IIa), (Hb), (IIc), (III), (HIa), (IIb) and (HIc) have one or more of the following characteristics:
  • R is a hydrogen atom
  • This monomer (1) will then be reacted with the corresponding pyrrole substituted by a chain A 3 bearing a terminal hydroxyl function, one of the hydroxyl functions, preferably the one located on the ferrocene side, having previously been activated in the form of a phosphoramidite.
  • the ferrocene (2) thus obtained can then be coupled, when X represents -NR 1 , with the corresponding pyrrole substituted by a chain bearing a terminal halogen atom, said chain being chosen to obtain the desired arm A 3 , or else when X represents -NH-P (O) (OR 2 ) -O-, the terminal amine function of ferrocene (2) will be activated in the form of a phosporamidite to be able to couple to a pyrrole bearing a terminal hydroxyl on the arm A 3 .
  • a 3 represents - (CH 2 ) n- or - [(CH 2 ) 2 O] n 2 - (CH 2 ) n 3 -
  • pyrrole substituted with a - (CH 2 ) n -Br or - (CH 2) group ) n 3 - [O (CH 2 ) 2 ] n 2 -Br can be obtained from the pyrrole substituted with a - (CH 2 ) n -OH group (prepared according to Synth Commun., 1996, 26, 1289) or - (CH 2 ) n 3 - [O (CH 2 ) 2] n 2 -OH (prepared according to FR 2849038) respectively, for example in the presence of CBr 4 and triphenyl phosphine in methanol at 0 ° C.
  • This pyrrole substituted with a polyamine will be obtained conventionally by coupling a polyamine (15) on an alkyl halogenated pyrrole (16), as shown in FIG. 4.
  • Monomers (II), (IIa), (IIc) and (IIb) have a metallocene group with a 1-1 'substitution. Metallocene substitutions show some symmetry found in Ai and Ae.
  • a 1 - (CH 2 ) 3 - OPO- (CH 2 ) r + TBDMSiCl
  • the monomers (III) (HIa) 7 (HIc) and (HIb), for their part, are obtained by coupling a ligand on the corresponding monomer (II), (IIa), (IIc) or (IIb).
  • a reactive function Fi (Z 1 H) of amine, hydroxyl or carboxylic acid type.
  • this coupling will be via a spacer arm A 7, for example of the polymer or alkyl chain type.
  • Spacer arms that can be used to move the ligand Biological chain polymer finally obtained are well known to those skilled in the art. Any spacer arm which will not alter the solubility or the electroactive properties of the monomer may be used.
  • the spacer arm is coupled to the reactive function Fi, then the ligand is coupled with another reactive function F ⁇ , for example of the activated ester type carried by the spacer arm.
  • the arm (II) is used for the supported synthesis of the oligonucleotides, that is to say in the cases defined above where Zi represents an activating group of the amino or alkoxy function of the spacer arm Ae to which Z 1 is bonded respectively forming with the amine function to which it is attached a phosphoramidate monoester, a phosphoramidate diester, an H-phosphoramidate or a phosphoramidite or with the alkoxy function to which it is attached a phosphodiester, a phosphotriester, an H-phosphonate or a phosphoramidite, then the arm
  • a 6 bonded to the phosphorus atom may be an oxygen atom or a nitrogen atom, -NH- OR - NR 4 -.
  • the use of the monomers according to the invention allows an addressing of the biomolecules on a pad of an electrode.
  • this addressing can be done in a single step.
  • another object of the invention is to provide electroactive probes and electrodes, at least partially covered with such a probe, which are simpler to produce, and which allow a more direct measurement of the ligand probe / target ligand interaction.
  • electroactive probe is meant a probe whose electrochemical response is modified when a target ligand interacts specifically with the probe ligands carried by the probe. Thus, a modification of the electrochemical signal is observed following the specific interaction with the analyte.
  • target ligand is intended to mean any molecule capable of interacting specifically with a probe ligand attached to the monomer according to the invention and therefore capable of being detected with a copolymer or polymer according to the invention, obtained from such a polymer. monomer.
  • This target ligand can be, for example, a biomolecule such as, for example, a nucleotide, in particular an oligonucleotide, a protein, an antibody, an antigen, a peptide, a lipid, a steroid, a sugar or a nucleic acid.
  • the probe ligand carried by the polymer is specific for the target ligand to be detected.
  • the present invention therefore also relates to electroactive probes that can be obtained by electropolymerization of at least two soluble monomers according to the invention each carrying a biological ligand forming a conductive homopolymer.
  • at least two monomers of formula (III), (IHa), (HIb) or (HIc) as previously defined will be used.
  • a monomer of formula (II), (IIa), (Hb) or (Ile) as previously defined will be used.
  • the subject of the present invention is electroactive probes in the form of a conductive copolymer capable of being obtained by copolymerization between two different monomers of which at least one is in accordance with the invention, at least one, and preferably one, monomers carrying a biological ligand
  • the copolymerization will be carried out starting from a monomer of formula (III), (HIa), (HIb) or (IIIc) and a monomer (I), (Ia), (Ib) or (Ic) as previously defined. This gives a spacing of biological ligands probe which improves the sensitivity.
  • the electroactive probes in the form of a conductive copolymer that can be obtained by electropolymerization of at least one, and preferably a single, soluble monomer according to the carrier invention. of an amine, hydroxyl or carboxylic acid reactive functional group (F), optionally in protected form, followed by a coupling of said reactive function (F) with a biological ligand, form an integral part of the invention.
  • the copolymerization will be carried out starting from a monomer of formula (II), (IIa), (Hb) or (Ile) and a monomer (I), (Ia), (Ib) or (Ic) as previously defined.
  • a pair of monomers (II) / (I) or (IIa) / (Ia) or (IIb) / (Ib) or (IIc) / (Ic) in which M, Al and R are identical will be used.
  • the present invention also relates to an electropolymerization process carried out in aqueous solution, implementing at least one of the monomers according to the invention, and in particular at least one of the monomers carrying a biological ligand.
  • This electropolymerization may be a homopolymerization.
  • the electropolymerization will be a copolymerization carried out between two different monomers of which at least one is in accordance with the invention.
  • at least one, and preferably only one, monomer carries a biological ligand.
  • the copolymerization will be carried out starting from a monomer of formula (III), (IHa) 7 (HIb) or (HIc) and a monomer (I), (Ia), (Ib) or (Ic) as previously defined.
  • a pair of monomers (III) / (I) or (IIIa) / (Ia) or (IIIb) / (Ib) or (IIIc) / (Ic) in which M, Al and R are identical will be used. .
  • copolymerization of at least two different soluble monomers according to the invention each carrying a reactive function (F) amine, hydroxyl or carboxylic acid, optionally in protected form.
  • This copolymerization reaction in aqueous phase will advantageously be followed by coupling of said reactive function (F) with a biological ligand.
  • the copolymerization will be carried out starting from a monomer of formula (II), (IIa), (Hb) or (Ile) and a monomer (I), (Ia), (Ib) or (Ic) as previously defined.
  • the subject of the present invention is also the polymers that can be obtained by such polymerization reactions, optionally followed by coupling with a biological ligand.
  • the present invention also relates to electrodes comprising a conductive support of which all or part of the surface is coated with an electroactive probe as defined above.
  • the present invention also relates to a method for detecting a target ligand in a biological sample, in which the sample is brought into contact with an electroactive probe as defined. previously, carrying a probe ligand, under conditions suitable for the probe ligand / target ligand interaction and the difference in potential or current emitted by the probe before and after being placed in contact with, and possibly quantifying, the potential and current difference with the sample.
  • the polymers obtained from the monomers according to the invention can be used in particular in all applications in which biological ligands are addressed and immobilized on a solid support.
  • these polymers can be obtained in the form of self-supported films or in the form of an electrode film.
  • the electrode makes it possible to control, by measuring the current delivered during the reaction, the evolution of the polymerization reaction.
  • the electrode also makes it possible to measure the subsequent electrochemical responses of the polymer.
  • the present invention therefore also relates to an electrode comprising a conductive support coated on the surface with at least one electroactive conductive polymer functionalized with biological ligands according to the invention, that is to say an electroactive probe according to the invention.
  • the state of the art is known of conductive supports for electrodes, in particular substrates made of metal or of carbon derivatives.
  • the polymer is generally deposited on the conductive support.
  • the electrochemical polymerization is advantageously carried out at the surface of the electrode to obtain an electrode comprising a conductive support coated on the surface of a polymer according to the invention.
  • the electrode is obtained by depositing a layer of polymer on the surface of a support in gold or platinum.
  • the monomers according to the present invention allow the immobilization and addressing of biological ligands on small surfaces.
  • This electrocopolymerization addressed makes it possible to produce a matrix of miniaturized and ordered points, each of the points carrying a defined biological ligand.
  • the invention thus also relates to an electrode matrix.
  • the invention therefore also relates to an electrode matrix comprising at least one electrode according to the invention.
  • electrode matrices may be in the form of a card or analysis chip comprising a series of wells, each well corresponding to an electrode.
  • the different electrodes of the matrix carry different biological ligands.
  • the invention relates to a plurality of electrodes or microelectrodes fixed on a solid support, these electrodes are coated with a copolymer according to the invention and advantageously carry different biological ligands.
  • Such matrices of electrodes may advantageously be obtained by electropolymerization of monomers according to the invention, and in particular by copolymerization of at least two monomers, at least one of which carries a biological ligand, such as a monomer of formula (III), (HIa), (HIb) or (IIIc) and a non-functionalized monomer with a ligand, such as a monomer of formula (I), (Ia), (Ib) or (Ic).
  • a biological ligand such as a monomer of formula (III), (HIa), (HIb) or (IIIc)
  • a non-functionalized monomer with a ligand such as a monomer of formula (I), (Ia), (Ib) or (Ic).
  • the electrodes and the matrices of electrodes according to the invention are particularly useful for the detection of analytes likely to be present in a sample and likely to react specifically with the biological ligands carried by the polymer.
  • the present invention makes it possible to detect a target ligand in any type of sample.
  • the sample is a biological sample.
  • this sample may have been taken from a patient for diagnostic purposes.
  • the sample may be, for example, urine, blood, serum, plasma, cell extracts or body fluid.
  • the probe Since the probe is electroactive, its electrochemical response will be modified when a target ligand interacts specifically with the probe ligand carried by the polymer.
  • the electroactive conductive polymer according to the invention therefore translates the interaction with the target ligand into an electrochemical signal.
  • the specific interaction of a ligand target with the oligonucleotides carried by the polymer causes a change in the electrochemical response of the polymer studied compared to that obtained before introduction of the target ligand.
  • the detection of the target ligand is therefore performed by an electrical measurement.
  • electrical measurement is meant the measurement of a potentiometric type variation such as the variation of the oxidation potential of the polymer or the measurement of an amperometric type variation by variation of the oxidation current observed at a given potential.
  • the electrical measurement consists of measuring a potential variation or a current variation.
  • cyclic voltammetry is used. It is an electroanalytical method that consists in sweeping a range of potential in one direction then in the other, at constant speed. The voltammogram obtained gives the current response of the electrochemical system studied and allows its characterization.
  • the detection of the specific interaction between the target ligand and the probe ligand carried by the polymer can be done with the electrode which was used for the electropolymerization of the polymer.
  • the hybridization of a nucleic acid complementary to oligonucleotides carried by the polymer can be detected by electrical measurement on the electrode which supports the polymer according to the invention.
  • Hybridization of oligonucleotides can be directly monitored by measuring the variation of the detected electrochemical signal or via an enzymatic reaction.
  • the target oligonucleotide is, for example, carrying a biotin.
  • the detection can be done either at the level of the substrate, or at the level of the electrochemical signal.
  • the monomer Ia.1 is prepared according to the scheme below
  • reaction medium After stirring for 6 hours at this temperature, the reaction medium is cooled to ambient temperature and left stirring overnight.
  • 40 mg (1.06 mmol, 1.10 eq.) Of sodium borohydride (Aldrich) is added directly to the reaction medium. Allowed to react for 2 hours with stirring at room temperature.
  • the ethanol is then evaporated, the medium taken up in dichloromethane then purified on a silica column with a mixture of dichloromethane-methanol-triethylamine 80-18-2.
  • ferrocene (10-amino-5,8-dioxa-2-azadedyl) (0.26 mmol, 1 eq.) are introduced into a flask and dissolved in 1 ml of acetonitrile / water mixture. 10. 0.26 mmol (1 eq) of phthalimidyl or succinimidyl activated pyrrole ester obtained in paragraph I.2.b previously dissolved in 1 ml of solvent are added slowly. The mixture is stirred at room temperature for 30 minutes (phthalimidyl ester) at 4 hours. (succinimidyl ester). The reaction medium is then purified on a silica column with a 90-10 dichloromethane-methanol mixture. 15 mg of a yellow solid (0.03 mmol, 13%) which is soluble in water to a concentration of at least 30 mM is obtained.
  • the monomer (Here) is obtained from the monomer (Ia.1) by a methylation reaction.
  • Step 1 Synthesis of 1- [3-O- (2-cyanoethyl-N, N-diisopropylphosphoramide) propyl] ferrocene:
  • Ferrocene monopropanol (53.3 mg, 0.218 mmol) is coevaporated three times in 1 ml of anhydrous acetonitrile. After taking the orange oil in ImL anhydrous acetonitrile under argon the DIPEA (120 ⁇ L, 0.480mmol), then chlorophosphine (42 ⁇ L, 0.240mmol) are added. The progress of the reaction is monitored by TLC (cyclohexane-ethyl acetate-triethylamine, (49.5: 49.5: 1)), on premigrated plates in the same eluent: after 10 min of reaction there is a more starting material, the reaction medium is concentrated by half.
  • TLC cyclohexane-ethyl acetate-triethylamine, (49.5: 49.5: 1)
  • the crude reaction product obtained is purified on silica gel, neutralized with a cyclohexane-triethylamine mixture (99: 1); eluent ethyl acetate-cyclohexane (50:50).
  • the oil is taken up in ImL of acetonitrile and then filtered on 0.45 ⁇ m PVDF filter, the product is concentrated.
  • Step 2 Synthesis of [3-Ferrocenylpropyl-2-cyanoethyl-2- (3-pyrrole) ethyl] phosphate triester: 1) Tetrazole
  • Pyrrole-3-ethanol (26 mg, 0.233 mmol) is coevaporated twice in 1 ml of anhydrous acetonitrile and then taken up in 1 ml of anhydrous acetonitrile.
  • the 0.45M terazole solution in acetonitrile (1 mL, 0.436 mmol) is added in the presence of a few grains of molecular sieve (3 angstroms).
  • the ferrocene phosphoramidite derivative obtained at step 1 (97 mg, 218 mmol) is added in solution in anhydrous acetonitrile (ImL). The solution becomes orange.
  • reaction is monitored by TLC in the eluent cyclohexane-ethyl acetate-triethylamine (49.5: 49.5: 1). After one hour of reaction, no more starting material remains, the oxidation solution (butanone peroxide 0.67% in dichloromethane) (2 ml) is added. The solution becomes brown.
  • the product is purified on silica gel previously neutralized with a dichloromethane-triethylamine mixture (99: 1), eluent: dichloromethane-methanol (90:10).
  • Step 3 Synthesis of [3-ferrocenylpropyl-2- (3-pyrrole) ethyl] phosphate diester rib.11
  • reaction crude thus obtained is purified on silica gel, conditioned with a mixture of dichloromethane-triethylamine (99: 1). For this purification an elution gradient is necessary: dichloromethane-methanol (100: 0) to (85:15). After purification, 21.1 mg (0.05 mmol, 48%) of a yellow-orange oil are obtained. at
  • reaction medium is then purified on a silica column with an 80-20 dichloromethane-methanol mixture. 18 mg (0.02 mmol, 17%) of a brown-yellow oil which is soluble in water are obtained, at least up to a concentration of 100 mM.
  • This monomer is obtained from the monomer (Ha.1). It suffices to carry out a deprotection of the primary amine (removal of the trifluoroacetyl group) as illustrated in the diagram below.
  • the monomer (Hb.1) is prepared according to the scheme below
  • silica (prior silica neutralization with TEA) with a gradient of
  • Monomer IIa.2 (1 eq) is dissolved in water.
  • DiSuccinimidylGIutaryl 200 eq is dissolved in the minimum amount of DMF such that the final proportion of DMF does not exceed 10%. Allowed to react 2h at 37 ° C with stirring. Then a reverse phase silica column is made by eluting with a water-acetone mixture. The desired product is recovered which can be identified by its yellow color. Acetone is evaporated.
  • the coupling is allowed to proceed for 1 h at 37 ° C. with stirring and then the conjugate can be purified by HPLC.
  • Figure 9 Percent decrease in current intensity at the peak of oxidation of ferrocene as a function of time; (") control (polymer prepared with the monomer Ib.1 and 3-ethanol pyrrole) + addition of the HBV complementary target (A) + addition of the non-complementary target HIV (4) + addition of the complementary target HBV .
  • the readings were carried out with a buffer already used for detecting biological interactions.
  • the MICAM oligonucleotide hybridization buffer (Apibio, Grenoble, France) was used. This last buffer contains: 9.5 mM phosphate buffer, 0.515 M NaCl, 2.6 mM KCl, 0.048% Tween, Denhardt IX, salmon sperm DNA 10 ⁇ g / mL
  • Lb- A copolymer layer with the monomer (Ib.1) and pyrrole-3-ethanol was also carried out.
  • the following formulation is used: 50 mM pyrrole-3-ethanol and 20 mM monomer (Ib.l).
  • the deposits are made at 0.60 V with a load of 21.6 mC / cm 2 in 10 mM sodium acetate / acetic acid buffer, pH 4.2, 0.2 M LiClO 4.
  • the voltammogram obtained at 200 mV / s in the deposition buffer clearly shows the reduction and oxidation of ferrocene.
  • the voltammogram of the polymer formed in this same buffer is shown in Figure 2 and shows the oxidation and reduction of ferrocene.
  • the voltammogram obtained is rather dissymmetrical for scanning rates higher than 50 mV / s, which reflects the fact that the polymer layer obtained is sterically constrained and therefore the electron exchanges are less easy.
  • IXLb- A layer of copolymer with the monomer (Ila.l) and 3-pyrrole-3-ethanol was also carried out.
  • the advantage of making a copolymer lies in the fact that it will make it possible to space, through the pyrrole-3-ethanol, the positive charges on the surface of the layer.
  • a concentration of 50 mM pyrrole-3-ethanol and 20 mM monomer (IIa.l) is used to make each deposit on an electrode chip.
  • Two deposit buffers yielded good results:
  • the monomer was electropolymerized at a concentration of 2 mM in a
  • Electropolymerization was carried out by 3-chronoamperometry
  • sequences is derived from the HIV virus (SEQ ID No. 1). The others are from the HIV virus.
  • HBV-105C virus (SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3).
  • the grafting of pyrrole is
  • oligonucleotide modified at the 5 'position by a hexylamine.
  • a copolymer was obtained from 50 mM pyrrole-3- monomer
  • oligonucleotides derived from the HBV virus SEQ ID No. 2 and SEQ ID No. 3, each at
  • the hybridization buffer contains sodium acetate / acetic acid
  • sequence SEQ ID No. 4 is a 33-mer.
  • the HBV capture probe oligonucleotide (SEQ ID No. 3) modified at the 5 'position
  • HBV-105C pyrrole
  • the hybridization reaction is monitored over time by measuring the
  • HBV or HIV HBV or HIV
  • the white is made on a polymer pad that does not contain
  • the monomer (Here) is copolymerized at 0.60 V and 21.6 mC / cm 2 with pyrrole monomers functionalized with oligonucleotides (SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, provided by Biomérieux Polytech).
  • the concentrations of the monomers are respectively 15 mM and 3.75 ⁇ M.

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Abstract

L'invention concerne un monomère électropolymérisable, destiné à être polymérisé en solution aqueuse, comportant un seul motif électropolymérisable et un groupe électrodonneur caractérisé en ce qu'il comprend également au moins un bras ionisable en solution aqueuse. L'invention est également relative au procédé de polymérisation, à la sonde électroactive ainsi obtenue et au procédé de détection d'un ligand cible dans un échantillon biologique.

Description

électroactives susceptibles d'être obtenues avec de tels monomères »
L'invention concerne le domaine technique de l'électropolymérisation. En particulier, la présente invention a pour objet des monomères électropolymérisables solubles en solution aqueuse.
Les polymères électroactifs sont utilisés dans de nombreux domaines d'applications. Par exemple, il est possible d'utiliser des polymères électroactifs pour détecter l'interaction d'un ligand biologique sonde avec un ligand biologique cible. L'interaction spécifique d'un ligand sonde avec un ligand cible entraîne une variation sensible et sélective des propriétés électrochimiques du polymère électroactif, telle qu'une diminution de l'électroactivité dudit polymère. Cette variation, qui dépend de la concentration en ligand cible lié sur un ligand sonde, est observée, éventuellement mesurée, et directement corrélée à la quantité de ligand cible lié. Une des applications essentielles de cette technique réside donc dans la détection, l'identification, et éventuellement le dosage d'un ligand, présent dans un échantillon biologique. La variation précitée est de type potentiométrique, et correspond, par exemple, à une variation du potentiel d'oxydation du polymère électroactif avant et après interaction, ou de type ampérométrique, et correspond, par exemple, à une variation du courant d'oxydation ou de réduction du polymère avant et après hybridation, déterminé à un potentiel déterminé. Pour caractériser précisément la réponse électrochimique du polymère, celui-ci doit présenter une forte électroactivité. Des polymères obtenus par électropolymérisation, par exemple sous la forme d'homopolymère ou copolymère de pyrroles et comportant un groupe électrodonneur, tel qu'un ferrocène, permettant d'améliorer son électroactivité et sa conductivité ont donc été développés et décrits notamment dans la demande de brevet WO 01/81446.
