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WO2006019116A1 - 光反応性化合物、光反応性ポリアミンおよびポリアミンシートの製造方法 - Google Patents

光反応性化合物、光反応性ポリアミンおよびポリアミンシートの製造方法 Download PDF

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WO2006019116A1
WO2006019116A1 PCT/JP2005/015013 JP2005015013W WO2006019116A1 WO 2006019116 A1 WO2006019116 A1 WO 2006019116A1 JP 2005015013 W JP2005015013 W JP 2005015013W WO 2006019116 A1 WO2006019116 A1 WO 2006019116A1
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formula
group
polyamine
repeating unit
unit represented
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PCT/JP2005/015013
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Yasumaru Hatanaka
Takenori Tomohiro
Gabin Vic
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University Of Toyama
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    • A61K2800/95—Involves in-situ formation or cross-linking of polymers

Definitions

  • Photoreactive compound photoreactive polyamine and method for producing polyamine sheet
  • the present invention relates to a photoreactive compound, a photoreactive polyamine, and a method for producing a polyamine sheet.
  • the present invention relates to a photoreactive compound having a diazirine group as a photoreactive group and a photoreactive polyamine, and further relates to a method for producing a polyamine sheet using the photoreactive polyamine.
  • DNA chip technology is a technology for identifying a gene by labeling a target expression gene, hybridizing it to DNA on a glass surface or a silicon substrate, and confirming the immobilization position.
  • DNA chip There are two types of DNA chip: cDNA, a spot method in which synthetic oligonucleotides are immobilized on a substrate, and an in situ (on chip) method in which oligonucleotides are synthesized directly on the substrate. The latter is represented by Aifymetrix's “Gene ChipJ.
  • cDNA a spot method in which synthetic oligonucleotides are immobilized on a substrate
  • an in situ (on chip) method in which oligonucleotides are synthesized directly on the substrate.
  • the latter is represented by Aifymetrix's “Gene ChipJ.
  • In the spot method DNA fragments of several hundred to 10,000 kinds of genes can be aligned on a substrate such as a glass slide within a range of several square centimeters. Fixed and
  • a method for fixing by covalent bond is the treatment of a substrate surface with a silane coupling agent having an amino group, an aldehyde group, an epoxy group, an active ester group, a bur group, etc., and then an amino group, an aldehyde group. It binds to DNA into which a group, thiol group, or piotin is introduced. This increases the stability of the immobilized molecules, but it can be used for hybridization, etc. Due to the influence of the substrate surface, there is a report that the surface force of 20 to 30 bases is rarely used, and problems of specificity and reproducibility are likely to occur.
  • Non-Patent Document 4 discloses a method for aligning polyacrylamide gel fragments on the glass surface.
  • Non-patent document 1 “DNA chip application technology” (2000), published by CM Publishing Co., Ltd.
  • Non-Patent Document 2 “DNA chip technology and its application”, “Protein Nucleic Acid Enzyme 43 (13)” (1998), Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., 2004— 2011
  • Non-Patent Literature 3 Microarrays: the use of oligonucleotides and cDNA for the analysis of gene expression, Drug Discov Today, 8,134-141, 2003.
  • Patent Document 4 DNA analysis and diagnostics on oligonucleotide microchips, Proc. Natl. Acad. Sci. US A "93, 4913-4918, 1996.
  • An object of the present invention is to provide a material and method capable of directly bonding a polyamine to a predetermined region on the surface of a resin substrate such as a polypropylene sheet by using an optical lithography technique. There is to do. Specifically, it provides photoreactive compounds that can be used for DNA chips and protein chips as raw materials such as polyamine sheets, photoreactive polyamines and photoreactive polyamines used in the production of polyamine sheets. That is.
  • the inventors of the present invention have been engaged in research on an advanced technique called a photoaffinity method for irreversibly linking a specific ligand and a partner protein using a photoreaction, and using a diazirine derivative as a photoreactive group.
  • An original high-speed optical affinity method was developed (see Reference Documents 1 to 7 below).
  • Reference 3 A novel approach for affinity-based screening of target specific ligands: application of photoreactive D—glyceraidehyde— 3— phosphate dehydrogenase, Bioconjugate Chem., 14, 849—52 (2003).
  • the inventors of the present invention are particularly suitable for substrate modification with polyamines in the production of DNA chips and protein chips, which are newly developed in the research on the photo-affinity method.
  • the inventors have found that the above problems can be solved, and have made the present invention. That is, the first aspect of the present invention is a novel compound represented by the following general formula (I).
  • R 1 represents a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted alkenyl group, an alkoxy group, a formyl group, a carboxyl group or a -tro group
  • R 2 represents a hydrogen atom, a halogen atom, An alkyl group that may be substituted with an atom or a halogen atom is shown.
  • a second aspect of the present invention is a polyamine compound in which at least a part of an amino group or imino group is substituted with a group represented by the following general formula (II), and the average molecular weight is in the range of 2,000 to 150,000 It is.
  • R 1 represents a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted alkenyl group, an alkoxy group, a formyl group, a carboxyl group or a -tro group
  • R 2 represents a hydrogen atom, a halogen atom, An alkyl group optionally substituted by an atom or a halogen atom
  • Z is 1 to 10
  • Each represents an alkylene group having 1 to 5 carbon atoms, more preferably 1 to 3 carbon atoms, and optionally substituted with a hydroxyl group.
  • the group represented by the general formula (II) preferably has a structure represented by the following general formula (III) or ( ⁇ ).
  • a polyamine compound is applied to a substrate surface, and then irradiated with ultraviolet rays to bind the polyamine compound onto the substrate. It is a manufacturing method of a min sheet.
  • a fourth aspect of the present invention is a polyamine sheet produced by the above production method.
  • a halogen atom is a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or an iodine atom
  • an alkyl group is methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl Linear or branched C alkyl group such as tert-butyl, pentyl, etc .
  • alkellyl group means bur, allyl, isopropyl etc.
  • alkoxy group means methoxy, ethoxy, Linear or branched C alkoxy groups such as Roxy, Isopropoxy, Butoxy
  • the average molecular weight means a weight average molecular weight unless otherwise specified.
  • Examples of the substituent for the alkyl group, alkenyl group, and alkoxy group of R 1 include a nitrogen atom, a hydroxyl group, an alkoxy group, a carboxyl group, a nitro group, and an amino group.
  • alkyl group that may be substituted with the halogen atom of R 2 include trifluoromethyl, chloromethyl, fluorethyl, difluoromethyl, trifluoromethyl, trifluoromethyl, and the like.
  • the "polyamine compound” in the present specification means a compound having two or more amino groups or imino groups in the molecule.
  • Examples thereof include synthetic high molecules such as polyalkyleneimine (polyethyleneimine, etc.), polyalkylamine (polybuluamine, polyallylamine, etc.) and polyamino acids such as polyorthine and polylysine.
  • polyamine compounds in which part of the amino group or imino group is substituted with a group represented by the general formula (II) and the average molecular weight is in the range of 2,000 to 150,000 include the following: Polyamine compounds (10) to (15) can be mentioned.
  • the polyamine compound (10) includes a repeating unit represented by the formula (3) and a repeating unit represented by the formula (A), and the molar ratio thereof is preferably 1:50 to The range is 1: 2, more preferably the range is 1: 10-1: 2.
  • the average molecular weight of the polyamine compound (10) is in the range of 2,000 to 100,000, preferably in the range of 5,000 to 80,000, more preferably in the range of 10,000 to 50,000.
  • the polyamine compound (11) includes a repeating unit represented by the formula (4) and a repeating unit represented by the formula (B) and Z or ( ⁇ '), and the molar ratio thereof is A range of 1:50 to 1: 2 is preferable, and a range of 1:10 to 1: 2 is more preferable.
  • the molar ratio of the repeating unit represented by the formula ( ⁇ ) and the repeating unit represented by the formula ( ⁇ ⁇ ⁇ ′) can be, for example, 100: 0 to 0: 100.
  • the average molecular weight of the polyamine compound (11) is in the range of 2,500 to 150,000, preferably in the range of 2,500 to 120,000, more preferably in the range of 3,000 to 100,000.
  • the polyamine compound (12) includes a repeating unit represented by the formula (6) and a repeating unit represented by the formula (C) and Z or (C '), and the molar ratio thereof is A range of 1:50 to 1: 2 is preferable, and a range of 1:10 to 1: 2 is more preferable.
  • the molar ratio of the repeating unit represented by the formula (C) and the repeating unit represented by the formula (C ′) can be, for example, 100: 0 to 0: 100.
  • the average molecular weight of the polyamine compound (12) is in the range of 2,000 to 150,000, preferably in the range of 2,500 to 120,000, more preferably in the range of 3,000 to 10,000.
