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WO2000077250A2 - Procede de circularisation d'oligonucleotides autour d'un acide nucleique en double brin, les structures obtenues et leurs applications - Google Patents

Procede de circularisation d'oligonucleotides autour d'un acide nucleique en double brin, les structures obtenues et leurs applications Download PDF

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WO2000077250A2
WO2000077250A2 PCT/FR2000/001655 FR0001655W WO0077250A2 WO 2000077250 A2 WO2000077250 A2 WO 2000077250A2 FR 0001655 W FR0001655 W FR 0001655W WO 0077250 A2 WO0077250 A2 WO 0077250A2
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oligonucleotide
nucleic acid
stranded
double
sequence
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PCT/FR2000/001655
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Christophe Escude
Thérèse GARESTIER
Claude Helene
Thibaut Roulon
Original Assignee
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (I.N.S.E.R.M.)
Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S.)
Museum National D'histoire Naturelle (M.N.H.N.)
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Publication date
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Definitions

  • the subject of the invention is a method of circularization of 1 oligonucleotides around a double-stranded nucleic acid, the structures obtained and their applications.
  • Short chain oligonucleotides have previously been described which can specifically bind to double helix DNA to form a triple helix or triplex structure.
  • the fixation takes place at the level of the large groove of the DNA double helix with establishment of non-covalent interactions.
  • oligonucleotides have been developed with the aim of artificially controlling the expression of specific genes at the level of transcription, but can be used for other applications, such as for example the purification of plasmids.
  • Target cleavage can be achieved with an oligonucleotide covalently linked to an Fe-EDTA or Cu-phenanthroline complex, while psoralen-oligonucleotide conjugates can be crosslinked to their target after UV irradiation.
  • Binding of a preformed circular oligonucleotide to a short double stranded DNA fragment can be accomplished in two topologically distinct ways.
  • the oligonucleotide binds in the large DNA groove while remaining outside this duplex.
  • the circular oligonucleotide circles the duplex after one of the ends of it has slipped into the oligonucleotide circle.
  • This second structure can be inserted into a longer circular double-stranded DNA fragment, but this procedure requires the intervention of ligation steps whose yield and efficiency are limited.
  • the invention relates to a new method allowing the circularization of an oligonucleotide directly around a double-stranded nucleic acid, whatever its length and its topological state and, without the need to modify the target d enzymatically or chemically. 'nucleic acid.
  • This process is based on the development of a three-strand complex, comprising an oligonucleotide which can be wound around the double strand of nucleic acid, and which can be circularized.
  • the circularization process according to the invention is characterized in that it comprises - the incubation of a double-stranded nucleic acid comprising a target sequence, with a single-stranded oligonucleotide comprising a central part capable of binding to said target sequence, linked by spacer sequences to 5 'and 3' terminal sequences, these sequences being either a) complementary to the sequence of an oligonucleotide matrix,
  • a loop oligonucleotide which has a hairpin structure, with a single-strand part and a folded part which forms a double strand
  • said incubation step being carried out under conditions allowing fixing the single-stranded oligonucleotide at the target sequence by formation of reversible bonds, which leads to the winding of the oligonucleotide around its target, and in case x), after a heating step, in order allow the opening of the oligonucleotide and its winding around the target DNA before rehybridization of its ends,
  • this circularization technique can be carried out without chemical or enzymatic modification of the target nucleic acid and only involves a short sequence on the target as a recognition site.
  • the double-stranded nucleic acid used according to the invention consists, according to one embodiment, of a DNA in double helix.
  • double helix DNA can be a linear or circular plasmid, and in particular a supercoiled circular plasmid.
  • this oligonucleotide As regards the single-stranded oligonucleotide, which must be circularized, in accordance with the invention, around the nucleic acid target, this oligonucleotide must be of sufficient length to, on the one hand, bind to the target and , on the other hand,
  • case a) bind to the oligonucleotide matrix
  • case x) allow the hybridization of its ends and the hybridization of the loop oligonucleotide. It can thus comprise more than 20 nucleotides, in particular from 20 to several hundred nucleotides.
  • An oligonucleotide comprising 20 to 300 nucleotides, in particular 30 to 100, is advantageously used with, as central part, intended to be fixed on the nucleic acid target, a sequence, of 10 to 25 nucleotides.
  • oligonucleotides in which the nucleotides are chemically modified at the sugar level, in particular at the 2 ′ position, for example by amino or methoxy groups, or at the base level, for example 5-propinyl-pyrimidines.
  • the single-stranded oligonucleotide used may comprise one or more non-nucleoside links, for example of the hexaethylene glycol type, or be covalently linked to one or more molecules stabilizing the triple helices, such as for example the benzo-indolo-quinolines, benzo-quino-quinoxalines, benzo-pyrido-indoles and benzo-pyrido-quinoxalines.
  • the single-stranded oligonucleotide (case a) or the looped oligonucleotide (case x) can be chemically modified so as to be covalently linked to one or more low molecular weight ligands.
  • Binding of a peptide can be carried out directly on a base, for example using a thymine carrying an amino group in position 5 and a bifunctional binding agent, such as the N-hydroxysuccinimide ester of 4- (N-maleimidomethyl acid). ) - cyclohexane-1-carboxylic (SMCC).
  • a base for example using a thymine carrying an amino group in position 5 and a bifunctional binding agent, such as the N-hydroxysuccinimide ester of 4- (N-maleimidomethyl acid).
  • SMCC cyclohexane-1-carboxylic
  • the single-stranded oligonucleotide binds to the target nucleic acid sequence and wraps around the double-strand, if necessary, constituted, as indicated above, by DNA in double helix.
  • the oligonucleotide can bind simultaneously to two double-stranded sequences carried by two different nucleic acids, in particular two different DNAs, which can be in double helix, and for example plasids.
  • the attachment of the central part to a target DNA sequence in double helix leads to the formation of a triple helix.
  • the target sequence on the double-stranded DNA is then advantageously an oligopurine oligopyrimidine sequence.
  • the binding of the oligonucleotide to the double-stranded nucleic acid in particular the formation of a triple helix, can be induced by adding to the reaction medium a ligand of low molecular weight.
  • a ligand of low molecular weight By decreasing the amount of ligand, or even removing the ligand, it is possible to detach the ring from its target and control its movement along the target.
  • the oligonucleotide binds to an oligopurine sequence of the target.
  • the oligonucleotide can be linked in parallel to the oligopurine strand of the oligopurine sequence. oligopyrimidine or, as a variant, antiparallel with respect to the oligopurine strand of said sequence according to the triplets engaged.
  • the oligonucleotide matrix on which the ends of the single-stranded oligonucleotide a) will hybridize contains 10 to 36 nucleotides.
  • the ends which hybridize with such a matrix then generally comprise, each 5 to 18 nucleotides.
  • the loop oligonucleotide on which the free end of the single-stranded oligonucleotide x) will hybridize contains from 16 to 100 nucleotides.
  • the conditions in particular pH, temperature, ionic strength, are chosen so as to obtain the desired fixation.
  • the operation is carried out at a pH of 3 to 9, in particular 4.5 to 8.5, in particular 6 to 8, with or without heating.
  • hybridization and ligation steps are carried out after the incubation step, in the same or different buffer than that used for the incubation.
  • the temperature depends on the ligation agent used.
  • a chemical agent is used for the circularization of the oligonucleotide.
  • examples include N- (3-dimethylaminopropyl) -N '-ethylcarbodiimide (EDC), cyanogen bromide, or cyanoimidazole.
  • EDC N- (3-dimethylaminopropyl) -N '-ethylcarbodiimide
  • cyanogen bromide or cyanoimidazole.
  • the ligation can be carried out at temperatures below 10 ° C., in particular of the order of 4 ° C.
  • a 5'-iodo and 3 '-phosphorothioate oligonucleotide is used.
  • the chemical circularization reaction is initiated when these ends are juxtaposed, which is obtained by hybridization on a matrix. This reaction can be carried out at temperatures from 4 to 50 ° C, at pH varying from 3 to 8.
  • the ionic concentrations can vary from 0 to 20 mM approximately, for ions such as Mg ", and from 0 to 1M for ions such as Na * or K * .
  • Said oligonucleotide matrix, (case a) or said looped oligonucleotide (case b) are added after the incubation and just before the addition of the ligation agent.
  • the ligase is inactivated, and advantageously the purification of the complex.
  • This purification step can be carried out by loading the sample on a gel, for example a 1% agarose gel, by chromatography, exclusion column, or using beads, optionally using a receptor for a ligand attached to the single strand oligonucleotide, the loop oligonucleotide or the template oligonucleotide.
  • the invention relates, as new products, to the intermediate structures and the circularized structures formed.
  • intermediate nucleic acid structures characterized in that they comprise a single-stranded oligonucleotide as defined above, fixed by reversible bonds to the target nucleic acid sequence.
  • the invention relates to such structures in which the nucleic acid target is a double helix DNA, and in particular a plasmid, in particular a supercoiled plasmid.
  • the oligonucleotide is attached to the nucleic acid target, wrapped around that target.
  • the oligonucleotide is attached to DNA in a double helix and forms a triple helix.
  • the target sequence of the double-stranded DNA is advantageously an oligopurine sequence.
  • oligopyrimidine is advantageously an oligopurine sequence.
  • These structures include in particular a sequence with 10 to 25 triplets, formed by the oligopurine-oligopyrimidine sequence of the target to which the oligonucleotide is attached.
  • the oligonucleotide is fixed parallel to the strand containing the oligopurine sequence, the triplets formed being for example T.A x T; C.G x C; C.G x G.