Les réactions d'électropolymérisation sont généralement réalisées en solvant organique, les monomères mis en oeuvre étant hydrophobes. En matière de détection électrochimique, les systèmes utilisés jusqu'à présent nécessitent une électropolymérisation en solvant organique car les monomères utilisés, par exemple ferrocénylés, sont plutôt hydrophobes (Synthetic Metals, 2001, 119, 265-266). Or, des manipulations en milieu organique ne sont pas compatibles avec l'utilisation de biomolécules. Ces dernières ne sont pas solubles dans de tels milieux et/ou, bien souvent, s'y dénaturent et leurs propriétés sont altérées. Dans le cas des protéines, on constate le plus souvent une perte de la conformation active. De ce constat, deux stratégies ont jusqu'à présent, émergé : la première consiste à réaliser, sur une puce à électrodes, plusieurs couches de polymères conducteurs avec, en partant de l'électrode, une couche polypyrrole (déposée en solvant), une couche de copolymère pyrrole / pyrrole-ferrocène (déposée en solvant) et enfin une couche de copolymère pyrrole / pyrrole lié covalemment à une biomolécule (dépôt en milieu aqueux). Cette stratégie nommée « multi-couche » est par exemple décrite dans FR 2849038. Des polymères pouvant être utilisés dans cette stratégie sont, par exemple, décrits dans WO 95/29199 et dans WO 01/81446 qui décrit des polymères présentant une électroactivité améliorée, obtenus par électropolymérisation, par exemple sous la forme d'homopolymère ou copolymère de pyrroles et comportant un groupe électrodonneur, tel qu'un ferrocène. Cette stratégie « multi-couche » ne donne pas entière satisfaction, car elle est fastidieuse du fait de la mise en œuvre de plusieurs transitions solvant organique-milieu aqueux avec à chaque fois la nécessité de rincer la puce plusieurs fois.
L'autre stratégie est nommée post-fonctionnalisation : elle consiste en la fixation covalente post-polymérisation de biomolécules, en milieu aqueux, grâce à des fonctions réactives situées sur la couche de polymère. On pourra notamment se référer à Synthetic Metals 1999, 89-94 et à Biomacromolecules 2001, 2, 58-64. Cette stratégie de post-fonctionnalisation ne permet pas, quant à elle l'adressage de biomolécules. De plus, elle présente un manque de reproductibilité plot à plot lié à la variabilité de l'efficacité de couplage de la biomolécule sur le polymère.
Or, la détection de biomolécule par voie électrochimique est un principe prometteur de détection dont l'atout principal est l'absence de marquage préalable des biomolécules, qui est obligatoire pour une détection par fluorescence, par exemple. De plus, les appareillages nécessaires pour une mesure de potentiel électrochimique sont peu encombrants et laissent entrevoir une grande praticité d'utilisation.
Compte tenu des inconvénients de l'art antérieur, les inventeurs se proposent de fournir de nouveaux monomères qui soient parfaitement compatibles avec une réaction d'électropolymérisation en milieu aqueux et qui permettent donc de s'affranchir de l'utilisation de solvant organique. De ce fait, les monomères selon l'invention sont parfaitement compatibles pour porter des ligands biologiques.
Dans ce contexte, la présente invention a tout d'abord pour objet un monomère électropolymérisable, destiné à être polymériser en solution aqueuse, comportant un seul motif électropolymérisable et un groupe électrodonneur, ainsi qu'au moins un bras ionisable en solution aqueuse.
De façon avantageuse, le monomère électropolymérisable tel que défini ci-dessus présente l'une ou plusieurs des caractéristiques ci-après : - il est soluble dans l'eau distillée, au moins jusqu'à une concentration de ImM, de préférence au moins jusqu'à une concentration de 1OmM, et préférentiel lement au moins jusqu'à une concentration de 3OmM,
- il comprend, en tant que bras ionisable, un bras de liaison ionisable en solution aqueuse, qui assure la liaison entre le motif électropolymérisable et le groupe électrodonneur ; de préférence, le bras de liaison ionisable comprend une fonction ionisable en solution aqueuse choisie parmi les fonctions : aminé, acide carboxylique et phosphate,
- il comprend un bras libre non ionisable qui est fixé sur le groupe électrodonneur uniquement, - il comprend, un bras libre qui porte, un ligand biologique, choisi parmi les polynucléotides, les polypeptides, les protéines, les antigènes, les anticorps, les haptènes, la biotine, les oligosaccharides ; en particulier, le ligand biologique est un polynucléotide ;
- le motif électropolymérisable est choisi parmi l'acétylène, les pyrroles, les thiophènes, les indoles, les anilines, les azines, les p-phénylènevinylènes, les p-phénylènes, les pyrènes, les furanes, les sélénophènes, les pyrridazines, les carbazoles, les acrylates, les méthacrylates et leurs dérivés ; de préférence le motif électropolymérisable est un pyrrole, la liaison au bras de liaison ionisable étant, de préférence, assurée en position 3 du pyrrole,
- le groupe électrodonneur est choisi parmi les métallocènes, la quinone et leurs dérivés ; de préférence le groupe électrodonneur est un férrocène.
Les monomères selon l'invention, de part la présence d'un bras ionisable en solution aqueuse, vont être solubles en solution aqueuse, autorisant ainsi leur polymérisation dans de tels milieux aqueux.
Avant de décrire plus en détail l'invention, certains termes et expressions utilisés dans le cadre de la présente invention vont maintenant être définis.
Par « monomère électropolymérisable », on entend un monomère comportant un seul motif électropolymérisable, ledit monomère étant susceptible de réagir par polymérisation électrochimique avec d'autres monomères pour former un polymère. Un motif électropolymérisable présente une alternance de liaisons simples et de doubles liaisons. A titre d'exemple de motif électropolymérisable, on peut citer l'acétylène, les pyrroles, les thiophènes, les indoles, les anilines, les azines, les p- phénylènevinylènes, les p-phénylènes, les pyrènes, les furanes, les sélénophènes, les pyrridazines, les carbazoles, les acrylates, les méthacrylates et leurs dérivés. Les monomères comportant un seul motif électropolymérisable choisi parmi l'acétylène, les pyrroles, les thiophènes, les indoles, les anilines, les azines, les p-phénylènevinylènes, les p-phénylènes, les pyrènes, les furanes, les sélénophènes, les pyrridazines, les carbazoles et leurs dérivés qui conduisent à un polymère conducteur seront préférés.
Par « bras ionisable en solution aqueuse », on entend un groupe chimique hydrophile susceptible de former un cation ou un anion en solution aqueuse. La forme ionisée en solution aqueuse est obtenue selon un premier mode de réalisation sans mise en oeuvre d'une réaction chimique, de type hydrolyse ou dégradation. La forme ionisée est, par exemple, obtenue par échange d'un proton ou sous la forme d'une paire d'ions en solution à partir d'un sel. De tels bras ionisables, comportent notamment un groupe aminé, polyamine, acide carboxylique (-COOH) ou phosphate ou sulfonate. Pour augmenter le caractère hydrophile du bras ionisables et donc la solubilité du monomère sur laquelle il est fixé, celui-ci peut également contenir un groupement polyéther. Un bras ionisable se trouve sous forme ionique lorsqu'il est mis dans une solution aqueuse qui présente un pH compris entre 5 et 8. De façon avantageuse, le bras ionisable se trouve sous forme ionisée dans l'eau distillée.
Selon un second mode de réalisation la forme ionisée en solution aqueuse est obtenue par une réaction chimique. Dans ce cas le monomère ionisé est obtenu par une réaction d'alkylation à partir du monomère Ia, Ha ou IHa, selon le schéma ci-dessous : Ia
Figure imgf000006_0001
lia
Figure imgf000006_0002
IHa
Figure imgf000007_0001
A2, A3, Li, R, R6, R7, Zi sont tels que définis plus loin. De préférence la réaction d'alkylation est une réaction de bis méthylation.
Par « monomère soluble en solution aqueuse », on entend un monomère soluble en solution aqueuse dans les conditions de polymérisation, à savoir dans les conditions de température, pH et force ionique utilisées lors de sa mise en œuvre dans une réaction de polymérisation par voie électrochimique. L'electropolymérisation sera, en général, réalisée dans une solution aqueuse dont le pH est compris entre 3 et 8 et à une température de l'ordre de 20 à 3O0C. De préférence, la solubilité d'un monomère selon l'invention sera telle que l'introduction dudit monomère dans l'eau distillée à une température de 25° C, au moins jusqu'à une concentration de ImM, de préférence au moins jusqu'à une concentration de 1OmM, et préférentiellement au moins jusqu'à une concentration de 3OmM, conduise à une solution homogène et transparente à l'œil nu, sans précipitation.
On entend par « polymérisation » une réaction par voie chimique ou électrochimique d'unités de même nature chimique permettant l'assemblage d'un certain nombre de monomères pour former un polymère (r x M → (M)r avec r supérieur ou égal à 2). Le terme « polymérisation » englobe la copolymérisation et l'homopolymérisation. Il s'agit avantageusement dans le cadre de l'invention de la condensation de motifs pyrrole pour former un polypyrrole. On entend par « copolymérisation » la polymérisation simultanée de monomères différents, tel que, par exemple, la polymérisation simultanée d'un mélange d'un monomère substitué porteur d'un ligand biologique et d'un monomère soluble ne comportant pas de ligand biologique.
Les termes « électropolymérisation », « électrocopolymérisation », « copolymérisation électrochimique » et « polymérisation électrochimique » désignent une polymérisation par voie électrochimique. Les procédés d'électropolymérisation sont bien connus de l'homme du métier. On citera par exemple les techniques de la voltampérométrie cyclique, la chronopotentiométrie (courant imposé) et la chronoampérométrie (potentiel imposé). Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la polymérisation sera effectuée par un dépôt par chronoampérométrie ou dépôt à potentiel contrôlé. Cette méthode consiste à imposer un saut de potentiel à partir du potentiel d'équilibre (courant nul) jusqu'à une valeur fixe à laquelle s'effectue la réaction à l'électrode et à mesurer le courant en fonction du temps.
Les « conditions de polymérisation » désignent le pH, la température et la force ionique de la solution aqueuse utilisée lors de la polymérisation. Dans le cas du pyrrole, l'électropolymérisation s'effectue par le mécanisme de Diaz (Sadki et al, Chem. Soc. Rev., 29 : 283-293, 2000) conduit à la formation du polypyrrole. Cette polymérisation s'effectue au niveau des positions 2 et 5 des monomères pyrrole. Un pyrrole substitué en position 3 ou 4 du noyau pyrrole est donc susceptible de polymériser ou de copolymériser avec d'autres pyrroles au niveau des positions 2 et 5. Les motifs pyrroles substitués en position 3 sont préférés.
On entend par « polymère conducteur », un polymère dont les électrons sont fortement délocalisés, le plus souvent le long d'un enchaînement de liaisons simples et doubles (liaisons conjuguées), ce qui le conduit à se comporter comme un semi-conducteur micro-électronique.
Par « groupe électrodonneur », on entend un groupe chimique correspondant à un couple redox présentant une vague d'oxydation étroite, rapide et réversible, tels que les métallocènes comme le ferrocène, la quinone et leurs dérivés.
Les groupes protecteurs des alcools, aminés et acides carboxyliques sont bien connus de l'homme du métier. On pourra notamment se référer à « Protective Groups in Organic Synthesis », 2nde édition, Greene T.W. et Wuts P.G.M., ed John Wiley et Sons, 1991.
A titre de groupe protecteur des alcools, on peut citer, à titre d'exemple, les groupes acyle, trityle, silyle, et tétrahydrofuranyle.
A titre de groupe protecteur des acides carboxyliques, on peut citer, à titre d'exemple, les groupements chimiques conduisant à des esters, en particulier des alkylesters, acylesters, silylesters ou thioesters.
A titre de groupe protecteur des aminés, on peut citer, à titre d'exemple, les groupes trifluoroacétyle, te/t-butoxycarbonyle et 9- fluorénylméthoxycarbonyle. A titre de groupe activateur des acides carboxyliques, on peut citer, à titre d'exemple, les groupes succinimidyle ou phtalimidyle, ou tout autre groupe permettant de former un ester activé.
A titre de groupe activateur des alcools ou des aminés, on peut citer, à titre d'exemple, les groupements, conduisant, dans le cas des alcools, à un phosphodiester, phosphotriester, H-phosphonate ou phosphoramidite et dans le cas des aminés, à un phosphoramidate monoester, phosphoramidate diester, H-phosphoramidate ou phosphoramidite. De tels groupements sont notamment choisi parmi :
° OR1 H
I I NR1R" P-OR' -P-OR" -P-OR1 _p'
O O O -t. NOR'" avec R', R", R'" qui représentent un groupe alkyle ou aryle, par exemple.
Par ligand biologique, on entend un composé qui possède au moins un site de reconnaissance lui permettant de réagir avec une molécule cible d'intérêt biologique. A titre d'exemple, on peut citer, comme ligands biologiques, les polynudéotides, les antigènes, les anticorps, les polypeptides, les protéines, les haptènes, la biotine, les oligosaccharides ... Un couple ligand/anti-ligand susceptible d'interagir spécifiquement pour former un conjugué est également nommé, dans la présente invention ligand sonde/ligand cible.
Le terme "polynucléotide" signifie un enchaînement d'au moins 2 désoxyribonucléotides ou ribonucléotides comprenant éventuellement au moins un nudéotide modifié, par exemple au moins un nucléotide comportant une base modifiée tel que l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée permettant l'hybridation. Ce polynucléotide peut aussi être modifié au niveau de la liaison internucléotidique comme par exemple les phosphorothioates, les H phosphonates, les alkyl-phosphonates, au niveau du squelette comme par exemple les alpha-oligonucléotides (FR 2 607 507), ou les PNA (Egholm M. et al., J. Am. Chem, Soc, 1992, 114, 1895-1897), ou les 2-O-alkyl ribose, ou les LNA (de l'anglais « Loked Nucleic Acids », décrits notamment dans la demande de brevet publiée sous le numéro WO 00/66 604). Chacune de ces modifications peut être prise en combinaison. Le polynucléotide peut être un oligonucléotide, un acide nucléique naturel ou son fragment comme un ADN, un ARN ribosomique, un ARN messager, un ARN de transfert, un acide nucléique obtenu par une technique d'amplification enzymatique.
Par "polypeptide", on entend un enchaînement d'au moins deux acides aminés. Par acides aminés, on entend les acides aminés primaires qui codent pour les protéines, les acides aminés dérivés après action enzymatique comme la
Figure imgf000010_0001
et les acides aminés naturels mais non présents dans les protéines comme la norvaline, la /V-méthyl-L-leucine, la Staline (Hunt S. dans Chemistry and Biochemistry of the amino acides, Barett G.C., éd., Chapman and Hall, London, 1985), les acides aminés protégés par des fonctions chimiques utilisables en synthèse sur support solide ou en phase liquide et les acides aminés non naturels. Le terme "haptène" désigne des composés non immunogènes, c'est-à- dire incapables par eux-mêmes de promouvoir une réaction immunitaire par production d'anticorps, mais capables d'être reconnus par des anticorps obtenus par immunisation d'animaux dans des conditions connues, en particulier par immunisation avec un conjugué haptène-protéine. Ces composés ont généralement une masse moléculaire inférieure à 3000 Da, et le plus souvent inférieure à 2000 Da et peuvent être par exemple des peptides glycosylés, des métabolites, des vitamines, des hormones, des prostaglandines, des toxines, des antibiotiques ou divers médicaments, les nucléosides et les nucléotides.
Le terme "anticorps" inclut les anticorps polyclonaux ou monoclonaux, les anticorps obtenus par recombinaison génétique et des fragments d'anticorps. Le terme "antigène" désigne un composé susceptible d'être reconnu par un anticorps dont il a induit la synthèse par une réponse immune. Le terme "protéine" inclut les holoprotéines et les hétéroprotéines comme les nucléoprotéines, les lipoprotéines, les phosphoprotéines, les métalloprotéines et les glycoprotéines aussi bien fibreuses que globulaires.
Selon un autre de ses aspects, la présente invention a pour objet les différentes séries de monomères comportant un motif pyrrole et un motif métallocène tels que définis ci-après : a) tout d'abord les monomères de formule (I) :
Figure imgf000011_0001
dans laquelle :
- M est un métal de transition, de préférence Fe, Ru ou Os, - Ai est un enchaînement :
• -A2-X-A3- avec : X qui représente -NR1-, -Y-P(O)(OR2)-O- ou -N+R6R7- o Y qui représente O ou NH, o A2 qui représente -(CH2)mr, <CH2)m2-O-[(CH2)2O]m3-(CH2)2- ou -(CH2)m4-C(O)-NR3-[(CH2)2O]m5-(CH2)2- o A3 qui représente -(CH2)ni-, -[(CH2)2O]n2-(CH2)n3- ou
-[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5-, o ml et ni qui représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un entier compris dans la gamme allant de 1 à 6 ; étant entendu que si X représente -NR1- et les groupes A2 et A3 représentent respectivement -(CH2)mr et -(CH2)nr alors la somme ml + ni est comprise dans la gamme allant de 2 à 6, o m2 et n3 qui représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un entier compris dans la gamme allant de O à 3, de préférence dans la gamme allant de 1 à 3, o m3, n2, m4, n4, m5 et n5 qui représentent, chacun indépendamment les uns des autres, un entier compris dans la gamme allant de 0 à 6, de préférence dans la gamme allant de 1 à 6, o R1, R3 et R4 qui représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou un groupe (Ci-C4)alkyle, et o R2 qui représente un atome d'hydrogène ou un groupe (Ci-C-Oalkyle, cyanoéthyle ou 2-chlorophényle, • ou bien -A4-[NH(CH2)^n-A5- avec : o A4 qui représente -(CH2)pi- ou -(CH2)p2-C(O)-, o A5 qui représente -(CH2)qi- ou, -NR5-C(O)-(CH2)q2-, o n qui est un entier compris dans la gamme allant de 2 à 6, o pi, ql, p2 et q2 qui représentent, chacun indépendamment les uns des autres, un entier compris dans la gamme allant de 1 à 6, o R5 qui représente un atome d'hydrogène ou un groupe
(Ci-C4)alkyle, par exemple méthyle ou éthyle, o R6, R7 qui représente chacun indépendamment l'un de l'autre un groupe (Ci-C4)alkyle,
- R représente un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur de la fonction aminé, par exemple choisi parmi les groupes monométhoxytrityle, diméthoxytrityle, tosyle, triisopopyl silyle, tert-butoxycarbonyle, 9- fluorényloxycarbonyle, benzyloxycarbonyle, triphénylméthanesulfényle et acétyle, b) ensuite les monomères de formule (II) :
dans laquelle :
- M, Ai et R sont tels que définis pour les monomères de formule
(I),
- AÔ représente un bras espaceur défini comme suit : o lorsque Ai est un enchaînement -A2-NR^A3- ou -A2- N+R6R7-A3-, dans lequel R1, A2, A3, R6 et R7 sont tels que définis pour les monomères de formule (I) et
• quand A2 représente -(GH2)mi- ou -(CH2)m2-O- [(CH2)2O]m3-(CH2)2- et A3 représente -(CH2)ni- ou -[(CH2)2O]n2-(CH2)n3-, alors Ae représente un enchaînement -A2-NR1-, avec ml, m2, m3, ni, n2, n3 et
R1 tels que définis pour les monomères de formule (I),
• quand A2 représente -(CH2)m4-C(O)-NR3- [(CH2)2O]m5-(CH2)2- et A3 représente -(CH2)ni- ou -[(CH2)2O]n2-(CH2)n3-, alors A6 représente un enchaînement -(CH2)m4-C(O)O-, ou -A2-NR1-, avec m4, R3, m5, ni, n2, n3 et R1 tels que définis pour les monomères de formule (I),
• quand A2 représente -(CH2)mi- ou -(CH2)m2-O- [(CH2)2O]m3-(CH2)2- et A3 représente -[(CH2)2O]n4-(CH2)2- NR4-C(O)-(CH2)n5-, alors A6 représente un enchaînement
-A2-NR1- ou -A2-NR4(CH2)2OJn4-(CH2)2-NR4-, avec ml, m2, m3, n4, R4, n5 et R1 tels que définis pour les monomères de formule (I),
• quand A2 représente -(CH2)m4-C(O)-NR3- [(CH2)2O]m5-(CH2)2- et A3 représente -[(CH2)2O]n4-(CH2)2-
NR4-C(O)-(CH2)n5-, alors A6 représente un enchaînement -(CH2WC(O)O-, -A2-NR1- ou
