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WO2005078129A2 - Procede pour le diagnostic/pronostic d’une thrombose - Google Patents

Procede pour le diagnostic/pronostic d’une thrombose Download PDF

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WO2005078129A2
WO2005078129A2 PCT/FR2005/050083 FR2005050083W WO2005078129A2 WO 2005078129 A2 WO2005078129 A2 WO 2005078129A2 FR 2005050083 W FR2005050083 W FR 2005050083W WO 2005078129 A2 WO2005078129 A2 WO 2005078129A2
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primer
seq
nucleotide
amplification
nucleotide sequence
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Aurélie BRION
Philippe Leissner
Cécile BERARD
Original Assignee
Biomerieux
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Publication date
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Publication of WO2005078129A3 publication Critical patent/WO2005078129A3/fr

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to an in vitro method for the diagnosis / prognosis of thrombosis.
  • the invention also relates to amplification primers and hybridization probes which can be used in this method, as well as a kit for diagnosis / prognosis of a thrombosis.
  • Coagulation is an essential homeostatic system which must be properly regulated in order to avoid hemorrhages as well as thromboses.
  • This coagulation involves a cascade of activations of inactive circulating precursors which, by losing one end of their protein chain, give activated factors.
  • factors II and factor V there may be mentioned in particular factor II and factor V.
  • Factor IL also called prothrombin, is a pro-enzyme synthesized by the liver. It is activated in thrombin, active form, by factors X and V activated in the presence of phospholipids. When activated, it is responsible for the proteolysis of fibrinogen to fibrin.
  • This mutation leads to a 25% increase in the activity of thrombin in the plasma and is considered to be a risk factor for venous thrombosis.
  • the mutation of nucleotide 1691 of the gene encoding factor V, called the Leiden mutation of factor V is also a risk factor. This mutation increases the risk of venous thrombosis by 4 to 8 times in heterozygous individuals and by 50 to 100 times for homozygotes.
  • factor II 20210 mutations and the factor V Leiden mutation are therefore essential in order to prevent the risks of vein thrombosis.
  • numerous studies show that the 20210 mutation of factor II and the Leiden mutation of factor V are often consistent and the presence of the two mutations induces an increased risk of venous thrombosis. It is therefore also important to study these two mutations simultaneously.
  • US Pat. No. 6,558,913 presents a method for detecting the presence of a genetic risk of thrombosis, based on the detection of the Leiden factor V mutation. Mention may also be made of US Pat. No. 6,043,035 which presents a method for detecting the presence of a genetic risk of thrombosis, based on the detection of the 20210 mutation of factor I
  • These methods include in particular the amplification step of the region of the gene in which the mutation is located, by the use of amplification primers , followed by a mutation detection step by the use of a mutation-specific detection probe.
  • these methods do not allow the simultaneous detection of the Leiden factor N mutation and the factor H 20210 mutation, which however greatly increases the risk of thrombosis in a patient.
  • the early detection of this double mutation which can be done sequentially or separately, makes it possible to warn the patient and offer him appropriate treatment.
  • these methods can be optimized by the choice of amplification primers used during the amplification step, in order to improve the detection step, and this all the more so when the amplification step is performed simultaneously with the detection step.
  • the present invention proposes to improve the state of the art by proposing a new method for evaluating the risk of thrombosis of a patient.
  • This method implements in particular during the amplification step of new amplification primers perfectly suited for the detection of a mutation increasing the risk of thrombosis.
  • These new amplification primers can also be used within the same amplification reaction, which in particular makes it possible to determine by a single reaction the presence of the 20210 mutations of factor II and the Leiden mutation of factor V.
  • the invention relates to an in vitro method for the diagnosis / prognosis of a thrombosis comprising the following steps: A - extract the nucleic material from a biological sample, B - use at least one pair of amplification primers to obtain amplicons from at least one target sequence of the nucleic material, C - use at least one probe detection method for detecting the presence of said amplicons, characterized in that, during step B, said primer pair comprises at least one amplification primer comprising at least 10 nucleotide units of a nucleotide sequence chosen from SEQ ID N ° l; 3 to 8, 15 and 16.
  • diagnosis / prognosis of a thrombosis is understood to mean the establishment of a genetic risk profile for thrombophilia.
  • biological sample means any sample capable of containing a nucleic material as defined below.
  • This biological sample can be taken from a patient and can be rotatively a sample of tissue, blood, serum, saliva, circulating cells of the patient.
  • This biological sample is available by any type of sample known to those skilled in the art.
  • the nucleic material comprises a nucleic acid sequence such as a deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA) sequence.
  • the nucleic material comprises a sequence of deoxyribonucleic acids.
  • the nucleic material is extracted from a biological sample taken from a patient.
  • nucleotide sequence or nucleic acid sequences or nucleotide fragment or oligonucleotide, or polynucleotide
  • nucleotide sequence is meant a chain of nucleotide patterns assembled together by phosphoric ester bonds, characterized by the informational sequence of natural nucleic acids, capable of s' hybridize to another nucleic acid sequence, the sequence being able to contain monomers of different structures and to be obtained from a natural nucleic acid molecule and / or by genetic recombination and / or by chemical synthesis.
  • nucleotide motif means a derivative of a monomer which can be a natural nucleotide of nucleic acid, the constituent elements of which are a sugar, a phosphate group and a nitrogenous base; in DNA the sugar is deoxy-2-ribose, in TARN the sugar is ribose; depending on whether it is DNA or RNA, the nitrogen base is chosen from adenine, guanine, uracil, cytosine, thymine; or the monomer is a nucleotide modified in at least one of the three constituent elements; by way of example, the modification may take place either at the level of the bases, with modified bases such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, deoxyuridine, dimethylamino-5-deoxyuridine, dia ⁇ nino-2,6-purine, bromo -5 deoxyuridine or any other modified base capable of hybridization, either at the sugar level, for example the replacement of at least one deoxyrib
  • target sequence is meant a sequence the sequence of which in nucleotide units is specific for a target gene, such as preferably the gene coding for factor ⁇ or the gene coding for factor V.
  • the target sequence includes a mutation which increases the risk of thrombosis such as in particular the Leiden mutation of factor V or the 20210 mutation of factor II. In the rest of the presentation, we will speak of target sequence whether it is single strand or double strand .
  • the nucleic material is extracted from a biological sample by any protocol known to those skilled in the art.
  • the extraction of nucleic acids can be carried out by a step of lysis of the cells present in the biological sample, in order to release the nucleic acids contained in the protein and / or lipid envelopes of the cells (such as cellular debris which disrupt subsequent reactions).
  • the lysis methods as described in patent applications WO00 / 05338 on mixed magnetic and mechanical lysis, WO99 / 53304 on electrical lysis, and WO99 / 15321 on mechanical lysis can be used.
  • This lysis step can also be followed by a purification step, allowing the separation between the nucleic acids and the other cellular constituents released in the lysis step.
  • This step generally makes it possible to concentrate the nucleic acids, and can be adapted to the purification of DNA or RNA.
  • magnetic particles can be used optionally coated with oligonucleotides, by adsorption or covalence (see on this subject US Patents 4,672,040 and US 5,750,338), and thus purify the nucleic acids which are fixed on these magnetic particles, by a washing step.
  • This nucleic acid purification step is particularly advantageous if it is desired to subsequently amplify said nucleic acids.
  • a particularly interesting embodiment of these magnetic particles is described in patent applications WO97 / 45202 and WO99 / 35500.
  • Another interesting example of a nucleic acid purification method is the use of silica either in the form of a column or in the form of inert particles (Boom R. et al., J. Clin.
  • DNA When it is desired to specifically extract DNA from a biological sample, it is possible in particular to carry out an extraction with phenol, chloroform and alcohol to remove proteins and precipitate DNA with alcohol. The DNA can then be pelleted by centrifugation, washed and resuspended.
  • step B at least one pair of amplification primers is used to obtain amplicons from at least one target sequence of the nucleic material.
  • amplification primer means a nucleic acid sequence comprising from 10 to 100 nucleotide units, preferably from 15 to 25 nucleotide units. This amplification primer comprises at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of a sequence chosen from SEQ ID No. 1; 3 to 8
  • an amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of a sequence homologous to SEQ ID No. 1; 3 to SEQ ID No. 8; 15 and 16, ie o the complementary sequence of SEQ ID No. 1; 3 to 8; 15 and 16 o a sequence having sufficient homology to hybridize to SEQ ID No. 1; 3 to SEQ ID No. 8; 15 and 16 or to the sequence complementary to SEQ ID No. 1; 3 to SEQ ID No. 8; 15 and 16, • a sequence comprising a sequence of SEQ ID No. 1; 3 to SEQ ID No. 8; 15 and 16 (or a sequence homologous to SEQ ID No. 1; 3 to SEQ ID No.
  • a pair of amplification primers allows the initiation of an enzymatic polymerization, such as in particular an enzymatic amplification reaction.
  • enzymatic amplification reaction is meant a process generating multiple copies (or amplicons) of a nucleic sequence by the action of at least one enzyme.
  • amplicons is understood to mean the copies of the target sequence obtained during an enzymatic amplification reaction.
  • amplification reactions are well known to those skilled in the art and mention may in particular be made of PCR (Polymerase Chain Reaction), as described in patents US-A-4,683,195,
  • these enzymatic amphfication reactions generally involve a succession of cycles comprising the following steps: o denaturation of the target sequence if it is in double strand in order to obtain two complementary, target strands, o hybridization of each of the target strands, obtained during the previous denaturation step with at least one amplification primer, the formation from the amplification primers of the strands complementary to the strands on which they are hybridized in the presence of an enzyme polymerase and of nucleoside triphosphate (ribonucleoside triphosphate and / or deoxyribonucleoside triphosphate according to the techniques) this cycle being repeated a number of times determined to obtain the target sequence in a sufficient proportion to allow its detection.
  • nucleoside triphosphate ribonucleoside triphosphate and / or deoxyribonucleoside triphosphate according to the techniques
  • hybridization is meant the process during which, under appropriate conditions, two nucleic acid sequences such as in particular an amplification primer and a target sequence or a hybridization probe and a target sequence, bind with stable hydrogen bonds and specific to form a double strand.
  • These hydrogen bonds are formed between the complementary bases Adenine (A) and thymine (T) (or uracil (U)) (we speak of bond A-T) or between the complementary bases Guanine (G) and cytosine (C) (we speaks of GC liaison).
  • the hybridization of two nucleic sequences can be total (we then speak of complementary sequences), that is to say that the double strand obtained during this hybridization comprises only AT bonds and CG bonds.
  • This hybridization can be partial (we then speak of sufficiently complementary sequences), that is to say that the double strand obtained comprises AT bonds and CG bonds making it possible to form the double strand, but also bases not linked to a complementary base. .
  • the hybridization between two complementary or sufficiently complementary sequences depends on the operating conditions which are used, and in particular on the stringency. Stringency is defined in particular as a function of the base composition of the two nucleic sequences, as well as by the degree of mismatch between these two nucleic sequences. The stringency can also be a function of the parameters of the reaction, such as the concentration and the type of ionic species present in the hybridization solution, the nature and the concentration of denaturing agents and / or the hybridization temperature.
  • NASBA is an isothermal amphfication technology for nucleic acid based on the joint action of three enzymes (reverse transcriptase AMV, Rnase-H and polymerase-RNA T7). Associated with amplification primers specific for a target sequence, it amplifies RNA targets more than a billion times in 90 minutes. The amplification reaction occurs at 41 ° C and gives single stranded RNA molecules as the final product. NASBA requires a primer pair, at least one of which includes a promoter for initiating transcription by a bacteriophage T7 polymerase.
  • step C at least one detection probe is used to detect the presence of said amplicons.
  • this detection probe makes it possible to detect not only the presence of said amplicons, but also makes it possible to detect the presence of a given mutation, likely to be included in the amplicon.
  • This detection step can be carried out by all the protocols known to those skilled in the art relating to the detection of nucleic acids.
  • hybridization probe is intended to mean a nucleic sequence having a specificity of hybridization under conditions determined to form a hybridization complex with a target nucleic sequence.
  • the hybridization probe can comprise a marker allowing its detection.
  • detection is meant either a direct detection by a physical method, or an indirect detection by a detection method using a marker.
  • marker is meant a tracer capable of generating a signal which can be detected.
  • tracers includes the enzymes which produce a detectable signal for example by colorimetry, fluorescence or luminescence, such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, beta galactosidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase; chromophores such as fluorescent, luminescent or coloring compounds; electron density groups detectable by electron microscopy or by their electrical properties such as conductivity, by amperometry or voltammetry methods, or by impedance measurements; the groups detectable by optical methods such as diffraction, surface plasmon resonance, variation of contact angle or by physical methods such as atomic force spectroscopy, tunnel effect, etc. ; radioactive molecules like 32 P, 35 S or 1 5 I.
  • the detection probe can in particular be a “molecular beacon” detection probe as described by Tyagi & Kramer (Nature biotech, 1996, 14: 303-308).