  • the oligonucleotide is fixed antiparallel with respect to the oligopurine sequence, the triplets formed being T.A x T; T. x A; C.G x G.
  • the oligonucleotide binds simultaneously to two different nucleic acid sequences, carried by two different nucleic acids, in particular two double helix DNAs, in particular two plasmids.
  • the 2 ends of the oligonucleotide are also hybridized on the oligonucleotide matrix and advantageously connected enzymatically or chemically.
  • the corresponding structures therefore comprise a triplet sequence involving the target nucleic acid, linked on each side, by spacer sequences, to a doublet sequence involving the oligonucleotide matrix.
  • Advantageous structures comprise on the one hand a target comprising 10 to 25 triplets and on the other hand a matrix comprising 10 to 36 doublets, preferably from 14 to 20.
  • the two ends of the oligonucleotide are hybridized to one another and advantageously linked enzymatically or chemically to the two ends of a looped oligonucleotide.
  • the corresponding structures therefore comprise a triplet sequence involving the target nucleic acid, linked on each side, by spacer sequences, to a sequence in rod-loop structure (or hairpin).
  • the invention relates in particular to the structures as defined above but released from the matrix, comprising a double-stranded nucleic acid encircled by a ring formed by a single-stranded oligonucleotide.
  • the ring In the circularized structures obtained the ring is fixed noncovalently to the nucleic acid target. Alternatively, it is free to move along the target nucleic acid. As indicated above, the movement of the ring relative to the target can be controlled by adding or removing a ligand specific for the complex formed between the sequence of the oligonucleotide involved in the binding and that of the target.
  • the oligonucleotide may contain bonds other than phosphodiester, or be chemically linked to other molecules, as defined above.
  • the target is advantageously DNA in double helix.
  • the target is a linear or circular plasmid, in particular a supercoiled circular plasmid.
  • the corresponding structure then consists of 2 circular DNA molecules, one in double strand, the other in single strand, which are attached to each other and can be separated, if desired, by breaking of a covalent bond.
  • the two plasmids are linked after circularization covalently.
  • the single-stranded oligonucleotide circularized around the double-stranded nucleic acid allows the labeling of this nucleic acid and thus constitutes a tool of great interest for detection applications or for the purification of nucleic acids.
  • the invention therefore relates to the application of the circularization process defined above for marking or detection of double-stranded nucleic acids, in particular of plasmids, comprising the use of a single-strand (case a) or loop (case x) oligonucleotide linked covalently or not to a molecule of interest.
  • the non-covalent bond can be obtained for example by the use of a biotinylated oligonucleotide which interacts strongly with an avidin or streptavidin molecule linked to a molecule of interest.
  • Such labeling which requires no chemical or enzymatic modification of the target, is particularly advantageous in the case of plasmids and more particularly of supercoiled plasmids.
  • the labeling can be radioactive or chemical, for example using fluorescent groups.
  • the intensity of the labeling can be improved by using anti-streptavidin antibodies coupled to biotin, followed by a second layer of streptavidin-fluorescein.
  • the labeling can be carried out via another nucleic acid molecule capable of hybridizing with the single-stranded oligonucleotide.
  • Detection can also be carried out by a loop replication mechanism which makes it possible to amplify the sequence of the circular single-stranded oligonucleotide.
  • Circularized structures produced with such oligonucleotides advantageously make it possible to count the plasmids in the cells, even present in small numbers, which constitutes an advantage compared to the FISH techniques which do not allow the measurement of transfection efficiency only when the plasmid is present with a very high copy number.
  • the circularization process according to the invention can be implemented to select, for example from degenerate single-stranded nucleic acid sequences, nucleic acid sequences capable of binding to an acid double-stranded nucleic acids, or sequences capable of promoting the penetration of double-stranded nucleic acids into cells, or the targeting of these nucleic acids towards specific cellular compartments, in particular towards the nucleus.
  • oligonucleotide is irreversibly attached to its target, which can be isolated, for example, by chromatography, gel purification, exclusion columns.
  • the invention thus relates to the application of the circularization process defined above for the purification of double-stranded nucleic acids, in particular of plasmids, comprising the use of a single-stranded oligonucleotide or of a looped oligonucleotide covalently linked to a molecule which can interact with another molecule attached to a solid support, in particular an affinity column.
  • Such purification can also be carried out using a single-stranded oligonucleotide circularized around a plasmid and a matrix covalently linked to a molecule which can interact with another molecule attached to a solid support, in particular an affinity column.
  • the invention also relates to the applications of said structures, in particular in detection and in gene therapy.
  • the single-stranded oligonucleotide may comprise a residue of chemical compound chosen to improve, for example, plasmid purification protocols, the intracellular delivery of plasmids to a specific cellular compartment (nucleus, mitochondria, for example), or targeting in gene therapy applications.
  • NLS nuclear localization sequence
  • synthetic molecules of a nature other than peptide for example glycoconjugates or nucleic acid fragments (DNA or RNA) which can be integrated into the sequence of the single-stranded oligonucleotide.
  • peptides having a translocation property may be used, for example a peptide corresponding to residues 48 to 57 of the HIV TAT protein
  • Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys For cell targeting, membrane receptor ligands, for example TGF- ⁇ , will advantageously be used.
  • Sequences with these properties can be isolated by selection-amplification experiments from minicircles containing a random sequence.
  • triplex structures according to the invention is also of interest for specifically repressing the expression of a gene.
  • This repression can be inducible, in particular by using a specific ligand for the triple helices. It is thus possible to eliminate the expression of the transgene by treating patients with said ligand.
  • triplex structures of the invention can also be used to carry out genetic analyzes, for example to detect mutations in cytological samples, or even to study the distribution of certain sequences.
  • FIGS. 1 to 17, respectively represent:
  • FIG. 1 a schematic diagram of the method of circularization of an oligonucleotide around a plasmid and around a DNA in double helix
  • FIG. 2 a target sequence of the plasmid construction pAR1 with insertion of the promoter of the androgen receptor (- 146, +131), a monobrin oligonucleotide to be circularized and an oligonucleotide matrix,
  • FIG. 4 a photo of an electrophoresis gel under denaturing conditions, with the ligation and cleavage products
  • FIG. 5 a photo of a non-denaturing gel showing the dissociation of triple helices in the absence of magnesium
  • - Figure 6 a target sequence of the plasmid construction pGAl, consisting of the insertion of a synthetic duplex between the EcoR I and Pst I sites of the plasmid pBluescript SK +, marketed by Proméga, the sequence of the central part of the oligonucleotide to be circularized for constructs 2 and 3, and the ligands used for construct 1,
  • FIG. 9 a photo of an electrophoresis gel under denaturing conditions, with the ligation products
  • FIG. 10 a photo of an agarose electrophoresis gel, showing the modified or unmodified plasmid and the products of various enzymatic digestions, viewed by lighting with a UV lamp in the presence of ethidium bromide,
  • FIG. 11 a photo of an electrophoresis gel under denaturing conditions, with the ligation products
  • FIG. 12 a photo of an electrophoresis gel under denaturing conditions, with the ligation products
  • FIG. 14 a photo of an electrophoresis gel under non-denaturing conditions, showing the presence of streptavidin attached to the circular oligonucleotide after purification and digestion of the plasmid,
  • FIG. 15 a target sequence of the plasmid construction pBluescript SK +, where the sequence of the single-stranded oligonucleotide, the central part of which fixes by forming a triple helix and the sequence of the mother loop oligonucleotide 32 circularizes together with this oligonucleotide , and
  • Figure 16 a photograph of a gel electrophoresis under denaturing conditions 1, with the ligation products.
  • FIG. 1 The diagram of the circularization process used in the examples is given in FIG. 1, the examination of which shows the central part (1) of the linear oligonucleotide which binds to the large groove of a specific sequence inside the plasmid ( 2) (left part) or double stranded DNA (3) (right part), to form a triple helix complex. Its 5 'and 3' ends (4) and (5) hybridize next to each other, to an oligonucleotide matrix (6) and are linked by a ligation agent (7) to form a circular oligonucleotide (8) padlocked at the plasmid DNA (left part) or to a DNA fragment (right part)
  • FIG. 2 represents the plasmid pAR1 constructed by insertion of the promoter of the mouse androgen receptor (-146, +131) between the BamH I and Xho I site of the plasmid pBL-CAT (in the plasmid pAR4, the GC base pairs indicated by an * have been mutated to TA)
  • SEQ ID No. 1 represents the sequence -119, -70 of the promoter and SEQ ID No. 2, the complementary sequence.
  • the target DNA sequence for the formation of the triple helix is located between positions -102 and -88 on SEQ ID No. 1. It corresponds to SEQ ID No. 4.
  • the mother oligonucleotide 89 comprises
  • a phosphate group is added to the 5 'end of
  • FIG. 6 comprises the sequences of the synthetic duplex between the EcoR I and Pst I sites (SEQ ID No. 8 and SEQ ID No. 9) of the plasmid pGAl.
  • the target sequence is an oligopurine sequence. 20 bp oligopyrimidine (SEQ ID No. 10).
  • Those of construction 2 have a central part of 18 nucleotides composed of G and T
  • the oligonucleotides of construction 3 have a central part of 15 nucleotides composed of T and C (SEQ ID No. 17).
  • the single-stranded oligonucleotide corresponding to the following sequence was produced: 5 'CGTACGGTCGACGCTAGCTTTTCTCTTCTCCTTTCTCTTTTTCACGTGGAGCTCGGATCC 3' (SEQ ID NO: 18).
  • SEQ ID NO: 18 The single-stranded oligonucleotide corresponding to the following sequence was produced: 5 'CGTACGGTCGACGCTAGCTTTTCTCTTCTCCTTTCTCTTTTTCACGTGGAGCTCGGATCC 3' (SEQ ID NO: 18).
