WO2004080995A1 - プロアントシアニジン高含有物の製造方法 - Google Patents

Abstract

植物体の抽出物または搾汁を塩および／またはアルカロイドで処理した後に、合成樹脂系吸着剤で処理する、あるいは植物体の抽出物または搾汁を合成樹脂系吸着剤で処理した後に、塩および／またはアルカロイドで処理することによって、効率的に生理活性の高いＯＰＣを多く含むプロアントシアニジン含有物を容易に得ることができる。

Description

明 細 書 プロアントシァニジン高含有物の製造方法 技術分野

本発明は、 生理活性の高い O P Cを多く含むプロアントシァ-ジン含有物 を、 効率よく製造する方法に関する。 背景技術

プロアントシァニジンは、 各種植物中に存在する縮合または重合 （以下、 縮重合という) したタンニンであり、 フラバン一 3—オールまたはフラバン - 3 , 4ージオールを構成単位として縮重合した化合物群である。 これらは、 酸処理によりシァ-ジン、 デルフィ二ジン、 ペラルゴェジンなどのアントシ ァニジンを生成することから、 その名称が与えられている。

プロアントシァニジンは、 ポリフエノール類の一種で、 植物が作り出す強 力な抗酸化物質であり、 植物の葉、 樹皮、 果物の皮もしくは種の部分に集中 的に含まれている。 プロアントシァ-ジンは、 具体的には、 ブドウの種、 松 の樹皮、 ピーナッツの皮、 イチヨウ葉、 -セアカシアの果実、 コケモモの果 実などに含まれている。 また、 西アフリカのコーラナッツ、 ペルーのラタ二 ァの根、 日本の緑茶にも、 プロアントシァニジンが含まれることが知られて いる。 プロアントシァニジンは、 ヒトの体内では、 生成することのできない 物質である。

プロアントシァニジンは、 一般的には植物体からの抽出によって得られる。 抽出に用いる溶媒としては、 水；メタノール、 エタノール、 アセトン、 へキ サン、 酢酸ェチルなどの有機溶媒；またはこれらの混合物が挙げられる (特 開平 1 1一 8 0 1 4 8号公報） 。 し力 し、 単に溶媒による抽出のみでは、 プ 口アントシァ-ジンの回収量は低く、 純度も低い。 したがって、 健康食品、 化粧品および医薬品原料として使用するためには、 純度を上げるために、 さ らなる濃縮、 精製などの工程が必要であり、 コス トおよび時間がかかる。 プロアントシァ-ジンを含むポリフエノール類を回収する方法が報告され ている。 例えば、 特開平 5— 2 7 9 2 6 4号公報および特開平 6— 5 6 6 8 9号公報には、 ポリフエノール類をキチンに吸着させ、 ポリフエノール類が 吸着したキチンをポリフエノール製品として利用することが記載されている。 特開 2 0 0 2 - 9 7 1 8 7号公報には、 植物抽出液にァスコルビン酸おょぴ アル力リ金属またはその塩を添加して、 p Hを 6〜1 1としてポリフエノー ル類の金属塩を沈殿させ、 この沈殿物をイオン交換樹脂などで脱塩すること によつて遊離ポリフヱノールを回収する方法が記載されている。

ところで、 近年、 プロアントシァ-ジンの中でも、 重合度が低いプロアン トシァニジン、 特に重合度が 2〜 4の縮重合体 （2〜4量体） 力 抗酸化作 用に優れていることが報告されている。 本明細書では、 この重合度が 2〜4 の縮重合体を、 オリゴメリック ·プロアントシァ-ジン （oligomeric proan thocyanidin： O P C) とレ、う。 O P Cは、 さらに抗酸化作用のほか、 口腔 内のバクテリア増殖を抑制してプラーク （歯こう） を減少させる効果；血管 の弾力性を回復させる効果；血 ί夜中でのリポタンパク質が活性酸素によりダ メージを受けるのを防止することによって、 損傷したリポタンパク質が血管 の内壁に凝集することを回避し、 コレステロールが付着することを防止する 効果；活性酸素によって分解されたビタミン Εを再生させる効果； ビタミン Εの増強剤としての効果などを有することが知られている。

しかし、 上記の方法で回収されるプロアントシァニジンは、 重合度が高い ものがほとんどであり、 生理活性が高い 2〜 4量体の O P Cの含有量は極め て低い。 ..

特開平 4一 1 9 0 7 7 4号公報、 特開平 1 0— 2 1 8 7 6 9号公報、 特開 2 0 0 1 - 1 3 1 0 2 7号公報、 およひ、Eberhard Scholzら， Proanthocyani dins from Kramer i a triandra Root, Planta Medica, 55 (1989) , 379 - 384 頁には、 植物体から O P cを抽出する方法おょぴ Zまたは o P Cを合成する 方法が記載されている。 し力 し、 上記抽出方法においては、 植物体の抽出液 を吸着体に接触させて、 吸着した成分を溶出させ、 得られた画分を回収した 後、 この画分を用いてさらに同じ工程を繰り返さなければ、 O P C含有量を 高めることができず、 効率的ではない。 合成方法についても、 工程数が多く、 コストおよび時間がかかる問題、 廃液処理の問題などがある。

そこで、 O P Cを多く含有するプロアントシァニジンの精製方法が求めら れている。

発明の開示

本発明者らは、 有用な生理活性を有する O P Cを高い割合で含有するプ口 アントシァニジン含有物を効率よく得る方法について鋭意検討した。 その結 果、 植物体の抽出物または搾汁を塩および /またはアルカロイドで処理した 後に、 合成樹脂系吸着剤で処理することによって、 あるいは植物体の抽出物 または搾汁を合成樹脂系吸着剤で処理した後に、 塩おょぴ zまたはアル力口 ィドで処理することによって、 生理活性の高い O P Cを高い割合で含有する プロアントシァニジン含有物が効率良く得られることを見出して本発明を完 成させた。

本発明のプロアントシァ-ジン含有物の製造方法は、 植物体の抽出物また は搾汁から得られ、 塩おょぴアル力ロイドのうちの少なくとも一方で処理す る工程、 および合成樹脂系吸着剤で処理する工程の組み合わせを包含する。 好ましい実施態様においては、 上記塩およびアル力ロイドのうちの少なく とも一方で処理する工程の前および後の少なくとも一方に、 合成樹脂系吸着 剤による処理以外の濃縮処理を行う工程を包含する。 本発明のプロアントシァニジン含有物の製造方法はまた、 植物体の抽出物 または搾汁を濃縮処理して濃縮物を得る工程；該濃縮物を塩およびアルカロ ィドのうちの少なくとも一方で処理し、 粗プロアントシァニジン含有物を得 る工程；およぴ該粗プロアントシァ-ジン含有物を合成樹脂系吸着剤で処理 する工程を包含する。 ·

好ましい実施態様においては、 上記塩およびアル力ロイドのうちの少なく とも一方を添加して不溶物を生じさせる工程の前およぴ上記不溶物を除去す る工程の後の少なくとも一方に、 合成樹脂系吸着剤による処理以外の濃縮処 理を行う工程を包含する。

好ましい実施態様においては、 上記塩は、 一価のアルカリ金属、 二価のァ ルカリ金属塩、 および硫安からなる群より選択される少なくとも 1種である。 好ましい実施態様においては、 上記アルカロイドは、 ベタイン、 カフエイ ン、 およびこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも 1種である。 好ましい実施態様においては、 上記プロアントシァ-ジン含有物は、 オリ ゴメリック 'プロアントシァニジンを乾燥質量換算で 2 0質量⁰ /₀以上含有す る。

本努明はまた、 プロアントシァニジン含有物を提供し、 該プロアントシァ ュジン含有物は、 オリゴメリック 'プロアントシァニジンを乾燥質量換算で 2 0質量％以上の割合で含有する。

好ましい実施態様においては、 上記プロアントシァ-ジン含有物は、 さら に力テキン類を乾燥質量換算で 5〜： 1 5質量％の割合で含有する。 発明を実施するための最良の形態

本発明のプロアントシァニジン含有物の製造方法は、植物体の抽出物また は搾汁を、 塩および/またはアルカロイ ドで処理した後に、 合成樹脂系吸着 剤で処理する、 あるいは植物体の抽出物または搾汁を合成樹脂系吸着剤で処 理した後に、 塩および/またはアル力ロイドで処理することによって行われ る。 好ましくは、 上記塩および/またはアル力ロイド処理の前おょぴ後の少 なくとも一方で濃縮処理することによって行われる。

(植物体の抽出物または搾汁）

まず、 植物体の抽出物または搾汁を得る。

本発明に用いられる植物体は、 プロアントシァ-ジンを含有する植物体で あればその種類に特に制限はない。 杉、 檜、 松などの樹皮；ブドウ、 ブルー ベリー、 イチゴ、 アポガド、 ニセアカシア、 コケモモ、 エルダ一ベリーなど の植物の果実、 果皮、 および種子；大麦；小麦；大豆；黒大豆；カカオ；小 豆； トチの実の殻； ピーナッツの薄皮；ィチヨゥ葉；茶葉および茶抽出液； モロコシキビ； リンゴ果実；クマザサ；フコィダン；ヤーコン葉；コーラナ ッッ （例えば、 西アフリカのコーラナッツ） ；ラタニア （例えば、 ペルーの ラタニア） の根などが挙げられる。 これらの中で、 特に松樹皮、 ブドウ種子 およぴ果皮、 ピーナッッの薄皮などが好適に用いられる。

植物体の抽出物を得る場合には、 植物体に抽出溶媒を添加し、 必要に応じ て所定温度で保持する。

抽出を行う場合には、 抽出効率の点から、 好ましくは植物体を適当な大き さに破砕し、 体積当たりの表面積を大きくする。 破碎方法は、 特に限定され ない。 例えば、 カッター、 スライサーなどで処理した破砕物； ミキサ^"、 ジ ユーサー、 プレンダー、 マスコ口イダーなどで処理した粉砕物などでもよレ、。 破碎物または粉砕物の大きさは、 0 . 1〜 1 0 c m、 好ましくは 0 . ：!〜 5 c mの細片である。 破碎効率を上げるために、 破砕時に水、 あるいはェタノ ール、 メタノール、 酢酸ェチルなどの有機溶媒を加えてもよい。

抽出溶媒としては、 水または有機溶媒が用いられる。 有機溶媒としては、 例えば、 メタノール、 エタノール、 1一プロパノール、 2一プロパノール、 1ーブタノール、 2—ブタノール、 アセトン、 へキサン、 シク口へキサン、 プロピレングリコール、 含水エタノール、 含水プロピレングリコール、 ェチ ルメチルケトン、 グリセリン、 酢酸メチル、 酢酸ェチル、 ジェチルエーテル、 ジクロロメタン、 食用油脂、 i， i， 1 , 2—テトラブルォロェタン、 およ ぴ 1， 1， 2—トリクロロェテンが挙げられる。 さらに、 水一有機溶媒の混 合溶媒も好ましく用いられる。 これらの有機溶媒は単独で用いてもよいし、 組合わせて用いてもよい。 なお、 製造時の廃液処理の観点、 あるいは後述す る塩および/またはアル力ロイドを添加する処理または合成樹脂系吸着剤に よる処理を行う観点から、 水またはェタノールが好適に用いられる。

