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WO2006018534A1 - Dispositif de detection de la fluorescence emise par des elements chromophores dans des puits d'une plaque a puits multiples - Google Patents

Dispositif de detection de la fluorescence emise par des elements chromophores dans des puits d'une plaque a puits multiples Download PDF

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WO2006018534A1
WO2006018534A1 PCT/FR2005/001928 FR2005001928W WO2006018534A1 WO 2006018534 A1 WO2006018534 A1 WO 2006018534A1 FR 2005001928 W FR2005001928 W FR 2005001928W WO 2006018534 A1 WO2006018534 A1 WO 2006018534A1
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WO
WIPO (PCT)
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wells
well
waveguide
excitation
transparent
Prior art date
Application number
PCT/FR2005/001928
Other languages
English (en)
Inventor
Claude Weisbuch
Maxime Rattier
Georges Olivier Reymond
Houtai Choumane
Original Assignee
Genewave
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genewave filed Critical Genewave
Priority to EP05793551A priority Critical patent/EP1774297A1/fr
Publication of WO2006018534A1 publication Critical patent/WO2006018534A1/fr
Priority to US11/627,043 priority patent/US20080056950A1/en

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    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
    • G—PHYSICS
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    • G01N2201/0826—Fibre array at source, distributing

Definitions

  • the invention relates to a device for detecting fluorescence emitted by chromophore elements contained in wells of a multiwell plate of the type used in biology and pharmacology.
  • Cells or molecules of biological interest contained in these wells can be specifically labeled with chromophore elements that emit fluorescence on a narrow wavelength band in response to light excitation on another narrow band of wavelengths. , the emitted fluorescence making it possible to highlight the marked cells or molecules or some of their properties.
  • an antibody can be detected on the surface of cells that are selected from the amount of fluorescent markers they have captured (screening technique).
  • DNA strands labeled on known complementary strands attached to the bottom of the wells of a multiwell plate can also be hybridized. In all cases, it is necessary to determine a quantity of fluorescent markers fixed at the bottom of the wells.
  • the bottoms of the wells are made of transparent material, which makes it possible to excite the fluorescent markers by means of a light beam which passes through the bottoms of the wells and a confocal scanning microscope is used.
  • a confocal scanning microscope is used to excite a point of the bottom of a well and to capture the fluorescence emitted by this point, with a very small depth of field which isolates this point from neighboring points in the well.
  • the sweep makes it possible to construct, point by point, an image of the internal surface of the bottom of the well or of a central zone of this surface.
  • Fluorescent markers present in large numbers in the liquid contained in the well determine a background level of the image, in relation to which the fluorescent markers of the cells or molecules attached to the bottom of the well form easily identifiable point spots.
  • This confocal scanning microscopy technique makes it possible to selectively separate the markers from the cells or molecules fixed on the bottom of the wells of the markers suspended in the liquid contained in the wells, but it is expensive and very slow.
  • the subject of the invention is a device for detecting fluorescence emitted by markers or chromophoric elements fixed on the transparent bottoms of the wells of a multi-well plate, this device not having the drawbacks of cost and slowness of microscopy. confocal scanning while retaining its advantages of selectivity.
  • a device for detecting fluorescence emitted by chromophore elements contained in wells of a multi-well plate this device comprising means for exciting the chromophore elements by a light beam passing through transparent walls of the plates.
  • each well means for limiting the zone crossed in each well by the light excitation beam with a thin layer situated on the transparent bottom of the well, in order to excite only the chromophore elements present in this thin layer, and means for sensing through these funds the fluorescence emitted by the chromophoric elements in response to this excitation, characterized in that the transparent bottom of each well of the plate has on its inner face, a waveguide whose core contains components emitting, in response to light excitation, radiation at the excitation wavelength of the chromophore elements cited.
  • the bottoms of the wells are thus illuminated by radiation at the excitation wavelength of the emitter components of the waveguide, this radiation being directed towards the waveguide through the transparent bottoms of the wells.
  • the excitation light radiation of the chromophore elements is emitted by the above-mentioned components of the waveguide and propagates in a guided mode which is very spatially selective and which excites only the chromophore elements located in the immediate vicinity of the waveguide. .
  • a peripheral portion of the waveguide in each well is covered with an opaque layer and a layer of transparent material is interposed between the waveguide and this opaque layer.
  • the central portion of the waveguide in each well is devoid of the aforementioned components emitting the excitation light radiation of the chromophore elements.
  • the refractive indices of the different layers used are chosen so that the refractive index of the transparent bottom of each well is preferably lower than the refractive index of the liquid contained in the well, the heart of the waveguide necessarily having a refractive index greater than these two indices but low enough to ensure good penetration of the guided wave in the liquid.
  • the various elements can be made of plastic or sol-gel.
  • the components included in the waveguide for emitting at the excitation wavelength of the chromophore elements may be organic molecules such as those used in dye lasers and organic light-emitting diodes, or the usual fluorophores in biology. These emitting components can also be used for inorganic materials such as quantum dots or rare earths.
  • the manufacture of these funds microplate wells can be made by etching, embossing, stamping, pressing, molding or machining of the aforementioned layers.
  • the central zone of the waveguide in each well does not comprise organic molecules forming the emitting components, one can start from a waveguide containing these organic molecules over its entire surface and illuminate it locally in ultraviolet light or in intense light to destroy the organic molecules found in the central zones of the bottoms of the wells.
  • the device comprises a set of photodetectors of the CCD, CMOS or similar type, and image forming means mounted between the plate and the set of photodetectors to form on this set the image. transparent funds from a plurality of wells.
  • the field of the image forming means and the size of the set of photodetectors may be a few centimeters, which makes it possible to reconstruct the image of a whole multiwell plate from a few images provided by the set of photodetectors.
  • This reconstruction requires the use of a low precision mechanics to ensure the positioning of the multiwell plate relative to the set of photodetectors and the recovery of images.
  • the resolution and accuracy of the images depend only on the accuracy and performance of the photodetector assembly.
  • this assembly and the associated image forming means may advantageously be constituted by the imaging system of a conventional digital camera of a conventional type or a scientific digital camera.
  • the device may also include a set of optical fiber bundles extending between the transparent bottoms of the plate wells and the image forming means, each optical fiber bundle of this assembly having a first end facing the a transparent bottom of a well and a second end placed facing the image forming means, the second ends of the optical fiber bundles being gathered together to form a single beam facing the image forming means.
  • Each bundle of fibers may comprise a few hundred fibers covering an area of a few square millimeters.
  • a composite image of the transparent bottoms of all the wells of a multiwell plate can be formed directly on the set of photodetectors.
  • the image of a portion of the wells of the plate is formed on the set of photodetectors and the plate is moved relative to the set of photodetectors in order to reconstitute a complete image from several different juxtaposed images.