  • the 89-mer oligonucleotide (10 fmol) is incubated in 10 ⁇ l of 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 lOmM MgCl, 10 mM dithiothreitol, 1 mM ATP, 25 ⁇ g / ml of albumin bovine serum, in the absence of
  • the samples are heated to 75 ° C, then cooled to 37 ° C and loaded onto a 6% polyacrylamide gel.
  • the migration is carried out at 37 ° C. in a TBE buffer containing 10 mM of MgCl 2 •
  • the labeled oligonucleotide migrates along with the plasmid. This migration does not occur with the plasmid pAR4, in which the formation of the triple helix does not can occur as a result of 6 G to T mutations in the target sequence (these mutations are shown in Figure 2, and designated by an asterisk).
  • the labeled oligonucleotide migrates along with the 700 bp fragment which contains the target sequence.
  • the 89-mer labeled oligonucleotide is incubated as described above with reference to FIG. 3 when, as the ligase, the phage T4 DNA ligase is used as ligase.
  • the phage T4 DNA ligase is used as ligase.
  • Ampligase a Tris-HCl buffer using 20 mM (pH 8.3), 25 mM KC1, lOmM MgCl 2, 0.5 mM NAD, 0.01% Triton XlOO and with E. coli ligase, 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.8), 2 mO MgCl, 10 mM DTT, 26 ⁇ M NAD, bovine serum albumin 25 ⁇ g / ml.
  • the ligation reaction is carried out at 45 ° C, for 1 hour, using 40 U of T4 DNA ligase (New England, Biolabs). Carrying out the reaction at this temperature makes it possible to reduce the formation of molecules of linear dimers which are formed as a result of the ligation of two different 89-mer oligonucleotides which hybridize to the 20-mer matrix.
  • the ligase is inactivated by heat for 15 minutes at 65 ° C before treatment with restriction endonucleases. The results of the various tests are given in FIG. 4. In tracks 3 to 6 and 8, the plasmid is present during the ligation reaction.
  • the plasmid is added after circularization of the 89-mer oligonucleotide, followed by heat denaturation of the DNA ligase, as indicated by the asterisk.
  • the samples are precipitated by addition of ethanol and resuspended in 80% formamide, 10 mM NaOH, 1 mM EDTA as loading buffer.
  • the reaction mixture is heated at 90 ° C for 5 minutes, then loaded onto a 6% denaturing polyacrylamide gel.
  • the ligation is also carried out in the presence of the plasmid pAR1, under conditions allowing the formation of the triple helix.
  • the labeled oligonucleotide is transformed into a species with a very low migration speed, similar to that of the plasmid itself, as revealed by the ethidium bromide staining ( Figure 4, lane 4).
  • the sample was treated with the restriction endonuclease Xho I, which makes it possible to linearize the plasmid pAR1.
  • restriction endonuclease BsiW I This enzyme does not cleave pAR1, but can cleave the circular oligonucleotide in the presence of the oligonucleotide template.
  • the cleavage product migrates exactly as
  • the two molecules remain associated under highly denaturing conditions and can only be separated by breaking the chemical bonds.
  • the circular oligonucleotide capable of forming a triple helix, can diffuse in one dimension along the double helix.
  • the samples are prepared as described above in the presence of magnesium and loaded onto a 6% polyacrylamide gel free of magnesium.
  • the migration is carried out at 37 ° C. in a TBE buffer in the absence of MgCl 2 .
  • the radiolabelled oligonucleotide remains associated with the plasmid only when it has been circularized in the presence of the plasmid and of magnesium before loading the gel (lane 4).
  • the circular oligonucleotide remains associated with the linear plasmid when the gel contains magnesium, but dissociates in the absence of magnesium, although the cleavage site is located 200 bp from the target site of the triple helix.
  • the plasmid is added after circularization of the 89 mer oligonucleotide, followed by heat denaturation of the DNA ligase.
  • oligonucleotide which can be a 59-mer (tracks 1 to 6), a 69-mother (tracks 7 to 12), or an 89-mother (tracks 13 to 18) (OFMOL) is incubated in the medium. described in connection with
  • FIG. 3 in Example 2 in the absence of plasmid (lanes 1,2,7,8,13,14), in the presence of pGAl (l ⁇ g) (lanes 4,5,6,10,11,12 , 16, 17, 18), or in the presence of plasmid pBluescript which does not contain the target for the formation of the triple helix (l ⁇ g) (tracks 3.9 and 15) and in some cases in the presence of ligand SD46 (4 ⁇ M) (tracks 3,5,6,9,11,12,15,17,18).
  • the samples are heated to 70 ° C, then cooled to 37 ° C.
  • the circularization reaction is carried out at 37 ° C. for 1 h, using 40 U of T4 DNA ligase.
  • the matrix was not added in lanes 1,7 and 13.
  • the ligase is inactivated by heat. 10 ⁇ l of a formamide solution containing charge dyes are then added directly to the samples. The reaction mixture is heated at 90 ° C for 5 min, then loaded onto a 5% denaturing polyacrylamide gel.
  • the oligonucleotide 89-mother is incubated as indicated above, in the presence of plasmid pGAl (l ⁇ g) (tracks 1,2,4 and 5) or pBluescript (tracks 3 and 6), in the presence of 2 ⁇ M of ligand SD27 (tracks 1 to 3) or SD46 (tracks 4 to 6). In tracks 1 and 4, the matrix is omitted. After circularization reaction and inactivation of the ligase, 2 ⁇ l of glycerol were added to the samples which were loaded on a 1% agarose gel and migrated for 30 min at 50V in TBE buffer. The gel was viewed under UV lamp.
  • the results are given in FIG. 9.
  • the 59-mer oligonucleotide (10 fmol) is incubated in 10 ⁇ l of 50 mM MES (pH 6.0), 20 mM MgCl 2 , 3 mM DTT, ATP 1 mM, in the absence of plasmid (lanes 1 and 2), in the presence of pGAl (5 ⁇ g) (lane 4) or pBluescript (lane 3).
  • the samples are heated to 70 ° C, then cooled to 4 ° C. After approximately 14 h, the circularization reaction is carried out at room temperature, for 2 h, using 40 U of T4 DNA ligase. The ligase is inactivated by heat.
  • the oligonucleotide can be circularized by the DNA ligase of phage T4 (lane 2). It is circularized around the plasmid when it contains the target sequence for the formation of the triple helix (well 4).
  • oligonucleotides are reported below designed so that they can be circularized around the target sequence of construction 2, and comprising a central part composed of G and T which may be shorter than that used in the oligonucleotides described above (SEQ ID No. 11, 18 nucleotides).
  • this central part can be 14 nucleotides (SEQ ID No 19) for the 57-mer oligonucleotide (SEQ ID No 21) or even 12 nucleotides (SEQ ID No 20) for the 54-mother oligonucleotides (SEQ ID N ° 22), 43-mother (SEQ ID N ° 23), 33-mother (SEQ ID N ° 24).
  • SEQ ID N ° 19 GTTTGGGTGTTGTG
  • the oligonucleotides SEQ ID Nos. 21, 22, 23 and 24 can be circularized around their target carried by the plasmid pGAl.
  • Example 8 Dissociation of triple helices when extracting the specific ligand for triple helices with a trap oligonucleotide forming an intramolecular triple helix: analysis of the mobility of the circular oligonucleotide along the plasmid.
  • a trap oligonucleotide (SEQ ID No. 25) is used, capable of forming an intramolecular triple helix,
  • the plasmid pGA2 is used which is derived from the plasmid pGAl by the introduction of two mutations which reveal a unique restriction site for the enzyme Bgl II. This site partially covers the binding site of the oligonucleotides forming triple helices, represented by a black line (FIG. 10). The formation of a triple helix inhibits cleavage by this restriction enzyme.
  • the samples are prepared as follows.
  • the mother oligonucleotide 59 (SEQ ID No. 14) (1 ⁇ M) is incubated in the T4 DNA ligase buffer (50 mM tris-HCl, 10 mM
  • the reaction is stopped after 20 minutes by adding 5 ⁇ L of a 1% SDS solution - 0.4 M EDTA.
  • the samples are then precipitated with 1 ethanol and loaded onto a 1% agarose gel migrated in a 0.5 buffer. x TBE.
  • Well 1 shows the supercoiled plasmid pGA2, whose migration profile reveals the supercoiled plasmid (se) with the presence of a small amount of released plasmid (oc).
  • Well 2 shows the linearized plasmid pGA2 (1) after cutting by the enzyme Bgl II.
  • the circularization reaction as described above was carried out in wells 3 to 8.
  • Wells 9 to 14 were subjected to the same treatment, but the matrix and the ligase were not added.
  • Wells 4, 5, 7, 10, 11 and 13 were treated with the enzyme Bgl II (B), wells 8 and 14 with the enzyme Hind III (H).
  • TRAP trap oligonucleotide
  • SEQ ID No. 26 and its complement SEQ ID No. 27 which is present in the origin of replication of phage fl, and as such in many plasmids commonly used in research laboratories, for example the pBluescript plasmids (sold by Stratagene), pUC family plasmids, pGFP family plasmids (sold by Clontech), pGL family plasmids (sold by Proméga). This sequence is not present in the plasmid pBR322.
  • the oligonucleotides of construction 4 have a central part composed of G and T (SEQ ID No. 28). They can also carry one or two molecules of biotin grafted in position 5 of a thymine. SEQ ID N ° 28 TTTGTTGGGTTGGTTTGT The following oligonucleotides have been developed:
  • CGTACGGTCGACGCXAGCTTTTTGTTGGGTTGGTTTGTTTTCACGTGGAGCTCGGATCC (X represents a thymine carrying a biotin in position 5).