上記抽出溶媒のうち、 植物の抽出物をさらに濃縮する場合に、 濃縮を比較 的低い温度で短時間に行う観点から、 抽出溶媒として、 水よりも沸点の低い ェタノールなどの有機溶媒か、 これらの有機溶媒と水との混合溶液を用レヽる ことが好ましい。 このような有機溶媒は、 濃縮時に容易に除去することがで きる。 中でも、 食品、 医薬品などとして用いる場合の安全性を考慮すると、 ェタノールまたはエタノールと水との混合溶液が特に好適である。

植物体に添加する抽出溶媒の量は、 目的とするプロアントシァ-ジン濃度 および抽出効率を考慮して設定し得る。 例えば、 水を抽出溶媒として使用す る場合、 植物体と水との比が質量比で 1 ： 5〜1 ： 1 0 0、 好ましくは 1 ： 1 0〜1 ： 5 0である。 水および/または有機溶媒を添カ卩して破砕した場合 は、 破砕に使用しだ量を考慮し、 添加する抽出溶媒の量を調製すればよい。 抽出温度は、 抽出効率を高めるためには高い方が好ましい。 例えば、 水を 用いる場合、 5 0〜1 2 0 °C、 好ましくは 7 0〜1 0 0 °Cで熱水抽出する。 植物体に熱水を加えてもよく、 植物体に水を加えた後、 加熱してもよい。 抽 出時間は、 一般的には 1 0分〜 2 4時間であるが、 抽出温度により適宜決定 され得る。

.有機溶媒を用いる抽出方法としては、 加温抽出法あるいは超臨界流体抽出 法が好適である。 加温抽出法としては、 植物体に加温した溶媒を加える方法、 または植物体に溶媒を添カ卩して加温する方法が用いられる。 例えば、 粉碎し た植物体に対して、 抽出溶媒として、 水とエタノールとの比が、 質量比で

1 ： 1〜1 ： 9である水一エタノール混合溶媒を植物体の 1倍〜 2 0倍量使 用して、 7 0〜7 5 °Cで還流させながら、 0 . 5時間〜 6時間攪拌する方法 が挙げられる。 還流をしない場合は、 一度上記混合溶媒を用いて、 加温抽出 し、 濾過などにより上清を回収し、 残渣について、 再度上記混合溶媒を加え て加温することによつても、 抽出効率を上げることが可能である。

超臨界流体抽出法は、 物質の気液の臨界点 （臨界温度、 臨界圧力） を超え た状態の流体である超臨界流体を用いて目的成分を抽出する方法である。 超 臨界流体としては、 二酸化炭素、 エチレン、 プロパン、 亜酸化窒素 （笑気ガ ス） などが用いられ、 二酸ィヒ炭素が好ましく用いられる。

超臨界流体抽出法は、 目的成分を超臨界流体によって抽出する抽出工程お よび目的成分と超臨界流体とを分離する分離工程からなる。 分離工程では、 圧力変化による抽出分離、 温度変化による抽出分離、 または吸着剤 ·吸収剤 を用いた抽出分離のいずれを行ってもよい。

また、 ェントレーナー添加法による超臨界流体抽出を行ってもよい。 この 方法は、 超臨界流体に、 例えば、 エタノール、 プロパノール、 ' n—へキサン、 アセトン、 トルエン、 その他の脂肪族低級アルコール類、 脂肪族炭化水素類、 芳香族炭化水素類、 またはケトン類を 2〜2 0 W/V %程度添加し、 得られ た抽出流体で超臨界流体抽出を行うことによって、 O P C、 カテキン類 （後 述） などの目的とする被抽出物の抽出流体に対する溶解度を飛躍的に上昇さ せる、 あるいは分離の選択性を増強させる方法であり、 プロアントシァ-ジ ンを効率的に抽出する方法である。

抽出には、 例えば、 回分式、 半連続式、 または連続式などのいずれの抽出 置を用いてもよい。 '

植物体の搾汁を得る場合には、 植物体を直接圧搾し、 あるいは適宜切断ま たは破枠した後に圧搾する。 この方法は、 水分含量の高い植物体を使用する 場合に好適に採用される。 例えば、 ブドウ果実の場合には、 圧搾によりプロ アントシァニジンを含む搾汁が得られる。 植物体を破砕して得られる植物体 由来の固形分を含む植物体破砕物 (例えば、 上記ブドウ果実破砕物) もまた 搾汁と同様に用いられ、 本明細書中では、 この植物体由来の固形分を含む植 物体破砕物も搾汁に包含される。 (濃縮処理工程）

植物体の抽出物または搾汁 （以下、 抽出物等という） は、 塩および/また はアルカロイド処理を行う前に、 予め濃縮処理することが好ましい。 濃縮処 理することによって、 少量の塩またはアル力ロイドで処理することが可能に なり、 重合度の高レ、プロアントシァ-ジンを効率よく除去することができる。 濃縮処理する場合は、 予め濾過などを行い、 溶液中の不溶物を除去しておく ことが、 濃縮を均一に行うことができ、 濃縮物の濃縮率の調整が容易になる 点から好ましい。

濃縮方法としては、 加熱濃縮、 減圧濃縮、 凍結乾燥、 合成樹脂系吸着剤処 理による濃縮、 限外濾過膜による濃縮、 透析膜による濃縮などの当業者が通 常用いる濃縮方法が利用される。 好ましい濃縮方法は、 プロアントシァ-ジ ンの熱変性が少ない減圧濃縮、 凍結乾燥、 および合成樹脂系吸着剤処理によ る濃縮であり、 より好ましい濃縮方法は、 減圧濃縮および合成樹脂系吸着剤 処理による濃縮である。 これらの濃縮方法は、 単独で行ってもよいし、 複数 を組み合わせて行ってもよい。

加熱濃縮を行う場合は、 加熱によるプロアントシァニジンの熱変性を防ぐ ために、 通常、 4 0 °C〜1 0 0。Cの温度で行われる。

令成樹脂系吸着剤処理による濃縮は、 後述する O P Cを優先的に吸着し得 る合成樹脂系吸着剤で吸着処理し、 吸着した O P Cを溶媒で脱離させて、 該 成分を当初の濃度より高い濃度で含有する溶液 （濃縮物） を得ることにより 行われる。 上記合成樹脂系吸着剤処理による濃縮においては、 さらに、 抽出 に使用した抽出溶媒を、 濃縮し易い揮 性の高い有機溶媒に置換することが でき、 例えば、 水を抽出溶媒とした抽出物に比べて、 減圧濃縮などで容易に 濃縮率の高い濃縮物を得ることが可能である。 例えば、 抽出溶媒が水 （例え ば、 熱水） の場合は、 吸着剤からの脱離時に、 有機溶媒 （例えば、 エタノー ル） または有機溶媒と水との混合溶媒を用いることにより、 この有機溶媒ま たは混合溶媒の溶液とし、 次いで、 有機溶媒を必要な程度に除去する、 ある いは完全に除去した後、 適切な溶媒を必要量だけ加えることにより、 濃縮を 行うことができる。 特に、 後述のダイアイオン H P- 2 0などの芳香族系樹 脂を用いた場合は、 合成樹脂吸着剤へプロアントシァニジン等を吸着ざせた 後に、 無水エタノールなどでカラムから吸着物全てを回収するだけで、 合成 樹脂吸着剤によるプロアントシァ-ジンの濃縮と共に、 簡単に減圧濃縮など でェタノールを完全に除去でき、 より濃縮率の高い濃縮物を得ることが可能 である。

得られた濃縮物の濃縮率に特に制限はない。 濃縮物の体積が、 濃縮前の抽 出物等の体積に比べて、 好ましくは 1 / 2〜1 Z 1 0 0容量、 より好ましく は 1 / 5〜： 1 / 7 0容量、 さらに好ましくは 1ノ 1 0〜l Z 5 0容量となる ように濃縮が行われる。

濃縮処理は、 上記塩および/またはアル力口ィド処理を行う前に限られず、 各処理を行う上で好ましくない溶媒を除去する目的で、 必要に応じて行われ 得る。 好ましくは、 塩および/またはアルカロイド処理工程の前後、 より好 ましくは、 塩および/またはアル力ロイド処理工程の前に行われる。

濃縮処理 （透析、 減圧濃縮など） は、 さらに、 抽出物等の被処理物が有機 溶媒を含む場合に、 有機溶媒を除去して水に置換することが可能である。 水 に置換することによって、 塩および/またはアル力ロイドの溶液中の電離が よくなり、 重合度の高いプロアントシァュジンを効率よく不溶化し得る。 水 置換は、 容積が抽出物等の倍以上にならないことが好ましい。

(塩および/またはアル力ロイド処理工程)

この工程は、 植物体の抽出物または搾汁、 その濃縮物あるいは合成樹脂系 吸着剤処理液に、 塩および Zまたはアル力口ィドを添加することを包含し得 る。 すなわち、 得られた抽出物等、 その濃縮物、 または合成樹脂系吸着剤処 理液に、 塩おょぴ zまたはアルカロイドを添加することによって、 重合度の 高いプロアントシァニジンを、 例えば、 沈殿物などの不溶物として生じさせ る、 あるいは合成樹脂系吸着剤に吸着し難い性質 （以下、 非吸着プロアント シァニジンという） にする。 上記不溶物は、 濾過などにより容易に除去され 得、 非吸着プロアントシァ-ジンは、 その後の合成樹脂系吸着剤処理で除去 されるため、 O P C含量の高 V、プロアントシァニジン含有物を得ることがで きる。 これらの塩おょぴアルカロイドは、 単独で用いてもよく、 組み合わせ て用いてもよい。

本発明に用いられる塩は、 溶液中で電離するものであればよレ、。 塩として は、 例えば、一価の金属塩、 二価の金属塩、 およぴ非金属性の塩が挙げられ る。 一価の金属塩おょぴ非金属性の塩は、 重合度の高いプロアントシァ-ジ ンを不溶物として生じさせる点、 二価の金属塩は、 重合度の高いプロアント シァ-ジンを非吸着プロアントシァニジンにする点で特に優れる。

—価の金属塩としては、 リチウム、 ナトリウム、 カリウム、 ルビジウム、 セシウム、 フランシウムなどのアルカリ金属の塩、 例えば、 ハロゲン化物塩 (塩化物塩、 臭化物塩など） 、 リン酸塩、 炭酸塩、 有機酸塩 （酢酸塩などの カルボン酸塩、 スルホン酸塩など） などが挙げられる。 具体的には、 塩化ナ ト.リウム、 硫酸ナトリウム、 クェン酸ナトリウム、 塩化カリウム、 リン酸ナ トリウム、 リン酸カリウム、 酢酸ナトリウムなどが挙げられる。 特に塩祈に 好ましく用いられる硫酸ナトリウム、 リン酸カリウム、 クェン酸ナトリウム、 および塩化ナトリゥムが好ましい。

二価の金属塩としては、 ベリ リウム、 マグネシウム、 アルカリ土類金属 (カルシウム、 フ、トロンチウム、 バリウム、 ラジウム） などの金属塩が挙げ られる。 好ましくはマグネシウムの塩おょぴカルシウムの塩、 特には、 硫酸 マグネシウムである。 なお、 二価の金属塩は、 酸化剤として用いられる金属 (例えば、 銅など) を含む塩を用いると、 プロアントシァニジンが酸化され る恐れがあるため注意を要する。

二価の金属塩は、 特にプロアントシァ-ジンに対して吸着力が強いため、 少ない塩の量で重合度の高いプロアントシァ-ジンを、 不溶物または非吸着 プロアントシァ-ジンとすることができる。

