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WO2001097791A2 - Utilisation d'acides en c4-c10 pour la prévention des infections a bactéries a gram négatif - Google Patents

Utilisation d'acides en c4-c10 pour la prévention des infections a bactéries a gram négatif Download PDF

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WO2001097791A2
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Michel Yvan Popoff
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Definitions

  • the present invention relates to the use of C 4 -C ⁇ acids for the prevention of infections with Gram negative bacteria, in particular with Salmonella, both in animals and in humans.
  • Salmonella are enteroinvasive bacteria pathogenic for humans and animals.
  • iagA Transcription of iagA requires the production of two derepressants, SprA (or HilC or SirC) and HilD, which are encoded by SPI-1 genes and are part of the AraC / XylS family (Eichelberg et al., 1999, Mol. MicrobioL, 1999, 33, 139-152; Schechter et al., Mol. MicrobioL, 1999, 32, 629-642).
  • the transcription of iagA is also controlled directly or indirectly by two two-component systems, RcsB-RcsC and PhoP-PhoQ, which are not coded by genes located at centisome 63.
  • the RcsB-RcsC system responds to osmolarity (Arricau et al., Mol. MicrobioL, 1998, 29, 835-850) and the Phop-PhoQ system for the concentration of divalent cations such as calcium and magnesium ions (Garcia Véscoci et al., Cell, 1996, 84, 165- 174; Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 5054-5058) of the environmental medium.
  • divalent cations such as calcium and magnesium ions
  • the PhoP-PhoQ and RcsB-RcsC systems suppress directly or indirectly the expression of iagA.
  • the genes coding for the components and targets of the Inv-Spa-Prg secretion apparatus are not expressed, the Salmonella are unable to enter the epithelial cells in culture.
  • the PhoP-PhoQ and RcsB-RcsC systems no longer repress the expression of iagA.
  • Sip proteins are also synthesized, but they remain stored in the cytoplasmic compartment because the secretion apparatus is inactive.
  • the activity of the secretory apparatus will be triggered by contact with the epithelial cell (Galan, 1996).
  • the Sip proteins will be secreted and form a translocator, which will be used to inject the effector proteins, including StpA and AvrA, into the cytosol of the target cell.
  • These effector proteins then activate different signaling pathways, leading to a variety of cellular responses and ultimately the entry of Salmonella into the cell.
  • these two conditions osmolarity and high concentration of divalent cations
  • Salmonella is then very greatly reduced (Bajaj et al, Mol. MicrobioL, 1996, 22, 703-714). In fact, Salmonella cultured in a medium with low osmolarity or with a low concentration of divalent cations are incapable of penetrating into the epithelial cells in culture. All the data reported above shows that the expression of the entry phenotype in Salmonella is very finely controlled by regulators acting in cascade (all are probably not identified) depending on the environmental conditions. If one interferes with only one of these regulators, then this should result in a non-invasive phenotype.
  • Salmonella therefore always constitutes a major public health problem.
  • Epidemiological studies have clearly shown that this resurgence of salmonellosis (except in the case of typhoid fever, which is a strictly human disease) was due to the consumption of animal products contaminated with Salmonella.
  • S. enteritidis which has caused a global epidemic.
  • the source of contamination by S. enteritidis has been fully identified. These were eggs and egg products.
  • lauric acid for example, which is a saturated fatty acid whose chain is formed by 12 carbon atoms, has bactericidal activity in vitro on S. typhi, Vibrio cholerae, and Shigella sonnei at a concentration of 0.25 g / 1.
  • caprylic acid has no bacteriostatic or bactericidal effect on Gram-positive or Gram-negative bacteria, while other fatty acids with a more saturated carbon chain long, in particular from 12 carbon atoms such as lauric acid or certain unsaturated fatty acids such as for example linoleic acid and oleic acid, are very effective (Kabara et al., Antimicrob. Agents Chemother, 1972, 2, 23-31).
  • fatty acids such as, for example, n-hexanoic, caprylic and decanoic acids exhibit, at acidic pH, bactericidal activity on a wide variety of Gram-positive or negative microorganisms and make it possible to treat different types of 'infections (US patents 4,489,097 and US 4,406,884, patent application EP 0 021 504). These documents specify however that to be effective, these acids must be used at acidic pH to be in the form of free acid.
  • bacteriostatic or bactericidal activity of fatty acids is linked to the length of the carbon chain and to the number of unsaturations which it carries, the most important activity being attributed to fatty acids containing at least 12 atoms of carbon and preferably one or two unsaturations.
  • a subject of the present invention is therefore the use of an effective amount of at least one compound of formula (I) below:
  • R, -COO-R 2 in which: - Ri represents a saturated C 4 -C carbon chain, optionally substituted by one or more hydroxyl or amino functions or by an aromatic ring; - R represents a hydrogen atom; a monovalent alkali metal atom; an alkyl radical; it being understood that when R represents a hydrogen atom and that Ri represents a saturated C 7 carbon chain substituted by an a ine function, then said amine function is not in position 2 or 8; as active ingredient, for the preparation of a pharmaceutical composition having a neutral pH intended to prevent infections with Gram-negative bacteria, in humans or in animals.
  • active principle for the preparation of a pharmaceutical composition having a neutral pH intended to prevent infections with Gram negative bacteria and in particular with Salmonella, both in humans and in animals.
  • the compounds of formula (I) above can therefore be in the form of an acid, a salt or an ester.
  • the inventors have in particular demonstrated that the preventive administration of a composition having a neutral pH and containing at least sodium caprylate to mice subsequently infected with three major Salmonella serotypes makes it possible to considerably reduce the level of splenic colonization by these bacteria. whereas this composition does not exhibit bactericidal activity at such a pH
  • the pH of the pharmaceutical composition used is preferably between 6.5 and 7.5 and even more preferably between 7.1 and 7.4.
  • a pH value which is particularly well suited to the use in accordance with the invention is between 7.2 and 7.3.
  • radical Ri of the compounds of formula (I) represents a carbon chain substituted by a hydroxyl function
  • said hydroxyl function is in position 2 when the radical Ri contains from 4 to 6 carbon atoms and in position 2 or 8 when the radical Ri contains from 7 to 9 carbon atoms.
  • caprylic acid which corresponds to a compound of formula (I) in which Ri represents a saturated C 7 carbon chain
  • Ri represents a saturated C 7 carbon chain
  • its derivatives hydroxylated in position 2 or 8 their salts and their esters are particularly preferred.
  • caprylic acid used at a neutral pH unexpectedly makes it possible to prevent Salmonella infections, while at such a pH value, this acid does not exhibit any bactericidal activity.
  • the alkali metal atoms defined for the radical R are preferably chosen from sodium and potassium.
  • the alkyl radicals defined for the radical R are preferably chosen from C ⁇ -C 4 alkyl radicals, among which very particularly preferred are methyl, ethyl and butyl radicals.
  • sodium caprylate is used, that is to say a compound of formula (I) in which R [represents a carbon chain saturated with C and R 2 represents an atom of sodium.
  • the effective amount of compound (s) of formula (I) preferably corresponds to unit doses of between 20 mM and 200 mM, and even more preferably between 50 mM and 100 mM.
  • composition used in accordance with the invention may also contain one or more additional active ingredients.
  • the compounds of formula (I) used in accordance with the invention can of course be formulated in an acceptable pharmaceutical vehicle consisting of one or more excipients conventionally used for the preparation of pharmaceutical compositions, such as anti-caking agents, anti- oxidants, colorants, vitamins, mineral salts, taste modifiers, smoothing agents, mounting agents, insulation agents and, in general, any excipient conventionally used in the pharmaceutical industry.
  • excipients conventionally used for the preparation of pharmaceutical compositions, such as anti-caking agents, anti- oxidants, colorants, vitamins, mineral salts, taste modifiers, smoothing agents, mounting agents, insulation agents and, in general, any excipient conventionally used in the pharmaceutical industry.
  • the pharmaceutical composition used according to the present invention is preferably administered orally and can be in various forms, such as in the form of tablets, capsules, oral suspensions, tablets or in any other form suitable for the mode of administration. oral.
  • the pharmaceutical composition used according to the present invention can in particular be added to drinking water and / or to feeds distributed to farm animals (poultry, cattle, pigs, sheep, etc.) so as to reduce the incidence infections with Gram negative bacteria and in particular with Salmonella and limit carriage, and thus reduce the risk of subsequent contamination of humans.
  • farm animals proultry, cattle, pigs, sheep, etc.