  • the polyamine compound (13) includes a repeating unit represented by the formula (7) and a repeating unit represented by the formula (A), and the molar ratio thereof is 1:50 to 1: 2. The thing of the range of is preferable.
  • the average molecular weight of the polyamine compound (13) is in the range of 2,000 to 100,000, preferably in the range of 5,000 to 80,000, more preferably in the range of 10,000 to 50,000.
  • the polyamine compound (14) includes a repeating unit represented by the formula (8) and a repeating unit represented by the formula (B) and Z or ( ⁇ '), and the molar ratio thereof is A range of 1:50 to 1: 2 is preferable, and a range of 1:10 to 1: 2 is more preferable.
  • the molar ratio of the repeating unit represented by the formula ( ⁇ ) and the repeating unit represented by the formula ( ⁇ ′) can be, for example, 100: 0 to 0: 100.
  • the average molecular weight of the polyamine compound (14) is in the range of 2,000 to 150,000, preferably in the range of 2,500 to 120,000, more preferably in the range of 3,000 to 10,000.
  • the polyamine compound (15) includes a repeating unit represented by the formula (9) and a repeating unit represented by the formula (C) and Z or (C '), and the molar ratio thereof is A range of 1:50 to 1: 2 is preferable, and a range of 1:10 to 1: 2 is more preferable.
  • the molar ratio of the repeating unit represented by the formula (C) and the repeating unit represented by the formula (C ′) can be, for example, 100: 0 to 0: 100.
  • the average molecular weight of the polyamine compound (15) is in the range of 2,000 to 150,000, preferably in the range of 2,500 to 120,000, more preferably in the range of 3,000 to 10,000.
  • the compound of the general formula (I) of the present invention can be produced, for example, by the following production method A.
  • R 1 represents a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl, an alkyl or alkoxy group, a formyl group, a carboxyl group, or a -tro group
  • R 2 represents a hydrogen atom, a halogen atom, And an alkyl group which may be substituted with a halogen atom, respectively.
  • the compound of the general formula (2a) can be produced by epoxidizing the compound of the general formula (la). This reaction may be carried out by a known method for synthesizing epoxides from aldehydes [4th edition experimental chemistry course 20, 215-218, (1992), Maruzen, etc.]. Specifically, for example, the power of aldehydes with dimethylsulfomethylide in a solvent such as hydrous acetonitrile. A methylene unit may be cycloadded to rubonyl.
  • the compound of the general formula (la) is, for example, a method described in Heterocycls, 49, 465-468 (1998) and J. Am. Chem. Soc, 115, 3458-3474 (1993), or the like. It can be prepared by a method.
  • the polyamine compound of the present invention can be produced, for example, by the following production methods B1 to B3.
  • R 1 represents a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl, an alcohol or an alcohol;
  • R 2 represents a hydrogen atom, a halogen atom or an alkyl group which may be substituted with a halogen atom, respectively;
  • Epoxy compounds usually produce 2-amino alcohol derivatives with ring cleavage under mild conditions by nucleophilic substitution with amin. Specifically, it is shown as production method B1.
  • polyalkylenimine used in the present invention include polyethyleneimine represented by the following formula.
  • Preferable polyethyleneimine used in the present invention has an average molecular weight of about 10,000, and (C H N) n 129 X n has n of about 78.
  • polyalkylamine used in the present invention include polyallylamine hydrochloride represented by the following formula.
  • Preferred polyallylimine hydrochloride used in the present invention has an average molecular weight of about 15,000 and (C H ClN) n 94 X n where n is about 156.
  • polyamino acid used in the present invention include poly (L-lysine) hydrobromide represented by the following formula.
  • the preferred poly-L-lysine 'hydrobromide used in the present invention has an average molecular weight of about 5,000 to 15,000 and (CH BrN 0) n 209 X n where n is about 24 to 72
  • the polyamine compound (1 (3A), (4A) and (5A) which are components of (0), (11) and (12) can be produced.
  • this reaction is preferably performed in the presence of a base when an acid salt of polyamine such as polyallylimine'hydrochloride or poly-L-lysine'hydrobromide is used.
  • the solvent can be distilled off and further purified by gel filtration or the like to obtain the desired polyamine compound.
  • Elution of polyamine compounds in gel filtration can be confirmed by measuring absorbance at 254 nm and 360 nm.
  • a substituted phenyl group is added to the amino group for the sake of notation.
  • some amino groups of the polyamine are free amino groups.
  • Substituted phenyl group is an amino group).
  • polyamine compounds (10), (11) and (12) are represented by (3A), (4A) and (5A), respectively, and a plurality of repeating units of polyalkyleneimine, polyalkylamine and polyamino acid. Each repeating unit in each polyamine compound is randomly arranged.
  • R 1 represents a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl, an alkenyl or alkoxy group, a formyl group, a carboxyl group, or a -tro group
  • R 2 represents a hydrogen atom, a halogen atom, And an alkyl group which may be substituted with a halogen atom
  • X represents a halogen atom, respectively.
  • the compound of the general formula (5A) can be produced, for example, by the method described in J. Am. Chem. So, 106, 7540-7545 (1984) or a method analogous thereto. Specific examples include 3- (4- (bromomethyl) phenol) -3- (trifluoromethyl) -3H-diazirine.
  • a halogenated alkyl compound and an amine are subjected to a nucleophilic substitution reaction in the presence of a base. Easily binds under mild conditions. Specifically, it is shown as production method B2.
  • polyalkylene-containing polyalkylamino-containing polyamino acids in production method B2 examples include polyethylamine-containing polyallylamine, poly-L-lysine and the like.
  • Elution of polyamine compounds in gel filtration can be confirmed by measuring absorbance at 254 nm and 360 nm.
  • a substituted phenyl group is added to all amino groups for the purpose of description, but in the actual polyamine compound of the present invention, some amino groups of the polyamine are free amino groups. (Substituted phenyl group is an amino group).
  • polyamine compounds (13), (14) and (15) are represented by (6A), (7A) and (8A), respectively, and a plurality of repeating units of polyalkyleneimine, polyalkylamine and polyamino acid. Each repeating unit in each polyamine compound is randomly arranged.
  • R 1 represents a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl, an alkyl or alkoxy group, a formyl group, a carboxyl group, or a -tro group
  • R 2 represents a hydrogen atom, a halogen atom, And an alkyl group which may be substituted with a halogen atom
  • X represents a halogen atom, respectively.
  • the compound of the general formula (la) can be produced, for example, by the method described in Heterocycls, 49, 465-468 (1998) or a method analogous thereto.
  • a specific compound is 4- [3-trifluoromethyl-3H-diazirine-3-yl] benzaldehyde.
  • Formyl compounds and amines are reacted under acidic conditions to form imi-um compounds. To do. These are reduced using a reducing agent such as sodium cyanoborohydride (NaCNBH)
  • the desired polyamine compound By carrying out the reaction, the desired polyamine compound can be produced. Specifically, it is shown as production method B3.
  • polyalkylamino-containing polyalkylamino-containing polyamino acids in production method B3 include polyethylamine-containing polyallylamine, poly-L-lysine and the like.
  • the above polyamine and compound (1) are reacted in a mixed solvent of, for example, acetic acid / water / methanol (7: 1: 8) for 1 day at around 50 ° C. in the dark, and after NaCNBH is prepared, 50 ° C
  • the solvent is distilled off, and further purified by gel filtration or the like to obtain the components (6A), (7A) and (8A) which are the components of the desired polyamine compound (13), (14) and (15). ) Can be manufactured.
  • Elution of polyamine compounds in gel filtration can be confirmed by measuring absorbance at 254 nm and 360 nm.
  • a substituted phenyl group is added to all amino groups for the purpose of description. However, in the actual polyamine compound of the present invention, some amino groups of the polyamine are free amino groups. (Substituted phenyl group is an amino group).
  • Polyamine compounds (13), (14) and (15) are represented by (6A), (7A) and (8A), respectively, and a plurality of repeating units of polyalkylenemine, polyalkylamine and polyamino acid. Each repeating unit in each polyamine compound is randomly arranged.
  • a solution containing a polyamine compound (10), (11), (12), (13), (14) or (15) is applied to a substrate surface, and then irradiated with ultraviolet rays to form a polyamine compound. Including bonding onto the substrate surface.
  • the amine sheet can be created by the following scheme, for example. In the description, all substituted amino groups are added to the amino groups. However, in the actual polyamine compound of the present invention, some amino groups of the polyamines are free amino groups (substituted phenyl groups). -The amino group is not attached. [0050] [Chemical 24]
  • a coating solution containing a polyamine compound can be prepared as follows.
  • water is usually used, but a solvent other than water, for example, various buffer solutions such as dimethylformamide or the like may be used alone or in combination depending on the physical properties such as solubility of the photoreactive polyamine. Can be used.