-A2-NR1-[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-, avec m4, R3, m5, n4, n5, R4 et R1 tels que définis pour les monomères de formule (I), o lorsque Ai est un enchaînement -A2-Y-P(O)(OR2)-O-A3-, dans lequel R2, A2, A3 et Y sont tels que définis pour les monomères de formule (I) et
• quand A2 représente -(CH2)mr ou -(CH2)m2-O- [(CH2)2O]m3-(CH2)2- et A3 représente -(CH2)ni- ou
-[(CH2)2O]n2-(CH2)n3-, alors A6 représente un enchaînement -A2-Y-, avec ml, m2, m3, ni, n2, n3 et Y tels que définis pour les monomères de formule (I),
• quand A2 représente -(CH2)m4-C(O)-NR3- [(CH2)2O]m5-(CH2)2- et A3 représente -(CH2)nl- ou
-[(CH2)2O]n2-(CH2)n3-, alors A6 représente un enchaînement -(CH2)m4-C(O)O- ou - A2-Y-, avec m4, R3, m5, ni, n2, n3 et Y tels que définis pour les monomères de formule (I),
• quand A2 représente -(CH2)mr ou -(CH2)m2-O- [(CH2)2O]m3-(CH2)2- et A3 représente -[(CH2)2O]n4-(CH2)2-
NR4-C(O)-(CH2)n5-, alors A6 représente un enchaînement -A2-Y- ou -A2-Y-P(O)(OR2)-O-[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-, avec ml, m2, m3, n4, n5, Y, R4 et R2 tels que définis pour les monomères de formule (I),
• quand A2 représente -(CH2)m4-C(O)-NR3- [(CH2)2O]m5-(CH2)2- et A3 représente -[(CH2)2O]n4-(CH2)2- NR4-C(O)-(CH2)n5-, alors A6 représente un enchaînement
-(CH2)m4-C(O)O-, -A2-Y- ou -A2-Y-P(O)(OR2)-O-[(CH2)2O]n4- (CH2)2-NR4-, avec m4, R3, m5, n4, n5, R2, R4 et Y tels que définis pour les monomères de formule (I), o lorsque Ai est un enchaînement -A4-[NH(CH2)2]n-A5-, dans lequel A4, n et A5 tels que définis pour les monomères de formule
(D,
• quand A4 représente -(CH2)p2-C(O)-, si A5 représente -(CH2)qi-, alors A6 représente un enchaînement -(GH2)p2- C(O)O- ou -A4-[NH(CH2)2]n'-NH-, et si A5 représente -NR5- C(O)-(CH2)q2-, alors A6 représente un enchaînement
-(CH2)p2-C(O)O-, -A4-[NH(CH2)2]n-NR5- ou -A4-[NH(CH2),]^ NH-, avec p2, R5, ql, q2 et n tels que définis pour les monomères de formule (I) et n' un entier compris dans la gamme allant de 1 à n-1, • quand A4 représente -(CΗ2)pi-, si A5 représente
-(CH2)qi-, alors A6 représente un enchaînement -(G~b)pi- [NH(CH2)2]n-NH- avec n' un entier compris dans la gamme allant de 1 à n-1, et si A5 représente -NR5-C(O)-(CH2)q2-, alors A6 représente un enchaînement -(CH2)pi-[NH(CH2)2]n- NR5- ou -(CH2)pi-[NH(CH2)2]n'-NH-, avec pi, ql, q2, n et R5 tels que définis pour les monomères de formule (I) et n' un entier compris dans la gamme allant de 1 à n-1,
- Zi représente un atome d'hydrogène, ou un groupe protecteur ou activateur des alcools, aminés ou acides carboxyliques, en fonction respectivement de la fonction terminale aminé, alcoxy ou carboxy du bras espaceur A6 à laquelle Z1 est lié, les monomères de formule (III) :
Figure imgf000016_0001
dans laquelle :
- M, Ai et R sont tels que définis pour les monomères de formule
(I), - A6 représente un bras espaceur défini comme suit : o lorsque Ai est un enchaînement -A2-NR^A3- ou -A2- N+R6R7-A3-, dans lequel R1, A2, A3, R6 et R7 sont tels que définis pour les monomères de formule (I) et
• quand A2 représente -(CH2)mi- ou -(CH2)m2-O- [(CH2)2O]m3-(CH2)2- et A3 représente -(CH2)ni- ou
-[(CH2)2O]n2-(CH2)n3-, alors A6 représente un enchaînement -A2-NR1-, avec ml, m2, m3, ni, n2, n3 et R1 tels que définis pour les monomères de formule (I),
• quand A2 représente -(CH2)m4-C(O)-NR3- [(CH2)2O]m5-(CH2)2- et A3 représente -(CH2)ni-, ou
-[(CH2)2O]n2-(CH2)n3-, alors A6 représente un enchaînement -(CH2)m4-C(O)O-, ou -A2-NR1-, avec m4, R3, m5, ni, n2, n3 et R1 tels que définis pour les monomères de formule (I), • quand A2 représente -(CH2)mi- ou -(CH2)m2-O-
[(CH2)2O]m3-(CH2)2- et A3 représente -[(CH2)2O]n4-(CH2)2- NR4-C(O)-(CH2)n5-, alors A6 représente un enchaînement -A2-NR1- ou -A2-NR1-[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-, avec ml, m2, m3, n4, n5, R4 et R1 tels que définis pour les monomères de formule (I), • quand A2 représente -(CH2 WC(O)-N R3- [(CH2)2O]m5-(CH2)r et A3 représente -[(CH2)2O]n4-(CH2)2- NR4-C(O)-(CH2)n5-, alors A6 représente un enchaînement -(CH2WC(O)O-, -A2-NR1- ou
Figure imgf000017_0001
NR4-, avec m4, R3, m5, n4, n5, R4 et R1 tels que définis pour les monomères de formule (I), o lorsque Ai est un enchaînement -A2-Y-P(O)(OR2)-O-A3-, dans lequel R2, A2, A3 et Y sont tels que définis pour les monomères de formule (I) et • quand A2 représente -(CH2)mr ou -(CH2)m2-O-
[(CH2)2O]m3-(CH2)2- et A3 représente -(CH2)nr, -[(CH2)2O]n2-(CH2)n3-, alors A6 représente un enchaînement -A2-Y-, avec ml, m2, m3, ni, n2, n3 et Y tels que définis pour les monomères de formule (I), • quand A2 représente -(CH2WC(O)-NR3-
[(CH2)2O]m5-(CH2)2- et A3 représente -(CH2)m- ou -[(CH2)2O]n2-(CH2)n3-, alors A6 représente un enchaînement -(CH2WC(O)O- ou - A2-Y-, avec m4, R3, m5, ni, n2, n3 et Y tels que définis pour les monomères de formule (I), • quand A2 représente -(CH2)mi- ou -(CH2)m2-O-
[(CH2)2O]m3-(CH2)2- et A3 représente -[(CH2)2O]n4-(CH2)2- NR4-C(O)-(CH2)n5-, alors A6 représente un enchaînement -A2-Y- ou -A2-Y-P(O)(OR2)-O-[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-, avec ml, m2, m3, n4, n5, Y, R4 et R2 tels que définis pour les monomères de formule (I),
• quand A2 représente -(CH2WC(O)-NR3- [(CH2)2O]m5-(CH2)2- et A3 représente -[(CH2)2O]n4-(CH2)2- NR4-C(O)-(CH2)n5-, alors A6 représente un enchaînement -(CH2WC(O)O-, -A2-Y- ou -ArY-P(O)(OR2)-O-[(CH2)2O]n4- (CH2)2-NR4-, avec m4, R3, m5, n4, n5, R2, R4 et Y tels que définis pour les monomères de formule (I), o lorsque Ai est un enchaînement -A4-[NH(CH2)Z]n-A5-, dans lequel A4, n et A5 tels que définis pour les monomères de formule
(D, o quand A4 représente -(CH2)p2-C(O)-, si A5 représente -(CH2)qi-, alors A6 représente un enchaînement
-(CH2)p2-C(O)O- ou -A4-[NH(CH2)Jn-NH-, et si A5 représente - NR5-C(O)-(CH2)q2-, alors A6 représente un enchaînement -(CH2)p2-C(O)O-, -A4-[NH(CH2)2]n-NR5- ou
-A4-[NH(CH2)Jn-NH-, avec p2, R5 ql, q2 et n tels que définis pour les monomères de formule (I) et n' un entier compris dans la gamme allant de 1 à n-1, o quand A4 représente -(CH2)pi-, si A5 représente
-(CH2)qr, alors A6 représente un enchaînement -(CH2)pi-
[NH(CH2)Jn-NH- avec n' un entier compris dans la gamme allant de 1 à n-1, et si A5 représente -NR5-C(O)-(CH2)q2-, alors
A6 représente un enchaînement -(CH2)pi-[NH(CH2)2]n-NR5- ou -A4-(CH2)Pi-[NH(CH2)Jn-NH-, avec pi, ql, q2, n et R5 tels que définis pour les monomères de formule (I) et n' un entier compris dans la gamme allant de 1 à n-1, - A7 représente un bras de liaison, tel qu'un polymère ou une chaîne alkyle, ou une liaison directe, et
- Li représente un ligand biologique.
Les bras ionisables (de liaison ou libre) présents sur ces monomères permettent d'obtenir un monomère soluble en solution aqueuse, malgré la présence d'un groupe métallocène, typiquement un groupe ferrocène, à caractère hydrophobe. De plus, la présence de ce bras ionisable n'altère en rien les propriétés du monomère électropolymérisable présent, la polymérisation pouvant être effectuée en phase aqueuse pour former des couches polymères qui seront, de préférence, conductrices. II faut souligner que, dans les composés de formule (II) et (III), l'enchaînement A6 correspond partiellement au bras Ai, c'est pourquoi la valeur que prend A6 est directement liée à la valeur de A2 et A3 notamment. Pour ne pas alourdir la définition des bras Aβ, dans les monomères (II) et (III), bien qu'il soit, spécifié à chaque point à quoi correspond A2, on a gardé la dénomination A2 pour définir Aβ. Par exemple, même si il est spécifié que A2 représente -(CH2)m4-C(O)-NR3-[(CH2)2O]m5-(CH2)2-, on aura gardé pour A6 la définition -A2-Y-, alors que bien entendu, cela correspond à -(CH2)m4-C(O)-NR3-[(CH2)2O]m5-(CH2)2-Y. Il en est de même pour A4 .
Parmi les monomères de formule (I), les monomères de formule (Ia), (Ib) et (Ic) tels que définis ci-après sont préférés.
Les monomères (Ia) répondent à la formule (Ia) suivante :
Figure imgf000019_0001
avec M, A2, A3 et R tels que définis pour les monomères de formule (I), étant entendu qu'au moins un des enchaînements A2 et A3 comprend un motif - [(CH2)2O]m- avec m qui représente m3, m5, n2 ou n4 tel que défini pour les monomères de formule (I). Sont préférés, les monomères de formule (Ia) tels que définis ci-dessus, dans lesquels A2 représente -(CH2)mi- et A3 représente -[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5-, avec ml, n4, n5 et R4 tels que définis pour les monomères de formule (I), et en particulier, ml=l, n4=2, n5=l et R4=H. Les monomères (Ic) répondent à la formule (Ic) suivante :
Figure imgf000020_0001
avec M, A2, A3 R, R6 et R7 tels que définis pour les monomères de formule (I), étant entendu qu'au moins un des enchaînements A2 et A3 comprend un motif -[(CH2)2O]m- avec m qui représente m3, m5, n2 ou n4 tel que défini pour les monomères de formule (I). Sont préférés, les monomères de formule (Ic) tels que définis ci-dessus, dans lesquels A2 représente -(GH2)mi- et A3 représente -[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5-, avec ml, n4, n5 et R4 tels que définis pour les monomères de formule (I), et en particulier, ml=l, n4=2, n5=l et R4=H.
Les monomères (Ib) répondent à la formule (Ib) suivante
Figure imgf000020_0002
avec M, A2, A3, R2 et R tels que définis pour les monomères de formule (I). De façon avantageuse, les monomères (Ib) présentent une ou plusieurs des caractéristiques suivantes :
- Y = O ;
- R2 représente un atome d'hydrogène ; - A2 et A3 représentent respectivement -(CH2)mi- et -(CH2)Pi-, avec ml et ni tels que définis pour les monomères de formule (I), et en particulier, ml=3 et nl=2.
De même, parmi les monomères de formule (II), les monomères de formule (lia), (Ile) et (Hb) tels que définis ci-après sont préférés. Ces monomères de formule (II), (lia), (Ile) et (Hb) correspondent aux monomères de formule (I), (Ia), (Ic) et (Ib) respectivement, modifiés pour porter, sur l'autre cyclopentadiène du métallocène, un bras libre ionisable. Ce dernier peut porter une fonction réactive (F) de type aminé hydroxyle ou acide carboxylique, éventuellement sous forme protégée ou activée, pour la fixation ultérieure d'un ligand biologique notamment. Les monomères (lia) répondent à la formule (lia) suivante :
Figure imgf000021_0001
dans laquelle : - M et R sont tels que définis pour les monomères de formule (I),
- A2 représente -(CH2W-, -(CH2)m2-O-[(CH2)2OJm3-(CH2)2- ou -(CH2)m4-C(O)-NR3-[(CH2)2O]m5-(CH2)2-, avec ml à m5 et R3 tels que définis pour les monomères de formule (I),
- A3 représente -(CH2)ni-, -[(CH2)2O]n2-(CH2)n3- ou, -[(CH2)2O]n4- (CH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5-, avec ni à n5 et R4 tels que définis pour les monomères de formule (I),
- A6 représente un bras espaceur défini comme suit :
• quand A2 représente -(CΗ2)mi- ou -(CH2)m2-O-
[(CH2)2O]m3-(CH2)2- et A3 représente -(CH2)ni- ou -[(CH2)2O]n2-(CH2)n3-, alors A6 représente un enchaînement -A2-NH-, avec ml, m2, m3, ni, n2 et n3 tels que définis pour les monomères de formule (I),
• quand A2 représente -(CH2)m4-C(O)-NR3- [(CH2)2O]m5-(CH2)r et A3 représente -(CH2)ni-, ou -[(CH2)2O]n2-(CH2)n3-, alors A6 représente un enchaînement -(CH2)m4-C(O)O-, ou -A2-NH-, avec m4, R3, m5, ni, n2 et n3 tels que définis pour les monomères de formule (I),
• quand A2 représente -(CH2)mi- ou -(CH2)m2-O- [(CH2)2O]m3-(CH2)2- et A3 représente -[(CH2)2O]n4-(CH2)2-
NR4-C(O)-(CH2)n5-, alors A6 représente un enchaînement -A2-NH- ou -A2-NH-[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-, avec ml, m2, m3, n4, R4 et n5 tels que définis pour les monomères de formule (I), « quand A2 représente -(CH2)m4-C(O)-NR3-
[(CH2)2O]m5-(CH2)2- et A3 représente -[(CH2)2O]n4-(CH2)2- NR4-C(O)-(CH2)n5-, alors A6 représente un enchaînement -(CH2)m4-C(O)O-, -A2-NH- ou -A2-NH-[(CH2)2O]n4-(CH2)2- NR4-, avec m4, R3, m5, n4, n5 et R4 tels que pour les monomères de formule (I), et
- Zi est un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur ou activateur des aminés ou des acides en fonction respectivement de la fonction aminé ou carboxy terminale du bras espaceur A6 à laquelle Zi est lié. Les monomères de formule (lia) tels que définis ci-dessus dans lesquels A6 représente un enchaînement -A2-NH- ou -A2-NH-[(CH2)2O]n4- (CH2)2-NR4- et Zi représente un groupement activateur de la fonction aminé formant avec la fonction aminé à laquelle il est lié un phosphoramidate monoester, un phosphoramidate diester, un H-phosphoramidate ou un phosphoramidite, constituent un aspect particulier de l'invention. Ces monomères pourront être utilisés dans la synthèse supportée d'oligonucléotides, comme décrit par exemple dans la demande de brevet WO 03/068787.
Comme pour les monomères de formule (Ia), sont préférés les monomères de formule (lia), tels que définis précédemment, dans lesquels au moins l'un des enchaînements A2 et A3 comporte un motif -[(CH2)2θ]-m avec m qui représente m3, m5, n2 ou n4 tels que définis pour les monomères (I).
Sont particulièrement préférés, les monomères de formule (lia), tels que définis précédemment dans lesquels : - A2 représente -(OH2)mi-, avec ml tel que défini pour les monomères de formule (I), et en particulier ml = 1,
- A3 représente -[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5-, avec n4, n5 et R4 tels que définis pour les monomères de formule (I), et en particulier n4 = 2, n5 = 1 et R4 = H, et - A6 représente -(CH2)mi-NH- ou, de préférence -(CΗ2)mi-NH-
[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-, avec ml, n4, R4 et n5 tels que définis pour les monomères (I), et en particulier ml = 1, n4 = 2, n5 = 1 et R4 = H,
- Zi est un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur des aminés, par exemple choisi parmi les groupes trifluoroacétyle, tert- butoxycarbonyle et 9-fluorénylméthoxycarbonyle ou bien Zi représente un groupement activateur de la fonction aminé formant avec la fonction aminé à laquelle il est lié un phosphoramidate monoester, un phosphoramidate diester, un H-phosphoramidate ou un phosphoramidite. Les monomères (Ile) répondent à la formule (Ile) suivante :
Figure imgf000024_0001
dans laquelle :
- M, R, R6 et R7 sont tels que définis pour les monomères de formule (I),
- A2 représente -(CH2)mi-, -(CH2)m2-O-[(CH2)2θ]m3-(CH2)2- ou -(CH2)m4-C(O)-NR3-[(CH2)2O]m5-(CH2)2-, avec ml à m5 et R3 tels que définis pour les monomères de formule (I),
- A3 représente -(CH2)nr, -[(CH2)2O]n2-(CH2)n3- ou, -[(CHz)2OIn4- (CH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5-, avec ni à n5 et R4 tels que définis pour les monomères de formule (I),
- A6 représente un bras espaceur défini comme suit :
• quand A2 représente -(CΗ2)mi- ou -(CH2)m2-O- [(CH2)2O]m3-(CH2)2- et A3 représente -(CH2)nr ou -[(CH2)2O]n2-(CH2)n3-, alors A6 représente un enchaînement -A2-NH-, avec ml, m2, m3, ni, n2 et n3 tels que définis pour les monomères de formule (I),
• quand A2 représente -(CH2)m4-C(O)-NR3- [(CH2)2O]m5-(CH2)2- et A3 représente -(CH2)ni-, ou -[(CH2)2O]n2-(CH2)n3-, alors A6 représente un enchaînement -(CH2)m4-C(O)O-, ou -A2-NH-, avec m4, R3, m5, ni, n2 et n3 tels que définis pour les monomères de formule (I), • quand A2 représente -(CH2)mr ou -(CH2)m2-O- [(CH2)2O]m3-(CH2)r et A3 représente -[(CH2)2O]n4-(CH2)2- NR4-C(O)-(CH2)n5-, alors A6 représente un enchaînement -A2-NH- ou -A2-NH-[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-, avec ml, m2, m3, n4, R4 et n5 tels que définis pour les monomères de formule (I),
• quand A2 représente -(CH2)m4-C(O)-NR3- [(CH2)2O]m5-(CH2)2- et A3 représente -[(CH2)2O]n4-(CH2)2- NR4-C(O)-(CH2)n5-, alors A6 représente un enchaînement -(CH2)m4-C(O)O-, -A2-NH- ou -A2-NH-[(CH2)2O]n4-(CH2)2-
NR4-, avec m4, R3, m5, n4, n5 et R4 tels que pour les monomères de formule (I), et
- Zi est un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur ou activateur des aminés ou des acides en fonction respectivement de la fonction aminé ou carboxy terminale du bras espaceur A6 à laquelle Zi est lié.
Les monomères de formule (Ile) tels que définis ci-dessus dans lesquels A6 représente un enchaînement -A2-NH- ou -A2-NH-[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4- et Zi représente un groupement activateur de la fonction aminé formant avec la fonction aminé à laquelle il est lié un phosphoramidate monoester, un phosphoramidate diester, un H-phosphoramidate ou un phosphoramidite, constituent un aspect particulier de l'invention. Ces monomères pourront être utilisés dans la synthèse supportée d'oligonucléotides, comme décrit par exemple dans la demande de brevet WO 03/068787. Comme pour les monomères de formule (Ic), sont préférés les monomères de formule (Ile), tels que définis précédemment, dans lesquels au moins l'un des enchaînements A2 et A3 comporte un motif -[(CH2)2O]-m avec m qui représente m3, m5, n2 ou n4 tels que définis pour les monomères (I). Sont particulièrement préférés, les monomères de formule (Ile), tels que définis précédemment dans lesquels : - A2 représente -(CH2)mi-, avec ml tel que défini pour les monomères de formule (I), et en particulier ml = 1,
- A3 représente -[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5-, avec n4, n5 et R4 tels que définis pour les monomères de formule (I), et en particulier n4 = 2, n5 = 1 et R4 = H, et
- A6 représente -(CΗ2)mi-NH- ou, de préférence -(CH2)mrNH- [(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-, avec ml, n4, R4 et n5 tels que définis pour les monomères (I), et en particulier ml = 1, n4 = 2, n5 = 1 et R4 = H,
- Zi est un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur des aminés, par exemple choisi parmi les groupes trifluoroacétyle, tert- butoxycarbonyle et 9-fluorénylméthoxycarbonyle ou bien Zi représente un groupement activateur de la fonction aminé formant avec la fonction aminé à laquelle il est lié un phosphoramidate monoester, un phosphoramidate diester, un H-phosphoramidate ou un phosphoramidite.
Les monomères (Hb) répondent à la formule (Hb) suivante :
Figure imgf000026_0001
dans laquelle
- M, R, A2, Y, R2 et A3 sont tels que définis pour les monomères (I),
- A6 représente un bras espaceur défini comme suit :
- quand A2 représente -(CH2)mr ou -(CH2)m2-O-[(CH2)2O]m3- (CHz)2- et A3 représente -(CH2)m- ou -[(CH2)2O]n2-(CH2)n3-, alors A6 représente un enchaînement -A2-Y-, avec ml, m2, m3, ni, n2, et Y tels que définis pour les monomères (I), - quand A2 représente -(CH2)m4-C(O)-NR3-[(CH2)2θ]m5-(CH2)2- et A3 représente -(CH2)ni- ou -[(CH2)2O]n2-(CH2)n3-, alors A6 représente un enchaînement -(CH2)m4-C(O)O-, -A2-Y-, avec m4, R3, m5, ni, n2, n3 et Y tels que définis pour les monomères (I), - quand A2 représente -(CH2)mi- ou -(CH2)m2-O-[(CH2)2O]m3-
(CH2)2- et A3 représente -[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5-, alors A6 représente un enchaînement -A2-Y- ou -A2-Y-P(O)(OR2)-O-[(CH2)2O]n4- (CH2)2-NR4-, avec ml, m2, m3, n4, R4, n5, Y et R2 tels que définis pour les monomères (I), - quand A2 représente -(CH2)m4-C(O)-NR3-[(CH2)2O]m5-(CH2)2- et A3 représente -[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5-, alors A6 représente un enchaînement -(CH2)m4-C(O)O-, -A2-Y- ou -A2-Y-P(O)(OR2)-O- [(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-, avec m4, R3, m5, n4, n5, R2 et R4 et Y tels que définis pour les monomères (I), - Zi représente un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur ou activateur des alcools, aminés ou acides carboxyliques, en fonction respectivement de la fonction terminale aminé, alcoxy ou carboxy du bras espaceur A6 à laquelle Zi est lié.
Les monomères de formule (Hb) tels que définis ci-dessus dans lesquels A6 représente -A2-Y- ou -A2-Y-P(O)(OR2)-O-[(CH2)2O]n4-(CH2)rNR4- et Zi représente un groupement activateur de la fonction aminé ou alcoxy du bras espaceur A6 à laquelle Zi est lié formant respectivement avec la fonction aminé à laquelle il est lié un phosphoramidate monoester, un phosphoramidate diester, un H-phosphoramidate ou un phosphoramidite ou avec la fonction alcoxy à laquelle il est lié un phosphodiester, un phosphotriester, un H-phosphonate ou un phosphoramidite, constituent un aspect particulier de l'invention et pourront être utilisés dans la synthèse supportée d'oligonucléotides.
