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WO2002039979A1 - Copolymere a structure sequencee compose d'un segment saccharidique lie a au moins un segment hydrophobe bioerodable, et particules correspondantes - Google Patents

Copolymere a structure sequencee compose d'un segment saccharidique lie a au moins un segment hydrophobe bioerodable, et particules correspondantes Download PDF

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WO2002039979A1
WO2002039979A1 PCT/FR2001/003619 FR0103619W WO0239979A1 WO 2002039979 A1 WO2002039979 A1 WO 2002039979A1 FR 0103619 W FR0103619 W FR 0103619W WO 0239979 A1 WO0239979 A1 WO 0239979A1
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WO
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radical
copolymer
poly
segment
particles
Prior art date
Application number
PCT/FR2001/003619
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English (en)
Inventor
Cédric CHAUVIERRE
Patrick Couvreur
Denis Labarre
Christine Vauthier
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S.)
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Filing date
Publication date
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Priority to AU2002220793A priority patent/AU2002220793A1/en
Publication of WO2002039979A1 publication Critical patent/WO2002039979A1/fr

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F251/00—Macromolecular compounds obtained by polymerising monomers on to polysaccharides or derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/1641—Organic macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, poloxamers

Definitions

  • the invention relates to a new family of bioerodible copolymers based on a polymer of alkyl cyanoacrylate type, or related and of poly- or oligosaccharides, particularly useful in the pharmaceutical, veterinary, food and cosmetic fields, in particular as vectors and / or excipients. It also proposes a process for preparing these copolymers.
  • Bioerodible polymers generally formulated in the form of liposomes, microemulsions, nanospheres, nanocapsules, microspheres, microcapsules, microparticles and nanoparticles constitute effective delivery systems for active ingredients.
  • micro- and nanoparticles based on poly (alkyl cyanoacrylate) are particularly advantageous given their rapid bioerosion compared to other biodegradable polymers, such as poly (lactic acid) / poly ( ⁇ -caprolactone) for example.
  • these particles based on poly (alkyl cyanoacrylate) are not entirely satisfactory.
  • these particles have the disadvantage of being rapidly captured by the macrophages of the System of
  • Mononuclear phagocytes (PMS). Their lifespan, in vivo, is therefore very short.
  • the present invention aims precisely to overcome the aforementioned drawbacks and to propose a new material for particles whose polymer structure derives from the association with a polymer. related to poly (alkyl cyanoacrylate), of a segment of poly- or oligosaccharide nature, such as dextran for example.
  • Nanoparticles based on amphiphilic block copolymers comprising dextran and poly (alkyl cyanoacrylate) segments have already been described (S.J. Douglas et al.; Journal of Controlled Release (1986) 15-23).
  • these copolymers which are derived from the anionic polymerization of cyanoacrylate monomers in the presence of dextran have grafted structures.
  • the anionic polymerization of alkyl cyanocrylates in the presence of dextran leads to the grafting of several poly (cyanoacrylate) chains on the dextran polymer chain without it being moreover possible to control the number, size and localization of these poly (cyanoacrylate) chains.
  • the particles thus formed have an interfacial layer of dextran on the surface, the overall structure of which leads to recognition by the complement system and by the macrophages of the SPM.
  • the present invention aims for its part to provide copolymers derived from cyanoacrylate or equivalent monomers and from oligo- or polysaccharides but having a completely different structure.
  • the copolymers are in a block form, as opposed to the graft forms described above. This sequenced form is in fact inaccessible by the anionic polymerization path discussed above.
  • the present invention also aims to propose a synthetic route for preparing this type of block copolymer.
  • the inventors have thus demonstrated that it is possible to effectively polymerize, by the radical route, molecules with a high charge density, of cyanoacrylate type, in the presence of poly- or oligosaccharides, this despite the fact that the energy of activation required for this radical polymerization is much higher than that required by anionic polymerization.
  • the cyanoacrylate or equivalent type monomers are naturally inclined to generate their anionic form when they are placed in the presence of a nucleophilic agent such as, for example, OH anions " and therefore to polymerize anionically.
  • the first object of the present invention is a copolymer with a block structure composed of a hydrophilic segment of saccharide nature, at least one of the ends of which is linked to a
  • - X represents a CN or CONHR radical
  • - Y represents a COOR 'or CONHR "radical, with R, R' and R" representing, independently of one another, an atom
  • Hydrogen a linear or branched C 20 to C 20 alkyl group, a linear or branched C 1 to C 20 alkoxy group, an amino acid radical, a mono- or poly-hydroxylated acid radical or an aryl radical or C 5 to C 12 heteroaryl, with said segment of saccharide nature being linked either by one of its
  • X preferably represents a CN radical. More preferably, Y represents a radical COOR 'with R' as defined above.
  • the repeating unit of isobutyl cyanoacrylate may be more particularly cited by way of illustration of a unit capable of composing a segment of general formula (I).
  • sequenced structure is intended to denote according to the invention a structure which derives from the establishment of a covalent bond between at least one of the ends of the segment of saccharide nature and one of the ends of the polymer chain of general formula (I).
  • copolymer structures comprising either a single segment of general formula (I) linked to one end of the segment of saccharide nature, or two segments of general formula (I), identical or different, linked respectively on either side of the saccharide segment.
  • the claimed copolymers do not have side branch (s) of saccharide nature on the hydrophobic segment, nor side branch (s) of hydrophobic nature on the saccharide segment .
  • the covalent bond, established between the two types of segment, is generally of C-C or C-O-C nature.
  • it is derived from the radical polymerization of at least one molecule of a compound of formula (II):
  • This radical polymerization is preferably carried out under the conditions set out below for the process claimed. In particular, it is carried out under conditions of pH and atmosphere unfavorable to the presence and or to the generation of anions in the reaction medium and in the presence of a sufficient amount of a suitable radical initiator Redox.
  • the saccharide-type segment is derived from an oligo- or polysaccharide of natural or synthetic origin, modified or not.
  • Modified polysaccharide is understood to mean any polysaccharide which has undergone a change on its skeleton, such as for example the introduction of reactive functions, the grafting of chemical entities (molecules, aliphatic links, PEG chains, etc.).
  • chemical entities molecules, aliphatic links, PEG chains, etc.
  • PEG polysaccharides modified by grafting biotin, fluorescent compounds, etc.
  • Other polysaccharides grafted with hydrophilic chains eg PEG
  • the oligo- or polysaccharide used according to the invention may already in itself have biological properties and / or activities. For example, it can confer anticoagulant, vaccinating, targeting or even mask properties to avoid capture by PMS macrophages. This is how it can be:
  • oligo- or polysaccharides with biological activity such as, for example, heparin, heparan sulfate, dermatan sulfate, dextran sulfate and pentosan sulfate, dextran substituted with carboxylic groups and sulfates or sulfonates , polysaccharides sulfates extracted from algae (fucans and fucoidans), poly (sialic acids), sulfated hyaluronic acid which have anticoagulant, anti-inflammatory activities to varying degrees, and / or
  • oligo- or polysaccharides involved in cell recognition and cell signaling processes such as, for example, poly (sialic acids), heparan sulfate, blood group antigens, polysaccharides and lipopolysaccharides of various strains bacterial, oligosaccharide chains of membrane and / or circulating glycoproteins, and oligosaccharide chains of glycolipids.
  • the copolymers derived from this type of polysaccharides are of course particularly advantageous in terms of therapeutic use, insofar as they naturally have their own biological activity and therefore can be used as such for this reason.
  • the polysaccharides which are particularly suitable for the invention are or are derived from D-glucose (cellulose, starch, dextran, cyclodextrin), D-galactose, D-mannose, D-fructose (galactosane, manane, fructosan), fucose (fucan).
  • D-glucose cellulose, starch, dextran, cyclodextrin
  • D-galactose D-mannose
  • D-fructose galactosane, manane, fructosan
  • fucose fucose
  • hyaluronic acid (composed of N-acetyl glucosamine and glucuronic acid units), poly (sialic acid) also called colominic acid or poly (N-acetyinaminic acid), chitosan, chitin, heparin or the orosomucoid contains nitrogen, while the agar, a polysaccharide extracted from seaweed, contains sulfur in the form of acid sulfate (> CH-O-SO 3 H). Chondroitin-sulfuric acid and heparin simultaneously contain sulfur and nitrogen.
  • the polysaccharide has a molecular weight greater than or equal to 6000 g / mole.
  • n varies between 10 and 620 and preferably between 33 and 220.
  • the molar mass varies between 5 10 3 and 5 10 6 g / mole, preferably between 5 10 4 and 2 10 6 g / mole.
  • the molar mass varies between 6 10 3 and 6 10 5 g / mole, preferably between 6 10 3 and 15 10 4 g / mole.
  • polydextroses such as dextran, chitosan, pullulan, starch, amylose, cyclodextrins, hyaluronic acid, heparin, amy
  • the copolymers have a controlled oligo- or polysaccharide content.
  • the claimed copolymer can be in a soluble form or in the form of a precipitate, micelles or particles. According to an advantageous aspect of the invention, it takes the form of particles. They can be micro- or nanoparticles. In the particular case of particles and micelles, it is likely that the copolymer has a structure organized as follows: chains of the same nature, that is to say saccharide or hydrophobic, are grouped together, either to constitute the structure heart of the micelle or particle, or the brush crown around this heart structure. Their distribution between the core structure and the crown will of course depend on the nature, aqueous or organic, of the solvent in which the particles or micelles are dispersed.
  • brush crown is intended to denote a structure in which the segments constituting the crown are linked by one of their ends to the segments constituting the heart. Their free ends constitute the periphery of the crown.
  • the hydrophobic segments are grouped so as to constitute the heart and the segments of a saccharide nature are arranged in a brush crown all around this heart.
  • the heart is hydrophilic in nature and therefore consists of the saccharidic segments
  • the brush crown is hydrophobic in nature and therefore constituted by the segments of formula general (I).