  • means may be placed in the wells of the plate to limit the area crossed by the excitation beam of the chromophore elements, such as for example an opaque liquid contained in the wells of the plate and which limits the length of penetration excitation beam at a value typically less than 100 ⁇ m and for example between 1 and 10 ⁇ m.
  • This liquid can be rendered opaque by adding an opaque liquid compound or a soluble compound or a compound forming an opaque suspension or emulsion with the aforementioned liquid or a solid powdery compound which forms by decantation an opaque layer deposited on the bottoms of the wells.
  • the compound used may be milk, which has the advantage of being biocompatible with the contents of the wells of the plate, or a paint or an ink, it may also be composed of fine sand, very fine powder of silica or alumina, carbon black, glass microbeads or colloid.
  • this compound which is opposed to penetration of the excitation light beam of the chromophoric elements may be white, that is to say non-absorbent, or colored, for example to specifically absorb the wavelength of excitation of the chromophore elements or the wavelength on which the fluorescence of the chromophore elements is emitted in response to excitation, or it may be black to absorb all light radiation.
  • the compound When the compound is colored or black, it is ensured that the absorption of the excitation light radiation of the chromophoric elements does not result in a parasitic emission by the compound at the wavelength of the fluorescence emitted by the chromophore elements. , so as not to distort the measurements.
  • the opaque means placed in the wells to limit the penetration of the excitation light beam of the chromophoric elements may comprise a screen which is arranged or deposited on the bottom of each well and which covers at least a portion of this background.
  • this screen is associated with means for moving it in the well between an active position and an inactive position, the various screens being for example carried by a lid of the multiwell plate.
  • each screen may comprise a solid plate, or a lattice or a three-dimensional mesh of son or fibers of an opaque material, such as for example a plastic material that may be white, colored or black.
  • FIG. 1 is a schematic view from above of a well plate multiples of a standardized type
  • FIG. 2 is a schematic view on a larger scale and in section of a portion of this plate
  • FIG. 3 and 4 show schematically means for capturing the fluorescence emitted by chromophore elements located on the bottoms of the wells of the aforementioned plate;
  • FIG. 5 schematically represents opaque means placed in the wells of the plate to limit the penetration length of the excitation radiation of the chromophore elements
  • FIGS. 6 and 7 schematically represent means integrated in the bottoms of the wells to limit the penetration length of the excitation radiation of the chromophoric elements.
  • FIGS. 1 and 2 show diagrammatically a multiwell plate 10 of a standard type, used very commonly in biology and pharmacology, this plate 10 being made of molded plastic and having a large number of wells 12 available. matrix which are closed at their lower end by an insert plate 14 of transparent material, for example plastic material, glass or quartz. Alternatively, the plate 10 may be molded in one piece of transparent plastic material.
  • the plate 10 comprises 96 wells which have, according to the embodiments, an internal diameter of between 5 and
  • the cells or the molecules of biological interest contained in the wells 12 are fixed on the bottoms of these wells, that is to say on the transparent plate 14 and are detectable by excitation of fluorescent markers that they comprise or which are attached to these cells or molecules.
  • fluorescent markers can be of different types and will be referred to in what follows by the generic name of "chromophoric elements”.
  • the excitation of the chromophore elements of interest is carried out by illumination at a determined wavelength through the transparent bottoms of the wells. It is necessary to detect and capture the fluorescence emitted by the chromophore elements of interest, without taking into account that which is emitted by the very large amount of chromophore elements suspended in the liquid contained in the wells 12, this detection and capture must therefore be particularly selective.
  • CMOS complementary metal-oxide-semiconductor
  • An optical filter 20 is arranged in the image-forming means 18 to allow only a narrow band of wavelengths centered on the wavelength of the fluorescence emitted by the elements to pass to the photodetector assembly 10. chromophores fixed on the funds transparencies of wells 12.
  • the set 16 of photodetectors and the imaging means 18 are those of a conventional digital camera, commercially available or a scientific digital camera.
  • the group of transparent backgrounds of the wells 12 whose image is formed on the set 16 of photodetectors, is illuminated at the excitation wavelength of the chromophoric elements by a light beam
  • a source 24 such as a laser, a laser diode, a light emitting diode or any other suitable generator.
  • the source 24, the set 16 of photodetectors and the optical imaging means 18, 20 are mounted stationary while the plate 10 is carried by a suitable support not shown, which is horizontally movable in two perpendicular directions for moving the bottoms of the wells 12 above the means for detecting and capturing fluorescence, so as to be able to reconstruct a complete image of the bottoms of the wells 12 of the plate from some images provided by the set of photodetectors 16.
  • software makes it possible to select in the images provided by the set 16 of photodetectors the zones corresponding to the central portions of the transparent bottoms of the wells 12 and to process only the images of these central zones.
  • the system shown diagrammatically in FIG. 3 has the advantage of not depending on the type and the format of the plate 10 used and of allowing a very fast acquisition of the images of the interesting portions of the transparent bottoms of the wells 12 of a plate.
  • the means used to move the plate 10 relative to the set 16 of photodetectors can be automated in a simple manner and can operate with a low precision, of the order of one millimeter. They are therefore simple and inexpensive.
  • a set of optical fiber bundles 26 the first ends 28 of which are separated and oriented towards the transparent bottoms of the wells 12 of the plate 10 and whose second ends are brought together in a single beam facing the imaging means 18, 20 and the assembly 16 of photodetectors.
  • Each bundle 26 of optical fibers may comprise a few thousand optical fibers whose first ends are spaced apart from each other by a small distance, and distributed in a surface of a few square millimeters.
  • each end 28 of a bundle of optical fibers may be aligned on a central zone of a transparent bottom of a well 12 of the plate 10 to form an image of this zone on a part of the set 16 of photodetectors .
  • Focusing lenses 32 are arranged between the bottoms of the wells 12 and the first ends 28 of the bundles 26 of the optical fibers.
  • a separating plate 34 is placed in the means 18, between the filter 20 and the second ends 30 of the optical fiber bundles 26.
  • the number of bundles 26 of optical fibers may be sufficient to form directly and all at once on the set 16 of photodetectors a complete image of the transparent bottoms of the wells 12 of the plate 10.
  • FIG. 5 shows several means that can be placed in the wells 12 to limit the penetration length of the excitation beam of the chromophore elements.
  • the liquid 36 contained in the well 12a of the plate 10 is made opaque to the excitation beam 22 of the chromophore elements 38, by adding to this liquid a suitable compound, which can take very different forms. variety.
  • This compound may be liquid or soluble, inert or biocompatible with the cells or strands of DNA contained in the well 12a, and it is added to the well together with the chromophore elements 38. It may form a suspension or an emulsion in the liquid 36.
  • the penetration wavelength of the excitation beam 22 in the liquid 36 from the transparent bottom 14 of the well 12a is less than about 100 .mu.m and preferably of the order of 5 .mu.m to excite only the chromophore elements 38 of interest which are fixed on the transparent bottom of the well 12a.