De façon avantageuse, comme pour les monomères de formule (Ib), les monomères (Hb) présentent une ou plusieurs des caractéristiques suivantes : - Y = O ; - R2 représente un atome d'hydrogène ;
- A2 et A3 représentent respectivement -(CH2)mi- et -(CHb)nI et Aβ représente l'enchaînement -(CH2)mi-O- avec ml et ni tels que définis pour les monomères (I) et en particulier, ml = 3 et ni = 2. De même, parmi les monomères de formule (III), les monomères de formule (HIa), (IHc) et (IHb) tels que définis ci-après sont préférés. Ces monomères de formule (III), (HIa), (IIIc) et (IHb) correspondent aux monomères de formule (II), (lia), (Ile) et (Hb) sur lesquels un ligand biologique a été couplé de façon covalente, éventuellement par l'intermédiaire d'un bras espaceur, sur la fonction réactive (F) présente sur le bras libre ionisable substituant le métallocène Les monomères (HIa) répondent à la formule (HIa) :
Figure imgf000028_0001
dans laquelle A7 représente un bras de liaison ou une liaison directe, Li représente un ligand biologique et A2, A3, A6 et R sont tels que définis pour les composés de formule (lia) et pour lesquels les valeurs préférées indiquées lors de la définition des composés de formule (lia) s'appliquent également.
Les monomères (IIIc) répondent à la formule (IIIc):
Figure imgf000029_0001
dans laquelle A7 représente un bras de liaison ou une liaison directe, U représente un ligand biologique et A2, A3, A6, R6, R7 et R sont tels que définis pour les composés de formule (Ile) et pour lesquels les valeurs préférées indiquées lors de la définition des composés de formule (Ile) s'appliquent également.
Les monomères (HIb) répondent à la formule (HIb):
Figure imgf000029_0002
dans laquelle A7 représente un bras de liaison ou une liaison directe, U représente un ligand biologique et A2, A3, A6, R et R2 sont tels que définis pour les composés de formule (Hb) et pour lesquels les valeurs préférées indiquées lors de la définition des composés de formule (Hb) s'appliquent également. De façon avantageuse, les monomères (I), (Ia), (Ib), (Ic), (II), (lia), (Hb), (Ile), (III), (HIa), (IHb) et (HIc) présentent l'une ou plusieurs des caractéristiques ci-dessous :
- la liaison entre le bras de liaison ionisable et le motif pyrrole se fait en position 3 du pyrrole,
- M est le fer,
- R est un atome d'hydrogène,
Ces différents monomères peuvent être préparés comme décrit ci- après, dans le cas des férrocènes, mais ces voies de synthèse sont applicables aux autres métallocènes. Dans ce qui va suivre, R, R1 à R7, Y, n, ni à n5, ml à m5, pi, p2, ql et q2 sont tels que définis pour les monomères
(D
La préparation des monomères de formule (I), (Ia) (Ic) ou (Ib) dans lesquels Ai est un enchaînement -A2-X-A3- avec X qui représente -NR1-, -Y- P(O)(OR2)-O- ou -N+(R6R7)- va tout d'abord être détaillée.
Tout d'abord, on pourra opérer par analogie avec les méthodes décrites pour les monomères (Ia.1), (Ici) et (Ib.l) données dans les exemples. Pour les autres monomères, les méthodes ci-après pourront être mises en œuvre :
1) lorsque A2 représente -(CH2)m2-O-[(CH2)2O]m3-(CH2)2-, on pourra : la) soit, lorsque X représente-O-P(O(OR2)-O- former le monomère de formule (1) suivante :
Figure imgf000030_0001
comme décrit dans Chem. Eur. J., 1996, 2, 877 ou J. Organometallic Chemistry, 2001, 630, 266. Ce monomère (1) sera alors mis à réagir avec le pyrrole correspondant substitué par une chaîne A3 portant une fonction hydroxyle terminale, l'une des fonctions hydroxyle, de préférence celle située du côté du férrocène, ayant été préalablement activée sous la forme d'un phosphoramidite.
Ib) soit, lorsque X représente -NR1-, -N+(R6R7)- ou -NH- P(O)(OR2)-O- former directement un bras poly(alkoxy)amine, par condensation d'un alcoolate (3) sur un férrocène substitué par un groupe -(CH2)m2-OH (4) (préparé selon Nucleic Acids Research, 2004, 32, 5310-5319), de la façon suivante (SCHEMA 1) pour former le monomère (2) :
SCHEMA 1
Figure imgf000031_0001
3/Pyridine
Figure imgf000031_0002
(CH2)2-NHBOC
Figure imgf000031_0003
Le férrocène (2) ainsi obtenu pourra alors être couplé, quand X représente -NR1, avec le pyrrole correspondant substitué par une chaîne portant un atome d'halogène terminal, ladite chaîne étant choisie pour obtenir le bras A3 souhaité, ou bien, quand X représente -NH-P(O)(OR2)-O-, la fonction aminé terminale du férrocène (2) sera activée sous la forme d'une phosporamidite pour pouvoir se coupler à un pyrrole porteur d'un hydroxyle terminal sur le bras A3.
2) lorsque A2 représente -(CH2)m4-C(O)-NR3-[(CH2)2O]m5-(CH2)2-, on pourra former un férrocène (5) substitué par un bras -(CH2)m4-C(O)-NR3- C(CH2)2O]m5-(CH2)2-NH2 (ou OH), par condensation d'un férrocène (6) substitué par un bras -(CH2)m4-C(O)OH (préparé selon WO 01/81446) sur une aminé (7), en présence d'EDC (l-éthyl-3-[3- (diméthylaminopropyl)carbodiimide) et de N-hydroxysuccinimide comme décrit sur le SCHEMA 2 suivant :
SCHEMA 2
Figure imgf000032_0001
EDC/N-hydroxysuccinimide
Figure imgf000032_0002
Figure imgf000032_0003
(6) (7)
3) Les pyrroles susbtitués mis en jeu peuvent quant à eux être préparés comme suit :
3a) quand A3 représente -(CH2)ni- ou -[(CH2)2θ]n2-(CH2)n3-, le pyrrole substitué par un groupe -(CH2)ni-Br ou -(CH2)n3-[O(CH2)2]n2-Br pourra être obtenu à partir du pyrrole substitué par un groupe -(CH2)ni-OH (préparé selon Synth. Commun., 1996, 26, 1289) ou -(CH2)n3-[O(CH2)2]n2- OH (préparé selon FR 2849038) respectivement, par exemple en présence de CBr4 et de triphényl phosphine dans le méthanol à O0C. 3b) quand A3 représente -[(CH2)2θ]n4-(CH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5-, le pyrrole substitué par un groupe -(CH2)n5-C(O)-NR4-(CH2)2-[O(CH2)2]n4- pourra être obtenu à partir du pyrrole (8) substitué par un groupe -(CΗ2)n5-C(O)- NR4-(CH2)2-[O(CH2)2]n4-OH. Ce pyrrole (8) est obtenu comme suit, par condensation d'un pyrrole (9) porteur d'une fonction ester activée (préparé selon Synthetic Metals, 1999, 100, 89) et d'une aminé (10) comme illustré SCHEMA 3 :
SCHEMA 3 HO-[(CH2)2
Figure imgf000033_0001
4) Lorsque A2 = -(CH2)mr, A3 = -(CH2)ni, avec mi + ni compris entre 2 et 6 et X = -NR1-, les monomères seront obtenus à partir d'un ferrocène halogène (11) et d'un pyrrole aminé (12) (par exemple préparé selon WO 01/81446) ci-dessous :
Figure imgf000033_0002
(11) (12)
La préparation des monomères (I) dans laquelle Ai représente -A4- [NH(CH2)2]n-A5- peut quant à elle être réalisée comme détaillé ci après.
1) lorsque A4 = -(CH2)pi et A5 = -(CH2)qi, on opérera par condensation d'un ferrocène halogène (13) sur un pyrrole (14) substitué par une polyamine.
Ce pyrrole substitué par une polyamine, sera obtenu classiquement par couplage d'une polyamine (15) sur un pyrrole alkylhalogéné (16), comme illustré sur le SCHEMA 4.
SCHEMA 4
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000034_0002
La synthèse du ferrocène halogène (13) peut être effectuée suivant le protocole décrit dans J. electroanal. Chem., 1994, 370, 203. Le pyrrole alkylhalogéné, dans le cas où HaI = Br peut être préparé comme décrit précédemment.
2) lorsque A4 = -(CH2V-CO-, on pourra opérer par couplage d'un ferrocène (17) (préparé selon WO 01/81446) porteur d'une fonction ester activé et d'un pyrrole (18) porteur d'un bras polyamine comme représenté sur le SCHEMA 5.
SCHEMA 5
Figure imgf000034_0003
Le pyrrole (16) peut être préparé comme sur le SCHEMA 4 si A5 représente -(CHOqr. Lorsque A5 = -NR5-C(O)-(CH2)q2-, on pourra former le pyrrole (19) (SCHEMA 6) qui sera couplé soit au ferrocène (13), soit au ferrocène (17) précédemment décrit. Le pyrrole (19) peut être préparé à partir d'une polyamine (20) et d'un pyrrole porteur d'une fonction ester activée (21)
SCHEMA 6
H-[NH(
Figure imgf000035_0001
Figure imgf000035_0002
Les monomères (II), (lia), (Ile) et (Hb) présentent un groupe métallocène avec une bisubstitution 1-1'. Les substitutions du métallocène présentent une certaine symétrie que l'on retrouve dans Ai et Ae.
Les réactions ci-dessus détaillées pour fonctionnaliser les métallocènes seront donc réalisées de façon à obtenir deux fonctionnalisations si besoin, ou une seule fonctionnalisation, en fonction de la structure recherchée pour Aβ. Pour cela, une réaction sélective ou une protection/déprotection bien connue de l'homme de l'art pourra être mise en œuvre.
Par ailleurs, pour la préparation de métallocène mono substitué ou bisubstitué, l'homme du métier sera à même d'adapter les méthodes de synthèse décrites, notamment dans WO 03/068787 ou dans Chem. Rev.,
2004, 104, 5931-5985.
Les exemples donnés plus loin illustrent de telles réactions. A titre d'autres voies de synthèse, lorsque A6 = -(CH2)n4-C(O)-O-, on pourra également mettre en œuvre un ferrocène bis ester activé de formule (22) :
Figure imgf000036_0001
(22)
préparé selon la demande de brevet WO 01/81446. Ce composé pourra alors être couplé avec un équivalent d'un pyrrole aminé de structure choisi pour obtenir l'enchaînement A3 souhaité selon les techniques bien connues de l'homme de l'art.
De même, lorsque A6 = -(CH2)mi- O- et A2 = -(CH2)mi-O-P(O)OR2-, on pourra utiliser un ferrocène (23) porteur de deux fonctions hydroxyle, en protégeant l'une de ces fonctions avec un chlorure de tertiobutyl diméthylsilyle, (TBDMSiCI) par exemple pour conduire au ferrocène protégé (24). Ce ferrocène protégé pourra alors être couplé avec un chlorure de phosphoramidite (25) pour conduire au ferrocène protégé (26) qui pourra ensuite après déprotection être couplé avec un pyrrole-3-alcanol pour conduire au ferrocène (27). La fonction hydroxyle libre du ferrocène (27) pourra alors être couplée avec un autre chlorure de phosphoramidite pour conduire au composé (28).
Cette préparation est illustrée SCHEMA 7, dans Ie cas où A6 = -(CH2)3-O- ;
O
A1 = -(CH2)3— O-P-O-(CH2)r + TBDMSiCl
Figure imgf000037_0002
Figure imgf000037_0001
Figure imgf000037_0003
Les monomères (III) (HIa)7 (HIc) et (HIb), quant à eux, sont obtenus par couplage d'un ligand sur le monomère (II), (lia), (Ile) ou (Hb) correspondant porteur d'une fonction réactive Fi (Z1 = H) de type aminé, hydroxyle ou acide carboxylique. Le plus souvent, ce couplage se fera par l'intermédiaire d'un bras espaceur A7 par exemple de type polymère ou chaîne alkyle. Les bras espaceurs utilisables pour éloigner le ligand biologique de la chaîne polymère obtenue au final sont bien connus de l'homme du métier. Tout bras espaceur qui n'altérera pas la solubilité, ni les propriétés électroactives du monomère pourra être utilisé. A titre d'exemple, on peut citer les dérivés fonctionnels des jeffamines ou de l'anhydride maléique. Ce bras espaceur est couplé sur la fonction réactive Fi, puis le ligand est couplé avec une autre fonction réactive Fγ, par exemple du type ester activé portée par le bras espaceur. Le bras polymère peut être un polymère bifonctionnel (polyéthylène glycol bis ester activé, par exemple) ou multifonctionnel (AMMVE = Anhydride maléique-co-méthylvinyléther, NVPNAS : N-Vinypyrrolidone-co-n-Acryloxysuccinimide, NAMNAS : n- Acryloylmorpholin-co-n- acryloxysuccinimide).
Dans les cas où le monomère (II) est utilisé pour la synthèse supportée des oligonucléotides, c'est-à-dire dans les cas précédemment définis où Zi représente un groupement activateur de la fonction aminé ou alcoxy du bras espaceur Ae à laquelle Z1 est lié formant respectivement avec la fonction aminé à laquelle il est lié un phosphoramidate monoester, un phosphoramidate diester, un H-phosphoramidate ou un phosphoramidite ou avec la fonction alcoxy à laquelle il est lié un phosphodiester, un phosphotriester, un H-phosphonate ou un phosphoramidite, alors le bras
OR1 OR'
I I
— P-O — — P-N —
II II H espaceur A7 sera du type ° ou ° , l'extrémité du bras
A6 lié à l'atome de phosphore pouvant être un atome d'oxygène ou un atome d'azote, -NH- OU - NR4-.
Comme dit précédemment, la mise en oeuvre des monomères selon l'invention permet un adressage des biomolécules sur un plot d'une électrode. De plus, cet adressage peut être réalisé en une seule étape.
Aussi, un autre objectif de l'invention est de proposer des sondes électroactives et électrodes, au moins partiellement recouvertes d'une telle sonde qui soient plus simples à réaliser, et qui permettent une mesure plus directe de l'interaction ligand sonde/ligand cible. On entend par « sonde électroactive », une sonde dont la réponse électrochimique, est modifiée lorsqu'un ligand cible interagit de manière spécifique avec les ligands sondes portés par la sonde. Ainsi, on observe une modification du signal électrochimique suite à l'interaction spécifique avec l'analyte.
On entend par « ligand cible », toute molécule susceptible d'interagir spécifiquement avec un ligand sonde fixé au monomère selon l'invention et donc susceptible d'être détecté avec un copolymère ou polymère selon l'invention, obtenu à partir d'un tel monomère. Ce ligand cible peut être, par exemple, une biomolécule telle que par exemple, un nucléotide, notamment un oligonucléotide, une protéine, un anticorps, un antigène, un peptide, un lipide, un stéroïde, un sucre ou encore un acide nucléique. Le ligand sonde porté par le polymère est spécifique du ligand cible à détecter.
La présente invention a donc également pour objet des sondes électroactives susceptibles d'être obtenues par électropolymérisation d'au moins deux monomères solubles conformes à l'invention porteur chacun d'un ligand biologique formant un homopolymère conducteur. En particulier, au moins deux monomères de formule (III), (IHa), (HIb) ou (HIc) tels que précédemment définis seront utilisés. Même si elles ne sont pas préférées, les sondes électroactives sous la forme d'un homopolymère conducteur susceptibles d'être obtenues par électropolymérisation d'au moins deux monomères solubles conformes à l'invention porteurs chacun d'une fonction réactive (F) aminé, hydroxyle ou acide carboxylique, éventuellement sous forme protégée, suivie d'un couplage de ladite fonction réactive (F) avec un ligand biologique, font partie intégrante de l'invention. En particulier, un monomère de formule (II), (lia), (Hb) ou (Ile) tel que précédemment défini sera utilisé.
De façon préférée, la présente invention a pour objet des sondes électroactives sous la forme d'un copolymère conducteur susceptibles d'être obtenues par copolymérisation entre deux monomères différents dont au moins un est conforme à l'invention, l'un au moins, et de préférence un seul, des monomères étant porteur d'un ligand biologique En particulier, la copolymérisation sera effectuée à partir d'un monomère de formule (III), (HIa), (HIb) ou (IIIc) et d'un monomère (I), (Ia), (Ib) ou (Ic) tels que précédemment définis. On obtient ainsi, un espacement des ligands biologiques sonde ce qui permet d'améliorer la sensibilité. De façon avantageuse, on utilisera un couple de monomères (III)/(I) ou (IIIa)/(Ia) ou (IIIb)/(Ib) ou (IIIc)/(Ic) dans lesquels M, Ai et R sont identiques.
Là encore, même si elles ne sont pas préférées, les sondes électroactives sous la forme d'un copolymère conducteur susceptibles d'être obtenues par électropolymérisation d'au moins un, et de préférence de un seul, monomère soluble conforme à l'invention porteur d'une fonction réactive (F) aminé, hydroxyle ou acide carboxylique, éventuellement sous forme protégée, suivie d'un couplage de ladite fonction réactive (F) avec un ligand biologique, font partie intégrante de l'invention. En particulier, la copolymérisation sera effectuée à partir d'un monomère de formule (II), (lia), (Hb) ou (Ile) et d'un monomère (I), (Ia), (Ib) ou (Ic), tels que précédemment définis. De façon avantageuse, on utilisera un couple de monomères (II)/(I) ou (IIa)/(Ia) ou (IIb)/(Ib) ou (IIc)/(Ic) dans lesquels M, Ai et R sont identiques. La présente invention a également pour objet un procédé d'électropolymérisation réalisé en solution aqueuse, mettant en œuvre au moins un des monomères conformes à l'invention, et en particulier au moins un des monomères porteur d'un ligand biologique.
Cette électropolymérisation peut être une homopolymérisation. En particulier, une homopolymérisation avec un monomère de formule
(III), (HIa) ou (HIb) ou (IIIc) tel que précédemment défini sera réalisée. Une homopolymérisation à partir d'au moins deux monomères solubles conformes à l'invention porteurs chacun d'une fonction réactive (F) aminé, hydroxyle ou acide carboxylique, éventuellement sous forme protégée, peut également être mise en oeuvre. Cette homopolymérisation pourra alors être suivie d'un couplage de ladite fonction réactive (F) avec un ligand biologique. En particulier, un monomère de formule (II), (lia), (Hb) ou (Ile) tel que précédemment défini sera utilisé.
De façon préférée, l'électropolymérisation sera une copolymérisation réalisée entre deux monomères différents dont au moins un est conforme à l'invention. De préférence, l'un au moins, et de préférence un seul, des monomères est porteur d'un ligand biologique. En particulier, la copolymérisation sera effectuée à partir d'un monomère de formule (III), (IHa)7 (HIb) ou (HIc) et d'un monomère (I), (Ia), (Ib) ou (Ic), tels que précédemment définis. De façon avantageuse, on utilisera un couple de monomères (III)/(I) ou (IIIa)/(Ia) ou (IIIb)/(Ib) ou (IIIc)/(Ic) dans lesquels M, Ai et R sont identiques.
Il est également possible de réaliser une copolymérisation d'au moins deux monomères solubles différents conformes à l'invention porteurs chacun d'une fonction réactive (F) aminé, hydroxyle ou acide carboxylique, éventuellement sous forme protégée. Cette réaction de copolymérisation en phase aqueuse sera, avantageusement, suivie d'un couplage de ladite fonction réactive (F) avec un ligand biologique. En particulier, la copolymérisation sera effectuée à partir d'un monomère de formule (II), (lia), (Hb) ou (Ile) et d'un monomère (I), (Ia), (Ib) ou (Ic), tels que précédemment définis. De façon avantageuse, on utilisera un couple de monomères (II)/(I) ou (IIa)/(Ia) ou (IIb)/(Ib) ou (IIc)/(Ic) dans lesquels M, Ai et R sont identiques.
La présente invention a également pour objet les polymères susceptibles d'être obtenus par de telles réactions de polymérisation, éventuellement suivies d'un couplage avec un ligand biologique.
Selon un autre de ses aspects, la présente invention a également pour objet des électrodes comprenant un support conducteur dont tout ou partie de la surface est revêtue d'une sonde électroactive telle que définie ci- dessus. La présente invention a également pour objet, un procédé de détection d'un ligand cible dans un échantillon biologique, dans lequel on met en contact l'échantillon avec une sonde électroactive telle que définie précédemment, porteuse d'un ligand sonde, dans des conditions appropriées pour l'interaction ligand sonde/ligand cible et on met en évidence et éventuellement, on quantifie, la différence de potentiel ou de courant émis par la sonde avant et après mise en contact avec l'échantillon. Les polymères obtenus à partir des monomères selon l'invention peuvent être utilisés notamment dans toutes les applications dans lesquelles des ligands biologiques sont adressés et immobilisés sur un support solide.
Plus particulièrement, ces polymères peuvent être obtenus sous forme de films auto-supportés ou sous forme de film sur électrode. L'électrode permet en effet de contrôler, par mesure du courant délivré au cours de la réaction, l'évolution de la réaction de polymérisation. L'électrode permet également de mesurer les réponses électrochimiques ultérieures du polymère. La présente invention se rapporte donc également à une électrode comprenant un support conducteur revêtu en surface d'au moins un polymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des ligands biologiques selon l'invention, c'est-à-dire une sonde électroactive selon l'invention.
On connaît de l'état de la technique les supports conducteurs pour électrodes, on citera notamment les substrats en métal ou en dérivés de carbone. Pour la fabrication d'une électrode selon l'invention, le polymère est généralement déposé sur le support conducteur. La polymérisation électrochimique est effectuée avantageusement en surface de l'électrode pour obtenir une électrode comprenant un support conducteur revêtu en surface d'un polymère selon l'invention. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'électrode est obtenue en déposant une couche de polymère à la surface d'un support en or ou en platine.
Etant donné qu'il est possible de limiter et de contrôler les réactions de polymérisations électrochimiques au niveau d'une électrode, les monomères selon la présente invention permettent l'immobilisation et l'adressage de ligands biologiques sur de petites surfaces. Cette électrocopolymérisation adressée permet de réaliser une matrice de points miniaturisés et ordonnés, chacun des points portant un ligand biologique défini. Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention se rapporte donc également à une matrice d'électrodes.