金属塩による処理に際しては、 酸性側で処理を行うことが好ましい。 弱〜 強アル力リ性ではプロアントシァェジンの安定性が悪くなり分解する恐れが ある。 そのため、 溶液中の] D Hを好ましくは 7 . 5未満、 より好ましくは 6 未満、 さらに好ましくは 5 . 5以下となるように調整することが好ましい。 特に、 二価の金属塩を添加する場合、 溶液中の p Hが上がりやすいため注意 を要する。 p Hの調整は、 例えば、 プロアントシァ-ジンを安定化するため の助剤 （ァスコルビン酸などの p H調整剤） 、 陽イオン交換樹脂などで処理 した低 p Hの水 （低 p H水） などを用いることによって行われる。 特に、 低 p H水は、 p H調整剤を添加する場合に比べて、 除去工程が必要ない点およ ぴ全体的なコスト面から好ましい。 具体的には、 予め金属塩濃度が塩処理時 の最終濃度の 2〜： 1 0倍濃度となるように低 p H水に添加して、 金属塩溶液 を調製する。 この溶液は、 1) 11が4〜6、 好ましくは4〜5 . 5、 より好ま しくは 4〜 5であることが好ましい。 この溶液を抽出物等に加えて処理する とによって、 プロアントシァニジンの分解を回避することができる。

非金属性の塩としては、 例えば、 硫安などが好適に用いられる。 上記塩の中で、 特に重合度の高いプロアントシァ-ジンの沈澱を選択的に 生じさせ、 ◦ P Cの精製効率を高める点では、 一価のアルカリ金属塩または 硫安が好ましい。 塩の使用量を少なくする点では、 重合度の高いプロアント シァニジンを非吸着ブロアントシァニジンにして精製効率を高める 2価の金 属塩が好ましい。 使用量が少ない点では、 後述のアルカロイドも好ましい。 上記塩の添加量は、 特に制限されず、 その種類に応じて適宜設定される。 例えば、 抽出物等、 合成樹脂系吸着剤処理液、 または濃縮物中に 0 . 0 0 0 + 1質量 容量％〜5 0質量/容量％添加され得る。

一価の金属塩を用いる場合は、 好ましくは抽出物等、 合成樹脂系吸着剤処 理液、 または濃縮物中に 0 . 1質量/容量％〜5 0質量 Z容量％、 より好ま しくは 3質量/容量％〜 5 0質量/容量 °/₀、 さらに好ましくは 5質量 Z容 量％〜4 5質量 容量％、 最も好ましくは 8質量/容量％〜4 5質量 容 量。 /₀となるように添加し得る。 特に、 2 5 °Cの水における塩の最大溶解量 (例えば、 塩ィ匕ナトリゥムの場合、 3 5 . 8質量 容量％) を 1 0 0 % (飽 和濃度） とした場合に、 塩の飽和濃度の 1 0〜 7 5 %、 好ましくは 2 0〜 6 0 %となるように抽出物等、 合成樹脂系吸着剤処理液、 または濃縮物に添加 することが好ましい。

カルシウム塩、 マグネシウム塩などの二価の金属塩を用いる場合は、 好ま しくは抽出物等、 合成樹脂系吸着剤処理液、 または濃縮物中に 0 . 0 0 0 1 質量/容量％〜3 0質量 7容量％、 より好ましくは 0 . 0 0 1質量 容量％ 〜 1 0質量 容量％となるように添加する。 上記二価の金属塩は、 さらに、 植物 （例えば、 松樹皮） の抽出物等の乾燥質量 1 0 0質量部に対して、 0 . 0 0 2質量部〜 4質量部程度となるように添加することが好ましい。

非金属性の塩を用いる場合は、 好ましくは抽出物等、 合成樹脂系吸着剤処 瑪液、 または濃縮物中に 8質量/容量％以上、 より好ましくは 8質量/容 量％〜 8 0質量/容量 °/₀となるように添加する。 本発明に用いられるアル力ロイドは、 一般的にアル力ロイドに分類されて いる含窒素有機化合物をいう。 アルカロイドは、 重合度の高いプロアントシ ァニジンを、 不溶物または非吸着プロアントシァニジン、 特に非吸着ブロア ントシァニジンにする点で優れる。

上記アルカロイドとしては、 カフェインなどのキサンチン誘導体、 簡単な ァミン類からなるもの (ベタインなど) 、 ピロールおよびピロリジンアル力 ロイド、 ピリジンぉよびピぺリジンァルカロイ ド、 トロパンアルカロイド、 ィミダゾーノレア/レカロイ ド、 プリンァルカロイ ド、 キノリンァノレ力ロイ ド、 イソキノリンァルカロイド、 キナゾリンァルカロイド、 ピロリジジンアル力 ロイド、 キノリジジンァノレカロイド、 インドリジンァノレカロイド、 フエナン トレンアル力ロイド、 エリ トリナンアル力ロイド、 インドールアルカロイド、 トロポロン環を含むアルカロイド、 ジテルペンアルカロイド、 ステロイドァ ルカロイド、 トリテルペンアルカロイド、 コルヒチンなどが該当する。 本発 明においては、 この中でも、 簡単なァミン類からなるものまたはプリンアル カロイドが好ましく用いられ、 特にべタインなどのアミン類、 カフェインな どのキサンチン誘導体が好ましく用いられる。 重合度の高いプロアントシァ ェジンを非吸着プロアントシァニジンにする効果およぴ不溶物にする効果の いずれも優れる点から、 カフェインが特に好ましい。

上記アルカロイドは、 好ましくは抽出物等、 合成樹脂系吸着剤処理液、 ま たは濃縮物中に 0 . 0 0 0 0 5質量/容量％〜 5質量/容量％、 より好まし くは 0 . 0 0 0 1質量 Z容量％〜 3質量ノ容量％、 さらに好ましくは 0 . 0 0 0 1質量/容量％〜 1質量/容量％となるように添加され得る。 上記アル 力ロイドは、 さらに、 植物 (例えば、 松樹皮） の抽出物等の乾燥質量 1 0 0 質量部に対して、 0 . 0 0 0 2質量部〜 0. 5質量部程度となるように添加 することが好ましい。 .

抽出物等の濃縮物を使用する場合、 塩および zまたはアル力ロイドの使用 量は、 上記の量の好ましくは 1 / 2〜1 Z 1 0 0、 より好ましくは 1 / 5〜 1 / 5 0である。

塩および/またはアル力ロイド処理の温度に特に制限はない。 好ましくは 1〜4 0 °Cである。 処理時間についても特に制限はなく、 処理温度に応じて 適宜設定され得る。 例えば、 塩および/またはアルカロイドを添加後、 1 °C 〜 4 0 °Cで 3 0分〜 4 8時間静置し、 十分に沈殿物などの不溶物を生じさせ る。 なお、 静置時間は、 4 8時間以上でもよいが、 O P Cが自動酸化し、 赤 褐色が濃い褐色に変色する前に次工程に移ることが好ましい。

次いで、 生じた沈殿物などの不溶物を除去してもよい。 不溶物を除去する ことによって、 その後の合成樹脂系吸着剤処理を短時間で行うことができる。 不溶物を除去する方法としては、 当業者が通常用いる方法、 例えば、 濾過や 遠心分離などが挙げられる。 処理時間の点から、 濾過が好適に用いられる。 濾過は、 好ましくは 1〜 4 0 °Cで行われ得る。 低温であるほど、 より多くの 重合度の高いプロアントシァニジンを除去することができ、 好ましくは 3 0 °C以下、 より好ましくは 2 5 °C以下で行われる。 濾過による損失を最小限 に抑えるために、 ろ過後の残渣を、 塩おょぴ Zまたはアルカロイド処理に用 いた溶媒と同じ溶媒を用いて洗浄し、 洗浄液を回収してもよい。 なお、 塩お よび/またはアルカロイド処理において、 特に、 二価の金属塩またはアル力 ロイドを用いた場合、 重合度の高いプロアントシァニジンは、 主に非吸着プ 口アントシァ-ジンとなり、 不溶物は比較的少ない。 このように不溶物が比 較的少ない場合は、 コスト削減の点から、 不溶物を除去せずに合成樹脂系吸 着剤処理を行ってもよい。

このようにして得られた粗プ口アントシァニジン含有物の上清に含有され る 5量体以上のプロアントシァ-ジンの量は、 塩および Zまたはアル力ロイ ド:処理前の濃縮物に比べて 1 / 2以下、 好ましくは 1 Z 3以下、 より好まし くは 1 / 5以下、 さらに好ましくは 1 / 6以下の量になる。 (合成樹脂系吸着剤で処理する工程）

この工程は、 上記塩およぴ /またはアル力ロイド処理することにより得ら れた粗プロアントシァニジン含有物に対して行われる、 あるいは植物の抽出 物または搾汁もしくは濃縮物に対して、 塩および/またはアル力ロイド処理 する前に行われる。 合成樹脂系吸着剤で処理することにより、 糖類、 有機酸 などの夾雑物が除去される。 例えば、 抽出物等を合成樹脂系吸着剤で処理す る場合、 上記の夾雑物が除去されるため、 次の塩処理を効率よく行うことが できる。 具体的には、 抽出物等または粗プロアントシァ-ジン含有物を合成 樹脂系吸着剤と接触させて、 プロアントシァニジンを合成樹脂系吸着剤に吸 着させた後、 所定の溶媒で溶出することにより行われる。 なお、 抽出物等ま たは粗プロアントシァニジン含有物を合成樹脂系吸着剤で処理する場合、 予 め不溶物を除去することが効率的な処理を行う点から好ましい。

上記処理に用いられる合成樹脂系吸着剤としては、 有機系樹脂、 イオン交 換榭脂、 シリカゲル、 逆相シリカゲルなどが挙げられる。

有機系樹脂としては、 例えば、 スチレン一ジビュルベンゼン系樹脂などの 芳香族系樹脂、 アタリル酸系メタクリル樹脂、 アタリロニトリル脂肪族系榭 脂などが使用できる。 好ましくは、 芳香族系樹脂である。 芳香族樹脂として は、 疎水性置換基を有する芳香族系樹脂、 無置換基型の芳香族系樹脂、 無置 換基型に特殊処理を施した芳香族系樹脂が挙げられ、 無置換基型に特殊処理 を施した芳香族系樹脂がより好適である。 これらの樹脂は、 多孔性であるこ とが好ましい。 このような合成樹脂は市販されており、 例えば、 次のものが 挙げられる ：アクリル酸系メタクリル樹脂としては、 ダイアイオン （登録商 標） H P 1 MG、 H P 2 MG (以上、 三菱化学株式会社製） ；芳香族系樹脂 としては、 S P - 9 0 0 (三菱化学株式会社製) 、 アンバーライト (登録商 標） XAD— 2 、 XAD - 4 、 XAD— 1 6 、 XAD - 2 0 0 0 (以上、 株式会社オルガノ製） ；疎水性置換基を有する芳香族系樹脂としては、 ダイ アイオン (登録商標) S P— 205 、 S P— 206 、 SP— 207、 HP 一 2MG 、 E X - 0021 (以上、 三菱化学株式会社製） 、 アンバーライ ト (登録商標) XAD- 7 、 XAD- 8 (以上、 株式会社オルガノ製) ； 無置換基型の芳香族系樹脂としては、 ダイアイオン （登録商標） HP— 10 、 HP- 20 、 HP— 21 、 HP— 30 、 HP— 40 、 HP— 50 (以上、 三菱化学株式会社製） ；無置換基型に特殊処理を施した芳香族系樹 脂としては、 SP— 825 、 S P- 800 、 S P- 850 、 S P- 87 5 (以上、 三菱化学株式会社製) ；架橋デキストランの誘導体としては、 セ フアデックス （登録商標） LH20 、 LH60 (以上、 フアルマシアバイ ォテク株式会社製） などが挙げられる。 中でも芳香族系樹脂 （ダイアイオン またはアンバーライト) または架橋デキストランの誘導体 (セフアデックス LH20など） が好ましい。

イオン交換樹脂としては、 陽イオン交換樹脂および陰イオン交換樹脂のい ずれも使用できる。 市販されている陽イオン交換樹脂としては、 例えば、 官 能基としてスルホン酸塩基を有する樹脂である、 アンバーライト （登録商 標） CG— 4000、 CG— 5000、 CG_6000、 CG—8000、 I R— 116、 I R— 118、 I R— 120B、 I R— 122、 I R- 12 4、 XT— 1007、 XT— 1009、 XT— 1002 (以上、 株式会社ォ ルガノ製） などが挙げられる。 弱塩基性陰イオン交換樹脂としては、 例えば、 官能基として 4級ァミンを有する樹脂である、 OPT I PORE-XUS 4 0285. 00、 OPT I PORE-XUS 40390. 00 (以上、 ダ ゥケミカル株式会社製) などが挙げられる。 ィォン交換樹脂を用いる際の溶 出溶媒は、 水が好ましく、 カラム温度は 10〜120°C、 カラム内は常圧ま たは加圧された状態であることが好ましい。 .

