WO2006106994A1 - セイヨウトチノキの抽出成分を配合した歯周病用剤 - Google Patents

Abstract

【課題】　歯肉上皮組織の不正常な伸展に対する阻害効果に優れた新規の歯周病用剤を提供する。 【解決手段】　セイヨウトチノキ(Aesculus hippocastanum L.)を溶媒で抽出して得られた分離成分を含む歯周病用剤、および歯肉炎や歯周炎などの口腔内疾患を処置するための当該用剤を含む口腔用組成物。

Description

セィヨウトチノキの抽出成分を配合した歯周病用剤

技術分野

[0001] 本願発明は、歯肉炎や歯周炎 (歯周病)などの口腔内疾患の起因に関与する歯肉 上皮組織の不正常な伸展を阻害する、新規の歯周病用剤に関する。

背景技術

[0002] 哺乳動物の歯牙の歯頸部や歯根部を取り囲む歯周組織は、歯肉（歯茎）、歯根膜 、セメント質および歯槽骨から構成されており、歯牙を支持する役割を担っている。 この歯周組織に炎症症状が出現して、炎症部位が歯肉に止まって 、る状態を「歯肉 炎」、そして、炎症部位が歯肉を超えて歯根膜や歯槽骨にまで拡大して組織破壊に 至っている状態を「歯周炎」と区別している。 歯肉炎および歯周炎は共に、口腔内 の食物残渣に付着した細菌類が繁殖して形成された歯垢や、その他の環境要因な どの影響を受けて、歯周組織に炎症が出現することに起因している。 歯肉炎につい ては、炎症部位が歯肉に限定されており、歯根膜や歯槽骨にまで炎症が拡大してい ないので、口腔内を物理的に清浄 (例えば、歯磨き)することにより、症状を概ね緩和 または治癒することができる。 これに対して、症状が歯周炎にまで進行してしまうと、 歯肉と歯牙との間の結合組織性付着が喪失されてしまうので、歯牙の揺動のみなら ず、歯根膜や歯槽骨の損傷'破壊にまで至り、口腔内を単に物理的に清浄しても、も はや歯周炎の症状回復を期待することは難しくなつてしまう。 また、歯周炎の発症に よって歯周組織の破壊が進むと、歯肉上皮細胞が歯根に向けて伸展 (ダウングロ一 ス)するので、結果として、歯肉と歯牙との間に歯周炎に特有の歯肉溝、いわゆる、歯 周ポケットが形成される。

[0003] 歯周炎の発症に関与する歯周組織の炎症を医薬ィヒ合物を用いて化学的に処置す る方法として、抗炎症効果に優れた ε—アミノカプロン酸を利用して、その抗プラスミ ン作用によって、歯肉炎や歯周炎の症状の発現を抑制する手法が用いられている。 あるいは、歯周糸且織の炎症の原因菌であるテトラサイクリン（Tetracycline)耐性のス タフイロコツキ（Sraphylococci)を除去するための薬剤、すなわち、テトラサイクリン系の 塩酸ミノサイクリン (Minocycline)を用いる手法もある。

[0004] また、歯周ポケット内に定着している原因菌およびその滞留相（バイオフィルム）を 除去するための薬剤として、マクロライド (Macrolide)系抗生物質、具体的には、ラクト ン環を構成する原子数に応じて 14員環〜 16員環の物質、例えば、エリスロマイシン類 、 16員環マクロライドのジョサマイシン類、クラリスロマイシン類などがある。 これらの 内でも、 14員環マクロライド系抗生物質が、バイオフィルムの形成予防および除去を 効果的に達成できるので有用である。

[0005] ところで、歯周糸且織の構成成分の約 60%はコラーゲンであるため、コラーゲンの分 解が進行すると、歯肉の縮小や後退という現象が誘導される。 これらコラーゲンのよ うな細胞外マトリックスに作用してその分解を促す金属酵素群が、一般に、マトリックス メタ口プロテアーゼ（以下、単に「MMP」と称する）と呼ばれて 、る。