  • this brush crown structure cannot exist in an aqueous medium, insofar as several hydrophobic segments are linked by covalent bond to a single chain of saccharide nature.
  • a second aspect of the invention relates to particles consisting of a copolymer in accordance with the invention.
  • - isohexyl cyanoacrylate isobutyl cyanoacrylate, N-butyl cyanoacrylate, N-propyl cyanoacrylate, ethyl cyanoacrylate or 2-methoxyethyl cyanoacrylate in the presence of dextran
  • - isobutyl cyanoacrylate in the presence of heparin, chitosan, pectin, hyaluronic acid, dextran sulfate or ⁇ -cyclodextrin isohexyl cyanoacrylate, isobutyl cyanoacrylate, N-butyl cyanoacrylate, N-propyl cyanoacrylate, ethyl cyanoacrylate or 2-methoxyethyl cyanoacrylate in the presence of dextran, - isobutyl cyanoacrylate in the presence of heparin, chitosan, pectin, hyaluronic acid,
  • the claimed particles can have a size between 1 nm and 1 mm and preferably between 60 nm and 100 ⁇ m.
  • the particles having a size between 1 and 1000 nm are then called nanoparticles.
  • Particles varying in size from 1 to several thousand microns refer to microparticles. These particles may in certain cases be in an aggregated or micellar form.
  • the particles resulting from the polymerization of isobutyl cyanoacrylate in the presence of ⁇ -cyclodextrin have an aggregated appearance.
  • These particles can have a biological activity either because of the nature of the polysaccharide which constitutes them, or because they incorporate in addition a biological or pharmaceutical active material.
  • biological active materials mention may more particularly be made of peptides, proteins, carbohydrates, nucleic acids, lipids, polysaccharides or their mixtures. It can also be synthetic organic or inorganic molecules which, administered in vivo to an animal or to a patient, are capable of inducing a biological effect and / or of manifesting a therapeutic activity. It can thus be antigens, enzymes, hormones, receptors, peptides, vitamins, minerals and / or steroids.
  • the particles can thus include magnetic particles, radio-opaque materials (such as, for example, air or barium) or fluorescent compounds.
  • fluorescent compounds such as rhodamine or Nile red can be included in particles with a hydrophobic core.
  • gamma emitters for example Indium or Technetium
  • Hydrophilic fluorescent compounds can also be loaded into the particles, but with a lower yield compared to hydrophobic compounds, because of their reduced affinity with the matrix.
  • these particles can be combined with peptides / proteins capable of helping them to diffuse through biological membranes such as the TAT peptide, or compounds such as the 2OT protein (Zonula Occludens Toxin) and zonulin or equivalents, or any other absorption promoter.
  • biological membranes such as the TAT peptide, or compounds such as the 2OT protein (Zonula Occludens Toxin) and zonulin or equivalents, or any other absorption promoter.
  • this type of association can be achieved by chemical functionalization of the polysaccharide surface of the particles. It is thus possible to envisage covalently fixing, at the level of functions present on the skeleton of a saccharide nature, specific ligands, such as targeting agents, markers or more generally any compound capable of conferring on said particles an ability to react with a external species, as by example a function on a support or a biological entity present in a considered environment.
  • specific ligands such as targeting agents, markers or more generally any compound capable of conferring on said particles an ability to react with a external species, as by example a function on a support or a biological entity present in a considered environment.
  • the active material can be incorporated into these particles during their formation process or, on the contrary, be loaded at the level of the particles once they are obtained. It is thus possible to charge them by adsorption or by covalent grafting.
  • the particles according to the invention can be administered in different ways, for example by the oral, parenteral, ocular, pulmonary, nasal, vaginal, cutaneous, oral, etc. routes.
  • the non-invasive oral route is the route of choice.
  • the present invention also relates to the use of the particles as a vector of pharmaceutical, cosmetic, agrifood or veterinary active principles.
  • a third aspect of the present invention relates to a process for the preparation of the claimed copolymer. More specifically, the present invention relates to a process which is useful for the preparation of block copolymers composed of a hydrophilic segment of saccharide nature, at least one of the ends of which is linked to a hydrophobic segment, characterized in that it comprises polymerization by radical route of at least one molecule of a compound of general formula (11):
  • - X represents a CN or CONHR radical
  • - Y represents a COOR 'or CONHR "radical with R, R 'and R "representing independently of one another, a hydrogen atom, an alkyl group in C 1 -C 20 linear or branched alkoxy, C, to C 20 linear or branched , an amino acid radical, a mono- or poly-hydroxylated acid radical or a C 5 to C 12 aryl or heteroaryl radical, said radical polymerization being carried out in the presence of at least one molecule of a poly- or oligosaccharide , under pH and atmosphere conditions unfavorable to the presence and / or generation of anions in the reaction medium and in the presence of a sufficient amount of a suitable radical redox initiator.
  • X represents a CN radical and / or more preferably Y represents a COOR radical.
  • the pH of the reaction medium is preferably adjusted to a value less than 2 and more preferably less than 1.5. Surprisingly, it appeared that adjusting the pH to such a value was not detrimental to the rate of polymerization. Against all expectations and as is apparent from the examples present below, the radical polymerization initiated under these pH conditions is carried out on the contrary at a speed greater than that of an anionic polymerization. This is illustrated in particular in FIGS. 1 and 2.
  • reaction is also carried out under inert atmosphere conditions.
  • the solvent is advantageously chosen so that, while maintaining conditions favorable to radical polymerization and more particularly to the formation of the hydrophobic segment of formula (I), the solubility of the oligo or polysaccharide is complete in the medium defined by this solvent.
  • the solvent is also chosen to be weakly or non-solubilizing with respect to the copolymer.
  • the poly- or oligosaccharide molecule is chosen from dextran, heparin, poly (N-acetylneuraminic acid), amylose, chitosan, pectin and hyaluronic acid, and their derivatives. It is also of course chosen to remain inert with respect to the polymerization.
  • such a solvent is preferably chosen from aqueous, hydroalcoholic or hydroacetonic solvents.
  • the solvent chosen is acidified with an organic or inorganic acid and preferably a nitric acid to obtain an adequate pH during the course of the radical polymerization.
  • oligo- or polysaccharide and monomer of general formula (II) can vary widely.
  • the claimed process precisely has the advantage of allowing control of the structure of the copolymer which it is desired to prepare.
  • the quantities of reagents introduced also depend on their respective molecular weights and their degrees of solubility in the reaction medium.
  • Redox initiator these are generally mixtures of oxidizing and reducing agents, organic or inorganic, generating radicals during the electronic transfer step. This generation of radicals has the advantage of requiring a low activation energy unlike conventional radical initiators, which makes it possible to initiate radical polymerizations at relatively low temperatures (0-50 ° C).
  • the Redox initiator used preferably comprises at least one metal salt chosen from the salts of Ce 4+ , V 5+ , Cr 6+ , Mn 3+ . According to a preferred variant of the invention, it is Ce 4+ . It is generally introduced in the form of cerium and ammonium nitrate. The concentration of radical initiator is also capable of influencing the course of the radical polymerization.
  • composition of the copolymer and the length of the respective blocks of the polysaccharide and of the polymer of general formula (I) can be adjusted as a function of the initiator concentration. Its adjustment is within the competence of a person skilled in the art.
  • reaction temperature it is adjusted to a value compatible with the initiation of the polymerization.
  • this temperature is between 0 and 50 ° C.
  • the oligo- or polysaccharide is preferably dissolved in the chosen solvent, then the radical initiator Redox is added.
  • the monomer of formula (H) is then introduced into the mixture.
  • the copolymer can be obtained in a soluble form or in the form of micelles, powders or particles. Preferably, it is obtained directly in the form of particles.
  • the particles can be loaded with active ingredients either after their preparation or during their preparation.
  • the copolymer is obtained in the form of a powder, it is of course possible to formulate this powder in the form of particles, using suitable transformation techniques.
  • suitable transformation techniques one can more particularly mention the techniques of emulsification-evaporation of solvent, emulsification-diffusion of solvent or nanoprecipitation.
  • the particles meet the specificities set out above.
  • the polymerization of the compound of general formula (II) is carried out in the presence of the active material to be loaded.
  • the pH of the reaction medium can be neutralized if necessary. Preferably, this is adjusted to a value that remains less than or equal to 7.5.
  • the copolymer is recovered by conventional techniques.
  • the metal salt is complexed before the isolation of the copolymer resulting from the reaction of the radical initiator. This complexation, which is within the competence of a person skilled in the art, makes it possible to eliminate these metal salts.
  • Figure 1 Kinetics of radical polymerizations according to the invention of isobutyl cyanoacrylate in the presence of dextran, chitosan or pectin.
  • Figure 2 Reference kinetics of anionic polymerizations of isobutyl cyanoacrylate in the presence of dextran or chitosan.
  • FIG. 3 Electronic paramagnetic resonance spectrum (EPR) of copolymers in accordance with the invention of dextran-poly (isobutyl cyanoacrylate) labeled with 4-aminoTEMPO.
  • EPR Electronic paramagnetic resonance spectrum
  • the size of the polymer particles (average hydrodynamic diameter) is determined using a nanosizer (Coulter N4 PLUS®) by quasi-elastic diffusion of laser radiation.
  • the surface charge of the particles is determined using a
  • the dextran-poly (isobutyl cyanoacrylate) and heparin-poly (isobutyl cyanoacrylate) suspensions are diluted 1/200 e and 1/30 e respectively in potassium chloride at 1 mmol / l.
  • the purification of the copolymer particles is carried out as follows:
  • Dialysis tubes (Spectra / Por ® CE MWCO: 100,000) are regenerated for 30 minutes with osmosis water, and the colloidal suspensions passed through a vortex and then introduced into the tubes.
  • the lyophilization of the copolymer particles is carried out as follows:
  • Lyophilizations are carried out without the addition of cryoprotective.