  • molecular beacons become fluorescent during hybridization. They have a rod-loop structure and contain a fluorophore and an inhibitor or “quencher” group. The binding of the specific loop sequence with its complementary target nucleic acid sequence causes the rod to unwind and the emission of a fluorescent signal upon excitation at the appropriate wavelength.
  • the detection probe comprises a fluorophore and a quencher.
  • the hybridization probe comprises a FAM (6-carboxy-fluorescein) or ROX (6-carboxy-X-rhodamine) fluorophore at its 5 ′ end and a quencher (Dabsyl ) at its 3 'end.
  • a hybridization probe is called “molecular beacon”.
  • the presence or absence of the Leiden factor V mutation is detected.
  • it is detected during in step C) the presence or absence or of the 20210 mutation of factor H.
  • said detection probe comprises at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide patterns of a nucleotide sequence chosen from SEQ ID No. 9 to 12; 17 and 18.
  • SEQ ID No. 9 makes it possible to diagnose the presence of the Leiden mutation of factor V
  • SEQ ID N ° 10 makes it possible to diagnose the absence of the Leiden mutation for factor V.
  • a detection probe comprising SEQ ID No. 11 makes it possible to detect the presence of the mutation 20210 of factor II
  • the use of a detection probe comprising SEQ ID No. 12 makes it possible to detect the absence of the 20210 mutation of factor IL
  • the use of a detection probe comprising SEQ ID No. 17 makes it possible to detect the presence of the mutation 20210 of factor ⁇
  • the use of a detection probe comprising SEQ ID N ° 18 makes it possible to detect the absence of the 20210 mutation of factor II
  • said pair of primers is chosen from the following primer pairs: ⁇ a first amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 1 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 2;
  • a first amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 1
  • a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 2
  • an amplicon specific for the gene encoding factor V, of a size of 1 is obtained.
  • This amplicon may contain the mutated allele responsible for the Leiden mutation or the wild-type allele, the allele being characterized during step C.
  • a first amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 3 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 4;
  • the first primer has the sequence SEQ ID No. 3
  • the second primer has the sequence SEQ ID No.
  • an amplicon is obtained, specific for the gene encoding factor V, of a size of 374 base pairs, which corresponds to the sequence 36568-36941 on the sequence of the gene encoding the reference factor V (NT_004668).
  • This amplicon may contain the mutated allele responsible for the Leiden mutation or the wild allele, the allele being characterized during step C.
  • a first amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide motifs of the nucleotide sequence SEQ ID N ° 5
  • a second primer amplification comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No.
  • a first amphfication primer comprising at least 10, preferably 15 and again more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No.
  • a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 8;
  • an amplicon specific for the gene encoding factor II, of a size of 1 is obtained. 434 base pairs, which corresponds to the sequence 21217-21650 on the sequence of the gene encoding the reference factor II (AF478696).
  • This amplicon may contain the mutated allele responsible for the 20210 mutation of factor II or the wild-type allele, the allele being characterized during step C.
  • a first amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and again more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 15 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 16;
  • an amplicon specific for the gene encoding factor II, of a size of 1 is obtained.
  • 108 base pairs which corresponds to the sequence 21465-21573 on the sequence of the gene encoding the reference factor ⁇ (AF478696).
  • This amplicon may contain the allele mutate responsible for the 20210 mutation in factor II or the wild-type allele, the allele being characterized in step C.
  • said pair of primer comprises at least one amphfication primer comprising a promoter allowing initiation of transcription by a bacteriophage T7 polymerase.
  • this first amplification primer comprises a sequence chosen from the sequences of SEQ ID N ° 13 to 14.
  • step B and step C are carried out simultaneously.
  • This can be implemented in particular by a NASBA amplification reaction with detection in real time.
  • Real-time detection of amplicons can be carried out using a Nuclisens EasyQ® reader (bioMérieux BV, The Netherlands) and “molecular beacon” detection probes, as defined above.
  • the amplification of DNA in NASBA can be carried out in the following way: the DNA is denatured at 95 ° C. to allow the fixing of a "first primer", comprising a polymerase promoter T7 (only one primer is present at this stage). At 41 ° C, the enzyme reverse transcriptase (AMV-RT) is added and allows the extension of the primer.
  • AMV-RT enzyme reverse transcriptase
  • a "second primer” is added and a new denaturation is carried out.
  • An alternative is made by adding the two primers simultaneously, in order to carry out only one denaturation step.
  • NASBA enters a cychach phase: the "second primer” hybridizes to a new RNA molecule formed; AMV-RT extends this primer; RNase H degrades RNA from RNA / cDNA hybrids; a "first primer” binds to the cDNA obtained; AMV-RT synthesizes from this a new complementary strand then from this strand, extends the T7 part of the "first primer”; thus T7 RNA polymerase has new matrices with a T7 double tail to generate RNAs.
  • the quencher When the “molecular beacon” is in solution, the quencher, near the fluorophore, inhibits its fluorescence. In the presence of the target nucleic acid, the beacon will bind to the sequence complementary to that of the loop. H will therefore change conformation and open, moving the fluorophore away from the quencher and thus allowing the emission of fluorescence. During the amplification, many molecules will be synthesized allowing as many “molecular beacons” to be fixed. The fluorescence will therefore increase during the reaction.
  • a suitable device such as EasyQ
  • the invention also relates to an amplification primer comprising at least 10, preferably 15, and even more preferably 20 nucleotide units of a nucleotide sequence chosen from SEQ ID No. 1; 3 to 8; 15 and 16.
  • the amplification primer comprises a promoter allowing the initiation of transcription by a polymerase of bacteriophage T7.
  • amphfication primer comprises a sequence chosen from the sequences of SEQ ID Nos. 13 to 14.
  • the invention also relates to a pair of amphfication primer chosen from the following primer pairs: p a first amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide motifs of the nucleotide sequence SEQ ID N 1 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 2; as a guide, when the first primer has the sequence SEQ ID No. 1, and the second primer has the sequence SEQ ID No. 2, an amplicon, specific for the gene encoding factor V, of a size of 1 is obtained.
  • a first amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 3 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 units nucleotides of the nucleotide sequence SEQ ID No.
  • a amplicon specific for the gene encoding factor V, with a size of 374 base pairs, which corresponds to the sequence 36568-36941 on the sequence of the gene encoding the reference factor V (NT_004668).
  • a first amphfication primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 5
  • a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 units nucleotides of the nucleotide sequence SEQ ID No.
  • the first primer has the sequence SEQ ID N ° 5- and the second primer has the sequence SEQ ID N ° 6, an amplicon is obtained, specific for the gene coding for factor II, of a size of 145 base pairs, which corresponds to the sequence 21455-21599 on the sequence of the gene encoding the reference factor II (AF478696).
  • a first amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 7
  • a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 units nucleotides of the nucleotide sequence SEQ ID No.
  • a first amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 nucleotide units of the nucleotide sequence SEQ ID No. 15 and a second amplification primer comprising at least 10, preferably 15 and even more preferably 20 units nucleotides of the nucleotide sequence SEQ ID No.
  • said first primer comprises a promoter allowing the initiation of transcription by a polymerase of bacteriophage T7.
  • this first amplification primer comprises a sequence chosen from the sequences of SEQ ID N ° 13 to 14.
  • the invention also relates to the use of at least one amphfication primer as defined above and / or of a primer pair as defined above during a NASBA amphfication reaction
  • the invention also relates to the use of at least one primer as defined above, and / or of at least one pair of primers as defined above for the diagnosis / prognosis of a thrombosis.
  • the invention finally relates to a kit for the diagnosis / prognosis of a venous thrombosis comprising at least one primer as defined above and / or at least one pair of primers as defined above.
  • Figures 1 and 2 represent the genotyping of different cell lines for the +1691 G / A mutation in Factor V, thanks to the simultaneous presence of the molecular beacons of SEQ ID No.10 and SEQ ID No.9 in the reaction mixture.
  • FIG. 1a represents the genotyping of the GM16000C cell line, homozygous for the wild allele (+ 1691-G) of Factor V
  • FIG. 1b represents the genotyping of the GM14899 cell line, homozygous for the mutated allele (+ 1691-A) of Factor V
  • the white squares represent the detection of the fluorescence of the “molecular beacons” of SEQ ID N ° 9, making it possible to highlight the wild allele of factor V
  • the black triangles represent the detection of the fluorecence of the “molecular beacons” of SEQ ID No. 10, allowing the detection of the mutated allele (Leiden mutation).
  • FIG. 2 represents the genotyping of the cellular gene GM16028B, heterozygous for the mutation +1691 of Factor V.
  • the white squares represent the detection of the fluorescence of the "molecular beacons" of SEQ ID N ° 9, making it possible to highlight the wild factor V allele, while the black triangles represent the detection of the fluorecence of the “molecular beacons” of SEQ ID No. 10, allowing the detection of the mutated allele (Leiden mutation).
  • Figures 3 and 4 represent the genotyping of different cell lines for the Factor II mutation +20210 G / A, thanks to the simultaneous presence of the molecular beacons OGH 916 (SEQ ID No. 11, + 20210- A) and OGH 1104 ( SEQ ID No. 12, + 2010-G) in the reaction mixture.
  • FIG. 3a represents the genotyping of the GM 14899 cell line, homozygous for the wild-type allele (+ 20210-G) of Factor ⁇ while FIG. 3b represents the genotyping of the GM16000C cellular hgnea, homozygous for Factor II mutated allele (+ 20210- A).
  • the crosses represent the detection of the “molecular beacons” of SEQ ID No. 12, allowing the detection of the wild allele, while the circles represent the detection of the “molecular beacons” of SEQ ID No. 11, allowing the detection of the 20210 mutation in factor ⁇ .
  • FIG. 4 represents the genotyping of the cell line GM16028B, heterozygous for the +20210 mutation of factor ⁇ .
  • the presence of the mutated allele (black circles) and the wild allele (cross curve) is clearly detected.
  • the crosses represent the detection of the “molecular beacons” of SEQ ID No. 12, allowing the detection of the wild allele, while the circles represent the detection of the “molecular beacons” of SEQ ID No. 1 1, allowing the detection of the ⁇ factor 20210 mutation.
  • FIG. 5 represents the detection of the FAM beacon specific for the allele A of Factor V (G + 1691A) from DNA of the GM14899 lines (A / A homozygous allele mutated; triangles), GM16028B (A / G heterozygous; cross) and GM16000C (G / G homozygous wild allele; round)
  • FIG. 6 represents the detection of the ROX beacon specific for the G allele of factor V (G + 1691A) from DNA of the GM14899 lines: A / A (homozygous mutated allele; triangles); GM16028B (A / G heterozygous; cross) and GM 16000C (G / G homozygous wild allele, round)
  • FIGS 7 and 8 represent the genotyping of different cellular cells (GM
  • FIG. 7 represents the detection of the FAM beacon specific for the G allele of factor II (G + 20210A) from DNA of the GM14899 lines: G / G (homozygous mutated allele; triangles); GM16028B (A / G heterozygous; cross) and GM 16000C (A / A homozygous wild allele, round)
  • G / G homozygous mutated allele; triangles
  • GM16028B A / G heterozygous; cross
  • GM 16000C A / A homozygous wild allele, round
  • FIG. 8 represents the detection of the ROX beacons specific for the allele A of factor II (G + 20210A) from DNA of GM14899 lines: G / G (homozygous allele mutated; triangles); GM16028B (A / G heterozygous; cross) and GM 16000C (A / A homozygous wild allele, round)
  • Figure 9 is a graphic representation of 72 samples (clinical and cell lines) Factor V. These samples are positioned according to their ratios of fluorescence intensity of FAM (specific for allele A) and ROX (specific for allele G) beacons.
  • FIG. 10 is a graphic representation of 130 samples (clinical and cell line) IL factor These samples are positioned according to their fluorescence intensity ratios of the FAM (specific for allele G) and ROX (specific for the beacons) beacons. allele A).
  • the method according to the invention has been validated on cellular cells, as well as on chemical samples from patients.
  • Cell lines Three lymphoblastoid cell lines of known genotype for the Leiden factor V mutations and the factor II 20210 (Coriell cell repository) mutation were used:
  • the GM14899 line expresses only the Leiden mutation for factor V: this gene is homozygous for the Leiden mutation of factor V (A / A) and homozygous for the wild-type allele in position 20120 of factor H (G / G).
  • the GM16000C line only expresses the 20210 mutation of factor II: this line is homozygous for the 20210 mutation of factor ⁇ (A / A) and homozygous for the wild-type allele in position 1691 of factor V
  • the GM16028B line is heterozygous for the 2 mutations (G / A).
  • These cell lines were cultured (37 ° C, CO2 5%) in RPMI 1640 medium, supplemented with fetal beef serum (15%), L glutamine (2mM), Penistreptomycin (penicillin: 200 U / ml ; streptomycin: 0.2 mg / ml).
  • DNA extraction was carried out from a GM16000C cell pellet, a GM16028B or GM14899 cell pellet. The pellet cells are subjected to hypotonic lysis and to enzymatic digestion with proteinase K. After deproteinization, the DNA is precipitated with ethanol, dried, and dissolved in water.