[0006] MMPは、歯周炎や歯肉炎などの他に、ガン (癌)疾患、潰瘍形成、慢性関節リュウ マチ、骨粗鬆症などの種々の病態での細胞外マトリックスの分解において中心的な 役割を果たす物質である (非特許文献 1参照)。 そして、 MMPは、多種多様の細胞 によって産生されており、コラゲナーゼ（MMP-1および MMP-8)、ストロメライシン（ MMP-3)、ゼラチナーゼ（MMP- 2および MMP- 9)などの、 10種類以上の酵素分 子種がこれまでに報告されている（非特許文献 2参照)。 この内、コラゲナーゼは、 通常は、上皮系細胞からは産生されないが、歯周組織の付着上皮および歯周ポケッ ト上皮周辺に発現していることが報告されている (非特許文献 3参照)。 また、ゼラチ ナーゼは、歯周病原因菌由来のリポ多糖などによる刺激に起因して上皮細胞力 産 生され、かつ基底膜の構成成分であるタイプ IVコラーゲンを分解することが報告され ている。 すなわち、このことは、 MMP活性の上昇力 歯周病の病態の進行とも密接 に相関していることを示唆しているものと考えられる。 実際のところ、歯周病患者の 口腔洗浄液、歯肉溝滲出液および唾液内に含まれる MMP量は、歯周病患者の病 態を反映しており、歯周病の治療処置を施すことによって、 MMP量が減少したことも 報告されて 、る (非特許文献 4参照)。 また、歯肉炎患者と健常者が保有して 、る M MPの量と TIMPの量を測定したところ、歯肉炎患者での MMP量が非常に多ぐし 力も、歯周炎患者に至っては MMP量が著量であったことも報告されている（非特許 文献 5参照)。 従って、 MMPの酵素活性や MMP産生を阻害する物質は、局所的 炎症の悪ィ匕に伴う歯周疾患の病態進行の抑制を促す上で有用であると考えられる。 非特許文献 1 :中田、岡田、「呼吸」、 18、 4、 pp.365- 371 (1999)

非特許文献 2 :吉原、新名、「炎症と免疫」、 2、 pp.177-185 (1994)

非特許文献 3 : M. Kylmaniemi, et al: J. Dent Res., 75,pp.919- 926 (1996) 非特許文献 4 : M. Makela, et al: J. Dent Res., 73,pp.1397-1406 (1994)

非特許文献 5 : A. Haerian, et al: J. ClinPeriodontoL, 22, pp.505- 509 (1995) 発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0007] 本願発明は、哺乳動物での歯肉上皮組織の不正常な伸展を阻害して歯周ポケット の形成を妨げ、それにより、歯周炎などの口腔内疾患の進行を効果的に抑止して、 健全な歯肉組織を維持せしめる新規の歯周病用剤の提供を目的とする。

課題を解決するための手段

[0008] すなわち、本願発明の要旨とするところは、古来より周知の薬用植物であることに加 えて、ヒトに対する安全性が確認されている、セィヨウトチノキ (Aesculus hippocastanu mし)を溶媒で抽出して得られた分離成分を含み、かつ哺乳動物での歯肉上皮組織 の不正常な伸展を阻害する歯周病用剤にある。 また、本願発明の他の態様によれ ば、本願発明の歯周病用剤を含む口腔用組成物も提供される。

[0009] 本願発明者が鋭意研究を行ってきた結果、セィヨウトチノキを溶媒で抽出して得ら れた分離成分が、歯肉上皮組織、特に、哺乳動物での歯肉上皮組織の不正常な伸 展を有意に阻害するとの知見を得るに至り、歯周炎などの口腔内疾患の予防や治療 などの用途への応用性を見出したのである。

発明の効果

[0010] 本願発明によると、歯肉上皮糸且織の不正常な伸展を阻害し、かつ歯周ポケットの形 成を効果的に抑止できる新規の歯周病用剤が実現されるのである。

発明を実施するための最良の形態

[0011] 本願発明の歯周病用剤の構成を、以下に、詳細に説明する。 [0012] 本願発明の一態様によれば、セィヨウトチノキ (Aesculus hippocastanum し)を溶媒で抽出して得られた分離成分を含み、かつ哺乳動物での歯肉上皮組織の 不正常な伸展を阻害する歯周病用剤が提供される。