L'invention concerne donc également une matrice d'électrodes comprenant au moins une électrode selon l'invention. De telles matrices d'électrodes peuvent se présenter sous la forme de carte ou puce d'analyse comportant une série de puits, chaque puits correspondant à une électrode.
Dans un mode de réalisation avantageux, les différentes électrodes de la matrice portent des ligands biologiques différents. Selon un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une pluralité d'électrodes ou de microélectrodes fixées sur un support solide, ces électrodes sont revêtues d'un copolymère selon l'invention et portent avantageusement des ligands biologiques différents. De telles matrices d'électrodes peuvent avantageusement être obtenues par électropolymérisation adressée de monomères selon l'invention, et en particulier par copolymérisation d'au moins deux monomères dont au moins un est porteur d'un ligand biologique, tel qu'un monomère de formule (III), (HIa), (HIb) ou (IIIc) et d'un monomère non fonctionnalisé avec un ligand, tel qu'un monomère de formule (I), (Ia), (Ib) ou (Ic).
Les électrodes et les matrices d'électrodes selon l'invention sont notamment utilisables pour la détection d'analytes susceptibles d'être présents dans un échantillon et susceptibles de réagir spécifiquement avec les ligands biologiques portés par le polymère.
La présente invention permet de détecter un ligand cible dans tout type d'échantillon. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'échantillon est un échantillon biologique. Avantageusement, cet échantillon peut avoir été prélevé sur un patient à des fins de diagnostic. L'échantillon peut être, par exemple, l'urine, le sang, le sérum, le plasma, des extraits cellulaires ou un fluide corporel. La sonde étant électroactive, sa réponse électrochimique sera modifiée lorsqu'un ligand cible interagit de manière spécifique avec le ligand sonde porté par le polymère. Le polymère conducteur électroactif selon l'invention traduit donc l'interaction avec le ligand cible en un signal électrochimique. L'interaction spécifique d'un ligand cible avec les oligonucléotides portés par le polymère engendre une modification de la réponse électrochimique du polymère étudié par rapport à celle obtenue avant introduction du ligand cible. Avantageusement, la détection du ligand cible s'effectue donc par une mesure électrique. On entend par « mesure électrique », la mesure d'une variation de type potentiométrique comme la variation du potentiel d'oxydation du polymère ou la mesure d'une variation de type ampérométrique par variation du courant d'oxydation observé à un potentiel donné. Ces variations sont mesurées de manière rapide, sensible et quantitative selon des méthodes bien connues de l'homme du métier.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, la mesure électrique consiste en la mesure d'une variation de potentiel ou d'une variation de courant. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, on utilise la voltamétrie cyclique. Il s'agit d'une méthode électroanalytique qui consiste à balayer une gamme de potentiel dans un sens puis dans l'autre, à vitesse constante. Le voltampérogramme obtenu donne la réponse en courant du système électrochimique étudié et permet sa caractérisation.
Les méthodes de détection par une mesure électrique sont préférées avec les polymères selon l'invention. Cependant d'autres méthodes traditionnelles de détection connues de l'homme du métier peuvent également être utilisées.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la détection de l'interaction spécifique entre le ligand cible et le ligand sonde porté par le polymère peut se faire avec l'électrode qui a servi à l'électropolymérisation du polymère. Par exemple, l'hybridation d'un acide nucléique complémentaire à des oligonucléotides portés par le polymère peut être détectée par mesure électrique sur l'électrode qui supporte le polymère selon l'invention.
L'hybridation d'oligonucléotides peut être suivie directement en mesurant la variation du signal électrochimique détecté ou bien par l'intermédiaire d'une réaction enzymatique. Dans ce cas, l'oligonucléotide cible est par exemple porteur d'une biotine. Après introduction de streptavidine-peroxidase et du substrat de l'enzyme, la détection peut se faire soit au niveau du substrat, soit au niveau du signal électrochimique.
De la même façon, il est possible de suivre, grâce aux variations du signal électrochimique les interactions protéine/protéine du type anticorps/antigène et anticorps/protéine notamment.
Il est également possible d'utiliser les polymères susceptibles d'être obtenus avec les monomères selon l'invention, pour le dosage des ions phosphates, dans le cadre du suivi d'une PCR par exemple ; pour étudier l'activité d'une enzyme ; dans des applications en électronique moléculaire comme décrit par exemple dans Science, 2004, 306, 2048-2074.
Les exemples de préparation de monomères et la caractérisation électrochimique des polymères obtenus qui vont suivre, sont donnés à titre illustratif.
A. Exemples de préparation de monomères
I- Monomère fia. I^
Figure imgf000045_0001
Le monomère Ia.1 est préparé selon le schéma ci-dessous
Figure imgf000045_0002
Figure imgf000045_0003
1-1 Synthèse du (10-amino-5,8-dioxa-2-azadédvlVferrocène : Dans un ballon bicol muni d'un réfrigérant, on introduit 158 mg (1,06 mmol, 1,10 eq.) de 8-diamino-3,6-dioxaoctane (Aldrich) dans 5 mL d'éthanol absolu. On y ajoute goutte à goutte, grâce à une ampoule de coulée isobare, 207 mg (0,97 mmol, 1 eq.) de ferrocène carboxaldéhyde (ABCR) dissous dans 15 mL d'éthanol absolu. Une fois l'addition terminée, le milieu réactionnel est porté au reflux de l'éthanol (800C). Après 6 heures d'agitation constante à cette température, le milieu réactionnel est refroidi jusqu'à température ambiante et laissé toute la nuit sous agitation. Afin de réduire l'imine formée en aminé, on ajoute 40 mg (1,06 mmol, 1,10 eq.) de borohydride de sodium (Aldrich) directement dans le milieu réactionnel. On laisse réagir 2 heures sous agitation à température ambiante. L'éthanol est ensuite évaporé, le milieu repris dans le dichlorométhane puis purifié sur colonne de silice avec un mélange dichlorométhane-méthanol-triéthylamine 80-18-2.
On obtient 90 mg de produit sous forme d'un solide jaune (0,26 mmol, 26%).
RMN 1H (200MHz, CDCI3, TMS) : delta 2,95 ppm (t, 2 H, CH2OZiNH), 3,10 ppm (t, 2 H, CH2CAZiMH2), 3,72 ppm (m, 8 H, NCH2OZA OCH2CHJd)1 3,91 ppm (s, 2H, FcO/JMH), 4,20 ppm (s, 7 H, Cp H), 4,40 ppm (s, 2 H, Cp H).
I -2 Couplage pyrrole ester activé / (10-amino-5f8-dioxa-2-azadédyiy ferrocène:
Dans un ballon, on introduit 89 mg de ferrocène (10-amino-5,8-dioxa-2- azadédyl) (0,26 mmol, 1 eq.) que l'on dissout dans 1 mL de mélange acétonitrile/eau 90/10. On ajoute lentement 0,26 mmol (1 eq.) de pyrrole ester activé phtalimidyle ou succinimidyle obtenu au paragraphe I.2.b préalablement dissous dans 1 mL de solvant. On laisse à température ambiante sous agitation 30 minutes (ester phthalimidylique) à 4 heures (ester succinimidylique). On purifie ensuite le milieu réactionnel sur colonne de silice avec un mélange dichlorométhane-méthanol 90-10. On obtient 15 mg d'un solide jaune (0,03 mmol, 13%) qui est soluble dans l'eau jusqu'à une concentration d'au moins 30 mM.
RMN 1H (200MHz, CD3OD, TMS) : delta 3,03 ppm (t, 2H, CH2OZ2NHCH2), 3,34 ppm (m, 2H, CH2CrZ2NHC(O), CHPi), 3,50 ppm (t, 2 H, 0OZ2CH2NHC(O)), 3,60 ppm (s, 4 H, 0OZ2OZ2O), 3,63 ppm (t, 4H7 CH2NCH2OZ2O), 3,99 ppm (s, 2 H, FcOZ2NH), 4,20 ppm (s, 5 H, Cp H), 4,27 ppm (t, 2 H, Cp H), 4,39 ppm (t, 2 H, Cp H), 6,01 ppm (s, 1 H, OZ=CH-N), 6,67 ppm (m, 2 H, CH-CH)
SM électrospray : M+H+ = 454, M-I-Na+ = 475, fragmentation = 199
II Monomère flclΛ
Le monomère (Ici) est obtenu à partir du monomère (Ia.1) par une réaction de méthylation.
Figure imgf000047_0001
Dans un ballon monocol, on dissout 1 eq du monomère Ia dans le DMF (DiMéthylFormamide) à la concentration de 0.15 M. Puis on ajoute avec précaution 200 eq de iodométhane. On met en place un système réfrigérant pour éviter l'évaporation du iodométhane. On laisse réagir 12h sous agitation à température ambiante puis on ajoute de nouveau 200 eq de iodométhane. On laisse réagir 24h. On évapore ensuite l'iodométhane en excès et on réalise une purification sur colonne de silice phase normale. On recueille le produit désiré (qui est le plus polaire) sous la forme d'une huile jaune- orange. On a un rendement de 60 %. Le produit est ensuite passé sur colonne échangeuse d'anions pour échanger les contre-ions iodures contre des chlorures. Cette molécule possède une solubilité dans l'eau pure à 25°C supérieure à 50 mM.
1H NMR (200MHz, CD3OD, TMS) : delta 2.97 ppm (s, 6H, CH3), 3.34 ppm (m, CH2CH2NHC(O)), 3.39 ppm (s, CH2Py), 3.43 ppm (t, 2H, CIi2CH2^(CRi)2CE2), 3.50 ppm (t, 2 H, OCH2CH2NHC(O)), 3.60 ppm (s, 4 H, OCH2CH2O), 3.63 ppm (t, 4H, CH2NCH2CH2O), 3.99 ppm (s, 2 Η, FcCH2NH), 4.20 ppm (s, 5 H, Cp H), 4.27 ppm (s, 2 H, Cp H), 4.39 ppm (s, 2 H, Cp H), 6.01 ppm (s, 1 H, CH=CH-N), 6.67 ppm (d, 2 H, CH-CH) MS electrospray : M+H+= 482
III- Monomère (Ib.1)
Figure imgf000048_0001
(Ib.l)
Etape 1 : Synthèse du l-[3-O-(2-cyanoéthyl-N,N- diisopropylphosphoramidityl)propyl] ferrocène :
Figure imgf000049_0001
Le ferrocène monopropanol (53,3mg, 0,218mmol) est coévaporé trois fois dans ImL d'acétonitrile anhydre. Après avoir repris l'huile orange dans ImL d'acétonitrile anhydre sous argon la DIPEA (120μL, 0,480mmol), puis de la chlorophosphine (42μL, 0,240mmol) sont ajoutés. L'avancement de la réaction est suivi par CCM (cyclohexane-acétate d'éthyle-triéthylamine, (49,5 :49,5 :1)), sur plaques prémigrées dans le même éluant : après 10 min de réaction il n'y a plus de produit de départ, le milieu réactionnel est concentré de moitié. Le brut réactionnel obtenu est purifié sur gel de silice, neutralisé par un mélange cyclohexane-triéthylamine (99:1) ; éluant acétate d'éthyle- cyclohexane (50:50).
Les fractions contenant le produit sont rassemblées et concentrées. L'huile obtenue est coévaporée trois fois avec un mélange éthanol- acétonitrile afin d'éliminer la triéthylamine.
L'huile est reprise dans ImL d'acétonitrile puis filtrée sur filtre PVDF 0,45μm, le produit est concentré.
Masse de produit obtenu : 0,116g
Etape 2 : Synthèse du [3-ferrocénylpropyl-2-cyanoéthyl-2-(3-pyrrole)éthyl] phosphate triester :
Figure imgf000050_0001
1) tétrazole
2) butanone peroxide 0,67%
Figure imgf000050_0002
Figure imgf000050_0003
MW =444,34 MW=470,29
C22H33FeN2O2P C22H27FeN2O4P
Le pyrrole-3-éthanol (26mg, 0,233mmol) est coévaporé deux fois dans ImL d'acétonitrile anhydre, puis repris dans ImL d'acétonitrile anhydre. La solution de térazole 0,45M dans l'acétonitrile (1 mL, 0,436mmol) est ajoutée en présence de quelques grains de tamis moléculaire (3 angstrôms). Le dérivé ferrocène phosphoramidite obtenu à retape 1 (97 mg, 218mmol) est ajouté en solution dans l'acétonitrile anhydre (ImL). La solution devient orange. Le suivi de la réaction se fait par CCM dans l'éluant cyclohexane- acétate d'éthyle-triéthylamine (49,5:49,5:1). Après une heure de réaction, il ne reste plus de produit de départ, la solution d'oxydation (butanone peroxyde 0,67% dans dichlorométhane) (2mL) est ajoutée. La solution devient marron.
Après 30min de réaction, 2OmL de dichlorométhane sont ajoutés, la solution se trouble car le tétrazole n'est pas soluble. La solution est filtrée puis extraite trois fois avec une solution saturée de NaHCO3, puis une fois avec une solution saturée de NaCI.
La phase organique est séchée sur Na2Sθ4, filtrée et concentrée. Masse de produit brut obtenue : 0,155g
Le produit est purifié sur gel de silice préalablement neutralisé avec un mélange dichlorométhane-triéthylamine (99:1), éluant : dichlorométhane- méthanol (90:10).
On obtient 53,3 mg du produit attendu sous la forme d'une huile jaune- orange, cela correspond à 52% de rendement, mais aussi 65 mg de produit impur.
Figure imgf000051_0001
RMN1H (CDCI3) 200 MHz :
1,8 (m, 2H, Hc) ; 2,424 (m, 2H, Hb) ; 2,597-2,678 (m, 4H, Hj et CH2 TEA) ; 2,908 (m, 2H, Hf) ; 3,842 (q, 2H, Hd) ; 4,147-4,010 (m, 18H, Ha, Hd, He) ; 6,0120 (I, IH, Hg) ; 6,670 (I, 2H, Hh)
Etape 3 : Synthèse du [3-ferrocénylpropyl-2-(3-pyrrole)éthyl] phosphate diester rib.11
Figure imgf000051_0002
(Ib.l)
A 50mg du [3-ferrocénylpropyl-2-cyanoéthyl-2-(3-pyrrole)éthyl] phosphate triester (obtenu à l'étape 2) en solution dans ImL de méthanol dans un tube Weaton, est ajouté 2 ml_ d'ammoniaque concentrée. Il se forme un précipité, solubilisé par ajout de ImL de méthanol. La réaction est suivie par CCM dichlorométhane-méthanol (85:15) révélation par UV (254nm) et par la vanilline. Après 3 heures à température ambiante, il y a peu d'évolution. Le tube est placé l'étuve à 600C pendant 2 heures, tout le produit de départ a été consommé. 0,5mL de TEA sont rajouté au milieu réactionnel avant de le concentrer, afin d'éviter la polymérisation du pyrrole. Le brut réactionnel ainsi obtenu est purifié sur gel de silice, conditionné avec un mélange dichlorométhane-triéthylamine (99:1). Pour cette purification un gradient d'élution est nécessaire : dichlorométhane-méthanol (100:0) à (85:15). On obtient après purification : 21,1 mg (0,05mmol, 48%) d'une huile jaune-orange. a
Figure imgf000052_0001
RMN1H (CDCI3) 200 MHz : 1,786-1,857 (m, 4H, Hc) ; 2,406 (t, 2H, Hb, J3 bc= 7,2 Hz) ; 2,858 (t, 2H, Hf, J3 ef= 6,4 Hz) ; 3,887 (m, 2H, He, J3 ef= 6,4Hz) ; 3,962-4,075 (m, 15H, Ha, Hd, impureté) ; 6,110 (I, IH, Hg) ; 6,678 (I, 2H, Hh).
RMN31P (CDCI3) 200 MHz :
Présence d'un seul produit phosphore à 0,7224 ppm SM( ESI) :
[M+H+]= 417,1 ; [M+Na+]= 439,9 ; [M+2Na+]= 461,8
IVr Monomère QIa. D
Figure imgf000052_0002
(Ila.l) Le monomère (Ha.1) est préparé selon le schéma ci-dessous :
Figure imgf000052_0003
o o o N>^
H2N O O N' H
Figure imgf000053_0001
OU
Figure imgf000053_0002
IV-I Synthèse du bis-flO-amino-5,8-dioxa-2-azadédvfl-ferrc)cène:
Dans un ballon bicol muni d'un réfrigérant, on introduit 304 mg (2,05 mmol, 2,5 eq.) de 8-diamino-3,6-dioxaoctane (Acros Organics) dans 5 ml_ d'éthanol absolu. On y ajoute goutte à goutte, grâce à une ampoule de coulée isobare, 200 mg (0,82 mmol, 1 eq.) de ferrocène dicarboxaldéhyde (Aldrich) dissous dans 15 ml_ d'éthanol absolu. Une fois l'addition terminée, le milieu réactionnel est porté au reflux de l'éthanol (8O0C). Après 6 heures d'agitation constante à cette température, le milieu réactionnel est refroidi jusqu'à température ambiante et laissé toute la nuit sous agitation. Afin de réduire l'imine formée en aminé, on ajoute 186 mg (4,92 mmol, 6 eq.) de borohydride de sodium (Aldrich) directement dans le milieu réactionnel. On laisse réagir 2 heures sous agitation à température ambiante. L'éthanol est ensuite évaporé, le milieu repris dans l'eau puis purifié sur colonne de silice phase inverse avec un mélange eau-acétone 50-50.
On obtient 41 mg (0,08 mmol, 10%) de produit sous forme d'une huile marron. RMN 1H (500MHz, CDCI3, TMS) : Delta 1,92 ppm (s, 6 H, CH2CH2ZVZy, QH2CH2NH2), 2,83 ppm (m, 8 H, CH2CH2NH, CH2CZV2NH2), 3,49 ppm (m, 8H, NCH2O//)), 3,60 ppm (m, 12 H, FCCZV2NH, OCH2CH2O), 4,06 ppm (t, 4 H, Cp H), 4,15 ppm (t, 4 H, Cp H).
SM électrospray : M +H+ = 507, M+Na+ = 529, fragmentation = 359
IV-2 Couplage pyrrole ester activé (phthalimidyl ou succinimidyO Z bis-(10- amino-5,8-dioxa-2-azadédylVferrocène:
IV-2a Monoprotection trifluoroacétyle :
On coévapore à l'évaporateur rotatif 286 mg de ferrocène bis-(10-amino-5,8- dioxa-2-azadédyl) (0,56 mmol, 1 eq.) 3 fois avec de l'acétonitrile anhydre et 1 fois avec du dichlorométhane anhydre. On opère sous atmosphère inerte (argon). Dans ce ballon, on introduit ensuite 3 ml_ de dichlorométhane anhydre puis on ajoute lentement, sur 2 heures, 80 mg de trifluoroacétate d'éthyle (0,56 mmol, 1 eq.). Au bout de 6 heures de réaction, on rajoute 24 mg (0,17 mmol, 0,3 eq.) de trifluoroacétate d'éthyle. On laisse tourner la réaction toute une nuit. Puis, on concentre le milieu et on le purifie sur colonne de silice avec un mélange dichlorométhane-méthanol-triéthylamine 80-18-2. On obtient une huile marron avec un rendement de 50%.
SM électrospray : M+H+ = 603, M+Na+ = 625, fragmentation = 454
IV-2 b Synthèse d'un pyrrole ester activé (phthalimidyl ou succinimidyl) :
La synthèse a été réalisée selon le protocole décrit dans (Korri-Youssoufi H ; et al. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119(31), 7388-7389) et selon les schémas ci- dessous : Pyrrole porteur d'une fonction ester activé par un groupe succinimide
Figure imgf000055_0001
/ DCC o OH
Figure imgf000055_0002
Pyrrole porteur d'une fonction ester activé par un groupe phtalimide
TI/K-10 NaOH 6M
Figure imgf000055_0003
Figure imgf000055_0005
Figure imgf000055_0004
Figure imgf000055_0006
IV-2c Couplage avec le pyrrole ester activé (phthalimidyl ou succinimidyl)
Dans un ballon, on introduit 88 mg de bis-(10-amino-5,8-dioxa-2-azadédyl)- ferrocène (0,15 mmol, 1 eq.) monoprotégé avec un groupement 10 trifuoroacétyle obtenu au paragraphe I-2a que l'on dissout dans 375 μl_ de mélange acétonitrile/eau 90/10. On ajoute lentement 48 mg de pyrrole ester phthalimidique ou 40 mg de pyrrole ester succinimidique (0,18 mmol, 1,2 eq.) obtenu au paragraphe IV-2b préalablement dissous dans 375 mL de solvant. On laisse 4 heures à température ambiante sous agitation. On purifie ensuite le milieu réactionnel sur colonne de silice avec un mélange dichlorométhane-méthanol 80-20. On obtient 18 mg (0,02 mmol, 17%) d'une huile marron-jaune qui est soluble dans l'eau, au moins jusqu'à une concentration de 100 mM.
RMN 1H (500MHz, DMSO-d, TMS) : delta 2,81 ppm (q, 4 H, CH2CH2NHCH2), 3,36 ppm (t, 4 H, C(O)NCH2OZ2O), 3,42 ppm (t, 4 H, OCH2CW2NC(O)), 3,53 ppm (m, 14 H, OZ2Py, OCH2CHJd1 CH2NCH2OZ2O) ; 3,63 ppm (d, 4 H, FcCA2NH), 4,16 ppm (s, 4 H, Cp H), 4,24 ppm (s, 4 H, Cp H), 5,92 ppm (s, 1 H, OZ=CH-N), 6,60 ppm (d, 2 H, CH-CH)1 7,42 ppm (s (large), 1 H, M/py)
RMN 19F (200MHz, DMSO-d, TMS) : delta -74.71 ppm (C(O)CF3)
SM électrospray : M+H+ = 710, M+Na+ = 732, fragmentations = 455, 466
V Monomère QIa.2^
Figure imgf000056_0001
(IIa.2)
On obtient ce monomère à partir du monomère (Ha.1). Il suffit de réaliser une déprotection de l'aminé primaire (suppression du groupement trifluoroacétyle) comme illustré sur le schéma ci-dessous.