合成樹脂系吸着剤の量は、 溶媒の種類、 合成樹脂系吸着剤の種類等によつ て適宜設定すればよい。 例えば、 処理する液の乾燥質量に対して、 0 . 0 1 〜 3 0倍質量、 好ましくは 0 . 1〜 1 0倍質量の合成樹脂系吸着剤を使用す ることが好ましい。 合成樹脂系吸着剤の量が、 処理する液の乾燥質量に対し T O . 0 1倍質量より少なすぎると、 プロアントシァニジンの回収率が下が るため、 好ましくない。 .

合成樹脂系吸着剤の中でも、 プロアントシァニジンの吸着効率が高い合成 樹脂系吸着剤、 例えば、 芳香族系樹脂のダイアイオン、 芳香族系樹脂のアン バーライト、 架橋デキストラン誘導体のセフアデックスなどを用いる場合は、 吸着効率がよい点から、 上記のような処理する液の乾燥質量を考慮すること なく、 処理する液の容量を基準として、 より簡便に操作を行うことができる。 処理する液の容量に対して水や有機溶媒などで膨潤した合成樹脂吸着剤の体 積が 0 . 0 1倍〜 5 0倍量、 好ましくは 0 . 1〜2 0倍量の上記合成樹脂吸 着剤を用いることで、 処理する液と合成樹脂吸着剤との接触が十分に行われ、 効率よく吸着させることができる。

抽出物等または粗ブロアントシァニジン含有物と合成樹脂系吸着剤との接 触は、 いかなる方法で行ってもよい。 例えば、 簡易な方法としては、 合成樹 脂系吸着剤をカラムに充填し、 抽出物等または粗プロアントシァ-ジン含有 物を通過させるカラム法、 合成樹脂系吸着剤を抽出物等または粗プロアント シァュジン含有物に加え、 一定時間後、 合成樹脂系吸着剤を除去するバッチ 法などが挙げられる。

カラム法を用いて処理するには、 例えば、 まず、 合成樹脂系吸着剤をカラ ムに充填し、 そのカラムに抽出物等または粗プロアントシァニジン含有物を 通液し、 次いで合成樹脂系吸着剤の体積に対して、 5倍から 1 0倍の体積の 水を通液させる。 これにより、 不純物である糖類おょぴ有機酸が除去される。 その後、 適切な溶媒によりプロアントシァニジンを溶出する。 -溶媒としては、 水、 メタノール、 エタノール、 酢酸ェチル、 クロ口ホルム、 およぴこれらの 混合溶媒が挙げられる。 安全性の面から好ましくは水とエタノールとの混合 溶媒が用いられる。 水とエタノールとの混合比は、 合成樹脂系吸着剤によつ て異なるが、 例えば、 ダイアイオン H P— 2 0等の芳香族系樹脂の場合、 5 〜5 0容量％、 好ましくは 1 0〜4 0容量％、 さらに好ましくは 1 0〜3 0 容量％のエタノール水溶液を用いる。 .

バッチ法を用いて処理するには、 上記カラム法と同様の質量比の合成樹脂 系吸着剤を抽出物等または粗プロアントシァ-ジン含有物に加え、 攪拌しな がら 1〜 3時間接触させた後に、 濾過または遠心分離により吸着剤を回収す る。 プロアントシァュジンが吸着された合成樹脂系吸着剤を、 さらに上記力 ラム法の場合と同様な組成の溶媒に加えて 1時間〜 3時間攪拌し、 プロアン トシァェジンを溶出させ、 次いで濾過または遠心分離して上清を回収するこ とにより、 合成樹脂系吸着剤処理物、 あるいはプロアントシァニジンまたは O P Cをより多く含むプロアントシァ-ジン含有物を得ることができる。 本発明の方法によって得られるプロアントシァニジン含有物の収率は、 例 えば、 塩および/またはアルカロイド処理工程において、 アルカロイドや二 価の金属塩を用いた場合、 好ましくは松樹皮の乾燥質量 1 0 0質量部あたり、 0 . 4〜3質量部、 好ましくは 0 . 5質量部〜 2質量部である。

(製造工程）

上記の通り、 本発明の製造方法において、 抽出物等に塩および/またはァ ルカ口ィドで処理する工程と、 合成樹脂系吸着剤で処理する工程との順序は、 特に制限されず、 どちらを先に行ってもよい。 すなわち、 まず、 抽出物等を 塩および/またはアル力ロイドで処理し、 次に合成樹脂系吸着剤処理しても よく、 抽出物等を合成樹脂系吸着剤処理し、 次に塩おょぴ zまたはアルカロ ィドで処理してもよい。 前者の工程の順序で行う方が、 溶液中の塩および Z またはアルカロイドを除去するために、 浸透膜、 吸着剤などの処理工程を設 ける必要がなくなる点や、 合成樹脂系吸着剤での処理効率が高まり、 O P C の含有量を高められる点から好ましい。 また、 塩および/またはアル力ロイ ド処理の前後に濃縮工程ゃ不溶物の除去工程を必要に応じて加えてもょレ、。 本発明の製造方法は、 好ましくは、 植物体の抽出物または搾汁を濃縮処理 して濃縮物を得る工程；該濃縮物を塩およびアル力口ィドのうちの少なくと も一方で処理し、 粗プロアントシァニジン含有物を得る工程；および該粗プ 口アントシァ-ジン含有物を合成樹脂系吸着剤で処理する工程の順で行われ、 より好ましくは、 上記方法の濃縮処理を合成樹脂系吸着剤により濃縮するこ と、 すなわち、 植物体の抽出物または搾汁を、 合成樹脂系吸着剤で処理する 工程、 塩およぴ Zまたはアル力口ィドで処理する工程、 およぴ合成樹脂系吸 着剤処理する工程の順で行われる。 なお、 これらの工程の後でさらなる精製 工程 （例えば、 上記の浸透膜、 吸着剤などによる脱塩処理など） を行ってよ いことはいうまでもない。 (プロアントシァュジン含有物）

このようにして得られたプロアントシァ-ジン含有物は、 プロアントシァ ェジンを高い割合で含有する。 ここで、 プロアントシァ-ジン含有物には、 その後、 当業者が通常用いる方法によって得られる濃縮物、 希釈物、 粉末な ども含まれる。 プロアントシァニジンは、 生理活性の点から重合度が低いプ 口アントシァ-ジンが好ましく用いられる。 重合度の低い縮重合体としては、 重合度が 2〜 3 0の縮重合体 （ 2〜 3 0量体） が好ましく、 重合度が 2〜 1 0の縮重合体 （2〜1 0量体） がより好ましく、 重合度が 2〜4の縮重合体 ( 2〜 4量体) がさらに好ましい。 本発明の製造方法によって得られるプロ アントシァニジン含有物は、 この 2〜 4量体 (オリゴメリック ·プロアント シァニジン； O P C) を豊富に含む。 このプロアントシァェジン含有物は、 好ましくは O P Cを乾燥質量換算で 2 0質量％、 好ましくは 3 0質量％以上 より好ましくは 3 5質量％以上、 好ましくは 5 0質量％以上含有する。

特に、 本発明の方法が、 塩おょぴ Zまたはアルカロイド処理工程の前後に 濃縮処理工程を包含する場合には、 該方法によって得られるプロアントシァ 二ジン含有物は、 O P Cを乾燥質量換算で、 好ましくは 3 5質量％以上、 よ り好ましくは 4 0質量％以上、 さらに好ましくは 4 0質量％〜 8 0質量％含 有する。 このプロアントシァニジン含有物の O P C含有量は、 抽出物等を、 濃縮処理ならぴに塩および/またはアル力ロイド処理せずに、 合成樹脂系吸 着剤処理のみ行った処理物に比べて、 好ましくは 2倍以上、 より好ましくは 2倍〜 4倍である。 また、 濃縮しなかった場合に比べ、 好ましくは 1 . 3倍 以上、 より好ましくは 1 . 3倍〜 2倍である。

さらに、 プロアントシァ-ジン含有物に含有される全プロアントシァニジ ン中に占める O P Cの割合は、 上述の処理によって、 好ましくは 2 0 %以上、 より好ましくは 3 0 %以上、 さらに好ましくは 4 0 %以上である。 さらに、 本発明の方法が、 塩および/またはアル力ロイド処理工程の前後に濃縮処理 工程を包含する場合には、 好ましくは 3 5 %以上、 より好ましくは 4 0 %以 上、 さらに好ましくは 4 5 %〜 9 5 %、 最も好ましくは 5 0。/。〜 8 0 %であ る。 特に、 抽出物等の濃縮後に塩おょぴ またはアル力ロイド処理および合 成樹脂系吸着剤処理を行うことによって得られたプロアントシァ-ジン含有 物は、 抽出物等、 あるいは抽出物等を濃縮せずに塩おょぴ またはアルカロ ィド処理または合成樹脂系吸着剤処理のみ行うことによって得られた処理物 に比べて、 全プロアントシァニジン中に占める O P Cの割合が高く、 好まし くは 2倍以上、 より好ましくは 2倍〜 5倍、 さらに好ましくは 2倍〜 4倍で ある。 全プロアントシァニジン中に占める O P Cの割合が高いほど、 ブロア ントシァニジン含有物の生理活性おょぴ水への溶解性が高くなる。

得られたプロアントシァニジン含有物は、 さらに、 乾燥質量換算で力テキ ン類を好ましくは 1 0〜1 5質量％含有し得る。 カテキン （catechin) 類は、 単独では水溶性が乏しく、 その生理活性が低いが、 O P Cは、 カテキン類と 共存すると、 カテキン類の水溶性を增加させると同時に、 カテキン類の作用 を活性化する性質を有する。 したがって、 〇 P Cとカテキン類とを含有する プロアントシァェジン含有物は、 特に有用である。