[0013] なお、本明細書で使用する「歯肉上皮細胞」の用語は、歯頸部および歯根部を取り 囲んで隣接組織の支持構成物としての役割を果たす口腔内縁粘膜の上皮細胞（口 腔内縁粘膜上皮細胞）を指すものであって、この上皮細胞は、歯牙のエナメル層表 面に付着して、歯周炎の進行に伴って歯周ポケットを形成する。 また、口腔内縁粘 膜上皮細胞は、常に細菌による感染の危険性にさらされる環境に置かれているため 、細胞分裂性に優れているなど、口腔内の他の部位にある口腔粘膜上皮細胞が有 する性質とは、一線を画している。

[0014] 本願発明の歯周病用剤での有効成分をもたらすセィヨウトチノキ (Aesculus hippoca stanum L.)には、ギリシャ北部からトルコ地域原産の落葉高木で、その種子には、打 ち身や捻挫、外傷時の炎症で生じる腫脹を速やかに緩解する成分が含まれて!/ヽる。

[0015] このセィヨウトチノキを、溶媒を用いた抽出工程に適用する。 抽出工程に適用され るセィヨウトチノキまたはそのいずれかの部位 (例えば、枝葉、榭枝、幹、榭皮、果実 または根）は、そのままの状態で、または、物理的に破砕してから、あるいは、必要に 応じて、乾燥および粉砕して粉体に加工して力も抽出工程に適用することもできる。

[0016] この抽出工程で利用する溶媒としては、当該技術分野で周知の溶媒が利用可能で あり、例えば、低級アルコール、多価アルコール、非極性溶媒、極性溶媒などが使用 できる。

[0017] 低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアル コール、ブタノールなどの炭素数が 1〜4のアルコール；多価アルコールとしては、グ リセリン、ポリエチレングリコールなど；非極性溶媒としては、ペンタン、へキサン、ヘプ タン、オクタン、ノナン、デカンなどの飽和炭化水素;極性溶媒としては、水、温水 (熱 水）、アセトン、酢酸ェチル、酢酸メチルなどがある。 溶媒としては、前記したものの 内の単品だけを選択して利用できることは勿論、二種類以上の溶媒を組み合わせて 使用することもできる。 例えば、脂肪分の多い原料を用いる場合には、非極性溶媒 で脱脂抽出処理した後に、任意の溶媒で抽出処理を行ってもよぐあるいは含水有 機溶媒を用いて抽出処理を行うこともできる。

[0018] セィヨウトチノキの抽出方法としては、当該技術分野で周知の方法を用いることがで きる。 例えば、セィヨウトチノキそれ自体、もしくはその粗粉砕物または裁断物、ある いはその乾燥破砕物 (粉末)を、溶媒に、冷浸、温浸などして浸漬する方法や、加温 して攪拌しながら抽出を行って、濾過を経て所望の分離成分を含む抽出物を得る方 法、それにバーコレーシヨン法なども利用することができる。

[0019] このようにして得られた抽出物を、必要に応じて、濾過または遠心分離によって不 要な固形物を除去した後に、使用態様に応じて、そのまま用いるか、または溶媒を留 去して一部濃縮または乾燥したものを用いることができる。 なお、濃縮または乾燥し て得られた分離物を、非溶解性溶媒で洗浄して精製して用いてもよぐあるいは、こ のものをさらに適当な溶剤に溶解または懸濁して用 、ることもできる。

[0020] 別法として、得られた抽出物を、慣用されて 、る精製法、例えば、向流分配法や液 体クロマトグラフィーなどを用いて、所望の阻害活性を有する画分を取得および精製 して使用することも可能である。

[0021] さらに、前述したようにして得られた溶媒抽出物を、減圧乾燥、凍結乾燥などの通 常の乾燥手段によって、乾燥濃縮エキスの形態に加工して使用することも可能である