  • CGTACGGTCGACGCXAGCTTTTTGTTGGGTTGGTTTGTTTTCACGXGGAGCTCGGATCC (X represents a thymine carrying a biotin in position 5).
  • the oligonucleotides of construction 5 have a central part composed of C and T (SEQ ID No. 32) SEQ ID No. 32 TCTTTCCTTCCCTTCTTT
  • Example 9 Analysis of the ligation products by gel electrophoresis under denaturing conditions, with construction 4.
  • No. 30 and SEQ ID No. 31 are used respectively in wells 1 to 5, 6 to 10 and 11 to 15.
  • the radiolabeled 5 'oligonucleotides (10 nM) are incubated in the absence of plasmid (wells 1, 2 , 6, 7, 11 and 12), with 1 ⁇ g of plasmid pBluescript (wells 3, 8 and 13), 1 ⁇ g of plasmid pEGFPCl (wells 4, 9 and 14), or 1 ⁇ g of plasmid pBR322 (wells 5, 10 and 15), in a T4 DNA ligase incubation buffer in the presence of 20 ⁇ M BQQ. After having heated the samples to 65 ° C. and then cooled to 37 ° C., the 20-mer template oligonucleotide and 4 ⁇ l of T4 DNA ligase are added. The reaction is carried out at 45 ° C for 1 h.
  • Example 11 Another sequence used to circularize an oligonucleotide around a double-stranded DNA.
  • the target sequence used is an oligopurine sequence.
  • 23 base pair oligopyrimidine SEQ ID No. 35 for the oligopurine portion which is present in the promoter of the murine IGF1 gene.
  • this sequence is carried by the plasmid pl71lb / luc.
  • This plasmid is constructed by cloning the sequence (-1711, +328) of the murine IGF1 gene into the plasmid pGL2 (Proméga).
  • the oligonucleotide of construction 6 has a central part composed of G and T (SEQ ID N ° 36) capable of
  • the single strand oligonucleotide (SEQ ID NO: 37) used for the circularization experiments is produced from this sequence in the same way as the oligonucleotide SEQ ID No: 14 is designed from the sequence SEQ ID No 11.
  • oligonucleotide SEQ ID No. 37 can be circularized around its target carried by the plasmid pl711b / luc.
  • the oligonucleotide of construction 7 has a central part composed of G and T (SEQ ID No ll) capable of
  • the oligonucleotide of construction 8 (SEQ ID No 40) has a central part composed of C and T (SEQ ID No 32) capable of binding to the plasmid pBluescript SK + thanks to the target sequence (SEQ ID No 26 and its complementary SEQ ID N ° 27).
  • Example 12 Analysis of the chemical ligation and cleavage products by gel electrophoresis under non-denaturing conditions, with construction 7.
  • oligonucleotide of construction 8 (SEQ ID No. 40) can be circularized around the plasmid pBluescript SK + in the acetate buffer at pH 4.5 described in Example 10.
  • Example 13 Attachment of streptavidin to a plasmid carrying a biotinylated oligonucleotide.
  • Biotinylated (SEQ ID NO: 30) (well 1 to 9) or non-biotinylated (SEQ ID No: 29) (well 10 to 12) oligonucleotides 59-mer (well 10 to 12), radiolabelled in 5 ′, were circularized as described in the example 9, in the absence (wells 3 and 4) or in the presence (wells 5 to 12) of the plasmid pGA2. Streptavidin (200 nM) was then added to wells 2, 4, 6, 9, 11 and 12.
  • the complexes were then precipitated (wells 7, 8, 9 and 12) in order to remove the oligonucleotides which did not are not circularized around the plasmid, then optionally digested with the Hind III restriction endonuclease (wells 8, 9 and 11).
  • FIG 14 summarizes the results obtained.
  • O denotes the migration position of the oligonucleotides alone.
  • OS designates the migration position of the oligonucleotide-streptavidin complexes
  • P designates the migration position of plasmin.
  • Complexation of streptavidin slows the migration of the linear (well 2) or circular (well 4) oligonucleotide. The precipitation makes it possible to eliminate the oligonucleotides which are not linked to the plasmid (well 7). After digestion with Hind III, it can be observed that the circular biotinylated oligonucleotide is released from the plasmid, alone (well 8) or linked to streptavidin (well 9).
  • the radiolabelled biotinylated oligonucleotide is added after precipitation of a complex formed with the non-biotinylated 59-mer in the presence of streptavidin, the migration of this oligonucleotide is not delayed (well 12), which demonstrates that the precipitation of the streptavidin is indeed due to its attachment to the biotinylated oligonucleotide attached to the plasmid.
  • FIG. 15 The principle of the circularization process used is given in FIG. 15, the examination of which reveals the central part of the linear oligonucleotide (1) which can bind in the large groove of a specific sequence inside the plasmid (2 ) to form a triple helix complex (3), and 5 'and 3' ends capable of hybridizing to each other by forming a short double helix (4).
  • One end protrudes from the short double-stranded sequence by a single-stranded sequence (5).
  • This end can form a double-strand with a complementary single-strand sequence (6) protruding from an oligonucleotide which has the form of a loop or hairpin (7).
  • this double-strand results in the juxtaposition of the 5 'and 3' ends of the single-strand and loop oligonucleotides. These ends are then linked by a ligation agent to form a circular oligonucleotide locked with plasmid DNA or with a DNA fragment.
  • the looped oligonucleotide can be chemically modified so as to carry, for example, a biotin molecule, or else an amino function which can be used to covalently link a peptide to this oligonucleotide.
  • a biotin molecule or else an amino function which can be used to covalently link a peptide to this oligonucleotide.
  • FIG. 15 represents the target sequence located on the plasmid pBluescript SK + (SEQ ID Nos. 26 and 27).
  • the figure also gives the complete sequence of the mother oligonucleotide 63 (SEQ ID No. 41) on which the site binding to the target has been indicated ("triplex site") and which corresponds to SEQ ID No. 28, and the sequence of the 32 nucleotide loop oligonucleotide (SEQ ID NO: 42).
  • the mother oligonucleotide 63 comprises:
  • the 32-mer oligonucleotide comprises:
  • a construction of analogous structure was carried out using as target sequence of the formation of a triple helix that of constructions 2 and 3 (SEQ ID No. 10), using an oligonucleotide 63 mother (SEQ ID No. 43) or 73 mother (SEQ ID No. 44) whose central part forming a triple helix contains G and T (SEQ ID No. 11).
  • Example 14 Analysis of the ligation products by gel electrophoresis under denaturing conditions, with construction 9.
  • the radiolabeled mother oligonucleotide 63 (SEQ ID No. 41) is incubated in the T4 DNA ligase buffer, the sample is heated to 80 ° C. before the subsequent ligation step using the T4 phage DNA ligase.
  • the ligation reaction is carried out at 37 ° C., for one hour, by adding the loop oligonucleotide and 40 ⁇ l of T4 DNA ligase (New England Biolabs).
  • the reaction is then stopped by adding an equivalent volume of a loading solution containing 80% formamide, 10 mM NaOH and 1 mM EDTA.
  • the reaction mixture is heated at 90 ° C for 5 minutes, then loaded onto an 8% denaturing polyacrylamide gel.
  • the linear oligonucleotide 63-mer is transformed into a circular molecule of 95 nucleotides.
  • the low intensity intermediate band corresponds to a linear 95-mer, obtained when only one of the two ligation reactions is carried out.
  • Example 15 Synthesis of a loop peptide-oligonucleotide conjugate.
  • NLS peptide was conjugated to a loop oligonucleotide by the reaction described using FIG. 17.
  • the oligonucleotide (6 nmol) carrying an amino group grafted in position 5 of a thymine is taken up in 50 ⁇ l of a 100 mM Borate pH 8.5 solution.
  • 50 ⁇ l of a 30 mM solution of SMCC (Sigma catalog) in DMF are added and the mixture is left to incubate for 1 h 30 min. This results in an oligonucleotide-maleimide conjugate capable of reacting with a cysteine carried by a peptide.
  • the excess SMCC is removed by passge on a nick-spin column (Amersham Pharmacio Biotech) pre-equilibrated with PBS buffer (GibcoBRL).
  • PBS buffer GibcoBRL
  • the NLS peptide 100 nmol is then added and the reaction is allowed to proceed overnight at room temperature with stirring.
  • the reaction product is purified on a 12% denaturing polyacrylamide gel.

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Abstract

Le procédé de circularisation d'un oligonucléotide selon l'invention comprend: l'incubation d'un acide nucléique double brin comprenant une séquence cible, avec un oligonucléotide simple brin comprenant une partie centrale capable de se fixer sur ladite séquence cible, reliée par des séquences espaceurs à des séquences terminales en 5' et 3', ces séquences étant: soit a) complémentaires de la séquence d'une matrice oligonucléotidique; soit x) partiellement complémentaires l'une de l'autre, de manière à pouvoir s'hybrider l'une à l'autre en formant un double brin tout en conservant une extrémité en simple brin, laquelle est capable de s'hybrider à la séquence terminale d'un autre oligonucléotide, dit oligonucléotide-boucle, qui possède une structure en épingle à cheveux, avec une partie en simple brin et une partie repliée qui forme un double brin, la mise en contact, dans le premier cas a), du complexe formé avec ladite matrice oligonucléotidique, dans des conditions permettant l'hybridation des extrémités 5' et 3', de manière adjacente, à la matrice, et dans le cas x), celle du complexe formé avec ledit oligonucléotide-boucle, dans des conditions permettant, par l'hybridation des extrémités libres de l'oligonucléotide simple brin et de l'oligonucléotide-boucle, la juxtaposition des extrémités 5' et 3' de ces oligonucléotides, la ligation des extrémités hybridées, de manière à circulariser l'oligonucléotide autour de l'acide nucléique double brin et, si on le souhaite, l'isolement de la structure circularisée. Application du procédé et des structures obtenues en diagnostic et thérapeutique.

