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WO2005085841A1 - Procede et dispositif de controle du positionnement d'un element biologique sur un support - Google Patents

Procede et dispositif de controle du positionnement d'un element biologique sur un support Download PDF

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Publication number
WO2005085841A1
WO2005085841A1 PCT/FR2005/050118 FR2005050118W WO2005085841A1 WO 2005085841 A1 WO2005085841 A1 WO 2005085841A1 FR 2005050118 W FR2005050118 W FR 2005050118W WO 2005085841 A1 WO2005085841 A1 WO 2005085841A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
light radiation
support
layer
biological element
trapping
Prior art date
Application number
PCT/FR2005/050118
Other languages
English (en)
Inventor
Nathalie Picollet-D'hahan
Patrick Chaton
Stéphane Getin
Original Assignee
Commissariat A L'energie Atomique
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat A L'energie Atomique filed Critical Commissariat A L'energie Atomique
Priority to EP05728107A priority Critical patent/EP1759200A1/fr
Priority to US10/590,496 priority patent/US7521255B2/en
Publication of WO2005085841A1 publication Critical patent/WO2005085841A1/fr

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48728—Investigating individual cells, e.g. by patch clamp, voltage clamp

Definitions

  • the invention relates to a method making it possible to control directly and in real time the positioning of a biological element on an area of a support on which it is intended to be positioned. It also relates to a device making it possible to apply this method to the positioning of one or more biological elements on one or more zones of a support.
  • biological element means any natural or artificial element at least part of which is made up of a biological membrane or reproduces the functional characteristics of a biological membrane.
  • the cell may be a cell or a cell organelle of the vacuole type, golgi apparatus, mitochondria, endoplasmic reticulum, lysosome, etc., of a fragment of biological membrane, with or without cytosolic parts , an artificial lipid bilayer such as a phosphatidylcholine or phosphatidylglycerol film, provided with one or more protein pores, or even a biomimetic membrane.
  • the method and the device according to the invention make it possible, in particular, to verify the establishment of a high resistance seal between a biological element and an area of a support by the patch-clamp technique. They are therefore likely to constitute tools of choice in all areas where the patch-clamp technique is itself capable of being used.
  • Examples of applications of this technique include: - pharmaceutical research, in particular for the study of the mechanisms responsible at the cellular level for pathologies linked to dysfunction of ion channels; identifying the sites and modes of action of drugs known to be effective in the treatment of these pathologies; the medium or high throughput screening of molecules having targets for ion channels and which may therefore be of therapeutic interest, or of candidate drugs whose effects and / or toxicity are to be evaluated; the development of antidotes against poisons or venoms; - the medical field, in particular for the diagnosis of pathologies linked to a dysfunction of the ion channels; - industry, in particular agrifood, pharmaceutical and cosmetic, in particular for the sanitary control of the manufacturing chains and the products which result from it; - the environment, in particular for the detection of pollutants; - fundamental research, for example for the study of mechano-sensitive ion channels with a view to the development of "mechanical"sensors; the detection of living cells or cells which have retained their membrane integrity, or, on the contrary, dead cells or cells
  • These devices generally comprise a flat, microstructured substrate, that is to say provided with micrometric wells, on which the cells are deposited, as well as one or more channels making it possible, by actuation of a pump, to create a suction at the base of these wells and thereby achieve a gigaseal between the substrate and a fragment of the plasma membrane of these cells.
  • micrometric wells on which the cells are deposited, as well as one or more channels making it possible, by actuation of a pump, to create a suction at the base of these wells and thereby achieve a gigaseal between the substrate and a fragment of the plasma membrane of these cells.
  • the reliability of the results obtained depends mainly on the success of the gigaseal, that -conditioning, in fact, the stability of the connection between the support and the cell membrane, the electrical isolation of the membrane fragment, the correct application of an electrical potential to this fragment and the validity of the measurement of the resulting electric current.
  • the gigaseal is relatively difficult to obtain: thus, the success rate is around 40 to 50% in conventional patch-clamp, and around 20% for biochips.
  • the monitoring and control of the establishment of a gigaseal is done by electrical resistance measurements since the invagination of a fragment of cell membrane in the end of a micropipette or at the base of a microwell, then the sealing of this fragment on this end or this base has the effect of creating a resistance to the passage of an electric current.
  • These measures have the major drawback of not allowing direct control of the establishment of the gigaseal because they require applying successive voltage wells and calculating the variations in resistance, knowing that the increase in resistance can be rapid. or slow, according to the all-or-nothing law or be very progressive.
  • a method of controlling the positioning of a biological element on a zone of a support in which, this biological element being marked by a tracer emitting a light radiation and the area of the support on which it is to be positioned being located in a layer of a material capable of trapping this light radiation: a) the biological element is allowed to position itself on the area of the support; b) the intensity of the light radiation trapped in said layer is measured; and c) determining the positioning of the biological element by comparing the intensity value thus measured with at least one reference value; steps a), b) and c) can be carried out successively or simultaneously.
  • the method according to the invention consists in an optical control of the positioning of the biological element with respect to the area of the support on which it is intended to be positioned, and in particular in monitoring this positioning over time.
  • This optical control is based on the property that a radiation emitted by a light source has to behave differently in a layer of a material more refractive than the medium in which it is emitted according to the distance which separates said light source from the surface of this layer. Indeed, as shown experimentally by M. Lieberherr et al. in Surface Science, vol. 189/190, 954-959, 1987 [3], and illustrated in FIG.
  • the biological element is preferably marked with a fluorescent tracer although other types of tracers can be used as bioluminescent or chemiluminescent tracers as long as they can be fixed on or expressed at the surface of a biological element.
  • This fluorescent tracer can come in a variety of forms.
  • it may especially be an organic fluorophore of the fluorescein type and its derivatives (fluorescein isothiocyanate for example), Oregon green, rhodamine and its derivatives (tetramethylrhodamine isothiocyanate for example), Texas red, Bodipy, cyanine and its derivatives (Cy 3.5 for example), which are chemically coupled to one or more membrane proteins of the biological element.
  • the biological element can also be labeled with a mineral fluorescent tracer such as a "quantum dot", as described by B.
  • the area of the support on which the biological element is to be positioned is situated in a layer of a material capable of trapping the light radiation emitted by the biological element, more simply referred to below as "the layer”.
  • the term "material capable of trapping the light radiation emitted by the biological element” means any material having the dual property of being transparent to the type of light radiation emitted by the biological element so to allow its propagation, and to present a refractive index greater than the refractive index of the media located on either side of the propagation medium at the time when it is desired to position the biological element on the zone of the support , and in particular the environment in which the biological element is found. It is desirable that this material is, moreover, biocompatible and that it does not itself emit light radiation, in any case of the same wavelength as the light radiation emitted by the biological element so as not to interfere with it.
  • the material forming the layer may be an organic or inorganic glass, in particular glass, silica, silicon nitride (Si 3 N 4 ), titanium dioxide (Ti0 2 ), hafnium dioxide (Hf0 2 ), alumina (AI2O3), silica charged with potassium or silver ions, for example by ion exchange, or one of the very many synthetic polymers offered on the market which exhibit high percentages of visible light transmission (in practice, around 90% or higher) combined with refractive indices of 1.5 or higher.
  • step a) of the process can consist in letting this biological element settle on the support area, for example by simple sedimentation, or, on the contrary, in acting on this element so as to facilitate , accelerate or optimize its positioning, for example by applying a pressure field, an electric field, or the like.
  • step b) the measurement of the intensity of the light radiation trapped in the layer implies that this radiation is previously extracted from this layer, that is to say that it is brought out of this layer after s '' be propagated there by internal reflection.
  • this extraction can be carried out by means which the support comprises permanently or with which the latter is provisionally provided before measuring the intensity of the trapped light radiation, or even before allowing the biological element of position in the case where steps a) and b) are not carried out simultaneously.
  • the method according to the invention comprise, prior to step a) or between steps a) and b), a step consisting in providing the support with means for extracting the light radiation trapped in the layer.
  • the measurement of the light radiation trapped in the layer can be optimized by the presence of means suitable for collecting the light radiation extracted from this layer before its intensity is measured, of the lens (s) type. ) convergent (s), mirror (s), possibly associated with one or more lenses, matrix of microlenses and / or micromirrors, or the like.
  • the method according to the invention also comprise, prior to step a) or between steps a) and b), a step consisting in placing, opposite the layer, means for collecting the light radiation extract of this layer if such means are not initially present.
  • Step b) of the method can be carried out by any system making it possible to detect and quantify light radiation such as, for example, a point sensor of the photomultiplier or photodiode tube type, or an image sensor such as a video tube, a camera CCD, CMOS camera or photodiode camera.
  • step c) it can notably consist in comparing the intensity value measured with a standard curve expressing the variation of the light intensity trapped in the layer as a function of the position of the biological element relative to the area of the support on which it must be positioned, previously established under identical experimental conditions.
  • the positioning of the biological element on the area of the support preferably comprises the sealing of this element on this area.