[0022] また、本願発明の好ましい実施態様によれば、本願発明の歯周病用剤を有効成分 とする口腔用組成物も提供される。 そして、本願発明の歯周病用剤での阻害効果に 悪影響を及ぼすものでな 、限りは、口腔用組成物に一般的に用いられて 、るその他 の成分、例えば、粘着剤、清涼剤、結合剤、甘味料、着香料、崩壊剤、滑沢剤、着色 料、徐放調整剤、界面活性剤、溶解剤、湿潤剤、 pH調整剤などを任意に加えること ちでさる。

[0023] 粘着剤としては、多糖類、セルロース系高分子物質、合成高分子物質、天然系高 分子物質、アミノ酸系高分子物質、ゴム系高分子物質などを由来とする水溶性高分 子物質が利用できる。 例えば、プルラン、プルラン誘導体およびデンプンなどの多 糖類；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシェチルセルロース、ヒドロキシプロピル メチノレセノレロース、ヒドロキシェチノレメチノレセノレロース、カノレボキシメチノレセノレロース 塩類（カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび力 ルボキシメチルセルロースカリウムなど）、メチノレセノレロース、ェチルセルロース、ポリ アクリル酸、ポリアクリル酸塩 (ポリアクリル酸ナトリウムおよびアクリル酸 ·アクリル酸ォ クチルエステル共重合体など）、メタアクリル酸類の共重合体 (メタアクリル酸とアタリ ル酸

n-ブチルの重合体、メタアクリル酸とメタアクリル酸メチルの重合体およびメタアクリル 酸とアクリル酸ェチルの重合体など）などのセルロース系高分子物質；カルボキシビ 二ルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールな どの合成高分子物質；レクチン、アルギン酸、アルギン酸塩 (アルギン酸ナトリウム、ァ ルギン酸カリウム、アルギン酸マグネシウム、アルギン酸プロピレングリコールエステ ル、アルギン酸トリエタノールァミン、アルギン酸トリイソプロパノールァミン、アルギン 酸アンモ-ゥム、アルギン酸ブチルァミンおよびアルギン酸ジァミルァミンなど）、コン ドロイチン硫酸ナトリウム、寒天、キトサン、カラギーナンなどの天然系高分子物質;コ ラーゲンおよびゼラチンなどのアミノ酸系高分子物質;および、アラビアガム、カラャ ガム、トラガカントガム、キサンタンガム、ローカストビンガム、グァガム、タマリンドガム およびジエランガムなどのゴム系高分子物質など力 本願発明にお 、て好適に利用 することができる。

[0024] 清涼剤としては、 1-メントール、 cQ-メントール、ハツ力油、カンフル、ハツ力水、ボルネ オール、ペパーミント精油、スペアミント精油などが本願発明において利用可能であ る力 これらに限定されるものではなぐこれらのいずれか 1種類のみを用いることも、 あるいは 2種類以上を併用することもできる。

[0025] 結合剤としては、糖類 (ブドウ糖など）、糖アルコール類 (ソルビトール、キシリトール 、エリスリトール、マン-トールなど）、ポリビュルピロリドン、デンプン類、マクロゴール 、デキストリン、トラガント、ゼラチン、ポリビュルアルコール、セラック、アラビアゴム、ァ ルギン酸ナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロースなどが本願発明にお 、て利用可能 であるが、これらに限定されるものではなぐこれらのいずれ力 1種類のみを用いるこ とも、あるいは 2種類以上を併用することもできる。

[0026] 甘味料としては、サッカリンナトリウム、ステピオサイド、ステビアエキス、ァスバルテ ーム、キシリトール、水飴、蜂蜜、ソルビトール、マルチトール、マン-トール、糖類（乳 糖、白糖、果糖、ブドウ糖など)などが本願発明において利用可能であるが、これらに 限定されるものではなぐこれらのいずれか 1種類のみを用いることも、あるいは 2種類 以上を併用することもできる。