Description

PROCEDE DE CIRCU ARISATION D'OLIGONUCLEOTIDES AUTOUR D'UN ACIDE NUCLEIQUE EN DOUBLE BRIN, LES STRUCTURES OBTENUES ET LEURS
APPLICATIONS
L'invention a pour objet un procédé de circularisation d1 oligonucleotides autour d'un acide nucléique en double brin, les structures obtenues et leurs applications.
On a déjà décrit des oligonucleotides à courte chaîne pouvant se fixer spécifiquement à de l'ADN en double hélice pour former une structure en triple hélice ou triplex. La fixation s'effectue au niveau du grand sillon de la double hélice d'ADN avec établissement d'interactions non covalentes .
De tels oligonucleotides ont été développés dans le but de contrôler artificiellement l'expression de gènes spécifiques au niveau de la transcription, mais peuvent être utilisés pour d'autres applications, comme par exemple la purification de plasmides.
On a également proposé de modifier chimiquement les oligonucleotides formant des triplex pour induire des modifications irréversibles des acides nucléiques cibles. Le clivage de la cible peut être obtenu avec un oligonucleotide lié de manière covalente à un complexe Fe-EDTA ou Cu-phénanthroline, tandis que des conjugués psoralène-oligonucléotides peuvent être réticulés à leur cible après irradiation UV.
L'intérêt s'est porté, ces dernières années, sur des oligonucleotides circulaires en raison de leurs propriétés topologiques et de reconnaissance d'acides nucléiques. Par rapport aux oligonucleotides linéaires, les oligonucleotides circulaires permettent de concevoir des outils d'analyse génétique améliorés, en particulier grâce à leur amplification efficace par réplication en boucle.
La liaison d'un oligonucleotide circulaire préformé à un court fragment d'ADN en double brin peut être effectuée selon deux voies topologiquement distinctes .
Dans l'une de ces voies, 1 'oligonucleotide se fixe dans le grand sillon de l 'ADN tout en restant à l'extérieur de ce duplex. Dans l'autre voie, 1 'oligonucleotide circulaire encercle le duplex après que l'une des extrémités de celui-ci se soit glissée dans le cercle oligonucléotidique. Cette deuxième structure peut être insérée dans un fragment d'ADN en double brin circulaire plus long, mais cette procédure nécessite l'intervention d'étapes de ligation dont le rendement et l'efficacité sont limités.
L'invention vise un nouveau procédé permettant la circularisation d'un oligonucleotide directement autour d'un acide nucléique en double brin, quels que soient sa longueur et son état topologique et, sans qu'il soit nécessaire de modifier enzymatiquement ou chimiquement la cible d'acide nucléique. Ce procédé repose sur l'élaboration d'un complexe à trois brins, comportant un oligonucleotide pouvant s'enrouler autour du double brin d'acide nucléique, et pouvant être circularisé.
Le procédé de circularisation selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend - l'incubation d'un acide nucléique double brin comprenant une séquence cible, avec un oligonucleotide simple brin comprenant une partie centrale capable de se fixer sur ladite séquence cible, reliée par des séquences espaceurs à des séquences terminales en 5 ' et 3 ' , ces séquences étant soit a) complémentaires de la séquence d'une matrice oligonucléotidique ,
- soit x) partiellement complémentaires l'une de l'autre, de manière à pouvoir s'hybrider l'une à l'autre en formant un double brin tout en conservant une extrémité en simple brin, laquelle est capable de s'hybrider à la séquence terminale d'un autre oligonucleotide, dit oligonucléotide-boucle, qui possède une structure en épingle à cheveux, avec une partie en simple brin et une partie repliée qui forme un double brin, ladite étape d'incubation étant réalisée dans des conditions permettant la fixation de 1 'oligonucleotide simple brin au niveau de la séquence cible par formation de liaisons réversibles, ce qui conduit à l'enroulement de 1 ' oligonucleotide autour de sa cible, et dans le cas x) , après une étape de chauffage, afin de permettre l'ouverture de 1 ' oligonucleotide et son enroulement autour de l'ADN cible avant réhybridation de ses extrémités,
- la mise en contact dans le premier cas a) du complexe formé avec ladite matrice oligonucléotidique, dans des conditions permettant l'hybridation des extrémités 5' et 3', de manière adjacente, à la matrice, et dans le cas x) , la mise en contact du complexe formé avec ledit oligonucléotide-boucle, dans des conditions permettant, par l'hybridation des extrémités libres de 1 'oligonucleotide simple brin et de 1 ' oligonucléotide-boucle, la juxtaposition des extrémités 5' et 3' de ces oligonucleotides , la ligation des extrémités hybridées, de manière à circulariser 1 'oligonucleotide simple brin (cas a) ou
1 'oligonucleotide simple brin et 1 ' oligonucleotide boucle (cas x) , autour de l'acide nucléique double brin et, si on le souhaite,
- l'isolement de la structure circularisée, où l'acide nucléique cible est cadenassé par 1 'oligonucleotide circulaire, suivi le cas échéant de sa purification.
On observera que, de manière avantageuse, cette technique de circularisation est réalisable sans modification chimique ou enzymatique de l'acide nucléique cible et n'implique qu'une courte séquence sur la cible comme site de reconnaissance .
L'acide nucléique double brin mis en oeuvre selon l'invention est constitué, selon un mode de réalisation, par un ADN en double hélice.
On notera qu'un tel ADN en double hélice peut être un plasmide linéaire ou circulaire, et notamment un plasmide circulaire surenroulé.
En ce qui concerne 1 ' oligonucleotide simple brin, qui doit être circularisé, conformément à l'invention, autour de la cible d'acide nucléique, cet oligonucleotide doit avoir une longueur suffisante pour, d'une part, se lier à la cible et, d'autre part,
- cas a) se lier à la matrice oligonucléotidique, cas x) permettre l'hybridation de ses extrémités et l'hybridation de 1 ' oligonucleotide boucle. Il peut ainsi comporter plus de 20 nucléotides, notamment de 20 à plusieurs centaines de nucléotides. On utilise avantageusement un oligonucleotide comportant de 20 à 300 nucléotides, notamment de 30 à 100, avec comme partie centrale, destinée à se fixer sur la cible d'acide nucléique, une séquence, de 10 à 25 nucléotides.
Selon une disposition de l'invention, on peut utiliser des oligonucleotides simple brin dans lesquels l'enchaînement comportant des bases nucléiques n'est pas constitué que de liaisons internucléosidiques naturelles de type phosphodiester, mais peut comporter par exemple des liaisons de type phosphorothiate, phosphora idate, méthylphosphonate ou acide nucléique peptidique, ou des mélanges de ces liaisons.
On peut également utiliser des oligonucleotides simple brin dans lesquels les nucléotides sont modifiés chimiquement au niveau des sucres, notamment en position 2', par exemple par des groupements amino ou méthoxy, ou au niveau des bases, par exemple de 5-propinyl-pyrimidines .
L 'oligonucleotide simple-brin mis en oeuvre peut comporter un ou plusieurs liens non nucléosidiques, par exemple de type hexaéthylène glycol, ou être relié covalemment à une ou plusieurs molécules stabilisant les triple-hélices, comme par exemple les benzo-indolo-quinolines, les benzo-quino- quinoxalines, les benzo-pyrido-indoles et les benzo-pyrido- quinoxalines .
Selon une autre disposition de l'invention, 1 ' oligonucleotide simple-brin (cas a) ou 1 ' oligonucleotide boucle (cas x) peuvent être modifiés chimiquement de manière à être relié covalemment à un ou plusieurs ligands de faible masse moléculaire .
II peut s'agir par exemple de molécules fluorescentes, de marqueurs comme la biotine, ou de peptides. La liaison d'un peptide peut être effectuée directement sur une base, par exemple en utilisant une thymine portant un groupement amino en position 5 et un agent de liaison bifonctionnel , comme le N- hydroxysuccinimide ester de l'acide 4- (N-maléimidométhyl) - cyclohexane-1-carboxylique (SMCC) .
De manière générale, 1 'oligonucleotide simple brin se lie à la séquence cible d'acide nucléique et s'enroule autour du double brin constitué, le cas échéant, comme indiqué plus haut, par un ADN en double hélice.
On observera que l 'oligonucleotide peut se fixer simultanément sur deux séquences en double brin portées par deux acides nucléiques différents, notamment deux ADN différents, qui peuvent être en double hélice, et par exemple des plas ides .
Dans un mode de réalisation de l'invention, la fixation de la partie centrale sur une séquence cible d'ADN en double hélice conduit à la formation d'une triple hélice.
La séquence cible sur l'ADN double brin est alors avantageusement une séquence oligopurine oligopyrimidine .
La liaison de 1 'oligonucleotide à l'acide nucléique en double brin, notamment la formation d'une triple hélice, peut être induite en ajoutant au milieu réactionnel un ligand de faible poids moléculaire . En diminuant la quantité de ligand, ou même en supprimant le ligand, il est possible de désolidariser l'anneau de sa cible et de contrôler son mouvement le long de la cible.
Dans un mode préféré de l'invention, 1 'oligonucleotide se fixe au niveau d'une séquence oligopurine de la cible.