  • the quantity and quality of DNA were determined by UV spectrophotometry.
  • Patient sample - 200 ⁇ l of blood taken from patients whose presence of the Leiden mutation was known was used.
  • the genomic DNA was extracted using the NucleoSpin kit (Marcherey-Nagel, Hoerdt, France), and taken up in 20 ⁇ l of DNAse-free water.
  • the quantity and quality of the DNA were determined on an agarose gel containing ethidium bromide, and by UV spectrophotometry.
  • PCR was carried out using genomic DNA as obtained previously, from cell lines or blood samples, by the use of a pair of amplification primers comprising SEQ ID No. 3, 5 'AGTGCTTAACAAGACCATACTA 3' for the first primer and SEQ ID No. 4, 5 'AACAGACCTGGAATTTGAAACTAA 3' for the second primer.
  • the PCR parameters were as follows: 2 min at 95 ° C; 30 cycles of 30 s at 95 ° C, 30 s at 55 ° C, 30 s at 72 ° C; followed by 7 min at 72 ° C).
  • Plasmids containing either a nucleotide G or a nucleotide A in position 1691 were amplified and purified by the use of a Plasmid Maxi kit
  • a PCR was carried out using genomic DNA as obtained previously, from cellular genes or from blood samples, by the use of a pair of amphfication primers comprising SEQ ID No. 7, 5 '
  • PCR were as follows: 2 min at 95 ° C; 30 cycles of 30 s at 95 ° C, 30 s at 55 ° C, 30 s at 72 ° C; followed by 7 min at 72 ° C).
  • the amplicons thus obtained were cloned into a PCR-Trap vector (GeneHunter, USA) and verified by sequencing.
  • the plasmids, containing either a nucleotide G or a nucleotide A at position 1691, were amplified and purified by the use of a Plasmid Maxi kit (Qiagen; Germany). 2) Amplification by NASBA
  • an amplification reaction mixture (40m_M Tris HC1 ph 8.5; 12 mM MgC12; 70 mM KC1; 5 mM dithiotheitol; 15% v / v DMSO; 1 mM dNTP) containing the amphfication primers making it possible to amplify either the region capable of containing the Leiden mutation, or the region capable of containing the 20210 mutation of factor II, and detection probes, specific for each mutation has been carried out.
  • the reaction medium for detecting the presence of the factor V Leiden mutation included: - 0.2 ⁇ M (final concentration) of a first primer for amplification of SEQ ID No. 2, 5 'AGT GCT TAA CAA GAC CAT ACT A 3 ', - 0.2 ⁇ M (final concentration) of a second amplification primer of SEQ ID No 1.5, AAA TTC TCA GAA TTT CTG AAA GG 3' comprising the promoter of the phage polymerase T7, i.e. an amplification primer whose total sequence corresponds to SEQ ID No.
  • the “molecular beacon” of SEQ ID No. 9, marked with a ROX fluorophore (6-carboxy-X-rhodamine) is very specific for the wild-type allele: in fact, the fluorescence was exponential, before the appearance of a plateau, when the reaction was carried out using a cellular signal not expressing the Leiden mutation (curve in white square; FIG. la), while the fluorescence remained basal when the reaction was carried out using a cell line expressing the Leiden mutation (white square curve; FIG. 1 b).
  • the “molecular beacons” of SEQ ID No. 10, labeled with a FAM fluorophore (6-carboxy-fluorescein) is specific for the mutated allele.
  • the fluorescence was exponential, when the reaction was carried out from a cell line expressing the Leiden mutation (triangle curve; FIG. 1b), while the fluorescence remained basal, when the reaction was carried out from a cell sequence not expressing the Leiden mutation (triangle curve; figure la).
  • the “molecular beacon” of SEQ ID No. 9 could be used simultaneously with a “molecular beacon” of SEQ ID No. 10, which made it possible to detect very quickly, and from a single reaction, the presence or absence of the Leiden mutation for factor V.
  • the results are presented in FIG. 2, obtained from a heterozygous cell line for the Leiden mutation for factor V.
  • Table 1 O / C ratio obtained on cell lines and blood samples expressing or not expressing the Leiden mutation
  • the “molecular beacon” of SEQ ID No. 12, marked with a FAM fluorophore (6-carboxy-fluorescein) is very specific for the wild factor H allele. Indeed, the fluorescence was exponential , when the reaction was carried out from a cell line not expressing the 20210 mutation (cross curve; FIG. 3a), while the fluorescence remained basal, when the reaction was carried out from a cell gene expressing this mutation (cross curve; Figure 3b).
  • the “molecular beacons” of SEQ ID No. 11, marked with a ROX fluorophore (6-carboxy-X-rhodamine) is specific for the mutated allele.
  • the fluorescence was exponential, when the reaction was carried out from a cell line expressing the 20210 mutation (circle curve; FIG. 3b), while the fluorescence remained basal, when the reaction was carried out from a cell line n '' not expressing this mutation (round curve; Figure 3a).
  • the “molecular beacon” of SEQ ID N ° 11 could be used simultaneously with a “molecular beacon” of SEQ ID N ° 12, which made it possible to detect very quickly, and from a single reaction, the presence or absence of the 20210 mutation in factor ⁇ .
  • This is what is represented in FIG. 4, obtained from a heterorozygous cell line for the mutation 20210 of the actor H. Comparable results were obtained from a clinical sample.
  • 203 clinical DNAs were genotypes.
  • the GM14899 gene expresses only the Leiden factor V mutation: this line is homozygous for the Leiden mutation of factor V (A / A) and homozygous for the wild alder at position 20120 of factor ⁇ (G / G).
  • the GM16000C line only expresses the 20210 mutation for factor II: this line is homozygous for the 20210 mutation in factor II (A / A) and homozygous for the wild animal in position 1691 for factor V (G / G).
  • the GM16028B is heterozygous for the 2 mutations (G / A).
  • Genomic DNA was extracted using the NucliSens Magnetic Extraction reagent kit and NucliSens Lysis Buffer and the miniMag instrument. (cf Notice miniMag except washing Wash3 (10 sec in 15 hr) and the DNA is eluted in 80 ⁇ L of Elution buffer (10min at 70 ° C + mix at 14000 rpm).
  • the quantity and quality of the DNA were determined by UV spectrophotometry.
  • Cloning of the region of interest In order to obtain a large amount of DNA from the region capable of expressing the Leiden factor V mutation, a PCR was carried out using genomic DNA as obtained above, from cell lines or blood samples, by the use of a pair of amplification primers comprising SEQ ID No. 3, 5 'AGTGCTTAACAAGACCATACTA 3' for the first primer and SEQ ID No. 4, 5 'AACAGACCTGGAATTTGAAACTAA 3' for the second primer.
  • the PCR parameters were as follows: 2 min at 95 ° C; 30 cycles of 30 s at 95 ° C, 30 s at 55 ° C, 30 s at 72 ° C; followed by 7 min at 72 ° C).
  • the amplicons thus obtained were cloned into a PUC19 vector and verified by sequencing.
  • the plasmids, containing either a nucleotide G or a nucleotide A at position 1691, were amplified and purified by the use of a Plasmid Maxi kit (Qiagen; Germany).
  • a PCR was carried out using genomic DNA as obtained previously, from cell lines or from blood samples, by the use of a pair of amphfication primers comprising SEQ ID No 7, 5 'TCTAGAAACAGTTGCCTGGC 3' for the first primer and SEQ ID No 8, 5 'CTACCAGCGTGCCACCAGGT 3' for the second primer.
  • the PCR parameters were as follows: 2 min at 95 ° C; 30 cycles of 30 s at 95 ° C, 30 s at 55 ° C, 30 s at 72 ° C; followed by 7 min at 72 ° C).
  • the amplicons thus obtained were cloned into a PCR-Trap vector (GeneHunter, USA) and verified by sequencing.
  • the plasmids, containing either a nucleotide G or a nucleotide A at position 1691, were amplified and purified by the use of a Plasmid Maxi kit (Qiagen; Germany). 2) Amplification by NASBA
  • “molecular beacons” of SEQ ID N ° 10, 3 'CTG GAC AGG CAA IGA A 3', marked with a fluorophore FAM (6-carboxy-fluorescein) in 5 ', and of a "Quencher” (Dabsyl) in 3 ', (complete sequence: 5' FAM-cgatcg CTGGACAGGCAAIGAAcg ⁇ tC £ -Dabsyl 3 ').
  • This “molecular beacon” made it possible to demonstrate the presence of the Leiden mutation.
  • a Factor II amplification reaction mixture (40mM tris HC1 ph 8.5; 12mM MgC12; 70mM KC1; 5mM dithiotheitol; 15% v / v DMSO; 1 mM dNTP) containing the amphfication primers making it possible to amplify the region capable of containing the +20210 mutation of the FH:
  • Factor II were added to the reaction medium: - 0.2 ⁇ M (final concentration) of a first amplification primer of SEQ ID No.
  • This “molecular beacon” made it possible to highlight the absence of the 20210 mutation of factor II
  • the “molecular beacon” of SEQ No. 9 marked with a FAM fluorophore is very specific for the mutated allele: in fact, the fluorescence was exponential, before the appearance of a plateau, when the reaction was carried out using cell lines expressing the Leiden mutation (curves in triangle; and cross in FIG. 5), while the fluorescence remained basal, when the reaction was carried out using cell cells expressing the Leiden mutation (curve white circle; figure 5).
  • the “molecular beacon” of SEQ ID No. 10, labeled with a ROX fluorophore is specific for the wild allele. Indeed, the fluorescence was exponentieEe, when the reaction was carried out starting from cellular hgussis expressing the wild genotype
  • the “molecular beacon” of SEQ ID No. 10 is used simultaneously with a “molecular beacon” of SEQ ID No. 9, which made it possible to detect very quickly, and from a only reaction, the presence and / or absence of the mutation for the two factors of the FactorV gene. Thanks to the analysis of Figures 5 and 6 we can therefore determine if the sample has the genotypes G / G, G / A, or A / A
  • results obtained can also be expressed by the ratio between the fluorescence emitted when the plateau is reached and the initial fluorescence (O / C ratios
  • Each “square” symbol represents a sample tested and positioned according to the value of F O / C ratio of the FAM beacons and the OC ratio of the ROX beacon for this sample. Thanks to the positivity detection hms of these two beacons, Factor V Leiden typing can be determined graphically for 72 samples. A sample is classified A / A when its O / C ratio beacon FAM specific for the mutated allele (A) is greater than 1.5 and when its O / C ratio beacon ROX specific for the wild allele (G) is less than 2 .
  • a sample is classified G / G when its O / C ratio beacon FAM specific for the mutated allele (A) is less than 1.5 and when its O / C ratio beacon ROX specific for wild aele (G) is greater than 2 .
  • a sample is classified G / A when its O / C ratio beacon FAM specific for the mutated allele (A) is greater than 1.5 and when its O / C ratio beacon ROX specific for the wild allele (G) is greater than 2 .
  • the “molecular beacon” of SEQ No. 18 marked with a FAM fluorophore is very specific for wild honey: in fact, the fluorescence was exponent, before the appearance of a plateau, when the reaction was carried out using cell lines expressing the wild Factor II (curves in triangle; and crosses in FIG. 7), while the fluorescence remained basal, when the reaction was carried out using a cell line expressing the wild factor polymorphism II (round curve; Figure 7).
  • the “molecular beacons” of SEQ ID No. 17, marked with a ROX fluorophore is specific for the mutated allele.
  • the “molecular beacon” of SEQ ID N ° 17 is used simultaneously with a “molecular beacon” of SEQ ID N ° 18, which made it possible to detect very quickly, and from a only reaction, the presence or absence of the mutation for the Factor IL gene Thanks to the analysis of FIGS. 7 and 8, it can therefore be determined whether the sample has the G / G, G / A or A / A genotype.
  • the results of 130 samples including cell lines (squares) and samples extracted from fresh blood (triangle and round) are shown in the figure
  • Each symbol represents a sample tested and positioned according to the value of the O / C ratio of the FAM beacons and FOC ratio of the ROX beacon for this sample. Thanks to the positivity detection limits of these two beacons, Factor II typing can be determined graphically for 130 samples.
  • a sample is classified A / A when its O / C ratio beacon ROX specific for the mutated allele (A) is greater than 3.5 and when its O / C ratio beacon FAM specific for the wild allele (G) is less than 1.8 .
  • a sample is classified G / G when its O / C ratio beacon ROX specific for the mutated allele (A) is less than 3.5 and when its O / C ratio beacon FAM specific for wild alu (G) is greater than 1.8 .
  • a sample is classified G / A when its O / C ratio beacon ROX specific for the mutated allele (A) is greater than 3.5 and when its O / C ratio beacon FAM specific for the wild allele (G) is greater than 1.8 .
  • the fresh blood samples were genotyped.