カテキン類とは、 ポリヒドロキシフラバン一 3—オールの総称である。 力 テキン類としては、 (+) 一力テキン、 (一） ーェピカテキン、 （+) —ガ ロカテキン、 （一） ーェピガロカテキン、 ェピガロカテキンガレート、 ェピ 力テキンガレートなどが挙げられる。 さらに、 天然物由来のァフゼレキン、 ならびに （+) —力テキンまたはガロカテキンの 3—ガロイル誘導体も含む。 カテキン類は、 ツバキ科の植物 （例えば、 緑茶、 紅茶、 ウーロン茶などの 茶葉） 、 麻黄などに含有される。 例えば、 これらの植物の抽出物等を上記の プロアントシァェジン含有物に加えもよいし、 プロアントシァニジンとカテ キン類との両者を含む植物抽出物等 （例えば、 松樹皮抽出物） を利用しても よい。

カテキン類の作用としては、 発癌抑制作用、 動脈硬化予防作用、 脂肪代謝 異常の抑制作用、 血圧上昇抑制作用、 血小板凝集抑制作用、 抗アレルギー作 用、 抗ウィルス作用、 抗菌作用、 虫歯予防作用、 口臭防止作用、 腸内細菌叢 正常化作用、 活性酸素やフリーラジカルの消去作用、 抗酸化作用、 血糖の上 昇を抑制する抗糖尿病作用な'どが挙げられる。

本発明のプロアントシァ-ジン含有物は、 濃縮して， その濃度を高めてか ら種々の用途に利用することもできる。 濃縮には、 膜濃縮、 加熱濃縮、 真空 (減圧） 濃縮、 凍結濃縮などの種々の方法が用いられる。

さらに必要に応じて、 これらのプロアントシァニジン含有物を殺菌処理し て保存する。 殺菌は、 気流殺菌、 高圧殺菌、 加熱殺菌などの当業者が通常用 いる方法により行われる。 .

また、 これらのプロアントシァニジン含有物は、 殺菌後、 濃縮、 乾燥、 お よび粉末ィ匕してもよい。 乾燥は、 当業者が通常用いる方法によって行われる。 中でも、 凍結乾燥、 真空乾燥、 およぴ噴霧乾燥が好ましく用いられる。

得られたプロアントシァニジン含有物は、 例えば、 ドリンク剤およびゲル 化した飲食物などとしても利用できる。 さらに、 プロアントシァェジン含有 物は、 そのまま飲食に供するだけでなく、 賦形剤、 増量剤、 結合剤、 増粘剤、 乳化剤、 香料、 食品添加物、 調味料などと混合し、 用途に応じて、 顆粒、 錠 剤などの形態に成形することもできる。 例えば、 ローヤルゼリー、 ビタミン 類、 プロテイン、 カルシウム、 キトサン、 レシチン、 カフェインなどと混合 し、 さらに糖液おょぴ調味料により味が整えられる。 さらにこれらは、 ハー ドカプセルおよびソフトカプセルなどのカプセル剤、 丸剤、 またはテイーバ ッグ状などにされる。 これらは、 これらの形状または好みに応じて、 そのま ま食してもよく、 あるいは水、 湯、 牛乳などに溶いて飲んでもよい。 またテ イーバッグ状などの場合、 成分を浸出させてから飲んでもよい。

上述のように、 本発明により得られたプロアントシァェジン含有物は、 食 品、 化粧品、 および医薬品の原料として広く使用することができる。 実施例

以下、 実施例に基づいて本発明を説明するが、 この実施例は本発明を制限 するものではない。 実施例に示す単位 (V/V) は （容量/容量） を、 （W /W) は （質量/質量） を、 （W/V) は （質量/容量） を示す。 まず、 塩処理または濃縮処理によるプロアントシァニジン含有量の変化を 調べるために、 以下の参考例 1〜 1 6を行つた。 (参考例 1 ) .

松樹皮 9 0 0 gに精製水 7 . 2 Lを加え、 プレンダー （Waring Blender) で破碎した後、 1 0 0 °Cで 1 0分間加熱抽出した。 次いで、 直ちに濾過し、 濾過後の不溶物を精製水 1 . 8 Lで洗浄し、 濾液と洗浄液とを合わせて 9 L の松樹皮抽出液を得た。

この抽出液 1 m Lを凍結乾燥したところ、 乾燥質量は 8 m gであった。 上 記抽出液 1 L (抽出物粉末乾燥質量 8 g ) を 2 5 °Cまで放冷し、 塩化ナトリ ゥムが 3 5 . 8 (W/V) % (飽和濃度) となるように添加してよく攪拌し た。 この溶液を 4 °Cで 2 4時間静置後、 濾過し、 9 1 0 ni Lの粗プロアント シァニジン含有液 Aを得た。

得られた粗プロアントシァニジン含有液 Aに含まれる 5量体以上のプロア ントシァニジン含有量を、 以下のようにして、 塩処理前の松樹皮抽出物と比 較した。

まず、 塩で処理する前の松樹皮抽出液 1 0 0 Lを、 精製水を用いて 2、 4、 6、 および 8倍に希釈した溶液を調製した。 次いで、 松樹皮抽出液の原 液おょぴ 2〜 8倍希釈溶液、 ならびに粗プロアントシァ-ジン含有液 Aにつ いて、 シリカゲ 薄層クロマトグラフィー （T L C) により、 各溶 ϊί支中に含 まれる 5量体以上のプロアントシァ-ジンを検出した。

T L Cの展開条件おょぴ検出方法は下記の通りである。

T L C ：シリカゲルプレート （Merck & CO. , Inc.製）

展開溶媒：ベンゼン/蟻酸ェチル /蟻酸 ( 2 / 7 / 1 )

検出試薬：硫酸およぴァュスアルデヒド硫酸

サンプル量：各 1 0 L

検出試薬にて発色後、 粗プロアントシァ-ジン含有液 Aに含有される 5量 体以上のプロアントシァュジン （R i値： 0 . 1以下） の発色度合いを、 処 理前の松樹皮抽出液の原液おょぴ 2〜 8倍希釈溶液に含有される 5量体以上 のプロアントシァニジンの発色と比較して、 含有液 A中の 5量体以上のプロ アントシァ-ジンのおよその量を求めた。 結果を表 1に示す。 なお、 表中、 粗プロアントシァニジン含有液 Aの発色が松樹皮抽出液の原液および希釈液 の発色に比べて強い場合は +を、 弱い場合は一を示す。 表 1の粗プロアント シァニジン含有液 Aの発色が、 松樹皮抽出液の原液の 6倍希釈液に比べて弱 く、 8倍希釈液に比べて強いことから、 含有液 A中の 5量体以上のプロアン トシァ-ジンの含有量は、 原液の 1Z6〜1Z8の間になつていると考えら れる。

(参考例 2)

塩ィ匕ナトリウムを 25. 8 (W/V) % (70%飽和濃度） となるように 添加したこと以外は、 参考例 1と同様にして、 90 OmLの粗プロアントシ ァニジン含有液 Bを得、 TLCにて含有液 B中の 5量体以上のプロアントシ ァ-ジンのおよその量を求めた。 結果を表 1に併せて示す。

(参考例 3)

塩化ナトリウムを 17. 9 (W/V) % (50%飽和濃度） となるように 添加したこと以外は、 参考例 1と同様にして、 900 m Lの粗プロアントシ ァニジン含有液 Cを得、 T L Cにて含有液 C中の 5量体以上のプロアントシ ァュジンのおよその量を求めた。 結果を表 1に併せて示す。 (参考例 4)

塩化ナトリウムを 10. 7 (W/V) % (30%飽和濃度） となるように 添加したこと以外は、 参考例 1と同様にして、 92 OmLの粗プロアントシ ァニジン含有液 Dを得、 TLCにて含有液 D中の 5量体以上のプロアントシ ァェジンのおよその量を求めた。 結果を表 1に併せて示す。

. .

(参考例 5) 塩ィ匕ナトリウムの代わりに、 硫安を 76. 8 (W/V) % (飽和濃度） と なるように添カ卩したこと以外は、 参考例 1と同様にして、 90 OmLの粗プ 口アントシァニジン含有液 Eを得、 TLCにて含有液 E中の 5量体以上のプ 口アントシァニジンのおよその量を求めた。 結果を表 1に併せて示す。 '

(参考例 6 )

塩化ナトリゥムの代わりに、 硫安を 53. 8 (W/V) % (70 %飽和濃 度） となるように添加したこと以外は、 参考例 1と同様にして、 90 OmL の粗プ口アントシァニジン含有液 Fを得、 T L Cにて含有液 F中の 5量体以 上のプロアントシァ-ジンのおよその量を求めた。 結果を表 1に併せて示す。

(参考例 7)

塩ィヒナトリウムを 1. 8 (W/V) % (5%飽和濃度） となるように添加 したこと以外は、 参考例 1と同様にして、 90 OmLの粗プロアントシァニ ジン含有液 Gを得、 TLCにて含有液 G中の 5量体以上のプロアントシァニ ジンのおよその量を求めた。 結果を表 1に併せて示す。

(参考例 8)

塩化ナトリウムの代わりに、 硫安を 7. 7 (W/V) % (10%飽和濃 度） となるように添加したこと以外は、 参考例 1と同様にして、 900mL の粗プロアントシァ-ジン含有液 Hを得、 TLCにて含有液 H中の 5量体以 上のプロアントシァ-ジンのおよその量を求めた。 結果を表 1に併せて示す。

(参考例 9)

松樹皮 900 gに 80 (V/V) %エタノール水溶液 7. 2丄を加え、 ブ レンダー （Waring Blender) で破碎した後、 70 °Cで 1時間還流させながら カロ熱抽出した。 次いで、 直ちに濾過し、 濾過後の不溶物を 80 (V/V) % ェタノール水溶液 1. 8 Lで洗浄し、 濾液と洗浄液を合わせて 9 Lの松樹皮 の含水エタノール抽出液を得た。

この抽出液 1 OmLを凍結乾燥したところ、 乾燥質量は 1 O Omgであつ た。 上記抽出液 1 L (抽出物粉末乾燥質量 10 g) を 25°Cまで放冷し、 濃 縮してエタノールを完全に除去した。 その後、 精製水を添加して容量が 50 mLとなるように調整して、 抽出液の 1/20容量に相当する濃縮液 Iを得 た。 得られた 5 OmLの濃縮液 Iに塩化ナトリウムを 9 g添加してよく攪拌 した （塩化ナトリウム濃度約 17. 9W/V%, 約 50%飽和濃度） 。 この 溶液を 4 °Cで 24時間静置後、 析出した不溶物を濾過により除去し、 52m Lの粗プロアントシァェジン含有液 I 1を得た。

得られた粗プ口アントシァェジン含有液 I 1に含まれる 5量体以上のプ口 アントシァニジン含有量を、 参考例 1と同様に、 TLCにて含有液 I 1中の 5量体以上のプロアントシァ-ジンのおよその量を求めた。 結果を表 1に併 せて示す。

(参考例 10)

参考例 9で得られた 5 OmLの濃縮液 Iに、 塩ィヒナトリウムを 3. 6 g添 加してよく攪拌した （塩化ナトリウム濃度約 7. 2W/V%、 約 20%飽和 濃度） 。 この溶液を 4 °Cで 24時間静置後、 析出した不溶物を濾過により除 去し、 51 m Lの粗プロアントシァェジン含有液 I 2を得た。 塩処理前の溶 液 (濃縮液 I ) を指標として、 参考例 1と同様に、 TLCにて該含有液 I 2 中の 5量体以上のプロアントシァニジンのおよその量を求めた。 結果を表 1 に併せて示す。