  • various buffer solutions such as dimethylformamide or the like may be used alone or in combination depending on the physical properties such as solubility of the photoreactive polyamine. Can be used.
  • the mixing ratio of the polyamine compound and the solvent is not particularly limited as long as the polyamine compound can be dissolved.
  • the polyamine compound (12) 0.01 to 10 mg in 1 mL of solvent. Can be used with a melting force. In the case of other polyamine compounds, they can be mixed under substantially the same conditions.
  • the coating solution is applied to the substrate surface. It is preferable that at least the surface of the substrate is made of resin. As shown in the above scheme, the resin substrate has a methyl group on the surface, and this methyl group reacts with the diazirine group of the polyamine compound by ultraviolet irradiation.
  • Diazirine which is a photoreactive group, generates carbene, which is a highly reactive active species, by light irradiation, and is easily inserted between chemical bonds such as alkyl chains to form new bonds. Therefore, it can basically be fixed to a general resin substrate, but as shown in the above reaction scheme, the reactivity is high when a resin having a methyl group or the like on the surface is used.
  • a resin substrate include various substrates such as polypropylene and metatalylate.
  • the surface of the resin substrate is irradiated with ultraviolet rays to react the polyamine compound.
  • UV light For irradiation, light in the vicinity of 350 nm, which is the light absorption band of diazirine, is required, and this light can be obtained by using, for example, a 100 W black light lamp.
  • aqueous solution of 1.0 mg / mL polyamine compound is spotted on a polypropylene sheet and dried.
  • the ion-exchanged water, 1M hydrochloric acid, and ultrapure water may be washed in this order.
  • the polymer is synthesizing a photoreactive polymer obtained by modifying a polymer with photoreactive diazirine, placing the photoreactive polymer on a solid phase, and applying light to the polymer, the polymer is applied to any location on the solid phase. Covalently bond the polymer.
  • the reactive polyamine of the present invention can be baked by the photoreaction of polypropylene to produce a new type of amine sheet.
  • the polyamine sheet of the present invention the polyamine is pinpointed at an arbitrary position and the force is also immobilized by a covalent bond, and therefore, impurities such as non-specific adsorption are thoroughly washed. It is possible to exclude. In addition, the reaction takes place efficiently with light near 360 nm, which is hardly absorbed by normal biomolecules such as DNA and proteins, and it is extremely fast, so it has little effect on the analysis system used.
  • the polyamine sheet of the present invention makes it possible to produce a DNA chip or the like simply, quickly and at a low cost without the need for special treatment of the resin on the substrate before spotting.
  • the fixed polyamine has a three-dimensional and flexible structure, so that it becomes closer to the environment in the liquid phase in the subsequent biological material reaction system, and the force is also unit area. It is possible to improve the amount of fixed substances per hit.
  • the polyamine sheet of the present invention can easily bind and remove oligomers and DNA by adjusting pH when DNA is electrostatically fixed on a substrate.
  • FIG. 1 shows an elution pattern of gel filtration in Example 2.
  • FIG. 2 shows the elution pattern of gel filtration in Example 3.
  • FIG. 3 shows the elution pattern of gel filtration in Example 4.
  • FIG. 4 shows the elution pattern of gel filtration in Example 5.
  • FIG. 5 shows the elution pattern of gel filtration in Example 6.
  • FIG. 6 shows the elution pattern of gel filtration in Example 7.
  • FIG. 7 shows the elution pattern of gel filtration in Example 8.
  • FIG. 8 Conceptual diagram of immobilization of protein on polyamine sheet.
  • the polyamine compound has a force in which a substituted phenyl group is added to the amino group.
  • some amino groups of the polyamine are substituted. It is present as an amino group with a phenyl group attached.
  • Figure 1 shows the elution pattern
  • Figure 2 shows the elution pattern
  • Figure 3 shows the elution pattern
  • Figure 4 shows the elution pattern
  • Figure 6 shows the elution pattern
  • the solvent was completely distilled off under reduced pressure, and 1 mL of water was added.
  • the solution was purified by gel filtration * (solvent; water) through a column.
  • the absorbance of diazirine was monitored at 360 nm and 254 nm and the photoreactive polyamine fraction was collected and lyophilized. The progress of the reaction was confirmed by thin layer chromatography.
  • Figure 7 shows the elution pattern
  • DIA mixed 5 ⁇ L of 1% (W / V) aqueous solution of polyethyleneimine and 5 / z L of 1% (W / V) aqueous solution of horse radish peroxidase (HR P) into a polypropylene sheet. Spotted and dried for 20 minutes under reduced pressure. Next, after irradiation with ultraviolet rays (360 nm, 15 WX 2 for 60 minutes), ultrasonic cleaning was performed in a buffer solution for 1 minute.
  • HR P horse radish peroxidase
  • a photoreactive polymer having a V or diazirine group introduced into a polyamine which is widely used in the photoaffinity method, which is an effective structure analysis method for physiologically active substances, was produced.
  • a polyamine can be immobilized by covalent bonding by spotting on a solid phase such as polypropylene and irradiating with light. This lithography makes it possible to construct functional groups at any location even on the surface of a resin that has poor chemical reactivity.

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Abstract

　ＤＮＡチップやプロテインチップに利用可能なポリアミンシート、このポリアミンシートの作製に用いられる光反応性ポリアミン、この光反応性ポリアミンの原料となる光反応性化合物を提供する。 　光反応基としてジアジリン基を有する光反応性化合物、この光反応性化合物とポリアミンから生成する光反応性ポリアミン化合物、この光反応性ポリアミン化合物を用いたポリアミンシートとその製造法に関する。

Description

明 細 書
光反応性化合物、光反応性ポリアミンおよびポリアミンシートの製造方法 技術分野
[0001] 本発明は、光反応性化合物、光反応性ポリアミンおよびポリアミンシートの製造方 法に関する。特に本発明は、光反応性基としてジアジリン基を有する光反応性化合 物および光反応性ポリアミンに関し、さらに、前記光反応性ポリアミンを用いたポリアミ ンシートの製造方法に関する。
背景技術
[0002] DNAチップ技術は、対象の発現遺伝子を標識し、ガラス表面やシリコン基板上の D NAにハイブリダィゼーシヨンさせ固定化位置を確認することにより遺伝子を特定する 技術である。 DNAチップには cDNAある 、は合成オリゴヌクレオチドを基板上に固定 化するスポット方式と、オリゴヌクレオチドを基板上で直接合成する in situ (on chip) 方式がある。後者は Aifymetrix社の「Gene ChipJに代表される。スポット方式では数 百から一万種類に及ぶ遺伝子の DNA断片をスライドガラス等基板上に数平方センチ メートルの範囲で整列でき、主に静電的結合及び共有結合による固定ィ匕法が利用さ れている (非特許文献 1)。
[0003] 静電結合による固定ィ匕ではポリカチオンをコーティングしたスライドグラスにポリア- オンである DNAやオリゴヌクレオチドをスポットする。ただし、固定ィ匕効率はその長さ に依存する。 SNP解析における 1塩基の差を見るには 20— 30塩基の合成オリゴヌク レオチドを用いることが必要だが、長さが短くなれば DNAの安定的な固定ィ匕は困難 であり効率も低くなる。また、ポリアミンは DNAチップの基板修飾用として使用されてき たが固相上全体に被覆されるため非特異的吸着により微粒検出が困難であった (非 特許文献 2及び 3)。
[0004] 一方、共有結合による固定ィ匕方法は、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基、活性ェ ステル基、ビュル基などを有するシランカップリング剤で基板表面を処理した後、アミ ノ基、アルデヒド基、チオール基、ピオチンなどを導入した DNAと結合させる。これに より固定化される分子の安定性は増したが、ハイブリダィゼーシヨンなどを行う場合に 基板表面の影響を受けやすぐ特に表面力も 20— 30塩基までは殆んど利用されな いとの報告もあり特異性や再現性の問題が生じやすい。最近、ガラス表面にポリアク リルアミドゲル微小片を整列させることにより、表面に共有結合された合成オリゴマー に対し、液相環境下でノヽイブリダィゼーシヨンが可能となった力 ガラス表面の官能 基付加など事前の表面処理過程は免れ得な!、 (非特許文献 4)。
[0005] また、プロテオミクスにより創薬候補とその標的分子を効率よく探索するためにはタ ンパク質のリガンド認識能に基づく直接的 ·合理的な解析が不可欠である。しかし、こ れまでの DNAチップやプロテインチップでは、上記の欠点を有するため、そのような 解析に十分な性能を具備して 、なかった。
[0006] 非特許文献 1：「DNAチップ応用技術」（2000年) ,シーエムシー出版 (株)発行
非特許文献 2 :「DNAチップ技術とその応用」， 「蛋白質核酸酵素 43(13)」，（1998年)， 共立出版 (株)発行， 2004— 2011頁
非特干文献 3 : Microarrays: the use of oligonucleotides and cDNA for the analysis of gene expression, Drug Discov Today, 8,134—141, 2003.
