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WO1999036430A1 - Oligoliganden mit bindungsvermögen - Google Patents

Oligoliganden mit bindungsvermögen Download PDF

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WO1999036430A1
WO1999036430A1 PCT/EP1999/000120 EP9900120W WO9936430A1 WO 1999036430 A1 WO1999036430 A1 WO 1999036430A1 EP 9900120 W EP9900120 W EP 9900120W WO 9936430 A1 WO9936430 A1 WO 9936430A1
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WO
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ligands
oligo
building blocks
mono
oligoligands
Prior art date
Application number
PCT/EP1999/000120
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English (en)
French (fr)
Inventor
Alexander Gasch
Douglas Friday
Kornelia Berghof
Lutz MÜLLER-KUHRT
Original Assignee
BioteCon Gesellschaft für Biotechnologische Entwicklung und Consulting mbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BioteCon Gesellschaft für Biotechnologische Entwicklung und Consulting mbH filed Critical BioteCon Gesellschaft für Biotechnologische Entwicklung und Consulting mbH
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Priority to AU26163/99A priority patent/AU2616399A/en
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
    • C07K1/047—Simultaneous synthesis of different peptide species; Peptide libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1048—SELEX
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • the invention relates to a system which consists of molecular mono ligands which are produced by in vitro selection against small biological molecules (building blocks). These mono ligands are subsequently linked together to create combinatorial libraries of oligo ligands.
  • Such libraries can be used for the identification of affinity ligands for the purification of macromolecules and for the identification of novel, therapeutically or diagnostically usable substances.
  • the advantage of such libraries is that the macromolecule does not have to be present in pure form in order to produce or identify suitable oligo ligands with the desired affinity or activity. That's why it is possible to obtain ligands for almost any macromolecular target substance, even if this is unknown.
  • Building blocks or building block molecules are the individual molecular units (monosaccharides, amino acids, nucleotides, fatty acids) as well as those units in modified form (e.g. glycosylated, phosphorylated, acetylated, sulfonylated or methylated) from which larger biological molecules (hereinafter: macromolecules) are formed, for example Carbohydrates, proteins, glycoproteins, DNA / RNA / nucleic acids, fats. Building blocks can also be short oligomeric molecules, e.g. Dimers or trimers etc.
  • Monomers are individual building block molecules.
  • the products are oligomers when two (dimer), three (trimer) or more building block molecules are linked to one another by class-specific bonds (e.g. peptide bond with amino acids).
  • Oligomers are also molecules in which building block molecules of different classes are linked to one another (e.g. glycosylated peptide).
  • In vitro selection is a process by which molecules with certain properties can be isolated relatively quickly from a complex mixture. To do this, it must be possible to separate molecules with a desired property from other molecules without the desired property. Some methods for the in vitro selection of molecules with special properties are described.
  • a parent library is a mixture of ligands isolated by in vitro selection against a single building block molecule.
  • a parent library can consist of several ligands that show the desired activity, or in extreme cases a single ligand with high affinity or activity.
  • a macromolecule is a larger molecule that is derived from the above There are building blocks and usually have a biological function (e.g. enzyme, receptor, genetic information carrier, structural component, energy source).
  • An oligonucleotide can be characterized as being 10 to 250 and preferably 20 to 120 nucleotides in length.
  • an oligonucleotide according to the invention can be characterized in that it is single-stranded or has a complementary strand.
  • an oligonucleotide according to the invention can be characterized in that it is present i) as DNA or ii) as RNA or iii) as PNA, the oligonucleotide molecule optionally in one for analytical detection methods, in particular based on
  • Hybridization and / or amplification modified or labeled in a manner known per se.
  • an oligonucleotide according to the invention can be characterized in that it is a modified or labeled or additionally labeled nucleic acid molecule which, in a manner known per se for analytical detection methods, contains one or more radioactive groups, colored groups, fluorescent groups, groups for immobilization on solid Phase, groups for uptake in cells, groups for an indirect or direct reaction, in particular for an enzymatic reaction, preferably with the aid of antibodies, Antigens, enzymes and / or substances with affinity for enzymes or enzyme complexes, and / or other known modifying or modified groups of nucleic acid-like structure.
  • Aptamers are oligonucleotides selected in vitro which (due to their secondary structure) have a desired activity.
  • a mono ligand is a ligand that consists of a single molecule of a parent library and has affinity for a building block molecule.
  • a monoaptamer is a mono ligand that consists of an oligonucleotide molecule. Two or more mono ligands can be linked together by various methods to produce an oligo ligand. If the oligo ligand consists of aptamer molecules, it is an oligoaptamer. Methods for creating oligo ligands or oligoaptamers include:
  • oligoligands can be a spacer molecule between the individual mono ligands can be integrated. This can be a linear or branched chain of molecules which carries the corresponding groups at the ends in order to bind modified or unmodified ligands in covalent or non-covalent form. By varying the length or the flexibility of the spacer molecule, an additional variability in the properties of the oligo ligand can be achieved.
  • the properties of the parent libraries and the methods with which they are linked correspond to those of the combinatorics.
  • the use of small building blocks for in vitro selection creates libraries of mono ligands that can be combined with one another in any way to create oligo ligands with new specificities.
  • Affinity ligands can be used in several areas: as specific ligands in affinity chromatography, in binding studies and diagnostic tests or as therapeutic agents. Such ligands show high specificity to their respective target substance or group of
  • Widespread ligands are e.g. Cofactors, substrate analogs or (monoclonal) antibodies. The latter often recognize short sequences of amino acids on the protein surface (epitopes). This enables the use of oligopeptides as immunogens for the production of antibodies against proteins which contain the respective peptide sequence.
  • affinity ligands have only been available or can be produced for a limited number of target molecules, in particular for those target molecules which are either present in purified form or whose structure is at least partially known.
  • a universally applicable process with which Ligands against any macromolecule in principle can also be produced without these prerequisites is not yet known.
  • Oligomers or polymers are known from WO 95/17413. Such "functional elements" are more likely to be obtained by randomly or directionally linking structural domains of natural or functional polymers than by randomly combining all possible monomers
  • the object on which the invention is based is achieved by a process for the production of oligo ligands with binding capacity to macromolecules possibly unknown construction from building blocks, the method being characterized by: a) selection of ligands against a mono- or oligomeric building block, b) selection of ligands against a second mono- or oligomeric building block and optionally against a third to nth mono- or oligomeric building block, c) chemical or enzymatic linking of the selected ligands according to a) and b), in particular with the introduction of spacer molecules, d) screening of the oligoligands obtained for binding to one or more macromolecules (e) to which the oligoligands have binding capacity and e) isolation of the binding oligo ligand according to d) and optionally f) production of the binding oligo ligand according to e) by means of chemical or enzymatic synthesis or by means of cloning,
  • a further embodiment of the invention relates to a process for the preparation of oligo ligands with the desired biological activity, the process being characterized by: a) selection of ligands against a mono- or oligomeric building block, b) selection of ligands against a second mono- or oligomeric building block and optionally against a third to nth mono- or oligomeric building block, c) chemical or enzymatic linking of the selected ligands according to a) and b), in particular with the introduction of spacer molecules, d) screening of the oligoligands obtained for desired biological activity, such as stimulation or inhibition of cell division or inhibition of an enzymatic activity, and e) isolation of the oligoligand (s) with the desired biological activity and optionally f) production of the binding oligoligand (s) according to e) by means of chemical or enzymatic synthesis or by means of cloning.
  • the linked ligands can be RNA oligonucleotides or single-stranded DNA oligonucleotides, and the ligands can be obtained by SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). Furthermore, the ligands can be peptides which have been obtained, for example, by a) chemical synthesis and b) expression on the surface of phages (phage display) or on the surface of bacteria.
  • Building blocks can be amino acids, dipeptides, tripeptides, monosaccharides, disaccharides, trisaccharides, mononucleotides, dinucleotides, trinucleotides or fatty acid molecules.
  • a further embodiment of the invention relates to oligo ligands which can be obtained by a process according to the invention.
  • a further embodiment of the invention relates to oligo ligands which are identified, ie screened and isolated, by a method according to the invention and subsequently produced in large amounts, in particular by a) chemical synthesis, b) in vitro transcription by means of purified RNA polymerases, c) in vitro amplification, in particular by means of PCR, LCR and / or 3SR, and / or d) cloning, in particular in E. coli.
  • Oligoligands according to the invention can be characterized in that they are modified or labeled or additionally modified or labeled nucleic acid molecules or peptide molecules which, in a manner known per se for analytical detection methods, involve one or more radioactive groups, colored groups, fluorescent groups, groups for immobilization solid phase, groups for the uptake into cells, groups for an indirect or direct reaction, in particular for an enzymatic reaction, preferably for a reaction with the aid of antibodies, antigens, enzymes and / or substances with affinity for enzymes or enzyme complexes, and / or have otherwise known modifying or modified groups nucleic acid-like structure.
  • All or part of the oligo ligands according to the invention can consist of PNA.
  • the oligo ligands according to the invention can be protected against nuclease degradation, in particular by incorporating modified nucleotides which are modified in particular by 2'-amino, 2'-fluoro- or 2'-O-methyl groups.
  • Oligoligands according to the invention can consist wholly or partly of L-RNA or L-DNA.
  • one embodiment relates to the use of one or more oligoligands according to the invention for the detection of macromolecules of unknown structure from building blocks, the oligoligands and macromolecules being incubated and oligoligands bound after washing steps being detected.
  • the macromolecules can be extracted in cell extracts or in tissue sections
  • one embodiment relates to the use of oligo ligands according to the invention for therapeutic purposes.
