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WO2003025567A2 - Herstellung von trägergebundenen molekülen mittels oligonucleotid-tags - Google Patents

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WO2003025567A2
WO2003025567A2 PCT/DE2002/003414 DE0203414W WO03025567A2 WO 2003025567 A2 WO2003025567 A2 WO 2003025567A2 DE 0203414 W DE0203414 W DE 0203414W WO 03025567 A2 WO03025567 A2 WO 03025567A2
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Inventor
Stefan Dübel
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Bernard, André
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
    • G01N2458/10—Oligonucleotides as tagging agents for labelling antibodies

Definitions

  • Bioarrays for high-grade analysis of complex mixtures of biomolecules.
  • the production of such bioarrays are carried out either expensively by the individual (serial) application of the “target” molecules, for example with the aid of spotters or printers, or by combinatorial synthesis from monomers in a serial process for each synthesis step.
  • This invention describes a method in which the assignment of the “target” proteins is carried out by simply overlaying a surface that has been pretreated in a certain way with a solution that contains a mixture of specially derivatized “target proteins a specific place on the array is determined by a system of Marking molecules (hereinafter referred to as “tags”) are guaranteed which are recognized by receptor molecules arranged in a specific form on the carrier (FIGS. 1 and 2).
  • tags are typically nucleic acid pieces, but can also be other classes of molecules, in particular Leuci, zipper, antibody-antigen pairs or other protein pairs.
  • the invention enables in particular a method for the inexpensive production of a large number of different binding molecules (in particular antibodies, synthetic binding molecules such as single domain antibodies, anticalins, RNA aptamers and their derivatives, fibronectin domains with randomized ones
  • binding molecules in particular antibodies, synthetic binding molecules such as single domain antibodies, anticalins, RNA aptamers and their derivatives, fibronectin domains with randomized ones
  • the key process is the coupling of "tag" and binding protein during the synthesis of the binding protein.
  • a clear assignment in such a Coupling is ensured in that the nucleic acid which codes for the binding protein is bound to the finished binding protein after it has been synthesized.
  • Such a process is described, for example, in the form of the ribosomal display (Roberts and Szostak, PNAS USA Vol 94, pp. 12297-12302, 1997) - here a puromycin at the 3 'end of the RNA creates a covalent bond to the one translated by this RNA polypeptide.
  • the coupled RNA is shortened in a further step, which only comprises the "tag" sequence and short flanking regions, coupled to the polypeptide.
  • binding protein "tag” pairs for the ligands to be detected (8), a complex mixture of binding protein "tag” complexes (with different binding specificity) is overlaid on an oligonucleotide array produced according to the prior art, the surface of which at defined points coincides with that in the mixture of binding protein "tag” complexes is complementary nucleotide sequences coated.
  • By hybridization of "tag” and counter strand a locally known coupling of the binding proteins to the array is achieved.
  • This array can then be used to detect ligands (8) in a sample, in particular by using them directly (or in several steps indirectly) fluorescence or enzyme-labeled ligands, plasmon resonance or other detection methods according to the prior art.
  • binding protein "tag" pair only requires two analysis steps (binding assay and sequencing of a short nucleic acid sequence) to define the binding protein "tag" pair,
  • one embodiment variant can be carried out completely in vitro (selection from combinatorial gene libraries)
  • Example 1 Preparation of a Proteomic Microarray
  • ribosomal display gene libraries of fibronectin domain analogs with randomized loop regions are produced.
  • Such gene libraries are manufactured, for example, by Phylos, Lexington, Massachusetts, USA.
  • some nucleotides are in Reading direction behind the translation stop codon of the open reading frame, which codes for the fibronectin domain analogs with randomized loop regions, clones in a second randomized region.
  • the binding activity of the clones selected by the ribosomal display is determined by a binding assay (eg ELISA, immunoblot, plasmon resonance analysis) and the nucleotide sequence of the associated nucleic acid is determined in the region of the “tag” sequence. Since the theoretical The complexity of the "tag" sequences is greater, ideally several orders of magnitude is larger than that of the gene library of binding proteins, it is ensured that each binding protein has a very high probability of having an individual "tag".
  • the sequence information of these tags is used to generate oligonucleotide arrays with their complementary strands, for example according to the known methods of the companies Affymetrix, USA, or Febit AG, Mannheim.