  • a concentration of 10 to 100g per liter of skimmed milk powder or carbon black is appropriate.
  • the liquid 36 rendered opaque by this compound may be white, that is to say non-absorbent, or colored, to specifically absorb a wavelength corresponding to the excitation of the chromophoric elements 38 or the fluorescence emission by these chromophore elements, or black to absorb all wavelengths.
  • the penetration wavelength of the excitation beam As the penetration wavelength of the excitation beam
  • the chromophore elements contained in the liquid 36 above the transparent bottom of the well 12a are not excited and the means for capturing the fluorescence through the transparent bottom 14 receive only the fluorescence emitted by the chromophore elements of the cells or molecules of interest fixed on the bottom of the well.
  • the liquid 36 contained in the well 12b is added a powdery solid compound which does not dissolve and which descends on the bottom of the well by settling, until it forms an opaque layer covering partially or completely the cells fixed on the bottom of the well.
  • This compound may be fine sand, a very fine powder of silica or alumina, carbon black, a colloid, glass microbeads or the like. It can be diffusing or colored or reflective.
  • the compound When the compound is colored or black, it is ensured that the absorption of the excitation light 22 does not result in a parasitic emission at the wavelength of the fluorescence emitted by the chromophore elements 38.
  • a mesh, a glass or metal frit or a three-dimensional mesh 42 of yarns or fibers of an opaque material is deposited on the transparent bottom of the well 12c to limit the penetration length of the light
  • the trellis, sintered mesh or mesh 42 allows a circulation of the liquid 36 while forming a screen opaque to the propagation of the excitation light 22.
  • the trellis or the mesh is preferably made in one embodiment. plastic material that can be white, black or colored.
  • This mesh, frit or mesh 42 is advantageously connected by a rigid rod 44 to a cover 46 placed on the top of the plate 10.
  • the means placed in the well 12d to limit the propagation of the excitation light 22 are formed by a piston 48 whose rod 50 is fixed to the aforementioned lid 46 and whose opaque lower surface may be white for backscattering the light or black or reflective thanks to the integration of a mirror, constituted for example by a metal layer protected by a layer of plastic or dielectric material, the mirror can also be made by a stack of dielectric layers or again by a layer of plastic material.
  • the lower end of the piston 48 has fingers or projections forming a spacer and making it possible to place the lower face of the piston at a predetermined distance from the transparent bottom of the well 12d, this distance being for example of the order of 10 ⁇ m.
  • the means placed in the well 12e are formed by a cylinder 52 carried by the cover 46 and whose lower end comprises point or quasi-point support means on the transparent bottom of the well 12e, to leave a thin layer of liquid between the lower end of the cylinder 52 and the transparent bottom 14 of the well 12e, this thin layer having for example a thickness of about 10 .mu.m.
  • the underside of the cylinder 52 which is opaque to the excitation light 22 may be white, colored, black or reflective.
  • Figures 6 and 7 show the means which according to the invention are integrated in the bottoms of the wells 12 to limit the penetration length inside these wells of the excitation light of the chromophore elements.
  • the transparent plate 14 forming the bottoms of the wells 12 has, on its face located inside the wells, a waveguide 54 whose core contains chromophore components 56 different from the elements.
  • chromophores 38 for labeling cells or molecules. These components 56 have a excitation wavelength which is less than the excitation wavelength of the aforementioned chromophoric elements 38 and they have an emission wavelength which is equal to the excitation wavelength of the chromophoric elements 38 which themselves emit fluorescence at a higher wavelength.
  • the guided mode corresponds to a significant fraction of the light emission by the components 56, this fraction generally being greater than 10%.
  • the central portion of the waveguide 54 in the well 12 does not contain emitter components 56, this central portion typically having a radius of the order of 1 millimeter.
  • the direct emission E at the excitation wavelength of the chromophore elements 38 therefore only concerns the peripheral portion of the waveguide in the well 12 and only lightens the central zone of the well, while the guided wave in the waveguide 54 reaches the central zone of this waveguide and excites the chromophore elements 38 which are fixed on this central part or which are immediately adjacent thereto.
  • the peripheral surface of the waveguide 54 in the well 12 is masked by an annular layer 60 of opaque material which stops the direct light emission by the emitter components 56 contained in the heart of the waveguide.
  • a transparent layer 62 separates the waveguide 54 from the opaque annular layer 60 so as not to absorb the guided wave.
  • the emitter components 56 may be organic molecules such as those used in dye lasers (rhodamine, coumarin), in organic light-emitting diodes (copolymers such as Alq3), or the usual fluorophores such as Cyanine-3, Cyanine-5 or
  • Emitting components 56 may also be used for inorganic materials such as quantum dots or rare earths.
  • the refractive index of the transparent bottom 14 is preferably lower than that of the liquid 36 and the heart of the waveguide 54 must have a higher index than those of the bottom 14 and the liquid 36. It is also necessary that this index of refraction is relatively low to ensure good penetration of the guided wave in the liquid 36.
  • the effective index is chosen to obtain optimal penetration corresponding to the thickness of a cell (about 1 ⁇ m) or a molecule (thickness less than 0.1 ⁇ m).
  • the thickness of the guiding layer is approximately 1 ⁇ m and is chosen to ensure good absorption of the excitation light 58 and to constitute a guide with a low number of modes, and preferably in a single mode.
  • each well 12 it is advantageous to use organic molecules as emitting components and to eliminate them locally from the waveguide 54 by exposure to a light. ultraviolet or intense light.
  • FIG. 7 can advantageously be realized with multi-well plates whose bottoms are opaque and each have an opening of a diameter for example of the order of 2 millimeters. It is then sufficient to stick on the bottoms of the wells a composite plastic film which contains the waveguide with emitting components formed by organic molecules, then to illuminate the wells in ultraviolet light to destroy the emitting components which are at the same time. inside the bottom holes of the wells.
  • the refractive index of the transparent bottom 14 of the wells is equal to 1.3, that of the liquid 36 is equal to 1.35 and that of the core of the waveguide 54 is equal to 1, 4. In a variant, the refractive index of the bottom 14 is equal to 1.4, that of the liquid 36 to 1.35 and that of the core of the waveguide to 1.45.
  • the multiwell plate is made of polystyrene, polypropylene, polyvinyl chloride or acrylic polymer.
  • the multilayer composite that can be used in the embodiments of FIGS. 6 and 7 is made of glass, quartz, or transparent dielectric materials or plastic materials such as polystyrene, polypropylene, polyvinyl chloride, an acrylic polymer, polyethylene, polycarbonate or polyolefin in general.

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Abstract

Dispositif de détection de la fluorescence émise par des éléments chromophores contenus dans des puits d'une plaque à puits multiples, ce dispositif comprenant des moyens intégrés (54,56) dans les fonds transparents des puits (12) de la plaque (10) pour limiter la longueur de pénétration dans les puits d'un faisceau lumineux d'excitation des éléments chromophores (38) fixés sur les fonds (14) des puits.