  • the suspensions of colloidal particles are aliquoted in pillars and then frozen (-18 ° C). Lyophilization (Bioblock Scientific Christ alpha 1-4) is carried out for 48 hours. The lyophilisates (white powders) are stored in the refrigerator.
  • a specific mass lyophilisate is dispersed in a known volume of water MilliQ ® so that the mass ratio of freeze-dried / water volume is 1%.
  • the suspension is homogenized using a vortex at maximum speed and then by ultrasound for a few minutes using a sonicator (Branson 5200 ® ).
  • dextran sulfate of molecular mass (6-8000, 10000, 40000, 50000 or 500000 g / mol); - 0.1375 g of ⁇ -cyclodextrin; or
  • Example 3 The protocol of Example 1 is reproduced by substituting for isobutyl cyanoacrylate, one of the following monomers:
  • Table 1 summarizes the particle sizes of the various particulate suspensions produced.
  • the standard deviations represent the repeatability of the measurements.
  • the polymer content of the suspensions is determined by evaluating the weight of the dry residue obtained after lyophilization of a known quantity of suspension purified by dialysis. To do this, an aliquot of purified suspension prepared according to Example 1 or 2 is weighed with precision in a pill box and then frozen at (-18 ° C) before lyophilization for 48 hours in a Christ Alpha 1-4 lyophilizer (Bioblock Scientific). The mass of lyophilisate is weighed and then brought back to the mass of initial suspension.
  • the suspension of dextran-poly copolymer (isobutyl cyanoacrylate) obtained according to Example 1 contains 3.1 ⁇ 0.4% of copolymer (mass / mass).
  • the suspension of heparin-poly copolymer (isobutyl cyanoacrylate) obtained according to Example 2 contains 2.4 ⁇ 0.7% of copolymer (mass / mass).
  • the composition of the copolymers is evaluated by elementary analysis of the powders obtained by lyophilization of the purified suspensions as indicated above.
  • the dextran-poly (isobutyl cyanoacrylate) copolymer obtained according to Example 1 contains 20%
  • PC2000 Plug-in type spectrometer (Ocean Optics Europe) inserted into a PC type computer, an HL-2000-LL light source (Ocean Optics Europe), Fiber optics (200 and 100 ⁇ m) (Top sensor Systems FC-UV, Ocean Optics Europe) and OOI Base V 1.5 Software (Ocean Optics Europe).
  • the polymerization is carried out according to the protocol described in examples 1 to 3 in the 2 cm diameter glass tube placed in a water bath at 40 ° C. and on which is mounted the Teflon® ring supporting the optical fibers connected to the spectrometer and the light source. Argon bubbling is placed so as not to disturb the acquisition of the measurements. The background noise of the spectrometer is recorded before the introduction of the acid solution of cerium IV ions (8.10 "2 mol / l of cerium ammonium nitrate in HNO 3 at 0.2 mol / l).
  • the reference is recorded after l addition of the acid solution of cerium IV ions (8.10 "2 mol / l of cerium ammonium nitrate in HNO 3 at 0.2 mol / l).
  • the recording of the polymerization kinetics is started as soon as the 0.5 ml of monomer is added. It is carried out by the almost instantaneous acquisition of an absorbance spectrum over a wide wavelength range (400 - 800 nm) every 30 seconds for 50 min.
  • the absorbances measured at the wavelength of 650 nm are used to draw absorbance curves as a function of time, thus reflecting the kinetics of polymerization.
  • EXAMPLE 7 This example illustrates the synthesis of isobutyl dextran-polycyanoacrylate particles on a larger scale.
  • 0.6875 g of dextran 70,000 g / mol are dissolved in 40 ml of 0.2 mol / l nitric acid with magnetic stirring, at 40 ° C. and under gentle bubbling of argon for 10 min.
  • This example illustrates the synthesis of isobutyl dextran-polycyanoacrylate particles according to simplified experimental conditions.
  • the anticoagulant activity of the heparin of the heparin-poly (isobutyl cyanoacrylate) copolymer is evaluated by measuring the activated partial thromboplastin time (TCA) or anti-Ila activity and by measuring the anti-Xa activity produced by the particles consisting of said copolymer synthesized according to Example 2.
  • a calibration range of the method is carried out with the same heparin as that used for the synthesis of the copolymer.
  • a stock solution at 1700 IU / ml is prepared in the TOK buffer and then diluted in this same buffer to give solutions at 0.17; 0.85; 1, 7; 4.25 and 8.5 IU / ml.
  • 100 ⁇ l of each of the dilutions are themselves diluted in 900 ⁇ l of normal plasma.
  • the suspensions copolymer particles are diluted in the TOK at 1/100 and 1/200 ⁇ .
  • 100 ⁇ l of each of the dilutions of the suspension are themselves diluted in 900 ⁇ l of normal plasma.
  • a coagulation control consists of 100 ⁇ l of TOK and 900 ⁇ l of normal plasma. Measurement of coagulation times:
  • a bead is placed in each of the tanks of the ST4 coagulometer (Diagnostica Stago) then 100 ⁇ l of one of the samples prepared in the previous step and 100 ⁇ l of the APTT solution are introduced into the various tanks. After 300 seconds of incubation at 37 ° C, 100 ⁇ l of the calcium chloride solution are added. The coagulometer measures the coagulation times of the different samples in seconds. The results obtained for the heparin standard solutions make it possible to establish a calibration curve giving the activity of the heparin solution expressed in U.l./ml as a function of the coagulation time expressed in seconds. The heparin activity associated with the copolymer particles is evaluated on the calibration curve from the coagulation times measured for the suspensions.
  • the suspension containing particles of heparin-poly copolymers (isobutyl cyanoacrylate) prepared according to Example 2 have an anti-lla activity of 329 + 28 U.l./ml.
  • the copolymer particle suspension was diluted to 1/50 th, 1/100 th and 1/200 8 in TOK buffer then to 1/10 in the normal plasma thawed as described above.
  • the coagulation times are automatically evaluated on an ST1 coagulomer
  • a suspension not purified by dialysis of particles of copolymers is prepared according to Example 2 with dextran 15-20000 g / mol.
  • the suspension is filtered on a filter 1, 2 .mu.m (Millipore ® SLA PO 2550) and then purified by dialysis 2 2 hours against 11 of osmosed water followed by dialysis for 2 hours against 11 of phosphate buffer (Sigma ref. P 3813) (dialysis membrane: Spectra / Por ® CE MWCO: 100,000 regenerated 30 min in osmosis water).
  • the suspension was placed in dialysis tubing (Spectra / Por ® CE MWCO: 100000) previously regenerated with 30 min of reverse osmosis water and then dialyzed 3 times against 1 L of phosphate buffer for 2 hours.
  • the suspensions of grafted particles are recovered and can be stored at (+ 4 ° C).
  • the grafting of the marker can be demonstrated by electron paramagnetic resonance spectroscopy (EPR).
  • EPR electron paramagnetic resonance spectroscopy
  • the suspension obtained is placed in a measurement cell of a Varian E-4 EPR spectrometer.
  • the spectrum obtained presented in FIG. 3 indicates that the 4-amino TEMPO has indeed been grafted onto the dextran chains of the copolymer forming the particles and that it is animated by slow movements for 81% and by rapid movements for 19% according to Kivelson's simulation (Kivelson DJ, Journal Chem. Phys; 1960; 33; 1107).

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Abstract

La présente invention a pour objet un copolymère à structure séquencée composé d'un segment hydrophile de nature saccharidique et au moins un segment hydrophobe bioérodable de formule générale (I), dans laquelle: X représente un radical CN ou CONHR, Y représente un radical COOR' ou CONHR' avec R, R' et R' représentant, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène, un groupement alkyle en C1 à C20 linéaire ou ramifié, un groupement alcoxy en C1 à C20 linéaire ou ramifié, un radical acide aminé, un radical acide mono- ou poly- hydroxylé ou un radical aryle ou hétéroaryle en C5 à C12, avec ledit segment de nature saccharidique étant lié soit par l'une de ses extrémités à un unique segment de formule générale (I), soit par chacune de ses deux extrémités, à un segment de formule générale (I), les deux segments hydrophobes étant identiques ou différents. Elle concerne également des particules à base dudit copolymère et un procédé de préparation correspondant.

Description

COPOLYMERE A STRUCTURE SEQUENCEE COMPOSE D'UN SEGMENT
SACCHARIDIQUE LIE A AU MOINS UN SEGMENT HYDROPHOBE BIOERODABLE,
ET PARTICULES CORRESPONDANTES
L'invention concerne une nouvelle famille de copolymères bioérodables à base d'un polymère de type cyanoacrylate d'alkyle, ou apparenté et de poly- ou oligo- saccharides, particulièrement utiles dans les domaines pharmaceutique, vétérinaire, agroalimentaire et cosmétique, notamment à titre de vecteurs et/ou d'excipients. Elle propose également un procédé pour préparer ces copolymères.
Les polymères bioérodables formulés généralement sous l'aspect de liposomes, microémulsions, nanosphères, nanocapsules, microsphères, microcapsules, microparticules et nanoparticules constituent des systèmes de délivrance efficaces pour des principes actifs. Parmi ces systèmes, les micro- et nano- particules à base de poly(cyanoacrylate d'alkyle) s'avèrent tout particulièrement intéressantes compte tenu de leur rapide bioérosion comparativement à d'autres polymères biodégradables, comme les poly(acide lactique) / poly(ε-caprolactone) par exemple. Toutefois, ces particules à base de poly(cyanoacrylate d'alkyle) ne donnent pas entière satisfaction. D'une part, on ne dispose pas aujourd'hui de méthode de préparation efficace pour obtenir ces systèmes avec une structure et/ou une composition contrôlée des polymères entrant dans leur constitution. Par ailleurs, ces particules ont pour inconvénient d'être rapidement captées par les macrophages du Système des
Phagocytes Mononucléés (SPM). Leur durée de vie, in vivo, est donc très réduite.