  • a further embodiment relates to the therapeutic use of oligo ligands according to the invention with antibacterial, antiviral or cytostatic activity.
  • one embodiment relates to the therapeutic use of oligo ligands according to the invention by introduction into infected cells, tissues or organisms for combating infections or tumors.
  • Target substance selected selected. After suitable washing steps, bound molecules are eluted and duplicated. This is done by means of PCR (polymerase chain reaction) in the case of DNA ligands or RT-PCR (reverse transcriptase - PCR) in the case of RNA ligands.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR reverse transcriptase - PCR
  • flanking regions can contain a promoter to be transformed by in vitro transcription with e.g. bacterial or viral RNA polymerases to enable translation into single-stranded RNA.
  • the amplified double-stranded DNA e.g. can be converted into single-stranded DNA (ssDNA) by asymmetric PCR or by immobilization of a strand and subsequent denaturation. After several rounds of selection and amplification under conditions of increasing stringency, those oligonucleotides dominate in the mixture which have a high affinity for the target substance or a desired activity. Through additional "counter selection" with undesired target molecules e.g.
  • sequences can be removed which have undesirable affinity for these groups / target molecules.
  • Individual aptamers can finally be isolated and characterized by cloning.
  • Oligonucleotide ligands in biological fluids is that in some cases (eg in blood) they are broken down very quickly by nucleases.
  • nucleases for the use of oligonucleotide ligands in liquids containing nucleases, it is therefore advantageous if they are protected against nuclease degradation. This can be achieved by integrating chemically modified nucleotides (e.g. with 2'-amino, 2'-fluoro- or 2'-O-methyl groups) (Jellinek, D; 1995; Eaton, B & Picken, W; 1995 ).
  • Synthetic peptide libraries Oligopeptides with a length of approximately 6-7 amino acids are synthesized by "split synthesis" (Furka, A., Sebestyen, F., Asgedum, M. & Dibo, G; 1988 ). The synthesis is started with, for example, 20 parallel batches, each of these batches starting with a different amino acid. Each of these synthesis approaches is in turn in z. B. 20 synthesis approaches and the synthesis continued with a different one of the 20 amino acids. This is repeated until the desired length (X) is reached.
  • Such a library consists of 20 x peptide sequences.
  • the peptides can either be on a matrix (eg beads) or in a solution
  • Affinity or activity are screened and active peptides are identified by peptide sequencing.
  • SPLC Synthetic Peptide Combinatorial Library
  • SPLC synthetic Peptide Combinatorial Library
  • a library of peptides with a length of approximately 6-7 amino acids is synthesized, the sequence of the first two amino acids being defined.
  • 400 separate peptide mixtures - each with a different dipeptide sequence at the NH 2 terminus - are screened for an affinity or activity.
  • the peptide mixtures which show the highest activities are now varied at the position of the third amino acid, the remaining amino acids again not being determined.
  • the present invention thus relates to combinatorial libraries of oligomeric molecules which have an affinity for one or more target substance (s) or a desired biological, biochemical or chemical activity.
  • monoligands against building block molecules eg monosaccharides, amino acids, nucleotides and short oligomers
  • building block molecules eg monosaccharides, amino acids, nucleotides and short oligomers
  • Two or more of the individual selected mono ligands are subsequently linked together to create new specificity or activity.
  • the oligo ligands are finally tested for the new specificity or activity, for example as follows:
  • building block molecules eg monosaccharides, glycosylated amino acids, nucleotides and short oligomers
  • Suitable spacer molecule are, for example, activated Sepharose beads or the wells of a microtiter plate (MTP).
  • MTP microtiter plate
  • the building blocks are bound by their chemical groups, for example -OH, -NH 2 , -COOH and / or -P0 3 , so that, for example, the side chains of amino acids or the bases of nucleotides are accessible to the potential ligands.
  • Ligands are made from a mixture of degenerate single-stranded oligonucleotides (SELEX) or from a mixture of the peptides expressed on the surface of phages (phage display) or from a mixture of synthetically produced peptides ("Synthetic Peptide Combinatorial Library”) with the immobilized building blocks in vi tro selected.
  • SELEX degenerate single-stranded oligonucleotides
  • phage display a mixture of the peptides expressed on the surface of phages
  • Synthetic Peptide Combinatorial Library synthetically produced peptides
  • An optional intermediate step consists in checking which of the ligands against building blocks already have significant affinity for the respective target macromolecule and / or have a desired activity.
  • the test can be carried out, for example, in an MTP or on a membrane: if the macromolecule is present in pure form, it is immobilized, for example, in the wells of an MTP or as a spot on a membrane.
  • Monoligands which are provided with a suitable label such as, for example, radioactive, colored, fluorescent groups or groups which directly or indirectly allow enzymatic detection
  • a suitable label such as, for example, radioactive, colored, fluorescent groups or groups which directly or indirectly allow enzymatic detection
  • the extract can first be separated in an SDS polyacrylamide gel and blotted onto a membrane. Incubation and detection then take place as above. Two or more of the above mono ligands are linked together.
  • the classes of mono ligands that bind the respective macromolecules are used (eg ligands against amino acids for proteins or polypeptides as macromolecules).
  • mono ligands against building blocks of different classes eg oligoligands against, for example, modified proteins can be created (for example against myristoylated, glycosylated or proteins complexed or covalently linked with nucleic acids).
  • the linkage could take place according to one of the following methods: a) Cloning (in the case of aptamers): the DNA product of aptamer 1 contains an interface for restriction enzyme 1 (eg Barn HI) in the region of one of the two flanking primer binding sites and an interface for restriction enzyme 2 (eg Hind III) in the region of the other flanking primer binding sites.
  • Aptamer 2 also contains an interface for restriction enzyme 2 (eg Hind III) in one flanking region and an interface for restriction enzyme 3 (eg Eco RI) in the other flanking region.
  • the aptamers are then fused to one another at the interface for restriction enzyme 2 using methods familiar to the skilled worker (J. Sambrook, EF Fritsch, T. Maniatis, 1989) and ligated into a plasmid vector. Large amounts of the diaptamer can then be obtained by multiplying the plasmid in, for example, Escherichia coli, cleaving with suitable restriction enzymes and
  • This chemical coupling has the advantage that mono ligands can also be linked to one another via non-class-specific bonds, and that at the same time an immense
  • the oligo ligands are then linked to the binding to target substances or to activity e.g. tested in the form of a microtiter plate test.
  • Individual oligo ligands are e.g. each immobilized in a well of a microtiter plate (e.g. using biotin / streptavidin) and incubated with a mixture of macromolecules (e.g. a cell extract).
  • the bound target molecule is detected by a specific activity test.
  • a prerequisite for such an approach is that a suitable test must exist with which the macromolecule sought can be detected.
  • Such a test can be used to identify oligo ligands which are e.g. are suitable as ligands for the affinity chromatography purification of a target macromolecule.
  • the binding or inhibition of at least partially purified target macromolecules can also be investigated directly.
  • a target macromolecule immobilized on a solid phase e.g. a target macromolecule immobilized on a solid phase and those
  • Oligoligands detected (eg via introduced groups, see Section 2), which show the highest affinity for the target macromolecule or exert the greatest inhibitory effect on the target macromolecule.
  • one or more oligo ligands can also be examined for their modulating properties of biological processes by means of an in vivo system.
  • B. A population of different oligo ligands can be systematically examined for suitable cytostatic and antibacterial properties using suitable test systems. Oligoligands with weak activity in such a test system could use the ones described above Strategies are combined until an oligoligand with sufficient activity / specificity is found.
  • monomeric building blocks of macromolecules are used for the in vitro selection of ligands, e.g. Amino acids, monosaccharides, nucleotides or short oligomers (e.g. dimers, trimers etc.), as well as such monomeric building blocks in modified form (e.g. glycosylated, sulfonylated, acetylated amino acids, phosphorylated sugars, methylated nucleotides).
  • ligands e.g. Amino acids, monosaccharides, nucleotides or short oligomers (e.g. dimers, trimers etc.)
  • modified form e.g. glycosylated, sulfonylated, acetylated amino acids, phosphorylated sugars, methylated nucleotides.
  • Ligand libraries are related to the size of the target molecule. For example, there are 20 natural amino acids but already 400 (20 2 ) dipeptides. So, for example, if the goal is an extensive collection of protein binding ligands of different specificity, the preferred one should
  • nuclease-resistant oligonucleotides by incorporating modified nucleotides (for example nucleotides which are chemically modified at the 2 V or 5 position) are described in patent application US08 / 117,991 with the title "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides ".
  • Patent US5637459 and patent application WO96 / 04403, both entitled “Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chimeric SELEX”, describe methods in which oligonucleotide molecules from two or more parent libraries are mixed against known target molecules and linked together to form a new one To produce library.
  • the chimeric molecules of these libraries simultaneously bind either two epitopes of one target molecule or two epitopes in different target molecules.
  • the present invention differs from these as follows:
  • the individual ligands produced by SELEX or by other methods are selected by selection on building blocks of macromolecules. Such ligands bind extremely non-specifically to the respective macromolecules and
  • Binding sites cannot be called "epitopes”.
  • the present invention describes a new technique for identifying high affinity molecules.
  • the greatest advantage is that ligands can be produced for any or almost any macromolecular target substance, even if this target substance has not been characterized so far or is not in pure form.
  • the likelihood of finding ligands with affinity for the respective macromolecule class is significantly increased. This is particularly important when looking for substances with a biological activity in biological tests, since the probability of finding substances with the desired properties is greatly increased.