Description

DISPOSITIF DE DETECTION DE LA FLUORESCENCE
EMISE PAR DES ELEMENTS CHROMOPHORES DANS DES PUITS D'UNE PLAQUE A PUITS MULTIPLES
L'invention concerne un dispositif de détection de la fluorescence émise par des éléments chromophores contenus dans des puits d'une plaque à puits multiples du type utilisé en biologie et en pharmacologie.
Ces plaques normalisées comprennent un nombre important de puits à disposition matricielle et sont manipulables par des robots qui y déposent des quantités prédéterminées de liquides pour des réactions de dosage d'échantillons, d'hybridation d'ADN, etc.
Les cellules ou les molécules d'intérêt biologique contenues dans ces puits peuvent être spécifiquement marquées par des éléments chromophores qui émettent une fluorescence sur une bande étroite de longueurs d'onde en réponse à une excitation lumineuse sur une autre bande étroite de longueurs d'onde, la fluorescence émise permettant de mettre en évidence les cellules ou molécules marquées ou certaines de leurs propriétés. On peut par exemple détecter un anticorps à la surface de cellules qui sont sélectionnées à partir de la quantité de marqueurs fluorescents qu'elles ont capturés (technique du criblage). On peut aussi hybrider des brins d'ADN marqués sur des brins complémentaires connus fixés au fond des puits d'une plaque à puits multiples. Dans tous les cas, il faut déterminer une quantité de marqueurs fluorescents fixés au fond des puits. Pour cela, dans une technique connue, les fonds des puits sont réalisés en matière transparente, ce qui permet d'exciter les marqueurs fluorescents au moyen d'un faisceau lumineux qui passe à travers les fonds des puits et on utilise un microscope confocal à balayage pour exciter un point du fond d'un puits et capter la fluorescence émise par ce point, avec une très faible profondeur de champ qui isole ce point des points voisins dans le puits. Le balayage permet de construire point par point une image de la surface interne du fond du puits ou d'une zone centrale de cette surface. Les marqueurs fluorescents présents en grand nombre dans le liquide contenu dans le puits déterminent un niveau de fond de l'image, par rapport auquel les marqueurs fluorescents des cellules ou molécules fixées au fond du puits forment des taches ponctuelles facilement identifiables.
Cette technique de microscopie confocale à balayage permet bien de séparer sélectivement les marqueurs des cellules ou molécules fixées sur le fond des puits des marqueurs en suspension dans le liquide contenu dans les puits, mais elle est coûteuse et très lente.
L'invention a pour objet un dispositif de détection de la fluorescence émise par des marqueurs ou éléments chromophores fixés sur les fonds transparents des puits d'une plaque à puits multiples, ce dispositif ne présentant pas les inconvénients de coût et de lenteur de la microscopie confocale à balayage tout en conservant ses avantages de sélectivité.
Elle propose à cet effet un dispositif de détection de la fluorescence émise par des éléments chromophores contenus dans des puits d'une plaque à puits multiples, ce dispositif comprenant des moyens pour exciter les éléments chromophores par un faisceau lumineux passant à travers des parois transparentes des puits, des moyens pour limiter la zone traversée dans chaque puits par le faisceau lumineux d'excitation à une couche mince située sur le fond transparent du puits, afin d'exciter seulement les éléments chromophores présents dans cette couche mince, et des moyens pour capter à travers ces fonds la fluorescence émise par les éléments chromophores en réponse à cette excitation, caractérisé en ce que le fond transparent de chaque puits de la plaque comporte sur sa face interne, un guide d'onde dont le coeur contient des composants émettant, en réponse à une excitation lumineuse, un rayonnement à la longueur d'onde d'excitation des éléments chromophores précités. Les fonds des puits sont ainsi éclairés par un rayonnement à la longueur d'onde d'excitation des composants émetteurs du guide d'onde, ce rayonnement étant dirigé vers le guide d'onde à travers les fonds transparents des puits.
Le rayonnement lumineux d'excitation des éléments chromophores est émis par les composants précités du guide d'onde et se propage dans un mode guidé qui est très sélectif spatialement et qui n'excite que les éléments chromophores situés au voisinage immédiat du guide d'onde.
Avantageusement, une partie périphérique du guide d'onde dans chaque puits est recouverte d'une couche opaque et une couche de matière transparente est interposée entre le guide d'onde et cette couche opaque.
De préférence, la partie centrale du guide d'onde dans chaque puits est dépourvue des composants précités émettant le rayonnement lumineux d'excitation des éléments chromophores.
Les indices de réfraction des différentes couches utilisées sont choisis pour que l'indice de réfraction du fond transparent de chaque puits soit de préférence inférieur à l'indice de réfraction du liquide contenu dans le puits, le cœur du guide d'onde ayant nécessairement un indice de réfraction supérieur à ces deux indices mais suffisamment bas pour assurer une bonne pénétration de l'onde guidée dans le liquide. Dans cette forme de réalisation, les différents éléments sont réalisables en matière plastique ou par voie sol-gel. Les composants inclus dans le guide d'onde pour émettre à la longueur d'onde d'excitation des éléments chromophores peuvent être des molécules organique telles que celles utilisées dans les lasers à colorant et les diodes électroluminescentes organiques, ou les fluorophores usuels en biologie. On peut également utiliser pour ces composants émetteurs des matériaux inorganiques tels que des boîtes quantiques ou des terres rares.
La fabrication de ces fonds de puits de microplaques peut être faite par gravure, embossage, estampage, pressage, moulage ou usinage des couches précitées. Dans le cas où la zone centrale du guide d'onde dans chaque puits ne comprend pas de molécules organiques formant les composants émetteurs, on peut partir d'un guide d'onde contenant ces molécules organiques sur toute sa surface et l'éclairer localement en lumière ultraviolette ou en lumière intense pour détruire les molécules organiques se trouvant dans les zones centrales des fonds des puits. Selon une autre caractéristique de l'invention, le dispositif comprend un ensemble de photodétecteurs du type CCD, CMOS ou analogue, et des moyens de formation d'image montés entre la plaque et l'ensemble de photodétecteurs pour former sur cet ensemble l'image des fonds transparents d'une pluralité de puits. Le champ des moyens de formation d'image et la taille de l'ensemble de photodétecteurs peuvent être de quelques centimètres, ce qui permet de reconstituer l'image de toute une plaque à puits multiples à partir de quelques images fournies par l'ensemble de photodétecteurs. Cette reconstitution nécessite l'utilisation d'une mécanique de faible précision pour assurer le positionnement de la plaque à puits multiples par rapport à l'ensemble de photodétecteurs et le recouvrement des images. La résolution et la précision des images ne dépendent que de la précision et des performances de l'ensemble de photodétecteurs. Par ailleurs, cet ensemble et les moyens associés de formation d'image peuvent avantageusement être constitués par le système imageur d'un appareil photographique numérique d'un type classique disponible dans le commerce ou d'une caméra numérique scientifique.