(参考例 11 ) 参考例 9で得られた 50 m Lの濃縮液 Iに、 硫安を 19. 2 g添加してよ く攪拌した （硫安濃度約 38. 4W/V%、 約 50%飽和濃度） 。 この溶液 を 4でで 24時間静置後、 析出した不溶物を濾過により除去し、 51 m Lの 粗プロアントシァニジン含有液 I 3を得た。 塩処理前の溶液 （濃縮液 I) を 指標として、 参考例 1と同様に、 丁 。にて該含有液13中の 5量体以上の プロアントシァェジンのおよその量を求めた。 結果を表 1に併せて示す。

(参考例 12)

参考例 9と同様にして松樹皮エタノール抽出液を濃縮した後、 精製水を用 いて容量が 10 OmLとなるように調整して、 抽出液の 1/10容量に相当 する濃縮液 Jを得た。 この 10 OmLの濃縮液 Jに塩化ナトリウムを 17· 9 g添加してよく攪拌した （塩ィ匕ナトリウム濃度約 17. 9W/V%, 約 5 0%飽和濃度） 。 この溶液を 4 °Cで 24時閬静置後、 析出した不溶物を濾過 により除去し、 96mLの粗プ口アントシァ-ジン含有液 Jを得た。 塩処理 前の溶液 （濃縮液 J) を指標として、 参考例 1と同様に、 TLCにて該含有 液 J中の 5量体以上のプロアントシァニジンのおよその量を求めた。 結果を 表 1に併せて示す。

(参考例 13)

松樹皮 900 gに精製水 7. 2 Lを加え、 ブレンダー （Waring Blender) で破枠した後、 100 Cで 10分間加熱抽出した。 次いで、 直ちに濾過し、 濾過後の不溶物を精製水 1. 8 Lで洗浄し、 濾液と洗浄液を合わせて 9 Lの 松樹皮の水抽出液を得た。

この水抽出液 1 OmLを凍結乾燥したところ、 乾燥質量は 73m gであつ た _p 上記抽出液 1 L (抽出物粉末乾燥質量 7. 3 g) を 25°Cまで放冷した。 水で膨潤させた 50 OmLのダイアイオン HP— 20を充填したカラムに、 この水抽出液を通液した。 ついで、 3 Lの精製水でカラムを洗浄した後、 5 00 m Lの無水エタノールで吸着成分を全て溶出させた。 溶出液を減圧濃縮 してエタノールを完全に除去した。 その後、 精製水を添加して容量が 50m Lとなるように調整して、 抽出液の 1/20容量に相当する濃縮液 Kを得た。 参考例 9と同様に塩処理し、 析出した不溶物を濾過により除去し、' 5 lmL の粗プロアントシァニジン含有液 Lを得た。 塩処理前の溶液 (濃縮液 K) を 指標として、 参考例 1と同様に、 TLCにて該含有液 K中の 5量体以上のプ 口アントシァニジンのおよその量を求めた。 結果を表 1に併せて示す。 (参考例 14)

参考例 9と同様にして松樹皮のエタノール抽出液を濃縮した後、 精製水を 用いて容量が 1 Lとなるように調整して、 抽出液の 1 / 1容量に相当する濃 縮液 Lを得た。 1 Lの濃縮液 Lに塩化ナトリゥムを 1 79 g添加してよく攪 拌した （塩化ナトリウム濃度約 17. 9W_ V%、 約 50%飽和濃度） 。 こ の溶液を 4 で 24時間静置後、 析出した不溶物を濾過により除去し、 95 OmLの粗プ口アントシァニジン含有液 L 1を得た。 塩処理前の溶液 （濃縮 液 ） を指標として、 参考例 1と同様に、 丁 じにて該含有液 1中の5量 体以上のプロアントシァニジンのおよその量を求めた。 結果を表 1に併せて 示す。

(参考例 15)

参考例 14で得られた 1 Lの濃縮液 Lに、 塩ィヒナトリウムを 72 g添カロし てよく攪拌した （塩化ナトリウム濃度約 7. 2W/V%、 約 20 %飽和濃 度） 。 この溶液を 4 °Cで 24時間静置後、 析出した不'溶物を濾過により除去 レ、 93 OmLの粗プロアントシァェジン含有液 L 2を得た。 '塩処理前の溶 液 (濃縮液 L) を指標として、 参考例 1と同様に、 丁1^0にて該含有液 2 中の 5量体以上のプロアントシァ-ジンのおよその量を求めた。 結果を表 1 に併せて示す。

(参考例 1 6 )

参考例 14で得られた 1 Lの濃縮液 Lに、 硫安を 384 g添加してよく攪 拌した (硫安濃度約 3 8. 4W/V%、 約 50%飽和濃度） 。 この溶液を 4°Cで 24時間静置後、 析出した不溶物を濾過により除去し、 9 7 OmLの 粗プロアントシァニジン含有液 L 3を得た。 塩処理前の溶液 （濃縮液 L) を 指標として、 参考例 1と同様に、 T L Cにて該含有液 L 3中の 5量体以上の プロアントシァニジンのおよその量を求めた。 結果を表 1に併せて示す。

+は発色が強い、および一は発色が弱いことを示す。

* 1…濃縮率 =濃縮液容量/抽出液容量

* 2…濃縮後、再度抽出液と同じ容: 1に調製

* 3···塩処理前の濃縮液または抽出液との比較

表 1の結果から、 濃縮処理を行わない場合 （参考例:！〜 8) 、 飽和容量 7 0 %以上の塩化ナトリゥムで、 または飽和容量 70 %以上の硫安で処理した 粗プロアントシァニジン含有液 A、 B、 E、 および Fはいずれも、 松樹皮抽 出液の 6倍希釈液より発色が弱かった。 他方、 濃縮処理を行った場合、 その 後希釈せずに、 塩処理した粗プロアントシァニジン含有液 I (1 1-1 3) 、 J、 および Kはいずれも、 塩処理前の溶液 （濃縮液） の 6倍希釈液より発色 が弱かった (参考例 9〜 1 2 ) 。 これらのことから、 粗プロアントシァニジ ン含有液 A、 B、 E、 F、 I (I 1〜1 3) 、 J、 および Kは、 5量体以上 のプロアントシァニジンが、 塩処理前の量の 1Ζ6〜 1/8に減少している ことがわかる。 特に、 濃縮処理を行った場合、 塩の量を少なくできることが わかる。 以下、 得られた各粗プロアントシァニジン含有液を、 さらなる精製 に供した。

(実施例 1)

粗プロアントシァニジン含有液 Αを、 以下のようにしてさらに精製した。 まず、 90 OmLの粗プロアントシァニジン含有液 Aを、 水で膨潤させた芳 香族系合成樹脂 （ダイアイオン HP— 20 ：三菱化学株式会社製） を 100 mL充填した 30 X 30 Ommのカラムに通液し、 プロアントシァニジンを カラムに吸着させた。 このカラムを 1 Lの精製水で洗浄して、 カラムに残存 する糖類、 有機酸などを除去した。 次いで 1 5% (V/V) のエタノール一 水混合溶媒でカラムからプロアントシァ-ジンを溶出し、 20 OmLの精製 プロアントシァ-ジン含有液 Aを得た。 この含有液 Aを凍結乾燥し、 乾燥質 量を測定した。

次に、 得られた精製プロアントシァニジン含有液 Aの各成分の含有量を調 ベるために、 OP Cを含む成分、 5量体以上のプロアントシァ-ジン画分、 力テキン類を含む成分、 およぴカテキン類以外の成分に、 以下のようにして 分離した。 まず、 水で膨潤させたセフアデックス LH— 20 (アマシャムバ ィォテック株式会社製) 25mLを 15 X 300 mmのカラムに充填し、 5 0 m Lのェタノールで洗浄した。 100 m gの上記乾燥粉末を 2 m Lのェタ ノールに溶解させ、 この溶液をカラムに通液して吸着させた後、 100〜 8 0% (V/V) エタノール一水混合溶媒でグラジェント溶出し、 10mLず つ分取した。 分取すると同時に、 2〜4量体の O PCの標品 （2量体：プロ アントシァニジン B - 2 (R f値： 0. 6) 、 3量体：プロアントシァ-ジン C -1 (R f値： 0. 4) 、 および 4量体：シンナムタン-ン八₂ (R f値： 0. 2) ) を指標として、 各画分中の OPCを上記参考例 1と同様に TLCによ り検出した。

TLCにより OPCが含まれることを確認した溶出画分を合わせて、 O P C画分を得た。

次いで、 OPCが検出されなくなった時点で、 300mLの 50% (V/ V) 水一アセトン混合溶媒を通液し、 カラムに吸着した残りの吸着物を溶出 させた。

回収した吸着物を含む画分について、 カテキン （R f値： 0. 8) を指標 として、 TLCを行い、 力テキン類を含む画分と 5量体以上のプロアントシ ァ-ジン画分とに分離した。 T L Cの展開条件おょぴ検出方法は上記と同様 に行った。 '

力テキン類を含む画分については、 さらに、 以下のようにしてカテキン類 とカテキン類以外の成分とに分離した。 まず、 力テキン類を含む画分を凍結 乾燥し、 粉末を得た。 この粉末を 3 m Lの水に溶解させ、 この溶液を水で膨 潤させた 20 m Lの MC Iゲル (三菱化学株式会社製) を 15 X 300 mm のカラムに充填した力ラムに通液して吸着させた。 このカラムを水で洗浄し た後、 10〜 100 % (V/V) ェタノ一ルー水混合溶媒でダラジェント溶 出し、 7mLずつ分取した。 溶出終了後、 カテキンを指標として、 各画分中 の力テキン類を TLCにより検出し、 力テキン類画分とカテキン類以外の成 分の画分とに分離した。

上記のようにして得た O P C画分、 5量体以上のプロアントシァニジン画 分、 力テキン類画分、 およびカテキン類以外の成分の画分をそれぞれ凍結乾 燥により粉末化し、 乾燥質量を測定した。 なお、 OPC画分、 5量体以上の プロアントシァ-ジン画分、 力テキン類画分、 カテキン類以外の成分の画分、 およびその他の成分の画分の総和は、 精製プロアン'トシァ-ジン含有液 Aの 乾燥粉末 10 Omgに対して 99. 2〜99. 6mgであり、 ほぼ全量回収 されていた。

表 2に、 精製プロアントシァニジン含有液 Aの乾燥質量、 そして精製プロ アントシァ-ジン含有液 Aに含まれる OP C、 5量体以上のプロアントシァ 二ジン、 全プロアントシァニジン （OPCおよび 5量体以上のプロアントシ ァ-ジンの合計） 、 およぴカテキン類の乾燥質量および含有率、 ならびに全 プロアントシァェジン中の OP Cの割合を示す。 表 2において、 aは上記固 形物質量、 bは OPC質量、 cは 5量体以上のプロアントシァニジンの質量、 dは力テキン類の質量を示す。

(実施例 2〜 8 )