Figure imgf000056_0002
Pour cela, on introduit 1 eq. de monomère (Ila.l) dans un tube Wheaton étanche de 4 mL On le remplit au tiers avec une solution d'hydroxyde d'ammonium 28% (Aldrich). On referme et on laisse à l'étuve à 600C toute une nuit. On évapore ensuite l'ammoniaque à l'évaporateur rotatif. On obtient environ 600 mg de produit sous la forme d'une huile marron qui est soluble à plus de 100 mM dans l'eau.
RMN 1H (200MHz, DMSO-d, TMS) : delta 2,73 ppm (m, CH2UVJMHCH2, CH2OVJMH2,), 2,93 ppm (t, C(O)IMCH2CW), 3,09 ppm (t, 2H, OCH2CHJMC(O)), 3,35 ppm (s, 4 H, OCH2CHJD), 3,53 ppm (t, ???, CH2NCH2OVA NH2CH2OViD), 3,60 ppm (s, 2H, OVJ3Y), 3,77 ppm (d, 4H, FcOVJMH), 4,30 ppm (s, 4 H, Cp H), 4,42 ppm (s, 4 H, Cp H), 6,13 ppm (s, 1 H, OV=CH-N), 6,82 ppm (d, 2 H, CH-CH)1 7,87 ppm (s (large), 1 H, /WV py)
SM électrospray : M+H+ = 614, M+Na+ = 636, fragmentations = 359, 455
VI- Monomère (Hb.1)
Figure imgf000057_0001
Le monomère (Hb.1) est préparé selon le schéma ci-dessous
Figure imgf000058_0001
VI-I Synthèse du l-[3-O-tert-butyldiméthylsilylpropyl)-l'-[3'-
hydroxypropyljferrocène (intermédiaire 2 de la figure ci-dessus).
Le l,l'-dihydroxypropylferrocène (Ezus, Lyon) (0.15g, 0.496mmol) a été
coévaporé trois fois dans de l'acétonitrile (3x2.5mL) avant solubilisation dans
5 mL d'acétonitrile anhydride. Puis, 0,05 g d'imidazole (0.745mmol), 45μL de
DIPEA (0.125mmol) et 150mg de chlorure de
Figure imgf000058_0002
(0.994mmol) ont été successivement rajouté dans le milieu réactionnel. La
solution a été mise sous agitation durant 90 min. Puis, le milieu réactionnel a
été refroidi à 00C avant d'ajouter 2mL d'eau pour stopper la réaction. Les
solvants ont alors été évaporés à sec sous pression réduite. Le brut
réactionnel obtenu a été repris dans 40 mL de dichlorométhane. La phase
organique a été lavée deux fois par une solution saturée de biocarbonate de
sodium (2x20mL), puis séchée sur sulfate de sodium. Après évaporation des
solvants sous pression réduite, le produit a été purifié par chromatographie
sur gel de silice (neutralisation préalable de la silice par de la TEA) avec un gradient de méthanol dans du dichlorométhane. Après séchage, une huile
orange a été obtenue qui correspond au produit pur (0.102g, 39% yield).
RMN 1H (200MHz, CDCI3) delta (en ppm) : 0.06 (s, 6H, Si-CH3), 0.91 (s, 9H,
CH3 tBu), 1.68-1.83 (m, 4H, Hc, HcO, 2.32-2.44 (m, 4H, Hb, HbO, 3.59-3.68
(m, 4H, Hd, HdO, 3.99 (s, 8H, Ha-HaO-
VI-2 Synthèse du l-[3-O-tert-butyldiméthylsilylpropyl)-l'-[3'-O-(2-cyanoéthyl-
N,N-diisopropylpropyl phosphoramidityl)propyl]ferrocène (intermédiaire 3 de
la figure ci-dessus).
0, 103 g du composé 2 (0.246mmol) ont été coévaporés 3 fois dans de
l'acétonitrile anhydride (3x3 ml) puis repris dans 3 ml_ de ce même solvant.
La solution a été mise sous agitation et sous flux d'argon. La DIPEA (94μL,
0.545mmol) et la chlorophosphine (60μL, 0.270mmol) ont alors été ajoutées
dans le milieu réactionnel au travers d'un septum. Après 30 minutes de
réaction la solution a été concentrée sous pression réduite jusqu'à un volume
de 1 mL. Le produit a été purifié directement par chromatographie sur gel de
silice (neutralisation préalable de la silice par de la TEA) avec un gradient de
méthanol dans du dichlorométhane. Après séchage, une huile orange a été
obtenue qui correspond au produit pur (0.121g, 80% yield).
RMN 1H (200 MHz, CDCI3) delta (en ppm) : 0.06 (s, 6H, Si-CH3), 0.91 (s,
9H, CH3 tBu), 1.19 (d, 12H, CH3 iPr), 1.68-1.77 (m, 4H, Hc, HcO, 2.32-2.36 (m, 4H, Hb, HbO, 2.63 (t, 2H, CH2-CN), 3.56-3.65 (m, 6H, Hd, Hd', CH2-CH2-
CN), 3.83-3.97 (m, 2H, CH- iPr), 3.98 (s, 8H, Ha-Ha7). RMN 31P (200MHz,
CDCI3) delta: 147.92 ppm.
VI-3 Synthèse du {3-[l'-(3'-O-tert-butyldiméthylsilylpropyl)ferrocène-l-
yl]propyl}-[2-(3-pyrrole)éthyl] phosphate triester (intermédiaire .4 de la
figure ci-dessus).
0.024g de 3-(hydroxyéthyl)pyrrole (0.215mmol) ont été coévaporés 3 fois
dans de l'acétonitrile anhydride (3x3 ml) puis repris dans 3 ml_ de ce même
solvant, en présence d'argon. 1.ImL d'une solution de tétrazole 0.45M dans
de l'acétonitrile (0.489mmol) ont alors été ajoutés dans la solution, suivis par
0.121g du composé 3 (0.215mmol). Le milieu réactionnel a été alors agité
durant 30 minutes à température ambiante et sous argon. Puis le produit a
été oxydé par l'addition d'une solution de butanone peroxyde dans du
dichlorométhane (4.5mL, 0.67%) dans le milieu réactionnel. Après 45
minutes sous agitation, 25 mL de dichlorométhane ont été alors ajoutés. La
phase organique a été lavée deux fois par une solution saturée de
biocarbonate de sodium (2xl5mL), puis séchée sur sulfate de sodium. Après
évaporation des solvants sous pression réduite, le produit brut résiduel a été
dissous dans de l'ammonia (30% aqueux), puis placé 16 heures à 600C dans
un flacon étanche. Après évaporation des solvants sous pression réduite, le
produit a été purifié par chromatographie sur gel de silice (neutralisation
préalable de la silice par de la TEA) avec un gradient de méthanol dans du dichlorométhane. Après séchage, une huile orange a été obtenue qui
correspond au produit pur (0.042g, 33% yield).
RMN 1H (200 MHz, CDCI3) delta(en ppm): 0.06 (s, 6H, Si-CH3), 0.91 (s, 9H,
CH3 tBu), 1.33 (t, CH3 TEA), 1.68 (m, 4H, Hc, Hc7), 2.31-2.44 (m, 4H, Hb,
HbO, 2.85 (t, 2H, HO, 2.99-3.09 (q, CH2 TEA), 3.62 (t, 2H, Hg), 3.85-3.91
(m, 4H, Hd, HdO, 3.96 (s, 8H, Ha-HaO, 6.11 (s, IH, H9), 6.67 (d, 2H, Hh).
RMN 31P (200 MHz, CDCI3) delta (en ppm): 0.865. SM (EI): m/z 588 (M-H)'.
VI-4 Synthèse du {3-[l'-(3'-hydroxypropyl)ferrocèneJpropyl}-[2-(3-
pyrrole)éthyl] phosphate triester (composé Ilb.l).
Le compose intermédiaire^ précédemment obtenu a été coévaporé 3 fois
dans du THF anhydride (3x2.5mL), puis repris dans 1 ml_ de THF et
conditionné sous argon. 140μL (0.143 mmol) d'un solution de TBAF IM dans
du THF ont alors été ajoutés au milieu réactionnel. Après 3 heures sous
agitation la solution a alors été concentrée sous pression réduite jusqu'à un
volume final de 0.5 mL Ce brut réactionnel a été directement purifié par
chromatographie sur gel de silice (neutralisation préalable par de la TEA)
avec un gradient de méthanol dans du dichlorométhane pour obtenir un
produit pur sous la forme d'une huile orange (0.013g, 39 % yield).
RMN 1H (200 MHz, CDCI3) delta (en ppm): 1.28-1.35 (m, 9H, CH3 TEA),
1.81-1.83 (m, 4H, Hc, HcO, 2.37-2.45 (m, 4H, Hb, HbO, 2.88 (t, 2H, Hf), 3.66
(t, 2H, HdO, 2.92-3.06 (q, 6H, CH2 TEA), 3.91-3.94 (m, 4H, Hd, He), 4.01 (s, 8H, Ha-HaO, 6.08 (s, IH, Hg)7 6.68 (I, 2H, Hh). RMN 31P (200 MHz, CDCI3)
delta (en ppm): 0.43 ppm. (ESI) SM m/z: 474.1 (M-H)".
VII- Monomère QIIa, n On obtient ce monomère à partir du monomère IIa.2.
VILl Synthèse du composé IIa.2:
Figure imgf000062_0001
VII.2 Greffage d'un oligonucléotide ou d'un peptide sur le monomère IIa.2
lère étape : Greffage d'un ester activé sur le monomère IIa.2
Figure imgf000062_0002
Figure imgf000062_0003
Le monomère IIa.2 (1 eq) est dissous dans l'eau. Le DiSuccinimidylGIutaryl (200 eq) est dissous dans la quantité minimale de DMF telle que la proportion finale de DMF ne dépasse pas 10 %. On laisse réagir 2h à 37°C sous agitation. Puis on fait une colonne de silice phase inverse en éluant avec un mélange eau-acétone. On récupère le produit désiré repérable à sa couleur jaune. L'acétone est évaporée.
2ème étape : Greffage du monomère ester activé sur un peptide ou oligonucléotide
On ajoute 1 eq de peptide ou d'oligonucléotide portant une ou plusieurs fonctions aminés. Pour les oligonudéotides, on peut créer une fonction aminé en bout de chaîne par fixation d'une hexylamine. Pour les peptides, on a une aminé en position N-terminale et on peut éventuellement ajouter un tag lysine qui permet d'avoir des fonctions aminés primaires sur les chaînes latérales.
On laisse le couplage se faire pendant Ih à 37°C sous agitation puis le conjugué peut être purifié par HPLC.
B. Caractérisations électrochimiαues et applications biologiques :
On se référera aux figures 1 à 11 annexées.
Figure 1 : Lecture, à 100 mV/s, en acétate de sodium/acide acétique 10 mM, LiCIO4 0,2 M, à pH == 4,2 (tracé de gauche en ligne pleine) et à pH = 7 (tracé de droite en pointillé) d'une couche d'homopolymère obtenue avec le monomère (Ici) 30 mM, déposée à 0,60 V avec une charge de 21,6 mC/cm2 en acétate de sodium/acide acétique 10 mM, LiCIO4 0,2 M, pH =4,2
Figure2 : Lecture, à 200 mV/s, en acétate de sodium/acide acétique 10 mM, LiCIO4 0,2 M, Tween 0,05 %, pH = 4,2 d'une couche d'homopolymère obtenu avec le monomère (Ila.l) 10OmM, déposée à 0,65 V avec une charge de 360 mC/cm2 en acétate de sodium/acide acétique 10 mM, pH = 4,2, NaCI 0,5M, Tween 0,05 %
Figure 3: Lecture, à 100 mV/s, en acétate de sodium/acide acétique 10 mM, pH = 4,2, LiCIO4 0,2 M, d'une couche de copolymère pyrrole-3-éthanol 50 mM, monomère (Ila.l) 20 mM, déposée à 0,65 V avec une charge de 21,6 mC/cm2 en acétate de sodium/acide acétique 10 mM, pH = 4,2, LiCIO4 0,2 M
Figure 4 : Lecture, à 200 mV/s, en acétate de sodium/acide acétique 10 mM, pH = 4,2, NaCI 0,5 M, d'une couche de copolymère pyrrole-3-éthanol 50 mM, monomère (Ila.l) 20 mM, déposée à 0,65 V
Figure 5 : Lecture, à 200 mV/s, en tampon MICAM, d'une couche de copolymère pyrrole-3-éthanol 50 mM, monomère (Ila.l) 20 mM, déposée à 0,65 V avec une charge de 3,6 mC/cm2 en acétate de sodium/acide acétique 10 mM, pH = 4,2, NaCI 0,5 M
Figure 6 : Lecture, à 200 mV/s, en acétate de sodium/acide acétique 10 mM, pH = 4,2, NaCI 0,5 M, Tween 0,05 % d'une couche d'homopolymère (IIa.2) déposée à 0,65 V avec une charge de 28,8 mC/cm2 en acétate de sodium/acide acétique 10 mM, pH = 4,2, NaCI 0,5 M, Tween 0,05 %
Figure 7 .lecture à 100 mV/s, en tampon acide acétique/acétate de sodium,
0,2 M LiCIO4, pH = 4,2, d'une couche d'homopolymère (Hb.1) déposée à 2
mM à 3 potentiels différents, i.e. 0,3V, 0,4V, 0,5V/FeCp2/FeCp2+ et à une
charge constante de 10,8mC/cm2 en tampon acide acétique/acétate de sodium, 0,2 M LiCIO4, pH = 4,2
Figure 8 : Evolution de Q = (I0 - I) / 1° en fonction du temps, où 1° est l'intensité d'oxydation du ferrocène à t = 1 min après ajout de la séquence complémentaire et I l'intensité au temps t = x min après ajout de la séquence complémentaire. Il s'agit d'une couche de copolymère du monomère (Ia.1)
Figure 9 : Pourcentage de diminution de l'intensité de courant au pic d'oxydation du ferrocène en fonction du temps ; (") contrôle (polymère élaboré avec le monomère Ib.1 et le 3-éthanol pyrrole) + ajout de la cible complémentaire HBV; (À) + ajout de la cible non complémentaire HIV ; (4) + ajout de la cible complémentaire HBV.
Figure 10 : Pourcentage de diminution de l'intensité d'oxydation du ferrocène au cours de l'hybridation lorsqu'une cible HIV est ajoutée. Les lectures sont réalisées à 100 mV/s, en acétate de sodium/acide acétique 10 mM, LiCIO4 0,2 M, pH =4,2, Tween 0,005 % et ADN de sperme de saumon 10 μg/mL II s'agit d'une couche de copolymère du monomère (Ici) 30 mM et de pyrroles-oligonucléotides 12,5 μM (respectivement py-SEQ ID n°l 12,5 μM et [py-SEQ ID n°2 6,25 μM + py-SEQ ID n°3 6,25 μM]), déposée à 0,60 V avec une charge de 21,6 mC/cm2 en acétate de sodium/acide acétique 10 mM, LiCIO4 0,2 M, pH =4,2 Delta Iox / P = [(Intensité d'oxydation du ferrocène à t=l min après introduction de la cible)-( Intensité d'oxydation du ferrocène au temps t après introduction de la cible)] / (Intensité d'oxydation du ferrocène à t=l min après introduction de la cible).
Figure 11 : Pourcentage de diminution de l'intensité d'oxydation du ferrocène au cours de l'hybridation lorsqu'une cible HBV est ajoutée. Les lectures sont réalisées à 100 mV/s, en acétate de sodium/acide acétique 10 mM, LiCIO4 0,2 M, pH =4,2, Tween 0,005 % et ADN de sperme de saumon 10 μg/mL. Il s'agit d'une couche de copolymère du monomère (Ici). 30 mM et de pyrroles-oligonucléotides 12,5 μM (respectivement py-SEQ ID n°l 12,5 μM et [py-SEQ ID n°2 6,25 μM + py-SEQ ID n°3 6,25 μM]), déposée à 0,60 V avec une charge de 21,6 mC/cm2 en acétate de sodium/acide acétique 10 mM, LiCIO4 0,2 M, pH =4,2
Matériel : Les études électrochimiques ont été réalisées sur un potentiostat VMP2 fabriqué par la société Bio-Logic Science Instruments SA (Claix, France). Il est équipé de trois voies, d'une carte bas courant et d'un connecteur adapté pour puces de type ApiT8 (LETI, Grenoble, France). Ce potentiostat obéit au logiciel d'électrochimie EC Lab version V8.32. Des puces composées d'un réseau d'électrodes, sur support conducteur, reliées à des plots, une électrode de référence et une contre-électrode ont été utilisées. Un exemple de procédé de fabrication de ces puces est décrit dans l'article suivant : Cosnier, B. P., Marquette, C, Blum, L. J. Am. Chem. Soc, 2005, 127, 18328-18332. Lors des caractérisations électrochimiques des monomères, les lectures ont été réalisées avec un tampon déjà utilisé en détection d'interactions biologiques. Le tampon d'hydridation d'oligonucléotides MICAM (Apibio, Grenoble, France) a été utilisé. Ce dernier tampon contient : tampon phosphate 9,5 mM, NaCI 0,515 M, KCI 2,6 mM, Tween 0,048 %, Denhardt IX, ADN sperme de saumon 10 μg/mL
I- Polymère issu du monomère (Ia .Ω ou du monomère (Ib. D La- L'homopolymère a été déposé à partir du monomère (Ia.1) à 0,60 V, avec une charge de 61,2 mC/cm2, à une concentration de 50 mM dans un tampon acétate de sodium/acide acétique 10 mM, pH 4,2, LiCIO4 0,2 M sur une puce à électrode. Là encore, lorsqu'on lit la couche formée dans ce même tampon, on voit bien l'oxydation et la réduction du ferrocène. On observe aussi un signal stable en tampon d'hybridation MICAM.
Lb- Une couche de copolymère avec le monomère (Ib.1) et du pyrrole-3- éthanol a également été réalisée. On utilise la formulation suivante : 50 mM de pyrrole-3-éthanol et 20 mM de monomère (Ib.l). On fait les dépôts à 0,60 V avec une charge de 21,6 mC/cm2 en tampon acétate de sodium/acide acétique 10 mM, pH 4,2, LiCIO4 0,2 M. Là encore, le voltamogramme obtenu à 200 mV/s dans le tampon de dépôt montre clairement la réduction et l'oxydation du ferrocène.
II- Polymère issu du monomère (Ic.11
Un homopolymère a été déposé à partir du monomère (Ici) à 0.6 V avec une charge de 21.6 mC/cm2 en acétate de sodium/acide acétique 1OmM, pH = 4,2, LiCIO4 0,2 M, sur une puce à électrode. Un autre dépôt a été réalisé dans les même conditions mais à un pH=7. Les voltamogrammes des polymères formés, sont présentés Figure 1 et font apparaître une réponse électrochimique importante du ferrocène. A pH =7, le signal électrochimique est plus important ce qui ouvre des perspectives intéressantes pour la détection électrochimique d'interactions biologiques à pH physiologique.
III- Polymère issu du monomère Ha.1
Ill.a- Un homopolymère a été déposé à partir du monomère (Ila.l) (50 mM) à 0,65 V avec une charge de 360 mC/cm2 en acétate de sodium/acide acétique 10 mM, pH = 4,2, L1CIO4 0,2 M, Tween 0,05 %, sur une puce à électrode. Le voltamogramme du polymère formé, dans ce même tampon est présenté Figure 2 et fait apparaître l'oxydation et la réduction du ferrocène. Le voltamogramme obtenu est assez dissymétrique pour des vitesses de balayage supérieures à 50 mV/s, ce qui traduit le fait que la couche de polymère obtenue est contrainte stériquement et donc que les échanges d'électrons se font moins facilement. IXLb- Une couche de copolymère avec le monomère (Ila.l) et du 3- pyrrole-3-éthanol a également été réalisée.
L'intérêt de faire un copolymère réside dans le fait qu'il permettra d'espacer, à travers les pyrrole-3-éthanol, les charges positives sur la surface de la couche. Une concentration de 50 mM de pyrrole-3-éthanol et de 20 mM de monomère (Ila.l) est utilisée pour effectuer chaque dépôt sur une puce à électrode. Deux tampons de dépôt ont donné de bons résultats :
-le tampon acétate de sodium/acide acétique 10 mM, pH 4,2, NaCI 0,5 M, dépôt à 0,65 V avec une charge de 21,6 mC/cm2, -le tampon acétate de sodium/acide acétique 10 mM, pH 4,2, LiCIO4 0,2
M, dépôt à 0,65 V avec une charge 3,6 mC/cm2.
Les voltamogrammes obtenus avec ces tampons sont donnés Figure 3, (NaCI 0,5 M, et vitesse de balayage = 100 mV/s) et Figure 4 (LiCIO4, 0,2 M, vitesse de balayage = 200 mV/s). (Apibio, Grenoble, France). Une stabilité du signal est également observé en utilisant le tampon d'hybridation MICAM (Apibio, Grenoble, France), comme le montre le voltamogramme donné Figure 5 obtenu pour une vitesse de balayage de 200 mV/s, avec le copolymère déposé en tampon acétate de sodium/acide acétique 10 mM, pH 4,2, LiCIO4 0,2 M.
IV - Polymère issu du monomère QIa .2^
IV.a- Un homopolymère a été déposé à partir du monomère (IIa.2) à 0.65V, avec une charge de 28, 8mC/cm2 à une concentration de 10 mM dans un tampon acétate de sodium/acide acétique 10 mM, pH = 4,2, NaCI 0,5 M, Tween 0,05%, sur une puce à électrode. Lorsqu'on lit la couche formée dans ce même tampon, on voit bien l'oxydation et la réduction du ferrocène, comme illustré Figure 6.
IV.b- Une couche de copolymère est formée à 0,65 V avec une charge de 90 mC/cm2 en acétate de sodium/acide acétique 10 mM, pH = 4,2, NaCI 0,5 N,
Tween 0,05 %, à partir de 50 mM de pyrrole-3-éthanol et 10 mM de monomère (IIa.2). On fait les dépôts en tampon acétate de sodium/acide acétique 10 mM, pH 4,2, NaCI 0.5 M, Tween 0,05 %. Là encore, une lecture à 200 mV/s dans le tampon de dépôt fait apparaître l'oxydation et la réduction du ferrocène.
V Polymère issu du monomère (Hb.1)
Le monomère a été électropolymérisé à une concentration de 2 mM dans un
tampon (nommé PB pour polymérisation Buffer) acide acétique/acétate de
sodium, 0,2 M LiCIO4, pH = 4,2. 20μL de solution ont été déposés sur la zone
de plots de la puce.