  • the pharmaceutical composition used according to the present invention can also be administered to humans as a preventive medicine in order to reduce the risk of infection in people spending limited stays in a region with a high endemic, in particular of salmonellosis.
  • the pharmaceutical composition used according to the present invention can also be used in humans to stop or slow down an epidemic of typhoid fever.
  • the invention also comprises other provisions which will emerge from the description which follows, which refers to an example of demonstration of the activity of sodium caprylate in the prevention of salmonellosis in mice (example 1), to a comparative study of the effect of certain fatty acids on the expression of the invasion genes (example 2), as well as to the appended figures, in which:
  • FIG. 1 shows the effect of the concentration of Ca 2+ ions on the expression of the iagA '-lacZ, invF'-lacZ and sipB' -lacZ fusions;
  • FIG. 2 shows the effect of the concentration of sodium benzoate on the expression of the iagA '-lacZ, invF'-lacZ and sipB' -lacZ fusions
  • FIG. 3 shows the effect of the concentration of sodium caprylate on the expression of the iagA '-lacZ, invF'-lacZ and sipB' -lacZ fusions
  • TCS trypto-casein-soy broth
  • the original standard LB medium contains 170 mM NaCl and 850 ⁇
  • the favorable LB medium (high osmolarity and concentration of Ca2 + ions) was defined as being the standard LB medium modified so as to have a final concentration of 300 mM in NaCl and 5 mM in Ca2 +.
  • the unfavorable LB medium (high osmolarity and low concentration of Ca2 + ions) has been defined as being the standard LB medium modified so as to have a final concentration of 300 mM in NaCl and is added with 1 mM of ethylene glycol bis- ( ⁇ -aminoethyl ether) -N, N, N ', N'-tetraacetic (EGTA) so as to create a depletion of the medium in divalent cations.
  • EGTA ethylene glycol bis- ( ⁇ -aminoethyl ether) -N, N, N ', N'-tetraacetic
  • a "Biotype 100” ® plate sold by the company BioMérieux is made up of 100 microcupules. Each microcupule contains a dehydrated carbon substrate, with the exception of the first well which is a control without substrate (the amount of dehydrated substrate per well is not given by the manufacturer).
  • the "Biotype 100" ® plate makes it possible to study the nutritional capacity of a bacterial strain on 99 different sources of carbon (auxanogram).
  • strain S. typhi Ty267 which is a derivative of the parental strain Ty2 carrying the transcriptional fusion iagA '-lacZcat (Table I), was cultivated in TCS broth for 18 hours at 37 ° C. with shaking (200 turns / min). This culture was then diluted 1/100 in favorable LB medium
  • this suspension was used immediately to inoculate the 100 wells of a "Biotype 100" ® plate at the rate of 450 ⁇ l of suspension per well.
  • mice By comparing the value of the ⁇ -galactosidase activity measured in a well containing a carbonaceous substrate to that of the control well without substrate, it was thus possible to determine whether a substrate had no effect on, activated or repressed the expression of the iagA '-lacZcat merger.
  • I-d Experimental infection of mice
  • mice The female C57B1 / 6 mice, 5-6 weeks old, used for this experiment, came from the IFF A-CREDO breeding center (L'Arbresle, France).
  • mice had unlimited access to drinking water, the composition of which is given for each experiment.
  • mice Seven days after infection (D + 7), the spleens of the mice thus infected were removed and homogenized separately in 1 ml of physiological water containing 0.7% NaCl.
  • the number of viable bacteria per spleen was determined by plating dilutions of the homogenate on TCS agar.
  • mice were infected as indicated above and the mortality of the animals was recorded for 21 days.
  • aromatic acids In addition to caprylic acid, aromatic acids have been studied in order to compare their properties to those of caprylic acid.
  • the aromatic acids studied were the following: benzoic acid, phenylacetic acid, 3-phenylpropionic acid and 4-phenylbutyric acid.
  • aromatic acids and caprylic acid come from the company Sigma. They were all used in the form of their sodium salt and at a pH between 7.2 and 7.3.
  • the aim of this preliminary step was to demonstrate that lacZ transcriptional fusions could be used for the search for environmental conditions repressing the expression of the genes present on the SPI-1 pathogenicity island.
  • the S. typhi Ty267, Ty272 and Ty277 strains which carry respectively the iagA '-lacZ, invF'-lacZ and sipB'-lacZ (see Table I) fusions were cultured in favorable LB or unfavorable LB medium.
  • the S. typhi strains Ty267 (iagA'-lacZ), Ty272 (invF'-lacZ) and Ty277 (sipB'-lacZ) were cultured in LB medium containing 300 mM NaCl and 5 mM CaCl (representation by a square) or 300 mM NaCl and 1 mM EGTA (representation by a diamond).
  • strain S. typhi Ty267 (fusion iagA '-lacZ), suspended in favorable LB medium, was used to inoculate the "Biotype 100" ® plates.
  • the ⁇ -galactosidase activity expressed by the iagA '-lacZ fusion was determined for the culture in each well. Compared to the ⁇ -galactosidase activity measured in the control cup without substrate (11250 ⁇ -galactosidase units), no substrate led to an increase in the expression of the iagA '-lacZ fusion.
  • the S. typhi Ty267, Ty272 and Ty277 strains were seeded in favorable LB medium and in favorable LB medium containing different concentrations of sodium benzoate or sodium caprylate.
  • the square-shaped symbols correspond to the favorable LB medium without the addition of sodium benzoate
  • the diamond-shaped symbols correspond to the favorable LB medium with the addition of 5 mM of sodium benzoate
  • the circle-shaped symbols correspond to the favorable LB medium with addition of
  • the diamond-shaped symbols correspond to the favorable LB medium with the addition of 5 mM sodium caprylate
  • the circle-shaped symbols correspond to the favorable LB medium with the addition of
  • sodium benzoate or sodium caprylate very strongly represses the expression of the iagA genes, invF and sipB.
  • the activity of the fusions is further reduced by 50% compared to the values measured in the favorable LB medium without sodium benzoate. If the favorable LB medium contains 1 mM sodium caprylate, the ⁇ -galactosidase activity expressed by the fusions remains low, of the order of 20% of that measured in the favorable LB medium without sodium caprylate.
  • the activity of the iagA '-lacZ fusion measured after 6 hours of culture is very reduced (317 ⁇ 12 ⁇ -galactosidase units ).
  • FIG. 4 The results are shown in FIG. 4, in which it can be seen that samples were taken every two hours for the measurement of the OD 6 oo (corresponding to the open symbols) and for the determination of the ⁇ -galactosidase activity (corresponding with solid symbols).
  • the strains were cultivated in favorable LB medium without the addition of sodium benzoate or sodium caprylate (symbols in the form of a square in FIG. 4) and in favorable LB medium containing 5 mM of sodium benzoate (diamond shaped symbols in Figure 4) or 5 mM sodium caprylate (circle shaped symbols in Figure 4).
  • sodium benzoate and sodium caprylate specifically suppress the expression of the invasion genes of the pathogenicity island SPI-1 in Salmonella.
  • strain S. typhi Ty267 (fusion iagA '-lacZ) was seeded in favorable LB medium and in favorable LB medium containing the aromatic acid to be tested at the final concentration of 5 mM.
  • the ⁇ -galactosidase activity of the iagA '-lacZ fusion was measured after 6 hours of incubation at 37 ° C. with shaking (200 rpm).
  • Sodium 3-phenylpropionate and sodium 4-phenylbutyrate is additive because if each of them is added to the final concentration of 1 mM in the favorable LB medium, the activity of the iagA '-lacZ fusion is strongly repressed (236 ⁇ 10 ⁇ -galactosidase units), whereas this fusion is only partially repressed when the favorable LB medium is supplemented with 1 mM sodium benzoate only (5455 ⁇ 223 ⁇ -galactosidase units).
  • the strain S. typhimurium C52 was used to infect C57B1 / 6 mice orally.
  • C52 is equal to approximately 4.10 5 bacteria (Coynault et al, Mol. MicrobioL, 1996, 22, 149-160) and the kinetics of colonization of the spleen has been previously reported (Pardon et al, Ann. Inst. Pasteur / MicrobioL, 1986, 137B, 47-60).
  • mice were orally infected with 10 8 viable bacteria (250 LD 50 ), the number of viable bacteria was then determined seven days after infection. These results show that the bacterial load in the spleen is reduced significantly significantly (p ⁇ 0.001) in mice having received drinking water having a pH between 7.2 and 7.3 and containing a mixture of 50 mM of sodium benzoate and 50 mM sodium caprylate, provided that treatment is started two days before infection.