粗プロアントシァニジン含有液 B〜Hについて、 上記実施例 1と同様にし て、 それぞれ精製プロアントシァニジン含有液 B〜Hを得、 精製プロアント シァニジン含有液 B〜Hの乾燥質量、 そして精製プロアントシァ-ジン含有 液 B〜Gに含まれる OP C、 5量体以上のプロアントシァニジン、 全プロア ントシァニジン、 およぴカテキン類の乾燥質量おょぴ含有率、 ならびに全プ 口アントシァニジン中の O P Cの割合をそれぞれ測定した。 結果を表 2に併 せて示す。 · (実施例 9〜 14 )

粗プロアントシァニジン含有液 I 1- 1 3, J、 K、 および L 1について、 溶出液として 1 5% (V/V) のエタノール一水混合溶媒の代わりに、 2 0% (V V) のェタノ一ルー水混合溶液を用いたこと以外は、 実施例 1と 同様にして、 それぞれ精製プロアントシァニジン含有液 I 1〜 I 3、 J、 K、 および L 1を得、 表 2に示す各項目について測定した。 結果を表 2に併せて 示す。

(実施例 15)

松樹皮 900 gに 80 (V/V) %ェタノール水溶液 7. 2 Lを加え、 ブ レンダー （Waring Blender) で破枠した後、 100 °Cで 1時間還流させなが ら加熱抽出した。 次いで、 直ちに濾過し、 濾過後の不溶物を 80 (V/ V) %エタノール水溶液 1. 8 Lで洗浄し、 濾液と洗浄液とを合わせて 7. 6 Lの松樹皮の含水ェタノール抽出液を得た。

上記抽出液 1 Lを 25°Cまで放冷し、 減圧濃縮によりエタノールを完全に 除去するとともに濃縮した。 その後、 精製水を添加して容量が 5 OmLとな るように調整して、 抽出液の 1Z20容量に相当する濃縮液 Mを得た。 得ら れた 5 OmLの濃縮液 Mにカフェイン 0. 005 gを添加してよく攪拌した (カフェイン濃度約 0. 01 (WZV) %) 。 この溶液を 4 °Cで 24時間静 置後、 粗プロアントシァェジン含有液 Mを得た。

この 90 OmLの粗プロアントシァニジン含有液 Mについて溶出液として 15% (V/V) のエタノール一水混合溶媒の代わりに、 20% (VZV) のェタノ一ル--水混合溶液を用いたこと以外は、 実施例 1と同様にして精製 し、 精製プロアントシァニジン含有液 Mを得、 表 2に示す各項目について測 定した。 結果を表 2に併せて示す。 · (実施例 16)

カフェインの代わりに、 ベタインを 0. 005 g添加したこと (ベタイン 濃度約 0. 01 (W/V) %) 以外は、 実施例 1 5と同様にして精製し、 精 製プロアントシァェジン含有液 Nを得、 表 2に示す各項目について測定した。 結果を表 2に併せて示す。

(実施例 1 7)

参考例 9で得られた松樹皮の含水エタノ一ノレ抽出液を 1 Z 20容量まで濃 縮した濃縮液 I (50mL) に、 硫酸マグネシウムを 0. 025 g添加して よく攪拌した （硫酸マグネシウム濃度約 0. 05 (W/V) %) 。 この溶液 を 4でで 24時間静置後、 粗プロアントシァ-ジン含有液 I 4を得た。 この 90 OmLの粗プロアントシァ-ジン含有液 I 4を実施例 1と同様にして精 製し、 精製プロアントシァ-ジン含有液 I 4を得、 表 2に示す各項目につい て測定した。 結果を表 2に併せて示す。

(比較例 1 )

粗プロアントシァ-ジン含有液 Aの代わりに、 参考例 1の松樹皮の精製水 抽出液を用いて、 実施例 1と同様に、 精製し、 表 2に示す各項目について測 定した。 結果を表 2に併せて示す。

(比較例 2)

粗プロアントシァ-ジン含有液 Aの代わりに、 参考例 9で得られた松樹皮 のエタノール抽出液を用いて、 実施例 1と同様に、 精製し、 表 2に示す各項 目について測定した。 結果を表 2に併せて示す。

.

(比較例 3) 精製水の代わりに、 80 (V/V) %エタノール水溶液 1 Lに対して、 ベ タインを 0. 005 gとなるように添加した溶液 (ベタイン含有溶液) を用 いたこと以外は、 実施例 1と同様にして松樹皮のベタイン抽出液を得た。 さ らに、 粗プロアントシァ-ジン含有液 Aの代わりに、 上記松樹皮のカフエイ ン抽出物を用いて、 実施例 1と同様に、 精製し、 表 2に示す各項目について 測定した。 結果を表 2に併せて示す。

(比較例 4)

実施例 17の濃縮液 I (5 OmL) に、 硫酸マグネシゥムを添加する工程 において、 0. 2 gのァスコルビン酸を添カ卩して、 さらに硫酸マグネシウム を 0. 2 g添加し、 さらに水酸ィ匕カルシウムを 0. 2 g添加して、 不溶成分 を回収した。 この不溶物を塩酸を 3% (V/V) 含有する溶液 5 OmLに溶 解し、 実施例 1と同様に、 精製し、 表 2に示す各項目について測定した。 結 果を表 2に併せて示す。

実施例

…合成樹脂 吸着剖処理工程

〜a縮率 容量/抽出液容量

…； 縮後、再度抽出液と同じ容量に調製

量体） 量体以上のプロアントシァニジン

* 5…固形物質 ΰに対する各成分の含有率 (質量％)を表す … %エタノール水溶液

工程

精 ¾物の測定

抽出 濃縮 塩/アル加仆'処理 吸着 ¹

塩類 プロアントシァニジン（Pra)

固形物 カテキン類 液 塩類 または 飽和 精製物 OPC(2~4量体） 5量体以上

濃縮 全 PC OPC/

使用量 処理の 質量

抽出溶媒 または アル力。仆' 濃度

(濃縮率) " ¹² 有率 *⁵ 質量 e 質量 含有率 ⁵ 全 Pro 質 a 含有率 *⁵ アルカロイト' (g) 有無 質量 含

濃度 (%) (mg (%) (%) (%) (mg) (%)

(W/V%) b b/a c c/a b+c (b+c) b/(b+c) d d/a

1 の

精 水 濃縮せず 塩/アル加仆'処理せず o 精製松樹皮

2548 312 12.2 1402 55.0 1714 67.3 18.2 166 6.5 水抽出物

it 2 80;;EtOH *^e 濃縮 ず 塩〃ルカロ仆'処理せず o 精製松樹皮の 2110 372 17.6 1087 51.5 1459 69.1 25.5 109 5.2

含水エタノ-ル抽出物

例 3 ベタイン

PC1/20) 塩〃ル加仆 '処理せず 1002 201 20.1 . 49Z 49.1 693 69.2 29.0 95 9.5 含有液 o 精製松樹皮の

へ'タイン抽出物

4 80S5EtOH*^s 1(1/20) 塩を添加後、不溶物回収 精製松樹皮の

o 317 57.4 18.1 212 67.0 270 85.1 21.3 31 9,8

不溶物

- 1…合成樹脂系吸着剤処理工程

* 2…！ ¾]|^=8縮浪容量/抽出液容量 CO

* 3〜iSfSf 、再度抽出液と同じ容量に調製

=：： 4"'OPG(2~4量体） +5量体以上のプロアントシァニジン

* 5…固形 質量に対する各成分の含有率 (質量％)を表す

* 6·-·80%エタノール水溶液

表 2の結果からわかるように、 塩おょぴ Zまたはアル力ロイド処理おょぴ 合成樹脂系吸着剤処理を行つた精製ブロアントシァニジン含有液は、 ブロア ントシァニジンを高い割合で含有していた。 濃縮工程を経ないで塩処理して 得られる精製プロアントシァニジン含有液 A〜F (実施例 1〜 6 ) は、 特に O P C含量が高く、 乾燥質量換算で 3 0質量％以上含有していた。.すなわち、 松樹皮抽出液に最終飽和濃度が 3 0 %以上となるように塩化ナトリウムまた は硫安を添加して得られたプロアントシァニジン含有液は、 O P Cおよび力 テキン類を高濃度で含有することがわかる。 さらに、 実施例 1〜6の精製プ 口アントシァェジン含有液 A〜Fは、 5量体以上のプロアントシァニジンの 乾燥質量が減少しているにもかかわらず、 O P Cの乾燥質量に大きな差はな いため、 全プロアントシァェジン中に占める Q P Cの割合が飛躍的に高くな つた。 特に、 比較例 1の未処理の松樹皮抽出物に比べて 2倍〜 3 . 5倍と飛 躍的に高くなつた。 以上のことから、一価のアルカリ金属または硫安を所定 量添加することによって、 プロアントシァェジンを安定化するための補助剤 などを添加することなく、 植物体から O P Cを多く含むプロアントシァニジ ン含有物を得ることができることがわかった。

また、 濃縮工程後に、 塩および Zまたはアル力ロイド処理を経て得られる 精製プロアントシァニジン含有液 I ( I 1〜 I 4 ) 、 J、 K、 Μ、 および Ν はいずれも、 乾燥質量換算で 3 5質量％以上の O P Cを含有していた （実施 例 9〜1 3および 1 5〜： 1 7 ) 。

実施例 9〜 1 3の精製プロァントシァニジン含有液 I 1〜： 1 3、 J、 およ ぴ Kは、 抽出液をそのまま塩処理した実施例 3の精製プロアントシァ-ジン 含有液 Cおよぴ抽出液を濃縮後、 もとの濃度に希釈して塩処理を行つた実施 例 1 4の精製プロアントシァ二ジン含有液 L 1に比べて、 塩処理における塩 の使用量が 1 / 9〜1 Z 2 0と少ないにもかかわらず、 O P Cを高濃度で含 有しており、 コストおょぴ環境保全の面からも優れていた。 また、 カテキン 類の含有率も高められていた。 さらに、 実施例 9〜1 3の精製プロアントシ ァェジン含有液 I 1〜 I 3、 J、 および Kは、 比較例 1〜 4の精製松樹皮抽 出液および精製松樹皮の不溶物に比べて、 5量体以上のプロアントシァニジ ン含有量 （質量） が低く、 O P C含有量 （質量） はそれほど低くなつていな い。 そのため、 全プロアントシァニジン中に占める O P Cの割合が 5 7質 量％〜7 1 . 5質量％と飛躍的に高くなつていることがわかる。 特に、 比較 例 2の濃縮処理およぴ塩処理をしていなレ、松樹皮の含水ェタノール抽出液に 比べて、 固形物中の O P Cの含有率は 2 . 3倍〜 2 . 9倍、 全プロアントシ ァニジンに対する O P Cの含有率は 2 . 2〜2 . 8倍と飛躍的に高くなつた。 実施例 9〜1 3の精製プロアントシァニジン含有液 I 1〜1 3、 J、 および Kは、 抽出液をそのまま塩処理した実施例 3の精製プ口アントシァニジン含 有液 Cおよび抽出液を濃縮後、 もとの濃度に希釈して塩処理を行った実施例 1 4の精製プロアントシァ-ジン含有液 L 1に比べて、 固形物中の O P Cの 含有率は 1 . 3倍〜 1 . 7倍、 全プロアントシァニジンに対する O P Cの含 有率は 1 . 3倍〜 1 . 7倍と高くなつた。 以上のことから、 松樹皮の抽出液 を濃縮処理し、 塩および/またはアルカロイド処理し、 そして合成樹脂系吸 着剤処理することによって、 塩処理時の塩の使用量が少量で、 植物体から O P Cを多く含むプロアントシァニジン含有物を得ることができることがわか つた。