特許文献 4 : DNA analysis and diagnostics on oligonucleotide microchips, Proc. Na tl. Acad. Sci. US A" 93, 4913-4918, 1996.
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 上記したように、 DNAチップやプロテインチップを作成する上で以下の課題が未解 決のままである。
(1) DNAチップの基板修飾用として使用されてきたポリアミンは、固相上全体に被覆さ れるため非特異的吸着により微粒検出が困難であること。
(2)—般に DNAチップやプロテインチップで汎用されるスライドガラスは、 目的に応じた 表面処理が必要であること。
(3)固相表面での生体分子結合には表面処理により液相環境を与えることが必要で あること。
[0008] 本発明の目的は、ポリプロピレンシートなど榭脂基板表面上の所定領域に、光リソ グラフィー技術を用いてポリアミンを直接結合させることができる材料及び方法を提供 することにある。具体的には、 DNAチップやプロテインチップに利用可能な、ポリアミ ンシート、ポリアミンシートの作製に用いられる光反応性ポリアミンおよび光反応性ポ リアミンなどの原料となる光反応性ィ匕合物を提供することである。
課題を解決するための手段
本発明者等は、光反応を利用して特異的リガンドと相手タンパク質を非可逆的に繋 ぎ止める光ァフィユティー法という先端技術の研究に従事してきており、ジアジリン誘 導体を光反応基として用いて独自の高速光ァフィ二ティー法を開発した（下記参考文 献 1〜7参照)。
参考文献 1 : MultilUnctional photoprooes for rapid protein mentincation. Inし hemic al Genomics, 199—214, Marcel Dekker Inc., New York, 2003.
参考文献 2 : Labeling in Drug Discovery and Developments: Chemical Gateway for Entering Proteomic Frontier., Curr. Top. Med. Chem., 2, 271—288, 2002.
参考文献 3 : A novel approach for affinity-based screening of target specific ligands ： application of photoreactive D—glyceraidehyde— 3— phosphate dehydrogenase, Bioco njugate Chem., 14, 849—52 (2003).
参考文献 4： Improvement in the properties of 3- phenyト 3- trifluoromethyldiazirine based photoreactive bis— glucose probes for GLUT4 following substitution on the phe nyl ring., Chem. Pharm. Bull., 50, 1004 - 1006, 2002.
参考文献 5： One-step Synthesis of Biotinyl Photoprobes from Unprotected Carboh ydrates., J. Org. Chem., 65, 5639—5643, 2000.
参考文献 6： A Rapid and Efficient Method for Identifying Photoaffinity Biotinylated Sites within Proteins., J. Am. Chem. Soc, 120, 453—454, 1998.
参考文献 7：特開 2000-319262号公報 (発明の名称：フエ二ルジァリジン化合物及び 光親和性標識試薬）
本発明者等は、前記光ァフィユティー法の研究において新たに開発された光反応 性ィ匕合物力 DNAチップやプロテインチップを製造する上でのポリアミンによる基板 修飾に特に適しており、それを用いることにより上記の課題を解決できることを見出し 、本発明をなすに至った。 [0010] 即ち、本発明の第 1の態様は、次の一般式 (I)で表される新規ィ匕合物である。
[化 1]
Figure imgf000006_0001
(式中、 R1は水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいァ ルケニル基、アルコキシ基、ホルミル基、カルボキシル基または-トロ基を; R2は水素 原子、ハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいアルキル基を、それぞれ 示す。）
これらの化合物は、光反応性のジアジリン構造及び反応性のエポキシ基を有して ヽ るため、エポキシ基を介してポリアミンと反応し、ポリアミンに光反応性のジアジリン構 造を導入するための原料として使用できる。
[0011] 本発明の第 2の態様は、アミノ基又はイミノ基の少なくとも一部が次の一般式 (II)で 表される基で置換され、平均分子量が 2,000〜150,000の範囲にあるポリアミン化合物 である。
[化 2]
Figure imgf000006_0002
(式中、 R1は水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいァ ルケニル基、アルコキシ基、ホルミル基、カルボキシル基または-トロ基を; R2は水素 原子、ハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいアルキル基を； Zは 1〜10 、好ましくは 1〜5、より好ましくは 1〜3の炭素原子を有しヒドロキシル基で置換されて いてもよいアルキレン基を、それぞれ示す。 )
より詳細には、前記一般式 (II)で表される基は、下記の一般式 (III)又は (ΠΓ )で表 される構造を有するのが好まし ヽ。
[化 3]
Figure imgf000007_0001
(式中、 R1及び R2は上記と同様である。 )
Figure imgf000007_0002
(式中、 R1及び R2は上記と同様である。 )
[0013] 本発明の第 3の態様は、上記のポリアミンィ匕合物を含む溶液を基板表面に塗布し、 次いで紫外線を照射してポリアミン化合物を基板上に結合させることを特徴とするポ リアミンシートの製造方法である。
本発明の第 4の態様は、上記の製造方法で製造されたポリアミンシートである。
[0014] 以下、詳細に説明する。
本発明において、特にことわりがない限り、ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原 子、臭素原子、ヨウ素原子を;アルキル基とは、メチル、ェチル、プロピル、イソプロピ ル、ブチル、イソブチル、 sec-ブチル、 tert-ブチル、ペンチルなどの直鎖状または分 岐状の C アルキル基を；ァルケ-ル基とは、ビュル、ァリル、イソプロべ-ルなどの
1-6
直鎖状または分岐状の C ァルケ-ル基を;アルコキシ基とは、メトキシ、エトキシ、プ ロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシなどの直鎖状または分岐状の C アルコキシ基を
1-6
、それぞれ意味する。
また、本発明において、平均分子量は、特にことわりがない限り、重量平均分子量 を意味する。
[0015] R1のアルキル基、ァルケ-ル基およびアルコキシ基の置換基としては、例えば、ノヽ ロゲン原子、ヒドロキシル基、アルコキシ基、カルボキシル基、ニトロ基、アミノ基など が挙げられる。
また、 R2のハロゲン原子で置換されていてもよいアルキル基としては、例えば、フル ォロメチル、クロルメチル、フルォロェチル、ジフルォロメチル、トリフルォロメチル、トリ クロルメチルなどが挙げられる力 好まし ヽものとしてトリフルォロメチルが挙げられる
[0016] 一般式 (I)の化合物として、具体的なものとして、例えば、以下の化合物が挙げられ
[化 4]
Figure imgf000008_0001
[0017] 本明細書における「ポリアミンィ匕合物」とは、分子内に 2以上のアミノ基又はイミノ基 を有する化合物を意味するものとする。例えば、ポリアルキレンィミン (ポリエチレンィ ミンなど）、ポリアルキルアミン (ポリビュルアミン、ポリアリルァミンなど）などの合成高 分子およびポリオル-チン、ポリリジンなどのポリアミノ酸が挙げられる。
[0018] アミノ基又はイミノ基の一部が一般式 (II)で表される基で置換され、平均分子量が 2, 000〜150,000の範囲にあるポリアミン化合物として、具体的なものは、以下のポリアミ ン化合物（10)〜（15)が挙げられる。
[0019] ·ポリアミンィ匕合物 (10)
Figure imgf000009_0001
[化 6]
Figure imgf000009_0002