  • EDTA which like EGTA chelates divalent cations, has been studied in conjunction with the effect of sodium benzoate or sodium caprylate during murine infection with S. typhimurium.
  • mice Groups of five C57B1 / 6 mice were infected orally with
  • sodium caprylate no longer has a significant protective effect when its concentration is lowered to 5 or 10 mM in drinking water, whatever the infectious dose used.
  • mice which had been administered drinking water of pH between 7.2 and 7.3 and containing 50 mM sodium caprylate two days before infection and for the duration of the experiment , was also infected orally with 10 7 bacteria (25 LD 5 o). One mouse died on the twelfth day of infection.
  • mice used in these experiments belong to the line C57B1 / 6, which is particularly sensitive to infection by Salmonella (Mastroeni et al, Fund. Clin. ImmunoL, 1994, 2, 83- 95).
  • strain S. typhi Ty267 (fusion iagA '-lacZ) was seeded in favorable LB medium and in favorable LB medium containing the fatty acid to be tested, in the form of its sodium salt, at the final concentration of 5 mM.
  • the different fatty acids tested are shown in Table VI below:
  • the ⁇ -galactosidase activity of the iagA '-lacZ fusion was measured after 6 hours of incubation at 37 ° C. with shaking (200 rpm).

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Abstract

L'invention a pour objet l'utilisation d'acides en C4-C10 et/ou d'au moins l'un de leurs sels ou esters pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à prévenir les infections à bactéries à Gram négatif, notamment à Salmonella.

Description

UTILISATION D'ACIDES EN C4-C10 POUR LA PRÉVENTION DES INFECTIONS A BACTÉRIES A GRAM NÉGATIF.
La présente invention a pour objet l'utilisation d'acides en C4-Cιo pour la prévention des infections à bactéries à Gram négatif, notamment à Salmonella, aussi bien chez l'animal que chez l'homme.
Les Salmonella sont des bactéries entéroinvasives pathogènes pour l'homme et l'animal. L'étape cruciale dans le déclenchement d'une salmonellose, qu'il s'agisse d'une gastro-entérite ou d'une infection généralisée de type fièvre typhoïde, est l'entrée des Salmonella dans les cellules épithéliales iléales.
Il est maintenant parfaitement démontré que la majorité des gènes requis pour cette entrée (gènes d'invasion) sont regroupés sur l'îlot de pathogénicité SPI-1 au centisome 63 sur le chromosome de Salmonella (J. E. Galan, Mol. MicrobioL, 1996, 20, 263-271). Ces gènes codent pour l'activateur transcriptionnel IagA (ou HilA) appartenant à la famille OmpR/ToxR, pour les composants de l'appareil de sécrétion de type III inv-spa-prg, et pour ses cibles dont les protéines SipBCDA (ou SspBCDA), StpA (ou SptP) et AvrA. L'expression du gène iagA est elle-même très étroitement contrôlée.
La transcription de iagA requiert la production de deux dérépresseurs, SprA (ou HilC ou SirC) et HilD, qui sont codés par des gènes de SPI-1 et font partie de la famille AraC/XylS (Eichelberg et al., 1999, Mol. MicrobioL, 1999, 33, 139-152 ; Schechter et al., Mol. MicrobioL, 1999, 32, 629-642). La transcription de iagA est également contrôlée directement ou indirectement par deux systèmes à deux composants, RcsB-RcsC et PhoP-PhoQ, qui ne sont pas codés par des gènes localisés au centisome 63. Le système RcsB-RcsC répond à l'osmolarité (Arricau et al., Mol. MicrobioL, 1998, 29, 835-850) et le système Phop-PhoQ à la concentration des cations divalents tels que les ions calcium et magnésium (Garcia Véscoci et al., Cell, 1996, 84, 165-174 ; Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 5054-5058) du milieu environnemental.
D'autres conditions environnementales (faible tension en oxygène, pH légèrement alcalin) sont également requises pour l'expression de iagA ; cependant les mécanismes mis enjeu ne sont pas identifiés.
Lorsque l'osmolarité et la concentration en ions calcium ou magnésium sont faibles (dans l'eau par exemple), les systèmes PhoP-PhoQ et RcsB-RcsC répriment directement ou indirectement l'expression de iagA. En l'absence de l'activateur IagA, les gènes codant pour les composants et les cibles de l'appareil de sécrétion Inv-Spa-Prg ne sont pas exprimés, les Salmonella sont incapables d'entrer dans les cellules épithéliales en culture. Au contraire, lorsque l'osmolarité et la concentration en ions calcium ou magnésium sont élevées (dans la lumière intestinale par exemple), les systèmes PhoP-PhoQ et RcsB-RcsC ne répriment plus l'expression de iagA.
On suppose que les dérépresseurs de SprA et HilD, en se liant au promoteur de iagA ou en interférant avec les régulateurs PhoP ou RcsB, sont impliqués dans ce mécanisme de régulation. La protéine IagA va alors activer la transcription des opérons inv, spa etprg. Le produit de invF, premier gène de l'opéron inv, est lui-même un régulateur de la famille AraC et va activer la transcription de l'opéron sip (Kaniga et al., Mol. MicrobioL, 1994, 13, 555-568). A ce stade, les composants de l'appareil de sécrétion Inv-Spa-Prg sont produits. Ses cibles, en particulier les protéines Sip, sont également synthétisées, mais elles demeurent stockées dans le compartiment cytoplasmique car l'appareil de sécrétion est inactif. L'activité de l'appareil de sécrétion sera déclenchée par le contact avec la cellule épithéliale (Galan, 1996). Les protéines Sip vont être sécrétées et former un translocateur, qui servira à injecter les protéines effectrices, dont StpA et AvrA, dans le cytosol de la cellule-cible. Ces protéines effectrices activent alors différentes voies de signalisation, conduisant à une variété de réponses cellulaires et finalement à l'entrée des Salmonella dans la cellule. Cependant, il a été montré que ces deux conditions (osmolarité et concentration en cations divalents élevées) devaient être simultanément optimales pour que les Salmonella expriment pleinement leur capacité invasive. Si l'on altère une seule de ces conditions, la capacité invasive des
Salmonella est alors très fortement diminuée (Bajaj et al, Mol. MicrobioL, 1996, 22, 703-714). De fait, les Salmonella cultivées dans un milieu à faible osmolarité ou à faible concentration en cations divalents sont incapables de pénétrer dans les cellules épithéliales en culture. L'ensemble des données rapportées ci-dessus montre que l'expression du phénotype d'entrée chez Salmonella est très finement contrôlée par des régulateurs agissant en cascade (tous ne sont probablement pas identifiés) en fonction des conditions environnementales. Si l'on interfère avec un seul de ces régulateurs, alors il doit en résulter un phénotype non invasif.
S'il est très facile de faire varier l'osmolarité ou la concentration en cations divalents d'un milieu de culture cellulaire in vitro dans le but de bloquer l'invasion des Salmonella dans ces cellules épithéliales en culture, la même approche n'est cependant pas réalisable in vivo.
Durant les quinze dernières années, le nombre des infections par Salmonella a considérablement augmenté. Chaque année dans le monde, la fièvre typhoïde est responsable de 600 000 morts pour environ 20 millions de cas. En France, la salmonellose à S. enter itidis représente environ 33% des toxi-infections alimentaires.
Les Salmonella constituent donc toujours un problème majeur de santé publique. Les études épidémiologiques ont clairement montré que cette recrudescence de salmonelloses (sauf dans le cas de la fièvre typhoïde, qui est une maladie strictement humaine) était due à la consommation de produits d'origine animale contaminés par Salmonella. Un des exemples les plus démonstratifs est celui de S. enteritidis, qui a été à l'origine d'une épidémie mondiale. La source de contamination par S. enteritidis a été parfaitement identifiée. Il s'agissait des œufs et des produits à base d'œufs.
La situation risque de devenir encore plus préoccupante avec la généralisation de l'utilisation des antibiotiques dans l'alimentation animale. Cette pratique d'élevage a pour conséquence l'apparition de souches bactériennes multirésistantes aux antibiotiques, à tel point que la panoplie des divers antibiotiques disponibles pourrait très rapidement devenir insuffisante.