  • a second step similar to the ribosomal display, but this time a preparative step, the characterized clones are now used to produce the binding molecule provided with the "tag".
  • mRNA molecules linked to puromycin are produced and an in vitro translation is carried out required cell-free translation can be carried out to facilitate cleaning according to Shimizu et al., Nature Biotech Vol 19, p. 751-755, 2001. It can also be done in a mixture of all binding molecules, which saves the enormous effort of individual preparations for each clone Since the "tag" sequence lies behind the translation stop signal, a "tag" is automatically added to each binding protein.
  • the coupled RNA is shortened, which only the " tag "sequence and short flanking regions coupled to the polypeptide.
  • Such shortening can be done in various ways according to the prior art. It can be a short (typically 5-20nt long) Oligonucleotide, which is complementary to the linker region (10), are hybridized to this after the selection has been carried out on the basis of the binding of the binding proteins. This makes this short region cuttable by certain nucleases, especially RnaseH (Fig. 4).
  • nuclease-resistant forms of RNA instead of that for the selection process for the binding molecules; in this case the nucleic acid derivatives, which are used analogously to the mRNA, would be produced synthetically so that the linker region (10) consists of non-nuclease-resistant nucleotides or DNA, while the rest of the sequence consists of nuclease-resistant nucleotides (e.g. PNA or nucleic acid strands from SP - Diastereomers of ribonucleoside 5'-O- (l-thiotriphosphate)) (Fig. 5).
  • the linker region (10) consists of non-nuclease-resistant nucleotides or DNA
  • the rest of the sequence consists of nuclease-resistant nucleotides (e.g. PNA or nucleic acid strands from SP - Diastereomers of ribonucleoside 5'-O- (l-thiotriphosphate)) (Fig. 5).
  • the mixture of binding protein "tag” complexes is subjected to column chromatographic purification on an ion exchange material in order to remove the cleaved sequences.
  • the mixture thus purified is applied to an array and incubated at 67 ° C. for 24 hours , so that the noncovalent bonds between "tag” and its receptor sequence can form.
  • the array is washed 5 times with PBS (137 M NaCl, 3 mM KC1, 8 mM Na 2 HPO 4 , 1 mM KH 2 PO 4 , pH 7.3) to remove unbound binding molecules, and can then be used immediately for a binding reaction
  • an oligonucleotide array is produced, on which 10,000 oligonucleotides optimized for optimal binding and minimal ker hybridization have been applied at known positions.
  • a gene library of ScFv antibody fragments in the phage display vector pSEX81 is screened for the desired antigens and the desired binders are cloned according to the prior art (Welschof, et al., (1997) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 94, 1902-1907 ). Streptavidin fusion proteins of the selected antibody clones are produced by recloning into the bacterial expression vector pSTE (Dübel et al., J. Immunol. Meth. 178, 201-209).
  • the pSTE vector was changed before inserting the genes for the ScFv antibody fragments by inserting a short nucleic acid sequence behind the stop codon for the streptavidin, which ensures that the translated RNA can later be cut off at this point (see Example 1)
  • DNA fragments coding for the antibody-streptravidin fusion proteins, including this linker sequence are obtained from E. coli plasmid DNA preparation by restriction digestion.
  • the excised gene pieces, containing the coding sequence for the antibody-streptravidin fusion protein and the linker sequence, are each linked to a specific tag sequence in individual ligation.
  • Oligonucleotides were produced by hybridizing two complementary synthetic oligonucleotides, the resulting double strand nucleic acid piece being derivatized with a biotin group at the end not to be ligated.
  • the ligation products are purified by ethanol precipitation and concentrated and serve as templates in a ribosome display reaction according to Hanes and Plückthun (1997, Proc Natl Acad Sei USA 13; 94 (10): 4937-42).
  • the biotinylated end of the nucleic acid couples to the antibody-streptravidin fusion protein, which was produced by this ribosome, and causes the formation of the binding molecule “tag” pair.
  • Fig. 1 Immobilization of the binding protein (1) by hybridizing the "tag” (4) with a receptor molecule (e.g. a nucleic acid counter-strand) (5), which is anchored to the array via a binding element (6).