[0027] 着香料としては、天然香料 (スペアミント油、ァニス油、ユーカリ油、ウィンターグリーン 油、カシア油、クローブ油、タイム油、セージ油、レモン油、オレンジ油、ハツ力油、力 ルダモン油、コリアンダー油、マンダリン油、ライム油、ラベンダー油、ローズマリー油 、ローレル油、カモミル油、キャラウェイ油、マジョラム油、べィ油、レモングラス油、オリ ナガム油、パイン-一ドル油など）、合成香料 (カルボン、ァネトール、シネオール、サ リチル酸メチル、シンナミックアルデヒド、オイゲノール、チモール、リナロール、リナリ ールアセテート、リモネン、メントン、メンチルアセテート、ピネン、ォクチルアルデヒド、 シトラール、プレゴン、カルビールアセテート、ァニスアルデヒドなど）、前掲の天然香 料および,または合成香料から任意に選択した香料を混合して得た調合香料などが 本願発明において利用可能である力 これらに限定されるものではなぐこれらのい ずれ力 1種類のみを用いることも、あるいは 2種類以上を併用することもできる。

[0028] 崩壊剤としては、デンプン類、メチルセルロース、結晶セルロース、セルロース誘導 体 (カルボキシメチルセルロースナトリウムなど）、アルギン酸、アルギン酸塩、炭酸塩 、有機酸、ポリビニルピロリドン、架橋ポリビュルピロリドンなどが本願発明において利 用可能であるが、これらに限定されるものではなぐこれらのいずれか 1種類のみを用 V、ることも、あるいは 2種類以上を併用することもできる。

[0029] 滑沢剤としては、滑石、金属石鹼、脂肪酸 (ステアリン酸など）、ステアリン酸塩 (ステ アリン酸マグネシウムなど）、タルク、ショ糖脂肪酸エステル、含水二酸化ケイ素、軽質 無水ケィ酸、乾燥水酸ィ匕アルミニウムゲル、マクロゴールなどが本願発明において利 用可能であるが、これらに限定されるものではなぐこれらのいずれか 1種類のみを用 V、ることも、あるいは 2種類以上を併用することもできる。

[0030] 着色料としては、青色 1号、黄色 4号、二酸化チタン、銅クロロフィリンナトリウムなど が本願発明において利用可能である力 これらに限定されるものではなぐこれらの V、ずれか 1種類のみを用いることも、あるいは 2種類以上を併用することもできる。 [0031] 防腐剤としては、安息香酸類、サリチル酸類、ソルビン酸類、ノ ラベン類、塩化セチ ルピリジニゥム、塩化デカリニゥム、塩化べンゼトニゥム、塩化ベンザルコニゥム、塩化 クロルへキシジン、ダルコン酸クロルへキシジン、イソプロピルメチルフエノール、トリク 口サン、ヒノキチオール、フエノールなどが本願発明において利用可能である力 これ らに限定されるものではなぐこれらのいずれ力 1種類のみを用いることも、あるいは 2 種類以上を併用することもできる。

[0032] 徐放調整剤としては、ポリ酢酸ビニル、ェチルセルロース、アミノアルキルメタアタリ レートコポリマーなどが本願発明において利用可能である力 S、これらに限定されるも のではなぐこれらのいずれか 1種類のみを用いることも、あるいは双方を併用するこ とちでさる。

[0033] 界面活性剤としては、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、モ ノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート、モノステアリン酸グリセリン、ラウリル流酸ナ トリウム、ラウロマクロゴールなどが本願発明において利用可能である力 これらに限 定されるものではなぐこれらのいずれか 1種類のみを用いることも、あるいは 2種類以 上を併用することもできる。

[0034] 溶解剤としては、グリセリン、濃グリセリン、プロピレングリコール、エタノール、流動 ノ《ラフィン、精製水、マクロゴール、ポリソルベートなどが本願発明において利用可能 であるが、これらに限定されるものではなぐこれらのいずれ力 1種類のみを用いるこ とも、あるいは 2種類以上を併用することもできる。

[0035] 湿潤剤としては、グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール液、水、エタノール 、希エタノールなどが本願発明において利用可能である力 これらに限定されるもの ではなぐこれらのいずれか 1種類のみを用いることも、あるいは 2種類以上を併用す ることちでさる。

[0036] pH調整剤としては、乳酸、パントテン酸、リン酸塩、リンゴ酸、クェン酸などが本願発 明において利用可能である力 これらに限定されるものではなぐこれらのいずれか 1 種類のみを用いることも、あるいは 2種類以上を併用することもできる。