  • step a) of the method according to the invention preferably comprises the creation of a depression in this opening suitable for allowing the biological element to partially penetrate there and to seal on its edges.
  • steps a), b) and c) are preferably carried out simultaneously so as to control the quality of the seal as it is established.
  • the biological element can be any natural or artificial element at least part of which consists of a biological membrane or reproduces the functional characteristics of a biological membrane, such as a cell or a cell organelle of the vacuole type, device golgi, mitochondria, reticulum endoplasmic, lysosome, ..., a fragment of biological membrane, with or without cytosolic parts, an artificial lipid bilayer such as a phosphatidylcholine or phosphatidylglycerol film, with one or more protein pores, or even a biomimetic membrane .
  • the biological element is a cell.
  • the subject of the invention is also a device for controlling the positioning of at least one biological element on at least one area of a support, which comprises: - a support comprising a layer of a material capable of trapping expected light radiation to be emitted by said biological element, and means for extracting the light radiation trapped in this layer, said area of the support being located in said layer; and - means for measuring the intensity of the light radiation extracted from said layer.
  • the support is a tube open at its two ends and the area on which the biological element is to be positioned is one of the two openings of this tube.
  • the support is preferably a micropipette, and in particular a micropipette suitable for implementing the patch-clamp technique.
  • the support is a planar support, that is to say of generally planar shape, and the area on which the biological element to be positioned is an opening that this support comprises, which can consist of a depression, more or less pronounced, hollowed out in one of the faces of the support or be a through opening, that is to say s extending from one side to the other of the support.
  • the support is preferably a support suitable for implementing the patch-clamp technique.
  • the layer of material capable of trapping light radiation can in particular be made of organic or mineral glass, silica, silicon nitride, titanium dioxide, hafnium dioxide, alumina, silica charged with potassium or silver ions, or a synthetic polymer.
  • This layer may, moreover, extend over the entire thickness of the support or, on the contrary, constitute only a part thereof, provided that the other material or materials constituting the support which are located in contact with it have a refractive index lower than that of the material which forms it. In any event, it has a thickness of at least 200 nm.
  • the means for extracting the light radiation trapped in the layer include any configuration of the support or any element associated with this support which makes it possible to stop the propagation of the light radiation in this layer and to bring it out .
  • these extraction means may in particular consist of a relief or a recess or a series of reliefs and recesses formed in one of the faces of the layer, or in a part which is arranged on one of the faces of the layer and which forms on this face a relief or a series of reliefs and hollows, this part being able to be removable or integral with said layer.
  • the device according to the invention further comprises means for collecting the light radiation extracted from the layer, of the converging lens (s), mirror (s) type, possibly associated with one or more lenses. , matrix of microlenses and / or micromirrors, or the like.
  • the measurement means can comprise any system making it possible to detect and quantify light radiation such as, for example, a photomultiplier tube, a photodiode, video tube, CCD camera, CMOS camera or photodiode camera.
  • the device according to the invention may also comprise means for exciting one or more fluorophores in the case where the light radiation intended to be emitted by the biological element is fluorescent radiation.
  • the support is a planar support which comprises a plurality of zones for the positioning of a plurality of biological elements, in which case: - the layer of material capable of trapping the light radiation is divided into as many parts as the support includes areas; - each area of the support is located in one of these parts; - These parts are separated from each other by means suitable for preventing light radiation from propagating from one part to another; and - for each part of said layer, the support comprises means for extracting the light radiation trapped in this part, while the device comprises means for collecting the light radiation extracted from this part and means for measuring the intensity of the radiation light collected by said collection means.
  • the layer capable of trapping light radiation is preferably supported by a layer of a material opaque to this light radiation and the parts of the layer capable of trapping light radiation are separated from each other by projections of the layer opaque to light radiation which extend in the thickness of the layer capable of trapping light radiation.
  • the device according to the invention is capable of being integrated into a more complex analysis system, in particular into a system making it possible to jointly measure the electrical activity of one or more biological elements.
  • - electrodes connected to an electrical supply and measurement circuit of an electrical quantity and suitable for allowing the application to biological elements of an electrical voltage and the recording of variations in this voltage following a change of state (opening or closing) of the ion channels of these biological elements;
  • - capillaries possibly connected to a liquid distribution system and / or to a liquid suction system and capable of allowing the addition of substances to the positioning zones of the biological elements or, on the contrary, the elimination such substances, or the change in composition of the study media (purge).
  • the subject of the invention is also the application of a method as previously defined, or of a device as previously defined, to control the establishment of a seal of high resistance between at least one biological element and at least one area of a support by the patch clamp technique.
  • Figure 1 illustrates the behavior of the rays emitted by a light source such as a fluorophore, when this source is sufficiently close to the surface of a layer of a material more refractive than the medium in which it is located.
  • Figure 2 is a schematic sectional representation of a first embodiment of a device according to the invention designed to allow a control of the sealing of a biological element on the end of a micropipette by the conventional technique of the patch -clamp.
  • Figures 3 to 6 are partial schematic representations in section of the micropipette shown in Figure 2 which illustrate five alternative embodiments of the means for extracting light radiation that this micropipette comprises.
  • Figure 7 is a schematic perspective representation of a second mode of realization of a device according to the invention designed to allow simultaneous control of the sealing of several biological elements on openings of a flat support by the patch-clamp technique.
  • Figure 8A is a partial schematic representation of the device shown in Figure 7, seen in section along the line VIII-VIII.
  • Figures 8B to 8D are partial schematic representations of the device shown in Figure 7, seen in section along the line VIII-VIII, which illustrate three alternative embodiments of the means for extracting a light radiation that the support of this device.
  • FIGS. 2 to 8D the identical elements have been given the same references.
  • FIG. 2 schematically shows in section a first embodiment of a device 10 according to the invention which is designed to allow the sealing of a seal to be checked.
  • biological element by the conventional patch-clamp technique, that is to say by means of a micropipette.
  • the support comprising an area on which the biological element must be positioned is a micropipette, referenced 11 in FIG. 2.
  • the micropipette 11 is in the form a rigid tube, open at its two ends, which is limited by a wall 13 of thickness substantially constant, and one of the two terminal parts of which becomes narrower.
  • the zone on which the biological element must be positioned is constituted by the end of the micropipette which has the smallest section, namely the end referenced 12 in FIG. 2.
  • This end represents, under conditions of use, the lower end of the micropipette 11. It will therefore be called, in what follows, lower end, while the end 20, which is opposite it, will be called upper end.
  • the wall 13 of the micropipette 11 can be made of glass, in which case this wall is capable of trapping any radiation whose wavelength is in the visible light spectrum, and in particular the fluorescent radiation.
  • the micropipette 11 comprises, at its middle part, means making it possible to extract light radiation trapped in the wall 13 under conditions of use.
  • these extraction means consist of a series of four annular grooves, respectively 14 ⁇ , 14 2 , 14 3 and 14 4 , separated by three ribs, which are of identical shape and dimensions to each other and which are formed in the external face 15 of the wall 13.
  • these grooves may have a depth of a few angstroms to a few microns and extend over the wall 13 over a total height of a few microns to a few millimeters.
  • the device 10 also includes means
  • these collecting means are constituted by a converging lens which is arranged opposite a portion of the outer face 15 of the wall 13 of the micropipette 11 in which the grooves 14 ⁇ are located at 14 4 , but it could just as easily be a mirror, a set of lenses and / or mirrors such as a matrix of microlenses and / or micromirrors.
  • the device 10 also includes means
  • the use of the device 10 for checking the sealing of a biological element on the end 12 of the micropipette 11 is extremely simple. As with a conventional micropipette, we begin by applying the lower end 12 of the micropipette 11 to a fragment of a biological element, for example a cell which will have been previously marked with a tracer emitting light radiation.
  • the micropipette 11 can have means for extracting light radiation other than those shown in FIG. 2.
  • FIGS. 3 to 6 illustrate five alternative embodiments of these extraction means.
  • these extraction means consist of a rough annular zone 24 situated in the external face 15 of the wall 13 of the micropipette 11.
  • the roughnesses forming this zone can have a depth and a periodicity (distance between two points or between two valleys) from a few angstroms to a few tens of microns.
  • the extraction means consist of a ring 34 which surrounds the external face 15 of the wall 13 of the micropipette 11 and which has on its own external face a rough annular zone 35 of the same type as that previously described for FIG. 3.
  • the extraction means consist of 4 rings, respectively 44 ⁇ , 44 2 , 44 3 and 44 4 , of identical shape and dimensions.
  • the extraction means consist of a single ring 54 which surrounds the external face 15 of the wall 13 of the micropipette 11 and which comprises a series of three annular grooves 54 ⁇ , 54 2 and 54 3 separated by ribs.
  • the rings 34, 44 ⁇ to 44 4 and 54 shown in Figures 4 to 6 may be integral with the wall 13 of the micropipette 11, in which case they may either be integral with this wall, or be attached and fixed on the latter.
  • FIG. 7 schematically represents in perspective a second embodiment of a device 30 according to the invention which is designed to allow the simultaneous control of the sealing of several biological elements on openings of a flat support. by the patch-clamp technique, as well as in FIG. 8A which schematically and partially represents this device, seen in section along line VIII-VIII.