  • a receptor molecule e.g. a nucleic acid counter-strand
  • Signal e.g. Fluorescence, change in reflection properties, conductivity, mass or plasmon resonance properties.
  • ribosomal display mRNA strand with genetic and molecular elements of the gene library for the "ribosomal display”.
  • sequence-identical spacer sequences 4 cleavage after the selection of nucleic acid sequences no longer required by hybridization of an oligonucleotide and subsequent nuclease digestion.
  • nucleic acid region 17 for the binding protein (1) coding nucleic acid region

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Abstract

Die Erfindung beschreibt Träger für Bindungsassays, bei dem die Zuordnung und Kopplung von Fängermolekülen an die Festphase durch einfaches Überschichten einer in bestimmter Weise vorbehandelten Fläche (Träger) mit einer Lösung geschieht, welche ein Gemisch speziell derivatisierter 'Targets' (Fängermoleküle) enthält. Die Zuordnung eines bestimmten Moleküls zu einem bestimmten Platz auf dem Träger wird durch ein System von Markierungsmolekülen ('Tags') gewährleistet, welche von in bestimmter Form angeordneten Rezeptormolekülen auf dem Träger erkannt wird. Diese 'Tags' und ihre Rezeptormoleküle sind typischerweise Nukleinsäurestücke, können aber auch andere Molekülklassen sein, insbesondere Leucin-zipper, Antikörper-Antigen-Paare oder andere Proteinpaare. Die Erfindung beschreibt weiterhin Verfahren zur Herstellung solcher Träger und der Fängermoleküle, sowie deren Anwendung nach der Kopplung.

Description

„Herstellung von trägergebundenen Molekülen"
Zweck der Erfindung:
Proteomics und Genomics erfordern immer komplexere Bioarrays zur hochpaξSillelen Analyse komplexer Gemische von Biomolekülen. Die Herstellung solcher Bioarrays, im besonderen von Protein- Arrays wie z.B. Antikörperarrays, erfolgt nach Stand der Technik entweder aufwendig durch einzelnes (serielles) Aufbringen der „Target"- Moleküle z.B. mithilfe von Spottern oder Druckern, oder durch kombinatorische Synthese aus Monomeren in einem seriellen Prozess für jeden Syntheseschritt. Eine wesentliche Erleichterung der Produktion solcher Bioarrays und damit eine preiswertere Herstellung würde durch einen nicht-seriellen Aufbringungsschritt der Proteine ermöglicht. Damit bei einem solchen Verfahren eine genaue Positionszuordnung des einzelnen Proteins zu einer bestimmten Stelle des Arrays möglich ist, mußten bisher extrem aufwendige und nicht mit hoher Komplexität herstellbare Mikrokanal-Festkörper eingesetzt werden, welche verschiedene Flüssiggkeitszuführungen für verschiedene Positionen auf dem Array gewährleisten.
Diese Erfindung beschreibt ein Verfahren, bei dem die Zuordnung der „Target"- Proteine durch einfaches Überschichten einer in bestimmter Weise vorbehandelter Fläche (Träger) mit einer Lösung geschieht, welche ein Gemisch speziell derivatisierter „Targef-Proteine enthält. Die Zuordnung eines bestimmten Proteins zu einem bestimmten Platz auf dem array wird durch ein System von Markierungsmolekülen (im weiteren als „tags" bezeichnet) gewährleistet, welche von in bestimmter Form angeordneter Rezeptormoleküle auf dem Träger erkannt werden (Figs. 1 und 2). „Tags" und ihre Rezeptormoleküle sind typischerweise Nukleinsäurestücke, können aber auch andere Molekülklassen sein, insbesondere Leuci, zipper, Antikörper-Antigen-Paare oder andere Proteinpaare.