Ce phénomène a d'ailleurs conduit à prendre des mesures drastiques dans certains cas. Par exemple, pour les élevages de volailles, la directive européenne 92/117 impose aux États membres une surveillance harmonisée de la présence de Salmonella dans les troupeaux reproducteurs. Le point N de l'annexe III précise que les troupeaux reconnus contaminés par S. typhimurium ou S. enteritidis doivent être abattus. Cette disposition a été modifiée dernièrement par la directive 97/22, qui permet de continuer à exploiter les troupeaux contaminés par S. typhimurium ou S. enteritidis s'il est établi à la satisfaction de l'autorité compétente que l'infection due à ces deux bactéries a disparu.
De nombreuses recherches ont porté sur l'étude de l'activité bactériostatique ou bactéricide de différents acides gras et mono-glycérides acylés. Ainsi, il a été montré (Petschow et al, J. Med. MicrobioL 1998, 47, 383-389) que l'acide laurique par exemple, qui est un acide gras saturé dont la chaîne est formée par 12 atomes de carbone, présentait une activité bactéricide in vitro sur S. typhi, Vibrio cholerae, et Shigella sonnei à la concentration de 0,25 g/1. Selon ce même article, il apparaît qu'à la concentration de 1,25 g/1, l'acide caprylique (CH3(CH2)6COOH), qui est un acide gras saturé à courte chaîne (8 atomes de carbone), n'a pas d'activité bactéricide in vitro sur S. typhi, Vibrio cholerae, E. coli entéropathogènes et entérotoxigènes et Shigella sonnei.
Il a également été montré in vitro qu'à la concentration de 7,8 mM l'acide caprylique est sans effet bactériostatique ou bactéricide sur les bactéries à Gram positif ou à Gram négatif, alors que d'autres acides gras à chaîne carbonée saturée plus longue, en particulier à partir de 12 atomes de carbone tels que l'acide laurique ou certains acides gras insaturés tels que par exemple l'acide linoléique et l'acide oléique, sont très efficaces (Kabara et al., Antimicrob. Agents Chemother, 1972, 2, 23-31). Enfin de nombreux auteurs ont démontré que certains acides gras tels que par exemple les acides n-hexanoïque, caprylique et décanoïque présentaient, à pH acide, une activité bactéricide sur une grande variété de microorganismes à Gram positif ou négatif et permettaient de traiter différents types d'infections (brevets US 4 489 097 et US 4 406 884, demande de brevet EP 0 021 504). Ces documents précisent cependant que pour être efficaces, ces acides doivent être utilisés à pH acide pour se présenter sous forme d'acide libre.
Il apparaît donc que l'activité bactériostatique ou bactéricide des acides gras est liée à la longueur de la chaîne carbonée et au nombre d'insaturations qu'elle porte, l'activité la plus importante étant attribuée aux acides gras comportant au moins 12 atomes de carbone et de préférence une ou deux insaturations.
Devant ce problème majeur que sont les infections à bactéries à Gram négatif et notamment les salmonelloses, et sachant que l'utilisation d'antibiotiques dans l'alimentation animale sera très certainement interdite d'ici quelques années, au moins dans les états membres de l'Europe, il existe un réel besoin de mettre au point des compositions permettant de prévenir les infections à bactéries à Gram négatif et notamment à Salmonella afin d'éviter l'utilisation des antibiotiques et les phénomènes de résistance.
C'est afin de remédier à ce problème que, de façon surprenante, les Inventeurs ont mis au point ce qui fait l'objet de l'invention. La présente invention a donc pour objet l'utilisation d'une quantité efficace d'au moins un composé de formule (I) suivante :
R,-COO-R2 (I) dans laquelle : - Ri représente une chaîne carbonée saturée en C4-C , éventuellement substituée par une ou plusieurs fonctions hydroxyle ou aminé ou par un cycle aromatique ; - R représente un atome d'hydrogène ; un atome d'un métal alcalin monovalent ; un radical alkyle ; étant entendu que lorsque R représente un atome d'hydrogène et que Ri représente une chaîne carbonée saturée en C7 substituée par une fonction a iné, alors ladite fonction aminé n'est pas en position 2 ou 8 ; à titre de principe actif, pour la préparation d'une composition pharmaceutique présentant un pH neutre destinée à prévenir les infections à bactéries à Gram négatif, chez l'homme ou chez l'animal. à titre de principe actif, pour la préparation d'une composition pharmaceutique présentant un pH neutre destinée à prévenir les infections à bactéries à Gram négatif et en particulier à Salmonella, aussi bien chez l'homme que chez l'animal.
En fonction de la signification du radical R2, les composés de formule (I) ci-dessus peuvent donc se présenter sous la forme d'un acide, d'un sel ou d'un ester.
Les Inventeurs ont en particulier démontré que l'administration préventive d'une composition présentant un pH neutre et contenant au moins du caprylate de sodium à des souris ultérieurement infectées par trois sérotypes majeurs de Salmonella permettait de réduire considérablement le niveau de colonisation splénique par ces bactéries alors que cette composition ne présente pas d'activité bactéricide à un tel pH
Selon l'invention, le pH de la composition pharmaceutique utilisée est de préférence compris entre 6,5 et 7,5 et encore plus préférentiellement entre 7,1 et 7,4.
Une valeur de pH particulièrement bien adaptée à l'utilisation conforme à l'invention est comprise entre 7,2 et 7,3.
Parmi les composés de formules (I) ci-dessus, on peut en particulier citer les acides valérique, caproïque, œnanthique, caprylique, pélargonique, et leurs dérivés monohydroxylés, ainsi que leurs sels et leurs esters.
Selon une forme de réalisation particulière de l'invention et lorsque le radical Ri des composés de formule (I) représente une chaîne carbonée substituée par une fonction hydroxyle, alors ladite fonction hydroxyle est en position 2 lorsque le radical Ri contient de 4 à 6 atomes de carbone et en position 2 ou 8 lorsque le radical Ri contient de 7 à 9 atomes de carbone. Parmi ces composés particuliers de formule (I), on peut notamment citer l'acide 2-hydroxycaprylique et l'acide 2-hydroxycaprylique.
Parmi les composés de formule (I), l'acide caprylique (qui correspond à un composé de formule (I) dans lequel Ri représente une chaîne carbonée saturée en C7), ses dérivés hydroxylés en position 2 ou 8, leurs sels et leurs esters sont particulièrement préférés.
En effet, outre ses propriétés antifongiques (Wyss et al., Arch.
Biochem., 1945, 7, 418), l'acide caprylique utilisé à un pH neutre permet de manière inattendue, de prévenir les infections à Salmonella, alors qu'à une telle valeur de pH, cet acide ne présente aucune activité bactéricide. Selon l'invention, les atomes de métal alcalin définis pour le radical R sont de préférence choisis parmi le sodium et le potassium.
Selon l'invention, les radicaux alkyle définis pour le radical R sont de préférence choisis parmi les radicaux alkyle en Cι-C4, parmi lesquels on préfère tout particulièrement les radicaux méthyle, éthyle et butyle.
Selon une forme de réalisation avantageuse de l'invention, on utilise le caprylate de sodium, c'est-à-dire un composé de formule (I) dans lequel R[ représente une chaîne carbonée saturée en C et R2 représente un atome de sodium.
La quantité efficace de composé(s) de formule (I) correspond de préférence à des doses unitaires comprises entre 20 mM et 200 mM, et encore plus préférentiellement entre 50 mM et 100 mM.
La composition pharmaceutique utilisée conformément à l'invention peut en outre renfermer un ou plusieurs principes actifs additionnels.
Les composés de formule (I) utilisés conformément à l'invention peuvent bien entendu être formulés dans un véhicule pharmaceutique acceptable constitué d'un ou de plusieurs excipients classiquement utilisés pour la préparation de compositions pharmaceutiques, tels que des anti-agglomérants, des anti-oxydants, des colorants, des vitamines, des sels minéraux, des agents modifiants du goût, des agents de lissage, de montage, d'isolation et de manière générale, tout excipient classiquement utilisé dans l'industrie pharmaceutique.
Bien entendu, l'homme de l'art veillera à cette occasion à ce que le ou les additifs éventuellement utilisés soient compatibles avec les propriétés intrinsèques attachées à la présente invention, en particulier l'utilisation des ces additifs ne devant avoir aucune incidence sur le pH des compositions pharmaceutiques utilisées
La composition pharmaceutique utilisée selon la présente invention est de préférence administrée par voie orale et peut se présenter sous diverses formes, telles que sous forme de comprimés, de gélules, de suspensions buvables, de tablettes ou sous toute autre forme appropriée au mode d'administration orale.