  • the device 30 comprises a support 31 of generally quadrangular shape.
  • This support comprises a layer 32 which is divided here into four parts, respectively 32a, 32b, 32c and 32d, of identical shape and dimensions to each other, but which could just as easily be divided into a number of parts other than 4 , the device 30 representing only a non-limiting example of a device according to the invention.
  • These four parts are embedded in a substrate 33 which has a base 34 and six walls erected vertically on this base, respectively 35a, 35b, 35c, 35d, 35e and 35f, together delimiting four cavities arranged in a checkerboard pattern and each housing one of the parts 32a to 32d of the layer 32.
  • Each part 32a to 32d of the layer 32 is provided in its center with a through opening, respectively 36a, 36b, 36c and 36d, which communicates with an opening which is coaxial with it and which crosses the base 34 of the substrate 33.
  • the substrate 33 therefore also has four through openings - one of these openings being visible in FIG. 8 on which it is referenced 37a - which can be connected to capillaries (not shown in Figures 7 and 8A) which can themselves be connected to a liquid suction system of the micropump type.
  • the layer 32 is made of a material capable of trapping light radiation intended to be emitted by these elements, while the substrate 33 is itself made of a material opaque to this radiation.
  • the layer 32 can be a layer of glass, silica, Si 3 N 4 , Ti0 2 , d ⁇ l 2 0 3 , or a transparent polymer, while the substrate 33 can be made of a metal (Al, Au, Cu, Ag, ...), a semiconductor (Si, Ge, ...) or an opaque polymer.
  • Each part 32a to 32d of the layer 32 is, moreover, provided with means making it possible to extract the light radiation trapped in this part in condition of use.
  • these extraction means consist of rings, respectively 38a, 38b, 38c, 38d, which are arranged on the face upper parts 32a to 32d and which surround the openings 36a to 36d.
  • these rings which may be present temporarily, that is to say the time to perform the experiment, or permanent, may be made of a material in the form of a liquid, a gel or of a solid and which is deposited on the upper face of the parts 32a to 32d before or during the experiment, or of a part integral with the said parts 32a to 32d, this part possibly being either of a in one piece with these parts, either be attached and fixed on them.
  • the device 30 also comprises means for collecting the light radiation extracted by each of the rings 38a to 38d under conditions of use, respectively 39a, 39b, 39c and 39d, as well as means for measuring the radiation luminous thus collected, respectively 40a, 40b, 40c and 40d.
  • the use of the device 30 for the simultaneous control of the positioning and / or sealing of biological elements on the openings 36a to 36d is also extremely simple. After having deposited a biological element, for example a cell which will have been previously marked with a tracer emitting light radiation on or near each of the openings 36a to 36d, a depression is created in each opening of the substrate 33 , for example by suction using the capillaries previously mentioned, so as to bring a fragment of the biological elements to penetrate into the openings 36a to 36d and to obtain its sealing on these openings, as illustrated in FIG. 8A which shows a cell 21 thus sealed on the opening 36a of the layer 32.
  • a biological element for example a cell which will have been previously marked with a tracer emitting light radiation on or near each of the openings 36a to 36d
  • a depression is created in each opening of the substrate 33 , for example by suction using the capillaries previously mentioned, so as to bring a fragment of the biological elements to penetrate into the openings 36a to 36d and to
  • FIGS. 8B to 8D are partial schematic representations of the device shown in Figure 7, seen in section along the line VIII-VIII, which illustrate three alternative embodiments of the means for extracting light radiation. In the variant illustrated in the figure
  • the extraction means consist of a series of four grooves, respectively 48ai, 48a 2 , 48a 3 and 48a, separated by three ribs, which are of identical shape and dimensions to each other and which are formed in the upper face of the part 32a of the layer 32, all around of opening 36a.
  • these grooves and ribs can have a periodicity of a few hundred nanometers to a few microns.
  • the extraction means consist of a rough area 58 formed in the upper face of the part 32a of the layer 32, all around the opening 36a.
  • the roughnesses forming this zone which can be produced by chemical or mechanical treatment, can have a depth and a periodicity from a few angstroms to a few tens of microns.
  • the extraction means consist of the lateral faces of the walls 35a and 35f of the substrate 33, the inclination of which combined with the opacity of these walls are such as to direct the light radiation. trapped in the part 32a of the layer 32 towards the collection means 39a (visible in FIG. 8A but not shown in FIG. 8D).

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Abstract

L'invention se rapporte à un procédé permettant de contrôler directement et en temps réel le positionnement d'un élément biologique sur une zone d'un support, dans lequel, cet élément biologique étant marqué par un traceur émetteur d'un rayonnement lumineux et la zone du support sur laquelle il doit être positionné étant située dans une couche d'un matériau apte à piéger ce rayonnement lumineux a) on permet à l'élément biologique de se positionner sur la zone du support ; b) on mesure l'intensité du rayonnement lumineux piégé dans ladite couche ; et c) on détermine le positionnement de l'élément biologique en comparant la valeur d'intensité ainsi mesurée à au moins une valeur de référence ; les étapes a), b) et c) pouvant être réalisées successivement ou simultanément. L'invention se rapporte également à un dispositif permettant d'appliquer ce procédé au positionnement d'un ou plusieurs éléments biologiques sur une ou plusieurs zones d'un support.

Description

PROCEDE ET DISPOSITIF DE CONTROLE DU POSITIONNEMENT D'UN ELEMENT BIOLOGIQUE SUR UN SUPPORT
DESCRIPTION
DOMAINE TECHNIQUE L'invention se rapporte à un procédé permettant de contrôler directement et en temps réel le positionnement d'un élément biologique sur une zone d'un support sur laquelle il est destiné à être positionné. Elle se rapporte également à un dispositif permettant d'appliquer ce procédé au positionnement d'un ou plusieurs éléments biologiques sur une ou plusieurs zones d'un support. Dans ce qui précède et ce qui suit, on entend par "élément biologique", tout élément naturel ou artificiel dont au 'moins une partie est constituée d'une membrane biologique ou reproduit les caractéristiques fonctionnelles d'une membrane biologique. Ainsi, il peut s'agir d'une cellule ou d'un organite cellulaire du type vacuole, appareil de golgi, mitochondrie, réticulum endoplasmique, lysosome, ..., d'un fragment de membrane biologique, agrémenté ou non de parties cytosoliques, d'une bicouche lipidique artificielle tel qu'un film de phosphatidylcholine ou de phosphatidylglycérol, dotée d'un ou plusieurs pores protéiques, ou encore d'une membrane biomimétique. Le procédé et le dispositif selon l'invention permettent, en particulier, de vérifier l'établissement d'un scellement de haute résistance entre un élément biologique et une zone d'un support par la technique du patch-clamp. Ils sont donc susceptibles de constituer des outils de choix dans tous les domaines où la technique du patch-clamp est elle-même susceptible d'être utilisée. A titre d'exemples d'applications de cette technique, on peut citer : - la recherche pharmaceutique, notamment pour l'étude des mécanismes responsables au niveau cellulaire des pathologies liées à un dysfonctionnement des canaux ioniques ; l'identification des sites et des modes d'action de médicaments connus pour être efficaces dans le traitement de ces pathologies ; le criblage à moyen ou haut débit de molécules ayant pour cibles des canaux ioniques et pouvant, de ce fait, présenter un intérêt thérapeutique, ou de médicaments candidats dont on souhaite évaluer les effets et/ou la toxicité ; la mise au point d'antidotes contre des poisons ou venins ; - le domaine médical, notamment pour le diagnostic de pathologies liées à un dysfonctionnement des canaux ioniques ; - l'industrie, en particulier agroalimentaire, pharmaceutique et cosmétique, notamment pour le contrôle sanitaire des chaînes de fabrication et des produits qui en sont issus ; - le domaine de l'environnement, notamment pour la détection de polluants ; - la recherche fondamentale, par exemple pour l'étude des canaux ioniques mécano-sensibles en vue du développement de capteurs "mécaniques" ; la détection de cellules vivantes ou ayant conservé leur intégrité membranaire, ou, au contraire, de cellules mortes ou ayant perdu leur intégrité membranaire ; la mesure d'une modification de capacitance membranaire consécutive à la fusion d'une cellule avec une autre cellule ou une vésicule ; la stimulation de cellules comme des neurones en vue, par exemple, d'étudier, de favoriser, voire d'accélérer, la régénération, la repousse ou la plasticité neuronale ; l'étude de l'activité intracellulaire d'un réseau cellulaire, d'un tissu ou d'une co-culture cellulaire, l'étude de la réponse de cellules A à l'application d'une stimulation électrique à des cellules B ou encore l'étude de la fonction d'un canal ionique par le blocage de l'expression du gène codant cette protéine, suite à l'introduction dans la cellule de molécules telles qu'un ADN anti-sens ou un ARNsi ("small interférence").
ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTÉRIEURE La technique du patch-clamp, mise au point par NEHER et SAKMANN en 1981, reste à ce jour la technique la plus performante pour contrôler les différences de potentiel électrique transmembranaire au niveau d'un fragment de membrane plasmique ou d'une cellule entière et, partant, pour accéder directement aux flux ioniques circulants dans les canaux ioniques de ce fragment de membrane ou de cette cellule . Telle qu'initialement conçue, elle consiste à appliquer l'extrémité inférieure d'une micropipette en verre sur la membrane plasmique d'une cellule et à établir, par une aspiration buccale au niveau de l'extrémité supérieure de la micropipette, un scellement de haute résistance, de l'ordre de 1 à 10 gigaohms (d'où le fait qu'il est usuellement désigné par le terme anglo-saxon "gigaseal"), entre l'extrémité inférieure de la micropipette et le fragment de membrane au contact duquel elle se trouve (configuration "cellule-attachée") . L'aspiration peut être poursuivie jusqu'à obtenir 1 ' ouverture de ce fragment de membrane (configuration "cellule-entière") . Ce dernier peut également être isolé du reste de la cellule par excision mécanique : on parle dans ce cas de "patch excisé". Il est alors possible, en appliquant une tension électrique constante au fragment de membrane ou à la cellule et en enregistrant les variations de cette tension, de mesurer l'activité électrique résultant d'un changement d'état (ouverture ou fermeture) des canaux ioniques situés sur l'intégralité de la membrane cellulaire (en configuration "cellule-entière") ou sur le seul fragment de membrane ou même sur un seul canal ionique (en configuration "cellule-attachée" ou "patch excisé") . Afin de faciliter la mise en œuvre de cette technique et de la rendre plus performante, un certain nombre d'équipes s'est attaché au cours de ces dernières années à développer des dispositifs, et notamment des dispositifs miniaturisés de type biopuces, destinés à mesurer les échanges ioniques transmembranaires de plusieurs cellules en parallèle selon le principe du patch-clamp. Ces dispositifs comprennent généralement un substrat plan, microstructuré, c'est-à-dire muni de puits micrométriques, sur lequel sont déposées les cellules, ainsi qu'un ou plusieurs canaux permettant, par actionnement d'une pompe, de créer une aspiration à la base de ces puits et de réaliser ainsi un gigaseal entre le substrat et un fragment de la membrane plasmique de ces cellules. De tels dispositifs sont, par exemple, décrits dans WO 01/25769 [1] et dans WO 01/59447 [2]. Que la technique du patch-clamp soit mise en œuvre de façon conventionnelle, c'est-à-dire au moyen d'une micropipette en verre, ou sur une biopuce, la fiabilité des résultats obtenus dépend principalement de la réussite du gigaseal, celle-ci conditionnant, en effet, la stabilité de la liaison entre le support et la membrane cellulaire, l'isolation électrique du fragment membranaire, la bonne application d'un potentiel électrique à ce fragment et la validité de la mesure du courant électrique résultant. Or, le gigaseal est relativement difficile à obtenir : ainsi, le taux de réussite est d'environ 40 à 50% en patch-clamp conventionnel, et d'environ 20% pour les biopuces. A l'heure actuelle, le suivi et le contrôle de l'établissement d'un gigaseal se fait par des mesures de résistance électrique puisque l'invagination d'un fragment de membrane cellulaire dans l'extrémité d'une micropipette ou à la base d'un micropuits, puis le scellement de ce fragment sur cette extrémité ou cette base ont pour effet de créer une résistance au passage d'un courant électrique. Ces mesures présentent l'inconvénient majeur de ne pas permettre un contrôle direct de l'établissement du gigaseal car elles nécessitent d'appliquer des puises de tension successifs et de calculer les variations de résistance, sachant que l'augmentation de la résistance peut être rapide ou lente, selon la loi du tout-ou-rien ou être très progressive. De plus, dans le cas d'une biopuce, elles nécessitent de procéder à un enregistrement en parallèle des variations de résistance dans tous les puits avant d'identifier ceux dans lesquels un gigaseal s'est établi, puis de revenir aux puits "positifs" pour ensuite leur appliquer les protocoles d'activation des canaux ioniques . Les Inventeurs se sont, donc, fixé pour but, de fournir un procédé qui permette de contrôler directement et en temps réel le positionnement d'un élément biologique sur une zone d'un support sur laquelle il est destiné à être positionné et, en particulier, le scellement de cet élément biologique sur cette zone, et ce, aussi bien dans le cas où le support est cylindrique à l'instar des micropipettes utilisées dans la technique conventionnelle du patch- clamp que dans celui où il est plan comme les supports entrant dans la constitution des biopuces. Ils se sont également fixé pour but de fournir un dispositif permettant d'appliquer ce procédé au positionnement d'un ou plusieurs éléments biologiques sur une ou plusieurs zones d'un support.
EXPOSÉ DE L'INVENTION Ce but, et d'autres encore, sont atteints par un procédé de contrôle du positionnement d'un élément biologique sur une zone d'un support, dans lequel, cet élément biologique étant marqué par un traceur émetteur d'un rayonnement lumineux et la zone du support sur laquelle il doit être positionné étant située dans une couche d'un matériau apte à piéger ce rayonnement lumineux : a) on permet à l'élément biologique de se positionner sur la zone du support ; b) on mesure l'intensité du rayonnement lumineux piégé dans ladite couche ; et c) on détermine le positionnement de l'élément biologique en comparant la valeur d'intensité ainsi mesurée à au moins une valeur de référence ; les étapes a) , b) et c) pouvant être réalisées successivement ou simultanément. Ainsi, le procédé selon l'invention consiste en un contrôle optique du positionnement de l'élément biologique par rapport à la zone du support sur laquelle il est destiné à être positionné, et en particulier en un suivi dans le temps de ce positionnement . Ce contrôle optique est basé sur la propriété que présente un rayonnement émis par une source lumineuse à se comporter différemment dans une couche d'un matériau plus réfringent que le milieu dans lequel il est émis selon la distance qui sépare ladite source lumineuse de la surface de cette couche. En effet, comme montré expérimentalement par M. Lieberherr et al . dans Surface Science, vol. 189/190, 954-959, 1987 [3], et illustré sur la figure 1 jointe en annexe, lorsqu'une source lumineuse S telle qu'un fluorophore, est suffisamment proche de la surface d'une couche C d'un matériau, par exemple à quelques nanomètres de cette surface, l'angle de réfraction θ des rayons de cette source dans la couche C se situe au-delà de l'angle critique θc. Il est, par ailleurs, bien connu que les rayons lumineux possédant un tel angle se propagent dans la couche C en réflexion totale. Ainsi, l'intensité lumineuse piégée dans le matériau est une fonction de la distance qui sépare la source lumineuse de la surface de la couche et sa mesure permet d'apprécier cette distance. Conformément à l'invention, l'élément biologique est, de préférence, marqué par un traceur fluorescent bien que d'autres types de traceurs puissent être utilisés comme des traceurs bioluminescents ou chimioluminescents dès lors qu'ils peuvent être fixés sur ou exprimés à la surface d'un élément biologique. Ce traceur fluorescent peut se présenter sous des formes très diverses. Ainsi, par exemple, il peut notamment s'agir d'un fluorophore organique du type fluorescéïne et ses dérivés (isothiocyanate de fluorescéïne par exemple) , vert Orégon, rhodamine et ses dérivés (isothiocyanate de tétraméthylrhodamine par exemple) , rouge Texas, Bodipy, cyanine et ses dérivés (Cy 3.5 par exemple), que l'on couple chimiquement à une ou plusieurs protéines membranaires de l'élément biologique. Il peut également s'agir d'un anticorps marqué par l'un de ces fluorophores, qui est dirigé contre une protéine membranaire de l'élément biologique et que l'on fixe sur cet élément par une réaction antigène-anticorps, ou d'une protéine membranaire fluorescente comme la protéine verte fluorescente (GFP) , extraite de la méduse Aequorea Victoria et ses dérivés de couleurs variées (cyan, jaune et bleu) , qui est exprimée par l'élément biologique après transfection de ce dernier avec l'ADNc codant cette protéine . Tous ces traceurs fluorescents et leurs protocoles d'utilisation sont bien connus de l'homme du métier et sont référencés dans des catalogues commerciaux tels que ceux des sociétés Molecular Probes et Clontech. L'élément biologique peut également être marqué par un traceur fluorescent minéral tel qu'un "quantum dot", comme décrit par B. Dubertret dans M/ S n°5, vol. 19, 532-534, 2003 [4]. Comme précédemment indiqué, la zone du support sur laquelle 1 ' élément biologique doit être positionné est située dans une couche d'un matériau apte à piéger le rayonnement lumineux émis par l'élément biologique, plus simplement désignée ci-après "la couche". Dans le cadre de la présente invention, on entend par "matériau apte à piéger le rayonnement lumineux émis par l'élément biologique", tout matériau présentant la double propriété d'être transparent au type de rayonnement lumineux émis par l'élément biologique de manière à en permettre la propagation, et de présenter un indice de réfraction supérieur à l'indice de réfraction des milieux situés de part et d'autre du milieu de propagation au moment où l'on souhaite positionner l'élément biologique sur la zone du support, et en particulier du milieu dans lequel se trouve l'élément biologique. Il est souhaitable que ce matériau soit, de plus, biocompatible et qu'il n'émette pas lui-même un rayonnement lumineux, en tout cas de même