La présente invention vise précisément à suppléer aux inconvénients précités et à proposer un nouveau matériau pour particules dont la structure polymère dérive de l'association à un polymère apparenté au poly(cyanoacrylate d'alkyle), d'un segment de nature poly- ou oligo- saccharidique, tel le dextrane par exemple.
Des nanoparticules à base de copolymères blocs amphiphiles comportant des segments de dextrane et de pόly(cyanoacrylate d'alkyle) ont déjà été décrites (S.J. Douglas et al. ; Journal of Controlled Release (1986) 15-23). Toutefois, ces copolymères qui dérivent de la polymérisation anionique de monomères cyanoacrylates en présence de dextrane possèdent des structures greffées. En effet, la polymérisation par voie anionique de cyanocrylates d'alkyle en présence de dextrane conduit au greffage de plusieurs chaînes poly(cyanoacrylates) sur la chaîne polymère de dextrane sans qu'il soit par ailleurs possible de contrôler le nombre, la taille et la localisation de ces chaînes poly(cyanoacrylates). Enfin, les particules ainsi formées possèdent en surface une couche interfaciale de dextrane dont la structure globale entraîne la reconnaissance par le système du complément et par les macrophages du SPM.
La présente invention vise pour sa part à proposer des copolymères dérivant de monomères cyanoacrylates ou équivalents et d'oligo- ou poly- saccharides mais possédant une structure totalement différente. C'est ainsi que dans le cadre de la présente invention, les copolymères se présentent sous une forme séquencée, par opposition aux formes greffées décrites ci-dessus. Cette forme séquencée est en fait inaccessible par la voie de polymérisation anionique discutée précédemment. La présente invention vise également à proposer une voie de synthèse pour préparer ce type de copolymères séquences.
Les inventeurs ont ainsi mis en évidence qu'il était possible de polymériser efficacement par voie radicalaire des molécules à forte densité de charge, de type cyanoacrylate, en présence de poly- ou oligo- saccharides et ceci en dépit du fait que l'énergie d'activation nécessaire pour cette polymérisation radicalaire soit bien supérieure à celle nécessitée par la polymérisation anionique. En effet, en raison de leur forte densité de charge, les monomères de type cyanoacrylate ou équivalent sont naturellement enclins à générer leur forme anionique lorsqu'ils sont mis en présence d'un agent nucléophile tels par exemple 5 des anions OH" et donc à polymériser par la voie anionique.
Or, les inventeurs ont mis. en évidence qu'il était possible, d'une part, de ralentir efficacement la manifestation de cette polymérisation notamment à travers le contrôle du pH du milieu de polymérisation et, d'autre part, de privilégier la polymérisation par voie radicalaire. Enfin, i o contre toute attente, la voie de polymérisation radicalaire proposée par les inventeurs s'avère plus rapide que la polymérisation anionique.
En conséquence, la présente invention a pour premier objet un copolymère à structure séquencée composé d'un segment hydrophile de nature saccharidique dont au moins l'une des extrémités est liée à un
15 segment hydrophobe bioérodable de formule générale (I) :
Figure imgf000004_0001
20 dans laquelle :
- X représente un radical CN ou CONHR, - Y représente un radical COOR' ou CONHR", avec R, R' et R" représentant, indépendamment l'un de l'autre, un atome
25 d'hydrogène, un groupement alkyle en C, à C20 linéaire ou ramifié, un groupement alcoxy en C^ à C20 linéaire ou ramifié, un radical acide aminé, un radical acide mono- ou poly- hydroxylé ou un radical aryle ou hétéroaryle en C5 à C12, avec ledit segment de nature saccharidique étant lié soit par l'une de ses
30 extrémités à un unique segment de formule générale (I), soit par chacune de ses deux extrémités, à un segment de formule générale (I), les deux segments hydrophobes étant identiques ou différents.
Dans le segment de formule générale (I), X représente de préférence un radical CN. Plus préférentiellement, Y représente un radical COOR' avec R' tel que défini précédemment.
L'unité répétitive du cyanoacrylate d'isobutyle peut être plus particulièrement citée à titre d'illustration d'une unité susceptible de composer un segment de formule générale (I).
Par structure séquencée, on entend désigner selon l'invention une structure qui dérive de l'établissement d'une liaison covalente entre au moins l'une des extrémités du segment de nature saccharidique et l'une des extrémités de la chaîne polymère de formule générale (I). Sont ainsi du domaine de l'invention, des structures copolymères comprenant soit un unique segment de formule générale (I) lié à une extrémité du segment de nature saccharidique, soit deux segments de formule générale (I), identiques ou différents, liés respectivement de part et d'autre du segment de nature saccharidique. Par opposition aux structures greffées évoquées précédemment, les copolymères revendiqués ne possèdent pas de ramification(s) latérale(s) de nature saccharidique sur le segment hydrophobe, ni de ramification(s) latérale(s) de nature hydrophobe sur le segment de nature saccharidique.
La liaison covalente, établie entre les deux types de segment, est généralement de nature C-C ou C-O-C. De préférence, elle dérive de la polymérisation radicalaire d'au moins une molécule d'un composé de formule (II) :
Figure imgf000005_0001
dans laquelle X et Y sont tels que définis précédemment, en présence d'un poly- ou oligo- saccharide. Cette polymérisation radicalaire est de préférence conduite dans les conditions exposées ci-après pour le procédé revendiqué. En particulier, elle est réalisée à des conditions de pH et d'atmosphère défavorables à la présence et ou à la génération d'anions dans le milieu réactionnel et en présence d'une quantité suffisante en un amorceur radicalaire Redox convenable. Le segment de nature saccharidique dérive d'un oligo- ou poly- saccharide d'origine naturelle ou synthétique, modifié ou non.
On entend par polysaccharide modifié tout polysaccharide ayant subi un changement sur son squelette, comme par exemple l'introduction de fonctions réactives, le greffage d'entités chimiques (molécules, chaînons aliphatiques, chaînes de PEG, etc.). Il existe dans le commerce des polysaccharides modifiés par greffage de la biotine, de composés fluorescents, etc. D'autres polysaccharides greffés avec des chaînes hydrophiles (ex. PEG) ont été décrits dans la littérature. On peut également envisager d'utiliser dans le cadre de la présente invention des polysaccharides modifiés à l'image de ceux décrits dans la référence Jozefowicz and Jozefonvicz, Biomaterials, 18, 1633-1644 (1997). Bien sûr, cette modification ne doit pas affecter la polymérisation du monomère de formule générale (II) en présence de l'oligo- ou poly- saccharide modifié. Selon une variante préférée de l'invention, l'oligo- ou polysaccharide mis en oeuvre selon l'invention peut déjà en soi posséder des propriétés et/ou des activités biologiques. Par exemple, il peut conférer des propriétés anticoagulantes, vaccinantes, de ciblage ou encore de masque pour éviter la capture par les macrophages du SPM. C'est ainsi qu'il peut s'agir :
- d'oligo- ou poly- saccharides présentant des propriétés antigéniques comme par exemple ceux d'origine bactérienne ou virale,
- d'oligo- ou poly- saccharides dotés d'activité biologique comme par exemple l'héparine, les sulfate d'héparane, sulfate de dermatane, sulfate de dextrane et sulfate de pentosane, le dextrane substitué par des groupes carboxyliques et sulfates ou sulfonates, les polysaccharides sulfatés extraits des algues (fucanes et fucoïdanes), les poly(acides sialiques), l'acide hyaluronique sulfaté qui possèdent des activités anticoagulantes, anti-inflammatoires à des degrés variables, et/ou
- d'oligo- ou poly- saccharides intervenant dans les processus de reconnaissance cellulaire et de signalisation cellulaire comme par exemple, les poly(acides sialiques), le sulfate d'héparane, les antigènes des groupes sanguins, les polysaccharides et lipopolysaccharides de diverses souches bactériennes, des chaînes oligosaccharidiques des glycoprotéines membranaires et/ou circulantes, et des chaînes oligosaccharidiques des glycolipides.
Les copolymères dérivant de ce type de polysaccharides s'avèrent bien entendu particulièrement intéressants en terme d'utilisation thérapeutique, dans la mesure où naturellement ils sont dotés d'une activité biologique propre et donc peuvent être utilisés tels quels à ce titre. Les polysaccharides convenant tout particulièrement à l'invention sont ou dérivent du D-glucose (cellulose, amidon, dextrane, cyclodextrine), D-galactose, D-mannose, D-fructose (galactosane, manane, fructosane), fucose (fucane). La majorité de ces polysaccharides contiennent les éléments carbone, oxygène et hydrogène. Les polysaccharides conformes à l'invention peuvent également contenir du soufre et/ou de l'azote. Ils peuvent ainsi dériver de glycoprotéine ou de glycolipide. De même, l'acide hyaluronique (composé d'unités N-acétyle glucosamine et acide glucuronique), le poly(acide sialique) encore dénommé acide colominique ou poly(acide N-acétyineuraminique), le chitosane, la chitine, l'héparine ou l'orosomucoïde contiennent de l'azote, tandis que la gélose, polysaccharide extrait d'algues marines, contient du soufre sous la forme de sulfate acide (>CH-O-SO3H). L'acide chondroitin- sulfurique et l'héparine contiennent simultanément du soufre et de l'azote.
Selon une variante préférée de l'invention, le polysaccharide possède un poids moléculaire supérieur ou égal à 6000 g/mole. Dans le cas particulier du dextrane et de l'amylose (C6H10O5)n, n varie entre 10 et 620 et de préférence entre 33 et 220. Dans le cas de l'acide hyaluronique, la masse molaire varie entre 5 103 et 5 106 g/mole, de préférence entre 5 104 et 2 106 g/mole. Dans le cas du chitosane, la masse molaire varie entre 6 103 et 6 105 g/mole, de préférence entre 6 103 et 15 104 g/mole.