La composition pharmaceutique utilisée selon la présente invention peut notamment être ajoutée à l'eau de boisson et/ou aux aliments distribués à des animaux d'élevage (volailles, bovins, porcins, ovin, etc ..) de façon à diminuer l'incidence des infections à bactéries à Gram négatif et notamment à Salmonella et limiter le portage, et réduire ainsi le risque d'une contamination subséquente de l'homme.
La composition pharmaceutique utilisée selon la présente invention peut également être administrée chez l'homme comme médicament préventif afin de réduire le risque d'infection chez les personnes effectuant des séjours limités dans une région à forte endémie notamment de salmonelloses.
La composition pharmaceutique utilisée selon la présente invention, couplée à une vaccination de masse et en attendant la mise en place d'une couverture immunitaire, peut également être utilisée chez l'homme pour stopper ou ralentir une épidémie de fièvre typhoïde. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, laquelle se réfère à un exemple de démonstration de l'activité du caprylate de sodium dans la prévention des salmonelloses chez la souris (exemple 1), à une étude comparative de l'effet de certains acides gras sur l'expression des gènes d'invasion (exemple 2), ainsi qu'aux figures annexées, dans lesquelles :
- la figure 1 montre l'effet de la concentration en ions Ca2+ sur l'expression des fusions iagA '-lacZ, invF'-lacZ et sipB '-lacZ ;
- la figure 2 montre l'effet de la concentration en benzoate de sodium sur l'expression des fusions iagA '-lacZ, invF'-lacZ et sipB '-lacZ ; - la figure 3 montre l'effet de la concentration en caprylate de sodium sur l'expression des fusions iagA '-lacZ, invF'-lacZ et sipB '-lacZ ;
- la figure 4 montre l'effet du benzoate de sodium et du caprylate de sodium sur l'expression de la fusion tviB'-lacZ ; - la figure 5 montre l'effet d'un mélange de benzoate de sodium et de caprylate de sodium sur la colonisation splénique de souris infectées oralement par S. typhimurium C52.
Il doit être bien entendu toutefois que cet exemple est donné uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont il ne constitue en aucune manière une limitation.
EXEMPLE DEMONSTRATION DE L'ACTIVITE PREVENTIVE DU
CAPRYLATE DE SODIUM SUR LES INFECTIONS A SALMONELLA I) Matériels et méthodes I-a) Souches, milieux et conditions de culture
La liste des souches de Salmonella utilisées dans cet exemple figure dans le Tableau I ci-après :
TABLEAU I
Figure imgf000009_0001
La formule antigénique de chaque souche de Salmonella a été contrôlée par agglutination sur lame avec des anti-sérums spécifiques des facteurs antigéniques somatiques et flagellaires vendus par la société BioRad-Diagnostics Pasteur.
En routine, les souches ont été cultivées à 37°C sur gélose ou en bouillon trypto-caséïne-soja (TCS ; vendu par la société BioRad-Diagnostics Pasteur).
Pour étudier l'expression des gènes d'invasion in vitro, deux milieux dérivant du milieu LB standard (Sambrook et al, Molecular Cloning, 1989) ont été préparés :
- un milieu favorable à l'expression des gènes d'invasion des Salmonella (milieu LB favorable), et
- un milieu LB défavorable à l'expression des gènes d'invasion des Salmonella (milieu LB défavorable).
Le milieu LB standard d'origine contient 170 mM dé NaCl et 850 ±
50 μM d'ion Ca2+.
Le milieu LB favorable (osmolarité et concentration en ions Ca2+ élevées) a été défini comme étant le milieu LB standard modifié de façon à avoir une concentration finale de 300 mM en NaCl et de 5 mM en Ca2+.
Le milieu LB défavorable (osmolarité élevée et faible concentration en ions Ca2+) a été défini comme étant le milieu LB standard modifié de façon à avoir une concentration finale de 300 mM en NaCl et est additionné de 1 mM d'acide éthylène glycol bis-(β-aminoéthyl éther)-N,N,N',N'-tetraacétique (EGTA) de façon à créer un appauvrissement du milieu en cations divalents.
La mobilité de chaque souche a été étudiée en utilisant la technique de la culture en tube U (Popoff et Le Minor, Guide pour la préparation des sérum anti- Salmonella, 1997). Lorsque nécessaire, les milieux de culture ont été additionnés de chloramphénicol (Cm) à 15 μg/ml. I-b) Détermination de l'activité β-galactosidase
Chacune des souches décrites ci-dessus a été cultivée à 37°C sur gélose, ou en bouillon TCS. L'activité β-galactosidase a été déterminée en utilisant du 4-méthyl- umbelliferyl-β-D-galactopyranoside vendu par la société Sigma, selon la technique de Klarsfeld et al. (Mol. MicrobioL, 1994, 13, 585-597). Les résultats, exprimés en unités β-galactosidase (fluorescence par heure et par DOgoo représentent la moyenne des valeurs obtenues dans au moins trois expériences indépendantes. Les écart-types ont été inférieurs à 10% des valeurs présentées. I-c) Utilisation des plaques "Biotype 100"®
Une plaque "Biotype 100"® vendue par la société BioMérieux est composée de 100 microcupules. Chaque microcupule contient un substrat carboné déshydraté, à l'exception de la première cupule qui est un témoin sans substrat (la quantité de substrat déshydraté par cupule n'est pas donné par le fabricant).
Normalement, la plaque "Biotype 100"® permet d'étudier la capacité nutritionnelle d'une souche bactérienne sur 99 sources différentes de carbone (auxanogramme).
Dans le cadre du présent exemple, ces plaques ont été utilisées pour rechercher des composés carbonés, qui bloqueraient l'expression des gènes d'invasion chez Salmonella.
Pour cela, la souche S. typhi Ty267, qui est un dérivé de la souche parentale Ty2 portant la fusion transcriptionnelle iagA '-lacZcat (Tableau I), a été cultivée en bouillon TCS durant 18 heures à 37°C avec agitation (200 tours/mn). Cette culture a ensuite été diluée au 1/100 en milieu LB favorable
(0,6 ml de culture pour 60 ml de LB favorable), puis cette suspension a été utilisée immédiatement pour ensemencer les 100 cupules d'une plaque "Biotype 100"® à raison de 450 μl de suspension par cupule.
Après 36 heures d'incubation à l'étuve à 37°C, l'activité de la fusion iagA '-lacZcat dans la souche Ty267 a été déterminée pour la culture de chaque cupule.
En comparant la valeur de l'activité β-galactosidase mesurée dans une cupule contenant un substrat carboné à celle de la cupule témoin sans substrat, il a été ainsi possible de rechercher si un substrat était sans effet sur, activait ou réprimait l'expression de la fusion iagA '-lacZcat. I-d) Infection expérimentale des souris
Les souris C57B1/6 femelles, âgées de 5-6 semaines, utilisées dans le cadre de cette expérience, provenaient du centre d'élevage IFF A-CREDO (L'Arbresle, France).
Durant toute la durée des expériences, les souris ont eu accès à volonté à l'eau de boisson dont la composition est donnée pour chaque expérience.
Elles ont été infectées par voie orale de la façon suivante. Les souches de Salmonella ont été cultivées en bouillon TCS durant 18 heures à 37°C avec agitation (200 tours/mn). Cette culture a ensuite été ajustée à 10^ bactéries/ml (en phase stationnaire de croissance, 1 DO6oo = 1,5.10^ bactéries/ml), puis le nombre de bactéries viables a été contrôlé par numération sur gélose TCS.
Le jour de l'infection (Jo), les biberons d'eau de boisson des souris ont été remplacés par des biberons contenant 100 ml d'eau de boisson dans laquelle avait été ajouté le nombre requis de bactéries.
Après 24 heures d'infection (J+l), les biberons contenant l'eau de boisson contaminée ont été remplacés par des biberons contenant de l'eau de boisson non contaminée.
Sept jours après l'infection (J+7), les rates des souris ainsi infectées ont été prélevées et homogénéisées séparément dans 1 ml d'eau physiologique contenant 0,7% de NaCl.
Le nombre de bactéries viables par rate a été déterminé en étalant des dilutions de l'homogénat sur gélose TCS.
L'effet de la composition de l'eau de boisson sur la colonisation splénique par Salmonella a été estimé par le test t de Student.
Pour les expériences de survie, les souris ont été infectées comme indiqué ci-dessus et la mortalité des animaux a été enregistrée durant 21 jours.
I-e) Nature des acides testés
En plus de l'acide caprylique, des acides aromatiques ont été étudiés dans le but de comparer leurs propriétés à celles de l'acide caprylique. Les acides aromatiques étudiés ont été les suivants : acide benzoïque, acide phénylacétique, acide 3-phénylpropionique et acide 4-phénylbutyrique.