  • target molecules are: amino acids and modified (e.g. glycosylated, phosphorylated) amino acids (e.g. tyrosine, phosphotyrosine, glucothreonine), sugar (glucose, ribulose phosphate), nucleotides (e.g. thymine, GTP, methyl-GTP) and oligomers such building blocks.
  • the monomeric or oligomeric building blocks are immobilized on a gel matrix (eg Sepharose) and placed in a column.
  • binding buffer for example 10mM Hepes, 150mM NaCl, 5mM KC1, 5mM CaCl 2 ImM MgCl 2 , pH 7.2
  • binding buffer for example 10mM Hepes, 150mM NaCl, 5mM KC1, 5mM CaCl 2 ImM MgCl 2 , pH 7.2
  • the bound oligonucleotides are (for example with free target substance) eluted.
  • the oligonucleotides are RNA molecules, they are converted into cDNA using reverse transcriptase.
  • the eluted ssDNA or cDNA is amplified by PCR and the dsDNA product is converted to either ssDNA or RNA. The process is repeated until an affinity of Kd ⁇ 10 ⁇ 4 M is reached.
  • Example 2 Creation of ligands of higher A inity / specificity by linking two or more mono ligands against monomeric or oligomeric building blocks
  • aptamers against monomeric or oligomeric amino acids are linked to one another by ligation in a plasmid vector.
  • the DNA product of Aptamer 1 contains an interface for restriction enzyme 1 (eg barn HI) in the region of one of the two flanking primer binding sites and an interface for restriction enzyme 2 (eg Hind III) in the region of the other flanking primer binding site.
  • Aptamer 2 also contains an interface for restriction enzyme 2 (eg Hind III) in one flanking region and an interface for restriction enzyme 3 (eg Eco RI) in the other flanking region.
  • the aptamers are then fused to one another at the interface for restriction enzyme 2 using methods familiar to the person skilled in the art and ligated into a plasmid vector. Large amounts of the diaptamer can then be obtained by cleaving the plasmid and denaturing the inserted DNA.
  • the mono- or oligo ligands are then checked for binding to proteins in the form of a microtiter plate test. Individual mono- or oligo ligands are immobilized in a well of a microtiter plate (eg using biotin / streptavidin) and incubated with a mixture of macromolecules (eg a cell extract). The bound target molecule is detected by a specific activity test. In this way, different mono- or oligoaptamers can be identified which have high affinity for the respective target protein.
  • Example 3 Mono- or oligo ligands as ligands for affinity chromatography.
  • Mono- or oligo ligands are immobilized on a matrix and used for affinity chromatography.
  • the macromolecules are purified sequentially.
  • a partially cleaned or unpurified mixture of substances e.g. a cell extract
  • Bound macromolecules eg proteins
  • Example 4 Diagnostic applications: Specific detection from a subset of phosphorylated proteins. Molecules from a parent library of ligands against phosphotyrosine are linked to those from a parent library of ligands against other mono- or oligomeric amino acids. These diligands are e.g. contacted with a cell extract. The presence of the target molecule can be detected by labeling (e.g. direct or indirect labeling with e.g. alkaline phosphatase) the di- or oligo ligand. aD The sample e.g. a cell extract is in an SDS
  • Combinatorial oligo ligands are isolated that have an affinity for a protein that has a role in tumor development.
  • In vitro screening of the combinatorial ligand library isolates molecules that bind to the target protein and possibly also inhibit it. In this way, identified oligo ligands could be used to combat tumors. These can be receptors or tumor antigens (e.g. HER 2), intracellular proteins (e.g. telomerase, protein kinases), secreted proteins (e.g. matrix metalloproteinases, angiogenic factors), which play an essential role in tumor growth or in the development of metastases play. Binding of the di- or oligo ligands inhibits tumor cell proliferation or metastasis.
  • the suitable di- or oligo ligands are obtained by screening combinatorial libraries in in vitro assays, for example in a proliferation assay with tumor cells or in an enzyme assay (protease, telomerase, protein kinase).
  • Example 6 Antibiotic tests on bacterial cells (growth inhibition) or viruses. Di- or oligo ligands are also used to combat bacterial and viral infections. The Di or
  • Oligo ligands bind to surface antigens of bacteria or
  • Viruses and thus block the growth of microorganisms or the binding to host cells. Viruses bind to specific receptors and have suitable proteins for them.
  • Blocking these proteins can prevent the infection.
  • Combinatorial binding assays are used for screening
  • Oligo ligands identified. These molecules can then be used to neutralize the microorganisms. Other di or oligo ligands can be screened by screening libraries in

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Oligoliganden mit Bindungsvermögen an Makromoleküle gegebenenfalls unbekannten Aufbaus aus Bausteinen, gekennzeichent durch: a) Selektion von Liganden gegen einen mono- oder oligomeren Baustein; b) Selektion von Liganden gegen einen zweiten mono- oder oligomeren Baustein und optional gegen einen dritten bis nten mono- oder oligomeren Baustein; c) Chemische oder enzymatische Verknüpfung der selektionierten Liganden nach a) und b), insbesondere unter Einführung von Spacer-Molekülen; d) Screening der gewonnenen Oligoligander auf Bindung an ein oder mehrere Makromolekül(e), gegenüber denen die Oligoliganden Bindungsvermögen besitzen sollen; und e) Isolation des (der) bindenden Oligoliganden nach d) und gegebenenfalls f) Herstellung des (der) bindenden Oligoliganden nach e) mittels chemischer oder enzymatischer Synthese bzw. mittels Klonierung, wobei das oder die Makromoleküle bei den Stufen a) bis c) nicht zugegen sind.

Description

Oligoliganden mit Bindungsvermögen etc.
Gegenstand der Erfindung ist ein System, das aus molekularen Monoliganden besteht, die durch in vitro Selektion gegen kleine biologische Moleküle (Bausteine) hergestellt werden. Diese Monoliganden werden nachfolgend miteinander verknüpft, um kombinatorische Bibliotheken von Oligoliganden zu schaffen. Solche Bibliotheken können für die Identifizierung von Affinitätsliganden zur Aufreinigung von Makromolekülen sowie für die Identifizierung von neuartigen, therapeutisch oder diagnostisch einsetzbaren Substanzen verwendet werden. Der Vorteil solcher Bibliotheken besteht darin, daß das Makromolekül nicht in reiner Form vorhanden sein muß, um geeignete Oligoliganden mit gewünschter Affinität oder Aktivität herzustellen bzw. zu identifizieren. Deshalb ist es möglich, Liganden zu fast jeder makromolekularen Zielsubstanz zu erhalten, auch wenn diese unbekannt ist.
Definitionen In der vorliegenden Patentanmeldung und insbesondere für die im folgenden beschriebene Erfindung werden die folgenden Begriffe durchgehend verwendet wie hier beschrieben:
Bausteine oder Bausteinmoleküle sind die einzelnen molekularen Einheiten (Monosaccharide, Aminosäuren, Nucleotide, Fettsäuren) sowie solche Einheiten in modifizierter Form (z.B. glykosyliert, phosphoryliert , acetyliert, sulfonyliert oder methyliert) , aus denen größere biologische Moleküle (nachstehend: Makromoleküle) gebildet werden, beispielsweise Kohlenhydrate, Proteine, Glykoproteine, DNA/RNA/Nucleinsäuren, Fette. Bausteine können auch kurze oligomere Moleküle sein, wie z.B. Dimere oder Trimere etc.
Monomere sind einzelne Bausteinmoleküle. Oligomere sind die Produkte, wenn zwei (Dimer) , drei (Trimer) oder mehrere Bausteinmoleküle durch klassenspezifische Bindungen (z.B Peptidbindung bei Aminosäuren) miteinander verknüpft werden. Oligomere sind auch Moleküle, bei denen Bausteinmoleküle verschiedener Klassen miteinander verknüpft sind (z.B. glykosyliertes Peptid) .
In vitro Selektion ist ein Prozeß, durch den aus einer komplexen Mischung Moleküle mit bestimmten Eigenschaften relativ schnell isoliert werden können. Dazu muß es möglich sein, Moleküle mit einer erwünschten Eigenschaft von anderen Molekülen ohne die erwünschte Eigenschaft zu trennen. Einige Methoden für die in vitro Selektion von Molekülen mit besonderen Eigenschaften sind beschrieben.
Eine Parent-Library ist eine Mischung von Liganden isoliert durch in vi tro Selektion gegen ein einzelnes Bausteinmolekül.
Eine Parent-Library kann aus mehreren Liganden bestehen, die die gewünschte Aktivität zeigen, oder im Extremfall aus einem einzelnen Liganden mit hoher Affinität oder Aktivität. Ein Makromolekül ist ein größeres Molekül, das aus den o.g. Bausteinen besteht und in der Regel eine biologische Funktion hat (z.B. Enzym, Receptor, Erbinformationsträger, strukturelle Komponente, Energiequelle) .
Ein Oligonucleotid kann dadurch gekennzeichnet sein, daß es 10 bis 250 und vorzugsweise 20 bis 120 Nucleotide lang ist.
Ferner kann ein erfindungsgemäßes Oligonucleotid dadurch gekennzeichnet sein, daß es einzelsträngig ist oder einen komplementären Strang aufweist.
Ferner kann ein erfindungsgemäßes Oligonucleotid dadurch gekennzeichnet sein, daß es i) als DNA oder ii) als RNA oder iii) als PNA vorliegt, wobei das Oligonucleotidmolekul gegebenfalls in einer für analytische Nachweisverfahren, insbesondere auf Basis von
Hybridisierung und/oder Amplifizierung, in an sich bekannter Weise modifiziert oder markiert ist.