実施例 1 5〜1 7のアル力ロイドおよび二価の金属塩を用いて得られた精 製プロアントシァ-ジン含有液 M、 N、 および I 4は、 アルカロイドで抽出 した抽出液 （比較例 3 ) および二価の金属塩 （硫酸マグネシウムおよび水酸 化カルシウム） を添加した後、 回収された不溶物 （比較例 4 ) に比べて、 高 い O P C含有量を有し、 5量体以上のプロアントシァェジンが少ないことが 分かる。 特に、 カフェインまたは二価の金属塩を用いた場合は、 顕著であつ た。 また、 使用したアルカロイドの量または塩の量は、 一価の金属塩または 硫安を用いた場合よりもごく少量でよく、 経済的にも廃液処理の観点からも 優れていることが分かる。

(実施例 18)

松樹皮 100 gに 1 Lの精製水を加え、 破砕し、 100 で 10分間加熱 した。 次いで、 直ちに濾過し、 濾過後の不溶物を精製水 20 OmLで洗浄し、 濾液と洗浄液とを合わせて 1. 2 Lの抽出液を得た。 この抽出液の一部 （5 mL) を減圧濃縮し、 得られた抽出物粉末の質量を測定した （39mg) 。 次いで、 上記抽出物粉末を残りの抽出液に加え、 湯で全量 1. 2Lに調整 した後、 25 °Cまで放冷し、 次いで塩化カルシウムを 30質量％含有する水 溶液 (pH5 ：クェン酸で調整） を 2. 4 L添加して攪拌した後、 4°Cにて 24時間静置した。 静置後、 この溶液を濾過し、 粗プロアントシァ-ジン含 有液 Oを得た。 この粗プロアントシァニジン含有液 Oを酢酸で p Hが 3とな るように調整した。 この溶液に 30 gのダイアイオン HP— 20を加え、 3 時間攪拌した後に、 濾過し、 プロアントシァニジンが吸着した固形分を回収 した。 この固形分を 25 OmLの精製水で洗浄し、 15 OmLの 20% (V /V) エタノール水溶液を加え、 1時間攪拌した後に濾過し、 濾液を回収し、 精製プロアントシァュジン含有液 Oとした。 この精製プロアントシァェジン 含有液 Oを減圧濃縮乾固して、 0. 2 gのプロアントシァニジン含有乾燥粉 末を得た。 10 Omgのプロアントシァ-ジン含有乾燥粉末を用いて、 上記 実施例 1と同様に OPCおよぴカテキン類の含有率を測定したところ、 乾燥 質量換算で O P Cを 48. 1質量％およぴカテキン類を 15. 2質量％含有 していた。 (実施例 19) .

松樹皮 100 gに 1 Lの精製水を加え、 破碎し、 100°Cで 10分間加熱 した。 次いで、 直ちに濾過し、 濾過後の不溶物を精製水 20 OmLで洗浄し、 濾液と洗浄液とを合わせて 1. 2 Lの抽出液を得た。 この抽出液の一部 （5 mL) を減圧濃縮し、 得られた抽出物粉末の質量を測定した （38mg) 。 次いで、 上記抽出物粉末を残りの抽出液に加え、 湯で全量 1. 2 Lに調整 した後、 25 °Cまで放冷し、 40 gのダイアイオン H P— 20を加え、 3時 間攪拌した後に濾過し、 プロアントシァニジンが吸着した固形分を回収した。 この固形分を 25 OmLの精製水で洗浄し、 150mLの 20% (V/V) エタノール水溶液を加え、 1時間攪拌した後に濾過し、 濾液を回収した。 次 いで塩ィ匕ナトリウムを飽和濃度 （約 35. 8 (W/V) %) となるように添 加して攪拌した後、 4°Cにて 24時間静置した。 静置後、 この溶液を濾過し、 プロアントシァェジン含有液 pを得た。 このプロアントシァェジン含有液 P を透析して脱塩し、 水に置換して塩類を除去した。 このプロアントシァニジ ン含有液 Pを減圧濃縮乾固して、 1. 3 gのプロアントシァニジン含有乾燥 粉末を得た。 10 Omgのプロアントシァ-ジン含有乾燥粉末 Pを用いて、 上記実施例 1と同様に O PCおよびカテキン類の含有率を測定したところ、 乾燥質量換算で O PCを 40. 1質量％以上および力テキン類を 13. 1質 量％含有していた。

(実施例 20)

松樹皮 100 gに 80 (V/V) %エタノール水溶液 1 Lを加え、 ブレン ダ一で破砕した後、 80°Cで 1時間加熱抽出した。 次いで、 直ちに濾過し、 濾過後の不溶物を精製水 20 OmLで洗浄し、 濾液と洗浄液とを合わせて 1. 2 Lの抽出液を得た。 この抽出液の一部 (5mL) を減圧濃縮し、 得られた 抽出物粉末の質量を測定した (49mg) 。

次いで、 上記抽出物粉末を残りの抽出液に加え、 減圧濃縮してエタノール を完全に除去した。 その後、 精製水を加え、 容量が 10 OmLとなるように 調製して、 25°Cまで放冷し、 抽出液の 1Z12容量に相当する濃縮液を得 た。 得られた濃縮液 100 m Lに塩化ナトリウムを飽和濃度 （約 35. 8 (W/V) %) となるように添カ卩してよく攪拌した。 この溶液を 4 °Cにて 2 4時間静置後、 濾過し、 粗プロアントシァ-ジン含有液 Qを得た。 この粗プ 口アントシァニジン含有液 Qに 90 OmLの精製水おょぴ 10 gのダイアイ オン HP— 20を加え、 3時間攪拌した。 その後、 濾過し、 プロアントシァ 二ジンが吸着した固形分を回収した。 この固形分を 25 OmLの精製水で洗 浄し、 15 OmLの 20% (V/V) ェタノール水溶液を加え、 1時間攪拌 した後に濾過し、 濾液を回収し、 精製プロアントシァ-ジン含有液 Qとした。 この精製プロアントシァ-ジン含有液 Qを減圧濃縮乾固して、 0. 2 gのプ 口アントシァニジン含有乾燥粉末を得た。 10 Omgのプロアントシァ-ジ ン含有乾燥粉末を用いて、 上記実施例 1と同様に O PCおよぴカテキン類の 含有率を測定したところ、 乾燥質量換算で OPCを 51. 2質量⁰ /₀以上およ ぴカテキン類を 13. 1質量％含有していた。

(実施例 21)

松樹皮 100 gに精製水 1 Lを加え、 プレンダ一で破碎した後、 100°C で 10分間加熱抽出した。 次いで、 直ちに濾過し、 濾過後の不溶物を精製水 20 OmLで洗浄し、 濾液と洗浄液とを合わせて 1. 2 Lの抽出液を得た。 この抽出液の一部 (5mL) を減圧濃縮し、 得られた抽出物粉末の質量を測 定した （36mg) 。

次いで、 上記抽出物粉末を残りの抽出液に加え、 減圧濃縮した。 その後、 精製水を加え、 容量が 10 OmLとなるように調製して、 25 °Cまで放冷し、 抽出液の 1/12容量に相当する濃縮液を得た。 得られた濃縮液 100 m L に塩化カルシゥムを 50質量％含有する水溶液 (pH5 ：タエ.ン酸で調整) を 10 OmL添加して攪拌した。 この溶液を 4 °Cにて 24時間静置後、 濾過 し、 粗プロアントシァニジン含有液 Rを得た。 この粗プロアントシァ-ジン 含有液 Rに酢酸と精製水とを加えて p H 3の溶液 1 Lを調製した。 この溶液 に 10 gのダイアイオン HP— 20を加え、 3時間攪拌した。 その後、 濾過 し、 プロアントシァニジンが吸着した固形分を回収した。 この固形分を 25 OmLの精製水で洗浄し、 150mLの 20% (V/V) エタノール水溶液 を加え、 1時間擾拌した後に濾過し、 濾液を回収し、 精製プロアントシァニ ジン含有液 Rとした。 この精製プロアントシァ-ジン含有液 Rを減圧濃縮乾 固して、 0. 3 gのプロアントシァ-ジン含有乾燥粉末 Rを得た。 100m gのプロアントシァニジン含有乾燥粉末 Rを用いて、 上記実施例 1と同様に O PCおよぴカテキン類の含有率を測定したところ、 乾燥質量換算で O PC を 46. 2質量％およぴカテキン類を 10. 1質量％含有していた。 産業上の利用可能性

本発明の方法によれば、 植物体の抽出物または搾汁を塩およぴ Zまたはァ ルカロイドで処理した後に、 合成樹脂系吸着剤で処理する、 あるいは植物体 の抽出物または搾汁を合成樹脂系吸着剤で処理した後に、 塩および/または アル力ロイドで処理することによって、 効率的に生理活性が高い O PCを高 レ、割合で含有するプロアントシァニジン含有物を容易に得ることができる。 この方法は、 コストおょぴ環境保全の面から特に有用である。 得られた OP C含量が高いプロアントシァニジン含有物は、 力テキン類も含有する。 その ため、 O PCがカテキン類の作用を活性化させるという相乗効果を有する。 これらのプロアントシァニジン含有物は、 血管増強、 高血圧、 冷え性などの 改善に効果があり、 食品、 化粧品、 医薬品の製造原料として非常に有用であ

Claims

請求の範囲

1 . 植物体の抽出物または搾汁から得られるプロアントシァ-ジン含有物 の製造方法であって、

塩およびアル力ロイドのうちの少なくとも一方で処理する工程、 および 合成樹脂系吸着剤で処理する工程

の組み合わせを包含する、 方法。

2 . 前記塩おょぴアル力ロイドのうちの少なくとも一方で処理する工程の 前および後の少なくとも一方に、 合成樹脂系吸着剤による処理以外の濃縮処 理を行う工程を包含する、 請求項 1に記載の方法。

3 . 植物体の抽出物または搾汁を濃縮処理して濃縮物を得る工程；該濃縮 物を塩おょぴアル力ロイドのうちの少なくとも一方で処理して、 粗プロアン トシァニジン含有物を得る工程；およぴ該粗プ口アントシァニジン含有物を 合成樹脂系吸着剤で処理する工程を包含する、 プロアントシァニジン含有物 の製造方法。

4. 前記塩が、 一価のアルカリ金属、 二価のアルカリ金属塩、 および硫安 からなる群より選択される少なくとも 1種である、 請求項 1から 3のいずれ かの項に記載の方法。

5 . 前記アルカロイドが、 ベタイン、 カフェイン、 およびこれらの誘導体 からなる群より選択される少なくとも 1種である、 請求項 1から 3のいずれ かの項に記載の方法。 .

6 . 請求項 1から 5のいずれかの項に記載のプロアントシァ-ジン含有物 の製造方法であって、

該プロアントシァ-ジン含有物が、 オリゴメリック 'プロアントシァ-ジ ンを乾燥質量換算で 2 0質量％以上含有する、 方法。

7 . 請求項 1から 6のいずれかの項に記載の方法によって得られるブロア ントシァニジン含有物であって、

該プロアントシァ-ジン含有物が、 オリゴメリック ♦プロアントシァュジ ンを乾燥質量換算で 2 0質量％以上含有する、 含有物。

8 . 前記プロアントシァニジン含有物が、 さらに力テキン類を乾燥質量換 算で 5〜1 5質量。/。の割合で含有する、 請求項 7に記載の含有物。