L'électropolymérisation a été effectuée par chronoampérométrie à 3
potentiels différents, i.e. 0,3V, 0,4V, 0,5V/FeCp2/FeCp2+ et à une charge
constante de 10,8mC/cm2 (Figure 7) Après polymérisation, les plots ont été
lavés successivement par du tampon PB, puis 3 fois dans du tampon (PB +
0.05% de tween) et enfin par du tampon PB dans le but d'éliminer les
espèces adsorbées sur la surface des électrodes. Pour les mesures en
voltamétrie cyclique, 30μL de tampon PB ont été utilisés comme solution
électrolytique et les cyclovoltamogrammes ont été enregistrés entre -0,5 V et
0,4 V, à une vitesse de balayage de 0,1 V/s. Les analyses montrent
clairement la présence du polymère sur la surface des plots et la bonne
réponse du ferrocène, à l'oxydation puis à la réduction.
Analyse en voltamétrie cyclique du polymère, sur puce carbone (Eox du Fc = -0,02V ; Eréd du Fc = -0,06V). VI-Sondes électroactives à partir du monomère Ia.1
VLa- Immobilisation du ligand biologique
Nous avons utilisé des séquences d'oligonucléotide de 22-mer
fonctionnalisées par un pyrrole sur leur extrémité 5' phosphorylée. Une des
séquences est issue du virus HIV (SEQ ID n°l). Les autres sont issues du
virus HBV-105C (SEQ ID n°2 et SEQ ID n°3). Le greffage du pyrrole est
réalisé en couplant le 3-methyl-/\Ahydroxysuccinimide-pyrrole sur un
oligonudeotide modifié en position 5' par une hexylamine.
Un copolymère a été obtenu à partir de 50 mM de monomère pyrrole-3-
ethanol, 15 mM du monomère Ia.l et 12.5 μM de monomère pyrrole-
oligonucléotide dans 20 μL d'acétate de sodium/acide acétique 10 mM, UCIO4
0.2 M, pH 4,2 en appliquant un potential de 0.55 V et une charge de 21.6
mC/cm2 . Sur une puce à électrodes, on adresse une électrode avec
l'oligonucléotide issu du virus HIV (SEQ ID n°l) et une autre avec les deux
oligonucléotides issus du virus HBV (SEQ ID n°2 et SEQ ID n°3, chacune à
6.25 μM ).
VLb- Hybridation
Le tampon d'hybridation contient de l'acétate de sodium/acide acétique 10
mM, LiCIO4 0.2 M, pH = 4.2, 0.005 % Tween 20 et 10 μg/mL d'ADN de sperme de saumon. La puce est saturée 10 minutes dans ce tampon. On ajoute alors 100 pM de
séquence complémentaire à la séquence SEQ ID n°l (SEQ ID n°4). La
séquence SEQ ID n°4 est un 33-mer. On lance alors des cycles de
voltamétrie cyclique à 100 mV/s entre -0.5 et 0.5 V, en continu pendant 20
minutes.
La figure 8 représente l'évolution de Q = (1° - 1) / 1° en fonction du temps.
Les pentes à l'origine de ces courbes sont calculées et permettent de
discriminer facilement le plot contenant la séquence complémentaire à la
SEQ ID n°l (HIV) car sa valeur de pente est plus forte.
VH-Sondes électroactives à partir du monomère Ib.1
VH-a- Immobilisation du ligand biologique (sonde HBV)
L'oligonucléotide sonde de capture HBV (SEQ ID n° 3) modifié en position 5'
par un pyrrole (HBV-105C) est immobilisé sur les plots de la puce carbone
par copolymérisation avec le composé Ib.1 et le 3-éthanol pyrrole. 30 μL
d'une solution contenant 50 mM de 3-éthanol pyrrole, 3 mM du composé
Ib.1 et 12,5 μM d'ODN (5'-pyrrole) dans un tampon 0,2M LiCIO4, acétate de
sodium 10 mM, Tween 0,025%, pH 4.2 sont déposés sur la zone de plots.
Une charge à atteindre de 22 mC/cm2 est alors imposée sur les plots à
adresser, à un potentiel fixe de 0,65 V. Puis la surface de plots est lavée avec
précaution dans le même tampon, puis dans de l'eau milli-Q, avant
incubation dans le tampon de mesure jusqu'à stabilisation du signal d'oxydo- réduction de la couche polymère. VII-b- Suivi de l'hybridation avec la cible complémentaire (SEQ ID n° 5
représentant la cible ADN HBV de 86 bases de longueur) et non
complémentaire (SEQ ID n°4 représentant la cible HIV de 33 bases de
longueur).
La réaction d'hybridation est suivie au cours du temps par mesure de la
réponse électrochimique des films polymères électrodéposés. 30μL d'ADN
cible (HBV ou HIV) à une concentration de 100 nM dans du tampon MICAM
sont initialement déposés sur la zone de plots de la puce et le suivi se fait
par la mesure de la variation de l'intensité de courant au pic d'oxydation du
ferrocène. Le blanc est effectué sur un plot de polymère ne contenant pas
d'oligonucléotide de capture. La stabilité du courant au cours du temps est
ainsi confirmée. Les résultats illustrés dans la figure 9 révèlent une nette
diminution de l'intensité de courant dans le cas des plots positifs.
L'écrasement est significatif et confirme la bonne sensibilité des films
polymères vis-à-vis de l'hybridation.
VIII- Sondes électroactives à partir du monomère Qc.1)
VIILa- Immobilisation du ligand biologique
On copolymérise à 0.60 V et 21.6 mC/cm2 du monomère (Ici) avec des monomères pyrroles fonctionnalisés par des oligonucléotides (SEQ ID n°l, SEQ ID n°2, SEQ ID n°3 ; fournis par Biomérieux Polytech). Les concentrations des monomères sont respectivement 15 mM et 3.75 μM. Le dépôt est réalisé en tampon acide acétique/acétate de sodium 10 mM, LJCIO4 0.2 M, pH = 4.2
On réalise des dépôts identiques sur deux puces. Chacune comporte deux plots polymérisés : un avec une séquence ODN issue du système HIV (SEQ
ID n°l), un autre avec deux séquences ODN issues du système HBV (SEQ ID n°2 et 3). Sur une puce on ajoute une séquence complémentaire (SEQ ID n°4 ; 1OnM) à la SEQ ID n°l issue du système de HIV (figure 10). Sur l'autre puce, on ajoute une séquence complémentaire (SEQ ID n°5 ; 10 nM) des seq ID n°2 et 3 issue du système HBV (Figure 11).
On voit que quand la séquence complémentaire est ajoutée, l'intensité d'oxydation du ferrocène diminue. Cela permet de discriminer facilement les plots sur lesquels se sont hybridées les séquences complémentaire des plots où l'hybridation n'a pas eu lieu.

Claims

REVENDICATIONS
1 - Monomère électropolymérisable, destiné à être polymérisé en solution aqueuse, comportant un seul motif électropolymérisable, un groupe électrodonneur et également au moins un bras ionisable en solution aqueuse.
2 - Monomère selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est soluble dans l'eau distillée, au moins jusqu'à une concentration de ImM, de préférence au moins jusqu'à une concentration de 1OmM, et préférentiellement au moins jusqu'à une concentration de 3OmM.
3 - Monomère selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce qu'il comprend, en tant que bras ionisable, un bras de liaison ionisable en solution aqueuse, qui assure la liaison entre le motif électropolymérisable et le groupe électrodonneur. 4 - Monomère selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il comprend, en tant que bras ionisable, un bras libre ionisable en solution aqueuse, qui est fixé sur le groupe électrodonneur uniquement.
5 - Monomère selon la revendication 3 caractérisé en ce qu'il comprend, un bras libre qui est fixé sur le groupe électrodonneur uniquement.
6 - Monomère selon l'une quelconque des revendications 4 ou 5 caractérisé en ce que le bras libre porte un ligand biologique (U) choisi parmi les polynucléotides, les polypeptides, les protéines, les antigènes, les anticorps, les haptènes, les oligosaccharides et la biotine, les polynucléotides étant préférés.
7 - Monomère selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que le motif électropolymérisable est choisi parmi l'acétylène, les pyrroles, les thiophènes, les indoles, les anilines, les azines, les p-phénylènevinylènes, les p-phénylènes, les pyrènes, les furanes, les sélénophènes, les pyrridazines, les carbazoles, les acrylates, les méthacrylates et leurs dérivés. 8 - Monomère selon la revendication 7 caractérisé en ce que le motif électropolymérisable est un pyrrole, de préférence la liaison au bras de liaison ionisable étant assurée en position 3 du pyrrole.
9 - Monomère selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisé en ce que le groupe électrodonneur est un métallocène, une quinone ou un des leurs dérivés, de préférence un ferrocène.
10 - Monomère de formule (I) :
Figure imgf000075_0001
dans laquelle : - M est un métal de transition, de préférence Fe, Ru ou Os,
- Ai est un bras de liaison ionisable comportant l'enchaînement suivant:
Figure imgf000075_0002
o X qui représente -NR1- , -Y-P(O)(OR2)-O-ou -N+R6R7- o Y qui représente O ou NH, o A2 qui représente -(CH2)mr, -(CH2)m2-O-[(CH2)2θ]m3-(CH2)2- ou
-(CH2)m4-C(O)-NR3-[(CH2)2O]m5-(CH2)2- o A3 qui représente -(CH2)ni-, -[(CH2)2O]n2-(CH2)n3- ou
-[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5-, o ml et ni qui représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un entier compris dans la gamme allant de 1 à 6 ; étant entendu que si X représente -NR1- et les groupes A2 et A3 représentent respectivement -(CH2)mr et -(CH2)ni- alors la somme ml + ni est comprise dans la gamme allant de 2 à 6, o m2 et n3 qui représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un entier compris dans la gamme allant de 0 à 3, de préférence dans la gamme allant de 1 à 3, o m3, n2, m4, n4, m5 et n5 qui représentent, chacun indépendamment les uns des autres, un entier compris dans la gamme allant de 0 à 6, de préférence dans la gamme allant de 1 à
6, o R1, R3 et R4 qui représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou un groupe (Ci-C4)alkyle, et o R2 qui représente un atome d'hydrogène ou un groupe
(Ci-C-Oalkyle, cyanoéthyle ou 2-chlorophényle, • ou bien -A4-[NH(CH2)2]n~A5- avec : o A4 qui représente -(CH2)pr ou -(CH2)P2-C(O)-, o A5 qui représente -(CH2)qi- ou, -NR5-C(O)-(CH2)q2-, o n qui est un entier compris dans la gamme allant de 2 à 6, o pi, ql, p2 et q2 qui représentent, chacun indépendamment les uns des autres, un entier compris dans la gamme allant de 1 à 6, o R5 qui représente un atome d'hydrogène ou un groupe
(Ci-C4)alkyle, o R6, R7 qui représente chacun indépendamment l'un de l'autre un groupe (CrC4)alkyle.
- R représente un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur de la fonction aminé, par exemple choisi parmi les groupes monométhoxytrityle, diméthoxytrityle, tosyle, triisopopyl silyle, tert-butoxycarbonyle, 9- fluorényloxycarbonyle, benzyloxycarbonyle, triphénylméthanesulfényle et acétyle.
11 - Monomère selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'il répond à la formule (Ia) :
Figure imgf000076_0001
avec M, A2, A3 et R tels que définis à Ia revendication 10, étant entendu qu'au moins un des enchaînements A2 et A3 comprend un motif -[(CH2)2O]m- avec m qui représente m3, m5, n2 ou n4 tel que défini à la revendication 10. 12 - Monomère selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'il répond à la formule (Ic) :
Figure imgf000077_0001
avec M, A2, A3, R, R6 et R7 tels que définis à la revendication 10, étant entendu qu'au moins un des enchaînements A2 et A3 comprend un motif - [(CH2)2O]m- avec m qui représente m3, m5, n2 ou n4 tel que défini à la revendication 10.
13 - Monomère selon la revendication 12 caractérisé en ce que R6 et R7 représente respectivement -(CH3)-,
14 - Monomère selon l'une quelconque des revendications 11 à 13 caractérisé en ce que A2 représente -(CH2)mi- et A3 représente -[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5-, avec ml, n4, n5 et R4 tels que définis à la revendication 10.
15 - Monomère selon la revendication 14 caractérisé en ce que ml≈l, n4=2, n5=l et R4=H. 16 - Monomère selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'il répond à la formule (Ib) :
Figure imgf000078_0001
avec M, A2, A3, R2 et R tels que définis à la revendication 10.
17 - Monomère selon la revendication 16 caractérisé en ce que Y = O.
18 - Monomère selon l'une quelconque des revendications 16 ou 17 caractérisé en ce que R2 représente un atome d'hydrogène.
19 - Monomère selon l'une quelconque des revendications 16 à 18 caractérisé en ce que A2 et A3 représentent respectivement -(CHbW- et -(CHb)nI-, avec ml et ni tels que définis à la revendication 10.
20 - Monomère selon la revendication 19 caractérisé en ce que ml =3 et nl=2.
21 - Monomère selon l'une quelconque des revendications 10 à 20 caractérisé en ce que la liaison entre le bras de liaison ionisable et le motif pyrrole se fait en position 3 du pyrrole.
22 - Monomère selon l'une quelconque des revendications 10 à 21 caractérisé en ce que M est le fer.
23 - Monomère selon l'une quelconque des revendications 10 à 22 caractérisé en ce que R est un atome d'hydrogène.
24 - Monomère de formule (II) :
Figure imgf000078_0002
dans laquelle :
- M, le bras de liaison ionisable Ai et R sont tels que définis à la revendication 10,
- A6 représente un bras espaceur défini comme suit : o lorsque Ai est un enchaînement -A2-NR^A3- ou -A2-N+R6R7- A3-, dans lequel R1, A2/A3/ R6 et R7 sont tels que définis à la revendication 10 et
• quand A2 représente -(CH2)mi- ou -(CH2)m2-O-[(CH2)2O]m3-(CH2)2- et A3 représente -(CH2)nr ou -[(CH2)2O]n2-(CH2)n3-, alors A6 représente un enchaînement -A2-NR1-, avec ml, m2, m3, ni, n2, n3 et R1 tels que définis à la revendication 10,
• quand A2 représente -(CH2)m4-C(O)-NR3-[(CH2)2O]m5-(CH2)2- et A3 représente -(CH2)ni- ou -[(CH2)2O]n2-(CH2)n3-, alors A6 représente un enchaînement -(CH2)m4-C(O)O-, ou -A2-NR1-, avec m4, R3, m5, ni, n2, n3 et R1 tels que définis à la revendication 10,
• quand A2 représente -(QH2)mi- ou -(CH2)m2-O-[(CH2)2O]m3-(CH2)2- et A3 représente -[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5-, alors A6 représente un enchaînement -A2-NR1- ou
-A2-NR1-[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-, avec ml, m2, m3, n4, R4, n5 et R1 tels que définis à la revendication 10,
• quand A2 représente -(CH2)m4-C(O)-NR3-[(CH2)2O]m5-(CH2)2- et A3 représente
-[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5-, alors A6 représente un enchaînement -(CH2)m4-C(O)O-, -A2-NR1- ou -A2-NR1-[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-, avec m4, R3, m5, n4, n5, R4 et R1 tels que définis à la revendication 10, o lorsque Ai est un enchaînement -A2-Y-P(O)(OR2)-O-A3-, dans lequel R2, A2, A3 et Y sont tels que définis à la revendication 10 et • quand A2 représente -(CH2)mr ou -(CH2)m2-O-[(CH2)2θ]m3-(CH2)2- et A3 représente -(CH2)nr ou -[(CH2)2O]n2-(CH2)n3-, alors A6 représente un enchaînement -A2-Y-, avec ml, m2, m3, ni, n2, n3 et Y tels que définis à la revendication 10,
• quand A2 représente -(CH2)m4-C(O)-NR3-[(CH2)2O]m5-(CH2)2- et A3 représente -(CH2)m- ou -[(CH2)2O]n2-(CH2)n3-, alors A5 représente un enchaînement -(CH2)m4-C(O)O- ou -A2-Y-, avec m4, R3, m5, ni, n2, n3 et Y tels que définis à la revendication 10,
• quand A2 représente -(GH2)mi- ou -(CH2)m2-O-[(CH2)2O]m3-(CH2)2- et A3 représente -[(CH2)2O]n4-(CH2)rNR4-C(O)-(CH2)n5-, alors A6 représente un enchaînement -A2-Y- ou -A2-Y-P(O)(OR2)-O-[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-, avec ml, m2, m3, n4, R4, n5, Y et R2 tels que définis à la revendication 10,
• quand A2 représente -(CH2)m4-C(O)-NR3-[(CH2)2O]m5-(CH2)2- et A3 représente -[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5-/ alors A6 représente un enchaînement -(CH2)m4-C(O)O-,
-A2-Y- ou -A2-Y-P(O)(OR2)-O-[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-, avec m4, R3, m5, n4, n5, R4, R2 et Y tels que définis à la revendication 10, o lorsque Ai est un enchaînement -A4-[NH(CH2)2]n-A5-, dans lequel A4, n et A5 tels que définis à la revendication 10,
• quand A4 représente -(CH2)p2-C(O)-, si A5 représente -(CH2)qr, alors A6 représente un enchaînement -(CH2)p2-C(O)O- ou -A4-[NH(CH2)2]n<-NH-, et si A5 représente -NR5-C(O)-(CH2)q2-, alors A5 représente un enchaînement -(CH2)p2-C(O)O-, -A4-[NH(CH2)2]n-NR5- ou
-A4-[NH(CH2)Jn-NH-, avec p2, R5, ql, q2 et n tels que définis à la revendication 10 et n' un entier compris dans la gamme allant de 1 à n-1,
• quand A4 représente -(CH2)Pr, si A5 représente -(CH2)qi-, alors Aβ représente un enchaînement -(CH2)pi-[NH(CH2)2]n'-NH- avec n' un entier compris dans la gamme allant de 1 à n-1, et si A5 représente
-NR5-C(O)-(CH2)q2-, alors A6 représente un enchaînement
-(CH2)pi-[NH(CH2)2]n-NR5- ou -(CH2)Pi-[NH(CH2)2]n'-NH-/ avec pi, ql, q2, n et R5 tels que définis à la revendication 10 et n' un entier compris dans la gamme allant de 1 à n-1,
- Zi représente un atome d'hydrogène, ou un groupe protecteur ou activateur des alcools, aminés ou acides carboxyliques, en fonction respectivement de la fonction terminale aminé, alcoxy ou carboxy du bras espaceur A& à laquelle Zi est lié. 25 - Monomère selon la revendication 24 caractérisé en ce qu'il répond à la formule (lia) :
Figure imgf000081_0001
dans laquelle :
- M et R sont tels que définis à la revendication 10, - A2 représente -(CH2)mr, -(CH2)m2-O-[(CH2)2O]m3-(CH2)2- ou -(CH2)m4-C(O)-NR3-[(CH2)2O]m5-(CH2)2-, avec ml à m 5 et R3 tels que définis à la revendication 12,
- A3 représente -(CH2)nr, -[(CH2)2O]n2-(CH2)n3- ou -[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5-, avec ni à n5 et R4 tels que définis à la revendication 10, - A6 représente un bras espaceur défini comme suit :
• quand A2 représente -(CH2)mi- ou -(CH2)m2-O-[(CH2)2O]m3-(CH2)2- et A3 représente -(CH2)nr ou -[(CH2)2O]n2-(CH2)n3-, alors A6 représente un enchaînement -A2-NH-, avec ml, m2, m3, ni, n2 et n3 tels que définis à la revendication 10,
• quand A2 représente -(CH2)m4-C(O)-NR3-[(CH2)2O]m5-(CH2)2- et A3 représente -(CH2)ni- ou -[(CH2)2O]nr(CH2)n3-, alors A6 représente un enchaînement -(OH2)m4-C(0)0-, ou -A2-NH-, avec m4, R3, m5, ni, n2 et n3 tels que définis à la revendication 10,
• quand A2 représente -(CH2)mr ou -(CH2)m2-O-[(CH2)2O]m3-(CH2)2- et A3 représente -[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5-, alors A6 représente un enchaînement -A2-NH- ou
-A2-NH-[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-, avec ml, m2, m3, n4, R4 et n5 tels que définis à la revendication 10,
• quand A2 représente -(CH2)m4-C(O)-NR3-[(CH2)2O]m5-(CH2)2- et A3 représente -[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5-, alors A6 représente un enchaînement -(CH2)m4-C(O)O-, -A2-NH- ou -A2-NH-[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-, avec m4, R3, m5, n4, R4 et n5 tels que définis à la revendication 10, et
- Zi est un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur ou activateur des aminés ou des acides en fonction respectivement de la fonction aminé ou carboxy terminale du bras espaceur A6 à laquelle Zi est lié. 26 - Monomère selon la revendication 24 caractérisé en ce qu'il répond à la formule (Ile) :
Figure imgf000083_0001
dans laquelle :
- M, R, R6 et R7 sont tels que définis à la revendication 10,
- A2 représente -(CH2)ml-, -(CH2)m2-O-[(CH2)2O]m3-(CH2)2- ou -(CH2)m4-C(O)-NR3-[(CH2)2O]m5-(CH2)2-, avec ml à m 5 et R3 tels que définis à la revendication 10,
- A3 représente -(CH2)ni-, -[(CH2)2O]n2-(CH2)n3- ou -[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5-, avec ni à n5 et R4 tels que définis à la revendication 10,
- A6 représente un bras espaceur défini comme suit :
• quand A2 représente -(CΗ2)mi- ou -(CH2)m2-O-[(CH2)2O]m3-(CH2)2- et A3 représente -(CH2)m- ou -[(CH2)2O]n2-(CH2)n3-, alors A6 représente un enchaînement -A2-NH-, avec ml, m2, m3, ni, n2 et n3 tels que définis à la revendication 10,
• quand A2 représente -(CH2)m4-C(O)-NR3-[(CH2)2O]m5-(CH2)2- et A3 représente -(CH2)ni- ou -[(CH2)2O]n2-(CH2)n3-, alors A6 représente un enchaînement -(CH2)m4-C(O)O-, ou -A2-NH-, avec m4, R3, m5, ni, n2 et n3 tels que définis à la revendication 10,
• quand A2 représente -(CH2)mi- ou -(CH2)m2-O-[(CH2)2O]m3-(CH2)2- et A3 représente -[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5-/ alors A6 représente un enchaînement -A2-NH- ou
-A2-NH-[(CH2)2θ]n4-(CH2)2-NR4-, avec ml, m2, m3, n4, R4 et n5 tels que définis à la revendication 10,
• quand A2 représente -(CH2)m4-C(O)-NR3-[(CH2)2O3m5-(CH2)2- et A3 représente
-[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5-, alors A6 représente un enchaînement -(CH2)m4-C(O)O-, -A2-NH- ou -A2-NH-[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-, avec m4, R3, m5, n4, R4 et n5 tels que définis à la revendication 10, et - Zi est un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur ou activateur des aminés ou des acides en fonction respectivement de la fonction aminé ou carboxy terminale du bras espaceur A6 à laquelle Zi est lié. 27 - Monomère selon la revendication 26 caractérisé en ce que R6 et R7 représente respectivement -(CH3)-. 28 - Monomère selon l'une quelconque des revendications 24 à 27 dans lequel Ae représente un enchaînement -A2-NH- ou -A2-NH-[(CH2)2O]n4- (CH2)2-NR4-, avec A2, n4 et R4 tels que définis à la revendication 10 et Zi représente un activateur de la fonction aminé à laquelle il est lié et forme avec cette dernière un phosphoramidate monoester, un phosphoramidate diester, un H-phosphoramidate ou un phosphoramidite.