[0020] ポリアミンィ匕合物 (10)は、式 (3)で表される繰返し単位と式 (A)で表される繰返し単位 を含み、それらのモル比は、好ましくは、 1:50〜1:2の範囲、より好ましくは、 1:10-1:2 の範囲である。
ポリアミン化合物 (10)の平均分子量は、平均分子量が 2,000〜100,000の範囲、好 ましくは 5,000〜80,000の範囲、より好ましくは 10,000〜50,000の範囲である。
[0021] ·ポリアミンィ匕合物 (11)
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000010_0002
《B) (Β' )
[0022] ポリアミンィ匕合物 (11)は、式 (4)で表される繰返し単位と式 (B)及び Z又は (Β')で表 される繰返単位を含み、それらのモル比は好ましくは、 1:50〜1:2の範囲、より好ましく は、 1:10〜1:2の範囲である。また、式（Β)で表される繰返し単位と式（Β' )で表される 繰返し単位のモル比は、例えば、 100:0〜0:100であることができる。
ポリアミン化合物 (11)の平均分子量は、平均分子量が 2,500〜150,000の範囲、好 ましくは 2,500〜120,000の範囲、より好ましくは 3,000〜100,000の範囲である。
[0023] ·ポリアミン化合物 (12)
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000011_0002
[化 10]
Figure imgf000011_0003
(C) (C )
[0024] ポリアミンィ匕合物 (12)は、式 (6)で表される繰り返し単位と式 (C)及び Z又は (C')で 表される繰返し単位を含み、それらのモル比は、好ましくは、 1:50〜1:2の範囲、より 好ましくは、 1:10〜1:2の範囲である。
また、式 (C)で表される繰返し単位と式 (C')で表される繰返し単位のモル比は、例え ば、 100:0〜0： 100であることができる。
ポリアミン化合物 (12)の平均分子量は、平均分子量が 2,000〜150,000の範囲、好 ましくは 2,500〜120,000の範囲、より好ましくは 3,000〜10,000の範囲である。
[0025] ·ポリアミンィ匕合物 (13)
Figure imgf000012_0001
Figure imgf000012_0002
[0026] ポリアミンィ匕合物 (13)は、式 (7)で表される繰返し単位と式 (A)で表される繰返し単位 を含み、それらのモル比は、 1:50〜1:2の範囲のものが好ましい。
ポリアミン化合物 (13)の平均分子量は、平均分子量が 2,000〜100,000の範囲、好 ましくは 5,000〜80,000の範囲、より好ましくは 10,000〜50,000の範囲である。
[0027] ·ポリアミンィ匕合物 (14)
[化 13]
Figure imgf000012_0003
[化 14]
Figure imgf000013_0001
[0028] ポリアミンィ匕合物 (14)は、式 (8)で表される繰返し単位と式 (B)及び Z又は (Β')で表 される繰返し単位を含み、それらのモル比は、好ましくは、 1:50〜1:2の範囲、より好ま しくは、 1:10〜1:2の範囲である。
また、式 (Β)で表される繰返し単位と式 (Β')で表される繰返し単位のモル比は、例え ば、 100:0〜0： 100であることができる。
ポリアミン化合物 (14)の平均分子量は、平均分子量が 2,000〜150,000の範囲、好 ましくは 2,500〜120,000の範囲、より好ましくは 3,000〜10,000の範囲である。
[0029] ·ポリアミン化合物 (15)
[化 15]
Figure imgf000013_0002
[化 16]
Figure imgf000014_0001
[0030] ポリアミンィ匕合物 (15)は、式 (9)で表される繰返し単位と式 (C)及び Z又は (C')で表 される繰返し単位を含み、それらのモル比は、好ましくは、 1:50〜1:2の範囲、より好ま しくは、 1:10〜1:2の範囲である。
また、式 (C)で表される繰返し単位と式 (C')で表される繰返し単位のモル比は、例え ば、 100:0〜0： 100であることができる。
ポリアミン化合物 (15)の平均分子量は、平均分子量が 2,000〜150,000の範囲、好 ましくは 2,500〜120,000の範囲、より好ましくは 3,000〜10,000の範囲である。
[0031] 本発明の一般式 (I)の化合物は、例えば以下の製造法 Aによって製造することがで きる。
[製造法 A]
[化 17]
Figure imgf000014_0002
[0032] 「式中、 R1は、水素原子、置換されていてもよいアルキル、ァルケ-ルもしくはアルコ キシ基、ホルミル基、カルボキシル基または-トロ基を; R2は、水素原子、ハロゲン原 子、ハロゲン原子で置換されていてもよいアルキル基を、それぞれ示す。」
一般式 (2a)の化合物は、一般式 (la)の化合物をエポキシィ匕することにより製造でき る。この反応は、エポキシドをアルデヒドより合成する公知の方法 [第 4版実験化学講 座 20、 215-218、（1992)、丸善、など]で実施すればよい。具体的には、例えば、含水 ァセトニトリルなど溶媒中で、ジメチルスルホ-ゥムメチリドなどにより、アルデヒドの力 ルボニルにメチレン単位を付加環化させればよい。
一般式 (la)の化合物は、例えば、 Heterocycls, 49, 465- 468(1998)及び J. Am. Che m. Soc, 115, 3458-3474(1993)などに記載の方法、またはそれらに準じた方法により 調製することができる。
[0033] 本発明のポリアミンィ匕合物は、例えば以下の製造法 B1〜B3によって製造すること ができる。
[製造法 B1]
[化 18]
Figure imgf000015_0001
(5A)
[0034] 「式中、 R1は、水素原子、置換されていてもよいアルキル、ァルケ-ルもしくはアルコ キシ基、ホルミル基、カルボキシル基または-トロ基を; R2は、水素原子、ハロゲン原 子、ハロゲン原子で置換されていてもよいアルキル基を、それぞれ示す。」
通常、エポキシ化合物は、ァミンにより求核置換反応により、温和な条件下で環開 裂を伴って 2—ァミノアルコール誘導体を生成する。具体的に製造法 B 1として図示し た。
本発明に使用されるポリアルキレンィミンの好ましい例としては、以下の式で示され るポリエチレンィミンが挙げられる。
[0035] [化 19]
Figure imgf000016_0001
[0036] 本発明に使用されるポリエチレンィミンとして好ましいものは、平均分子量が約 10,0 00であり、（C H N ) n 129 X nとしてnは約78のものでぁる。
6 15 3
[0037] 本発明に使用されるポリアルキルァミンの好ましい例としては、以下の式で示される ポリアリルァミンの塩酸塩が挙げられる。
[0038] [化 20]
Figure imgf000016_0002
[0039] 本発明に使用されるポリアリルイミン '塩酸塩として好ましいものは、平均分子量が 約 15, 000であり、 (C H ClN) n 94 X nとして nは約 156のものである。
3 8
[0040] 本発明に使用されるポリアミノ酸の好ましい例としては、以下の式で示されるポリ L リジンの臭化水素酸塩が挙げられる。
[化 21]
NH2 HBr
(CH2)4 [0041] 本発明に使用されるポリ— L—リジン'臭化水素酸塩として好ましいものは、平均分 子量が約 5,000〜15,000であり、（C H BrN 0) n 209 X nとして nは約 24〜72のもの
6 13 2
である。
[0042] 上記したポリアミンと一般式 (2a)の化合物を、例えば、ジメチルホルムアミドー水（1:1 )の混合溶媒中、 50°C付近で遮光下に終夜反応させることにより、ポリアミン化合物 (1 0)、（11)および (12)の成分である (3A)、（4A)および (5A)を製造することができる。ま た、この反応は、ポリアリルイミン'塩酸塩やポリ— L—リジン'臭化水素酸塩のように ポリアミンの酸性塩を使用する場合は、塩基の存在下に行うことが好ましい。反応終 了後、溶媒を留去し、さらにゲル濾過などにより精製して目的のポリアミンィ匕合物を得 ることがでさる。
ゲル濾過におけるポリアミンィ匕合物の溶出は、 254nmおよび 360nmの吸光度を測定 することで確認すればょ 、。
なお、製造法 B1においては、表記上、全てアミノ基に置換フエニル基が付加されて いるが、実際の本発明のポリアミンィ匕合物は、ポリアミンの一部のアミノ基は、フリーの アミノ基 (置換フ ニル基が付加して 、な 、ァミノ基）として存在する。
また、ポリアミンィ匕合物 (10)、（11)および (12)は、それぞれ (3A)、（4A)および (5A)と ポリアルキレンィミン、ポリアルキルァミンおよびポリアミノ酸の複数の繰り返し単位か らなる共重合体であり、各ポリアミン化合物における各繰り返し単位はランダムに配列 する。