La liaison de l' oligonucleotide peut se faire parallèlement au brin oligopurine de la séquence oligopurine. oligopyrimidine ou, en variante, antiparallèlement par rapport au brin oligopurine de ladite séquence selon les triplets engagés.
La matrice oligonucléotidique sur laquelle vont s'hybrider les extrémités de 1 ' oligonucleotide simple brin a) renferme 10 à 36 nucléotides. Les extrémités qui s'hybrident avec une telle matrice comportent alors généralement, chacune 5 à 18 nucléotides.
L ' oligonucleotide boucle sur lequel va s'hybrider l'extrémité libre de 1 ' oligonucleotide simple brin x) contient de 16 à 100 nucléotides. Les extrémités simple brin de ces deux oligonucleotides s'hybrident en formant une double hélice qui comporte généralement de 4 à 40 pb.
Pour la réalisation de l'incubation, les conditions notamment de pH, température, force ionique, sont choisies de manière à obtenir la fixation recherchée. De manière générale, on opère à un pH de 3 à 9 , notamment de 4,5 à 8,5, en particulier de 6 à 8 , avec ou sans chauffage .
Les étapes d'hybridation et de ligation, sont effectuées après l'étape d'incubation, dans un tampon identique ou différent de celui utilisé pour l'incubation.
La température dépend de l'agent de ligation utilisé.
Il peut s'agir d'une enzyme. On opérera alors avantageusement à une température de 16 à 45°C avec une ligase de E. coli , ou encore de 35 à 65°C avec une ligase thermostable comme celle commercialisée sous la marque Ampligase.
En variante, on utilise un agent chimique pour la circularisation de l' oligonucleotide . On citera par exemple le N- (3-diméthylaminopropyl) -N' -éthylcarbodiimide (EDC) , le bromure de cyanogène, ou le cyanoimidazole. Avec de tels agents, la ligation peut être effectuée à des températures inférieures à 10°C, notamment de l'ordre de 4°C.
En autre variante, on utilise un oligonucleotide 5'- iodo et 3 ' -phosphorothioate . La réaction de circularisation chimique est initiée lorsque ces extrémités sont juxtaposées, ce qui est obtenu par hybridation sur une matrice. Cette réaction peut être effectuée à des températures de 4 à 50°C, à des pH variant de 3 à 8.
Les concentrations ioniques peuvent varier de 0 à 20 mM environ, pour des ions tels que Mg", et de 0 à 1M pour des ions tels que Na* ou K* . Ladite matrice oligonucléotidique, (cas a) ou ledit oligonucleotide boucle (cas b) sont ajoutés après l'incubation et juste avant l'addition de l'agent de ligation.
On observe que dans le cas x) , deux réactions de ligation sont réalisées, 1 Oligonucleotide circulaire étant le résultat de la circularisation en chaîne de deux oligonucleotides .
Aux fins d'isolement de la structure complexe, on procède à 1 ' inactivation de la ligase, et avantageusement à la purification du complexe. Cette étape de purification peut s'effectuer en chargeant l'échantillon sur un gel, par exemple un gel d'agarose 1%, par chromâtographie, colonne d'exclusion, ou à l'aide de billes, en utilisant éventuellement un récepteur pour un ligand fixé sur 1 'oligonucleotide simple brin, 1 'oligonucleotide boucle ou 1 ' oligonucleotide matrice.
L'invention vise, en tant que nouveaux produits, les structures intermédiaires et les structures circularisées formées .
Entrent ainsi dans le champ de 1 ' invention des structures intermédiaires d'acides nucléiques caractérisées en ce qu'elles comprennent un oligonucleotide simple brin tel que défini plus haut, fixé par liaisons réversibles sur la séquence cible d'acide nucléique.
Plus spécialement, l'invention vise de telles structures dans lesquelles la cible d'acide nucléique est un ADN en double hélice, et notamment un plasmide, en particulier un plasmide surenroulé. Dans de telles structures, l' oligonucleotide est fixé à la cible d'acide nucléique, enroulé autour de cette cible.
En particulier, l' oligonucleotide est fixé à un ADN en double hélice et forme une triple hélice.
Dans une telle structure, la séquence cible de l'ADN double brin est avantageusement une séquence oligopurine . oligopyrimidine .
Ces structures comprennent notamment une séquence à 10 à 25 triplets, formée par la séquence oligopurine- oligopyrimidine de la cible sur laquelle est fixée 1 'oligonucleotide .
Dans ces triple hélices, 1 'oligonucleotide est fixé parallèlement au brin contenant la séquence oligopurine, les triplets formés étant par exemple T.A x T; C.G x C; C.G x G.
En variante, 1 ' oligonucleotide est fixé antiparallèlement par rapport à la séquence oligopurine, les triplets formés étant T.A x T ; T. x A ; C.G x G.
Dans d'autres structures selon l'invention,
1' oligonucleotide se fixe simultanément sur deux séquences d'acides nucléiques différentes, portées par deux acides nucléiques différents, notamment deux ADN en double hélice, en particulier deux plasmides.
Dans encore d'autres structures intermédiaires, les 2 extrémités de 1 'oligonucleotide sont en outre hybridées sur la matrice oligonucléotidique et avantageusement reliées enzymatiquement ou chimiquement. Les structures correspondantes comportent donc une séquence à triplets impliquant l'acide nucléique cible, reliée de chaque côté, par des séquences espaceurs, à une séquence à doublets impliquant la matrice oligonucléotidique .
Des structures avantageuses comportent d'une part une cible comportant 10 à 25 triplets et d'autre part une matrice comportant 10 à 36 doublets, de préférence de 14 à 20.
Dans d'autres structures intermédiaires, les deux extrémités de 1 ' oligonucleotide sont hybridées l'une à l'autre et avantageusement reliées enzymatiquement ou chimiquement aux deux extrémités d'un oligonucleotide boucle. Les structures correspondantes comportent donc une séquence à triplets impliquant l'acide nucléique cible, relié de chaque côté, par des séquences espaceurs, à une séquence en structure tige-boucle (ou épingle à cheveux) .
L'invention vise notamment les structures telles que définies ci-dessus mais libérées de la matrice, comprenant un acide nucléique double brin encerclé par un anneau formé par un oligonucleotide simple brin.
Dans les structures circularisées obtenues l'anneau est fixé de façon non covalente à la cible d'acide nucléique. En variante, il est libre de se déplacer le long de l'acide nucléique cible. Comme indiqué plus haut, le mouvement de l'anneau par rapport à la cible peut être contrôlé par addition ou suppression d'un ligand spécifique du complexe formé entre la séquence de 1 ' oligonucleotide impliquée dans la liaison et celle de la cible. Dans ces différentes structures, l' oligonucleotide peut contenir des liaisons autres que phosphodiester , ou être chimiquement lié à d'autres molécules, comme défini plus haut.
On observe également que dans le cas x) , le même oligonucleotide boucle, modifié ou non, peut être utilisé pour des oligonucleotides monobrin de séquences différentes, et donc pour des cibles différentes.
Comme indiqué ci-dessus en rapport avec le procédé, la cible est avantageusement de l'ADN en double hélice. En particulier, la cible est un plasmide linéaire ou circulaire, notamment un plasmide circulaire surenroulé. La structure correspondante est alors constituée de 2 molécules d'ADN circulaires, l'une en double brin, l'autre en simple brin, qui sont accrochées l'une à l'autre et peuvent être séparées, si on le souhaite, par rupture d'une liaison covalente.
Dans les structures où l' oligonucleotide est fixé simultanément sur deux séquences différentes d'acides nucléiques, portées par exemple par deux plasmides différents, les deux plasmides sont reliés après la circularisation de manière covalente .
On observera que 1 ' oligonucleotide simple brin circularisé autour de l'acide nucléique double brin permet le marquage de cet acide nucléique et constitue ainsi un outil de grand intérêt pour des applications de détection ou pour la purification des acides nucléiques.
L'invention vise donc l'application du procédé de circularisation défini plus haut pour le marquage ou la détection d'acides nucléiques en double brin, notamment de plasmides, comprenant l'utilisation d'un oligonucleotide monobrin (cas a) ou boucle (cas x) relié covalemment ou non à une molécule d'intérêt. La liaison non-covalente peut être obtenue par exemple par l'utilisation d'un oligonucleotide biotinylé qui interagit fortement avec une molécule d'avidine ou de streptavidine reliée à une molécule d'intérêt.
Un tel marquage, qui ne nécessite aucune modification chimique ou enzymatique de la cible, est particulièrement intéressant dans le cas de plasmides et plus spécialement de plasmides surenroulés .
Le marquage peut être radioactif ou chimique, par exemple en utilisant des groupements fluorescents.
L'intensité du marquage peut être améliorée par utilisation d'anticorps anti-streptavidine couplés à la biotine, suivi d'une deuxième couche de streptavidine- fluorescéine .
Alternativement, le marquage peut être effectué par l'intermédiaire d'une autre molécule d'acide nucléique capable de s'hybrider avec 1 'oligonucleotide simple brin.
La détection peut être également réalisée par un mécanisme de réplication en boucle qui permet d'amplifier la séquence de 1 'oligonucleotide circulaire simple brin.
Des structures circularisées réalisées avec de tels oligonucleotides permettent avantageusement de dénombrer les plasmides dans les cellules, même présents en faible nombre, ce qui constitue un avantage par rapport aux techniques FISH qui ne permettent la mesure d'une efficacité de transfection que lorsque le plasmide est présent avec un nombre de copies très élevé .
Elles permettent également de différencier deux séquences différant par seulement 1 ou 2 mutations, en détectant l' oligonucleotide fixé sur l'une de ces deux séquences grâce à la molécule portée par cet oligonucleotide ou par un procédé de réplication en boucle.