Die Erfindung ermöglicht insbesondere ein Verfahren zur preiswerten Herstellung einer großen Zahl verschiedener Bindemoleküle (insbesondere von Antikörpern, synthetischen Bindemolekülen wie Einzeldomänenantikörpern, Anticalinen, RNA- Aptameren und ihrer Derivate, Fibronectin-Domänen mit randomisierten
Loopbereichen) mit daran bebundenem „tag" in einem Gemisch, aus dem danach spezifische Bindemoleküle isoliert werden und bereits mit einem eindeutigen „tag" versehen sind. Zur Herstellung eines Arrays mit bekannter Anordnung von Proteinen muß dann nur noch die Verknüpfung der Bindungsspezifität des Bindemoleküls mit seiner „tag"-Sequenz bekannt sein. Diese Verknüpfung ist insbesondere durch DNA- Sequenzierung von durch Bindung selektierten Klonen einfach erhältlich. Der gesamte Herstellungsvorgang einer komplexen Mischung von typischerweise 20- 200000 verschiedenen Bindeproteinen erfordert dabei lediglich 2 Analyseschritte: die Überprüfung der Bindungsfähigkeit des Bindeproteins (1) und die Sequenzierng des „tags"
Der Schlüsselvorgang dabei ist die Kopplung von „tag" und Bindeprotein während der Synthese des Bindeproteins. Eine eindeutige Zuordnung bei einer solchen Kopplung wird dadurch gewährleistet, daß die Nukleinsäure, welche für das Bindeprotein codiert, an das fertige Bindeprotein gebunden wird, nachdem dieses fertig synthetisiert wurde. Ein solcher Vorgang ist z.B. in Form des Ribosomal Display (Roberts und Szostak, PNAS USA Vol 94, pp. 12297-12302, 1997) beschrieben - hier erzeugt ein Puromycin am 3 '-Ende der RNA eine kovalente Bindung zu dem von dieser RNA translatierten Polypeptid. Um störende Wechselwirkungen des für das Bindeprotin codierenden, langen Nukleinsäurestranges bei der später vorgesehen Hybridisierung der „tag"-Sequenz zu unterbinden, wird in einem weiteren Schritt eine Verkürzung der gekoppelten RNA durchgeführt, welche lediglich die „tag"-Sequenz und kurze flankierende Regionen, gekoppelt an das Polypeptid, übrig läßt.
Zur Herstellung des Proteinarrays nach Selektion og. Bindungsprotein-„tag"-Paare für die nachzuweisenden Liganden (8) wird eine komplexe Mischung von Bindungsprotein-„tag"-Komplexen (mit unterschiedlicher Bindungsspezifität) über einen nach Stand der Technik hergestellten Oligonukleotidarray überschichtet, dessen Oberfläche an definierten Stellen mit zu den in der Mischung von Bindungsprotein- „tag"-Komplexen komplementären Nukleotidsequenzen beschichtet ist. Durch Hybridisierung von „tag" und Gegenstrang wird eine ortsbekannte Kopplung der Bindeproteine an den Array erreicht.
Dieser Array kann dann zum Nachweis von Liganden (8) in einer Probe eingesetzt werden, insbesondere durch die Verwendung direkt (oder in mehreren Schritten indirekt) Fluoreszenz- oder Enzym-markierten Liganden, Plasmonresonanz oder anderen Detektionsverfahren nach Stand der Technik.
Der erfindungsgemäße Produktionsprozess eines Mikroarrays von Proteinen bietet signifikante Einsparungen gegenüber bestehenden Methoden, da er
- lediglich zwei Analyseschritte (Bindungsassay und Sequenzierung einer kurzen Nukleinsäuresequenz) zur Definition des Bindungsprotein-„tag"-Paares erfordert,
- in einem Schritt durch einfaches Inkubieren in einem Gemisch von Bindungsprotein-„tag"-Paaren hergestellt wird. - Zudem kann in einer Ausführungsvariante komplett in vitro durchgeführt werden (Selektion aus kombinatorischen Genbibliotheken)
Damit wird der bisher sehr aufwendige Weg zu hochkomplexen Protein- Arrays durch Vermeidung des bisher notwendingen sequenziellen Aufbringens der verschiedenen Bindungsproteine („spotten") deutlich vereinfacht.