[0043] [製造法 B2]
[化 22]
製造法 B2
Figure imgf000018_0001
(8A)
[0044] 「式中、 R1は、水素原子、置換されていてもよいアルキル、ァルケ-ルもしくはアルコ キシ基、ホルミル基、カルボキシル基または-トロ基を; R2は、水素原子、ハロゲン原 子、ハロゲン原子で置換されていてもよいアルキル基を; Xは、ハロゲン原子を、それ ぞれ示す。」
一般式 (5A)の化合物は、例えば、 J. Am. Chem. So ， 106, 7540-7545(1984)に記 載された方法またはそれに準じた方法により製造することができる。具体的な化合物 として、 3-(4- (ブロモメチル)フエ-ル) -3- (トリフルォロメチル) -3H-ジアジリンが挙げら れる。
[0045] 通常、ハロゲンィ匕アルキルィ匕合物とアミンは、塩基の存在下で求核置換反応により 温和な条件下で容易に結合する。具体的に製造法 B2として図示した。
製造法 B2おけるポリアルキレンイミ入ポリアルキルアミ入ポリアミノ酸としては、例 えば、ポリエチレンイミ入ポリアリルァミン、ポリ- L-リジンなどが挙げられる。
上記したポリアミンと Xが臭素である一般式 (5A)の化合物を、例えば、ジメチルホル ムアミドー水 (1:1)の混合溶媒中、 50°C付近で遮光下に終夜反応させ、反応終了後、 溶媒を留去し、さらにゲル濾過などにより精製して目的のポリアミン化合物（13)、 （14 )および（15)の成分である（6A)、 (7A)および (8A)を製造することができる。
ゲル濾過におけるポリアミンィ匕合物の溶出は、 254nmおよび 360nmの吸光度を測定 することで確認すればょ 、。
なお、製造法 B2においては、表記上、全てアミノ基に置換フエニル基が付加されて いるが、実際の本発明のポリアミンィ匕合物は、ポリアミンの一部のアミノ基は、フリーの アミノ基 (置換フ ニル基が付加して 、な 、ァミノ基）として存在する。
また、ポリアミンィ匕合物 (13)、（14)および (15)は、それぞれ (6A)、（7A)および (8A)と ポリアルキレンィミン、ポリアルキルァミンおよびポリアミノ酸の複数の繰り返し単位か らなる共重合体であり、各ポリアミン化合物における各繰り返し単位は、ランダムに配 列する。
[製造法 B3]
[化 23]
製造法 B3
Figure imgf000020_0001
(8A)
[0047] 「式中、 R1は、水素原子、置換されていてもよいアルキル、ァルケ-ルもしくはアルコ キシ基、ホルミル基、カルボキシル基または-トロ基を; R2は、水素原子、ハロゲン原 子、ハロゲン原子で置換されていてもよいアルキル基を; Xは、ハロゲン原子を、それ ぞれ示す。」
一般式（la)の化合物は、例えば、 Heterocycls, 49, 465- 468(1998)に記載された方 法またはそれに準じた方法により製造することができる。具体的な化合物として、 4-[3 -トリフルォロメチル -3H-ジアジリン- 3-ィル]ベンズアルデヒドが挙げられる。
[0048] ホルミルィ匕合物とアミンは、酸性下で反応させることにより、イミ-ゥム化合物が生成 する。これらをシァノ水素化ホウ素ナトリウム (NaCNBH )などの還元剤を使用して還元
3
反応を行うことにより目的のポリアミンィ匕合物を製造することができる。具体的に製造 法 B3として図示した。
製造法 B3おけるポリアルキレンイミ入ポリアルキルアミ入ポリアミノ酸としては、例 えば、ポリエチレンイミ入ポリアリルァミン、ポリ- L-リジンなどが挙げられる。
上記したポリアミンと化合物（1)を、例えば、酢酸一水 メタノール (7:1:8)の混合溶 媒中、 50°C付近で遮光下に 1日反応させ、次いで NaCNBHをカ卩えた後、さらに 50°C
3
付近で遮光下に 1日反応させる。
反応終了後、溶媒を留去し、さらにゲル濾過などにより精製して目的のポリアミンィ匕 合物 (13)、（14)および (15)の成分である (6A)、（7A)および (8A)を製造することがで きる。
ゲル濾過におけるポリアミンィ匕合物の溶出は、 254nmおよび 360nmの吸光度を測定 することで確認すればょ 、。
なお、製造法 B3においては、表記上、全てアミノ基に置換フエニル基が付加されて いるが、実際の本発明のポリアミンィ匕合物は、ポリアミンの一部のアミノ基は、フリーの アミノ基 (置換フ ニル基が付加して 、な 、ァミノ基）として存在する。
また、ポリアミンィ匕合物 (13)、（14)および (15)は、それぞれ (6A)、（7A)および (8A) とポリアルキレンィミン、ポリアルキルァミンおよびポリアミノ酸の複数の繰り返し単位 からなる共重合体であり、各ポリアミンィ匕合物における各繰り返し単位は、ランダムに 配列する。
[ポリアミンシートの製造方法]
本発明は、ポリアミンィ匕合物 (10)、（11)、（12)、（13)、（14)または (15)を含む溶液を 基板表面に塗布し、次いで紫外線照射してポリアミン化合物を基板表面上に結合さ せることを含む。
ァミンシートは、例えば、以下のスキームで作成することができる。なお、表記上、全 てァミノ基に置換フエ-ル基が付加されているが、実際の本発明のポリアミンィ匕合物 は、ポリアミンの一部のアミノ基は、フリーのアミノ基 (置換フエ-ル基が付カ卩していな ぃァミノ基）として存在する。 [0050] [化 24]
Figure imgf000022_0001
アミンシ—
[0051] ポリアミンィ匕合物を含む塗布液は、以下のように調製することができる。
塗布液に使用する溶媒としては、通常、水を使用すればよいが、光反応ポリアミン の溶解性などの物性により水以外の溶媒、例えば、各種緩衝液ゃジメチルホルムアミ ドなどを単独または混合して使用することができる。
ポリアミンィ匕合物と溶媒との混合比は、ポリアミン化合物が溶解される量であれば、 特に限定されないが、例えば、ポリアミンィ匕合物（12)の場合、 lmLの溶媒に 0.01〜10 mgを溶力して用いることができる。他のポリアミン化合物の場合もほぼ同様の条件で 混合することができる。
[0052] 上記塗布液は、基板表面に塗布する。基板は、その少なくとも表面が榭脂製である ことが好ましい。上記のスキームに示すように、榭脂基板は、表面にメチル基を有し、 このメチル基とポリアミン化合物のジアジリン基とが、紫外線照射により反応する。
[0053] 光反応基であるジアジリンは光照射により、極めて反応性の高い活性種であるカル ベンが生じ、容易にアルキル鎖などの化学結合間に挿入して新たな結合を作る。従 つて、基本的には一般的な榭脂基板に固定ィ匕が可能であるが、上記反応スキームに 示すように、表面にメチル基などを有する榭脂を用いる場合に反応性が高い。このよ うな榭脂基板としては、ポリプロピレン、メタタリレートなど多様なものが挙げられる。
[0054] 榭脂基板の表面にポリアミン化合物を反応させるために紫外線照射する。紫外線照 射についてはジアジリンの光吸収帯である 350nm付近の光が必要であり、この光は、 例えば、 100Wブラックライトランプを用いることで得ることができる。
具体的なポリアミンシートの作成手順は、例えば、 1.0mg/mLのポリアミンィ匕合物の水 溶液の適当量をポリプロピレンシートにスポッティングし乾燥させる。次いで、 100Wブ ラックライトランプを 30分間照射した後、イオン交換水、 1M塩酸、超純水の順で洗浄 すればよい。
[0055] 本発明にお 、て、ポリマーを光反応性であるジアジリンで修飾した光反応性ポリマー を合成し、それを固相上に載せて光をあてることで、固相の任意の場所にポリマーを 共有結合させる。
本発明の反応性のポリアミンは、ポリプロピレンの光反応で焼付けでき、新しいタイ プのァミンシートを作成することができる。
発明の効果
[0056] (1)本発明のポリアミンシートは、ポリアミンが任意の場所にピンポイントで、し力も共 有結合により固定化されているため非特異的吸着など夾雑物を徹底的な洗浄などに より除くことが可能である。また、反応は、 DNAやタンパク質など通常の生体分子に はほとんど吸収されない 360nm付近の光で効率よく起こり、しかも極めて早い反応の ため、用いる解析系に与える影響が少ない。
(2)本発明のポリアミンシートは、スポッティング前に基板の榭脂に特別な処理をする 必要が全くなぐ簡便かつ迅速で低コストに DNAチップなどを作製することができる。
(3)本発明のポリアミンシートは、固定されたポリアミンが 3次元的で柔軟な構造をとる ことで、その後の生体物質の反応系においてより液相中の環境に近くなり、し力も単 位面積あたりの物質の固定ィ匕量の向上を図ることができる。
(4)本発明のポリアミンシートは、 DNAを基板上に静電気的に固定する場合、オリゴ マーや DNAの結合および除去を pHの調整により容易に行うことができる。
図面の簡単な説明
[0057] [図 1]実施例 2のゲル濾過の溶出パターンを示す。
[図 2]実施例 3のゲル濾過の溶出パターンを示す。