Les acides aromatiques et l'acide caprylique proviennent de la société Sigma. Ils ont tous été utilisés sous la forme de leur sel de sodium et à un pH compris entre 7,2 et 7,3.
II) Résultats
Il-a) Etape préliminaire : effet de la concentration en cations divalents sur l'expression des gènes d'invasion de Salmonella
Cette étape préliminaire avait pour but de démontrer que des fusions transcriptionnelles lacZ pouvaient être utilisées pour la recherche des conditions environnementales réprimant l'expression des gènes présents sur l'îlot de pathogénicité SPI-1.
Pour cela, les souches S. typhi Ty267, Ty272 et Ty277, qui portent respectivement les fusions iagA '-lacZ, invF'-lacZ et sipB'-lacZ (voir Tableau I), ont été cultivées dans le milieu LB favorable ou LB défavorable.
L'activité β-galactosidase exprimée par les fusions a été mesurée à différents temps de culture. Les résultats apparaissent sur la figure 1. Des échantillons ont été prélevés toutes les deux heures pour la mesure de la DO6oo (symboles ouverts sur la figure 1) et pour la détermination de l'activité β-galactosidase (symboles pleins sur la figure 1).
Les souches S. typhi Ty267 (iagA'-lacZ), Ty272 (invF'-lacZ) et Ty277 (sipB'-lacZ) ont été cultivées en milieu LB contenant 300 mM NaCl et 5 mM de CaCl (représentation par un carré) ou 300 mM NaCl et 1 mM EGTA (représentation par un losange).
Ces résultats montrent que l'expression des fusions est très fortement diminuée lorsque le milieu de culture est appauvri en cations divalents.
Ils confirment par conséquent qu'il suffit d'altérer une seule condition favorable pour que les gènes d'invasion ne soient plus exprimés chez S. typhi, comme cela avait été démontré chez S. typhimurium (Bajaj et al, 1996 précité).
En conséquence, les fusions transcriptionnelles iagA '-lacZ, invF'-lacZ et sipB '-lacZ chez S. typhi ont été utilisées dans la suite de cet exemple.
Il-b) Effet de certains acides aromatiques et de certains acides gras sur l'expression des gènes d'invasion
La souche S. typhi Ty267 (fusion iagA '-lacZ), mise en suspension dans le milieu LB favorable, a été utilisée pour ensemencer les plaques "Biotype 100"®.
Après 36 heures d'incubation à l'étuve à 37°C, une culture nette a été observée dans toutes les cupules, ce qui indique qu'aucun des 99 substrats carbonés de la plaque n'a d'activité bactéricide ou bactériostatique pour la souche Ty267.
L'activité β-galactosidase exprimée par la fusion iagA '-lacZ a été déterminée pour la culture dans chaque cupule. Par rapport à l'activité β-galactosidase mesurée dans la cupule témoin sans substrat (11250 unités β-galactosidase), aucun substrat n'a entraîné une augmentation de l'expression de la fusion iagA '-lacZ. Au contraire, l'expression de cette fusion a été très fortement réprimée dans les cupules contenant le phénylacétate de sodium (81 unités β-galactosidase), le benzoate de sodium (245 unités β-galactosidase), le 3-phénylpropionate de sodium (166 unités β-galactosidase) et le caprylate de sodium (47 unités β-galactosidase).
La quantité de substrat contenu dans chaque cupule n'étant pas connue, une étude plus détaillée de l'action de ces substrats sur l'expression des gènes d'invasion a été entreprise. Dans un premier temps, le benzoate de sodium et le caprylate de sodium ont été utilisés.
L'effet du benzoate de sodium et celui du caprylate de sodium sur l'expression des trois fusions est rapporté dans les figures 2 et 3, respectivement.
Sur ces figures 2 et 3, la mesure de la DO6oo correspond aux symboles ouverts et la détermination de l'activité β-galactosidase correspond aux symboles pleins.
Les souches S. typhi Ty267, Ty272 et Ty277 ont été ensemencées en milieu LB favorable et en milieu LB favorable contenant différentes concentrations de benzoate de sodium ou de caprylate de sodium.
Sur la figure 2, les symboles en forme de carré correspondent au milieu LB favorable sans addition de benzoate de sodium, les symboles en forme de losange correspondent au milieu LB favorable avec addition de 5 mM de benzoate de sodium, les symboles en forme de cercle correspondent au milieu LB favorable avec addition de
2,5 mM de benzoate de sodium et les symboles en forme de triangle correspondent au milieu LB favorable avec addition de 1 mM de benzoate de sodium. Sur la figure 3, les symboles en forme de carré correspondent au milieu
LB favorable sans addition de caprylate de sodium, les symboles en forme de losange correspondent au milieu LB favorable avec addition de 5 mM de caprylate de sodium, les symboles en forme de cercle correspondent au milieu LB favorable avec addition de
2,5 mM de caprylate de sodium et les symboles en forme de triangle correspondent au milieu LB favorable avec addition de 1 mM de caprylate de sodium.
L'action de ces deux composés sur l'expression des fusions iagA '-lacZ, invF'-lacZ et sipB '-lacZ a été étudiée en mesurant l'activité β-galactosidase exprimée par ces fusions en fonction du temps de culture (prélèvement toutes les deux heures).
Ces résultats montrent que la présence de l'un ou l'autre de ces deux composés à la concentration finale de 5 mM dans le milieu de culture n'a pas affecté de manière significative la croissance des souches de S. typhi.
A une concentration supérieure ou égale à 2,5 mM, le benzoate de sodium ou le caprylate de sodium réprime très fortement l'expression des gènes iagA, invF et sipB.
Lorsque le milieu LB favorable contient 1 mM de benzoate de sodium, l'activité des fusions est encore réduite de 50% par rapport aux valeurs mesurées dans le milieu LB favorable sans benzoate de sodium. Si le milieu LB favorable contient 1 mM de caprylate de sodium, l'activité β-galactosidase exprimée par les fusions reste faible, de l'ordre de 20% de celle mesurée dans le milieu LB favorable sans caprylate de sodium.
Si le milieu LB favorable est additionné de 1 mM de benzoate de sodium et de 1 mM de caprylate de sodium, l'activité de la fusion iagA '-lacZ mesurée après 6 heures de culture est très réduite (317 ± 12 unités β-galactosidase).
L'ensemble de ces résultats montre que le benzoate de sodium ou le caprylate de sodium ajouté à la concentration finale de 2,5 mM dans le milieu LB favorable réprime très fortement l'expression des gènes d'invasion chez Salmonella.
Ces résultats suggèrent également que l'action inhibitrice du caprylate de sodium est supérieure à celle du benzoate de sodium, au moins lorsque ces produits sont utilisés à faible concentration (1 mM), mais que l'effet de ces deux produits est additif.
H-c) Effets du benzoate de sodium et du caprylate de sodium sur la répression spécifique de l'expression des gènes d'invasion de l'îlot de pathogénicité SPI-1
Pour examiner si l'effet du benzoate de sodium et du caprylate de sodium était spécifique des gènes d'invasion de l'îlot de pathogénicité SPI-1, l'action de ces deux produits a été étudiée sur la fusion transcriptionnelle tviB '-lacZ dans la souche Ty266 de S. typhi (Tableau I). Le gène tviB a été caractérisé chez S. typhi et il code pour une
GDP-déshydrogénase impliquée dans la biosynthèse de l'antigène Ni, le polysaccharide capsulaire du bacille typhique (Waxin et al, Res. MicrobioL, 1993, 144, 363-371).
Les résultats sont reportés sur la figure 4, dans laquelle on voit que des échantillons ont été prélevés toutes les deux heures pour la mesure de la DO6oo (correspondant aux symboles ouverts) et pour la détermination de l'activité β-galactosidase (correspondant aux symboles pleins). Les souches ont été cultivées en milieu LB favorable sans addition de benzoate de sodium ou de caprylate de sodium (symboles en forme de carré sur la figure 4) et en milieu LB favorable contenant 5mM de benzoate de sodium (symboles en forme de losange sur la figure 4) ou 5 mM de caprylate de sodium (symboles en forme de cercle sur la figure 4).
Comme le montre la figure 4, le benzoate de sodium et le caprylate de sodium à 5 mM sont sans effet significatif sur l'expression de la fusion tviB '-lacZ. Plusieurs composants de l'appareil de sécrétion Inv-Spa-Prg montrent des similitudes avec des composants de la machinerie impliquée dans la sécrétion de la flagelline et l'assemblage des flagelles.