Beispiel 1: Herstellung eines Proteomic-Microarrays
Mithilfe kombinatorischer Methoden nach Stand der Technik werden hochkomplexe (über 1010 verschiedene Sequenzen) Ribosomal-Display-Genbibliotheken von Fibronectin-Domänen- Analogen mit randomisierten Loop-Bereichen hergestellt. Solche Genbibliotheken werden z.B. von der Fa. Phylos, Lexington, Massachusetts, USA, hergestellt. In einem zweiten Klonierungsschritt werden einige Nukleotide in Leserichtung hinter dem Translations-Stopcodon des offenen Leserasters, welcher für die Fibronectin-Domänen- Analogen mit randomisierten Loop-Bereichen codiert, eine zweite randomisierte Region einkloniert. Diese wird durch Polymerase- Kettenreaktion mit einem in der mittleren Region randomisiert synthetisierten Oligonukleotid als Template und 2 Primern, welche an die beiden nichtrandomisierten Enden des Templates hybridisieren, hergestellt und mittels Restriktionsverdau einkloniert (eine andere Möglichkeit für die Herstellung mehrfach randomisierter Sequenzen ist in Hayashi et al., (1994, BioTechniques Vol.17, pp310-313) beschrieben). Die Länge der randomisierten Nukleotidsequenz ist dabei so gewählt, daß die entstehende theoretische Komplexität (Anzahl aller möglicher verschiedener Kobinationen dieser Nukleotide) größer ist als die der Genbibliothek von Bindeproteinen, die weiter vorne auf der Nukleinsäure codiert ist. Zwischen den beiden Genbibliotheken liegt eine Linker-Sequenz, welche später zum Abschneiden unnötiger RNA dient. Mit dem entstehenden DNA-Konstrukt (Fig. 3) wird ein Ribosomal-Display- Vorgang nach Stand der Technik (US Patent App. 6258558) durchgeführt und so viele verschiedene (typischerweise 20 - 500000) Binder gegen die unterschiedlichen Proteine einer Zelle hergestellt.
Im weiteren Verlauf wird die Bindungsaktivität der durch das Ribosomal Display selektierter Klone durch einen Bindungsassay (z.B. ELISA, Immunoblot, Plasmon- Resonanz- Analyse) festgestellt und die Nukleotid-Sequenz der dazugehörigen Nukleinsäure im Bereich der „tag"-Sequenz bestimmt. Da die theoretische Komplexität der „tag"-Sequenzen größer, im Idealfall mehrere Größenordnungen größer ist als die der Genbibliothek von Bindeproteine, ist gewährleistet, daß mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit jedes Bindeprotein ein individuelles „tag" besitzt. Die Sequenzinformation dieser Tags wird eingesetzt, Oligonukleotid- Arrays mit ihrem komplementären Strängen zu generieren, z.B. nach den bekannten Verfahren der Firmen Affymetrix, USA, oder Febit AG, Mannheim.
Aus den charakterisierten Klonen wird nun in einem zweiten, dem Ribosomal Display ähnlichen, diesmal aber präparativen Schritt das mit dem „tag" versehene Bindemolekül hergestellt. Im Detail werden dazu mit Puromycin verbundene mRNA- Moleküle hergestellt und eine in-vitro-Translation durchgeführt. Die erforderliche zellfreie Translation kann zur Erleicherung der Reinigung nach Shimizu et al., Nature Biotech Vol 19, p. 751-755, 2001) durchgeführt werden. Sie kann auch in einem Gemisch aller Bindemoleküle geschehen, was den enormen Aufwand einzelner Präparationen für jeden Klon einspart. Da die „tag"-Sequenz hinter dem Translations- Stopsignal liegt, wird automatisch ein „tag" an jedes Bindeprotein angehängt.
Um störende Wechselwirkungen des für das Bindeprotin codierenden, langen Nukleinsäurestranges bei der später vorgesehen Hybridisierung der „tag"-Sequenz zu unterbinden, wird nach Reinigung der „tag"-Bindeprotein-Komplexe aus der Translationsreaktionsmischung eine Verkürzung der gekoppelten RNA durchgeführt, welche lediglich die „tag"-Sequenz und kurze flankierende Regionen gekoppelt an das Polypeptid übrig läßt. Eine solche Verkürzung kann nach Stand der Technik auf verschiedene Weise erfolgen. Es kann ein kurzes (typischerweise 5-20nt langes) Oligonukleotid, welches komplementär zur Linker-Region (10) ist, an diese hybridisiert werden, nachdem die Selektion anhand der Bindung der Bindeproteine durchgeführt wurde. Dadurch wird diese kurze Region schneidbar durch bestimmte Nukleasen, insbesondere RnaseH (Fig. 4). Eine andere Möglichkeit, eine solche Verkürzung durchzuführen, ist die Verwendung von nukleaseresistenten Formen der RNA statt der für den Selektionsprozess für die Bindemoleküle; in diesem Falle würde die Nukleinsäurederivate, welche analog zur mRNA eingesetzt werden, so synthetisch hergestellt, daß die Linker-Region (10) aus nicht nukleaseresistenten Nukleotiden oder DNA besteht, während der Rest der Sequenz aus nukleaseresistenten Nukleotiden besteht (z.B. PNA oder Nukleinsäurestränge aus SP- Diastereomeren von Ribonucleosid-5'-O-(l-Thiotriphosphaten)) (Fig. 5).