Ferner kann ein erfindungsgemäßes Oligonucleotid dadurch gekennzeichnet sein, daß es sich um ein modifiziertes oder markiertes oder zusätzlich markiertes Nucleinsäuremolekul handelt, das in einer für analytische Nachweisverfahren an sich bekannten Weise eine oder mehrere radioaktive Gruppen, farbige Gruppen, fluoreszierende Gruppen, Gruppen zur Immobilisierung an fester Phase, Gruppen für die Aufnahme in Zellen, Gruppen für eine indirekte oder direkte Reaktion, insbesondere für eine enzymatische Reaktion, vorzugsweise mit Hilfe von Antikörpern, Antigenen, Enzymen und/oder Substanzen mit Affinität zu Enzymen oder Enzymkomplexen, und/oder anderweitige an sich bekannte modifizierende oder modifizierte Gruppen nucleinsäureähnlichen Aufbaus aufweist. Aptamere sind in vitro selektionierte Oligonucleotide, die (aufgrund ihrer Sekundärstruktur) eine gewünschte Aktivität aufweisen. Diese Aktivität kann z.B. die Affinität zu einem Zielmolekül, die Inhibition eines Enzyms oder aber enzymatische Aktivität sein. Ein Monoligand ist ein Ligand, der aus einem einzelnen Molekül einer Parent-Library besteht und Affinität zu einem Bausteinmolekül aufweist. Ein Monoaptamer ist ein Monoligand, der aus einem Oligonucleotidmolekül besteht. Zwei oder mehrere Monoliganden können durch verschiedene Methoden miteinander verknüpft werden, um einen Oligoliganden zu produzieren. Falls der Oligoligand aus Aptamer-Molekülen besteht, handelt es sich um ein Oligoaptamer . Methoden für die Schaffung von Oligoliganden bzw. Oligoaptameren sind z.B.:
1) der Einbau komplementärer Basen am 5' Ende eines Aptameres und am 3 ' Ende des anderen Aptameres, welche eine Hybridisierung der beiden Aptamere erlauben,
2) der Einbau von Schnittstellen für Restriktionsenzyme, die komplementäre Enden produzieren, wodurch die Ligation der doppelsträngigen Aptamere nach Restriktionsspaltung möglich ist,
3) der Einbau von chemischen Gruppen an den Enden der Monoliganden, welche eine direkte oder indirekte Verknüpfung der Monoliganden erlauben, und
4) eine direkte Fusion während der Synthese der Monoliganden. Um einen bestimmten Abstand zwischen den Domänen eines
Oligoliganden zu erreichen, kann ein Spacer-Molekül zwischen die einzelnen Monoliganden integriert werden. Dies kann eine lineare oder verzweigte Kette von Molekülen sein, welche die entsprechenden Gruppen an den Enden trägt, um modifizierte oder unmodifizierte Liganden in kovalenter oder nicht kovalenter Form zu binden. Durch eine Variation der Länge oder der Flexibilität des Spacer-Moleküls kann eine zusätzliche Variabilität der Eigenschaften des Oligoliganden erreicht werden.
Die Eigenschaften der Parent-Libraries und der Methoden, mit denen diese miteinander verknüpft werden, entsprechen denen der Kombinatorik. Durch die Anwendung kleiner Bausteine für in vitro Selektion entstehen Bibliotheken von Monoliganden, die beliebig miteinander kombiniert werden können, um Oligoliganden mit neuen Spezifitäten zu schaffen.
Hintergrund
Affinitätsliganden sind in mehreren Bereichen einsetzbar: als spezifische Liganden bei der Affinitätschromatographie, bei Bindungsstudien sowie diagnostischen Tests oder als therapeutische Wirkstoffe. Solche Liganden zeigen hohe Spezifität zu ihrer jeweiligen Zielsubstanz oder Gruppe von
Zielsubstanzen. Weit verbreitete Liganden sind z.B. Cofaktoren, Substratanaloga oder (monoklonale) Antikörper. Letztere erkennen häufig kurze Sequenzen von Aminosäuren an der Proteinoberfläche (Epitope) . Dies ermöglicht die Verwendung von Oligopeptiden als Immunogene für die Herstellung von Antikörpern gegen Proteine, welche die jeweilige Peptidsequenz enthalten.
Affinitätsliganden sind jedoch bisher nur für eine begrenzte Anzahl von Zielmolekülen verfügbar bzw. herstellbar, insbesondere für solche Zielmoleküle, die entweder in gereinigter Form vorliegen oder deren Aufbau zumindest partiell bekannt ist. Ein universell einsetzbares Verfahren, mit dem Liganden gegen prinzipiell jedes Makromolekül auch ohne diese Voraussetzungen hergestellt werden können, ist bisher nicht bekannt.
Aus WO 95/34575 AI ist ein Verfahren zur Herstellung von oligomeren Substanzen mit hoher Affinität an Makromoleküle bekannt. Durch schrittweise Optimierung jeder Position des Oligomers wird die Sequenz sukzessive aus Sätzen von Oligomer- bibliotheken identifiziert. Zur Anwendung diese Verfahrens ist es jedoch erforderlich, daß das Makromolekül anwesend ist. Ein anderes Verfahren zur Herstellung von funktionalen
Oligomeren oder Polymeren ist aus WO 95/17413 bekannt. Solche "Funktionselemente" sind durch zufällige oder gerichtete Verknüpfung von strukturellen Domänen natürlicher bzw. funktionaler Polymere mit höherer Wahrscheinlichkeit zu erhalten als durch zufällige Kombination aller möglichen monomeren
Bausteine. Jedoch eröffnet dieses Verfahren keinen universellen Weg zur Herstellung von Liganden für beliebige Makromoleküle.
Aus US-A-5 637 459 bzw. WO-A-96/04403 ist es bekannt, Liganden gegen ein erstes und ein zweites Zielmolekül oder Liganden gegen verschiedene Epitope desselben Zielmoleküls jeweils in Gegenwart der Zielmoleküle zu selektionieren und anschließend zu verknüpfen. Ferner ist aus Science, 278 (1997) 497-499 bekannt, Liganden mit Affinität für Epitope desselben Zielmoleküls zu selektionieren und miteinander zu verknüpfen. Auch diese Verfahren bedürfen der Anwesenheit des (der) Zielmoleküls (e) zur Herstellung von Affinitätsliganden.
Beschreibung der Erfindung
Gemäß einer Ausführungsform wird die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe durch ein Verfahren zur Herstellung von Oligoliganden mit Bindungsvermögen an Makromoleküle gegebenenfalls unbekannten Aufbaus aus Bausteinen gelöst, wobei das Verfahren gekennzeichnet ist durch: a) Selektion von Liganden gegen einen mono- oder oligomeren Baustein, b) Selektion von Liganden gegen einen zweiten mono- oder oligomeren Baustein und optional gegen einen dritten bis nten mono- oder oligomeren Baustein, c) chemische oder enzymatische Verknüpfung der selektionierten Liganden nach a) und b) , insbesondere unter Einführung von Spacer-Molekülen, d) Screening der gewonnenen Oligoliganden auf Bindung an ein oder mehrere Makromolekül (e) , gegenüber denen die Oligoliganden Bindungsvermögen besitzen sollen, und e) Isolation des (der) bindenden Oligoliganden nach d) und gegebenenfalls f) Herstellung des (der) bindenden Oligoliganden nach e) mittels chemischer oder enzymatischer Synthese bzw. mittels Klonierung,
wobei das oder die Makromoleküle bei den Stufen a) bis c) nicht zugegen sind.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Oligoliganden mit gewünschter biologischer Aktivität, wobei das Verfahren gekennzeichnet ist durch: a) Selektion von Liganden gegen einen mono- oder oligomeren Baustein, b) Selektion von Liganden gegen einen zweiten mono- oder oligomeren Baustein und optional gegen einen dritten bis nten mono- oder oligomeren Baustein, c) chemische oder enzymatische Verknüpfung der selektionierten Liganden nach a) und b) , insbesondere unter Einführung von Spacer-Molekülen, d) Screening der gewonnenen Oligoliganden auf gewünschte biologische Aktivität, wie Stimulation oder Inhibition von Zellteilung oder Inhibition einer enzymatischen Aktivität, und e) Isolation des (der) Oligoliganden mit gewünschter biologischer Aktivität und gegebenenfalls f) Herstellung des (der) bindenden Oligoliganden nach e) mittels chemischer oder enzymatischer Synthese bzw. mittels Klonierung.
Bei den verknüpften Liganden kann es sich um RNA-Oligonucleotide oder einzelsträngige DNA-Oligonucleotide handeln, wobei die Liganden durch SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) gewonnen sein können. Ferner kann es sich bei den Liganden um Peptide handeln, die beispielsweise durch a) chemische Synthese und b) Expression auf der Oberfläche von Phagen (Phage Display) oder auf der Oberfläche von Bakterien gewonnen worden sind.
Bei Bausteinen kann es sich um Aminosäuren, Dipeptide, Tripeptide, Monosaccharide, Disaccharide, Trisaccharide, Mononucleotide, Dinucleotide, Trinucleotide oder Fettsäuremoleküle handeln.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft Oligoliganden, die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren gewinnbar sind.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft Oligoliganden, die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert, d.h. gescreent und isoliert, und nachfolgend in größerer Menge hergestellt werden, insbesondere durch a) chemische Synthese, b) in vi tro Transkription mittels gereinigter RNA-Polymerasen, c) in vi tro Amplifikation, insbesondere mittels PCR, LCR und/oder 3SR, und/oder d) Klonierung, insbesondere in E. coli.