A titre iilustratif des polysaccharides convenant plus particulièrement à l'invention, on peut citer les polydextroses comme le dextrane, le chitosane, le pullulane, l'amidon, l'amylose, les cyclo- dextrines, l'acide hyaluronique, l'héparine, l'amylopectine, la cellulose, la pectine, l'alginate, le curdlan, le fucane, le succinoglycane, la chitine, le xylane, la xanthane, l'arabinane, la carragheenane, l'acide poly(glucuronique), le poly(acide N-acétylneuraminique), l'acide poly- (mannuronique), et leurs dérivés (comme par exemple le sulfate de dextrane, les esters de l'amylose, l'acétate de cellulose, le sulfate de pentosane, etc.).
Dans le cas particulier d'un polysaccharide cyclique à l'image des cyclodextrines, son couplage covalent avec un composé de formule générale (II), lors de la polymérisation radicalaire, a pour effet de provoquer une ouverture du cycle et donc de conduire le polysaccharide à adopter une structure linéaire conforme à l'invention.
Sont plus particulièrement préférés le dextrane, l'héparine, le poly(acide N-acétylneuraminique), l'amylose, le chitosane, la pectine et l'acide hyaluronique, et leurs dérivés. Avantageusement, les copolymères possèdent une teneur en oligo- ou poly- saccharide contrôlée.
Le copolymère revendiqué peut se présenter sous une forme soluble ou sous l'aspect d'un précipité, de micelles ou de particules. Selon un aspect avantageux de l'invention, il se présente sous l'aspect de particules. Il peut s'agir de micro- ou nano- particules. Dans le cas particulier des particules et des micelles, il est vraisemblable que le copolymère possède une structure organisée comme suit : les chaînes de même nature, c'est-à-dire saccharidiques ou hydrophobes, se regroupent entre elles, soit pour constituer la structure cœur de la micelle ou particule, soit la couronne en brosse autour de cette structure cœur. Leur répartition entre la structure cœur et la couronne va bien entendu dépendre de la nature, aqueuse ou organique, du solvant dans lequel sont dispersées les particules ou micelles. Par couronne brosse, on entend désigner une structure dans laquelle les segments constituant la couronne sont liés par l'une de leurs extrémités aux segments constituant le cœur. Leurs extrémités libres constituent la périphérie de la couronne. Ainsi, en milieu aqueux, les segments hydrophobes sont regroupés de manière à constituer le cœur et les segments de nature saccharidique sont disposés en couronne brosse tout autour de ce cœur. Dans un solvant de type organique, cette organisation entre les deux types de segment est inversée : le cœur est de nature hydrophile et donc constitué par les segments de nature saccharidique et la couronne en brosse est de nature hydrophobe et donc constituée par les segments de formule générale (I). Dans le cas des copolymères de structure greffée décrits précédemment, cette structure couronne brosse ne peut exister en milieu aqueux, dans la mesure où plusieurs segments hydrophobes sont liés par liaison covalente à une unique chaîne de nature saccharidique.
Un second aspect de l'invention concerne des particules constituées d'un copolymère conforme à l'invention.
A titre représentatif des particules revendiquées," on peut plus particulièrement citer celles composées d'un copolymère dérivant de la polymérisation du :
- cyanoacrylate d'isohexyle, cyanoacrylate d'isobutyle, cyano- acrylate de N-butyle, cyanoacrylate de N-propyle, cyanoacrylate d'éthyle ou cyanoacrylate de 2-méthoxyéthyle en présence de dextrane, - cyanoacrylate d'isobutyle en présence d'héparine, de chitosane, de pectine, d'acide hyaluronique, de sulfate de dextrane ou de γ-cyclodextrine.
Les particules revendiquées peuvent avoir une taille comprise entre 1 nm et 1 mm et de préférence entre 60 nm et 100 μm.
Généralement, les particules ayant une taille comprise entre 1 et 1000 nm sont alors dénommées nanoparticules. Les particules de taille variant de 1 à plusieurs milliers de microns font référence à des microparticules. Ces particules peuvent dans certains cas se présenter sous une forme agrégée ou micellaire. C'est ainsi que les particules issues de la polymérisation du cyanoacrylate d'isobutyle en présence de γ- cyclodextrine ont un aspect agrégé.
Ces particules peuvent être dotées d'une activité biologique soit en raison de la nature du polysaccharide qui les constitue, soit parce qu'elles incorporent en outre une matière active biologique ou pharmaceutique.
Comme matières actives biologiques, on peut plus particulièrement citer les peptides, les protéines, les carbohydrates, les acides nucléiques, les lipides, les polysaccharides ou leurs mélanges. Il peut également s'agir de molécules organiques ou inorganiques synthétiques qui, administrées in vivo à un animal ou à un patient, sont susceptibles d'induire un effet biologique et/ou de manifester une activité thérapeutique. Il peut ainsi s'agir d'antigènes, d'enzymes, d'hormones, de récepteurs, de peptides, de vitamines, de minéraux et/ou de stéroïdes.
A titre représentatif des médicaments susceptibles d'être incorporés dans ces particules, on peut citer les composés antiinflammatoires, les anesthésiants, les agents chimiothérapeutiques, les immunotoxines, les agents immunosuppresseurs, les stéroïdes, les antibiotiques, les antiviraux, les antifongiques, les antiparasitaires, les substances vaccinantes, les immunomodulateurs et les analgésiques. De même, on peut envisager d'associer à ces matières actives des composés destinés à intervenir au niveau de leur profil de libération.
Par exemple, on peut ajouter dans la composition des particules, des chaînes de PEG, ou de polyester (modifiés ou non), et obtenir ainsi des particules dites composites.
On peut également incorporer dans les particules, des composés à finalité de diagnostic. Il peut ainsi s'agir de substances détectables par rayons X, fluorescence, ultrasons, résonance magnétique nucléaire ou radioactivité. Les particules peuvent ainsi inclure des particules magnétiques, des matériaux radio-opaques (comme par exemple J'air ou le barium) ou des composés fluorescents. Par exemple, les composés fluorescents comme la rhodamine ou le rouge de Nile peuvent être englobés dans des particules à cœur hydrophobe. Alternativement, des émetteurs gamma (par exemple Indium ou Technetium) peuvent y être incorporés. Des composés fluorescents hydrophiles peuvent également être chargés dans les particules, mais avec un rendement moindre comparativement aux composés hydrophobes, du fait de leur affinité plus réduite avec la matrice.
Enfin, on peut associer à ces particules des peptides / protéines susceptibles de les aider à diffuser à travers les membranes biologiques comme le peptide TAT, ou des composés tels que la protéine 2OT (Zonula Occludens Toxine) et la zonuline ou équivalents, ou tout autre promoteur d'absorption.
En l'occurrence, ce type d'association peut être réalisé par fonctionnalisation chimique de la surface polysaccharidique des particules. On peut ainsi envisager de fixer de manière covalente, au niveau de fonctions présentes sur le squelette de nature saccharidique, des ligands spécifiques, tels des agents de ciblage, des marqueurs ou plus généralement tout composé susceptible de conférer auxdites particules une aptitude à réagir avec une espèce externe, comme par exemple une fonction sur un support ou une entité biologique présente dans un milieu considéré.
Des particules magnétiques commercialisées ayant des propriétés de surface contrôlées peuvent être également incorporées dans la matrice des particules ou attachées de manière covalente à l'un de leurs constituants.
La matière active peut être incorporée dans ces particules lors de leur processus de formation ou au contraire être chargée au niveau des particules une fois que celles-ci sont obtenues. Il est ainsi possible de les charger par adsorption ou par greffage covalent.
Les particules selon l'invention peuvent être administrées de différentes façons, par exemple par voies orale, parentérale, oculaire, pulmonaire, nasale, vaginale, cutanée, buccale, etc. La voie orale, non invasive, est une voie de choix. La présente invention a également pour objet l'utilisation des particules à titre de vecteur de principes actifs pharmaceutique, cosmétique, agroalimentaire ou vétérinaire.
Un troisième aspect de la présente invention concerne un procédé de préparation du copolymère revendiqué. Plus précisément, la présente invention vise un procédé utile pour la préparation de copolymères séquences composés d'un segment hydrophile de nature saccharidique dont au moins l'une des extrémités est liée à un segment hydrophobe, caractérisé en ce qu'il comprend la polymérisation par voie radicalaire d'au moins une molécule d'un composé de formule générale (11) :
dans laquelle :
Figure imgf000012_0001
- X représente un radical CN ou CONHR, - Y représente un radical COOR' ou CONHR" avec R, R' et R" représentant, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène, un groupement alkyle en C1 à C20 linéaire ou ramifié, un groupement alcoxy en C, à C20 linéaire ou ramifié, un radical acide aminé, un radical acide mono- ou poly- hydroxylé ou un radical aryle ou hétéroaryle en C5 à C12, ladite polymérisation radicalaire étant réalisée en présence d'au moins une molécule d'un poly- ou oligo- saccharide, dans des conditions de pH et d'atmosphère défavorables à la présence et/ou à la génération d'anions dans le milieu réactionnel et en présence d'une quantité suffisante en un amorceur Redox radicalaire convenable.
De préférence, X représente un radical CN et/ou plus préférentiellement Y représente un radical COOR.
Comme énoncé précédemment, il s'avère possible de privilégier la polymérisation radicalaire, au détriment de la polymérisation anionique naturellement prépondérante, en réalisant notamment la réaction de polymérisation dans des conditions de pH défavorables à la génération d'anions libres, comme par exemple les ions OH".
Pour ce faire, le pH du milieu réactionnel est de préférence ajusté à une valeur inférieure à 2 et plus préférentiellement inférieure à 1,5. De manière surprenante, il est apparu que l'ajustement du pH à une telle valeur ne portait pas préjudice à la vitesse de polymérisation. Contre toute attente et comme il ressort des exemples présents ci-après, la polymérisation radicalaire initiée dans ces conditions de pH s'effectue au contraire à une vitesse supérieure à celle d'une polymérisation anionique. Ceci est notamment illustré par les figures 1 et 2.