Nach Verkürzung der Nukleinsäure wird das Gemisch aus Bindeprotein-„tag"- Komplexen einer säulenschromatographischen Reinigung auf einem Ionentauscher- Material unterzogen, um die abgespaltenen Sequenzen zu entfernen. Das so gereinigte Gemisch wird auf einen Array aufgetragen und bei 67°C für 24 Stunden inkubiert, sodaß sich die nichtkovalenten Bindungen zwischen „tag" und seiner Rezeptorsequenz ausbilden können. Der Array wird 5 mal mit PBS (137 M NaCl, 3 mM KC1, 8 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, pH 7.3) gewaschen, um nicht gebundene Bindemoleküle zu entfernen, und kann dann sofort für eine Bindereaktion zum
Nachweis von Liganden in einer Probe eingesetzt werden. Einen Überblick über den ganzen erfindungsgemäßen Weg zur Herstellung einem Proteomics-Chips gibt Fig. 6. Beispiel 2
Herstellung eines Antikörper- Arrays
Nach Stand der Technik wird ein Oligonukleotidarray hergestellt, auf welchem 10000 für eine optimale Bindung und minimale Keruzhybridieirung optimierte Oligonukleotide an bekannten Positionen aufgebracht wurden.
Eine Genbinbliothek von ScFv- Antikörperfragmenten im Phagendisplay-vektor pSEX81 wird auf den gewünschten Antigenen gescreent und die gewünschten Binder nach Stand der Technik Moniert (Welschof, et al., (1997) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 94, 1902-1907). Durch Umklonierung in den bakteriellen Expressionsvektor pSTE (Dübel et al., J. Immunol. Meth. 178, 201-209) werden Streptavidin-Fusionsproteine der selektierten Antikörperklone hergestellt. Der pSTE- Vektor wurde vor dem Einsetzten der Gene für die ScFv- Antikörperfragmente durch Insertion einer kurzen Nukleinsäureseuqnez hinter dem Stopcodon für das Streptavidin verändert, welche gewährleistet, daß später an dieser Stelle die translatierte RNA abgeschnitten wertden kann (s. Beispiel 1)) Die für die Antikörper-Streptravidin-Fusionsproteine codierenden DNA-Stücke werden inklusive dieser Linker-Sequenz aus E. coli- Plasmid-DNA-Präparation durch Restriktionsverdau gewonnen. Die ausgeschnittenen Genstücke, enthaltend die kodierende Sequenz für das Antikörper-Streptravidin- Fusionsprotein und die Linkersequenz, werden in einzelnen Ligation mit jeweils einer spezifischen Tag-Sequenz verbunden. Die dazu werdenderen doppelsträngigen Oligonukleotide wurden durch Hybridisierung von zwei komplementären synthetischen Oligonukleotiden hergestellt, wobei das entstehende Dopplestrang- Nukleinsäurestück an dem nicht zu ligierenden Ende mit einer Biotin-Gruppe derivatisiert ist. Die Ligationsprodukte werden durch Ethanolfällung gereinigt und konzentriert und dienen als Template in einer Ribosomen-Display-Reaktion nach Hanes und Plückthun (1997, Proc Natl Acad Sei U S A 13;94(10):4937-42). Während der dazugehörigen in vitro Translation koppelt das biotinylierte Ende der Nukleinsäure an das Antikörper-Streptravidin-Fusionsprotein, welches von diesem Ribosom hergestellt wurde, und bewirkt die Ausbildung des Bindemolekül-„tag"- Paares.
Die weitere Prozedur wird entsprechend Beispiel 1 durchgeführt.