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Abstract

L'invention concerne un procédé in vitro pour le diagnostic/pronostic d'une thrombose comprenant les étapes suivantes : A - on extrait le matériel nucléique d'un échantillon biologique, B - on utilise au moins une paire d'amorces d'amplification pour obtenir des amplicons d'au moins une séquence cible du matériel nucléique C - on utilise au moins une sonde de détection pour détecter h présence desdits amplicons caractérisé en ce que, lors de l'étape B, ladite paire d'amorce comprend au moins une amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N' l ; 3 à 8, 15 et 16.

Description

Procédé pour le diagnostic/pronostic d'une thrombose
La présente invention concerne un procédé in vitro pour le diagnostic/pronostic de la thrombose. L'invention concerne également des amorces d'amplification et des sondes d'hybridation qui peuvent être πises en oeuvre dans ce procédé, ainsi qu'un kit de diagnostic/pronostic d'une thrombose.
La coagulation est un système homéostatique essentiel qui doit être correctement régulé afin d'éviter les hémorragies aussi bien que les thromboses. Cette coagulation fait intervenir une cascade d'activations de précurseurs circulants inactifs qui, par perte d'une extrémité de leur chaîne protéique donnent des facteurs activés. Parmi ces facteurs de coagulation, on peut citer notamment le facteur II et le facteur V. Le facteur IL également appelé prothrombine, est une pro-enzyme synthétisée par le foie. Elle est activée en thrombine, forme active, par les facteurs X et V activés en présence de phospholipides. Quand elle est activée, elle est responsable de la protéolyse du fibrinogène en fibrine.
Parmi les altérations connues de l'hémostase, on peut citer notamment les thromboses artérielles, qui se manifestent sous formes d'infarctus du myocarde , d'attaques, et par des maladies artérielles périphériques, ainsi que les thromboses emboliques veineuses qui sont des causes majeures de morbidité et de mortalité. Des mutations des gènes codant les facteurs II et V seraient des facteurs de risque de ces altérations. Ainsi, en 1996, l'étude des régions codantes et adjacentes du gène codant le facteur II, dans une famille avec différents individus atteints de thrombose veineuse, a permis de mettre en évidence une mutation à la position 20210 du gène (ci après appelé mutation 20210). Cette mutation entraîne une augmentation de 25% de l'activité de la thrombine dans le plasma et est considérée comme un facteur de risque aux thromboses veineuses. La mutation du nucleotide 1691 du gène codant le facteur V, appelée mutation Leiden du facteur V est également un facteur de risque. Cette mutation augmente le risque de thrombose veineuse de 4 à 8 fois chez les individus hétérozygotes et de 50 à 100 fois pour les homozygotes.
Une détection précoce des mutations 20210 du facteur II et la mutation Leiden du facteur V est donc essentielle {fin de prévenir le plus tôt possible les risques de thrombose veineuse. De plus, de nombreuses études montrent que la mutation 20210 du facteur II et la mutation Leiden du facteur V sont souvent cohéritées et la présence des deux mutations induit une augmentation du risque de thrombose veineuse. Il est donc également important d'étudier ces deux mutations simultanément.
Le brevet US 6 558 913 présente une méthode pour détecter la présence d'un risque génétique de thrombose, basée sur la détection de la mutation Leiden du facteur V. On peut également citer le brevet US 6 043 035 qui présente une méthode pour détecter la présence d'un risque génétique de thrombose, basée sur la détection de la mutation 20210 du facteur I Ces méthodes comprennent notamment me étape d'amplification de la région du gène dans laquelle est située la mutation, par F utilisation d'amorces d'amplification, suivie d'une étape de détection de la mutation par l'utilisation d'une sonde de détection spécifique de la mutation. Ces méthodes ne permettent toutefois pas la détection simultanée de la mutation Leiden du facteur N et la mutation 20210 du facteur H, qui augmente pourtant grandement le risque de thrombose chez un patient. La détection précoce de cette double mutation, qui peut se faire séquentiellement ou séparément, permet de prévenir le patient et lui proposer un traitement adapté. De plus, ces méthodes peuvent être optimisées par le choix des amorces d'amplification utilisées lors de l'étape d'amplification, afin d'améliorer l'étape de détection, et cela d'autant plus lors que l'étape d'amplification est réalisée simultanément à l'étape de détection.
A ce titre, la présente invention se propose d'améliorer l'état de la technique en proposant un nouveau procédé pour évaluer le risque de thrombose d'un patient. Ce procédé met notamment en œuvre lors de l'étape d'amplification de nouvelles amorces d'amplification parfaitement adaptée pour la détection d'une mutation augmentant le risque de thrombose. Ces nouvelles amorces d'amplification peuvent de plus être utilisées au sein de la même réaction d'amplification, ce qui permet notamment de déterminer par une réaction unique la présence des mutations 20210 du facteur II et la mutation Leiden du facteur V.
A ce titre, l'invention concerne un procédé in vitro pour le diagnostic/pronostic d'une thrombose comprenant les étapes suivantes : A - on extrait le matériel nucléique d'un échantillon biologique, B - on utilise au moins une paire d'amorces d'amplification pour obtenir des amplicons d'au moins une séquence cible du matériel nucléique, C - on utilise au moins une sonde de détection pour détecter la présence desdits amplicons, caractérisé en ce que, lors de l'étape B, ladite paire d'amorce comprend au moins une amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N°l ; 3 à 8, 15 et 16.
Au sens de la présente invention, on entend par diagnostic/pronostic d'une thrombose, l'établissement d'un profil de risque génétique de la thrombophilie.
Au sens de la présente invention, on entend par échantillon biologique, tout échantillon susceptible de contenir un matériel nucléique tel que défini ci après. Cet échantillon biologique peut être prélevé chez un patient et peut être rotamment un échantillon de tissus, de sang, de sérum, de salive, de cellules circulantes du patient. On dispose de cet échantillon biologique par tout type de prélèvement connu de l'homme du métier.
Au sens de la présente invention, le matériel nucléique comprend une séquence d'acides nucléiques telle que séquence d'acides désoxyribonucléiques (ADN) ou d'acides ribonucléiques (ARN). Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le matériel nucléique comprend une séquence d'acides désoxyribonucléiques. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le matériel nucléique est extrait d'un échantillon biologique prélevé chez un patient. Par séquence nucléotidique (ou séquences d'acides nucléiques ou fragment nucléotidique ou oligonucléotide, ou polynucléotide), on entend un enchaînement de motifs nucléotidiques assemblés entre eux par des liaisons ester phosphorique, caractérisé par la séquence informationnelle des acides nucléiques naturels, susceptibles de s'hybrider à une autre séquence d'acides nucléiques, l'enchaînement pouvant contenir des monomères de structures différentes et être obtenu à partir d'une molécule d'acide nucléique naturelle et/ou par recombinaison génétique et/ou par synthèse chimique. Par motif nucléotidique, on entend un dérivé d'un monomère qui peut être un nucleotide naturel d'acide nucléique dont les éléments constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base azotée; dans l'ADN le sucre est le désoxy-2-ribose, dans TARN le sucre est le ribose ; selon qu'il s'agisse de l'ADN ou l'ARN, la base azotée est choisie parmi l'adénine, la guanine, l'uracile, la cytosine, la thymine ; ou bien le monomère est un nucleotide modifié dans l'un au moins des trois éléments constitutifs ; à titre d'exemple, la modification peut intervenir soit au niveau des bases, avec des bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5désoxyuridine, la diaιnino-2,6-purine, la bromo -5 désoxyuridine ou toute autre base modifiée capable d'hybridation, soit au niveau du sucre, par exemple le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide (P.E. Nielsen et al, Science, 254, 1497-1500 (1991), soit encore au niveau du groupement phosphate, par exemple son remplacement par des esters notamment choisis parmi les diphosphates, alkyl- et aryl-phosphonates et phosphorothioates. Ce matériel nucléique comprend au moins une séquence cible.
Par séquence cible, on entend une séquence dont l'enchaînement en motifs nucléotidiques est spécifique d'un gène cible, tel que préférentiellement le gène codant le facteur π ou le gène codant le facteur V. Au sens de la présente invention, la séquence cible comprend une mutation qui augmente le risque de thrombose telle que notamment la mutation Leiden du facteur V ou la mutation 20210 du facteur II, Dans la suite de l'exposé, on parlera de séquence cible qu'elle soit en simple brin ou en double brin.
Lors de l'étape A, on extrait le matériel nucléique d'un échantillon biologique par tout protocole connu de l'homme du métier. A titre indicatif, l'extraction d'acides nucléique peut être réalisée par une étape de lyse des cellules présentes dans l'échantillon biologique, afin de libérer les acides nucléiques contenus dans les enveloppes protéiques et/ou lipidiques des cellules (comme des débris cellulaires qui perturbent les réactions ultérieures). A titre d'exemple, on peut utiliser les méthodes de lyse telles que décrite dans les demandes de brevet WO00/05338 sur la lyse mixte magnétique et mécanique, WO99/53304 sur la lyse électrique, et WO99/15321 sur la lyse mécanique. L'homme du métier pourra utiliser d'autres méthodes de lyse bien connues, telles que les chocs thermiques ou osmotiques ou les lyses chimiques par des agents chaotropiques tels que les sels de guanidium (US 5,234,809). Cette étape de lyse peut également être suivie d'une étape de purification, permettant la séparation entre les acides nucléiques et les autres constituants cellulaires relargués dans l'étape de lyse. Cette étape permet généralement de concentrer les acides nucléiques, et peut être adapté à la purification d'ADN ou d'ARN. A titre d'exemple, on peut utiliser des particules magnétiques éventuellement revêtues d'oligonucléotides, par adsorption ou covalence (voir à ce sujet les brevets US 4,672,040 et US 5,750,338), et ainsi purifier les acides nucléiques qui se sont fixés sur ces particules magnétiques, par une étape de lavage. Cette étape de purification des acides nucléiques est particulièrement intéressante si l'on souhaite amplifier ultérieurement lesdits acides nucléiques. Un mode de réalisation particulièrement intéressant de ces particules magnétiques est décrit dans les demandes de brevet WO97/45202 et WO99/35500. Un autre exemple intéressant de méthode de purification des acides nucléiques est l'utilisation de silice soit sous forme de colonne, soit sous forme de particules inertes (Boom R. et al., J. Clin. Microbiol., 1990, n°28(3), p. 495-503) ou magnétiques (Merck: MagPrep® Sihca, Promega: MagneSil™ Paramagnetic particles). D'autres méthodes très répandues reposent sur des résines échangeuses d'ions en colonne ou en format particulaire paramagnétique (Whatman: DEAE-Magarose) (Levison PR et al., J. Chromatography, 1998, p. 337-344). Une autre méthode très pertinente mais non exclusive pour l'invention est celle de l'adsorption sur support d'oxyde métallique (société Xtrana: matrice Xtra-Bind™).
Lorsque l'on souhaite extraire spécifiquement l'ADN d'un échantillon biologique, on peut notamment réaliser une extraction par du phénol, du chloroforme et de l'alcool pour éhminer les protéines et précipiter l'ADN avec de l'alcool. L'ADN peut alors être culoté par centrifugation, lavé et remis en suspension.
Lors de l'étape B on utilise au moins une paire d'amorces d'amplification pour obtenir des amplicons d'au moins une séquence cible du matériel nucléique. Au sens de la présente invention, on entend par amorce d'amplification une séquence nucléique comprenant de 10 à 100 motifs nucléotidiques, préférentiellement de 15 à 25 motifs nucléotidiques. Cette amorce d'amplification comprend au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques d'une séquence choisie parmi les SEQ ID N°l ; 3 à 8
Au sens de la présente invention, une amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de • une séquence homologue à la SEQ ID N°l ; 3 à SEQ ID N°8 ; 15 et 16, c'est à dire o la séquence complémentaire de la SEQ ID N°l ; 3 à 8; 15 et 16 o une séquence présentant une homologie suffisante pour s'hybrider à la SEQ ID N°l ; 3 à SEQ ID N°8; 15 et 16 ou à la séquence complémentaire à la SEQ ID N°l ; 3 à SEQ ID N°8; 15 et 16, • une séquence comprenant une séquence de SEQ ID N°l ; 3 à SEQ ID N°8; 15 et 16 (ou une séquence homologue à SEQ ID N°l ; 3 à SEQ ID N°8; 15 et 16 telle que définie précédemment) dans laquelle les bases uracile sont substituées aux bases thymine, et qui aurait la même fonction que l'amorce d'amplification selon l'invention, c'est à dire amplifier tout ou partie du gène codant le facteur V (SEQ ID N°l ; 3 à 4) suceptible de contenir la mutation Leiden ou tout ou partie du gène codant le facteur II (SEQ ID
N°5 à 8; 15 et 16), suceptible de contenir la mutation 20210, est considérée comme équivalente à l'amorce d'amplification selon l'invention.
Une paire d'amorces d'amplification permet l'initiation d'une polymérisation enzymatique, telle que notamment une réaction d'amplification enzymatique. Par réaction d'amplification enzymatique, on entend un processus générant de multiples copies (ou amplicons) d'une séquence nucléique par l'action d'au moins une enzyme.