Selon une variante préférée de l'invention, la réaction est également réalisée dans des conditions d'atmosphère inerte.
Le solvant est avantageusement choisi de façon à ce que, tout en maintenant des conditions favorables à la polymérisation radicalaire et plus particulièrement à la formation du segment hydrophobe de formule (I), la solubilité de l'oligo ou poly- saccharide soit complète dans le milieu défini par ce solvant.
Dans la mesure où l'on souhaite privilégier la formation du copolymère directement sous la forme de particules ou de micelles, le solvant est également choisi pour être faiblement ou non solubilisant vis- à-vis du copolymère.
De préférence, la molécule de poly- ou oligo- saccharide est choisie parmi le dextrane, l'héparine, le poly(acide N-acétylneuraminique), l'amylose, le chitosane, la pectine et l'acide hyaluronique, et leurs dérivés. 11 est également bien entendu choisi pour demeurer inerte vis-à-vis de la polymérisation.
Avantageusement, un tel solvant est choisi de préférence parmi les solvants aqueux, hydroalcooliques ou hydroacétoniques.
Le solvant choisi est acidifié avec un acide organique ou minéral et de préférence un acide nitrique pour obtenir un pH adéquat au déroulement de la polymérisation radicalaire.
En ce qui concerne les quantités respectives en oligo- ou polysaccharide et monomère de formule générale (II), elles peuvent varier largement. Le procédé revendiqué a précisément pour avantage de permettre un contrôle de la structure du copolymère que l'on souhaite préparer. Les quantités en réactifs introduits sont également fonction de leurs masses moléculaires respectives et de leurs degrés de solubilité dans le milieu réactionnel.
En ce qui concerne l'amorceur Redox, il s'agit généralement de mélanges d'agents oxydants et réducteurs, organiques ou inorganiques, générant des radicaux durant l'étape de transfert électronique. Cette génération de radicaux a pour avantage de nécessiter une énergie d'activation faible contrairement aux amorceurs radicalaires classiques, ce qui permet d'amorcer des polymérisations radicalaires à des températures relativement basses (0-50°C). L'amorceur Redox utilisé comprend de préférence au moins un sel métallique choisi parmi les sels de Ce4+, V5+, Cr6+, Mn3+. Selon une variante préférée de l'invention, il s'agit de Ce4+. Il est généralement introduit sous la forme de nitrate de cérium et d'ammonium. La concentration en initiateur radicalaire est également susceptible d'influencer le déroulement de la polymérisation radicalaire. C'est ainsi que la composition du copolymère et la longueur des séquences respectives du polysaccharide et du polymère de formule générale (I) sont modulables en fonction de la concentration en amorceur. Son ajustement relève des compétences de l'homme de l'art.
En ce qui concerne la température réactionnelle, elle est ajustée à une valeur compatible avec l'amorçage de la polymérisation.
Généralement, cette température est comprise entre 0 et 50°C. En ce qui concerne l'ordre d'introduction des différents réactifs, on procède de préférence à une solubilisation de l'oligo- ou poly- saccharide au sein du solvant choisi, puis à l'ajout de l'amorceur radicalaire Redox. Le monomère de formule (H) est ensuite introduit dans le mélange.
A l'issue du procédé, le copolymère peut être obtenu sous une forme soluble ou sous la forme de micelles, poudres ou particules. De préférence, il est obtenu directement sous la forme de particules. Les particules peuvent être chargées en matières actives soit après leur préparation ou durant leur préparation.
Lorsque le copolymère est obtenu sous la forme d'une poudre, il est bien entendu possible de formuler cette poudre à l'état de particules, en utilisant des techniques de transformation adéquates. A titre illustratif de ces techniques, on peut plus particulièrement mentionner les techniques d'émulsification-évaporation de solvant, d'émulsification- diffusion de solvant ou de nanoprécipitation.
Les particules répondent aux spécificités exposées précédemment. Selon une variante de l'invention, la polymérisation du composé de formule générale (II) est réalisée en présence de la matière active à charger.
A la fin de la polymérisation, on peut procéder si nécessaire à une neutralisation du pH du milieu réactionnel. De préférence, celui-ci est ajusté à une valeur demeurant inférieure ou égale à 7,5, Le copolymère est récupéré par des techniques conventionnelles.
Selon une variante préférée de l'invention, on procède préalablement à l'isolement du copolymère à une complexation du sel métallique résultant de la réaction de l'amorceur radicalaire. Cette complexation qui relève des compétences de l'homme de l'art, permet d'éliminer ces sels métalliques.
Les exemples et figures figurant ci-après sont présentés à titre illustratif et non limitatif de la présente invention.
FIGURES
Figure 1 : Cinétiques de polymérisations radicalaires selon l'invention du cyanoacrylate d'isobutyle en présence de dextrane, de chitosane ou de pectine.
Figure 2 : Cinétiques de référence de polymérisations anioniques du cyanoacrylate d'isobutyle en présence de dextrane ou de chitosane.
Figure 3 : Spectre de résonance paramagnétique électronique (RPE) de copolymères conformes à l'invention de dextrane- poly(cyanoacrylate d'isobutyle) marqué au 4-aminoTEMPO.
MATERIEL ET METHODE
- La taille des particules polymères (diamètre hydrodynamique moyen) est déterminée à l'aide d'un nanosizer (Coulter N4 PLUS®) par diffusion quasi-élastique d'un rayonnement laser. - La charge de surface des particules est déterminée à l'aide d'un
Zétasizer 4 Malvern®. Pour ce faire, les suspensions dextrane- poly(cyanoacrylate d'isobutyle) et héparine-poly(cyanoacrylate d'isobutyle) sont diluées respectivement au 1/200e et 1/30e dans du chlorure de potassium à 1 mmol/l.
EXEMPLE 1 :
Dans un tube en verre de 2 cm de diamètre, 0,1375 g de dextrane 70000 g/mol sont dissous dans 8 ml HNO3 (0,2 mol/l), sous agitation magnétique à 40°C et avec un léger bullage à l'argon. Après 10 minutes, 2 ml de solution acide d'ions cérium (8.10"2 mol/l de cérium IV ammonium nitrate dans HNO3 à 0;2 mol/l) puis 0,5 ml de cyanoacrylate d'isobutyle sont ajoutés. Après 10 minutes, le bullage à l'argon est arrêté et le tube en verre est bouché. Après au moins 40 min, l'agitation est arrêtée et le tube en verre refroidi sous l'eau du robinet. Le pH est ajusté avec NaOH (1 N) pour qu'après l'ajout de 1 ,25 ml de tri sodium citrate dihydrate (1 ,02 mol/l) il arrive directement à une valeur de 7 ± 0,5. Enfin, la suspension est stockée au réfrigérateur.
A ce stade, une suspension de particules polymères colloïdales stables est obtenue. Les' particules de copolymères peuvent alors être purifiées.
La purification des particules de copolymères s'effectue comme suit :
Des boudins à dialyse (Spectra/Por® CE MWCO : 100000) sont régénérés 30 minutes avec de l'eau osmosée, et les suspensions colloïdales passées au vortex puis introduites dans les boudins.
On réalise deux dialyses successives de 1 H30 contre 5 litres d'eau osmosée qui sont suivies d'une autre dialyse d'une nuit contre 5 litres d'eau osmosée. Les suspensions de particules de copolymères ainsi purifiées et contenues dans les boudins à dialyse sont récupérées puis conservées à (+4°C) ou éventuellement séchées par lyophilisation.
La lyophilisation des particules de copolymères s'effectue comme suit :
Les lyophilisations sont effectuées sans addition de cryoprotecteur.
Les suspensions de particules colloïdales sont aliquotées dans des pilϋliers puis congelées (-18°C). La lyophilisation (Bioblock Scientific Christ alpha 1-4) est réalisée pendant 48 heures. Les lyophilisats (poudres blanches) sont conservés au réfrigérateur.
Reconstitution des particules :
Pour reconstituer la dispersion de particules à partir du lyophilisât, une masse déterminée de lyophilisât est dispersée dans un volume connu d'eau MilliQ® afin que le rapport masse de lyophilisat/volume d'eau soit de 1 %. La suspension est homogénéisée à l'aide d'un vortex à la vitesse maximale puis par des ultrasons pendant quelques minutes à l'aide d'un sonicateur (Branson 5200®).
EXEMPLE 2 :
Le même protocole que celui décrit en exemple 1 est reproduit en utilisant à la place du dextrane 70000 g/mol l'un des polysaccharides suivants :
- 0,1375 g d'héparine ; - 0,0230 g de chitosane ;
- 0,0230 g de pectine ;
- une quantité soluble d'acide hyaluronique dans 8 ml HNO3 (0,2 mol/l) ;
- 0,1375 g de sulfate de dextrane de masse moléculaire (6-8000, 10000, 40000, 50000 ou 500000 g/mol) ; - 0,1375 g de γ-cyclodextrine ; ou
- 0,1375 g de dextrane 15-20000 g/mol.
EXEMPLE 3 : Le protocole de l'exemple 1 est reproduit en substituant au cyanoacrylate d'isobutyle, l'un des monomères suivants :
- le cyanoacrylate d'isohexyle,
- le cyanoacrylate de N-butyle, .
- le cyanoacrylate de N-propyle, - le cyanoacrylate d'éthyle, ou
- le cyanoacrylate de 2-méthoxyéthyle.
EXEMPLE 4 :
CARACTÉRISATION PHYSIQUE DES PARTICULES : Les copolymères obtenus en exemples 1 , 2 et 3 sont caractérisés, en termes de taille, de stabilité et de charge.
Taille des suspensions :
Les suspensions ont été préalablement diluées avec de l'eau illiCΛ
Le tableau 1 ci-après récapitule les tailles des particules des différentes suspensions particulaires élaborées.