Le dispositif peut également comprendre un ensemble de faisceaux de fibres optiques s'étendant entre les fonds transparents des puits de la plaque et les moyens de formation d'image, chaque faisceau de fibres optiques de cet ensemble ayant une première extrémité placée en regard d'un fond transparent d'un puits et une seconde extrémité placée en regard des moyens de formation d'image, les secondes extrémités des faisceaux de fibres optiques étant rassemblées entre elles pour former un faisceau unique en regard des moyens de formation d'image.
Chaque faisceau de fibres peut comporter quelques centaines de fibres couvrant une surface de quelques millimètres carrés. En utilisant un nombre suffisant de faisceaux de fibres, on peut former directement sur l'ensemble de photodétecteurs une image composite des fonds transparents de tous les puits d'une plaque à puits multiples. En variante, on forme sur l'ensemble de photodétecteurs l'image d'une partie des puits de la plaque et on déplace la plaque par rapport à l'ensemble de photodétecteurs pour reconstituer une image complète à partir de plusieurs images différentes juxtaposées.
Dans tous les cas, l'acquisition des images des fonds transparents des puits d'une plaque à puits multiples est bien plus rapide que dans la technique antérieure à microscopie confocale à balayage.
Eventuellement, des moyens peuvent être placés dans les puits de la plaque pour limiter la zone traversée par le faisceau d'excitation des éléments chromophores, tels par exemple qu'un liquide opaque contenu dans les puits de la plaque et qui limite la longueur de pénétration du faisceau d'excitation à une valeur typiquement inférieure à 100μm et par exemple comprise entre 1 et 10μm.
Ce liquide peut être rendu opaque par addition d'un composé liquide opaque ou bien d'un composé soluble ou encore d'un composé formant une suspension ou une émulsion opaque avec le liquide précité ou encore d'un composé solide pulvérulent qui forme par décantation une couche opaque déposée sur les fonds des puits.
Le composé utilisé peut être du lait, qui a l'avantage d'être biocompatible avec les contenus des puits de la plaque, ou une peinture ou une encre, il peut également être composé de sable fin, de poudre très fine de silice ou d'alumine, de noir de carbone, de microbilles de verre ou d'un colloïde.
De façon générale, ce composé qui s'oppose à la pénétration du faisceau lumineux d'excitation des éléments chromophores, peut être blanc, c'est-à-dire non absorbant, ou coloré, par exemple pour absorber spécifiquement la longueur d'onde d'excitation des éléments chromophores ou bien la longueur d'onde sur laquelle est émise la fluorescence des éléments chromophores en réponse à l'excitation, ou bien il peut être noir pour absorber tous les rayonnements lumineux.
Lorsque ce composé est blanc, la rétrodiffusion par ce composé du faisceau lumineux d'excitation se traduit par une augmentation de l'excitation des éléments chromophores et par une augmentation de la fluorescence émise, celle-ci étant elle-même rétrodiffusée vers les moyens précités de captation.
Lorsque le composé est coloré ou noir, on veille à ce que l'absorption du rayonnement lumineux d'excitation des éléments chromophores ne se traduise pas par une émission parasite par le composé à la longueur d'onde de la fluorescence émise par les éléments chromophores, afin de ne pas fausser les mesures.
Dans une autre forme de réalisation, les moyens opaques placés dans les puits pour limiter la pénétration du faisceau lumineux d'excitation des éléments chromophores peuvent comprendre un écran qui est disposé ou déposé sur le fond de chaque puits et qui recouvre au moins une partie de ce fond.
Avantageusement, cet écran est associé à des moyens permettant de le déplacer dans le puits entre une position active et une position inactive, les différents écrans étant par exemple portés par un couvercle de la plaque à puits multiples.
De façon pratique, chaque écran peut comporter une plaque pleine, ou bien un treillis ou un maillage tridimensionnel de fils ou de fibres d'une matière opaque, telle par exemple qu'une matière plastique qui peut être blanche, colorée ou noire.
L'invention sera mieux comprise et d'autres caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement à la lecture de la description qui suit, faite à titre d'exemple en référence aux dessins annexés dans lesquels :
- la figure 1 est une vue schématique de dessus d'une plaque à puits multiples d'un type normalisé ;
- la figure 2 est une vue schématique à plus grande échelle et en coupe d'une partie de cette plaque ;
- les figures 3 et 4 représentent schématiquement des moyens de captation de la fluorescence émise par des éléments chromophores situés sur les fonds des puits de la plaque précitée ;
- la figure 5 représente schématiquement des moyens opaques placés dans les puits de la plaque pour limiter la longueur de pénétration du rayonnement d'excitation des éléments chromophores ; - les figures 6 et 7 représentent schématiquement des moyens intégrés dans les fonds des puits pour limiter la longueur de pénétration du rayonnement d'excitation des éléments chromophores.
On a représenté schématiquement aux figures 1 et 2 une plaque 10 à puits multiples d'un type normalisé, utilisée de façon très courante en biologie et en pharmacologie, cette plaque 10 étant réalisée en plastique moulé et comportant un grand nombre de puits 12 à disposition matricielle qui sont fermés à leur extrémité inférieure par une plaque rapportée 14 en matériau transparent, par exemple en matériau plastique, en verre ou en quartz. En variante, la plaque 10 peut être moulée d'une seule pièce en matériau plastique transparent.
Dans l'exemple représenté, la plaque 10 comprend 96 puits qui ont typiquement, selon les réalisations, un diamètre interne compris entre 5 et
8 millimètres, une profondeur comprise entre 1 et 10 millimètres et qui sont séparés les uns des autres d'une distance égale à 2,25 ou 4,5 ou 9 millimètres, les puits 12 étant cylindriques ou légèrement tronconiques comme représenté schématiquement en figure 2.
Ces plaques normalisées sont manipulées par des robots qui déposent dans les puits 12 des quantités prédéterminées de liquides (échantillons, réactifs, solutions de lavage et de rinçage, etc.) pour réaliser des réactions de dosage enzymatique ou immunologique, des hybridations d'ADN, etc.
Les cellules ou les molécules d'intérêt biologique contenues dans les puits 12 sont fixées sur les fonds de ces puits, c'est-à-dire sur la plaque transparente 14 et sont repérables par excitation de marqueurs fluorescents qu'elles comportent ou qui sont fixés sur ces cellules ou molécules. Ces marqueurs peuvent être de différents types et seront désignés dans ce qui suit par l'appellation générique d'« éléments chromophores ».
Dans la pratique, on se contente en général de détecter et de dénombrer les éléments chromophores qui se trouvent sur une zone centrale du fond de chaque puits 12, cette zone centrale ayant typiquement un rayon de l'ordre du millimètre.