[図 3]実施例 4のゲル濾過の溶出パターンを示す。 [図 4]実施例 5のゲル濾過の溶出パターンを示す。
[図 5]実施例 6のゲル濾過の溶出パターンを示す。
[図 6]実施例 7のゲル濾過の溶出パターンを示す。
[図 7]実施例 8のゲル濾過の溶出パターンを示す。
[図 8]タンパク質のポリアミンシートへの固定の概念図。
発明を実施するための最良の形態
[0058] 実施例
以下、本発明を実施例および試験例で説明するが、本発明はこれらに限定される ものではない。
なお、以下の反応式において、ポリアミン化合物は、便宜上、全てアミノ基に置換フ ェニル基が付加されている力 実際の本発明のポリアミンィ匕合物は、ポリアミンの一部 のァミノ基は、置換フエニル基が付カ卩して ヽな 、ァミノ基として存在する。
[0059] 実施例 1 1
3-(4-ォキシラユルフェ-ル) -3-トリフルォロメチル -3H-ジアジリン (2)の合成
[3- (4- Oxiranylphenyl)- 3- trifluorometnyト JH- diazirine]
[化 25]
Figure imgf000024_0001
トリメチルスルホ -ゥムョージド 0.95g、水酸化カリウム 0.52gをァセトニトリル 4mLに 溶かし、窒素ガス雰囲気下、 60°Cで 10分攪拌した。 4-(3-トリフルォロメチル -3H-ジァ ジリン- 3-ィル)ベンズアルデヒド l.OOgを 5.3mLのァセトニトリルとともに加え、水 0.02gを 加えた。そのまま 1時間 60°C、窒素ガス雰囲気下で攪拌した。ェチルエーテルで抽出 した後、水で 2回飽和食塩水溶液で 1回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、 濾過した。溶媒を減圧留去し、シリカゲルクロマトグラフィー（へキサン:クロ口ホルム = -^θ) (ε)ベ ^ べ ^エ r ^
zrnm^ K900]
•(ZH 0·9 '9 =1" 'Ηΐ 'ΡΡ) WZ '(ΖΗ
0·9 '8·ε=ί" 'Ηΐ 'ΡΡ) VZ '(HS Ζ8·ε '(ΖΗ 8·ε '9 =1" Ήΐ 'ΡΡ) 9Vf '(HI Ζ9'9 '(ζ
Η ΐ·8=ί" 'Ηΐ 'Ρ) 6Ζ"9 '(ΖΗ ΐ·8=ί" 'Ηΐ 'Ρ) LVL 9 :(0oS2
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Cl0ST0/S00Zdf/X3d 9ΪΪ6Ϊ0/900Ζ OAV [化 27]
Figure imgf000026_0001
[0064] 3-(4-ォキシラユルフェ-ル) -3-トリフルォロメチル -3H-ジアジリン 20mg、ポリエチレ ンィミン [平均分子量 10,000、式中 nは約 78]11.2mg、水 2mLおよびジメチルホルムアミ ド 2mLを褐色ビンに入れ、 50°Cの油浴で一夜攪拌した。溶媒を完全に減圧留去し、 水を 4mL加えた。その溶液を lmLずつカラムでゲル濾過 * (溶媒;水）し、精製した。ジ アジリンの吸光度を 360nm、 254nmでモニターし、光反応性ポリアミンのフラクションを 回収し、それを凍結乾燥した。反応の進行は薄層クロマトグラフィーで確認した。 * 使用カラム； (ゲル部分）内径 0.75cm、高さ 18cm、体積 31.8cm3
使用ゲル；セフアデックス（Sephadex) G15
フラクション;約 0.7mLずつ試験管にとった
溶出パターンを図 1に示す。
[0065] 実施例 3
光反応性ポリアリルアミン (4)の合成
[化 28]
Figure imgf000027_0001
[0066] 3-(4-ォキシラユルフェ-ル) -3-トリフルォロメチル -3H-ジアジリン 20mg、ポリアリル ァミン'塩酸塩 [平均分子量 15,000、式中 nは約 156]8.2mg、ジイソプロピルェチルアミ ン 22.6mg、水 2mLおよびジメチルホルムアミド 2mLを褐色ビンに入れ、 50°Cの油浴で 一夜攪拌した。溶媒を完全に減圧留去し、水 4mLを加えた。その溶液を lmLずつカラ ムでゲル濾過 * (溶媒;水）し、精製した。ジアジリンの吸光度を 360nm、 254nmでモ- ターし、光反応性ポリアミンのフラクションを回収し、それを凍結乾燥した。反応の進 行は薄層クロマトグラフィーで確認した。
* 使用カラム； (ゲル部分）内径 0.75cm、高さ 18cm、体積 31.8cm3
使用ゲル；セフアデックス G15
フラクション;約 0.7mLずつ試験管にとった。
溶出パターンを図 2に示す。
[0067] 実施例 4
光反応性ポリ- L-リジン (6)の合成
[化 29]
Figure imgf000028_0001
[0068] 3- (4-ォキシラユルフェ-ル)- 3-トリフルォロメチル- 3H-ジアジリン 40mg、ポリ- L-リジ ン '臭素水素酸塩 [平均分子量 5,000〜15,000、式中 nは約 24-72]36.6mg、ジイソプロ ピルェチルァミン 45.3mg、水 4mLおよびジメチルホルムアミド 4mLを褐色ビンに入れ、 50°Cの油浴で一夜攪拌した。溶媒を完全に減圧留去し、水 8mLを加えた。その溶液 を 2mLずつカラムでゲル濾過 * (溶媒;水）し、精製した。ジアジリンの吸光度を 360nm 、 254nmでモニターし、光反応性ポリアミンのフラクションを回収し、それを凍結乾燥し た。反応の進行は薄層クロマトグラフィーで確認した。また、光反応性ポリ- L-リジンの 元素分析を行った（表 1)。
* 使用カラム； (ゲル部分）内径 0.75cm、高さ 36cm、体積 63.6cm3
使用ゲル；セフアデックス G15
フラクション;約 lmlずつ試験管にとった。
溶出パターンを図 3に示す。
[0069] [表 1] *RJS性ポリアミンの &有率
Figure imgf000029_0002
* 1 ジァジリンによる修飾率を娜としたとき： （L-リジン) s · (フエュルジアジリン) a · BO HBrとし ての删直
*ポリアミン *2の元素含有率
Figure imgf000029_0003
*2 上記 ¾5¾性ポリアミン合成、精概ィ牛と同じ餅で ffつたもの，ただし、ジアジリン化^ * (2) ii¾Pえな 、。
*3 (L-リジン) · 50 HBr · 22 ¾0としての理^！:
[0070] 吸光度
•光反応性ポリアミン 1.20mg/水 l.OmLを 10倍希釈したものの吸光度； 0.0806
'ジアジリン-エポキシドの εの値； 151
(波長； 356nm) (溶媒;水:メタノール =4: 1)
上記の 2つの値と式 Α= ε より
ジアジリンによるポリアミンの修飾率； 4.44 Χ 10— 3mol/1.00mg
[0071] 実施例 5
光反応性ポリエチレンィミン (7)の合成
[化 30]
Figure imgf000029_0001
3- (4- (ブロモメチル)フエ-ル)- 3-トリフルォロメチル- 3H-ジアジリン 20mg、ポリエチレ ンィミン 9.2mg、水 2mLおよびジメチルホルムアミド 2mLを褐色ビンに入れ、 50°Cの油 浴で一夜攪拌した。溶媒を完全に減圧留去し、水 4mLを加えた。その溶液を lmLず つカラムでゲル濾過 * (溶媒;水）し、精製した。ジアジリンの吸光度を 360nm、 254nm でモニターし、光反応性ポリアミンのフラクションを回収し、それを凍結乾燥した。反 応の進行は薄層クロマトグラフィーで確認した。
* 使用カラム； (ゲル部分）内径 0.75cm、高さ 18cm、体積 31.8cm3
使用ゲル；セフアデックス G15
フラクション;約 0.7mlずつ試験管にとった。
溶出パターンを図 4に示す。
[0073] 実施例 6
光反応性ポリアリルアミン (8)の合成
[化 31]
Figure imgf000030_0001
[0074] 3- (4- (ブロモメチル)フエ-ル)- 3-トリフルォロメチル- 3H-ジアジリン 20mg、ポリアリル アミン'塩酸塩 6.6mg、水 2mLおよびジメチルホルムアミド 2mLを褐色ビンに入れ、 50 °Cの油浴で一夜攪拌した。溶媒を完全に減圧留去し、水 4mLを加えた。その溶液を 1 mLずつカラムでゲル濾過 * (溶媒;水）し、精製した。ジアジリンの吸光度を 360應、 25 4nmでモニターし、光反応性ポリアミンのフラクションを回収し、それを凍結乾燥した。 反応の進行は薄層クロマトグラフィーで確認した。
*使用カラム； (ゲル部分）内径 0.75cm、高さ 18cm、体積 31.8cm3
使用ゲル；セフアデックス G15
フラクション;約 0.7mlずつ試験管にとった。 溶出パターンを図 5に示す。
実施例 7
光反応性ポリ- L-リジン (9)の合成
[化 32]
Figure imgf000031_0001
[0076] 3- (4- (ブロモメチル)フエ-ル)- 3-トリフルォロメチル- 3H-ジアジリン 20mg、ポリ- L-リ ジン.臭素水素酸塩 15.1mg、水 2mLおよびジメチルホルムアミド 2mLを褐色ビンに入 れ、 50°Cの油浴で一夜攪拌した。溶媒を完全に減圧留去し、水 4mLを加えた。その 溶液を lmLずつカラムでゲル濾過 * (溶媒;水）し、精製した。ジアジリンの吸光度を 36 0nm、 254nmでモニターし、光反応性ポリアミンのフラクションを回収し、それを凍結乾 燥した。反応の進行は薄層クロマトグラフィーで確認した。