De fait, il a été montré chez S. typhi que la sécrétion des protéines Sip, la quantité de flagelline sécrétée et la mobilité étaient régulées de manière coordonnée en réponse à l'osmolarité du milieu de culture (Arricau et al. , 1998 précité).
Ces données ont conduit les Inventeurs à étudier l'effet du benzoate de sodium et du caprylate de sodium sur la mobilité de la souche Ty2 de S. typhi.
Cette étude a montré que la souche Ty2 avait la même mobilité après culture en tube U et en tube U additionné de 5 mM de benzoate de sodium ou de 5 mM de caprylate de sodium.
Il en résulte que le benzoate de sodium et le caprylate de sodium répriment spécifiquement l'expression des gènes d'invasion de l'îlot de pathogénicité SPI-1 chez Salmonella.
Il-d) Effets de certains acides aromatiques sur l'expression des gènes d'invasion
La souche S. typhi Ty267 (fusion iagA '-lacZ) a été ensemencée en milieu LB favorable et en milieu LB favorable contenant l'acide aromatique à tester à la concentration finale de 5 mM.
L'activité β-galactosidase de la fusion iagA '-lacZ a été mesurée après 6 heures d'incubation à 37°C avec agitation (200 tours/mn).
Comme attendu d'après les résultats obtenus ci-dessus en plaque "Biotype 100"®, et ainsi que cela apparaît dans le Tableau II ci-après, le benzoate de sodium, le phénylacétate de sodium et le 3-phénylpropionate de sodium inhibent l'expression de la fusion iagA '-lacZ chez S. typhi. De plus, l'activité β-galactosidase de cette fusion est également inhibée par le 4-phénylbutyrate de sodium (Tableau II), substrat ne figurant pas dans la plaque "Biotype 100"® utilisée précédemment. TABLEAU II
Figure imgf000017_0001
Ces résultats montrent que l'activité inhibitrice de ces 4 acides aromatiques est très semblable. L'effet du benzoate de sodium, du phénylacétate de sodium, du
3-phénylpropionate de sodium et du 4-phénylbutyrate de sodium est additif car si l'on ajoute chacun d'entre eux à la concentration finale de 1 mM dans le milieu LB favorable, l'activité de la fusion iagA '-lacZ est fortement réprimée (236 ± 10 unités β-galactosidase), alors que cette fusion n'est que partiellement réprimée lorsque le milieu LB favorable est additionné de 1 mM benzoate de sodium uniquement (5455 ± 223 unités β-galactosidase).
Il-e) Effets comparés du benzoate de sodium et du caprylate de sodium dans un modèle d'infection murine par S. typhimurium C52
La souche S. typhimurium C52 a été utilisée pour infecter des souris C57B1/6 par voie orale. Dans ce modèle expérimental, la dose létale 50% (DL50) de la souche
C52 est égale à environ 4.105 bactéries (Coynault et al, Mol. MicrobioL, 1996, 22, 149-160) et la cinétique de colonisation de la rate a été rapportée précédemment (Pardon ét al, Ann. Inst. Pasteur/MicrobioL, 1986, 137B, 47-60).
Puisque le benzoate de sodium et le caprylate de sodium répriment in vitro l'expression des gènes d'invasion de Salmonella, il était logique d'étudier l'effet de ces produits sur la colonisation splénique de souris C57B1/6 infectées oralement par
S. typhimurium C52 avec 10 bactéries (250 DL5o).
Les résultats sont rapportés à la figure 5. Sur cette figure, le nombre de bactéries viables est reporté en moyenne (logio) des valeurs ± l'écart type. Des groupes de 8 souris ont été infectés par voie orale avec 108 bactéries viables (250 DL50), le nombre de bactéries viables a ensuite été déterminé sept jours après l'infection. Ces résultats montrent que la charge bactérienne dans la rate est réduite de manière hautement significative (p < 0,001) chez les souris ayant reçu une eau de boisson présentant un pH compris entre 7,2 et 7,3 et contenant un mélange de 50 mM de benzoate de sodium et de 50 mM de caprylate de sodium, à la condition que le traitement soit mis en place deux jours avant l'infection.
L'administration de benzoate de sodium et de caprylate de sodium le jour ou le lendemain de l'infection n'a aucun effet significatif sur le niveau de colonisation splénique.
Les effets du benzoate de sodium et du caprylate de sodium, administrés dans l'eau de boisson aux souris deux jours avant l'infection par S. typhimurium C52, ont ensuite été étudiés séparément.
L'effet de l'EDTA, qui comme l'EGTA chélate les cations divalents, a été étudié conjointement à l'effet du benzoate de sodium ou du caprylate de sodium lors de l'infection murine par S. typhimurium.
Des groupes de cinq souris C57B1/6 ont été infectés par voie orale avec
5.10? bactéries (125 DL5o) selon le protocole décrit ci-dessus. Les résultats obtenus sont regroupés dans le Tableau III ci-après :
TABLEAU III
Figure imgf000018_0001
Toutes ces compositions présentaient un pH compris entre 7,2 et 7,3.
Ces résultats montrent que l'administration, deux jours avant l'infection et pendant la durée de l'expérience, d'une eau de boisson contenant 50 mM de caprylate de sodium réduit d'un facteur 1000 environ la charge bactérienne dans la rate au septième jour de l'infection. L'administration d'un mélange de 50 mM de caprylate de sodium et de 50 mM de benzoate de sodium donne un résultat très comparable, ce qui indique que le benzoate de sodium n'agit pas en synergie avec le caprylate de sodium pour prévenir l'infection murine par S. typhimurium C52.
En fait, la présence de 50 mM de benzoate de sodium dans l'eau de boisson n'a aucun effet sur le niveau de colonisation splénique des souris C57B1/6 infectées par S. typhimurium C52.
Ce dernier résultat est à opposer à celui qui avait été obtenu ci-dessus in vitro sur l'expression des fusions iagA '-lacZ, invF'-lacZ et sipB'-lacZ chez S. typhi en présence de benzoate de sodium (figure 2).
Comme rapporté dans les expériences préliminaires (figure 1), la déplétion du milieu favorable en cations divalents par l'EGTA a pour conséquence la répression des fusions iagA '-lacZ, invF'-lacZ et sipB '-lacZ chez S. typhi.
L'addition de 10 mM d'EDTA à l'eau de boisson contenant 50 mM de benzoate de sodium ne confère aucune protection contre l'infection par S. typhimurium C52 (Tableau III).
Au contraire, la présence de 10 mM d'EDTA dans l'eau de boisson contenant 50 mM de caprylate de sodium se traduit par une réduction de l'effet protecteur observé avec le caprylate de sodium seul.
De la même manière, l'effet de la concentration en caprylate de sodium dans l'eau de boisson a ensuite été étudié en fonction de la dose infectieuse.
Les résultats sont rapportés dans le Tableau IV ci-après. TABLEAU IV
Figure imgf000019_0001
Toutes ces compositions présentaient un pH compris entre 7,2 et 7,3. Ces résultats confirment que l'administration, deux jours avant l'infection et pendant la durée de l'expérience, d'une eau de boisson contenant 50 mM de caprylate de sodium réduit d'une manière très hautement significative la charge bactérienne dans la rate des souris infectées par voie orale avec 5.10? bactéries (125 DL50). De plus, ces résultats montrent que l'addition de 50 mM de caprylate de sodium dans l'eau de boisson réduit d'un facteur 100 000 environ la charge bactérienne dans la rate des souris infectées par voie orale avec 10? bactéries (25 DL5o).
Par contre, le caprylate de sodium n'a plus d'effet protecteur significatif lorsque sa concentration est abaissée à 5 ou 10 mM dans l'eau de boisson, quelle que soit la dose infectieuse utilisée.
Il-f) Effet du caprylate de sodium sur la survie de souris infectées par S. typhimurium
L'effet du caprylate de sodium sur la survie de souris infectées par
S. typhimurium C52 a ensuite été étudié. Un premier de lot de dix souris C57B1/6, auquel était administré de l'eau de boisson, de pH compris entre 7,2 et 7,3, sans caprylate de sodium, a été infecté par voie orale avec 107 bactéries (25 DL5o). Aucun animal n'a survécu (3 morts au huitième jour après infection, 4 au neuvième et 3 au dixième).