Selon une autre application, on notera que le procédé de circularisation selon 1 ' invention peut être mis en oeuvre pour sélectionner, par exemple parmi des séquences d'acides nucléiques simple brin dégénérées, des séquences d'acides nucléiques capables de se fixer sur un acide nucléique en double brin, ou encore des séquences capables de favoriser la pénétration d'acides nucléiques en double brin dans des cellules, ou le ciblage de ces acides nucléiques vers des compartiments cellulaires spécifiques, en particulier vers le noyau .
Grâce à ce procédé, on forme en effet des structures où 1 ' oligonucleotide est fixé de manière irréversible à sa cible, qui peuvent être isolées, par exemple, par chromatographie, purification sur gel, colonnes d'exclusion. En utilisant des oligonucleotides contenant une séquence partiellement aléatoire, il est possible d'isoler et, si on le souhaite, d'amplifier les séquences qui confèrent à 1 ' oligonucleotide la capacité de se fixer sur la cible d'acide nucléique en s 'enroulant autour de lui. L'invention vise ainsi l'application du procédé de circularisation défini ci-dessus pour la purification d'acides nucléiques double-brin, notamment de plasmides, comprenant l'utilisation d'un oligonucleotide simple brin ou d'un oligonucleotide boucle relié covalemment à une molécule qui peut interagir avec une autre molécule attachée à un support solide, notamment une colonne d'affinité.
Une telle purification peut être également réalisée en utilisant un oligonucleotide simple brin circularise autour d'un plasmide et une matrice reliée covalemment à une molécule qui peut interagir avec une autre molécule attachée à un support solide, notamment une colonne d'affinité.
L'invention vise également les applications desdites structures, notamment en détection et en thérapie génique.
Conformément à l'invention, 1 ' oligonucleotide simple brin peut comporter un résidu de composé chimique choisi pour améliorer par exemple des protocoles de purification de plasmides, la délivrance intracellulaire de plasmides vers un compartiment cellulaire spécifique (noyau, mitochondries, par exemple) , ou le ciblage dans des applications de thérapie génique .
Il est ainsi possible de vectoriser des acides nucléiques double brin, avantageusement des ADN, et en particulier des plasmides, à l'aide de structures dans lesquelles 1 ' oligonucleotide simple brin est couplé, de manière covalente ou non-covalente, à des molécules susceptibles de favoriser sa pénétration à travers la membrane cellulaire et/ou nucléaire. On citera notamment, pour le ciblage nucléaire, des peptides correspondant à la séquence de localisation nucléaire (NLS) du produit du grand antigène T du virus SV40 (Pro-Lys-Lys- Lys-Arg-Lys-Val) ou des molécules synthétiques d'une nature autre que peptidique, par exemple des glycoconjugués ou des fragments d'acides nucléiques (ADN ou ARN) qui peuvent être intégrés dans la séquence de 1 'oligonucleotide simple brin. Pour la pénétration cellulaire, on pourra utiliser des peptides possédant une propriété de translocation, par exemple un peptide correspondant aux résidus 48 à 57 de la protéine TAT du VIH
(Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg) , ou un peptide correspondant aux résidus 43 à 58 de 1 ' homéodomaine de la protéine Antennapedia (Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-
Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys) . Pour le ciblage cellulaire, on utilisera avantageusement des ligands de récepteurs membranaires, par exemple le TGF-α.
Des séquences dotées de ces propriétés peuvent être isolées par des expériences de sélection-amplification à partir de minicercles contenant une séquence aléatoire.
La formation de structures triplex selon 1 ' invention présente également un intérêt pour réprimer spécifiquement l'expression d'un gène. Cette répression peut être inductible, notamment en utilisant un ligand spécifique des triple hélices. Il est ainsi possible d'éliminer l'expression du transgène en traitant les patients avec ledit ligand.
Ils permettent également de relier de manière irréversible, 2 molécules différentes d'acide nucléique circulaire double brin, et notamment 2 plasmides différents, ce qui permet d'augmenter par exemple des rendements de co- transformation de bactéries ou de co-transfection de cellules, en assurant la présence concomittante de 2 plasmides différents.
On notera que la formation de structures triplex de l'invention sont en outre utilisables pour effectuer des analyses génétiques par exemple pour détecter des mutations dans des échantillons cytologiques, ou encore pour étudier la distribution de certaines séquences.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent. Dans la description de ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à 17, qui représentent respectivement :
la figure 1, un diagramme schématique du procédé de circularisation d'un oligonucleotide autour d'un plasmide et autour d'un ADN en double hélice,
- la figure 2, une séquence cible de la construction plasmidique pARl avec insertion du promoteur du récepteur aux androgènes (- 146, +131) , un oligonucleotide monobrin à circulariser et une matrice oligonucléotidique,
- la figure 3, les résultats d'essais montrant la formation d'une triple hélice,
- la figure 4, une photo d'un gel d' électrophorèse en conditions dénaturantes, avec les produits de ligation et de clivage,
- la figure 5, une photo d'un gel non dénaturant montrant la dissociation de triple hélices en l'absence de magnésium, - la figure 6, une séquence cible de la construction plasmidique pGAl, constituée de l'insertion d'un duplex synthétique entre les sites EcoR I et Pst I du plasmide pBluescript SK+ , commercialisé par Proméga, la séquence de la partie centrale de l' oligonucleotide à circulariser pour les constructions 2 et 3 , et les ligands utilisés pour la construction 1,
- la figure 7, une photo d'un gel en conditions dénaturantes, avec les produits de ligation et de clivage,
- la figure 8, une photo d'un gel d' électrophorèse en agarose, avec les produits de ligation, visualisé soit par éclairage avec une lampe UV en présence de bromure d'éthidium (à droite), soit par autoradiographie après séchage du gel (à gauche) , et
- la figure 9, une photo d'un gel d' électrophorèse en conditions dénaturantes, avec les produits de ligation,
- la figure 10, une photo d'un gel d' électrophorèse en agarose, montrant le plasmide modifié ou non et les produits de diverses digestions enzymatiques, visualisé par éclairage avec une lampe UV en présence de bromure d'éthidium,
- la figure 11, une photo d'un gel d* électrophorèse en conditions dénaturantes, avec les produits de ligation,
la figure 12, une photo d'un gel d' électrophorèse en conditions dénaturantes, avec les produits de ligation,
- la figure 13, une photo d'un gel délectrophorèse en conditions non-dénaturantes, montrant que 1 'oligonucleotide circularise autour du plasmide par une réaction chimique comigre avec ce plasmide, et se dissocie ensuite de ce plasmide lorsque celui-ci est linéarisé et la triple hélice est déstabilisée,
la figure 14, une photo d'un gel d ' électrophorèse en conditions non-dénaturantes, montrant la présence de streptavidine fixée sur 1 ' oligonucleotide circulaire après purification et digestion du plasmide,
la figure 15, une séquence cible de la construction plasmidique pBluescript SK+, où la séquence de 1 ' oligonucleotide monobrin dont la partie centrale se fixe en formant une triple- hélice et la séquence de 1 ' oligonucleotide boucle 32 mère se circularise conjointement avec cet oligonucleotide, et
la figure 16, une photo d'un gel d1 électrophorèse en conditions dénaturantes, avec les produits de ligation.
- la figure 17, une description du schéma réactionnel pour la synthèse d'une conjugué peptide-oligonucléotide boucle.
Constructions de triple hélice 1, 2 et 3
Le schéma du procédé de circularisation utilisé dans les exemples est donné sur la figure 1 dont l'examen montre la partie centrale (1) de 1 'oligonucleotide linéaire qui se lie au grand sillon d'une séquence spécifique à l'intérieur du plasmide (2) (partie gauche) ou d'un ADN double brin (3) (partie droite), pour former un complexe à triple hélice. Ses extrémités 5' et 3 ' (4) et (5) s'hybrident l'une à côté de l'autre, à une matrice oligonucléotidique (6) et sont reliées par un agent de ligation (7) pour former un oligonucleotide circulaire (8) cadenassé à l'ADN plasmidique (partie gauche) ou à un fragment d'ADN (partie droite)
Conformément à ce schéma, 3 types de triple hélices différents sont décrits.
.Construction 1, entre les sites BamH I et Xho I :
Cette construction est illustrée par la figure 2 qui représente le plasmide pARl construit par insertion du promoteur du récepteur androgène de souris (-146, +131) entre le site BamH I et Xho I du plasmide pBL-CAT (dans le plasmide pAR4 , les paires de bases G.C. indiquées par un * ont été mutées en T.A.) SEQ ID N° 1 représente la séquence -119, -70 du promoteur et SEQ ID N°2, la séquence complémentaire.
SEQ ID N°l :
5 *AGGGGAGAAAAGGAAAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAGAGAAAGGAGGT
SEQ ID N°2 :
5 ' ACCTCCTTTCTCTCTCCCCTCCCCTCCCCTCCCCTTTCCTTTTCTCCCCT 3 '
La séquence d'ADN cible pour la formation de la triple hélice est localisée entre les positions -102 et -88 sur SEQ ID N° 1. Elle correspond à SEQ ID N" 4.