[0037] 本願発明の口腔用組成物の剤型としては、錠剤、丸剤、顆粒剤、液剤、シート剤、 ゲル剤、ペースト剤などのいずれでも利用可能である。 とりわけ、本願発明の口腔 用組成物を歯科製剤とする場合には、練歯磨、洗口液、口腔用パスタ、トローチなど の形態とすることで、歯周炎、歯肉炎、歯根膜炎、智歯周囲炎、インプラント周囲炎な どの歯周組織の破壊に起因する口腔内疾患の予防および治療に有効に対処できる

[0038] 以下に、本願発明をその実施例に沿って説明するが、この実施例の開示に基づい て本願発明が限定的に解釈されるべきでないことは勿論である。

実施例

[0039] A :歯肉十.皮細朐の焙着

歯肉組織が健康なヒトの口腔内から、歯肉上皮組織 (約 5.0mm X約 5.0mmの切片） を採取した。 採取した組織片を、リン酸緩衝液（1 X 10⁵U/ml

ペニシリン、 100 μ g/mlストレプトマイシン、 80 μ g/mlカナマイシンを含有）に浸漬し て、 24時間以内に、外科用メスで、約 0.5mm X約 0.5mmの小切片に裁断した。 この 小切片を、 I型コラーゲンコート 6ゥエルプレートのゥエルに静置した。 小切片とコラー ゲンとの癒着を確認してから、初代培養培地 (L-グルタミン、 10%

FBS、 10pg/ml EGF、 80 μ g/mlカナマイシン含有の DMEM/Ham's F12培地（大日本 製薬製)）をゥエルに静かに注いだ。 こうして調製された培養系を、 37°C、 5%二酸 化炭素の条件下で培養を行い、 2日に 1度の割合で、初代培養培地を新鮮なものと 交換した。

[0040] 小切片力 上皮細胞が増殖して 、ること、すなわち、ゥエルの概ね 3割を覆う程度に まで上皮細胞が増殖していることを確認してから、培地を、継代培養培地（EDGS、 80 μ g/mlカナマイシン含有の EpiLife培地（casdade社製) )に交換した。 培養液を、 I型 コラーゲンコート T75フラスコに移し、 2500cells/cm²の集密度をメドにして、細胞の増 殖速度にあわせて継代培養を行って、以下の実施例で用いる歯肉上皮細胞を得た

[0041] B : ^l ト.; ^田 の )¾阳 カ の 定

まず、歯周炎を人工的に誘発するための炎症誘導用培地を調製した。 炎症誘発物 質である、組換えヒト TNF- αを、 PEPROTECH社より購入した（Size B

vial: 50 μ g、 300-01A; Lot No. 121CY25)。 組換えヒト TNF- aの 50 μ gを、室温下 で、 1時間放置した後に、卓上遠心分離器に適用した。 遠心分離して得られた沈殿 物を、 500 μ 1の蒸留水に溶解し、 0.1mg/ml

Tris緩衝液を加えた後に、得られた水溶液の 36 1を、 3.564mlの生理食塩水（PBS (- ))にさらに溶解した。 こうして得た PBS溶液を、セラムチューブに 1.2mlずつ分注して 、 一 20°Cの温度下で保存した。 なお、残余の水溶液については、セラムチューブに 100 μ 1ずつ分注して、 20°Cの温度下で保存した。 PBS溶液の 1.2ml ( 1 μ g/mlの TNF- a含有）を、 10.8mlの EpiLife培地（血清および抗生物質を含まず）に溶解し、 そして、 0.2 mの孔径のフィルターを用いて濾過および滅菌をして、炎症誘導用培 地を得た。

[0042] 次に、セィヨウトチノキの榭皮のエキス粉末を、 75%エタノールを用いて、 0.02g/ml (

2% w/v)の成分濃度が溶解した溶液を得た。

[0043] セィヨウトチノキからの抽出成分を含む溶液を、 0.2 μ mの孔径のフィルターを用いて 濾過および滅菌をして、炎症誘導用培地を用いて、成分濃度の調整を行った。