*使用カラム； (ゲル部分）内径 0.75cm、高さ 18cm、体積 31.8cm3
使用ゲル；セフアデックス G15
フラクション;約 0.7mlずつ試験管にとった。
溶出パターンを図 6に示す。
[0077] 実施例 8
光反応性ポリエチレンィミン (7)の合成
[化 33]
Figure imgf000032_0001
[0078] ポリエチレンィミン 17mg、酢酸 700 μ Lおよび水 100 μ Lを褐色ビンに入れ、ビンを振 りポリエチレンイミンを溶解させた。ついで、 4-[3-トリフルォロメチル -3H-ジアジリン- 3 -ィル]ベンズアルデヒド 28mgおよびメタノール 800 μ Lを加え、 50°Cの油浴で 24時間 攪拌した後、溶媒を減圧留去した。窒素ガス雰囲気下で、シァノ水素化ホウ素ナトリ ゥムをスパチュラ一約 1杯分およびメタノール 1.6mLをカ卩え、 50°Cの油浴で 24時間攪 拌した。溶媒を完全に減圧留去し、水 lmLを加えた。その溶液をカラムでゲル濾過 * ( 溶媒;水）し精製した。ジアジリンの吸光度を 360nmおよび 254nmでモニターし、光反 応性ポリアミンのフラクションを回収し、それを凍結乾燥した。反応の進行は薄層クロ マトグラフィ一で確認した。
* 使用カラム； (ゲル部分）内径 0.75cm、高さ 18cm、体積 31.8cm3
使用ゲル；セフアデックス G15
フラクション;約 lmLずつ試験管にとった。
溶出パターンを図 7に示す。
[0079] 実施例 9
ァミンシートの作製
[化 34]
Figure imgf000033_0001
[0080] 化合物 (3)を水に溶かしたもの 10 Lをポリプロピレンのシート（厚さ： 0.2cm、横： 3.5c m、縦: 3.0cm)にのせ、ドラフト内で乾燥させた。次いで紫外線ランプを用い、シートの 上下から 4cmの間隔で 30分間、紫外線照射した。シートをイオン交換水で激しく洗浄 、 1M塩酸で洗い流し、超純水 (MilK-Q装置，ミリポア社製)で洗い流して、本発明の ポリアミンシートを得た。ニンヒドリン反応によってシート上にポリアミンが固定されたこ とを確認した。
[0081] 試験例 1
タンパク質のポリアミンシートへの固定 (概念図を図 8に示す）
DIA—ポリエチレンィミンの 1%(W/V)水溶液 5 μ L、西洋ヮサビパーォキシダーゼ（HR P)の 1%(W/V)水溶液 5 /z Lの混合液を、ポリプロピレンシート状にスポッティングし減 圧下 20分間乾燥した。次いで、紫外線を照射 (360nm,15WX 2で 60分)した後、緩衝 液中で 1分間超音波洗浄した。
ルミノール発光によって、シート上に固定ィ匕された HRPの活性を確認した。 産業上の利用可能性
[0082] 生理活性物質の有効な構造'機能解析法である光ァフィ二ティー法で汎用されて V、るジアジリン基をポリアミンに導入した光反応性高分子を製造した。ポリプロピレン など固相上にスポットし光照射を行うことによって共有結合によりポリアミンを固定ィ匕 できる。このリソグラフィ一により化学的に反応性が乏しい榭脂表面でも任意の場所 に官能基構築を可能とする。

Claims

請求の範囲 [1] 次の一般式 (I)
[化 1]
Figure imgf000034_0001
(式中、 R1は、水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいァ ルケニル基、アルコキシ基、ホルミル基、カルボキシル基または-トロ基を; R2は、水 素原子、ハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいアルキル基を、それぞ れ示す)で表される化合物。
[2] 次の一般式：
[化 2]
Figure imgf000034_0002
(式中、 Rlaは、水素原子またはメトキシ基を示す)で表される請求項 1に記載の化合 物。
[3] アミノ基又はイミノ基の少なくとも一部が次の一般式 (Π)：
[化 3]
Figure imgf000034_0003
(式中、 R1は、水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいァ ルケニル基、アルコキシ基、ホルミル基、カルボキシル基または-トロ基を; R2は、水 素原子、ハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいアルキル基を、それぞ れ示す）
で表される基で置換され、平均分子量が 2,000〜150,000の範囲にあるポリアミン化合 物。
下記式（3) :
[化 4]
Figure imgf000035_0001
で表される繰返し単位と、下記式 (Α)：
[化 5]
Figure imgf000035_0002
で表される繰返し単位を含み、平均分子量が 2,000〜100,000の範囲にある請求項 3 に記載のポリアミンィ匕合物。
[5] 式（3)で表される繰返し単位と式 (Α)で表される繰返し単位のモル比力 1:50〜1:2 の範囲である請求項 4記載のポリアミンィ匕合物。
[6] 下記式 (4) :
[化 6]
Figure imgf000036_0001
で表される繰返し単位と下記式 (B)及び Z又は (B ' )
[化 7]
Figure imgf000036_0002
で表される繰返単位を含み、平均分子量が 2,500〜150,000の範囲である請求項 3に 記載のポリアミン化合物。
[7] 式 (4)で表される繰返し単位と式 (B)及び (Β' )で表される繰返単位のモル比力 1:
50〜1:2の範囲である請求項 6記載のポリアミン化合物。
[8] 次の式 (6) :
[化 8]
Figure imgf000037_0001
Figure imgf000037_0002
(C) (C )
で表される繰返し単位を含み、平均分子量が 2,000〜150,000の範囲である請求項 3 に記載のポリアミンィ匕合物。
[9] 式 (6)で表される繰り返し単位と式 (C)及び (C ' )で表される繰返し単位が 1 :50〜 1：
2の範囲である請求項 8記載のポリアミンィ匕合物。
[10] アミノ基又はイミノ基の少なくとも一部が次の一般式 (ΠΙ)：
[化 10]
Figure imgf000037_0003
(式中、 R1は、水素原子、置換されていてもよいアルキル、ァルケ-ルもしくはアルコ キシ基、ホルミル基、カルボキシル基または-トロ基を; R2は、水素原子、ハロゲン原 子、ハロゲン原子で置換されていてもよいアルキル基を、それぞれ示す）で表される 基で置換され、平均分子量が 2,000〜150,000の範囲にあるポリアミン化合物。
下記式 (7) :
[化 11]
Figure imgf000038_0001
で表される繰返し単位と式 (A)：
[化 12]
Figure imgf000038_0002
で表される繰返し単位を含み、平均分子量が 2,000〜100,000の範囲である請求項 1
0に記載のポリアミンィ匕合物。
[12] 式（7)で表される繰返し単位と式 (A)で表される繰返し単位のモル比力 1:50〜1:2 の範囲である請求項 11記載のポリアミンィ匕合物。
[13] 下記式（8) :
[化 13]
Figure imgf000039_0001
で表される繰返し単位と式 (B)及び Z又は (Β' )：
[化 14]
Figure imgf000039_0002
で表される繰返し単位を含み、平均分子量が 2,000〜150,000の範囲である請求項 1 0に記載のポリアミンィ匕合物。
式 (8)で表される繰返し単位と式 (Β)及び (Β' )で表される繰返し単位のモル比が、 1:50〜1:2の範囲である請求項 13に記載のポリアミン化合物。
下記式（9) :
[化 15]
Figure imgf000039_0003
ΝΗ で表される繰り返し単位と式 (c)及び Z又は（C )
[化 16]
Figure imgf000040_0001
(C) (c'》
で表される繰返し単位を含み、平均分子量が 2,000〜150,000の範囲である請求項 1
0に記載のポリアミンィ匕合物。
[16] 式（9)で表される繰返し単位と式 (C)および (C' )で表される繰返し単位のモル比 が、 1 :50〜 1 :2の範囲である請求項 15に記載のポリアミン化合物。
[17] 請求項 3から 16のいずれか一項に記載のポリアミン化合物を含む溶液を基板表面 に塗布し、次いで紫外線を照射してポリアミンィ匕合物を基板上に結合させることを特 徴とするポリアミンシートの製造方法。
[18] 基板表面が榭脂性である請求項 17に記載の製造方法。
[19] 請求項 17または 18に記載の製造方法により製造されたポリアミンシート。
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