L'excitation des éléments chromophores d'intérêt est réalisée par éclairage à une longueur d'onde déterminée à travers les fonds transparents des puits 12. Il faut détecter et capter la fluorescence émise par les éléments chromophores d'intérêt, sans prendre en compte celle qui est émise par la très grande quantité d'éléments chromophores en suspension dans le liquide contenu dans les puits 12, cette détection et cette captation devant donc être particulièrement sélectives. Les moyens de détection et de captation représentés schématiquement en figure 3 comprennent un ensemble 16 de photodétecteurs du type CCD, CMOS ou analogue, qui sont de préférence à disposition matricielle et qui sont placés sous le fond transparent 14 de la plaque 10, l'ensemble 16 de photodétecteurs ayant des dimensions qui sont par exemple de quelques centimètres carrés et étant associé à des moyens 18 de formation d'image permettant de former sur l'ensemble 16 de photodétecteurs l'image de plusieurs fonds de puits 12 de la plaque 10. Un filtre optique 20 est agencé dans les moyens 18 de formation d'image pour ne laisser passer vers l'ensemble de photodétecteurs 10 qu'une bande étroite de longueurs d'onde centrée sur la longueur d'onde de la fluorescence émise par les éléments chromophores fixés sur les fonds transparents des puits 12.
Avantageusement, l'ensemble 16 de photodétecteurs et les moyens 18 de formation d'image sont ceux d'un appareil photographique numérique classique, disponible dans le commerce ou d'une caméra numérique scientifique.
Le groupe de fonds transparents des puits 12 dont l'image est formée sur l'ensemble 16 de photodétecteurs, est éclairé à la longueur d'onde d'excitation des éléments chromophores par un faisceau lumineux
22 généré par une source 24 telle qu'un laser, une diode laser, une diode électroluminescente ou tout autre générateur approprié.
De préférence, la source 24, l'ensemble 16 de photodétecteurs et les moyens optiques 18, 20 de formation d'image sont montés à poste fixe tandis que la plaque 10 est portée par un support approprié non représenté, qui est mobile horizontalement dans deux directions perpendiculaires pour déplacer les fonds des puits 12 au-dessus des moyens de détection et de captation de fluorescence, de façon à pouvoir reconstituer une image complète des fonds des puits 12 de la plaque à partir de quelques images fournies par l'ensemble de photodétecteurs 16.
Avantageusement, un logiciel permet de sélectionner dans les images fournies par l'ensemble 16 de photodétecteurs les zones correspondant aux parties centrales des fonds transparents des puits 12 et de ne traiter que les images de ces zones centrales.
Le système représenté schématiquement en figure 3 présente l'avantage de ne pas dépendre du type et du format de la plaque 10 utilisée et de permettre une acquisition très rapide des images des parties intéressantes des fonds transparents des puits 12 d'une plaque.
Les moyens utilisés pour déplacer la plaque 10 par rapport à l'ensemble 16 de photodétecteurs peuvent être automatisés de façon simple et peuvent fonctionner avec une précision faible, de l'ordre d'un millimètre. Ils sont donc de réalisation simple et peu coûteuse.
Dans la réalisation représentée schématiquement en figure 4, on associe à l'ensemble 16 de photodétecteurs et aux moyens 18, 20 de formation d'image placés sous la plaque 10, un ensemble de faisceaux 26 de fibres optiques dont les premières extrémités 28 sont séparées et orientées vers les fonds transparents des puits 12 de la plaque 10 et dont les secondes extrémités sont rassemblées en un faisceau unique orienté vers les moyens 18, 20 de formation d'image et l'ensemble 16 de photodétecteurs.
Chaque faisceau 26 de fibres optiques peut comprendre quelques milliers de fibres optiques dont les premières extrémités sont espacées les unes des autres d'une distance faible, et réparties dans une surface de quelques millimètres carrés. Ainsi, chaque extrémité 28 d'un faisceau de fibres optiques peut être alignée sur une zone centrale d'un fond transparent d'un puits 12 de la plaque 10 pour former une image de cette zone sur une partie de l'ensemble 16 de photodétecteurs. Des lentilles de focalisation 32 sont agencées entre les fonds des puits 12 et les premières extrémités 28 des faisceaux 26 des fibres optiques.
Lorsque l'éclairage des fonds transparents des puits 12 pour l'excitation des éléments chromophores d'intérêt est assuré par un faisceau lumineux 22 que l'on fait passer par les faisceaux 26 de fibres optiques, une lame séparatrice 34 est placée dans les moyens 18 de formation d'image, entre le filtre 20 et les secondes extrémités 30 des faisceaux 26 de fibres optiques.
Le nombre de faisceaux 26 de fibres optiques peut être suffisant pour former directement et en une seule fois sur l'ensemble 16 de photodétecteurs une image complète des fonds transparents des puits 12 de la plaque 10.
En variante, au moyen de l'ensemble de faisceaux 26 de fibres optiques, on ne forme sur l'ensemble 16 de photodétecteurs que l'image d'une partie des fonds transparents des puits 12 de la plaque 10 et on déplace cette plaque horizontalement au-dessus des faisceaux 28 de fibres optiques comme déjà décrit pour le mode de réalisation de la figure 3, afin de reconstituer une image complète des fonds des puits 12 de la plaque à partir de plusieurs images fournies par l'ensemble 16 de photodétecteurs. Comme représenté en figure 3, les fonds des puits sont alors éclairés par un faisceau lumineux 22 extérieur aux faisceaux 28 de fibres optiques. On a représenté en figure 5 plusieurs moyens qui peuvent être placés dans les puits 12 pour y limiter la longueur de pénétration du faisceau 20 d'excitation des éléments chromophores.
Dans une première forme de réalisation, le liquide 36 contenu dans le puits 12a de la plaque 10 est rendu opaque au faisceau 22 d'excitation des éléments chromophores 38, par addition à ce liquide d'un composé approprié, qui peut prendre des formes très diverses.
Ce composé peut être liquide ou soluble, inerte ou biocompatible avec les cellules ou les brins d'ADN contenus dans le puits 12a, et il est ajouté dans le puits en même temps que les éléments chromophores 38. Il peut former une suspension ou une émulsion dans le liquide 36.
Il est par exemple constitué d'une encre, d'une peinture, d'un hydrolisat de protéines ou de lait, la concentration et les caractéristiques du composé étant déterminées pour que la longueur d'onde de pénétration du faisceau d'excitation 22 dans le liquide 36 depuis le fond transparent 14 du puits 12a soit inférieure à 100 μm environ et de préférence de l'ordre de 5μm pour n'exciter que les éléments chromophores 38 d'intérêt qui sont fixés sur le fond transparent du puit 12a. Par exemple, une concentration de 10 à 100g par litre de lait écrémé en poudre ou de noir de carbone est appropriée. Le liquide 36 rendu opaque par ce composé peut être blanc, c'est-à- dire non absorbant, ou coloré, pour absorber spécifiquement une longueur d'onde correspondant à l'excitation des éléments chromophores 38 ou à l'émission de fluorescence par ces éléments chromophores, ou encore noir pour absorber toutes les longueurs d'onde. Comme la longueur d'onde de pénétration du faisceau d'excitation
22 dans le liquide est très faible et par exemple du même ordre de grandeur que l'épaisseur d'une cellule (environ 1 μm), les éléments chromophores contenus dans le liquide 36 au-dessus du fond transparent du puits 12a ne sont pas excités et les moyens de captation de la fluorescence à travers le fond transparent 14 ne reçoivent que la fluorescence émise par les éléments chromophores des cellules ou des molécules d'intérêt fixées sur le fond du puits.