Abbildungsbeschreibungen:
Fig. 1: Immobilisierung des Bindungsproteins (1) durch Hybridisierung des „tags" (4) mit einem Rezeptormolekül (z.B. einem Nukleinsäuregegenstrang) (5), welcher über ein Bindungselement (6) auf dem Array verankert ist.
Fig.: 2 Der Immobilisierung auf dem Array nachfolgende kovalente Verknüpfung (7) (2 verschiedene Möglichkeiten der Bindung sind angezeigt) mit diesem und darauffolgender Nachweis einer Probe (8) durch Bindung an das immobilisierte Bindungsprotein (1); die Bindung der Probe (8) erzeugt dabei ein detektierbares
Signal, z.B. Fluoreszenz, Änderung der Reflektionseigenschaften, der Leitfähigkeit, der Masse oder der Plasmonresonanzeigenschaften.
Fig. 3. mRNA-Strang mit genetischen und molekulare Elementen der Genbibliothek für das "Ribosomal Display". Dabei sind:
9 Genetische Bibliothek, codiert für Bindemoleküle
10 linker, der das Abschneiden ermöglicht
11 Genetische Bibliothek randomisierter Nukleotide ("tag"-Bibliothek) 12 Puromycin-Gruppe
13 nicht notwendigerweise sequenzidentische Spacersequenzen Fig. 4: Abspaltung nach der Selektion nicht mehr benötigter Nukleinsäuresequenzen durch Hybridisierung eines Oligonukleotides und nachfolgendem Nukleaseverdau.
14 Gegenstrang-Oligonukleotid zur Linker-Region (10)
Fig. 5: Abspaltung nach der Selektion nicht mehr benötigter Nukleinsäuresequenzen durch Einbau eines nicht nukleaseresistenten Nuklemsäurestückes und nachfolgendem Nukleaseverdau.
15 nicht nukleaseresistenten Nukleinsäurestück in der Linker-Region (10)
16 nukleaseresistente „tag"-Region 17 für das Bindeprotein (1) codierende Nukleinsäureregion
Fig. 6 Herstellung eines Protein-Arrays nach Beispiel 1

Claims

Ansprüche:
1. Trägergebundene Molekülanordnungen für die chemische, biochemische oder biomedizinische Analytik, dadurch gekennzeichnet, daß
a) das an einen Träger (2) zu bindende Bindungsmolekülolekül (1) über eine kovalente oder nichtkovalente Bindung (3) an ein „tag" (4) gebunden ist. Dieses wird von einem Rezeptormolekül (5) erkannt, welches seinerseits über eine kovalente oder nichtkovalente Bindung (6) an einen Träger (2) gebunden ist.
b) <§© diese Moleküle Arrays biologischer oder chemischer Substanzen bilden, dadurch gekennzeichnet, daß verschiedene Moleküle (1) an verschiedene „tags" (4) gebunden sind, wobei jeweils eine bestimmte typische Zusammensetzung des „tags" (4) für ein bestimmtes Molekül (1) gegeben ist und das „tag" somit eine
Identifikation (analog zu einem Namenschild oder einer Nummer) für das Molekül (1) darstellt. Der Array von verschiedenen Molekülen (1) an für jedes der verschiedenen Moleküle (1) definierten Positionen wird dann durch Mischen einer Molekülbibliothek bestehend aus Molekülkomplexen von Molekül (1) und „tag" (4), verbunden durch (3) und einem vorgefertigten Array auf einem Träger (2), auf dem die Rezeptormoleküle (5) durch Bindung (6) in definierter Anordnung aufgebracht sind, sich durch Bindung von „tag" (4) an Rezeptormolekül (5) ausbilden. c) && die Molekülkomplexe von Molekül (1) und „tag" (4), verbunden durch (3), während eines biochemischen Prozesses, insbesondere enzymatischer Reaktionen, Translation, Transkription, Polymerisation oder Replikation, hergestellt werden, sodaß eine Zuordnung eines bestimmten „Tags" (4) zu einem bestimmten Molekül
(1) erzeugt wird.