longueur d'onde que le rayonnement lumineux émis par l'élément biologique afin de ne pas interférer avec ce dernier. Ainsi, par exemple, si l'élément biologique est marqué par un traceur émetteur d'une lumière visible comme un traceur fluorescent, et si le milieu dans lequel il se trouve est un milieu physiologique (milieu aqueux salin d'indice de réfraction ≈ 1,33 pour la lumière visible) , le matériau formant la couche peut être un verre organique ou minéral, notamment du verre, de la silice, du nitrure de silicium (Si3N4) , du dioxyde de titane (Ti02), du dioxyde de hafnium (Hf02) , de l'alumine (AI2O3) , de la silice chargée en ions potassium ou argent, par exemple par échange d'ions, ou l'un des très nombreux polymères de synthèse proposés sur le marché qui présentent des pourcentages élevés de transmission de la lumière visible (en pratique, de l'ordre de 90% ou supérieurs) conjugués à des indices de réfraction d'1,5 ou plus. A titre d'exemples de tels polymères, on peut citer les polydiméthylsiloxanes, les poly- methacrylates de méthyle, plus connus sous le nom de plexiglas et d'altuglas , les polycarbonates de haute fluidité tels que ceux commercialisés par les sociétés Bayer, Dow ou GE Plastics ou encore les copolymères à base d'oléfines cycliques tels que ceux commercialisés par les sociétés Ticona et Mitsui Chemical Industries. Conformément à l'invention, l'étape a) du procédé peut consister à laisser cet élément biologique se mettre en place sur la zone du support, par exemple par simple sédimentation, ou, au contraire, à agir sur cet élément de manière à faciliter, accélérer ou optimiser son positionnement, par exemple par application d'un champ de pression, d'un champ électrique, ou analogue. A l'étape b) , la mesure de l'intensité du rayonnement lumineux piégé dans la couche implique que ce rayonnement soit préalablement extrait de cette couche, c'est-à-dire qu'il soit amené à ressortir de cette couche après s'y être propagé par réflexion interne. Conformément à l'invention, cette extraction peut être réalisée par des moyens que comporte de façon permanente le support ou dont on munit provisoirement celui-ci avant de procéder à la mesure de l'intensité du rayonnement lumineux piégé, ou même avant de permettre à l'élément biologique de se positionner dans le cas où les étapes a) et b) ne sont pas réalisées simultanément. Aussi, le procédé selon l'invention peut-il comprendre, préalablement à l'étape a) ou entre les étapes a) et b) , une étape consistant à munir le support de moyens d'extraction du rayonnement lumineux piégé dans la couche. Ces moyens d'extraction sont décrits plus loin. Par ailleurs, à l'étape b) , la mesure du rayonnement lumineux piégé dans la couche peut être optimisée par la présence de moyens propres à collecter le rayonnement lumineux extrait de cette couche avant que son intensité ne soit mesurée, du type lentille (s) convergente (s) , miroir (s), éventuellement associé (s) à une ou plusieurs lentilles, matrice de microlentilles et/ou de micromiroirs, ou analogues. Aussi, le procédé selon l'invention peut-il également comprendre, préalablement à l'étape a) ou entre les étapes a) et b) , une étape consistant à placer, en regard de la couche, des moyens pour collecter le rayonnement lumineux extrait de cette couche si de tels moyens ne sont pas initialement présents . L'étape b) du procédé peut être réalisée par tout système permettant de détecter et de quantifier un rayonnement lumineux comme, par exemple, un capteur ponctuel du type tube photomultiplicateur ou photodiode, ou un capteur d'images comme un tube vidéo, une caméra CCD, une caméra CMOS ou une caméra de photodiodes. Quant à l'étape c) , elle peut notamment consister à comparer la valeur d'intensité mesurée à une courbe étalon exprimant la variation de l'intensité lumineuse piégée dans la couche en fonction de la position de l'élément biologique par rapport à la zone du support sur laquelle il doit être positionné, préalablement établie dans des conditions expérimentales identiques. Conformément à l'invention, le positionnement de l'élément biologique sur la zone du support comprend, de préférence, le scellement de cet élément sur cette zone. Dans le cas où la zone du support sur laquelle l'élément biologique doit être scellé est constituée par les bords d'une ouverture traversante ménagée dans ce support, alors l'étape a) du procédé selon l'invention comprend, de préférence, la création d'une dépression dans cette ouverture propre à permettre à l'élément biologique d'y pénétrer partiellement et de se sceller sur ses bords. Dans un tel cas, les étapes a) , b) et c) sont, de préférence, réalisées simultanément de manière à contrôler la qualité du scellement au fur et à mesure que celui-ci s'établit. Comme précédemment indiqué, l'élément biologique peut être tout élément naturel ou artificiel dont au moins une partie est constituée d'une membrane biologique ou reproduit les caractéristiques fonctionnelles d'une membrane biologique, comme une cellule ou un organite cellulaire du type vacuole, appareil de golgi, mitochondrie, réticulum endoplasmique, lysosome, ..., un fragment de membrane biologique, agrémenté ou non de parties cytosoliques, une bicouche lipidique artificielle tel qu'un film de phosphatidylcholine ou de phosphatidylglycerol, dotée d'un ou plusieurs pores protéiques, ou encore une membrane biomimétique. De préférence, l'élément biologique est une cellule. L'invention a également pour objet un dispositif de contrôle du positionnement d'au moins un élément biologique sur au moins une zone d'un support, qui comprend : — un support comprenant une couche d'un matériau apte à piéger un rayonnement lumineux prévu pour être émis par ledit élément biologique, et des moyens pour extraire le rayonnement lumineux piégé dans cette couche, ladite zone du support étant située dans ladite couche ; et — des moyens pour mesurer l'intensité du rayonnement lumineux extrait de ladite couche. Selon un premier mode de réalisation préféré du dispositif, le support est un tube ouvert à ses deux extrémités et la zone sur laquelle l'élément biologique doit être positionné est l'une des deux ouvertures de ce tube. Dans ce cas, le support est, de préférence, une micropipette, et notamment une micropipette adaptée à la mise en œuvre de la technique du patch-clamp. Selon un autre mode de réalisation préféré du dispositif, le support est un support plan, c'est-à- dire de forme générale plane, et la zone sur laquelle l'élément biologique doit être positionné est une ouverture que comporte ce support, laquelle peut consister en une dépression, plus ou moins prononcée, creusée dans l'une des faces du support ou être une ouverture traversante, c'est-à-dire s 'étendant d'une face à l'autre du support. Dans ce dernier cas, le support est, de préférence, un support adapté à la mise en œuvre de la technique du patch-clamp. Comme précédemment indiqué, la couche de matériau apte à piéger le rayonnement lumineux, plus simplement désignée ci-après "la couche", peut notamment être en un verre organique ou minéral, en silice, en nitrure de silicium, en dioxyde de titane, en dioxyde de hafnium, en alumine, en silice chargée en ions potassium ou argent, ou en un polymère de synthèse . Cette couche peut, par ailleurs, s'étendre sur toute l'épaisseur du support ou, au contraire, n'en constituer qu'une partie, pour autant que le ou les autres matériaux constituant le support qui sont situés à son contact présentent un indice de réfraction inférieur à celui du matériau qui la forme . En tout état de cause, elle présente une épaisseur d'au moins 200 nm. Conformément à l'invention, les moyens pour extraire le rayonnement lumineux piégé dans la couche, comprennent toute configuration du support ou tout élément associé à ce support qui permet d'interrompre la propagation du rayonnement lumineux dans cette couche et de l'en faire ressortir. Ainsi, ces moyens d'extraction peuvent notamment consister en un relief ou un creux ou une série de reliefs et de creux ménagés dans l'une des faces de la couche, ou en une pièce qui est disposée sur l'une des faces de la couche et qui forme sur cette face un relief ou une série de reliefs et de creux, cette pièce pouvant être amovible ou solidaire de ladite couche. Ils peuvent également consister en un matériau qui est déposé sur l'une des faces de la couche, en un ou plusieurs points de cette face, ce matériau pouvant se présenter sous forme d'un liquide, d'un gel ou d'un solide. Ils peuvent encore consister en une interruption de la couche par un matériau opaque au rayonnement lumineux. Dans le cas où le support est un support plan, les moyens d'extraction s'étendent, de préférence, tout autour de la zone de ce support sur laquelle l'élément biologique doit être positionné. De préférence, le dispositif selon l'invention comprend de plus des moyens de collecte du rayonnement lumineux extrait de la couche, du type lentille (s) convergente (s) , miroir (s), éventuellement associé (s) à une ou plusieurs lentilles, matrice de microlentilles et/ou de micromiroirs, ou analogues. Comme précédemment indiqué, les moyens de mesure peuvent comprendre tout système permettant de détecter et de quantifier un rayonnement lumineux comme, par exemple, un tube photomultiplicateur, une photodiode, un tube vidéo, une caméra CCD, une caméra CMOS ou une caméra de photodiodes. Le dispositif selon l'invention peut encore comprendre des moyens d'excitation d'un ou plusieurs fluorophores dans le cas où le rayonnement lumineux prévu pour être émis par 1 ' élément biologique est un rayonnement fluorescent. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré du dispositif selon l'invention, le support est un support plan qui comprend une pluralité de zones pour le positionnement d'une pluralité d'éléments biologiques, auquel cas : — la couche de matériau apte à piéger le rayonnement lumineux est divisée en autant de parties que le support comprend de zones ; — chaque zone du support est située dans l'une de ces parties ; — ces parties sont séparées les unes des autres par des moyens propres à empêcher le rayonnement lumineux de se propager d'une partie à l'autre ; et — pour chaque partie de ladite couche, le support comprend des moyens pour extraire le rayonnement lumineux piégé dans cette partie, tandis que le dispositif comprend des moyens pour collecter le rayonnement lumineux extrait de cette partie et des moyens pour mesurer 1 ' intensité du rayonnement lumineux collecté par lesdits moyens de collecte. Dans ce mode de réalisation préféré, la couche apte à piéger le rayonnement lumineux est, de préférence, supportée par une couche d'un matériau opaque à ce rayonnement lumineux et les parties de la couche apte à piéger le rayonnement lumineux sont séparées les unes des autres par des saillies de la couche opaque au rayonnement lumineux qui s ' étendent dans l'épaisseur de la couche apte à piéger le rayonnement lumineux . Le dispositif selon l'invention est susceptible d'être intégré dans un système d'analyse plus complexe, notamment dans un système permettant de mesurer conjointement l'activité électrique d'un ou plusieurs éléments biologiques. En particulier, il peut être associé à : — des électrodes reliées à un circuit d'alimentation électrique et de mesure d'une grandeur électrique et propres à permettre l'application aux éléments biologiques d'une tension électrique et l'enregistrement des variations de cette tension consécutives à un changement d'état (ouverture ou fermeture) des canaux ioniques de ces éléments biologiques ; — des capillaires, éventuellement reliés à un système de distribution de liquides et/ou à un système d'aspiration de liquides et propres à permettre l'apport de substances au niveau des zones de positionnement des éléments biologiques ou, au contraire, l'élimination de telles substances, ou encore le changement de composition des milieux d'étude (purge) . L'invention a encore pour objet l'application d'un procédé tel que précédemment défini, ou d'un dispositif tel que précédemment défini, au contrôle de l'établissement d'un scellement de haute résistance entre au moins un élément biologique et au moins une zone d'un support par la technique du patch- clamp . L'invention sera mieux comprise à la lecture du complément de description qui suit, qui se rapporte à différents modes de réalisation d'un dispositif conforme à l'invention et qui se réfère aux dessins annexés. Bien entendu, ce complément de description est donné uniquement à titre d'illustration de 1 ' invention.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS La figure 1, déjà décrite, illustre le comportement des rayons émis par une source lumineuse telle qu'un fluorophore, lorsque cette source est suffisamment proche de la surface d'une couche d'un matériau plus réfringent que le milieu dans lequel elle se trouve . La figure 2 est une représentation schématique en coupe d'un premier mode de réalisation d'un dispositif selon l'invention conçu pour permettre un contrôle du scellement d'un élément biologique sur l'extrémité d'une micropipette par la technique conventionnelle du patch-clamp. Les figures 3 à 6 sont des représentations schématiques partielles en coupe de la micropipette montrée sur la figure 2 qui illustrent cinq variantes de réalisation des moyens d'extraction d'un rayonnement lumineux que comporte cette micropipette. La figure 7 est une représentation schématique en perspective d'un deuxième mode de réalisation d'un dispositif selon l'invention conçu pour permettre un contrôle simultané du scellement de plusieurs éléments biologiques sur des ouvertures d'un support plan par la technique du patch-clamp. La figure 8A est une représentation schématique partielle du dispositif montré sur la figure 7, vu en coupe selon la ligne VIII-VIII. Les figures 8B à 8D sont des représentations schématiques partielles du dispositif montré sur la figure 7, vu en coupe selon la ligne VIII-VIII, qui illustrent trois variantes de réalisation des moyens d'extraction d'un rayonnement lumineux que comporte le support de ce dispositif. Sur les figures 2 à 8D, les éléments identiques ont été affectés des mêmes références.
EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS On se réfère tout d'abord à la figure 2 qui représente schématiquement en coupe un premier mode de réalisation d'un dispositif 10 conforme à l'invention qui est conçu pour permettre le contrôle du scellement d'un élément biologique par la technique conventionnelle du patch-clamp, c'est-à-dire au moyen d'une micropipette. Aussi, dans ce mode de réalisation, le support comportant une zone sur laquelle doit être positionné l'élément biologique est une micropipette, référencée 11 sur la figure 2. Comme les micropipettes conventionnelles de patch-clamp, la micropipette 11 se présente sous la forme d'un tube rigide, ouvert à ses deux extrémités, qui est limité par une paroi 13 d'épaisseur sensiblement constante, et dont l'une des deux parties terminales va en se rétrécissant. La zone sur laquelle doit être positionné l'élément biologique est constituée par l'extrémité de la micropipette qui présente la section la plus faible, à savoir l'extrémité référencée 12 sur la figure 2. Cette extrémité représente, en condition d'utilisation, l'extrémité inférieure de la micropipette 11. Elle sera donc appelée, dans ce qui suit, extrémité inférieure, tandis que l'extrémité 20, qui lui est opposée, sera appelée extrémité supérieure . Comme les micropipettes conventionnelles de patch-clamp, la paroi 13 de la micropipette 11 peut être en verre, auquel cas cette paroi est apte à piéger tout rayonnement dont la longueur d'onde se situe dans le spectre de la lumière visible, et notamment les rayonnements fluorescents. Elle peut également être en un tout autre matériau présentant comme le verre, à la fois une rigidité, une transparence pour la lumière visible et une réfringence plus élevée que les deux types de milieux au contact desquels cette paroi est destinée à être en contact en condition d'utilisation, à savoir l'air et des solutions physiologiques. Ainsi, elle peut notamment être en un polymère transparent du type polyméthacrylate de méthyle ou polycarbonate. La micropipette 11 comporte, à sa partie médiane, des moyens permettant d'extraire un rayonnement lumineux piégé dans la paroi 13 en condition d'utilisation. Dans le mode de réalisation illustré sur la figure 2, ces moyens d'extraction consistent en une série de quatre rainures annulaires, respectivement 14χ, 142, 143 et 144, séparées par trois nervures, qui sont de forme et de dimensions identiques les unes aux autres et qui sont ménagées dans la face externe 15 de la paroi 13. A titre d'exemple, ces rainures peuvent présenter une profondeur de quelques angstroms à quelques microns et s'étendre sur la paroi 13 sur une hauteur totale de quelques microns à quelques millimètres . Le dispositif 10 comprend aussi des moyens
16 pour collecter le rayonnement lumineux extrait de la paroi 13 de la micropipette 11 en condition d'utilisation. Dans le mode de réalisation illustré sur la figure 2, ces moyens de collecte sont constitués par une lentille convergente qui est disposée en regard d'une portion de la face externe 15 de la paroi 13 de la micropipette 11 dans laquelle se trouvent les rainures 14ι à 144, mais il pourrait tout autant s'agir d'un miroir, d'un ensemble de lentilles et/ou de miroirs comme une matrice de microlentilles et/ou de micromiroirs . Le dispositif 10 comprend encore des moyens
17 pour mesurer l'intensité d'un rayonnement lumineux collecté par les moyens de collecte 16 en condition d'utilisation, qui sont disposés en regard des moyens de collecte. Ces moyens de mesure peuvent notamment comprendre un capteur ponctuel du type tube photomultiplicateur ou photodiode, ou un capteur d'images comme un tube vidéo, une caméra CCD, une caméra CMOS ou une caméra de photodiodes. L'utilisation du dispositif 10 pour le contrôle du scellement d'un élément biologique sur l'extrémité 12 de la micropipette 11 est extrêmement simple. Comme avec une micropipette conventionnelle, on commence par appliquer l'extrémité inférieure 12 de la micropipette 11 sur un fragment d'un élément biologique, par exemple une cellule que 1 ' on aura préalablement marquée par un traceur émetteur d'un rayonnement lumineux. Puis, par aspiration buccale au niveau de l'extrémité supérieure 20 de la micropipette 11, on crée une dépression dans la micropipette de manière à amener ce fragment à pénétrer dans 1 ' ouverture que comporte l'extrémité inférieure 12 de la micropipette 11 et à obtenir son scellement sur la paroi 13, comme illustré sur la figure 2 qui montre partiellement un fragment d'une cellule 21 ainsi scellé. Si ces processus d'invagination et de scellement se déroulent correctement, ils ont pour effet d'amener des molécules du traceur marquant l'élément biologique à venir, tout d'abord à toute proximité, puis au contact de la paroi 13 de la micropipette 11, ce contact étant de plus en plus étroit au fur et à mesure que s'établit le scellement. Ceci se traduit par une augmentation de la proportion des rayons qui pénètrent dans la paroi 13 de la micropipette 11 et qui s'y propagent par réflexion interne jusqu'aux moyens d'extraction 14χ à 144 au niveau desquels ils sont extraits de cette paroi, comme illustré par la figure 2 qui montre le parcours d'un rayon émis par une molécule 22 de traceur située au contact de la face interne 23 de la paroi 13. Les rayons extraits de la paroi 13 de la micropipette 11 sont ensuite collectés par les moyens de collecte 16 et transmis par ces derniers aux moyens de mesure 17 qui en mesurent l'intensité. Ainsi, si les processus d'invagination et de scellement se déroulent correctement, l'intensité