Erfindungsgemäße Oligoliganden können dadurch gekennzeichnet sein, daß es sich um modifizierte oder markierte oder zusätzlich modifizierte oder markierte Nucleinsäuremoleküle oder Peptidmoleküle handelt, die in einer für analytische Nachweisverfahren an sich bekannten Weise eine oder mehrere radioaktive Gruppen, farbige Gruppen, fluoreszierende Gruppen, Gruppen zur Immobilisierung an fester Phase, Gruppen für die Aufnahme in Zellen, Gruppen für eine indirekte oder direkte Reaktion, insbesondere für eine enzymatische Reaktion, vorzugsweise für eine Reaktion mit Hilfe von Antikörpern, Antigenen, Enzymen und/oder Substanzen mit Affinität zu Enzymen oder Enzymkomplexen, und/oder anderweitige an sich bekannte modifizierende oder modifizierte Gruppen nucleinsäureähnlichen Aufbaus aufweisen.
Die erfindungsgemäßen Oligoliganden können ganz oder teilweise aus PNA bestehen. Die erfindungsgemäßen Oligoliganden können vor Nucleaseabbau geschützt sein, insbesondere durch Einbau von modifizierten Nucleotiden, die insbesondere durch 2'-Amino-, 2'- Fluoro- oder 2 ' -O-Methylgruppen modifiziert sind.
Erfindungsgemäße Oligoliganden können ganz oder teilweise aus L- RNA oder L-DNA bestehen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung von einem oder mehreren erfindungsgemäßen
Oligoliganden bei der Affinitätschromatographie mit den
Schritten: a) Immobilisierung der Oligoliganden an einer Gelmatrix, b) Kontakt einer Substanzmischung mit den immobilisierten Oligoliganden, c) Entfernen unspezifisch gebundener Substanzen und d) Elution der gebundenen Substanzen.
Ferner betrifft eine Ausführungsform die Verwendung von einem oder mehreren erfindungsgemäßen Oligoliganden zum Nachweis von Makromolekülen unbekannten Aufbaus aus Bausteinen, wobei man die Oligoliganden und Makromoleküle inkubiert und nach Waschschritten gebundene Oligoliganden detektiert. Dabei kann man die Makromoleküle in Zellextrakten oder in Gewebeschnitten
(in vitro) oder an/in lebenden Zellen, Geweben oder Organismen
(in vivo) detektieren.
Ferner betrifft eine Ausführungsform die Verwendung von erfindungsgemäßen Oligoliganden für therapeutische Zwecke.
Eine weitere Ausführungsform betrifft die therapeutische Verwendung von erfindungsgemäßen Oligoliganden mit antibakterieller, antiviraler oder cytostatischer Wirksamkeit.
Schließlich betrifft eine Ausführungsform die therapeutische Verwendung von erfindungsgemäßen Oligoliganden durch Einleitung in infizierte Zellen, Gewebe oder Organismen zur Infektions- oder Tumorbekämpfung.
Die hier beschriebene Erfindung beruht also auf dem Prinzip, daß zunächst Liganden gegen verschiedene Bausteine in vi tro durch beispielsweise eine der folgenden Methoden selektioniert und nachfolgend miteinander kombiniert werden:
1. „Systematic Evolution of Ligands by Exponential Evolution" (SELEX) (Tuerk, C. & Gold, L.; 1990): Liganden für fast alle mögliche Zielsubstanzen (z.B. Proteine, Aminosäuren, Peptide, Nucleotide, Kohlenhydrate) (L. Gold; 1995) werden aus einer Ausgangsmischung von 1013 - 1015 hoch degenerierten einzelsträngigen Nucleinsäuren oder Nucleinsäureanaloga (ca. 20 - 100 degenerierte Basen) durch Bindung an eine
Zielsubstanz selektioniert . Nach geeigneten Waschschritten werden gebundene Moleküle eluiert und vervielfältigt. Dies erfolgt mittels PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion) im Falle von DNA Liganden bzw. RT-PCR (Reverse Transkriptase - PCR) im Falle von RNA Liganden. Die PCR wird durch konstante
Primerbindungsstellen ermöglicht, welche die randomisierten Basen flankieren. Einer von diesen flankierenden Bereichen kann einen Promotor beinhalten, um mittels in vi tro Transkription mit z.B. bakteriellen oder viralen RNA- Polymerasen die Übersetzung in einzelsträngige RNA zu ermöglichen. Alternativ kann die amplifizierte doppelsträngige DNA (dsDNA) z.B. durch asymmetrische PCR oder durch Immobilisierung eines Stranges und anschließende Denaturierung in einzelsträngige DNA (ssDNA) konvertiert werden. Nach mehreren Runden Selektion und Amplifikation unter Bedingungen steigender Stringenz, dominieren solche Oligonucleotide in der Mischung, die eine hohe Affinität zur Zielsubstanz bzw eine erwünschte Aktivität aufweisen. Durch zusätzliche "Counter Selection" mit unerwünschten Zielmolekülen z.B. der Matrix, an der das Zielmolekül immobilisiert ist, mit nah verwandten Zielmolekülen oder mit den "falschen" chemischen Gruppen (wie z.B. α-Amino Gruppe einer Aminosäure) können Sequenzen entfernt werden, die unerwünschte Affinität zu diesen Gruppen/Zielmolekülen aufweisen. Individuelle Aptamere können schließlich durch Klonierung isoliert und charakterisiert werden.
Ein großes Problem bei der Anwendung von Oligonucleotidliganden in biologischen Flüssigkeiten ist, daß sie in manchen Fällen (z.B. in Blut) sehr schnell von Nucleasen abgebaut werden. Für die Nutzung von Oligonucleotidliganden in Nuclease-haltigen Flüssigkeiten ist es daher vorteilhaft, wenn diese vor Nucleaseabbau geschützt sind. Dies kann erreicht werden durch die Integrierung chemisch modifizierter Nucleotide (z.B. mit 2'-Amino-, 2'- Fluoro- oder 2 ' -O-Methyl-Gruppen) (Jellinek, D; 1995; Eaton, B & Picken, W; 1995) . Eine interessante Alternative besteht in der Selektion von Aptameren gegen natürlich nicht vorkommende oder nur vereinzelt vorkommende optische Isomere von Zielmolekülen (z.B. D-Aminosäuren, L-Zucker, L- Nucleotide) und der nachfolgenden Synthese der entsprechenden L-Aptamere. Diese sogenannten Spiegelmere binden die natürlichen Zielsubstanzen und sind erheblich stabiler in biologischen Flüssigkeiten (Nolte, A.,Klußmann, S., Bald, R. , Erdmann, V. & Fürste, J; 1996) .
2. Screening von Peptidbibliotheken: a) Synthetische Peptidbibliotheken: Oligopeptide von einer Länge von ca. 6-7 Aminosäuren werden durch "Split Synthesis" synthetisiert (Furka, A. , Sebestyen, F., Asgedum, M. & Dibo, G; 1988). Dabei wird die Synthese mit z.B. 20 parallelen Ansätzen gestartet, wobei in jedem dieser Ansätze mit einer anderen Aminosäure begonnen wird. Jeder dieser Syntheseansätze wird wiederum in z. B. 20 Syntheseansätze geteilt und die Synthese mit jeweils einer anderen der 20 Aminosäuren fortgeführt. Dies wird wiederholt, bis die gewünschte Länge (X) erreicht wird. Eine solche Bibliothek besteht aus 20x Peptidsequenzen . Die Peptide können entweder auf einer Matrix (z.B. Beads) oder in einer Lösung auf
Affinität oder Aktivität gescreent werden und aktive Peptide durch Peptidsequenzierung identifiziert werden. Eine Alternative ist die "Synthetic Peptide Combinatorial Library" (SPLC) Methode (Houghten, R. , Pinilla, C. et al ; 1991) . In diesem Fall wird eine Bibliothek von Peptiden mit einer Länge von ca. 6-7 Aminosäuren synthetisiert, wobei die Sequenz der ersten zwei Aminosäuren definiert ist. Diese z.B. 400 separaten Peptidmischungen - jede mit einer unterschiedlichen Dipeptidsequenz am NH2-Terminus - werden auf eine Affinität oder Aktivität durchmustert. Die Peptidmischungen, welche die höchsten Aktivitäten zeigen, werden nun an der Position der dritten Aminosäure variiert, wobei die restlichen Aminosäuren wiederum nicht festgelegt werden. Der Prozeß wird wiederholt, bis die Aminosäuresequenz des Peptides definiert ist. b) "Phage Display Libraries": Peptide werden auf der Oberfläche von Bakteriophagen exprimiert (Scott, J. & Smith, G.: Science; 1990) . Eine kurze randomisierte DNA Sequenz kodierend für ca. 6 bis 7 Aminosäuren oder ein längeres Peptid oder Protein wird am Ende des "minor coat-Protein" Lokus (Gen III) eines filamentösen Phagen eingebaut. Das entsprechende Peptid wird als Teil des Hüllproteins exprimiert. Jeder Phage in einer solchen Bibliothek exprimiert ein definiertes Peptid. Die exprimierten Peptide können auf Affinität oder Aktivität gescreent werden, und die Phagen mit der erwünschten Eigenschaft können isoliert werden. Um die Peptidsequenz (en) zu bestimmen, wird DNA aus den Phagen isoliert und anschließend sequenziert. Nach Übersetzung der DNA-Sequenz in Aminosäure-Sequenz kann das freie Peptid für andere Anwendung synthetisiert werden oder es kann auf der Oberfläche des Phagen direkt verwendet werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind also kombinatorische Bibliotheken von oligomeren Molekülen, die eine Affinität zu einer oder mehreren Zielsubstanz (en) bzw. eine gewünschte biologische, biochemische oder chemische Aktivität aufweisen. Um eine solche Bibliothek zu schaffen, werden zunächst Monoliganden gegen Bausteinmoleküle (z.B. Monosaccharide, Aminosäuren, Nucleotide sowie kurze Oligomere) in vi tro selektioniert . Zwei oder mehrere der einzelnen selektionierten Monoliganden werden nachfolgend miteinander verknüpft, um neue Spezifität oder Aktivität zu schaffen. Die Oligoliganden werden schließlich auf die neue Spezifität bzw. Aktivität beispielsweise wie folgt getestet:
1. Isolation von Affinitätsliganden für Bausteinmoleküle Zunächst werden Bausteinmoleküle (z.B. Monosaccharide, glykosylierte Aminosäuren, Nucleotide sowie kurze Oligomere) an einer Festphase immobilisiert, optional unter Verwendung eines geeigneten Spacermoleküls . Geeignete Matrices sind z.B. aktivierte Sepharose Beads oder die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte (MTP) . Die Bausteine werden durch ihre chemische Gruppen, z.B. -OH, -NH2, -COOH und/oder -P03, so gebunden, daß z.B. die Seitenketten von Aminosäuren oder die Basen von Nucleotiden den potentiellen Liganden zugänglich sind. Dadurch wird die Chance erhöht, daß die Liganden für den jeweiligen Baustein spezifisch sind und, daß sie auch dann an den jeweiligen Baustein binden, wenn dieser Bestandteil eines oligomeren- oder Makro-Moleküls ist. Liganden werden aus einer Mischung von degenerierten einzelsträngigen Oligonucleotiden (SELEX) bzw. aus einer Mischung der auf der Oberfläche von Phagen exprimierten Peptide (Phage Display) oder aus einer Mischung von synthetisch hergestellten Peptiden ("Synthetic Peptide Combinatorial Library") mit den immobilisierten Bausteinen in vi tro selektioniert.