Dans une variante, on ajoute au liquide 36 contenu dans le puits 12b un composé solide pulvérulent qui ne se dissout pas et qui descend sur le fond du puit par décantation, jusqu'à former une couche opaque recouvrant partiellement ou complètement les cellules fixées sur le fond du puit.
Ce composé peut être du sable fin, une poudre très fine de silice ou d'alumine, du noir de carbone, un colloïde, des microbilles de verre ou analogues. Il peut être diffusant ou coloré ou réfléchissant.
Lorsque ce composé est blanc, la rétrodiffusion de la lumière 22 d'excitation des éléments chromophores se traduit par une augmentation de cette excitation et donc par une augmentation de la fluorescence émise, qui est elle-même rétrodiffusée vers les moyens précités de captation.
Lorsque le composé est coloré ou noir, on veille à ce que l'absorption de la lumière 22 d'excitation ne se traduise pas par une émission parasite à la longueur d'onde de la fluorescence émise par les éléments chromophores 38.
Dans une autre forme de réalisation, un treillis, un fritte de verre ou de métal ou un maillage tridimensionnel 42 de fils ou de fibres d'une matière opaque est déposé sur le fond transparent du puits 12c pour limiter la longueur de pénétration de la lumière 22 d'excitation des éléments chromophores 38. Le treillis, fritte ou maillage 42 permet une circulation du liquide 36 tout en formant un écran opaque à la propagation de la lumière d'excitation 22. Le treillis ou le maillage est réalisé de préférence en une matière plastique qui peut être blanche, noire ou colorée. Ce treillis, fritte ou maillage 42 est avantageusement relié par une tige rigide 44 à un couvercle 46 posé sur le dessus de la plaque 10. Dans une autre forme de réalisation, les moyens placés dans le puits 12d pour limiter la propagation de la lumière d'excitation 22 sont formés par un piston 48 dont la tige 50 est fixée au couvercle 46 précité et dont la surface inférieure opaque peut être blanche pour rétrodiffuser la lumière ou bien noire ou encore réfléchissante grâce à l'intégration d'un miroir, constitué par exemple par une couche métallique protégée par une couche de matière plastique ou diélectrique, le miroir pouvant également être réalisé par un empilement de couches diélectriques ou encore par une couche de matière plastique. L'extrémité inférieure du piston 48 comporte des doigts ou des saillies formant entretoise et permettant de placer la face inférieure du piston à une distance prédéterminée du fond transparent du puits 12d, cette distance étant par exemple de l'ordre de 10μm.
Dans encore une autre forme de réalisation, lès moyens placés dans le puits 12e sont formés par un cylindre 52 porté par le couvercle 46 et dont l'extrémité inférieure comporte des moyens d'appui ponctuels ou quasi ponctuels sur le fond transparent du puits 12e, pour laisser subsister une couche mince de liquide entre l'extrémité inférieure du cylindre 52 et le fond transparent 14 du puits 12e, cette couche mince ayant par exemple une épaisseur de 10μm environ. Comme déjà décrit pour le piston 48, la face inférieure du cylindre 52 qui est opaque à la lumière d'excitation 22, peut être blanche, colorée, noire ou réfléchissante.
Les figures 6 et 7 représentent les moyens qui sont selon l'invention intégrés dans les fonds des puits 12 pour limiter la longueur de pénétration à l'intérieur de ces puits de la lumière d'excitation des éléments chromophores.
Dans la forme de réalisation de la figure 6, la plaque transparente 14 formant les fonds des puits 12 comporte, sur sa face située à l'intérieur des puits, un guide d'onde 54 dont le cœur contient des composants chromophores 56 différents des éléments chromophores 38 servant au marquage des cellules ou des molécules. Ces composants 56 ont une longueur d'onde d'excitation qui est inférieure à la longueur d'onde d'excitation des éléments chromophores 38 précités et ils ont une longueur d'onde d'émission qui est égale à la longueur d'onde d'excitation des éléments chromophores 38 qui émettent eux-mêmes une fluorescence à une longueur d'onde supérieure.
Ainsi, lorsque le fond transparent 14 du puits 12 en figure 6 est éclairé par une lumière 58 à la longueur d'onde d'excitation des composants 56 du cœur du guide d'onde 54, ces composants 56 émettent sur la longueur d'onde d'excitation des éléments chromophores 38. Cette émission est en partie dirigée directement vers le liquide 36 contenu dans le puits 12 comme indiqué par la flèche E en traits pointillés, et en partie guidée dans le guide d'onde 14, cette émission guidée étant très sélective et n'excitant que les éléments chromophores 38 qui sont sur le guide d'onde 54 ou à son voisinage immédiat, c'est-à-dire à une distance inférieure à 1 μm, en fonction de la pénétration de l'onde guidée dans le liquide 36.
Le mode guidé correspond à une fraction notable de l'émission lumineuse par les composants 56, cette fraction étant en général supérieure à 10%. De façon avantageuse, on prévoit que la partie centrale du guide d'onde 54 dans le puits 12 ne contient pas de composants émetteurs 56, cette partie centrale ayant typiquement un rayon de l'ordre de 1 millimètre. L'émission directe E à la longueur d'onde d'excitation des éléments chromophores 38 n'intéresse donc que la partie périphérique du guide d'onde dans le puits 12 et n'éclaire que marginalement la zone centrale du puits, tandis que l'onde guidée dans le guide d'onde 54 parvient dans la zone centrale de ce guide d'onde et excite les éléments chromophores 38 qui sont fixés sur cette partie centrale ou qui en sont immédiatement voisins. Dans la forme de réalisation de la figure 7, la surface périphérique du guide d'onde 54 dans le puits 12 est masquée par une couche annulaire 60 de matière opaque qui arrête l'émission lumineuse directe par les composants émetteurs 56 contenus au cœur du guide d'onde. Une couche transparente 62 sépare le guide d'onde 54 de la couche annulaire opaque 60 pour ne pas absorber l'onde guidée. Le guide d'onde 54, la couche transparente 62 et la couche opaque
60 sont de préférence en matériaux plastiques ou sont réalisés par voie sol-gel. Les composants émetteurs 56 peuvent être des molécules organiques telles que celles utilisées dans les lasers à colorant (rhodamine, coumarin), dans les diodes électroluminescentes organiques (copolymères tels que Alq3), ou les fluorophores usuels tels que Cyanine-3, Cyanine-5 ou
Alexa. On peut aussi utiliser pour les composants émetteurs 56 des matériaux inorganiques tels que des boîtes quantiques ou des terres rares.