[0044] セィヨウトチノキ由来の抽出成分を含む溶液に関する本願発明による歯肉上皮細 胞の伸展阻害は、 Masami Yoshioka, et al, 'Effect

of Hydroxamic Acid Based Matrix Metalloproteinase

Inhibitors on Human ingival Cells and Porphyromonas gingivalis , .1. Periodontol. vol.74, pp.1219-1224 (2003)の文献で報告された手順に従って検定した。

[0045] まず、 24ゥエルプレート（1.8cm²Zゥエル）に、歯肉上皮細胞を、 2 X 10⁴個 Zゥェル の割合で配置せしめる。 2日に 1度の割合で、継代培養培地を新鮮なものと交換し て、細胞がゥエル全体を覆うようになるまで培養を継続した。 細胞がゥエル全体を覆 つたことを確認してから、ピペットチップの先端でゥエルの半分の細胞を搔き取った。 ゥエルを PBSで洗浄した後に、炎症誘導用培地とセィヨウトチノキ由来の (1.0%ま たは 0.1 %の濃度の)抽出成分を含む溶液とを注ぎ、 37°C、 5%二酸化炭素の条件下 で培養を行い、培養開始後、 0時間、 24時間および 48時間の時点にて、ゥエルの写 真撮影を行って、細胞の伸展度を検証した（図 1(b))。 なお、ゥエルを PBSで洗浄し た後に、炎症誘導用培地だけを注いだ以外は、同様の手順を踏んだ試験区を対照 とした (図 l(a))。 [0046] ゥエル上に現れた細胞を撮影した写真に基づ 、て、細胞の移動距離を目視で判定 した。

[0047] そして、対照での移動距離との比較に基づいて、セィヨウトチノキ由来の抽出成分 による歯肉上皮細胞の伸展阻害効果を、顕著な阻害効果 (+++)、強度の阻害効果（ ++)、通常の阻害効果（+ )および阻害効果無し（一）、との 4段階評価に従って等級 付けを行った。 その評価結果を、以下の表 1にまとめた。

[0048] [表 1]

表 1に記載の結果から明らかなように、セィヨウトチノキを溶媒で抽出して得られた 分離成分は、歯肉上皮細胞の伸展を有意に阻害し、この阻害効果が濃度依存的で あることが確認された。 また、この検定結果は、 in

vivo試験の前段をなすものであり、生体での歯肉上皮細胞の伸展阻害効果も十分に 期待できる。

[0049] C :牛.体での歯肉卜.皮細胞の伸展阳.害効 の枪定

本実施例では、 12週齢の wistar系雄性ラットを用いて、 D. Ekuni,

et al" Protease augment the effects of lipopolysacchande

in rat gingiva , .1. Periodont

Res, vol.38, pp.591-596 (2003)の文献で報告された手順に従って、歯肉上皮細胞の 伸展阻害効果の検定を行った。 すなわち、歯周炎の発症に起因する歯周組織の破 壊の進行に伴って、健全な歯肉上皮細胞（図 2(a))が歯根に向けてダウングロースし (図 2(b))、その結果、歯肉と歯牙との間に歯周炎に特有の歯肉溝 (歯周ポケット）が 形成される。 この症状特有の現象に着目して、生体での歯肉上皮細胞の伸展阻害 効果の検定した。

[0050] まず、 12週齢の wistar系雄性ラットの両側上顎第一臼歯口蓋側歯肉溝に、 Escheric hia coli由来の菌体内毒素 (LPS、 25 μ g/ 1;SIGMA)と Streptomyces griseus由来のプロ テアーゼ（TYPE XIV 4 units/mgゝ 2.25 units/ μ l[0.56mgを 1 μ 1に溶解したもの] ; SIG MA)の各 1.5 1を、 1日 1回、 4週間連続で投与して歯周炎を誘発した。