Au sens de la présente invention, on entend par amplicons les copies de la séquence cible obtenues lors d'une réaction d'amplification enzymatique. De telles réactions d'amplification sont bien connues de l'homme du métier et on peut citer notamment la PCR (Polymerase Chain Reaction), telle que décrite dans les brevets US-A-4,683,195,
US-A-4,683,202 et US-A-4,800,159 ; la LCR (Ligase Chain Reaction), exposée par exemple dans la demande de brevet EP-A-0201 184 ; la RCR (Repair Chain Reaction), décrite dans la demande de brevet WO-A-90/01069 ; la 3SR (Self Sustained Séquence
Replication) avec la demande de brevet WO-A-90/06995 ; la NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amphfication) avec la demande de brevet WO-A-91/02818, ou encore la TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US-A-5,399,491.
D'une manière générale, ces réactions d' amphfication enzymatique mettent généralement une succession de cycle comprenant les étapes suivantes : o la dénaturation de la séquence cible si celle ci est en double brin afin d'obtenir deux brins cibles, complémentaires, o l'hybridation de chacun des brins cibles, obtenus lors de l'étape de dénaturation précédente avec au moins une amorce d'amplification , o la formation à partir des amorces d'amplification des brins complémentaires aux brins sur lesquels elles sont hybridées en présence d'une enzyme polymérase et de nucléosides triphosphate (ribonucléoside triphosphate et/ou desoxyribonucléoside triphosphate selon les techniques) ce cycle étant répété un nombre de fois déterminé pour obtenir la séquence cible dans une proportion suffisante pour permettre sa détection.
Par hybridation, on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux séquences nucléiques telle que notamment une amorce d'amplification et une séquence cible ou une sonde d'hybridation et une séquence cible, se lient avec des liaisons hydrogènes stables et spécifiques pour former un double brin. Ces liaisons hydrogènes se forment entre les bases complémentaires Adénine (A) et thymine (T) (ou uracile (U)) (on parle de liaison A-T) ou entre les bases complémentaires Guanine (G) et cytosine (C) (on parle de liaison GC). L'hybridation de deux séquences nucléiques peut être totale (on parle alors de séquences complémentaires), c'est à dire que le double brin obtenu lors de cette hybridation comprend uniquement des liaisons AT et des liaisons C-G. Cette hybridation peut être partielle (on parle alors de séquences suffisamment complémentaires), c'est à dire que le double brin obtenu comprend des liaisons AT et des liaisons C-G permettant de former le double brin, mais également des bases non liées à une base complémentaire. L'hybridation entre deux séquences complémentaires ou suffisamment complémentaires dépend des conditions opératoires qui sont utilisées, et notamment de la stringence. La stringence est définie notamment en fonction de la composition en bases des deux séquences nucléiques, ainsi que par le degré de mésappariernent entre ces deux séquences nucléiques. La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier. D'une façon plus précise, la NASBA est une technologie d' amphfication isotherme de l'acide nucléique reposant sur l'action conjointe de trois enzymes (transcriptase inverse AMV, Rnase-H et polymérase- ARN T7). Associée à des amorces d'amplification spécifiques d'une séquence cible, elle amplifie les cibles ARN plus d'un milliard de fois en 90 minutes. La réaction d'amplification se produit à 41 °C et donne des molécules d'ARN simple brin comme produit final. La NASBA nécessite une paire d'amorce, dont au moins une comprend un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage T7. Lors de l'étape C, on utilise au moins une sonde de détection pour détecter la présence desdits amplicons. E-éférentiellement, cette sonde de détection permet de détecter non seulement la présence desdits amplicons, mais permet également de détecter la présence d'une mutation donnée, suceptible d'être comprise dans l'amplicon. Cette étape de détection, peut être réalisée par tous les protocoles connus de l'homme du métier concernant la détection d'acides nucléiques.
Au sens de la présente invention, on entend par sonde d'hybridation, une séquence nucléique possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec une séquence nucléique cible. La sonde d'hybridation peut comprendre un marqueur permettant sa détection. On parle alors de sondes de détection. Par détection on entend soit une détection directe par une méthode physique, soit une détection indirecte par une méthode de détection à l'aide d'un marqueur. De nombreuses méthodes de détection existent pour la détection des acides nucléiques. [Voir par exemple Kricka et al., Clinical Chemistry, 1999, n° 45(4), p.453- 458 ou Keller G.H. et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, 1993, sections 5 et 6, p.173-249]. Par marqueur, on entend un traceur capable d'engendrer un signal que l'on peut détecter. Une liste non limitative de ces traceurs comprend les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence ou luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la bêta galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase; les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents ou colorants ; les groupements à densité électronique détectables par microscopie électronique ou par leurs propriétés électriques comme la conductivité, par les méthodes d'ampérométrie ou de voltamétrie, ou par des mesures d'impédance ; les groupements détectables par des méthodes optiques comme la diffraction, la résonance plasmon de surface, la variation d'angle de contact ou par des méthodes physiques comme la spectroscopie de force atomique, l'effet tunnel, etc. ; les molécules radioactives comme 32P, 35S ou 1 5I. La sonde de détection peut être notamment une sonde de détection « molecular beacons » telle que décrite par Tyagi & Kramer (Nature biotech, 1996, 14 :303-308).
Ces "molecular beacons" deviennent fluorescentes lors de l'hybridation. Elles possèdent une structure de type tige-boucle et contiennent un fluorophore et un groupe inhibiteur ou "quencher". La fixation de la séquence de boucle spécifique avec sa séquence complémentaire d'acide nucléique cible provoque un déroulement de la tige et l'émission d'un signal fluorescent lors de l'excitation à la longueur d'onde qui convient.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la sonde de détection comprend un flurophore et un quencher. Selon un mode encore plus préféré de réalisation de l'invention, la sonde d'hybridation comprend un flurophore FAM (6-carboxy- fluorescein) ou ROX (6-carboxy-X-rhodamine) en son extrémité 5' et un quencher (Dabsyl) en son extrémité 3'. Dans la suite de l'exposé, une telle sonde d'hybridation est appelée « molecular beacon ». Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on détecte, lors de l'étape C) la présence ou l'absence de la mutation Leiden du facteur V. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on détecte, lors de l'étape C) la présence ou l'absence ou de la mutation 20210 du facteur H. Selon un mode encore plus préféré, on détecte simultanément la présence ou l'absence de la mutation Leiden du facteur V et de la mutation 20210 du facteur H Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, lors de l'étape C), ladite sonde de détection comprend au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N°9 à 12 ; 17 et 18. Ainsi, l'utilisation d'une sonde de détection comprenant la SEQ ID N° 9 permet de diagnostiquer la présence de la mutation Leiden du facteur V, alors que l'utilisation d'une sonde de détection comprenant la SEQ ID N°10 permet de diagnostiquer l'absence de la mutation Leiden du facteur V.
De même, l'utilisation d'une sonde de détection comprenant la SEQ ID N° 11 permet de détecter la présence de la mutation 20210 du facteur II, alors que l'utilisation d'une sonde de détection comprenant la SEQ ID N°12 permet de détecter l'absence de la mutation 20210 du facteur IL De plus, l'utilisation d'une sonde de détection comprenant la SEQ ID N° 17 permet de détecter la présence de la mutation 20210 du facteur π, alors que l'utilisation d'une sonde de détection comprenant la SEQ ID N°18 permet de détecter l'absence de la mutation 20210 du facteur II
Selon un mode préféré de réahsation de l'invention, lors de l'étape B, ladite paire d'amorces est choisie parmi les paires d'amorce suivantes : α une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°l et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°2 ; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°l, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°2, on obtient un amplicon, spécifique du gène codant le facteur V, d'une taille de 159 paires de base, qui correspond à la séquence 36568-36726 sur la séquence du gène codant le facteur V de référence (NT_004668). Cette amplicon peut contenir l'allèle mutée responsable de la mutation Leiden ou l'allèle sauvage, l'allèle étant caractérisée lors de l'étape C. α une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°3 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°4 ; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°3, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°4, on obtient un amplicon, spécifique du gène codant le facteur V, d'une taille de 374 paires de base, qui correspond à la séquence 36568-36941 sur la séquence du gène codant le facteur V de référence (NT_004668). Cette amplicon peut contenu- l'allèle mutée responsable de la mutation Leiden ou l'allèle sauvage , l'allèle étant caractérisée lors de l'étape C. α une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°5 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°6 ; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°5, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°6, on obtient un amplicon, spécifique du gène codant le facteur II, d'une taille de 145 paires de base, qui correspond à la séquence 21455-21599 sur la séquence du gène codant le facteur II de référence (AF478696). Cette amplicon peut contenir l'allèle mutée responsable de la mutation 20210 du facteur II ou l'allèle sauvage , l'allèle étant caractérisée lors de l'étape C. P une première amorce d' amphfication comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°7 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°8 ; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°7, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°8, on obtient un amplicon, spécifique du gène codant le facteur II, d'une taille de 434 paires de base, qui correspond à la séquence 21217-21650 sur la séquence du gène codant le facteur II de référence (AF478696). Cette amplicon peut contenir l'allèle mutée responsable de la mutation 20210 du facteur II ou l'allèle sauvage , l'allèle étant caractérisée lors de l'étape C. p une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°15 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°16 ; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ED N°15, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°16, on obtient un amplicon, spécifique du gène codant le facteur II, d'une taille de 108 paires de base, qui correspond à la séquence 21465-21573 sur la séquence du gène codant le facteur π de référence (AF478696). Cette amplicon peut contenir l'allèle mutée responsable de la mutation 20210 du facteur II ou l'allèle sauvage , l'allèle étant caractérisée lors de l'étape C.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, hdite paire d'amorce comprend au moins une amorce d' amphfication comprenant un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage T7. Préférentiellement, cette première amorce d'amplification comprend une séquence choisie parmi les séquences de SEQ ID N° 13 à 14.
Selon un mode préféré de réahsation de l'invention, l'étape B et l'étape C sont réalisée simultanément Ceci peut être mise en œuvre notamment par une réaction d'amplification NASBA avec détection en temps réel. La détection en temps réel des amplicons peut être réalisée par l'utilisation d'un lecteur Nuclisens EasyQ® (bioMérieux BV, The Netherlands) et sondes de détection «molecular beacons », telles que définies précédemment. D'une manière générale, l'amplification d'ADN en NASBA peut s'effectuer de la manière suivante : l'ADN est dénaturé à 95°C pour permettre la fixation d'une «première amorce », comprenant un promoteur de la polymérase T7 (une seule amorce est présente à ce stade). A 41°C, l'enzyme reverse transcriptase (AMV-RT) est ajoutée et permet l'extension de l'amorce. Puis une « deuxième amorce » est ajoutée et une nouvelle dénaturation est effectuée. Une alternative est réalisée en ajoutant simultanément les deux amorces, afin de ne réaliser qu'une seule étape de dénaturation. Après cette phase d'initiation, la NASBA rentre dans un phase cychque : la «deuxième amorce » s'hybride à une nouvelle molécule d'ARN formée ; l'AMV-RT étend cette amorce ; la RNase H dégrade l'ARN des hybrides ARN/ADNc ; une «première amorce » se fixe sur l'ADNc obtenu ; l'AMV- RT synthétise à partir de celui-ci un nouveau brin complémentaire puis à partir de ce brin, étend la partie T7 de la «première amorce » ; ainsi la T7 RNA polymérase possède de nouveUes matrices avec une double queue T7 pour générer les ARNs. Lorsque le « molecular beacon » est en solution, le quencher, à proximité du fluorophore, inhibe sa fluorescence. En présence de l'acide nucléique cible, le beacon va se fixer sur la séquence complémentaire à celle de la boucle. H va donc changer de conformation et s'ouvrir, éloignant le fluorophore du quencher et permettant ainsi l'émission de fluorescence. Au cours de l'amplification, de nombreuses molécules vont être synthétisées permettant à autant de «molecular beacons » de se fixer. La fluorescence va donc augmenter au cours de la réaction. Un appareil approprié, comme l'EasyQ
Nuchsens Analyser, permet d'enregistrer la fluorescence au cours du temps.
L'invention concerne également une amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15, et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N°l ; 3 à 8 ; 15 et 16.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'amorce d'amplification comprend un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage T7. Préférentiellement, une telle amorce d' amphfication comprend une séquence choisie parmi les séquences de SEQ ID N° 13 à 14.
L'invention concerne également une paire d'amorce d' amphfication choisie parmi les paires d'amorces suivantes : p une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°l et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentieUement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°2 ; à litre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°l, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°2, on obtient un amplicon, spécifique du gène codant le facteur V, d'une taille de 159 paires de base, qui correspond à la séquence 36568-36726 sur la séquence du gène codant le facteur V de référence (NT_004668). p une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°3 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°4 ; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°3, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°4, on obtient un amplicon, spécifique du gène codant le facteur V, d'une taille de 374 paires de base, qui correspond à la séquence 36568-36941 sur la séquence du gène codant le facteur V de référence (NT_004668). p une première amorce d' amphfication comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°5 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°6 ; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°5- et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°6, on obtient un amplicon, spécifique du gène codant le facteur II, d'une taille de 145 paires de base, qui correspond à la séquence 21455-21599 sur la séquence du gène codant le facteur II de référence (AF478696). p une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°7 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°8 ; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°7, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°8, on obtient un amplicon, spécifique du gène codant le facteur II, d'une taille de 434 paires de base, qui correspond à la séquence 21217-21650 sur la séquence du gène codant le facteur II de référence (AF478696). p une première amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentieUement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°15 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10, préférentiellement 15 et encore plus préférentiellement 20 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°16 ; à titre indicatif, lorsque la première amorce a pour séquence la SEQ ID N°15, et la deuxième amorce a pour séquence la SEQ ID N°16, on obtient un amplicon, spécifique du gène codant le facteur II, d'une taille de 108 paires de base, qui correspond à la séquence 21465-21573 sur la séquence du gène codant le facteur II de référence (AF478696).