Le second lot de 10 souris, auquel avait été administré de l'eau de boisson de pH compris entre 7,2 et 7,3 et contenant 50 mM de caprylate de sodium deux jours avant l'infection et pendant la durée de l'expérience, a également été infecté par voie orale avec 107 bactéries (25 DL5o). Une souris est morte le douzième jour de l'infection.
Le vingtième jour de l'infection, les neuf souris restantes ont été sacrifiées et le nombre de bactéries dans la rate a été déterminé. Dans la rate d'une souris, il a été dénombré logio = 7,3 bactéries viables. La moyenne (± écart-type) du nombre de bactéries viables dans la rate des huit autres animaux a été calculée égale à logio≈ 3,3 ± 0,3.
Ces résultats montrent que la présence de 50 mM de caprylate de sodium dans l'eau de boisson présentant un pH neutre permet de réduire de manière très significative la charge bactérienne dans la rate de souris C57B1/6 infectées oralement par S. typhimurium. De plus, le caprylate de sodium protège efficacement les animaux contre une infection par 25 DL50 de S. typhimurium. Il-g) Effet du caprylate de sodium dans un modèle d'infection murine par S. dublin et S. enteritidis
Les souches S. dublin 5917 (Coynault & Norel, Microb. Pathog., 1999, 26, 299-305) et S. enteritidis LA5 (Thorns et al., Microb. Pathog., 1996, 20, 235-246) ont été utilisées pour infecter des souris C57B1/6 par voie orale à la dose de 107 bactéries par animal.
Les résultats rapportés sont regroupés dans le Tableau V ci-après : TABLEAU V
Figure imgf000021_0001
Toutes les compositions utilisées présentaient un pH compris entre 7,2 et
7,3.
Ces résultats montrent que l'addition de 50 mM de caprylate de sodium dans l'eau de boisson à pH neutre réduit de manière très significative la charge bactérienne dans la rate des souris infectées par S. dublin ou par S. enteritidis.
Par conséquent, l'effet préventif du caprylate de sodium est indépendant du sérotype de Salmonella dans un modèle murin d'infection par voie orale.
III) Conclusion
L'ensemble de ces résultats montre que bien que le benzoate de sodium, le phénylacétate de sodium, le 3-phénylpropionate de sodium, le 4-phénylbutyrate de sodium et le caprylate de sodium inhibent in vitro l'expression des gènes d'invasion de Salmonella, alors que par ailleurs les conditions de culture sont optimales pour l'expression de ces gènes, aucun de ces composés n'a d'effet bactéricide ou bactériostatique significatif à pH neutre sur les Salmonella. En revanche, dans un modèle murin d'infection par voie orale, le caprylate de sodium (comparé au benzoate de sodium), ajouté à la concentration de 50 mM dans l'eau de boisson à pH neutre, permet de réduire considérablement le niveau de colonisation splénique par trois sérotypes majeurs de Salmonella : S. typhimurium, S. enteritidis et S. dublin.
Il est important de souligner à cet égard que les souris utilisées dans ces expériences appartiennent à la lignée C57B1/6, qui est particulièrement sensible à l'infection par Salmonella (Mastroeni et al, Fund. Clin. ImmunoL, 1994, 2, 83-95).
De plus, il ressort de ces expériences que le caprylate de sodium utilisé à pH neutre protège très efficacement les animaux contre une infection par 25 DL5o de S. typhimurium, puisque neuf souris sur dix ont survécues à cette dose infectieuse létale. Au contraire, le benzoate de sodium n'a aucun effet protecteur dans le même modèle d'infection.
Au total, l'ensemble de ces résultats montre qu'il est possible de prévenir par le caprylate de sodium les infections à bactéries à: Gram négatif telles que Salmonella. EXEMPLE 2 : ÉTUDE COMPARATIVE DE L'EFFET DE CERTAINS ACIDES GRAS SUR L'EXPRESSION DES GENES D'INVASION
Cette étude a été réalisée selon le protocole décrit ci-dessus à l'exemple 1.
Cette étude a pour but de démontrer que seuls les composés répondant à la formule (I) conformes à l'invention permettent d'inhiber l'expression de la fusion iagA '- lacZ chez S. typhi.
La souche S. typhi Ty267 (fusion iagA '-lacZ) a été ensemencée en milieu LB favorable et en milieu LB favorable contenant l'acide gras à tester, sous la forme de son sel de sodium, à la concentration finale de 5 mM. Les différents acides gras testés figurent dans le Tableau VI ci-après :
TABLEAU VI
Figure imgf000023_0001
(*) : Composé non conforme à l'invention car ne répondant pas à la formule (I).
L'activité β-galactosidase de la fusion iagA '-lacZ a été mesurée après 6 heures d'incubation à 37°C avec agitation (200 tours/mn).
Les résultats obtenus figurent dans le Tableau VII ci-après :
TABLEAU VII
Figure imgf000024_0001
Ces résultats montrent :
- que les sels de sodium des acides acétique, propionique et butyrique, qui sont des composés ne faisant pas partie de l'invention ne permettent pas n'inhiber l'expression de la fusion iagA '-lacZ chez S. typhi ;
- que les sels de sodium des acides valériques, caproïque, œnanthique, et pélargonique inhibent l'expression de la fusion iagA '-lacZ chez S. typhi aussi fortement que le caprylate de sodium ;
- que la présence d'un radical hydroxyle en position 2 ou 8 sur la molécule d'acide caprylique (acides 2-hydroxycaprylique et 8-hydroxycaprylique respectivement) ne modifie pas l'expression de la fusion iagA'-lacZ chez S. typhi par rapport à celle qui est obtenue avec l'acide caprylique ;
- que la présence d'un radical aminé en position 2 ou 8 sur la molécule d'acide caprylique (acides 2-aminocaprylique et 8-aminocaprylique respectivement) bloque totalement l'activité inhibitrice de l'acide caprylique. Par conséquent, l'ensemble de ces résultats démontre que les composés de formule (I) conformes à l'invention permettent de réprimer in vitro l'expression des gènes d'invasion chez une bactérie à Gram négatif telle que Salmonella.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'une quantité efficace d'au moins un composé de formule (I) suivante : Rι-COO-R2 (I) dans laquelle :
- Ri représente une chaîne carbonée saturée en C4-C , éventuellement substituée par une ou plusieurs fonctions hydroxyle ou aminé ou par un cycle aromatique ;
- R2 représente un atome d'hydrogène ; un atome d'un métal alcalin monovalent ; un radical alkyle ; étant entendu que lorsque R2 représente un atome d'hydrogène et que Ri représente une chaîne carbonée saturée en C7 substituée par une fonction aminé, alors ladite fonction aminé n'est pas en position 2 ou 8 ; à titre de principe actif, pour la préparation d'une composition pharmaceutique présentant un pH neutre destinée à prévenir les infections à bactéries à Gram négatif, chez l'homme ou chez l'animal.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée par le fait que lesdites infections à bactéries à Gram négatif sont des infections à Salmonella.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée par le fait que les composés de formule (I) sont choisis parmi les acides valérique, caproïque, œnanthique, caprylique, pélargonique, leurs dérivés monohydroxylés, ainsi que leurs sels et leurs esters.
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que les composés de formule (I) sont choisis parmi ceux dans lesquels le radical Ri représente une chaîne carbonée substituée par une fonction hydroxyle, ladite fonction hydroxyle étant en position 2 lorsque le radical Ri contient de 4 à 6 atomes de carbone et en position 2 ou 8 lorsque le radical Ri contient de 7 à 9 atomes de carbone.
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que les composés de formule (I) sont choisis parmi l'acide caprylique, ses dérivés hydroxylés en position 2 ou 8, leurs sels et leurs esters.
6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que les atomes de métal alcalin définis pour le radical R sont choisis parmi le sodium et le potassium.
7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que le radical R2 est un radical alkyle en Cι-C4.
8. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée par le fait que le radical alkyle en Cι-C4 défini pour le radical R2 est choisi parmi les radicaux méthyle, éthyle et butyle.
9. Utilisation d'une quantité efficace de caprylate de sodium, à titre de principe actif, pour la préparation d'une composition pharmaceutique de pH neutre destinée à prévenir les infections à bactéries à Gram négatif, notamment à Salmonella, chez l'homme ou chez l'animal.
10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que la quantité efficace desdits composés de formule (I) correspond à des doses unitaires comprises entre 20 mM et 200 mM.
11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que la composition pharmaceutique est administrée par voie orale.
12. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que la composition pharmaceutique est ajoutée à l'eau de boisson et/ou aux aliments distribués à des animaux d'élevage.
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