29 - Monomère selon l'une quelconque des revendications 24 à 28 dans lequel au moins l'un des enchaînements A2 et A3 comporte un motif -[(CH2)2O]-m avec m qui représente m3, m5, n2 ou n4 tels que définis à la revendication 10. 30 - Monomère selon l'une quelconque des revendications 24 à 29 dans lequel :
- A2 représente -(CH2)mr,
- A3 représente -[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5- et
- A6 représente -(CH2)mrNH- ou -(CH2)mi-NH-[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-, avec ml, n4, R4 et n5 tels que définis à la revendication 10, et
- Zi est un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur des aminés, par exemple choisi parmi les groupes trifluoroacétyle, tert-butoxycarbonyle et 9-fluorénylméthoxycarbonyle ou bien Zi représente un groupement activateur de la fonction aminé à laquelle Zi est lié et forme avec cette dernière un phosphoramidate monoester, un phosphoramidate diester, un H-phosphoramidate ou un phosphoramidite.
31 - Monomère selon la revendication 30 caractérisé en ce que ml = 1, n4 = 2, n5 = 1 et R4 = H.
32 - Monomère selon la revendication 24, caractérisé en ce qu'il répond à la formule (Hb) :
Figure imgf000085_0001
dans laquelle
- M, R, A2, Y, R2 et A3 sont tels que définis à la revendication 10,
- A6 représente un bras espaceur défini comme suit :
- quand A2 représente -(CH2)mi- ou -(CH2)m2-O-[(CH2)2O]m3-(CH2)2- et A3 représente -(CΗ2)ni- ou -[(CH2)2θ]n2-(CH2)n3-, alors A6 représente un enchaînement -A2-Y-, avec ml, m2, m3, ni, n2, et Y tels que définis à la revendication 10,
- quand A2 représente -(CH2)m4-C(O)-NR3-[(CH2)2θ]m5-(CH2)2- et A3 représente -(CH2)ni- ou -[(CH2)2θ]n2-(CH2)n3-, alors A6 représente un enchaînement -(CH2)m4-C(O)O-, - A2-Y-, avec m4, R3, m5, ni, n2, n3 et
Y tels que définis à la revendication 10,
- quand A2 représente -(CH2)mr ou -(CH2)m2-O-[(CH2)2O]m3-(CH2)2- et A3 représente -[(CH2)2O]n4KCH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5-, alors A6 représente un enchaînement -A2-Y- ou -A2-Y-P(O)(OR2)-O-[(CH2)2O]n4- (CH2)2-NR4-, avec ml, m2, m3, n4, R4, n5, Y et R2 tels que définis à la revendication 10, - quand A2 représente -(CH2)m4"C(O)-NR3-[(CH2)2θ]m5-(CH2)2- et A3 représente -[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5-, alors A6 représente un enchaînement -(CH2)m4-C(O)O-, -A2-Y- ou -A2-Y-P(O)(OR2)-O-
[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-, avec m4, R3, m5, n4, n5, R2, R4 et Y tels que définis à la revendication 10,
- Zi représente un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur ou activateur des alcools, aminés ou acides carboxyliques, en fonction respectivement de la fonction terminale aminé, alcoxy ou carboxy du bras espaceur A6 à laquelle Zi est lié. 33 - Monomère selon la revendication 32, caractérisé en ce que Aβ représente -A2-Y- ou -A2-Y-P(O)(OR2)-O-[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4- avec A2, Y, R2, n4 et R4 tels que définis à la revendication 12 et Zi représente un groupement activateur de la fonction aminé ou alcoxy du bras espaceur A6 à laquelle Zi est lié, formant respectivement avec la fonction aminé à laquelle il est lié un phosphoramidate monoester, un phosphoramidate diester, un H- phosphoramidate ou un phosphoramidite, ou avec la fonction alcoxy à laquelle il est lié un phosphodiester, un phosphotriester, un H-phosphonate ou un phosphoramidite.
34 - Monomère selon l'une quelconque des revendications 32 ou 33, caractérisé en ce que Y = O.
35 - Monomère selon l'une quelconque des revendications 32 à 34 , caractérisé en ce que R2 représente un atome d'hydrogène.
36 - Monomère selon l'une quelconque des revendications 32 à 35, caractérisé en ce que A2 et A3 représentent respectivement -(CH2)mi- et -(CH2)ni et A6 représente l'enchaînement -(CH2)mrO- avec ml et ni tels que définis à la revendication 10.
37 - Monomère selon la revendication 36, caractérisé en ce que ml = 3 et ni = 2.
38 - Monomère selon l'une quelconque des revendications 24 à 37 caractérisé en ce que la liaison entre le bras de liaison ionisable et le motif pyrrole se fait en position 3 du pyrrole. 39 - Monomère selon l'une quelconque des revendications 24 à 38 caractérisé en ce que M est le fer.
40 - Monomère selon l'une quelconque des revendications 24 à 39 caractérisé en ce que R est un atome d'hydrogène.
41 - Monomère de formule (III) :
Figure imgf000087_0001
dans laquelle : - M, le bras de liaison ionisable Ai et R sont tels que définis à la revendication 10, - A6 représente un bras espaceur défini comme suit : o lorsque Ai est un enchaînement -A2-NR1^-A3- ou -A2-N+R6R7- A3-, dans lequel R1, R6, R7, A2 et A3 sont tels que définis à la revendication 10 et
• quand A2 représente -((Η2)mi- ou -(CH2)m2-O-[(CH2)2O]m3-(CH2)2- et A3 représente -(CH2)ni- ou -[(CH2)2O]n2-(CH2)n3-, alors A6 représente un enchaînement -A2-NR1-, avec ml, m2, m3, ni, n2, n3 et R1 tels que définis à la revendication 10,
• quand A2 représente -(CH2)m4-C(O)-NR3-[(CH2)2O]m5-(CH2)2- et A3 représente
-(CH2)ni- ou -[(CH2)2OJn2-(CH2)n3-, alors A6 représente un enchaînement -(CH2)m4-C(O)O- ou -A2-NR1-, avec m4, R3, m5, ni, n2, n3 et R1 tels que définis à la revendication 10,
• quand A2 représente -(CH2)mi- ou -(CH2)m2-O-[(CH2)2O]m3-(CH2)2- et A3 représente
-[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5-, alors A6 représente un enchaînement -A2-NR1- ou
-A2-NR1-[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-/ avec ml, m2, m3, n4, R4, n5 et R1 tels que définis à la revendication 10, • quand A2 représente -(CH2)m4-C(O)-NR3-[(CH2)2O]m5-(CH2)2- et A3 représente
-[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4"C(O)-(CH2)n5-, alors A6 représente un enchaînement -(CH2)m4-C(O)O-, -A2-NR1- ou -A2-NR1-[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-, avec m4, R3, m5, n4, n5, R4 et R1 tels que définis à la revendication 10, o lorsque Ai est un enchaînement -A2-Y-P(O)(OR2)-O-A3-, dans lequel R2, A2, A3 et Y sont tels que définis à la revendication 10 et
• quand A2 représente -(CH2)mr ou -(CH2)m2-O-[(CH2)2O]m3-(CH2)2- et A3 représente -(OH2)ni- ou -[(CH2)2O]n2-(CH2)n3-, alors A6 représente un enchaînement -A2-Y-, avec ml, m2, m3, ni, n2, n3 et Y tels que définis à la revendication 10,
• quand A2 représente -(CH2)m4-C(O)-NR3-[(CH2)2O]m5-(CH2)2- et représente -(OH2)ni- ou -[(CH2)2O]nr(CH2)n3-, alors A6 représente un enchaînement -(CH2W-C(O)O-, -A2-Y-, avec m4, R3, m5, ni, n2, n3 et Y tels que définis à la revendication 10,
• quand A2 représente -(CH2)mi- ou -(CH2)m2-O-[(CH2)2O]m3-(CH2)2- et A3 représente -[(CH2)2O]n4-(CH2)rNR4-C(O)-(CH2)n5-, alors A6 représente un enchaînement -A2-Y- ou
-A2-Y-P(O)(OR2)-O-[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-, avec ml, m2, m3, n4, R4, n5, Y et R2 tels que définis à la revendication 10,
• quand A2 représente -(CH2)m4-C(O)-NR3-[(CH2)2O]m5-(CH2)2- et A3 représente -[(CH2)2O3n4-(CH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5-, alors A6 représente un enchaînement -(CΗ2)m4-C(O)O-, -A2-Y- ou -A2-Y-P(O)(OR2)-O-[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-, avec m4, R3, m5, n4, n5, R4, R2 et Y tels que définis à la revendication 10, o lorsque Ai est un enchaînement -A4-[NH(CH2)2]n-A5-, dans lequel A4, n et As tels que définis à la revendication 10, o quand A4 représente -(CH2)P2-C(O)-, si A5 représente -(CH2)qi, alors A6 représente un enchaînement -(CΗ2)P2-C(O)O- OU -A4-[NH(CH2^]n-NH-, et si A5 représente -NR5-C(O)-(CH2)q2-, alors A6 représente un enchaînement -(CH2)p2-C(O)O-, -A4-[NH(CH2)2]n-NR5- ou -A4-[NH(CH2)Z]n-NH-, avec p2, R5, ql, q2 et n tels que définis à la revendication 10 et n' un entier compris dans la gamme allant de 1 à n-1, o quand A4 représente -(CH2)pi-, si A5 représente -(CH2)qr, alors A6 représente un enchaînement
-(CH2)pi-[NH(CH2)2]n'-NH- avec n' un entier compris dans la gamme allant de 1 à n-1, et si A5 représente
-NR5-C(O)-(CH2)q2-, alors A6 représente un enchaînement -(CH2)pi-[NH(CH2)2]n-NR5- ou A4-(CH2)pi-[NH(CH2)2]n-NH-, avec pi, ql, q2, n et R5 tels que définis à la revendication 10 et n' un entier compris dans la gamme allant de 1 à n-1, - A7 représente un bras de liaison ou une liaison directe, et - Li représente un ligand biologique.
42 - Monomère selon la revendication 41 caractérisé en ce qu'il répond à la formule (HIa) :
Figure imgf000089_0001
dans laquelle : - M et R sont tels que définis à la revendication 10,
- A2 représente -(CH2)mr, -(CH2)m2-O-[(CH2)2O]m3-(CH2)2- ou -(CH2)m4-C(O)-NR3-[(CH2)2O]m5-(CH2)r/ avec ml à m5 et R3 tels que définis à la revendication 10, - A3 représente -(CH2)ni-, -[(CH2)2O]n2-(CH2)n3- ou
-[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5-, avec ni à n5 et R4 tels que définis à la revendication 10,
- A6 représente un bras espaceur défini comme suit :
• quand A2 représente -(CH2)mr ou -(CH2)m2-O-[(CH2)2O]m3-(CH2)2- et A3 représente -(CH2)ni- ou -[(CH2)2θ]n2-(CH2)n3-, alors A6 représente un enchaînement -A2-NHI-, avec ml, m2, m3, ni, n2 et n3 tels que définis à la revendication 10,
• quand A2 représente -(CH2)m4-C(O)-NR3-[(CH2)2O]m5-(CH2)2- et A3 représente
~(CH2)ni- ou -[(CH2)2O]n2-(CH2)n3-, alors A6 représente un enchaînement -(CH2)m4-C(O)O-, ou -A2-NH-, avec m4, R3, m5, ni, n2 et n3 tels que définis à la revendication 10,
• quand A2 représente -(CΗ2)mr ou -(CH2)m2-O-[(CH2)2O]m3-(CH2)2- et A3 représente
-[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5-, alors A6 représente un enchaînement -A2-NH- ou -A2-NH-[(CH2)2O]n4-(C.H2)2- NR4-, avec ml, m2, m3, n4, R4 et n5 tels que définis à la revendication 10, • quand A2 représente
-(CH2)m4-C(O)-NR3-[(CH2)2O]m5-(CH2)2- et A3 représente -[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5-, alors A6 représente un enchaînement -(CH2)m4-C(O)O-, -A2-NH- ou -A2-NH-[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-, avec m4, R3, m5, n4, n5 et R4 tels que définis à la revendication 10, et
- A7 représente un bras de liaison ou une liaison directe, et
- Li représente un ligand biologique. 43 - Monomère selon la revendication 41 caractérisé en ce qu'il répond à la formule (IIIc) :
Figure imgf000091_0001
dans laquelle :
- M, R, R6 et R7 sont tels que définis à la revendication 10,
- A2 représente -(CH2)mi-, -(CH2)m2-O-[(CH2)2O]m3-(CH2)2- ou -(CH2)m4-C(O)-NR3-[(CH2)2O]m5-(CH2)2-, avec ml à m5 et R3 tels que définis à la revendication 10,
- A3 représente -(CH2)ni-, -[(CH2)2O]n2-(CH2)n3- ou -[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5-, avec ni à n5 et R4 tels que définis à la revendication 10,
- A6 représente un bras espaceur défini comme suit : • quand A2 représente -(CH2)mi- ou
-(CH2)m2-O-[(CH2)2O]m3-(CH2)2- et A3 représente -(CH2)ni- ou -[(CH2)2O]n2-(CH2)n3-, alors A6 représente un enchaînement -A2-NH-, avec ml, m2, m3, ni, n2 et n3 tels que définis à la revendication 10, • quand A2 représente
-(CH2)m4-C(O)-NR3-[(CH2)2O]m5-(CH2)2- et A3 représente -(CH2)ni- ou -[(CH2)2O]n2-(CH2)n3-, alors A6 représente un enchaînement -(αH2)m4-C(O)O-, ou -A2-NH-, avec m4, R3, m5, ni, n2 et n3 tels que définis à la revendication 10, • quand A2 représente -(CH2)mr ou -(CH2)m2-O-[(CH2)2O]m3-(CH2)2- et A3 représente -[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5-, alors A6 représente un enchaînement -A2-NH- ou -A2-NH-[(CH2)2O]n4-(CH2)2- NR4-, avec ml, m2, m3, n4, R4 et n5 tels que définis à la revendication 10,
• quand A2 représente -(CH2)m4-C(O)-NR3-[(CH2)2O]m5-(CH2)2- et A3 représente -[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5-, alors A6 représente un enchaînement -((Η2)m4-C(O)O-, -A2-NH- ou
-A2-NH-t(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-, avec m4, R3, m5, n4, n5 et R4 tels que définis à la revendication 10, et
- A7 représente un bras de liaison ou une liaison directe, et
- Li représente un ligand biologique. 44 - Monomère selon la revendication 43 caratérisé en ce que R6 et R7 représente respectivement -(CH3)-.
45 - Monomère selon l'une quelconque des revendications 42 à 44 dans lequel au moins l'un des enchaînements A2 et A3 comporte un motif - [(CH2)2O]m- avec m qui représente m3, m5, n2 ou n4 tel que défini à la revendication 10.
46 - Monomère selon l'une quelconque des revendications 42 à 45 dans lequel :
- A2 représente -(CH2)mi-,
- A3 représente -[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5- et - A6 représente -(CΗ2)ml-NH- ou -(CH2)mi-NH-[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-/ avec ml, n4, R4 et n5 tels que définis à la revendication 10.
47 - Monomère selon la revendication 46 caractérisé en ce que ml = 1, n4 = 2, n5 = 1 et R4 = H.
48 - Monomère selon la revendication 41, caractérisé en ce qu'il répond à la formule (HIb):
Figure imgf000093_0001
dans laquelle
- M, R, A2, Y, R2 et A3 sont tels que définis à la revendication 10,
- A6 représente un bras espaceur défini comme suit : -quand A2 représente -(CH2)mi- ou -(CH2)m2-O-[(CH2)2O]m3-(CH2)2- et A3 représente -(CH2)nr ou -[(CH2)2O]n2-(CH2)n3-, alors A6 représente un enchaînement -A2-Y-, avec ml, m2, m3, ni, n2, n3 et Y tels que définis à la revendication 10,
-quand A2 représente -(CH2)m4-C(O)-NR3-[(CH2)2O]m5-(CH2)2- et A3 représente -(CH2)ni- ou -[(CH2)2O]n2-(CH2)n3-, alors A6 représente un enchaînement -(CH2)m4-C(O)O-, - A2-Y-, avec m4, R3, m5, ni, n2, n3 et
Y tels que définis à la revendication 10,
-quand A2 représente -(CH2)mr ou -(CH2)m2-O-[(CH2)2O]m3-(CH2)2- et A3 représente -[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5-, alors A6 représente un enchaînement -A2-Y- ou -A2-Y-P(O)(OR2)-O-[(CH2)2O]n4-
(CH2)2-NR4-, avec ml, m2, m3, n4, R4, n5, Y et R2 tels que définis à la revendication 102,
-quand A2 représente KCH2)m4-C(O)-NR3-[(CH2)2O]m5-(CH2)2- et A3 représente -[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-C(O)-(CH2)n5-, alors A6 représente un enchaînement -(CH2)m4-C(O)O-, -A2-Y- ou -A2-Y-P(O)(OR2)-O-
[(CH2)2O]n4-(CH2)2-NR4-, avec m4, R3, m5, n4, n5, R4 R2 et Y tels que définis à la revendication 10,
- A7 représente un bras de liaison ou une liaison directe, et
- Li représente un ligand biologique. 49 - Monomère selon la revendication 48, caractérisé en ce que Y = O. 50 - Monomère selon l'une quelconque des revendications 48 ou 49, caractérisé en ce que R2 représente un atome d'hydrogène.
51 - Monomère de formule (HIb) selon l'une quelconque des revendications 48 à 50, caractérisé en ce que A2 et A3 représentent respectivement -(CH2)mi- et -(CHOm et A6 représente l'enchaînement - (CH2)mi-O- avec ml et ni tels que définis à la revendication 10.
52 - Monomère selon la revendication 51, caractérisé en ce que ml = 3 et ni = 2.
53 - Monomère selon l'une quelconque des revendications 41 à 52 caractérisé en ce la liaison entre le bras de liaison ionisable et le motif pyrrole se fait en position 3 du pyrrole.
54 - Monomère selon l'une quelconque des revendications 41 à 53 caractérisé en ce que M est le fer.
55 - Monomère selon l'une quelconque des revendications 41 à 54 caractérisé en ce que R est un atome d'hydrogène.
56 - Monomère selon l'une quelconque des revendications 41 à 55, caractérisé en ce que le ligand biologique est choisi parmi les polynucléotides, les antigènes, les protéines, les anticorps, les polypeptides, les haptènes, les oligosaccharides, la biotine. 57 - Monomère selon l'une quelconque des revendications 41 à 56, caractérisé en ce que le ligand biologique est un polynucléotide.
58 - Monomère selon l'une quelconque des revendications 41 à 57 caractérisé en ce que A7 est un polymère ou une chaîne alkyle.
59 - Sonde électroactive susceptible d'être obtenue par électropolymérisation d'au moins deux monomères porteurs chacun d'un ligand biologique selon l'une quelconque des revendications 1 à 58, formant un homopolymère conducteur.
60 - Sonde électroactive susceptible d'être obtenue par copolymérisation d'au moins deux monomères différents dont au moins l'un est défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 58, au moins l'un des monomères étant porteur d'un ligand biologique, formant un copolymère conducteur. 61 - Sonde électroactive susceptible d'être obtenue par copolymérisation d'au moins un monomère selon l'une quelconque des revendications 10 à 23 et d'au moins un monomère selon l'une quelconque des revendications 41 à 58, formant un copolymère conducteur. 62 - Sonde électroactive selon la revendication 61, caractérisée en ce que M, Ai et R sont identiques dans le ou les monomères selon l'une quelconque des revendications 10 à 23 et dans le ou les monomères selon l'une quelconque des revendications 41 à 58.
63 - Procédé de détection d'un ligand cible dans un échantillon biologique, dans lequel on met en contact l'échantillon avec une sonde électroactive selon l'une des revendications 59 à 62 porteuse d'un ligand sonde, dans des conditions appropriées pour l'interaction ligand sonde/ligand cible et on met en évidence et éventuellement, on quantifie, la différence de potentiel ou de courant émis par la sonde avant et après mise en contact avec l'échantillon.
64 - Electrode comprenant un support conducteur dont tout ou partie de la surface est revêtue d'une sonde selon l'une quelconque des revendications 59 à 62.
65 - Procédé de polymérisation caractérisé en ce que la polymérisation est réalisée par électropolymérisation en solution aqueuse à partir d'au moins un monomère selon l'une quelconque des revendications 1 à 58.
66 - Procédé de synthèse d'un monomère ionisé à partir d'un monomère ionisable selon l'une quelconque des revendications 10 à 11 ou 24 à 25 ou 41 à 42 par une réaction de bis-méthylation. 67 - Polymère susceptible d'être obtenu selon le procédé de polymérisation défini à la revendication 65 ou 66.
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