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ladite première amorce comprend un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage T7. Préférentiellement, cette première amorce d'amplification comprend une séquence choisie parmi les séquences de SEQ ID N° 13 à 14.
L'invention concerne également l'utilisation d'au moins une amorce d' amphfication telle que définie précédemment et/ou d'une paire d'amorce telle que définie précédemment lors d'une réaction d' amphfication NASBA
L'invention concerne également l'utilisation d'au moins une amorce telle que définie précédemment, et/ou d'au moins une paire d'amorces telle que définie précédemment pour le diagnostic/pronostic d'une thrombose.
L'invention concerne enfin un kit pour le diagnostic/pronostic d'une thrombose veineuse comprenant au moins une amorce telle que définie précédemment et/ou d'au moins une paire d'amorces telle que définie précédemment.
Les figures suivantes sont données à titre illustratif et n'ont aucun caractère limitatif. Elles permettront de mieux comprendre l'invention.
Les figures 1 et 2 représentent le génotypage de différentes lignées cellulaires pour la mutation +1691 G/A du Facteur V, grâce à la présence simultanée des molecular beacons de SEQ ID N°10 et SEQ ID N° 9 dans le mélange réactionnel.
Ainsi, la figure la représente le génotypage de la lignée cellulaire GM16000C, homozygote pour l'allèle sauvage (+1691-G) du Facteur V, alors que la figure lb représente le génotypage de la lignée cellulaire GM14899, homozygote pour l'allèle muté (+1691-A) du Facteur V. Les carrés blancs représentent la détection de la fluorescence du « molecular beacons » de SEQ ID N°9, permettant de mettre en évidence l'allèle sauvage du facteur V, alors que les triangles noirs représentent la détection de la fluorecence du «molecular beacons » de SEQ ID N°10, permettant la détection de l'allèle mutée (mutation Leiden).
La figure 2 représente le génotypage de la hgnée cellulaire GM16028B, hétérozygote pour la mutation +1691 du Facteur V. Les carrés blancs représentent la détection de la fluorescence du « molecular beacons » de SEQ ID N°9, permettant de mettre en évidence l'allèle sauvage du facteur V, alors que les triangles noirs représentent la détection de la fluorecence du «molecular beacons » de SEQ ID N°10, permettant la détection de l'allèle mutée (mutation Leiden).
Les figures 3 et 4 représentent le génotypage de différentes lignées cellulaires pour la mutation +20210 G/A du Facteur II, grâce à la présence simultanée des molecular beacons OGH 916 (SEQ ID N° 11, +20210- A) et OGH 1104 (SEQ ID N° 12, +2010-G) dans le mélange réactionnel.
A ce titre, la figure 3a représente le génotypage de la lignée cellulaire GM 14899, homozygote pour l'allèle sauvage (+20210-G) du Facteur π alors que la figure 3b représente le génotypage de la hgnée cellulaire GM16000C, homozygote pour l'allèle muté (+20210- A) du Facteur II. Les croix représentent la détection du « molecular beacons » de SEQ ID N°12, permettant la mise en évidence de l'allèle sauvage, alors que les ronds représentent la détection du « molecular beacons » de SEQ ID N°ll, permettant la détection de la mutation 20210 du facteur π. La figure 4 représente le génotypage de la lignée cellulaire GM16028B, hétérozygote pour la mutation +20210 du Facteur π. On détecte bien la présence de l'allèle muté (ronds noirs) et de l'allèle sauvage (courbe en croix). Les croix représentent la détection du «molecular beacons » de SEQ ID N°12, permettant la mise en évidence de l'allèle sauvage, alors que les ronds représentent la détection du «molecular beacons » de SEQ ID N°l 1, permettant la détection de la mutation 20210 du facteur π.
Les figures 5 et 6 représentent le génotypage de différentes lignées cellulaires (GM 14899 : A/A ; GM 16028B : A/G ; GM 16000C G/G) pour la mutation +1691 du Facteur V, grâce à la présence des molecular beacons SEQ ID N°3 et 4 dans le mélange réactionnel. Ainsi la figure 5 représente la détection du beacon FAM spécifique de l'allèle A du Facteur V (G+1691A) à partir d'ADN des lignées GM14899 (A/A homozygote allèle muté ; triangles), GM16028B (A/G hétérozygote ; croix) et GM16000C (G/G homozygote allèle sauvage ; ronds)
Ainsi la figure 6 représente la détection du beacon ROX spécifique de l'allèle G du facteur V (G+1691A) à partir d'ADN des lignées GM14899 : A/A ( homozygote allèle muté ; triangles) ; GM16028B (A/G hétérozygote ; croix) et GM 16000C (G/G homozygote allèle sauvage, ronds)
Les figures 7 et 8 représentent le génotypage de différents hgnées cellulaires ( GM
14899 : G/G ; GM 16028B : A/G ; GM 16000C A/A) pour la mutation +20210 du
Facteur ϋ, grâce à la présence des molecular beacons SEQ ID N°7 et 8 dans le mélange réactionnel.
Ainsi la figure 7 représente la détection du beacon FAM spécifique de l'allèle G du facteur II (G+20210A) à partir d'ADN des lignées GM14899 : G/G ( homozygote allèle muté ; triangles) ; GM16028B (A/G hétérozygote ; croix) et GM 16000C (A/A homozygote allèle sauvage, ronds) Ainsi la figure 8 représente la détection du beacons ROX spécifique de l'allèle A du facteur II (G+20210A) à partir d'ADN des lignées GM14899 : G/G ( homozygote allèle muté ; triangles) ; GM16028B (A/G hétérozygote ; croix) et GM 16000C (A/A homozygote allèle sauvage, ronds) La figure 9 est une représentation graphique de 72 échantillons (cliniques et lignées cellulaires) Facteur V. Ces échantillons sont positionnés en fonction de leur ratios d'intensité de fluorescence des beacons FAM (spécifique de l'allèle A) et ROX (spécifique de l'allèle G).
La figure 10 est une représentation graphique de 130 échantillons (cliniques et lignée cellulaires) Facteur IL Ces échantillons sont positionnés en fonction de leur ratios d'intensité de fluorescence des beacons FAM (spécifique de l'allèle G) et ROX (spécifique de l'allèle A).
EXEMPLE 1 1/ Echantillon et extraction de l'ADN
Le procédé selon l'invention a été validé sur des hgnées cellulaires, ainsi que sur des échantillons chniques de patients. Lignées cellulaires - Trois hgnées cellulaires lymphoblastoïdes de génotype connu pour les mutations Leiden du Facteur V et la mutation 20210 du facteur II (Coriell cell repository) ont été utilisées:
La lignée GM14899 n'exprime que la mutation Leiden du facteur V: cette hgnée est homozygote pour la mutation Leiden du facteur V (A/A) et homozygote pour l'allèle sauvage en position 20120 du facteur H (G/G). La lignée GM16000C n'exprime que la mutation 20210 du facteur II : cette lignée est homozygote pour la mutation 20210 du facteur π (A/A) et homozygote pour l'allèle sauvage en position 1691 du facteur V
(G/G). La lignée GM16028B est hétérozygote pour les 2 mutations (G/A). Ces lignées cellulaires ont été mises en culture (37°C, CO2 5%) dans un milieu RPMI 1640, supplémenté en sérum fœtal de bœuf (15%), L glutamine (2mM), Peni- streptomycine (pénicilhne :200 U/ ml ; streptomycine : 0,2 mg/ml). L'extraction d'ADN a été réalisée à partir d'un culot cellulaire de GM16000C, d'un culot cellulaire de GM16028B ou de GM14899. Les cellules culotées sont soumises à une lyse hypotonique et à une digestion enzymatique par la protéinase K. Après déprotéinisation, l'ADN est précipité à l'éthanol, séché, et dissout dans de l'eau. La quantité et qualité de l'ADN étaient déterrninées par spectrophotométrie UV. Echantillon de patients - 200 μl de sang prélevés chez des patient dont la présence de la mutation Leiden était connu ont été utilisés. L'ADN génomique a été extrait par l'utilisation du kit NucleoSpin kit (Marcherey-Nagel, Hoerdt, France), et repris dans 20 μl d'eau DNAse-free. La quantité et qualité de l'ADN étaient déterminées sur gel agarose contenant du bromure d'éthidium, et par spectrophotométrie UV. Clonage de la région d'intérêt : Afin d'obtenir une grande quantité d'ADN de la région susceptible d'exprimer la mutation Leiden du facteur V, une PCR a été réalisée a partir de l'ADN génomique tel qu'obtenu précédemment, à partir de lignées cellulaires ou d'échantillons sanguins, par l' utilisation d'une paire d'amorces d'amplification comprenant la SEQ ID N° 3, 5' AGTGCTTAACAAGACCATACTA 3' pour la première amorce et la SEQ ID N°4, 5' AACAGACCTGGAATTTGAAACTAA 3' pour la deuxième amorce. Les paramètres de la PCR étaient les suivants: 2 min à 95°C; 30 cycles de 30 s à 95°C, 30 s à 55°C, 30 s à 72°C; suivis de 7 min à 72°C). Les amplicons ainsi obtenus étaient clones dans un vecteur PCR-Trap (GeneHunter, USA) et vérifiés par séquençage. Les plasmides, contenant soit un nucleotide G soit un nucleotide A en position 1691 ont été amplifiés et purifiés par l'utilisation d'un kit Plasmid Maxi kit
(Qiagen; Germany).
Afin d'obtenir une grande quantité d'ADN de la région susceptible d'exprimer la mutation 20210 du facteur H, une PCR a été réalisée a partir de l'ADN génomique tel qu'obtenu précédemment, à partir de hgnées cellulaires ou d'échantillons sanguins, par l'utilisation d'une paire d'amorces d' amphfication comprenant la SEQ ID N° 7, 5'
TCTAGAAACAGTTGCCTGGC 3' pour la première amorce et la SEQ ID N°8, 5'
CTACCAGCGTGCCACCAGGT 3' pour la deuxième amorce. Les paramètres de la
PCR étaient les suivants: 2 min à 95°C; 30 cycles de 30 s à 95°C, 30 s à 55°C, 30 s à 72°C; suivis de 7 min à 72°C). Les amplicons ainsi obtenus étaient clones dans un vecteur PCR-Trap (GeneHunter, USA) et vérifiés par séquençage. Les plasmides, contenant soit un nucleotide G soit un nucleotide A en position 1691 ont été amplifiés et purifiés par l'utilisation d'un kit Plasmid Maxi kit (Qiagen; Germany). 2) Amplification par NASBA
Afin de déterminer le génotypage de l'ADN prélevé d'un patient ou d'une lignée cellulaire, un mélange réactionnel d'amplification (40m_M Tris HC1 ph 8,5 ; 12 mM MgC12 ; 70 mM KC1; 5 mM dithiothéitol ; 15% v/v DMSO ; 1 mM dNTP) contenant les amorces d' amphfication permettant d'amplifier soit la région susceptible de contenir la mutation Leiden, soit la région suceptible de contenir la mutation 20210 du facteur II, et des sondes de détection, spécifiques de chaque mutation a été réalisé. Ainsi, le milieu réactionnel permettant de détecter la présence de la mutation Leiden du facteur V comprenait : - 0,2 μM (concentration finale) d'une première amorce d'amplification de SEQ ID N°2, 5' AGT GCT TAA CAA GAC CAT ACT A 3', - 0,2 μM (concentration finale) d'une deuxième amorce d'amplification de SEQ ID N°l, 5' AAA TTC TCA GAA TTT CTG AAA GG 3' comprenant le promoteur de la polymérase du phage T7, c'est à dire une amorce d'amplification dont la séquence totale correspond à la SEQ ID N°13, 5' aat tct aat acg act cac tat agg gag aAA ATT CTC AGA ATT TCT GAA AGG 3' - 0,2 μM (concentration finale) de « molecular "beacons » de SEQ ID N° 9, 5' CTG GAC AGG CGA IGA A 3', marquées avec un fluorophore ROX (6- carboxy-X-rhodamine) en 5', et d'un «quencher » (Dabsyl) en 3' (séquence complète : 5' ROX-cgatcg CTGGACAGGCGAIGAAc£αte£-Dabsyl 3'). Ce « moleculai- beacon» permettait de mettre en évidence l'absence de la mutation Leiden. - 0,1 μM (concentration finale) de « molecular beacons » de SEQ ID N° 10, 3' CTG GAC AGG CAA IGA A 3', marquées avec un fluorophore FAM (6- carboxy-fluorescein) en 5', et d'un «quencher » (Dabsyl) en 3', (séquence complète : 5' ΕΑM-cgatcg CTGGACAGGCAAIGAAcgαte£-Dabsyl 3'). Ce « molecular beacon » permettait de mettre en évidence la présence de la mutation Leiden.