lumineuse mesurée par les moyens de mesure 17 augmente au cours de l'aspiration pour devenir optimale à l'obtention du gigaseal. A l'inverse, une incapacité à obtenir une augmentation soutenue de l'intensité lumineuse mesurée par les moyens de mesure 17 au cours de l'aspiration ou une rupture brutale de cette augmentation signera une mauvaise tenue mécanique du scellement ou une perte de l'intégrité de l'élément biologique ou de sa viabilité s'il s'agit d'un élément vivant (éclatement de l'élément biologique par exemple) . La micropipette 11 peut présenter des moyens d'extraction du rayonnement lumineux autres que ceux montrés sur la figure 2. A titre d'exemples, les figures 3 à 6 illustrent cinq variantes de réalisation de ces moyens d'extraction. Dans la variante de réalisation illustrée sur la figure 3, ces moyens d'extraction consistent en une zone annulaire rugueuse 24 située dans la face externe 15 de la paroi 13 de la micropipette 11. A titre d'exemple, les rugosités formant cette zone, qui peuvent être réalisées par un traitement chimique ou mécanique, peuvent présenter une profondeur et une périodicité (distance entre deux pointes ou entre deux creux) de quelques angstroms à quelques dizaines de microns . Dans la variante de réalisation illustrée sur la figure 4, les moyens d'extraction consistent en une bague 34 qui entoure la face externe 15 de la paroi 13 de la micropipette 11 et qui comporte sur sa propre face externe une zone annulaire rugueuse 35 du même type que celle précédemment décrite pour la figure 3. Dans la variante de réalisation illustrée sur la figure 5, les moyens d'extraction consistent en 4 bagues, respectivement 44ι, 442, 443 et 444, de forme et de dimensions identiques les unes aux autres, et qui sont régulièrement réparties sur la face externe 15 de la paroi 13 de la micropipette 11, tandis que, dans la variante de réalisation illustrée sur la figure 6, les moyens d'extraction sont constitués par une seule bague 54 qui entoure la face externe 15 de la paroi 13 de la micropipette 11 et qui comporte une série de trois rainures annulaires 54ι, 542 et 543 séparées par des nervures . Les bagues 34, 44χ à 444 et 54 montrées sur les figures 4 à 6 peuvent être solidaires de la paroi 13 de la micropipette 11, auquel cas elles peuvent, soit être d'un seul tenant avec cette paroi, soit être rapportées et fixées sur cette dernière. Elles peuvent également être amovibles, ce qui peut présenter un certain nombre d'avantages comme celui, par exemple, de pouvoir disposer d'un jeu de bagues de configurations différentes et de pouvoir choisir la ou les bagues les plus adaptées aux conditions opératoires retenues. Par ailleurs, les bagues 34, 4 ι à 444 et 54 peuvent être formées du même matériau que celui qui constitue la paroi 13 de la micropipette 11 ou être réalisées en un matériau différent. On se réfère à présent à la figure 7 qui représente schématiquement en perspective un deuxième mode de réalisation d'un dispositif 30 selon l'invention qui est conçu pour permettre le contrôle simultané du scellement de plusieurs éléments biologiques sur des ouvertures d'un support plan par la technique du patch-clamp, ainsi qu'à la figure 8A qui représente schématiquement et partiellement ce dispositif, vu en coupe selon la ligne VIII-VIII. Comme visible sur la figure 7, le dispositif 30 comprend un support 31 de forme générale quadrangulaire . Ce support comporte une couche 32 qui est divisée ici en quatre parties, respectivement 32a, 32b, 32c et 32d, de forme et de dimensions identiques les unes aux autres, mais qui pourrait tout aussi bien être divisée en un nombre de parties différent de 4, le dispositif 30 ne représentant qu'un exemple non limitatif d'un dispositif selon l'invention. Ces quatre parties sont encastrées dans un substrat 33 qui comporte une base 34 et six parois érigées verticalement sur cette base, respectivement 35a, 35b, 35c, 35d, 35e et 35f, délimitant ensemble quatre cavités disposées en damier et logeant chacune l'une des parties 32a à 32d de la couche 32. Chaque partie 32a à 32d de la couche 32 est munie en son centre d'une ouverture traversante, respectivement 36a, 36b, 36c et 36d, laquelle communique avec une ouverture qui lui est coaxiale et qui traverse la base 34 du substrat 33. Le substrat 33 comporte donc également quatre ouvertures traversantes - l'une de ces ouvertures étant visible sur la figure 8 sur laquelle elle est référencée 37a - qui peuvent être reliées à des capillaires (non représentés sur les figures 7 et 8A) pouvant être eux-mêmes connectés à un système d'aspiration de liquides du type micropompe. Les ouvertures traversantes 36a à 36d de la couche 32 représentant les zones du support 31 sur lesquelles les éléments biologiques doivent être positionnés, la couche 32 est constituée d'un matériau apte à piéger un rayonnement lumineux prévu pour être émis par ces éléments, tandis que le substrat 33 est, lui, constitué d'un matériau opaque à ce rayonnement. Ainsi, par exemple, si les éléments biologiques sont prévus pour être marqués par un traceur fluorescent, la couche 32 peut être une couche de verre, de silice, de Si3N4, de Ti02, dΑl203, ou d'un polymère transparent, tandis que le substrat 33 peut être en un métal (Al, Au, Cu, Ag, ...) , en un semi-conducteur (Si, Ge, ...) ou en un polymère opaque . Chaque partie 32a à 32d de la couche 32 est, de plus, munie de moyens permettant d'extraire le rayonnement lumineux piégé dans cette partie en condition d'utilisation. Dans la forme de réalisation du dispositif 30 montrée sur les figures 7 et 8A, ces moyens d'extraction consistent en des anneaux, respectivement 38a, 38b, 38c, 38d, qui sont disposés sur la face supérieure des parties 32a à 32d et qui entourent les ouvertures 36a à 36d. Ces anneaux, qui peuvent être présents de façon provisoire, c'est-à-dire le temps de réaliser l'expérimentation, ou permanente, peuvent être constitués d'un matériau se présentant sous la forme d'un liquide, d'un gel ou d'un solide et qui est déposé sur la face supérieure des parties 32a à 32d avant l'expérimentation ou au cours de celle-ci, ou d'une pièce solidaire desdites parties 32a à 32d, cette pièce pouvant être soit d'un seul tenant avec ces parties, soit être rapportée et fixée sur elles. Comme visible sur la figure 7, le dispositif 30 comprend aussi des moyens pour collecter le rayonnement lumineux extrait par chacun des anneaux 38a à 38d en condition d'utilisation, respectivement 39a, 39b, 39c et 39d, ainsi que des moyens pour mesurer le rayonnement lumineux ainsi collecté, respectivement 40a, 40b, 40c et 40d. Ces moyens de collecte et de mesure peuvent être du même type que ceux précédemment mentionnés en relation avec la figure 2. L'utilisation du dispositif 30 pour le contrôle simultané du positionnement et/ou du scellement d'éléments biologiques sur les ouvertures 36a à 36d est également extrêmement simple. Après avoir déposé un élément biologique, par exemple une cellule que 1 ' on aura préalablement marquée d'un traceur émetteur d'un rayonnement lumineux sur ou à proximité de chacune des ouvertures 36a à 36d, on crée une dépression dans chaque ouverture du substrat 33, par exemple par aspiration au moyen des capillaires précédemment évoqués, de manière à amener un fragment des éléments biologiques à pénétrer dans les ouvertures 36a à 36d et à obtenir son scellement sur ces ouvertures, comme illustré sur la figure 8A qui montre une cellule 21 ainsi scellée sur l'ouverture 36a de la couche 32. Là également, si les processus d'invagination et de scellement s'effectuent correctement, l'intensité lumineuse mesurée par chacun des moyens de mesure 40a à 40d augmente au cours de l'aspiration pour devenir optimale à l'obtention du gigaseal . Le fait que le dispositif 30 comporte, pour chacune des parties 32a à 32d de la couche 32 et, donc, pour chaque zone de positionnement des éléments biologiques des moyens d'extraction, de collecte et de mesure du rayonnement lumineux piégé indépendants de ceux prévus pour les autres parties, permet d'identifier rapidement et précisément les éléments biologiques correctement scellés et ceux qui ne le sont pas, et, ainsi, de ne poursuivre l'expérimentation que sur ceux dont le scellement apparaît être satisfaisant, d'où un gain considérable à la fois d'efficacité et de temps . Les figures 8B à 8D sont des représentations schématiques partielles du dispositif montré sur la figure 7, vu en coupe selon la ligne VIII-VIII, qui illustrent trois variantes de réalisation des moyens d'extraction du rayonnement lumineux . Dans la variante illustrée sur la figure
8B, les moyens d'extraction consistent en une série de quatre rainures, respectivement 48ai, 48a2, 48a3 et 48a, séparées par trois nervures, qui sont de forme et de dimensions identiques les unes aux autres et qui sont ménagées dans la face supérieure de la partie 32a de la couche 32, tout autour de l'ouverture 36a. A titre d'exemple, ces rainures et nervures peuvent présenter une périodicité de quelques centaines de nanomètres à quelques microns. Dans la variante illustrée sur la figure 8C, les moyens d'extraction consistent en une zone rugueuse 58 ménagée dans la face supérieure de la partie 32a de la couche 32, tout autour de l'ouverture 36a. A titre d'exemple, les rugosités formant cette zone, qui peuvent être réalisées par traitement chimique ou mécanique, peuvent présenter une profondeur et une périodicité de quelques angstroms à quelques dizaines de microns. Enfin, dans la variante illustrée sur la figure 8D, les moyens d'extraction sont constitués par les faces latérales des parois 35a et 35f du substrat 33 dont l'inclinaison conjuguée à l'opacité de ces parois sont de nature à diriger le rayonnement lumineux piégé dans la partie 32a de la couche 32 vers les moyens de collecte 39a (visibles sur la figure 8A mais non représentés sur la figure 8D) .