2. Vortests Ein optionaler Zwischenschritt besteht in der Überprüfung, welche der Liganden gegen Bausteine bereits signifikante Affinität zum jeweiligen Zielmakromolekul aufweisen und/oder eine erwünschte Aktivität aufweisen. Der Test kann z.B. in einer MTP oder auf einer Membran durchgeführt werden: wenn das Makromolekül in reiner Form vorhanden ist, wird es z.B in den Vertiefungen einer MTP bzw. als Spot auf einer Membran immobilisiert. Monoliganden, die mit einer geeigneten Markierung (wie z.B. radioaktive, farbige, fluoreszierende Gruppen oder Gruppen, die direkt oder indirekt einen enzymatischen Nachweis erlauben) versehen sind, werden mit der immobilisierten Substanz inkubiert. Nach einem Waschschritt werden gebundene Liganden über die Markierung detektiert. Wenn die Zielsubstanz nicht in reiner Form verfügbar ist, sondern nur in einer Mischung, wie z.B. einem Proteinextrakt, kann der Extrakt zunächst in einem SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und auf eine Membran geblottet werden. Inkubation und Detektion erfolgen dann wie oben. Zwei oder mehrere der o.g. Monoliganden werden miteinander verknüpft. Dabei werden die Klassen von Monoliganden verwendet, die die jeweiligen Makromoleküle binden (z.B. Liganden gegen Aminosäuren für Proteine oder Polypeptide als Makromoleküle). Es besteht jedoch ebenso die Möglichkeit, Monoliganden gegen Bausteine unterschiedlicher Klassen miteinander zu verknüpfen. Hierdurch können Oligoliganden gegen z.B. modifizierte Proteine geschaffen werden (z.B. gegen myristoylierte, glykosylierte oder mit Nucleinsäuren komplexierte bzw. kovalent verknüpfte Proteine). Die Verknüpfung könnte nach einer der folgenden Methoden erfolgen: a) Klonierung (bei Aptameren) : Das DNA Produkt von Aptamer 1 enthält eine Schnittstelle für Restriktionsenzym 1 (z.B. Barn HI) in dem Bereich von einer der beiden flankierenden Primerbindungsstellen und eine Schnittschnelle für Restriktionsenzym 2 (z.B. Hind III) in dem Bereich der anderen flankierenden Primerbindungsstellen. Aptamer 2 enthält ebenfalls eine Schnittstelle für Restriktionsenzym 2 (z.B. Hind III) in einer flankierenden Region und eine Schnittstelle für Restriktionsenzym 3 (z.B. Eco RI) in der anderen flankierenden Region. Die Aptamere werden dann mit dem Fachmann geläufigen Methoden (J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis, 1989) an der Schnittstelle für Restriktionsenzym 2 miteinander fusioniert und in einen Plasmidvektor ligiert. Große Mengen des Diaptamers können dann durch Vermehrung des Plasmides in z.B. Escherichia coli, Spaltung mit geeigneten Restriktionsenzymen und
Denaturierung der inserierten DNA gewonnen werden. Die Schaffung von Oligoaptameren durch Klonierung hat den Vorteil, daß die Sequenz der Monoaptamere nicht bekannt sein muß, und daß bei der Klonierung leicht Spacer- Sequenzen variabler Länge und Sequenz eingefügt werden können. b) Klonierung (bei Peptidliganden) : Wenn die
Aminosäuresequenzen von zwei oder mehr Monoliganden bekannt ist, können diese in DNA-Sequenz übersetzt werden und in einer Expressionskassette auf beliebige Weise miteinander fusioniert werden. Diese Vorgehensweise erlaubt die Expression großer Mengen der jeweiligen Fusionsproteine sowie das Einfügen von Spacer-Sequenzen variabler Länge und Sequenz. c) Chemische Synthese: Zwei oder mehr Monoliganden, deren Sequenz vorher bestimmt wird, können direkt durch chemische Synthese, unter Beibehaltung der klassenspezifischen Bindungen (z.B. Phosphodiesterbindung bei Aptameren) , miteinander fusioniert werden. Diese Vorgehensweise hat den Vorteil, daß direkt bei der Synthese Gruppen eingefügt werden können, welche eine direkte oder indirekte Aufreinigung, Detektion oder
Kopplung (an z.B. cytotoxische Agentien) des resultierenden Oligoliganden ermöglichen. Wie bei a) und b) besteht zusätzlich die Möglichkeit der Einführung von Spacer-Molekülen variabler Größe und Sequenz. Chemische Kopplung: Bei der Synthese der Monoliganden werden - vorzugsweise an den Enden der Monoliganden - reaktive Gruppen eingeführt, die über einen mindestens bifunktionalen Spacer die kovalente Verknüpfung von zwei oder mehreren Monoliganden im Anschluß an die Synthese ermöglichen. Alternativ können zwei oder mehr Monoliganden direkt mit einem mindestens bifunktionalen Spacer sequentiell eingesetzt werden. Beide Verfahren resultieren in der allgemeinen Struktur; vgl. das folgende Schema.
Diese Synthesen können in Lösung oder an fester Phase erfolgen und erlauben nach Standardtechniken die kombinatorische Synthese definierter Konjugate in hoher Diversität .
Diese chemische Kopplung hat den Vorteil, daß Monoliganden auch über nichtklassenspezifische Bindungen miteinander verknüpft werden können, und daß gleichzeitig eine immense
Viefalt verschiedener Spacer-Moleküle eingeführt werden kann. Letzteres wiederum resultiert in einer unterschiedlichen Orientierung und Entfernung der miteinander verknüpften Monoliganden. Zusammen mit der Flexibilität des eingeführten Spacer-Moleküls sowie dessen Polyfunktionalität sind dies wichtige Parameter, mit denen die Spezifität des resultierenden Oligoliganden moduliert werden kann.
4. Die Oligoliganden werden anschließend auf die Bindung an Zielsubstanzen bzw. auf Aktivität z.B. in Form eines Mikrotiterplatten-Tests getestet. Einzelne Oligoliganden werden z.B. jeweils in einer Vertiefung einer Mikrotiterplatte immobilisiert (z.B. mittels Biotin/Streptavidin) und mit einer Mischung von Makromolekülen (z.B. einem Zellextrakt) inkubiert. Das gebundene Zielmolekül wird durch einen spezifischen Aktivitätstest nachgewiesen. Eine Voraussetzung eines solches Ansatzes ist, daß ein geeigneter Test existieren muß, mit dem das gesuchte Makromolekül nachgewiesen werden kann. Durch einen solchen Test können Oligoliganden identifiziert werden, welche sich z.B. als Liganden für die affinitätschromatographische Aufreinigung eines Zielmakromoleküls eignen.
Alternativ kann auch direkt die Bindung bzw. Inhibition von zumindest partiell aufgereinigten Zielmakromolekülen untersucht werden. Hierzu werden z.B. ein Zielmakromolekül an einer Festphase immobilisiert und diejenigen
Oligoliganden detektiert (z.B. über eingeführte Gruppen, siehe Abschnitt 2), die die höchste Affinität zum Zielmakromolekül zeigen, bzw. die größte inhibitorische Wirkung auf das Zielmakromolekül ausüben. Alternativ können eine oder mehrere Oligoliganden auch mittels eines in vivo-Systems auf ihre modulierende Eigenschaft von biologischen Prozessen untersucht werden. So könnte z. B. eine Population verschiedener Oligoliganden systematisch mittels geeigneter Testsysteme auf cytostatische und antibakterielle Eigenschaften untersucht werden. Oligoliganden mit schwacher Aktivität in einem solchen Testsystem könnten über die oben geschilderten Strategien miteinander kombiniert werden, bis ein Oligoligand mit ausreichender Aktivität/Spezifität gefunden wird.