Pour le facteur II ont été ajoutés dans le milieu réactionnel : 0,2 μM (concentration finale) d'une première amorce d'amplification de SEQIDN°6,5' TTCTGGGCTCCTGGA ACCAA 3' 0,2 μM (concentration finale) d'une deuxième amorce d'amplification de SEQ ID N°5, 5' ATT ACT GGC TCT TCC TGA GC 3', comprenant le promoteur de la polymérase du phage T7, c'est à dire une amorce d' amphfication dont la séquence totale correspond à la SEQ ID N°14 - 0,1 μM (concentration finale) de « molecular beacons » de SEQ ID N°ll, 5' ACT CTC AGC AAG CCT CAA 3', marquées avec un fluorophore ROX (6-carboxy-X-rhodamine) en 5', et d'un « quencher » (Dabsyl) en 3' (séquence complète : 5' ROX-cga tcg ACT CTC AGC AAG CCT CAA cga tcg-Dabsyl 3'). Ce « molecular beacon» permettait de mettre en évidence la présence de la mutation 20210 du facteur IL - 0,2 μM (concentration finale) de «molecular beacons » de SEQ ID N°12, 5' ACT CTC AGC GAG ICT CAA 3' marquées avec un fluorophore FAM (6- carboxy-fluorescein) en 5', et d'un «quencher » (Dabsyl) en 3', (séquence complète : 5' FAM-cgg tcg ACT CTC AGC GAG ICT CAA cga ccg-Dabsyl 3'). Ce «molecular beacon » permettait de mettre en évidence l'absence de la mutation 20210 du facteur IL
Comme le montre la figure 1, le «molecular beacon» de SEQ ID N° 9, marquées avec un fluorophore ROX (6-carboxy-X-rhodamine) est très spécifique de l'allèle sauvage : en effet, la fluorescence était exponentielle, avant l'apparition d'un plateau, lorsque la réaction était effectuée à partir d'une hgnée cellulaire n'exprimant pas la mutation Leiden (courbe en carré blanc ; figure la), alors que la fluorescence restait basale, lorsque la réaction était effectuée à partir d'une lignée cellulaire exprimant la mutation Leiden (courbe en carré blanc ; figure lb). Le « molecular beacons » de SEQ ID N° 10, marquées avec un fluorophore FAM (6- carboxy-fluorescein) est spécifique de l'allèle muté. En effet, la fluorescence était exponentielle, lorsque la réaction était effectué à partir d'une lignée cellulaire exprimant la mutation Leiden (courbe en triangle ; figure lb), alors que la fluorescence restait basale, lorsque la réaction était effectué à partir d'une hgnée cellulaire n'exprimant pas la mutation Leiden (courbe en triangle ; figure la). Par f utilisation de 2 fluorophores différents, le «molecular beacon » de SEQ ID N°9 pouvait être utilisé simultanément avec un «molecular beacon» de SEQ ID N°10, ce qui permettait de détecter très rapidement, et à partir d'une seule réaction, la présence ou l'absence de la mutation Leiden du facteur V. Les résultats sont présentés dans la figure 2, obtenue à partir d'une lignée cellulaire hétérozygote pour la mutation Leiden du facteur V. Ces deux « molecular beacons », utilisées simultanément avec les amorces d'amplification de SEQ ID N°l et SEQ ID N°2 permettent donc de différencier clairement les deux allèles. Des résultats comparables étaient obtenus à partir d'échantillons cliniques. Les résultats obtenus peuvent également être exprimés par le rapport entre la fluorescence émise lorsque le plateau est atteint et la fluorescence initiale (ratios O/C (open/close ratios) : plus le ratio est élevé, plus l'hybridation entre molecular beacon et l' amplicon est spécifique et plus la discrimination entre les deux allèles est importantes. Les résultats sont présentés dans le tableau 1 ci dessous :
Figure imgf000022_0001
Tableau 1 : ratio O/C obtenus sur des lignées cellulaires et des échantillons sanguins exprimant ou n'exprimant pas la mutation de Leiden
Ces résultats démontrent que l'utilisation d'un «molecular beacon » de SEQ ID N°9 simultanément à l' amphfication en NASBA avec une paire d'amorce d' amphfication, comprenant une première amorce comprenant la SEQ ID N°l et une deuxième amorce comprenant la SEQ ID N°2 permettait de détecter d'une manière très spécifique l'absence de la mutation Leiden. L'utilisation d'un «molecular beacon » de SEQ ID N°10 simultanément à l'amplification en NASBA avec une paire d'amorce d'amplification, comprenant une première amorce comprenant la SEQ ID N°l et une deuxième amorce comprenant la SEQ ID N°2 permettait de détecter d'un manière très spécifique la présence de la mutation Leiden.
Comme le montre la figure 3, le « molecular beacon » de SEQ ID N°12, marquées avec un fluorophore FAM (6-carboxy-fluorescein) est très spécifique de l'allèle sauvage du facteur H. En effet, la fluorescence était exponentielle, lorsque la réaction était effectué à partir d'une lignée cellulaire n'exprimant pas la mutation 20210 (courbe en croix ; figure 3a), alors que la fluorescence restait basale, lorsque la réaction était effectué à partir d'une hgnée cellulaire exprimant cette mutation (courbe en croix ; figure 3b). Le « molecular beacons » de SEQ ID N° 11, marquée avec un fluorophore ROX (6- carboxy-X-rhodamine) est spécifique de l'allèle muté. La fluorescence était exponentielle, lorsque la réaction était effectué à partir d'une lignée ceUulaire xprimant la mutation 20210 (courbe en rond ; figure 3b), alors que la fluorescence restait basale, lorsque la réaction était effectuée à partir d'une lignée cellulaire n'exprimant pas cette mutation (courbe en rond ; figure 3a).
Par l'utilisation de 2 fluorophores différents, le «molecular beacon» de SEQ ID N° 11 pouvait être utilisé simultanément avec un «molecular beacon » de SEQ ID N° 12, ce qui permettait de détecter très rapidement, et à partir d'une seule réaction, la présence ou l'absence de la mutation 20210 du facteur π. C'est ce qui est représenté figure 4, obtenue à partir d'une lignée cellulaire hétorozygote pour la mutation 20210 du acteur H. Des résultats comparables étaient obtenus à partir d'échantillon clinique. De plus, selon un protocole comparable, 203 ADNs cliniques ont été génotypes.
L'ensemble des résultats obtenus a été comparé aux résultats obtenus par une technique standart, la RFLP. Cette étude a montré 100% de concordance entre les 2 méthodes de génotypage.
Dans le but d'identifier la présence ou non des différents allèles du Facteur II et du
Facteur V dans un même tube, des essais d'amplification simultanée des deux gènes en présence de 4 « molecular beacons » spécifiques de chaque allèle ont été réalisés. Les mêmes « molecular beacons » et couples d'amorces d'amplification que pour les amplifications des gènes seuls ont été utilisés, aux mêmes concentrations.
EXEMPLE 2
1/ Echantillon et extraction de l'ADN Le procédé selon l'invention a été validé sur des hgnées ceUulaires, ainsi que sur des échantillons cliniques de patients.
Lignées cellulaires - Trois lignées cellulaires lymphoblastoïdes de génotype connu pour les mutations Leiden du Facteur V et la mutation 20210 du facteur II (Coriell cell repository) ont été utilisées: La hgnée GM14899 n'exprime que la mutation Leiden du facteur V: cette lignée est homozygote pour la mutation Leiden du facteur V (A/A) et homozygote pour l'aUèle sauvage en position 20120 du facteur π (G/G). La lignée GM16000C n'exprime que la mutation 20210 du facteur II : cette lignée est homozygote pour la mutation 20210 du facteur II (A/A) et homozygote pour l'aUèle sauvage en position 1691 du facteur V (G/G). La hgnée GM16028B est hétérozygote pour les 2 mutations (G/A).
Ces lignées ceUulaires ont été mises en culture (37°C, CO2 5%) dans un milieu RPMI 1640, supplémenté en sérum fœtal de bœuf (15%), L glutamine (2mM), Peni- streptomycine (pénicilhne :200 U/ ml ; streptomycine : 0,2 mg/ml). L'extraction d'ADN a été réalisée à partir d'un culot cellulaire de GM16000C, d'un culot cellulaire de GM16028B ou de GM14899. Les ceUules culotées sont soumises à une lyse hypotonique et à une digestion enzymatique par la protéinase K. Après déprotéinisation, l'ADN est précipité à l'éthanol, séché, et dissout dans de l'eau. La quantité et qualité de l'ADN étaient déterminées par spectrophotométrie UV.
Echantillon de patients - lOOμL de sang prélevés chez des donneurs sains de ETS (
Etablissement Français du sang ; Lyon) dont le typage Fil FV est inconnu mais testé en parallèle par une technique standard LighlCycler. L'ADN génomique a été extrait par l'utilisation du kit NucliSens Magnetic Extraction reagent et NucliSens Lysis Buffer et l'instrument miniMag. (cf Notice miniMag sauf lavage Wash3 (10 sec au heu de 15 sec) et l'ADN est élue dans 80μL de Elution buffer ( 10min à 70°C + mix à 14000 rpm).
La quantité et la qualité de l'ADN étaient déterminées par spectrophotométrie UV. Clonage de la région d'intérêt : Afin d'obtenir une grande quantité d'ADN de la région susceptible d'exprimer la mutation Leiden du facteur V, une PCR a été réalisée a partir de l'ADN génomique tel qu'obtenu précédemment, à partir de lignées cellulaires ou d'échantillons sanguins, par l'utilisation d'une paire d'amorces d'amplification comprenant la SEQ ID N° 3, 5' AGTGCTTAACAAGACCATACTA 3' pour la première amorce et la SEQ ID N°4, 5' AACAGACCTGGAATTTGAAACTAA 3' pour la deuxième amorce. Les paramètres de la PCR étaient les suivants: 2 min à 95°C; 30 cycles de 30 s à 95°C, 30 s à 55°C, 30 s à 72°C; suivis de 7 min à 72°C). Les amplicons ainsi obtenus étaient clones dans un vecteur PUC19 et vérifiés par séquençage. Les plasmides, contenant soit un nucleotide G soit un nucleotide A en position 1691 ont été amplifiés et purifiés par l'utilisation d'un kit Plasmid Maxi kit (Qiagen; Germany).
Afin d'obtenir une grande quantité d'ADN de la région susceptible d'exprimer la mutation 20210 du facteur II, une PCR a été réalisée a partir de l'ADN génomique tel qu'obtenu précédemment, à partir de lignées cellulaires ou d'échantillons sanguins, par l'utilisation d'une paire d'amorces d' amphfication comprenant la SEQ ID N° 7, 5' TCTAGAAACAGTTGCCTGGC 3' pour la première amorce et la SEQ ID N°8, 5' CTACCAGCGTGCCACCAGGT 3' pour la deuxième amorce. Les paramètres de la PCR étaient les suivants: 2 min à 95°C; 30 cycles de 30 s à 95°C, 30 s à 55°C, 30 s à 72°C; suivis de 7 min à 72°C). Les amplicons ainsi obtenus étaient clones dans un vecteur PCR-Trap (GeneHunter, USA) et vérifiés par séquençage. Les plasmides, contenant soit un nucleotide G soit un nucleotide A en position 1691 ont été amplifiés et purifiés par l'utilisation d'un kit Plasmid Maxi kit (Qiagen; Germany). 2) Amplification par NASBA
Afin de déterminer le génotypage de l'ADN prélevé d'un patient ou d'une hgnée ceUulaire, un mélange réactionnel d'amplification Facteur V ( 40mM tris HC1 ph 8.5 ;
12mM MgC12 ; lOOmM KC1; 5mM dithiothéitol ; 15% v/v DMSO ; 1 mM dNTP) contenant les amorces d' amphfication permettant d'amplifier la région susceptible de contenir la mutation FV Leiden : 0,2 μM (concentration finale) d'une première amorce d'amplification de SEQ ID N°2, 5' AGT GCT TAA CAA GAC CAT ACT A 3', 0,2 μM (concentration finale) d'une deuxième amorce d'amplification de SEQ ID N°l 5' AAA TTC TCA GAA TTT CTG AAA GG 3' comprenant le promoteur de la polymérase du phage T7, c'est à dire une amorce d'amplification dont la séquence totale correspond à la SEQ ID N°13, 5' aat tct aat acg act cac tat agg gag aAA ATT CTC AGA ATT TCT GAA AGG 3' 0,05 μM (concentration finale) de « molecular beacons » de SEQ ID N° 9, 5' CTG GAC AGG CGA IGA A 3', marquées avec un fluorophore ROX (6- carboxy-X-rhodamine) en 5', et d'un «quencher » (Dabsyl) en 3' (séquence complète : 5' ROX-cgatcg CTGGACAGGCGAIGAAc£αtC£-Dabsyl 3'). Ce « molecular beacon» permettait de mettre en évidence l'absence de la mutation Leiden. - 0,025 μM (concentration finale) de « molecular beacons » de SEQ ID N° 10, 3' CTG GAC AGG CAA IGA A 3', marquées avec un fluorophore FAM (6- carboxy-fluorescein) en 5', et d'un «quencher » (Dabsyl) en 3', (séquence complète : 5' FAM-cgatcg CTGGACAGGCAAIGAAcgαtC£-Dabsyl 3'). Ce « molecular beacon » permettait de mettre en évidence la présence de la mutation Leiden.