[0051] そして、ラットを、セィヨウトチノキエキス投与群とコントロール群とにグループ分けし た。 すなわち、セィヨウトチノキエキス投与群では、 LPSおよびプロテアーゼ処置を 開始して 2週間後から、セィヨウトチノキエキス原液 (西洋トチノキエキス（75%エタノー ル抽出物:株式会社ォムニ力）の O.lgを 75%エタノールに溶解して得た溶液を、蒸留 水で 5倍希釈して得た水溶液)の 1%水溶液 (0.2mg/ml)の 1.5 1を、 1日 1回、 2週間 連続で処置した。 コントロール群では、 LPSおよびプロテアーゼ処置を開始して 2 週間目以後には何らの処置も行わな力つた。

[0052] 実験終了後に、検定対照組織部位を固定 (還流 +浸漬)し、脱灰後にパラフィン包 埋し、 4 m厚の頰舌方向の切片を作製した。 次いで、へマトキシリン'ェォジン染 色を行い、顕微観察して、歯肉上皮組織のダウングロースの有無および程度を確認 した。

[0053] その結果、コントロール群では、試験を開始して 4週間後には、歯肉のダウングロ一 スが確認された（図 3(a))。 一方で、セィヨウトチノキエキス投与群では、試験を開始 して 4週間後には、歯肉のダウングロースが認められず（図 3(b))、健常組織が維持さ れていた。

[0054] この結果から、セィヨウトチノキを溶媒で抽出して得られた分離成分が、歯肉上皮細 胞の伸展を、生体内において有意に阻害することが確認された。

[0055] D:口腔用組成物の調製

実施例 Bおよび実施例 Cで歯肉上皮細胞の伸展阻害効果が実証されたセィヨウト チノキ抽出物（1.0%)を配合してなる、各種用途の口腔用組成物を調製した。 なお 、本実施例での成分配合量の単位は、特に断りのない限り、重量％で表示してある。

[0056] D— 1 :練歯磨剤

以下の表 2に記載の材料を、常温下で、混合および練合して練歯磨剤を調製した。

[0057] [表 2] 第 2リン酸カルシウム 30.00

グリセリン 10.00

ソルビトール 20.00

カルポキシメチルセルロースナトリゥム 1.00

ラウリル硫酸ナトリウム 1.50

カラギーナン 0.50

サッカリンナトリウム 0.10

香 料 1.00

安息香酸ナトリウム 0.30

セィヨウトチノキ抽出物 0.50

精 製 水 残部

100.00

D— 2:練歯磨剤

以下の表 3に記載の材料を、常温下で、混合および練合して練歯磨剤を調製した。

[表 3]

D— 3:洗口液

以下の表 4に記載の材料を、常温下で、混液して洗口液を調製した。

[表 4]

D-4:口腔用ノ スタ 以下の表 5に記載の材料を、常温下で、混合して口腔用パスタを調製した。

[0060] [表 5]

D— 5 :トローチ 以下の表 6に記載のマルチトール、アラビアガム、クェン酸、ァムラ 抽出物およびキシリトールを常温下で混合して得られた顆粒に対して、ショ糖脂肪酸 エステルと粉末香料を加えて打錠して、トローチを調製した。

[表 6]

産業上の利用可能性

[0062] 本願発明の歯周病用剤は、歯肉炎や歯周炎などの口腔内疾患を予防および治療 するための手段として有用である。

図面の簡単な説明

[0063] [図 1]歯肉上皮細胞の伸展阻害検定試験の原理を説明する模式図である。

[図 2]歯肉上皮組織の伸展の原理を説明する模式図である。

[図 3](a)コントロール群および (b)セィヨウトチノキ抽出成分投与群での歯肉上皮糸且織 の伸展状態を示す写真である。

Claims

請求の範囲

[1] セ =1ゥトチノや (Aes cuius hippocastanum

し）を溶媒で抽出して得られた分離成分を含み、かつ哺乳動物での歯肉上皮組織の 不正常な伸展を阻害する、ことを特徴とする歯周病用剤。

[2] 乾燥エキスの形態である請求項 1に記載の歯周病用剤。

[3] 前記哺乳動物が、ラットである請求項 1または 2に記載の歯周病用剤。

[4] 請求項 1乃至 3のいずれかに記載の歯周病用剤を含む口腔用組成物。