In der hier beschriebenen Erfindung werden für die in vi tro Selektion von Liganden monomere Bausteine von Makromolekülen eingesetzt, z.B. Aminosäuren, Monosaccharide, Nucleotide bzw. kurze Oligomere (z.B. Dimere, Trimere etc.), sowie derartige monomere Bausteine in modifizierter Form (z.B. glykosylierte, sulfonylierte, acetylierte Aminosäuren, phosphorylierte Zucker, methylierte Nucleotide) . Die Komplexität der möglichen
Ligandenbibliotheken steht im Zusammenhang mit der Größe des Zielmoleküls. So gibt es z.B. 20 natürliche Aminosäuren aber bereits 400 (202) Dipeptide. Wenn also z.B. das Ziel eine umfangreiche Kollektion von proteinbindenden Liganden unterschiedlicher Spezifität ist, sollte die bevorzugte
Strategie die Selektion von Liganden gegen monomere Aminosäuren sein. Aus der begrenzten Anzahl von Monoliganden (max. 20) kann durch unterschiedliche kovalente Verknüpfung bzw. durch Einführung variabler Spacer-Moleküle eine immense Vielfalt an Oligoliganden mit unterschiedlichen Bindungsspezifitäten gewonnen werden. Gegenüber der Alternativstrategie - der Selektion von Liganden gegen z.B. Oligopeptide - ist der Arbeitsaufwand stark reduziert.
Struktur möglicher Konjugate: 5'— ► 5'
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Die SELEX Methode für die Herstellung von Oligonucleotidliganden mit hoher Affinität zu Zielmolekülen ist in den Patenten W091/19813 und US5270163, beide mit dem Titel "Nucleic Acid Ligands", beschrieben.
Methoden für die Herstellung von Nuclease-resistenten Oligonucleotiden durch den Einbau von modifizierten Nucleotiden (z.B. von Nucleotiden, die an der 2V oder 5 Position chemisch modifiziert sind) sind in der Patentanmeldung US08/117,991 mit dem Titel "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides" beschrieben.
Patent US5637459 und Patentanmeldung WO96/04403, beide mit dem Titel "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chimeric SELEX", beschreiben Methoden, bei denen Oligonucleotidmoleküle von zwei oder mehr Parent-Libraries gegen bekannte Zielmoleküle gemischt und miteinander verknüpft werden, um eine neue Bibliothek zu produzieren. Die chimären Moleküle dieser Bibliotheken binden gleichzeitig entweder zwei Epitope eines Zielmoleküls oder zwei Epitope in verschiedenen Zielmolekülen. Die hier vorliegende Erfindung unterscheidet sich von diesen wie folgt:
• Die einzelnen mittels SELEX oder mittels anderer Verfahren produzierten Liganden werden durch Selektion an Bausteine von Makromolekülen selektioniert. Solche Liganden binden extrem unspezifisch an die jeweiligen Makromoleküle und die
Bindungsstellen können nicht als "Epitope" bezeichnet werden.
• Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, Liganden für fast jedes Makromolekül herzustellen, auch zu solchen, die noch nicht vollständig charakterisiert oder isoliert sind. Die Monoliganden der Parent Libraries sind relativ unspezifisch und die Spezifität wird erst erreicht durch die Kombinatorik der Oligoliganden.
Nachdem die einzelnen Liganden verknüpft sind, wird keine weitere Selektion, wie z.B. durch SELEX oder andere Verfahren, durchgeführt. Hingegen dienen z.B die Chimären Aptamere in der o.g. Erfindung als Quelle neuer Komplexität in weiteren SELEX Runden.
Die vorliegende Erfindung beschreibt eine neue Technik zur Identifizierung von hochaffinen Molekülen. Der größte Vorteil besteht darin, daß Liganden für jede bzw. fast jede makromolekulare Zielsubstanz hergestellt werden können, auch wenn diese Zielsubstanz bisher nicht charakterisiert wurde oder nicht in reiner Form vorliegt. Zusätzlich ist die Wahrscheinlichkeit, verglichen mit anderen kombinatorischen Bibliotheken, deutlich erhöht, daß man Liganden mit Affinität zu der jeweiligen Makromolekülklasse findet. Dies ist vor allem dann von Bedeutung, wenn in biologischen Tests nach Substanzen mit einer biologischen Aktivität gesucht wird, da die Wahrscheinlichkeit, Substanzen mit den gewünschten Eigenschaften zu finden, stark erhöht ist. Weiterhin läßt der modulartige
Aufbau der beschriebenen Oligoliganden vermuten, daß auch gegen solche Epitope Affinitätsliganden gefunden werden können, die mit konventionellen Methoden nicht zugänglich sind.
Beispiel 1 : Isolation von Apta eren mittels SELEX
Aptamere werden gegen verschiedene Bausteine selektioniert: Zielmoleküle sind: Aminosäuren und modifizierte (z.B. glycosylierte, phosphorylierte) Aminosäuren (wie z.B. Tyrosin, Phosphotyrosin, Glucothreonin) , Zucker (Glucose, Ribulosephosphat), Nucleotide (z.B. Thymin, GTP, Methyl-GTP) sowie Oligomere solcher Bausteine. Die monomeren oder oligomeren Bausteine werden an einer Gelmatrix (z.B. Sepharose) immobilisiert und in eine Säule gegeben. Nach Auftragung von degenerierten, einzelsträngigen Oligonucleotiden auf die Säule wird intensiv mit Bindungspuffer (z.B lOmM Hepes, 150mM NaCl, 5mM KC1, 5mM CaCl2 ImM MgCl2, pH 7,2) gewaschen, und die gebundenen Oligonucleotide werden (z.B. mit freier Zielsubstanz) eluiert. Falls es sich bei den Oligonucleotiden um RNA-Moleküle handelt, werden diese mit Reverse Transkriptase in cDNA umgewandelt. Die eluierte ssDNA oder cDNA wird mittels PCR amplifiziert und das dsDNA Produkt wird entweder in ssDNA oder RNA konvertiert. Der Prozeß wird wiederholt, bis eine Affinität von Kd < 10~4 M erreicht ist.
Beispiel 2 : Schaffung von Liganden höherer A inität/Spezifität durch Verknüpfung zweier oder mehrerer Monoliganden gegen monomere oder oligomere Bausteine
Wenn das Zielmakromolekül ein Protein ist, werden z.B. Aptamere gegen monomere oder oligomere Aminosäuren durch Ligation in einem Plasmidvektor miteinander verknüpft. Das DNA Produkt von Aptamer 1 enthält eine Schnittstelle für Restriktionsenzym 1 (z.B. Barn HI) in dem Bereich einer der beiden flankierenden Primerbindungsstellen und eine Schnittschnelle für Restriktionsenzym 2 (z.B. Hind III) in dem Bereich der anderen flankierenden Primerbindungsstelle . Aptamer 2 enthält ebenfalls eine Schnittstelle für Restriktionsenzym 2 (z.B. Hind III) in einer flankierenden Region und eine Schnittstelle für Restriktionsenzym 3 (z.B. Eco RI) in der anderen flankierenden Region. Die Aptamere werden dann mit dem Fachmann geläufigen Methoden an der Schnittstelle für Restriktionsenzym 2 miteinander fusioniert und in einen Plasmidvektor ligiert. Große Mengen des Diaptamers können dann durch Spaltung des Plasmides und Denaturierung der inserierten DNA gewonnen werden. Die Mono- oder Oligoliganden werden anschließend auf die Bindung zu Proteinen in Form eines Mikrotiterplatten-Tests geprüft. Einzelne Mono- oder Oligoliganden werden jeweils in einer Vertiefung einer Mikrotiterplatte immobilisiert (z.B. mittels Biotin/Streptavidin) und mit einer Mischung von Makromolekülen (z.B. einem Zellextrakt) inkubiert. Das gebundene Zielmolekül wird durch einen spezifischen Aktivitätstest nachgewiesen. So können verschiedene Mono-, oder Oligoaptamere identifiziert werden, die hohe Affinität zum jeweiligen Zielprotein aufweisen.
Beispiel 3 : Mono- , oder Oligoliganden als Liganden für die Affinitätschromatographie .
Mono-, oder Oligoliganden werden an einer Matrix immobilisiert und für die Affinitätschromatographie verwendet. Die Aufreinigung der Makromoleküle erfolgt sequentiell. Eine partiell gereinigte oder ungereinigte Substanzmischung (z.B. ein Zellextrakt) wird aufgetragen. Gebundene Makromoleküle (z.B. Proteine) werden nach einem Waschschritt eluiert und auf ihre Aktivität und ihren Reinheitsgrad untersucht. Durch Anwendung weiterer Mono-, oder Oligoliganden, die unter Beispiel 2 identifiziert wurden, kann bei Bedarf ein oder mehrere weitere (r) Reinigungsschritt (en) des Makromoleküls erfolgen.
Beispiel 4: Diagnostische Anwendungen: Spezifischer Nachweis aus einem Subset von phosphorylierten Proteinen. Moleküle von einer Parent-Library von Liganden gegen Phosphotyrosin werden mit denen von einer Parent-Library von Liganden gegen andere mono- oder oligomere Aminosäuren verknüpft. Diese Diliganden werden z.B. mit einem Zellextrakt kontaktiert. Durch eine Markierung (z.B. direkte oder indirekte Markierung mit z.B. alkalischer Phosphatase) des Di- oder Oligoliganden kann die Anwesenheit des Zielmoleküls nachgewiesen werden. aD Die Probe z.B. ein Zellextrakt wird in einem SDS-
Polyacrylamidgel getrennt und nachfolgend auf eine Membran geblottet . bD Die Membran wird mit dem markierten Di- oder Oligoligand inkubiert . cD Die Bindung des Di- oder Oligoligand an Proteine auf der Membran wird durch eine geeignete Detektionsreaktion (je nach eingeführter Markierung, z.B. Lumineszenz) dargestellt .