Afin de déterminer le génotypage de l'ADN prélevé d'un patient ou d'une lignée cellulaire, un mélange réactionnel d'amplification Facteur II ( 40mM tris HC1 ph 8.5 ; 12mM MgC12 ; 70mM KC1 ; 5mM dithiothéitol ; 15% v/v DMSO ; 1 mM dNTP) contenant les amorces d' amphfication permettant d'amplifier la région susceptible de contenir la mutation +20210 du FH : Pour le facteur II ont été ajoutés dans le milieu réactionnel : - 0,2 μM (concentration finale) d'une première amorce d'amplification de SEQ ID N°16, 5' CTGGAACCAATCCCGTGAAAG 3' - 0,2 μM (concentration finale) d'une deuxième amorce d'amplification de SEQ ID N°15, 5' AGCTGCCCATGAATAGCACT 3', comprenant en outre le promoteur de la polymérase du phage T7, c'est à dire correspondant à la SEQ ID N°19 aattctaatacgactcactataggAGCTGCCCATGAATAGCACT - 0,1 μM (concentration finale) de «molecular beacons » de SEQ ID N°17, 5' ACT CTC AGC AAG CCT CAA 3', marquées avec un fluorophore ROX (6-carboxy-X-rhodamine) en 5', et d'un « quencher » (Dabsyl) en 3' (séquence complète : 5' ROX-cga tcg ACT CTC AGC AAG CCT CAA cga tcg-Dabsyl 3'). Ce « molecular beacon » permettait de mettre en évidence la présence de la mutation 20210 du facteur π. - 0,1 μM (concentration finale) de « molecular beacons » de SEQ ID N°18, 5' TCTCAGCGGGCCTCA 3' marquées avec un fluorophore FAM (6- carboxy-fluorescein) en 5', et d'un «quencher » (Dabsyl) en 3', (séquence complète : 5' FAM- cgtcg TCTCAGCGGGCCTCA cgacg-Dabsyl 3'). Ce « molecular beacon » permettait de mettre en évidence l'absence de la mutation 20210 du facteur II
Comme le montre la figure 5, le « molecular beacon » de SEQ N°9 marqué avec un fluorophore FAM est très spécifique de l'allèle muté : en effet, la fluorescence était exponentielle, avant l'apparition d'un plateau, lorsque la réaction était effectuée à partir de hgnées ceUulaires exprimant la mutation Leiden (courbes en triangle; et en croix figure 5), alors que la fluorescence restait basale, lorsque la réaction était effectuée à partir d'une hgnée ceUulaire exprimant pas la mutation Leiden (courbe rond blanc ; figure 5).
Le « molecular beacon » de SEQ ID N° 10, marqué avec un fluorophore ROX est spécifique de l'allèle sauvage. En effet, la fluorescence était exponentieUe, lorsque la réaction était effectuée à partir de hgnées cellulaires exprimant la génotype sauvage
Leiden (courbe en rond et croix ; figure 6), alors que la fluorescence restait basale, lorsque la réaction était effectuée à partir d'une lignée ceUulaire n'exprimant pas le génotype sauvage ( Figure 6 courbe en triangle).
Par l'utilisation de 2 fluorophores différents, le «molecular beacon» de SEQ ID N°10 est utilisé simultanément avec un « molecular beacon » de SEQ ID N°9, ce qui permettait de détecter très rapidement, et à partir d'une seule réaction, la présence et/ou l'absence de la mutation pour les deux aUèles de gène FacteurV. Grâce à l'analyse des figures 5 et 6 on peut donc déterminer si l'échantillon possède les génotypes G/G, G/A, ou A/A
Ces deux « molecular beacons », utilisés simultanément avec les amorces d'amplification de SEQ ID N°2 et SEQ ID N°l permettent donc de différencier clairement les deux attelés.
Des résultats comparables ont été obtenus à partir de sang frais prélevés de donneurs de l'Etablissement de Transfusion Français ( ETS).
Les résultats obtenus peuvent également être exprimés par le rapport entre la fluorescence émise lorsque le plateau est atteint et la fluorescence initiale (ratios O/C
(open/close ratios) : plus le ratio est élevé, plus l'hybridation entre molecular beacon et l'amplicon est spécifique et plus la discrimination entre les deux allèles est importante.
Grâce aux hgnées cellulaires, des limites de détection de positivité (seuil ou eut off) ont été établies pour les beacons FAM et ROX. Les résultats de 72 échantiUons de lignées cellulaires sont représentés dans la figure 9.
Chaque symbole « carré » représente un échantillon testé et positionné en fonction de la valeur de F O/C ratio du beacons FAM et l'OC ratio du beacon ROX pour cet échantiUon. Grâce aux hmites de détection de positivité de ces deux beacons on peut ainsi déterminer graphiquement le typage Factor V Leiden pour 72 échantiUons. Un échantiUon est classé A/A lorsque son O/C ratio beacon FAM spécifique de l'allèle muté (A) est supérieur à 1.5 et lorsque son O/C ratio beacon ROX spécifique de l'allèle sauvage (G) est inférieur à 2.
Un échantillon est classé G/G lorsque son O/C ratio beacon FAM spécifique de l'allèle muté (A) est inférieur à 1.5 et lorsque son O/C ratio beacon ROX spécifique de l'aUèle sauvage (G) est supérieur à 2 . Un échantillon est classé G/A lorsque son O/C ratio beacon FAM spécifique de l'allèle muté (A) est supérieur à 1.5 et lorsque son O/C ratio beacon ROX spécifique de l'allèle sauvage (G) est supérieur à 2 .
Ces résultats démontrent que l'utilisation d'un «molecular beacon » de SEQ ID N°9 simultanément à F amphfication en NASBA avec une paire d'amorce d' amphfication, comprenant une première amorce comprenant la SEQ ID N°l et une deuxième amorce comprenant la SEQ ID N°2 permettait de détecter d'une manière très spécifique l'absence de la mutation Leiden. L'utilisation d'un «molecular beacon » de SEQ ID
N°10 simultanément à F amphfication en NASBA avec une paire d'amorce d' amphfication, comprenant une première amorce comprenant la SEQ ID N°l et une deuxième amorce comprenant la SEQ ID N°2 permettait de détecter d'un manière très spécifique la présence de la mutation Leiden.
Comme le montre la figure 7, fe «molecular beacon» de SEQ N°18 marqué avec un fluorophore FAM est très spécifique de l'aUèle sauvage : en effet, la fluorescence était exponentieUe, avant l'apparition d'un plateau, lorsque la réaction était effectuée à partir de hgnées cellulaires exprimant la sauvage Factor II (courbes en triangle; et en croix figure 7), alors que la fluorescence restait basale, lorsque la réaction était effectuée à partir d'une lignée ceUulaire exprimant pas le polymorphisme sauvage Facteur II (courbe rond ; figure 7). Le « molecular beacons » de SEQ ID N° 17, marqué avec un fluorophore ROX est spécifique de l'allèle muté. En effet, la fluorescence était exponentieUe, lorsque la réaction était effectué à partir de hgnées ceUulaires exprimant la mutation factor II (courbe en rond et croix ; figure 6), alors que la fluorescence restait basale, lorsque la réaction était effectuée à partir d'une lignée ceUulaire n'exprimant pas le génotype sauvage ( Figure 6 courbe en triangle).
Par l'utilisation de 2 fluorophores différents, le «molecular beacon» de SEQ ID N°17 est utilisé simultanément avec un « molecular beacon » de SEQ ID N°18, ce qui permettait de détecter très rapidement, et à partir d'une seule réaction, la présence ou l'absence de la mutation pour le gène Facteur IL Grâce à l'analyse des figures 7 et 8 on peut donc déterminer si FéchantiUon possède le génotype G/G, G/A ou A/A. Les résultats de 130 échantillons comprenant des hgnées ceUulaires (carrés) et des échantillons extraits à partir de sang frais (triangle et rond) sont représentés sur la figure
10.
Chaque symbole représente un échantillon testé et positionné en fonction de la valeur de l'O/C ratio du beacons FAM et FOC ratio du beacon ROX pour cet échantiUon. Grâce aux limites de détection de positivité de ces deux beacons on peut ainsi déterminer graphiquement le typage Factor II pour 130 échantillons.
Un échantillon est classé A/A lorsque son O/C ratio beacon ROX spécifique de l'allèle muté (A) est supérieur à 3.5 et lorsque son O/C ratio beacon FAM spécifique de l'allèle sauvage (G) est inférieur à 1.8.
Un échantillon est classé G/G lorsque son O/C ratio beacon ROX spécifique de l'allèle muté (A) est inférieur à 3.5 et lorsque son O/C ratio beacon FAM spécifique de l'aUèle sauvage (G) est supérieur à 1.8 .
Un échantillon est classé G/A lorsque son O/C ratio beacon ROX spécifique de l'allèle muté (A) est supérieur à 3.5 et lorsque son O/C ratio beacon FAM spécifique de l'allèle sauvage (G) est supérieur à 1.8 .
De plus, selon un protocole comparable, les échantillons de sang frais ont été génotypes.
L'ensemble des résultats obtenus a été comparé aux résultats obtenus par une technique standard de RT-PCR, (Lightcycler, Roche) . Cette étude a montré 100% de concordance entre les 2 méthodes de génotypage.
Dans le but d'identifier la présence ou non des différents allèles du Facteur II et du
Facteur V dans un même tube, des essais d' amphfication simultanée des deux gènes en présence de 4 «molecular beacons » spécifiques de chaque allèle ont été réalisés. Les mêmes « molecular beacons » et couples d'amorces d'amplification que pour les amplifications des gènes seuls ont été utilisés, aux mêmes concentrations.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé in vitro pour le diagnostic/pronostic d'une thrombose comprenant les étapes suivantes : A - on extrait le matériel nucléique d'un échantillon biologique, B - on utilise au moins une paire d'amorces d'amplification pour obtenir des amplicons d'au moins une séquence cible du matériel nucléique C - on utilise au moins une sonde de détection pour détecter la présence desdits amplicons caractérisé en ce que, lors de l'étape B, ladite paire d'amorce comprend au moins une amorce d' amphfication comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N°l ; 3 à 8, 15 et 16.
2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que lors de l'étape C), ladite sonde de détection comprend au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N°9 à 12 ; 17 et 18.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que, lors de l'étape B, ladite paire d'amorces est choisie parmi les paires d'amorce suivantes : α une première amorce d' amphfication comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°l et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°2 ; α une première amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°3 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°4 ; α une première amorce d' amphfication comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°5 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°6 ; α une première amorce d' amphfication comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°7 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°8 α une première amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°15 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°16
4. Procédé selon l'une quelconque des revendication 1 à 3 dans lequel ladite paire d'amorce comprend au moins une amorce d'amplification comprenant un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage T7.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 dans lequel, lors de l'étape C, la sonde de détection comprend un flurophore et un quencher.
6. Amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ιDjN°l ; 3 à 8, 15, 16
7. Amorce d' amphfication selon la revendication 7 comprenant un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage T7.
8. Paire d'amorce d' amphfication choisie parmi les paires d'amorces suivantes : u une première amorce d' amphfication comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°l et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°2 ; P une première amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°3 et une deuxième amorce d amphfication comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°4 ; α une première amorce d' amphfication comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°5 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°6 ; α une première amorce d' amphfication comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°7 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°8 α une première amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°15 et une deuxième amorce d'amplification comprenant au moins 10 motifs nucléotidiques de la séquence nucléotidique SEQ ID N°16
9. Paire d'amorce selon la revendication 9 dans laqueUe ladite première amorce comprend un promoteur permettant l'initiation de la transcription par une polymérase du bactériophage T7.
10. Utilisation d'au moins une amorce d' amphfication selon la revendication 7 ou 8. et/ou d'une paire d'amorce selon la revendication 9 ou 10 lors d'une réaction d'amplification NASBA
11. Utilisation d'au moins une amorce selon la revendication 7 ou 8 et/ou d'au moins une paire d'amorces selon la revendication 9 ou 10 pour le diagnostic/pronostic d'une thrombose.
12. Kit pour le diagnostic/pronostic d'une thrombose comprenant au moins une amorce selon la revendication 7 ou 8 et/ou d'au moins une paire d'amorces selon la revendication 9 ou 10.
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