La stabilité des suspensions obtenues a été évaluée en fonction de la taille des particules au cours du temps. Les résultats obtenus figurent dans le tableau 2 ci-après. Tableau 1
Figure imgf000020_0001
* : masse de polysaccharide solubilisée dans 8 ml d'acide nitrique 0,2 mol/l. ** : masse soluble dans 8 ml d'acide nitrique à 0,2 mol/l. Les écarts types représentent la répétabilité des mesures.
Tableau 2
Figure imgf000021_0001
T0 : jour de la préparation.
Les écarts types représentent la répétabilité des mesures.
Potentiel Zêta :
Le tableau 3 ci-après rend compte des résultats obtenus.
Tableau 3
Figure imgf000022_0001
On note que le potentiel Zêta obtenu avec les particules Héparine- poly(cyanoacrylate d'isobutyle) est plus éloigné de la neutralité que celui obtenu avec les particules Dextrane-poIy(cyanoacrylate d'isobutyle).
Ces résultats reproduisent donc la différence de charge naturelle entre l'héparine et le dextrane. A l'évidence, le polysaccharide présent dans chacune des deux types de particules est localisé à la surface de celles-ci.
EXEMPLE 5 : CARACTÉRISATIQN DE LA TENEUR EN COPOLYMÈRE DES
SUSPENSIONS ET COMPOSITION DES COPOLYMÈRES :
La teneur en polymère des suspensions est déterminée par l'évaluation du poids du résidu sec obtenu après lyophilisation d'une quantité connue de suspension purifiée par dialyse. Pour se faire, un aliquote de suspension purifiée préparée selon l'exemple 1 ou 2 est pesé avec précision dans un pillulier puis congelé à (-18°C) avant lyophilisation pendant 48H dans un lyophilisateur Christ Alpha 1-4 (Bioblock Scientific). La masse de lyophilisât est pesée puis ramenée à la masse de suspension initiale. La suspension de copolymère dextrane-poly(cyanoacry!ate d'isobutyle) obtenue selon l'exemple 1 contient 3,1 ± 0,4 % de copolymère (masse/masse).
La suspension de copolymère héparine-poIy(cyanoacrylate d'isobutyle) obtenue selon l'exemple 2 contient 2,4 ± 0,7 % de copolymère (masse/masse).
La composition des copolymères est évaluée par analyse élémentaire des poudres obtenues par lyophilisation des suspensions purifiées comme indiqué ci-dessus. Le copolymère dextrane- poly(cyanoacrylate d'isobutyle) obtenu selon l'exemple 1 contient 20%
(masse/masse) de dextrane.
EXEMPLE 6 : CINÉTIQUE DE POLYMÉRISATION
Matériel et appareillage :
- Spectromètre de type « PC2000 Plug-in » (Océan Optics Europe) inséré dans un ordinateur de type PC, une Source lumineuse HL-2000-LL (Océan Optics Europe), des Fibres optiques (200 et 100 μm) (Top sensor Systems FC-UV, Océan Optics Europe) et un Logiciel OOI Base V 1.5 (Océan Optics Europe).
- Tube en verre à fond rond de 2 cm de diamètre pour réaliser la polymérisation.
- Bague en téflon ® avec des trous à 0°, 90° et 180°. La taille des trous est ajustée pour servir de support aux fibres optiques et la taille de la bague en téflon ® est ajustée au tube en verre dans lequel sera réalisée la polymérisation. Les fibres optiques sont montées sur la bague en position 0° et 180° pour des mesures d'absorbance. Dans cet essai a été suivie la cinétique de polymérisation radicalaire du cyanoacrylate d'isobutyle en présence de dextrane, chitosane ou de pectine.
La polymérisation est réalisée selon le protocole décrit dans les exemples 1 à 3 dans le tube en verre de 2 cm de diamètre placé dans un bain marie à 40°C et sur lequel est montée la bague en téflon ® supportant les fibres optiques reliées au spectromètre et à la source lumineuse. Le bullage à l'argon est placé de façon à ne pas perturber l'acquisition des mesures. Le bruit de fond du spectromètre est enregistré avant l'introduction de la solution acide d'ions cérium IV (8.10"2 mol/l de cérium ammonium nitrate dans HNO3 à 0,2 mol/l). La référence est enregistrée après l'addition de la solution acide d'ions cérium IV (8.10"2 mol/l de cérium ammonium nitrate dans HNO3 à 0,2 mol/l). L'enregistrement de la cinétique de polymérisation est démarré dès l'addition des 0,5 ml de monomère. Elle s'effectue par l'acquisition quasi- instantanée d'un spectre d'absorbance sur une large gamme de longueur d'onde (400 - 800 nm) toutes les 30 secondes pendant 50 min. Les absorbances mesurées à la longueur d'onde de 650 nm sont retenues pour tracer des courbes d'absorbance en fonction du temps reflétant ainsi la cinétique de polymérisation.
Les résultats sont présentés en figure 1.
En figure 2 est rendue compte à titre comparatif la cinétique d'une polymérisation anionique réalisée avec le même monomère en présence de dextrane ou de chitosane mais en l'absence de l'amorceur redox responsable de la polymérisation radicalaire.
On note que le démarrage de la polymérisation anionique est retardé comparativement à la polymérisation radicalaire.
EXEMPLE 7 : Cet exemple illustre la synthèse de particules dextrane- polycyanoacrylate d'isobutyle à une échelle plus importante. Dans un ballon rodé de 50 ml à fond plat, 0,6875 g de dextrane 70000 g/mol sont dissous dans 40 ml d'acide nitrique 0,2 mol/l sous agitation magnétique, à 40°C et sous léger bullage d'argon pendant 10 min. Une solution acide d'ions cérium (10 ml) (8.10'2 mol/l de cérium IV ammonium nitrate dans l'acide nitrique 0,2 mol/l) puis 2,5 ml de cyanoacrylate d'isobutyle sont alors ajoutés et maintenus sous agitation forte et bullage d'argon pendant encore 10 min. Le bullage d'argon est arrêté et le ballon est bouché. La réaction est poursuivie sous agitation à 40°C pendant 50 min. La réaction est arrêtée et le ballon est refroidi sous l'eau du robinet. Le pH est ajusté avec NaOH (1N) pour qu'après l'ajout de 6,25 ml de tri sodium citrate dihydrate (1 ,02 mol/l) il arrive directement à une valeur de 7 ± 0,5. Le diamètre hydrodynamique moyen des particules de copolymères obtenues est de 291 ± 1 nm.
EXEMPLE 8 :
Cet exemple illustre la synthèse de particules dextrane- polycyanoacrylate d'isobutyle selon des conditions expérimentales simplifiées.
Dans un flacon à vis de 20 ml, 0,1375 g de dextrane 70000 g/mol sont dissous dans 8 ml HNO3 (0,2 mol/l), sous agitation magnétique à 20°C. Après 10 minutes, 2 ml de solution acide d'ions cérium (8.10"2 mol/l de cérium IV ammonium nitrate dans HNO3 à 0,2 mol/l) puis 0,5 ml de cyanoacrylate d'isobutyle sont ajoutés. Après 60 minutes, l'agitation est arrêtée. Le pH est ajusté avec NaOH (1N) pour qu'après l'ajout de 1 ,25 ml de tri sodium citrate dihydrate (1,02 mol/l) il arrive directement à une valeur de 7 ± 0,5. Le diamètre hydrodynamique moyen des particules de copolymères obtenues est de 393 ± 5 nm. .EXEMPLE 9 :
ÉVALUATION DE L'ACTIVITÉ BIOLOGIQUE ANTICOAGULANTE RÉSIDUELLE DE L'HÉPARINE DU COPOLYMÈRE HÉPAR1NE- POLYfCYANOACRYLATE D'ISOBUTYLE :
L'activité anticoagulante de l'héparine du copolymère héparine- poly(cyanoacrylate d'isobutyle) est évaluée par la mesure du temps de céphaline activé (TCA) ou activité anti-lla et par la mesure de l'activité anti-Xa produit par les particules constituées dudit copolymère synthétisé selon l'exemple 2.
Mesure de l'activité anti-lla :
Du plasma normal congelé est décongelé au bain marie à 37°C puis placé dans un bac à glace. Le réactif APTT (Organon Teknica
Corporation, Fresnes, France) est régénéré avec 3 ml d'eau stérile. Une solution de CaCI2 1/40 mol/l est préparée dans du tampon Owren-Koller
(TOK) (Diagnostic Stago).
Préparation des échantillons :
Une gamme d'étalonnage de la méthode est réalisée avec la même héparine que celle utilisée pour la synthèse du copolymère. Une solution mère à 1700 U.l./ml est préparée dans le tampon TOK puis diluée dans ce même tampon pour donner des solutions à 0,17 ; 0,85 ; 1 ,7 ; 4,25 et 8,5 U.l./ml. 100 μl de chacune des dilutions sont eux-mêmes dilués dans 900 μl de plasma normal. Les suspensions de particules de copolymères sont également diluées dans le TOK au 1/100e et au 1/200Θ. 100 μl de chacune des dilutions de la suspension sont eux-mêmes dilués dans 900 μl de plasma normal.
Un témoin de coagulation est constitué de 100 μl de TOK et 900μl de plasma normal. Mesure des temps de coagulation :
Une bille est placée dans chacune des cuves du coagulomètre ST4 (Diagnostica Stago) puis 100μl d'un des échantillons préparés dans l'étape précédente et 100μl de la solution d'APTT sont introduits dans les différentes cuves. Après 300 secondes d'incubation à 37°C, 100 μl de la solution de chlorure de calcium sont ajoutés. Le coagulomètre mesure les temps de coagulation des différents échantillons en seconde. Les résultats obtenus pour les solutions étalons d'héparine permettent d'établir une courbe d'étalonnage donnant l'activité de la solution d'héparine exprimée en U.l./ml en fonction du temps de coagulation exprimé en seconde. L'activité de l'héparine associée aux particules de copolymère est évaluée sur la courbe d'étalonnage à partir des temps de coagulation mesurés pour les suspensions.