2. Trägergebundene Molekülanordnungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das „tag" (4) eine Nukleinsäure, oder ihr Derivat, insbesondere DNA, RNA oder ihren nukleaseresistenten Derivaten wie PNA oder thioRNA, enthält und das
Rezeptormolekül (5) einen dazu komplementären Gegenstrang einer Nukleinsäure, oder ihres Derivats, insbesondere DNA, RNA oder ihren nukleaseresistenten Derivaten wie PNA oder thioRNA, enthält,
3. Trägergebundene Molekülanordnungen nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Molekülkomplexe aus Molekül (1) und „tag" (4), verbunden durch (3), durch eine zusätziche Bindung (7), welche während oder nach der Ausbildung der Bindung zwischen „tag" (4) und Rezeptormolekül (5) erfolgt, zusätzlich auf dem Träger stabilisiert werden.
4. Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine oder mehrere zusammenhängenden Flächen mit Bindemolekülen beschichtet werden, wobei die einzelne mit Bindemolekülen beschichtete Fläche von nicht mit Bindemolekülen beschichtete Flächen umgeben ist und eine einzelne mit Bindemolekülen beschichtete Fläche jeweils weniger als 100 Mikrometer x 100 Mikrometer bedeckt, insbesondere weniger als 10 x 10 Mikrometer.
5. Trägergebundene Molekülanordnungen nach einem der Ansrprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß nachweisbare Probenmoleküle (8) mit der trägergebundenen Molekülanordnung in einer Weise in Kontakt gebracht werden, die einen nachfolgenden Nachweis gebundener Probenmoleküle (8) mithilfe optischer Verfahren ermöglicht, insbesondere durch resonante oder nichtresonante optische Effekte wie Spiegelung, Brechung, Plasmon-Resonanz, Streuung, Beugung, Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Lumineszenz, Änderung der Polimersisationsebene, Änderung der Absorption oder Transmission, Phasenverschiebung oder Quenching.
6. Trägergebundene Molekülanordnungen nach einem der Ansrprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß nachweisbare Probenmoleküle (8) mit der trägergebundenen Molekülanordnung in einer Weise in Kontakt gebracht werden, die einen nachfolgenden Nachweis gebundener Probenmoleküle (8) mithilfe elektromagnetischer Verfahren auslesbar ist, insbesondere durch magnetische Effekte, elektrostatische Effekte, Resonanzfrequenzänderung bei Massenänderung, Hall-Effekt oder Leitfähigkeits- Wiederstands- oder Kapazitätsänderungen.
7. Gerät zur Herstellung eines Trägers nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Schritte, aber nicht notwendigerweise alle Schritte, welche zur Bildung der Träger notwending sind, unter definierten Umgebungsbedingungen durchgeführt werden sowie vorzugsweise halbautomatisch oder automatisch durchgeführt werden.
8. Gerät zur Analyse von molekularen Bindungsreaktionen an einem Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis der Bindung von Probenmolekülen (8) mithilfe optischer Verfahren durchgeführt wird, insbesondere resonanter oder nichtresonanter optischer Effekte wie Spiegelung, Brechung, Plasmon-Resonanz, Streuung, Beugung, Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Lumineszenz, Änderung der Polimersisationsebene, Änerung der Absorption oder Transmission, Phasenverschiebung oder Quenching.
9. Gerät zur Analyse von molekularen Bindungsreaktionen an einem Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis der Bindung von Probenmolekülen (8) mithilfe elektromagnetischer Verfahren durchgeführt wird, insbesondere durch magnetische Effekte, elektrostatische Effekte, Resonanzfrequenzänderung bei Massenänderung, Hall-Effekt oder Leitfähigkeits- Wiederstands- oder Kapazitätsänderungen.
10. Gerät zur Analyse von molekularen Bindungsreaktionen an einem Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 4, insbesondere zur Anwendung in biochemischen Labors, in Labors von Arztpraxen und Krankenhäusern sowie in allen Bereichen des Umweltschutzes, der Qualitätskontrolle, der Biotechnologie, Forensik, Agrar- und Pflanzenhybridanalytik, sowei der molekularbiologischen, pharmazeutischen und medizinischen Forschung und Entwicklung.
11. Kit, enthaltend die wesenthchen Substanzen zur Durchführung einer oder mehrerer Analysen mit den in den Ansprüchen 1 bis 10 beschriebenen Trägern und Geräten.
12. Verfahren zu Herstellung trägergebundener Molekülanordnungen für die chemische, biochemische oder biomedizinische Analytik nach Fig. 6.
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