L'indice de réfraction du fond transparent 14 est de préférence inférieur à celui du liquide 36 et le cœur du guide d'onde 54 doit avoir un indice supérieur à ceux du fond 14 et du liquide 36. Il faut par ailleurs que cet indice de réfraction soit relativement bas pour assurer une bonne pénétration de l'onde guidée dans le liquide 36. L'indice effectif est choisi pour obtenir une pénétration optimale correspondant à l'épaisseur d'une cellule (environ 1μm) ou d'une molécule (épaisseur inférieure à 0,1 μm). L'épaisseur de la couche guidante est d'environ 1 μm et est choisie pour assurer une bonne absorption de la lumière d'excitation 58 et pour constituer un guide à faible nombre de modes, et de préférence à un seul mode.
Les diverses couches précitées peuvent être gravées, embossées, estampées, pressées, moulées ou usinées.
Pour que la zone centrale du guide d'onde 54 dans chaque puits 12 ne comprenne pas de composants émetteurs, il est avantageux d'utiliser des molécules organiques comme composants émetteurs et de les éliminer localement du guide d'onde 54 par exposition à une lumière ultraviolette ou une lumière intense.
Le mode de réalisation de la figure 7 peut avantageusement être réalisé avec des plaques à puits multiples dont les fonds sont opaques et comportent chacun une ouverture d'un diamètre par exemple de l'ordre de 2 millimètres. Il suffit alors de coller sur les fonds des puits un film plastique composite qui contient le guide d'onde avec des composants émetteurs formés par des molécules organiques, puis d'éclairer les puits en lumière ultraviolette pour détruire les composants émetteurs qui sont à l'intérieur des trous des fonds des puits.
Dans un mode de réalisation particulier, l'indice de réfraction du fond transparent 14 des puits est égal à 1 ,3, celui du liquide 36 est égal à 1,35 et celui du cœur du guide d'onde 54 est égal à 1 ,4. Dans une variante, l'indice de réfraction du fond 14 est égal à 1 ,4, celui du liquide 36 à 1 ,35 et celui du cœur du guide d'onde à 1 ,45. La plaque à puits multiples est en polystyrène, en polypropylène, en chlorure de polyvinyle ou en polymère acrylique. Le composite multicouches utilisable dans les formes de réalisation des figures 6 et 7 est en verre, en quartz, ou en matériaux transparents diélectriques ou en matériaux plastiques tels que du polystyrène, du polypropylène, du chlorure de polyvinyle, un polymère acrylique, du polyéthylène, un polycarbonate ou une polyoléfine en général.

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif de détection de la fluorescence émise par des éléments chromophores (38) contenus dans des puits (12) d'une plaque (10) à puits multiples, ce dispositif comprenant des moyens pour exciter les éléments chromophores par un faisceau lumineux passant à travers les fonds transparents (14) des puits (12), des moyens pour limiter la zone traversée dans chaque puits par le faisceau lumineux (22) d'excitation à une couche mince située sur le fond transparent (14) du puits, afin d'exciter seulement les éléments chromophores (38) présents dans cette couche mince et des moyens pour capter à travers ces fonds la fluorescence émise par les éléments chromophores (38) en réponse à cette excitation, caractérisé en ce que le fond transparent (14) de chaque puits (12) comporte sur sa face interne un guide d'onde (54) dont le cœur contient des composants (56) émettant en réponse à une excitation lumineuse un rayonnement à la longueur d'onde d'excitation des éléments chromophores (38) précités et en ce que les moyens d'excitation précités émettent un rayonnement à la longueur d'onde d'excitation des composants (56) du guide d'onde, ce rayonnement étant dirigé vers le guide d'onde à travers le fond transparent (14) du puits (12).
2. Dispositif selon la revendication 1 , caractérisé en ce que la longueur d'onde d'excitation des composants (56) du guide d'onde (54) est inférieure à la longueur d'onde d'excitation des éléments chromophores (38) précités.
3. Dispositif selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'indice de réfraction du cœur du guide d'onde (54) est supérieur aux indices de réfraction du fond (14) du puits et du liquide (36).
4. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'une partie périphérique du guide d'onde (54) dans chaque puits (12) est recouverte d'une couche opaque annulaire (60) et d'une couche (62) de matière transparente interposée entre le guide d'onde et la couche annulaire (60).
5. Dispositif selon la revendication 4, caractérisé en ce que la partie centrale du guide d'onde (54) dans chaque puits est dépourvue des composants émetteurs (56) précités.
6. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend également des moyens placés dans les puits (12) pour limiter la zone traversée par le faisceau lumineux d'excitation (22), ces moyens étant constitués par un écran solide disposé ou déposé sur le fond (14) de chaque puits (12) et recouvrant au moins une partie de ce fond.
7. Dispositif selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens pour déplacer lesdits écrans dans les puits (12).
8. Dispositif selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce que les écrans sont portés par un couvercle (46) de la plaque (10) à puits multiples.
9. Dispositif selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que chaque écran comporte une plaque pleine (48), un treillis, un fritte de verre ou de métal ou un maillage tridimensionnel (42) de fils ou de fibres de matière opaque, par exemple de matière plastique.
10. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'un liquide (36) opaque au faisceau lumineux est contenu dans les puits (12) et limite la longueur de pénétration du faisceau d'excitation (22) à une valeur inférieure à 100μm et par exemple comprise entre 1 et 10μm.
11. Dispositif selon la revendication 10, caractérisé en ce que ledit liquide opaque comprend du lait, une peinture ou une encre, du sable fin, de Ia poudre de silice ou d'alumine, du noir de carbone, des microbilles de verre ou un colloïde.
12. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend un ensemble (16) de photodétecteurs du type CCD, CMOS ou analogue et des moyens (18) de formation d'image montés entre la plaque (10) et l'ensemble de photodétecteurs (16) pour former sur cet ensemble l'image des fonds transparents d'une pluralité de puits (12).
13. Dispositif selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend également un ensemble de faisceaux (26) de fibres optiques s'étendant entre les fonds transparents des puits (12) et les moyens (18) de formation d'image, chaque faisceau (26) de fibres optiques ayant une première extrémité (28) placée en regard du fond transparent d'un puits (12) et une seconde extrémité (30) placée en regard des moyens de formation d'image (18), ces secondes extrémités (30) des faisceaux (26) étant rassemblées en un faisceau unique.
14. Dispositif selon la revendication 13, caractérisé en ce que les extrémités des fibres optiques de chaque faisceau (26) sont séparées les unes des autres à la première extrémité (28) du faisceau et sont écartées entre elles d'une distance faible, par exemple comprise entre 5 et 50 μm.
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