Ainsi, la suspension contenant des particules de copolymères d'héparine-poly(cyanoacrylate d'isobutyle) préparées selon l'exemple 2 présentent une activité anti-lla de 329 + 28 U.l./ml.
Mesure de l'activité anti-Xa :
La suspension de particules de copolymère est diluée au 1/50e, au 1/100e et au 1/2008 dans le tampon TOK puis au 1/10e dans le plasma normal décongelé comme indiqué précédemment. Les temps de coagulation sont évalués automatiquement sur un coagulomère ST1
(Diagnostica Stago) de manière automatique.
L'activité anti-Xa de la suspension de particules des copolymères Héparine-poly(cyanoacrylate d'isobutyle) est de 408 ± 50 U.l./ml. EXEMPLE 10 :
GREFFAGE D'UN MARQUEUR SUR DES PARTICULES DE COPOLYMÈRES :
Une suspension non purifiée par dialyse de particules de copolymères est préparée selon l'exemple 2 avec du dextrane 15-20000 g/mol. La suspension est filtrée sur un filtre de 1 ,2 μm (Millipore® SLA PO 2550) puis purifiée par 2 dialyses de 2 heures contre 11 d'eau osmosée suivie d'une dialyse de 2 heures contre 11 de tampon phosphate (Sigma réf. P 3813) (membrane de dialyse : Spectra/Por® CE MWCO : 100000 régénérée 30 min dans de l'eau osmosée).
Pour le greffage, 0,0270 g de 1 ,1'-carbonyldiimidazole (Sigma réf. C-7625) et 0,0113 g de 4-amino TEMPO (Aldrich) sont introduits dans un flacon à vis de 20 ml muni d'un bouchon. Ces produits sont dissous dans 0,5 ml de tampon phosphate sous agitation. A ce mélange, 3 ml de la suspension purifiée de particules de copolymères sont ajoutés. L'ensemble est maintenu sous agitation magnétique à température ambiante pendant 48 heures. Après la réaction, les excès de réactifs et les sous-produits de réaction sont éliminés par dialyse. La suspension est placée dans un boudin de dialyse (Spectra/Por® CE MWCO : 100000) préalablement régénéré 30 min avec de l'eau osmosée puis dialysée 3 fois contre 1 I de tampon phosphate pendant 2 heures. Les suspensions de particules greffées sont récupérées et peuvent être conservées à (+4°C).
Le greffage du marqueur peut être mis en évidence par spectroscopie de résonance paramagnétique électronique (RPE). Pour ce faire, la suspension obtenue est placée dans une cellule de mesure d'un spectromètre Varian E-4 EPR. Le spectre obtenu présenté sur la figure 3 indique que le 4-amino TEMPO a bien été greffé sur les chaînes de dextrane du copolymère formant les particules et qu'il est animé de mouvements lents pour 81 % et de mouvements rapides pour 19 % selon la simulation de Kivelson (Kivelson D. J., Journal Chem. Phys ; 1960 ; 33 ; 1107).

Claims

REVENDICATIONS
1. Copolymère à structure séquencée composé d'un segment hydrophile de nature saccharidique et au moins un segment hydrophobe bioérodable de formule générale (I) :
Figure imgf000030_0001
dans laquelle :
- X représente un radical CN ou CONHR,
- Y représente un radical COOR' ou CONHR" avec R, R' et R" représentant, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène, un groupement alkyle en C, à C20 linéaire ou ramifié, un groupement alcoxy en C, à C20 linéaire ou ramifié, un radical acide aminé, un radical acide mono- ou poly- hydroxylé ou un radical aryle ou hétéroaryle en C5 à C12, avec ledit segment de nature saccharidique étant lié soit par l'une de ses extrémités à un unique segment de formule générale (I), soit par chacune de ses deux extrémités, à un segment de formule générale (l), les deux segments hydrophobes étant identiques ou différents.
2. Copolymère selon la revendication 1 , caractérisé en ce que X représente en formule générale (I) un radical CN.
3. Copolymère selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que Y représente en formule générale (I) COOR' avec R' tel que défini en revendication 1.
4. Copolymère selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le segment de nature saccharidique dérive d'un oligo- ou poly- saccharide naturel ou synthétique, modifié ou non.
5 5. Copolymère selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'oligo- ou poly- saccharide possède des propriétés et/ou des activités biologiques.
6. Copolymère selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en o ce que l'oligo- ou poly- saccharide est choisi parmi les polydextroses comme le dextrane, le chitosane, le pullulane, l'amidon, l'amylose, les cyclodextrines, l'acide hyaluronique, l'héparine, l'amylopectine, la cellulose, la pectine, l'alginate, le curdlan, le fucane, le succinoglycane, la chitine, le xylane, la xanthane, l'arabinane, la carragheenane, l'acide poly(glucuronique), le poly(acide N-acétylneuraminique), l'acide poly(mannuronique) et leurs dérivés.
7. Copolymère selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il s'agit de dextrane, d'héparine, de poly(acide N-acétylneuraminique), 0 d'amylose, de chitosane, de pectine, d'acide hyaluronique, ou un de leurs dérivés.
8. Copolymère selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il est obtenu par polymérisation radicalaire d'au moins une molécule 5 d'un composé de formule générale (II) :
Figure imgf000031_0001
dans laquelle X et Y sont tels que définis en revendication 1 , 2 ou 3, en o présence d'un poly- ou oligo- saccharide.
9. Copolymère selon la revendication 8, caractérisé en ce que la polymérisation radicalaire est réalisée à des conditions de pH et d'atmosphère défavorables à la présence et/ou à la génération d'anions dans le milieu réactionnel et en présence d'une quantité suffisante en un amorceur radicalaire Redox convenable.
10. Copolymère selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il se présente sous l'aspect de particules.
11. Particule caractérisée en ce qu'elle est constituée d'un copolymère selon l'une des revendications 1 à 9.
12. Particule selon la revendication 11 , caractérisée en ce qu'elle est composée d'un copolymère dérivant de la polymérisation du : - cyanoacrylate d'isohexyle, cyanoacrylate d'isobutyle, cyanoacrylate de N-butyle, cyanoacrylate de N-propyle, cyanoacrylate d'éthyle ou cyanoacrylate de 2-méthoxyéthyle en présence de dextrane, ou
- cyanoacrylate d'isobutyle en présence d'héparine, de chitosane de pectine, d'acide hyaluronique, de sulfate de dextrane ou de γ-cyclodextrine.
13. Particule selon la revendication 11 ou 12, caractérisée en ce qu'elle présente une taille comprise entre 1 nm et 1 mm.
14. Particule selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisée en ce qu'elle incorpore une matière biologique ou pharmaceutique.
15. Utilisation de particules selon l'une des revendications 1 1 à 14, à titre de vecteur de principes actifs pharmaceutique, agroalimentaire, cosmétique pu vétérinaire.
16. Procédé utile pour la préparation de copolymères séquences composés d'un segment hydrophile de nature saccharidique dont au moins l'une des extrémités est liée à un segment hydrophobe, caractérisé en ce qu'il comprend la polymérisation par voie radicalaire d'au moins une molécule d'un composé de formule générale (II) :
Figure imgf000033_0001
dans laquelle : - X représente un radical CN, ou CONHR, - Y représente un radical COOR' ou CONHR" avec R, R' et R" représentant, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène, un groupement alkyle en C1 à C20 linéaire ou ramifié, un groupement alcoxy en C, à C20 linéaire ou ramifié, un radical acide aminé, un radical acide mono- ou poly- hydroxylé ou un radical aryle ou hétéroaryle en C5 à C12, ladite polymérisation radicalaire étant réalisée en présence d'au moins une molécule d'un poly- ou oligo-saccharide, dans des conditions de pH et d'atmosphère défavorables à la présence et/ou à la génération d'anions dans le milieu réactionnel et en présence d'une quantité suffisante en un amorceur Redox radicalaire convenable.
17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que dans le dérivé de formule (II), X représente un radical CN et/ou Y représente un radical COOR' avec R' tel que défini en revendication 16.
18. Procédé selon la revendication 16 ou 17, caractérisé en ce que la polymérisation radicalaire est réalisée à un pH inférieur à 2 et de préférence inférieure à 1 ,5.
19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, caractérisé en ce que la polymérisation radicalaire est réalisée dans un solvant dans lequel l'oligo- ou poly- saccharide est sous forme soluble et le copolymère attendu, faiblement ou non soluble.
20. Procédé selon l'une des revendications 16 à 19, caractérisé en ce que la molécule de poly- ou oligo- saccharide est choisie parmi le dextrane, l'héparine, le poly(acide N-acétylneuraminique), l'amylose, le chitosane, la pectine et l'acide hyaluronique, et leurs dérivés.
21. Procédé selon l'une des revendications 16 à 20, caractérisé en ce que l'amorceur radicalaire Redox comprend au moins un sel métallique choisi parmi les sels de Ce4+, V5+, Cr6+, Mn3+ et de préférence un sel métallique de Ce4+.
22. Procédé selon l'une des revendications 16 à 21 , caractérisé en ce que l'on solubilise le poly- ou oligo- saccharide au sein du solvant, on ajoute l'amorceur radicalaire Redox puis le monomère de formule générale (II).
23. Procédé selon l'une des revendications 16 à 22, caractérisé en ce que la polymérisation est réalisée en présence d'une matière active à charger dans lesdites particules.
24. Procédé selon l'une des revendications 16 à 23, caractérisé en ce que le copolymère est isolé du milieu réactionnel après neutralisation du pH du milieu réactionnel.
25. Procédé selon l'une des revendications 16 à 24, caractérisé en ce qu'on procède préalablement à l'isolement du copolymère à une complexation du sel métallique résultant de la réaction de l'amorceur radicalaire.
26. Procédé selon l'une des revendications 16 à 25, caractérisé en ce que le copolymère est obtenu sous la forme de particules, d'agrégats et/ou micelles.
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