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de contrôle du positionnement d'un élément biologique sur une zone d'un support, dans lequel, cet élément biologique étant marqué par un traceur émetteur d'un rayonnement lumineux et la zone du support sur laquelle il doit être positionné étant située dans une couche d'un matériau apte à piéger ce rayonnement lumineux : a) on permet à l'élément biologique de se positionner sur la zone du support ; b) on mesure l'intensité du rayonnement lumineux piégé dans ladite couche ; et c) on détermine le positionnement de l'élément biologique en comparant la valeur d'intensité ainsi mesurée à au moins une valeur de référence ; les étapes a) , b) et c) pouvant être réalisées successivement ou simultanément.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel 1 ' élément biologique est marqué par un traceur fluorescent .
3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel le traceur fluorescent est un fluorophore organique couplé chimiquement à une ou plusieurs protéines membranaires de l'élément biologique, un anticorps marqué par un fluorophore organique, qui est dirigé contre une protéine membranaire de l'élément biologique et qui est fixé sur cet élément par une réaction antigène-anticorps, ou une protéine membranaire fluorescente qui est exprimée par l'élément biologique .
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la couche de matériau apte à piéger le rayonnement lumineux .est en un verre organique ou minéral, en silice, en nitrure de silicium, en dioxyde de titane, en dioxyde de hafnium, en alumine, en silice chargée en ions potassium ou argent, ou en un polymère de synthèse.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, qui comprend, préalablement à l'étape a) ou entre les étapes a) et b) , une étape consistant à munir le support de moyens pour extraire le rayonnement lumineux piégé dans la couche de matériau apte à piéger le rayonnement lumineux.
6. Procédé selon la revendication 5, qui comprend, préalablement à l'étape a) ou entre les étapes a) et b) , une étape consistant à placer, en regard de la couche de matériau apte à piéger un rayonnement lumineux, des moyens pour collecter le rayonnement lumineux extrait de cette couche.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le positionnement de l'élément biologique sur la zone du support comprend le scellement de cet élément sur cette zone.
8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel, la zone du support sur laquelle l'élément biologique doit être scellé étant constituée par les bords d'une ouverture traversante ménagée dans ce support, l'étape a) comprend la création d'une dépression dans cette ouverture.
9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel les étapes a) , b) et c) sont réalisées simultanément.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'élément biologique est une cellule.
11. Dispositif (10, 30) de contrôle du positionnement d'au moins un élément biologique sur au moins une zone d'un support, comprenant : — un support (11, 31) comprenant une couche (13, 32) d'un matériau apte à piéger un rayonnement lumineux prévu pour être émis par ledit élément biologique, et des moyens pour extraire le rayonnement lumineux piégé dans cette couche, ladite zone (12, 36a-36d) du support étant située dans ladite couche ; et - des moyens (17, 40a-40d) pour mesurer l'intensité du rayonnement lumineux extrait de ladite couche.
12. Dispositif (10) selon la revendication
11, dans lequel le support est un tube ouvert à ses deux extrémités et la zone (12) sur laquelle l'élément biologique doit être positionné est l'une des deux ouvertures de ce tube.
13. Dispositif (10) selon la revendication
12, dans lequel le support est une micropipette (11) , notamment une micropipette adaptée à la mise en œuvre de la technique du patch-clamp.
14. Dispositif (30) selon la revendication
11, dans lequel le support est un support plan (31) et ladite zone sur laquelle l'élément biologique doit être positionné est une ouverture que comporte ce support.
15. Dispositif selon la revendication 14, dans lequel 1 ' ouverture est une ouverture traversante (36a-36d) .
16. Dispositif selon la revendication 15, dans lequel le support est un support plan (31) adapté à la mise en œuvre de la technique du patch-clamp.
17. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 11 à 16, dans lequel la couche (13, 32) de matériau apte à piéger le rayonnement lumineux est en un verre organique ou minéral, en silice, en nitrure de silicium, en dioxyde de titane, en dioxyde de hafnium, en alumine, en silice chargée en ions potassium ou argent, ou en un polymère de synthèse.
18. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 11 à 17, dans lequel la couche (13, 32) de matériau apte à piéger le rayonnement lumineux présente une épaisseur d'au moins 200 nm.
19. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 11 à 18, dans lequel les moyens d'extraction du rayonnement lumineux consistent en un relief ou un creux ou en une série de reliefs et de creux (14ι-144, 24, 48aι-48a4, 58) ménagés dans l'une des faces de la couche de matériau apte à piéger le rayonnement lumineu .
20. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 11 à 18, dans lequel les moyens d'extraction du rayonnement lumineux consistent en une pièce (34, 44x-444, 54, 38a-38d) qui est disposée sur l'une des faces de la couche apte à piéger le rayonnement lumineux, et qui forme sur cette face un relief ou une série de reliefs et de creux.
21. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 11 à 18, dans lequel les moyens d'extraction du rayonnement lumineux consistent en un matériau (38a-38d) qui est déposé sur l'une des faces de la couche apte à piéger le rayonnement lumineux, en un ou plusieurs points de cette face.
22. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 11 à 18, dans lequel les moyens d'extraction du rayonnement lumineux consistent en une interruption de la couche apte à piéger le rayonnement lumineux par un matériau opaque au rayonnement lumineux .
23. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 19 à 21, dans lequel, le support étant un support plan, les moyens d'extraction du rayonnement lumineux s'étendent tout autour de la zone de ce support sur laquelle 1 ' élément biologique doit être positionné.
24. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 11 à 23, qui comprend de plus des moyens (16, 39a-39d) pour collecter le rayonnement lumineux extrait de la couche apte à piéger le rayonnement lumineux .
25. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 11 et 14 à 24, dans lequel, le support étant un support plan (31) comprenant une pluralité de zones pour le positionnement d'une pluralité d'éléments biologiques : — la couche (32) de matériau apte à piéger le rayonnement lumineux est divisée en autant de parties (32a-32d) que le support comprend de zones ; — chaque zone (36a-36d) du support est située dans l'une de ces parties ; — ces parties sont séparées les unes des autres par des moyens (35e-35f) propres à empêcher le rayonnement lumineux de se propager d'une partie à 1 ' autre ; et — pour chaque partie de ladite couche, le support comprend des moyens (38a-38d) pour extraire le rayonnement lumineux piégé dans cette partie, tandis que le dispositif comprend des moyens (39a-39d) pour collecter le rayonnement lumineux extrait de cette partie et des moyens (40a-40d) pour mesurer l'intensité du rayonnement lumineux collecté par lesdits moyens de collecte .
26. Dispositif selon la revendication 25, dans lequel la couche (32) apte à piéger le rayonnement lumineux est supportée par une couche (34) d'un matériau opaque à ce rayonnement lumineux et les parties de la couche apte à piéger le rayonnement lumineux sont séparées par des saillies (35a-35f) de la couche opaque au rayonnement lumineux s ' étendant dans l'épaisseur de la couche apte à piéger le rayonnement lumineu .
27. Application d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou d'un dispositif selon l'une quelconque des revendications 11 à 26 au contrôle de l'établissement d'un scellement de haute résistance entre au moins un élément biologique et au moins une zone d'un support par la technique du patch- clamp.
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