Beispiel 5 : Antitumorale Anwendungen
Kombinatorische Oligoliganden werden isoliert, die eine Affinität zu einem Protein aufweisen, das eine Rolle in der Tumorentwicklung aufweist. Durch in vi tro Screening der kombinatorischen Ligandbibliothek werden Moleküle isoliert, die an das Zielprotein binden und dieses möglicherweise auch inhibieren. So könnten identifizierte Oligoliganden bei der Tumorbekämpfung eingesetzt werden. Hierbei kann es sich um Rezeptoren oder Tumorantigene handeln (z.B. HER 2), intrazelluläre Proteine (z.B. Telomerase, Proteinkinasen) , sekretierte Proteine (z.B. Matrix-Metalloproteinasen, angiogenetische Faktoren), die bei dem Tumorwachstum bzw. bei der Entstehung von Metastasen eine essentielle Rolle spielen. Burch Bindung der Di- bzw. Oligoliganden wird die Tumorzellproliferation bzw. Metastasierung inhibiert. Die geeigneten Di- bzw. Oligoliganden werden durch Screening von kombinatorischen Bibliotheken in in vi tro Assays gewonnen z.B. in einem Proliferationsassay mit Tumorzellen oder in einem Enzymassay (Protease, Telomerase, Proteinkinase) .
Beispiel 6 : Antibiotische Tests an Bakterienzellen (Wachstumsinhibition) oder Viren Zur Bekämpfung von bakteriellen und viralen Infektionen werden ebenfalls Di- bzw. Oligoliganden eingesetzt. Die Di- bzw.
Oligoliganden binden an Oberflächenantigene von Bakterien oder
Viren und blockieren so das Wachstum der Mikroorganismen bzw. die Bindung an Wirtzellen. Viren binden an spezifische Rezeptoren und besitzen dafür geeignete Proteine. Durch
Blockierung dieser Proteine läßt sich die Infektion verhindern.
Zum Screening werden in Bindungsassays kombinatorische
Ligandbibliotheken eingesetzt und bindende Di- bzw.
Oligoliganden identifiziert. Diese Moleküle können dann zur Neutralisation der Mikroorganismen eingesetzt werden. Andere Di- bzw. Oligoliganden können durch Screening von Bibliotheken in
Wachstumsassays gewonnen werden.
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Claims

Patentansprüche
1. Ein Verfahren zur Herstellung von Oligoliganden mit
Bindungsvermögen an Makromoleküle gegebenenfalls unbekannten Aufbaus aus Bausteinen, gekennzeichnet durch: a) Selektion eines oder mehrerer Liganden gegen einen mono- oder oligomeren Baustein, b) Selektion eines oder mehrerer weiterer Liganden gegen einen zweiten mono- oder oligomeren Baustein und optional eines oder mehrerer dritter bis nter Liganden gegen einen dritten bis nten mono- oder oligomeren Baustein, c) chemische oder enzymatische Verknüpfung der selektionierten Liganden nach a) und b) , insbesondere unter Einführung von
Spacer-Molekülen, d) Screening der gewonnenen Oligoliganden auf Bindung an ein oder mehrere Makromolekül (e) , gegenüber denen die Oligoliganden Bindungsvermögen besitzen sollen, und e) Isolation des (der) bindenden Oligoliganden nach d) und gegebenenfalls f) Herstellung des (der) bindenden Oligoliganden nach e) mittels chemischer oder enzymatischer Synthese bzw. mittels Klonierung,
wobei das oder die Makromoleküle bei den Stufen a) bis c) nicht zugegen sind.
2. Ein Verfahren zur Herstellung von Oligoliganden mit gewünschter biologischer Aktivität, gekennzeichnet durch: a) Selektion eines oder mehrerer Liganden gegen einen mono- oder oligomeren Baustein, b) Selektion eines oder mehrerer weiterer Liganden gegen einen zweiten mono- oder oligomeren Baustein und optional eines oder mehrerer dritter bis nter Liganden gegen einen dritten bis nten mono- oder oligomeren Baustein, c) chemische oder enzymatische Verknüpfung der selektionierten Liganden nach a) und b) , insbesondere unter Einführung von Spacer-Molekülen, d) Screening der gewonnenen Oligoliganden auf gewünschte biologische Aktivität, wie Stimulation oder Inhibition von Zellteilung oder Inhibition einer enzymatischen Aktivität, und e) Isolation des (der) Oligoliganden mit gewünschter biologischer Aktivität und gegebenenfalls f) Herstellung des (der) bindenden Oligoliganden nach e) mittels chemischer oder enzymatischer Synthese bzw. mittels Klonierung.
3. Ein Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß die verknüpften Liganden RNA-Oligonucleotide sind.
4. Ein Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß die verknüpften Liganden einzelsträngige DNA Oligonucleotide sind.
5. Ein Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß die verknüpften Liganden Peptide sind.
6. Ein Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Bausteine Aminosäuren sind.
7. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Bausteine Dipeptide sind.
8. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Bausteine Tripeptide sind.
9. Ein Verfahren nach einem Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Bausteine Monosaccharide sind.
10. Ein Verfahren nach einem Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Bausteine Disaccharide sind.
11. Ein Verfahren nach einem Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Bausteine Trisaccharide sind.
12. Ein Verfahren nach einem Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Bausteine Mononucleotide sind.
13. Ein Verfahren nach einem Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Bausteine Dinucleotide sind.
14. Ein Verfahren nach einem Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Bausteine Trinucleotide sind.
15. Ein Verfahren nach einem Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Bausteine Fettsäuremoleküle sind.
16. Oligoliganden, gewinnbar durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15.
17. Oligoliganden, gewinnbar durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 und nachfolgende Herstellung in größerer
Menge, insbesondere durch a) chemische Synthese, b) in vi tro Transkription mittels gereinigter RNA-Polymerasen, c) in vi tro Amplifikation, insbesondere mittels PCR, LCR und/oder 3SR, und/oder d) Klonierung, insbesondere in E. coli.
18. Oligoliganden nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um modifizierte oder markierte oder zusätzlich modifizierte oder markierte Nucleinsäuremoleküle oder Peptidmoleküle handelt, die in einer für analytische Nachweisverfahren an sich bekannten Weise eine oder mehrere radioaktive Gruppen, farbige Gruppen, fluoreszierende Gruppen, Gruppen zur Immobilisierung an fester Phase, Gruppen für die Aufnahme in Zellen, Gruppen für eine indirekte oder direkte Reaktion, insbesondere für eine enzymatische Reaktion, vorzugsweise für eine Reaktion mit Hilfe von Antikörpern, Antigenen, Enzymen und/oder Substanzen mit Affinität zu Enzymen oder Enzymkomplexen, und / oder anderweitige an sich bekannte modifizierende oder modifizierte Gruppen nucleinsäureähnlichen Aufbaus aufweisen.
19. Oligoliganden nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß sie ganz oder teilweise aus PNA bestehen.
20. Oligoliganden nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß sie vor Nucleaseabbau geschützt sind, insbesondere durch Einbau von modifizierten Nucleotiden, die insbesondere durch 2'-Amino, 2'-Fluoro oder 2'-0-Methyl Gruppen modifiziert sind.
21. Oligoliganden nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß sie ganz oder teilweise aus L-RNA oder L-DNA bestehen.
22. Verwendung von einem oder mehreren Oligoliganden gemäß einem der Ansprüche 16 bis 21 bei der Affinitätschromatographie mit den Schritten: a) Immobilisierung der Oligoliganden an einer Gelmatrix, b) Kontakt einer Substanzmischung mit den immobilisierten Oligoliganden, c) Entfernen unspezifisch gebundener Substanzen und d) Elution der gebundenen Substanzen.
23. Verwendung von einem oder mehreren Oligoliganden gemäß einem der Ansprüche 16 bis 21 zum Nachweis von Makromolekülen unbekannten Aufbaus aus Bausteinen, dadurch gekennzeichnet, daß Oligoliganden und Makromoleküle inkubiert werden und nach Waschschritten gebundene Oligoliganden detektiert werden.
24. Verwendung nach Anspruch 23, gekennzeichnet dadurch, daß Makromoleküle in Zellextrakten oder in Gewebeschnitten ( in vi tro) oder an/in lebenden Zellen, Geweben oder Organismen (in vivo) detektiert werden.
25. Verwendung der Oligoliganden gemäß einem der Ansprüche 16 bis 21 für therapeutische Zwecke.
26. Therapeutische Verwendung von Oligoliganden gemäß einem der Ansprüche 16 bis 21 mit antibakterieller Wirksamkeit.
27. Therapeutische Verwendung von Oligoliganden gemäß einem der Ansprüche 16 bis 21 mit antiviraler Wirksamkeit.
28. Therapeutische Verwendung von Oligoliganden gemäß einem der Ansprüche 16 bis 21 mit cytostatischer Wirksamkeit.
29. Therapeutische Verwendung von Oligoliganden gemäß einem der Ansprüche 16 bis 21 durch Einleitung in infizierte Zellen, Gewebe oder Organismen zur Infektions- oder Tumorbekämpfung.
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