La figure 2 donne également la séquence complète de
1 Oligonucleotide 89 mère (SEQ ID N° 3) sur laquelle on a indiqué le site se fixant sur la cible ("site triplex") et qui correspond à SEQ ID N° 4, et la séquence de la matrice de 20 nucléotides (SEQ ID N° 5) . SEQ ID N°3 :
5 ' CGTACGGTCGACGCTAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGGGGAGGGGAGGGTTTTTTTTTT TTTTTTTTTCACGTGGAGCTCGGATCC 3 '
L' oligonucleotide 89 mère comporte
- une séquence centrale (SEQ ID N° 4) capable de former une triple hélice :
SEQ ID N° 4 : GAGGGGAGGGGAGGG
- deux lin ers reliant SEQ ID N° 4 à des séquences terminales de dix bases chacune, situées aux extrémités, pouvant former respectivement dix paires de bases avec la matrice de 20 nucléotides (SEQ ID N° 5) ,
SEQ ID N° 5 : CGACCGTACGGGATCCGAGC
On ajoute un groupe phosphate à l'extrémité 5' de
1 ' oligonucleotide pour l'étape suivante de circularisation enzymatique. En utilisant 32P-ATP, on obtient 1 'oligonucleotide radiomarqué .
La position du site de restriction pour BsiW 1 à l'intérieur de la matrice oligonucléotidique de 20 pb est également indiquée .
Deux autres séquences de matrice ont été utilisées, à savoir
SEQ ID N°6, 36-mère:
5' GCTAGCGTCGACCGTACGGGATCCGAGCTCCACGTG 3' SEQ ID N°7, 14 -mère: 5' CCGTACGGGATCCG 3'
.Constructions 2 et 3 , entre Hind III et Pst I :
La figure 6 comprend les séquences du duplex synthétique entre les sites EcoR I et Pst I (SEQ ID N°8 et SEQ ID N° 9) du plasmide pGAl . SEQ ID N° 8 :
5 'AGCTTCGTACGGCGCCCGAGTTAAGGGAGAAGAGGAAAGAGATTGAGCGAGCCCTAGGGACG TCCCGGGCTAGCGAATTCCTGCA 3 '
SEQ ID N°9 :
5 ' GGAATTCGCTAGCCCGGGACGTCCCTAGGGCTCGCTCAATCTCTTTCCTCTTCTCCCTTAAC TCGGGCGCCGTACAG 3 '
La séquence cible est une séquence oligopurine. oligopyrimidine de 20 pb (SEQ ID N° 10).
SEQ ID N°10: 5 " AAGGGAGAAGAGGAAAGAGA 3'
Deux types d' oligonucleotides ont été élaborés de manière à pouvoir être circularises autour de cette séquence cible.
.Construction 2 :
Ceux de la construction 2 comportent une partie centrale de 18 nucléotides composée de G et de T
(SEQ ID N°ll) . Leur longueur totale peut varier de 43 à 89 nucléotides .
SEQ ID N°ll : 5' TGTTTGGTGTTGTGGGTT 3' Les oligonucleotides simple brin correspondants suivants ont été élaborés :
5 ' CGTACGGTCGACGCTAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTTTGGTGTTGTGGGTTTTTTTTTT TTTTTTCACGTGGAGCTCGGATCC 3' (SEQ ID N°12, 89-mère) ,
CGGATCC3 ' (SEQ ID N°13, 69-mère) ,
5 ' CGTACGGTCGACGCTAGCTTTTGTTTGGTGTTGTGGGTTTTCACGTGGAGCTCGGATCC3 ' (SEQ ID N°14, 59 mère) ,
5 ' CGTACGGTCGACGTTTTGTTTGGTGTTGTGGGTTTTGGAGCTCGGATCC3 ' (49-mère) (SEQ ID N°15, 49-mère) , et
5 ' CGTACGGTCGTTTTGTTTGGTGTTGTGGGTTTTGCTCGGATCC3 * (SEQ ID N°16, 43 -mère)
.Construction 3 :
Les oligonucleotides de la construction 3 comportent une partie centrale de 15 nucléotides composée de T et de C (SEQ ID N°17) .
SEQ ID N° 17 : 5' CTCTTCTCCTTTCTCT 3'
L' oligonucleotide simple brin répondant à la séquence suivante a été élaboré : 5 ' CGTACGGTCGACGCTAGCTTTTCTCTTCTCCTTTCTCTTTTTCACGTGGAGCTCGGATCC 3 ' (SEQ ID N°18) . Exemple 1 : Analyse de la formation d'une triple hélice par essai de co-migration
On vérifie la formation d'une triple hélice dans la première construction, entre 1 ' oligonucleotide 89-mère et sa séquence cible sur le plasmide, en procédant à l'essai de co- migration suivant dont les résultats sont donnés sur la figure 3
- l 'oligonucleotide 89-mère (10 fmol) est mis à incuber dans 10 μl de Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), MgCl2 lOmM, dithiothréitol 10 mM, ATP 1 mM, 25 μg/ml d'albumine de sérum bovin, en l'absence de
- plasmide (piste 1 sur la figure 3) , en présence de 60 fmol de pARl surenroulé (piste 2) , 60 fmol de pARl digéré par BamHI et Xho I (piste 3) , et 60 fmol de pAR4 (piste 4) .
Les échantillons sont chauffés à 75°C, puis refroidis à 37°C et chargés sur un gel de polyacrylamide à 6 %.
La migration est effectuée à 37°C dans un tampon TBE contenant 10 mM de MgCl2 •
La coloration du gel avec du bromure d ' éthidium montre que le plasmide surenroulé pénètre entièrement dans le gel
(piste 2) et la comparaison avec la mobilité électrophorétique de marqueurs de poids moléculaires indique que la bande de la piste 3 migre comme un duplex de 700 pb.
Lorsque 1 'oligonucleotide et le plasmide pARl sont incubés ensemble, 1 'oligonucleotide marqué migre en même temps que le plasmide. Cette migration ne se produit pas avec le plasmide pAR4 , dans lequel la formation de la triple hélice ne peut se produire par suite de 6 mutations de G en T dans la séquence cible (ces mutations sont représentées sur la figure 2, et désignées par un astérisque) .
Lorsque pARl est digéré à la fois par Xho I et BamH I, 1 ' oligonucleotide marqué migre en même temps que le fragment de 700 pb qui contient la séquence cible.
Exemple 2 : Analyse des produits de la ligation et du clivage par électrophorèse sur gel dans des conditions dénaturantes avec la construction 1
a - étude des produits de ligation
L' oligonucleotide marqué 89-mère est incubé comme décrit ci-dessus en rapport avec la figure 3 lorqu'on utilise, comme ligase, pour l'étape ultérieure de ligation, l'ADN ligase du phage T4. Avec l'Ampligase, on utilise un tampon Tris-HCl 20 mM (pH 8,3), KC1 25 mM, MgCl2 lOmM, NAD 0,5mM, 0,01% Triton XlOO et, avec la ligase de E. coli , un tampon Tris-HCl 50 mM (pH 7,8), MgCl2 lOmM, DTT 10 mM, NAD 26 μM, albumine de sérum bovin 25 μg/ml .
La réaction de ligation est effectuée à 45°C, pendant 1 heure, en utilisant 40 U de T4 ADN ligase (New England, Biolabs) . La réalisation de la réaction à cette température permet de réduire la formation de molécules de dimères linéaires qui se forment par suite de la ligation de deux oligonucleotides différents 89-mère s ' hybridant à la matrice 20-mère. La ligase est inactivée par la chaleur pendant 15 minutes à 65°C avant traitement par des endonucléases de restriction. Les résultats des différents essais sont donnés sur la figure 4. Dans les pistes 3 à 6 et 8, le plasmide est présent durant la réaction de ligation.
Dans la piste 7, le plasmide est ajouté après la circularisation de 1 ' oligonucleotide 89-mère, suivie d'une denaturation par la chaleur de l'ADN ligase, comme indiqué par l'astérisque. Les échantillons sont précipités par addition d'éthanol et remis en suspension dans du formamide à 80 %, NaOH 10 mM, EDTA 1 mM comme tampon de charge.
Le mélange réactionnel est chauffé à 90°C pendant 5 minutes, puis chargé sur un gel de polyacrylamide dénaturant à 6 %.
On constate à l'examen de la figure 4 qu'en présence de la matrice de 20 oligonucleotides, 1 'oligonucleotide linéaire
89-mère est transformé en une molécule circulaire. La vitesse de migration dans un gel de polyacrylamide dénaturant à 6 % apparaît plus faible.
Comme indiqué ci-dessus, la ligation est également effectuée en présence du plasmide pARl, dans des conditions permettant la formation de la triple hélice.
L ' oligonucleotide marqué est transformé en une espèce ayant une très faible vitesse de migration, similaire à celle du plasmide lui-même, comme le révèle la coloration au bromure d'éthidium (figure 4, piste 4).
La nature de cette espèce a été identifiée selon deux approches différentes. b - étude des produits de clivage
L'échantillon a été traité avec 1 ' endonucléase de restriction Xho I, ce qui permet de linéariser le plasmide pARl .
Ce traitement libère 1 ' oligonucleotide circulaire comme le montre la mobilité électrophorétique (figure 4, piste 6).
En variante, l'échantillon a été traité avec
1 ' endonucléase de restriction BsiW I. Cet enzyme ne clive pas pARl , mais peut cliver 1 ' oligonucleotide circulaire en présence de la matrice de 20 oligonucleotide.
Le produit de clivage migre exactement comme
1 'oligonucleotide linéaire de 89 mère (figure 4, piste 5).
L'espèce à faible migration ne peut pas être détectée dans les essais suivants :
- lorsqu'on utilise, à la place de pARl, pAR4 qui ne forme pas de triplex avec 1 'oligonucleotide de 89 mère (piste 8),
- lorsqu'on ajoute le plasmide pARl après la circularisation de l 'oligonucleotide de 89 mère et la denaturation par la chaleur de la T4 ADN ligase (piste 7) , et également
lorsqu'on utilise pour la circularisation un autre oligonucleotide linéaire qui ne peut pas former de triple hélice. Ces expériences montrent que 1 'oligonucleotide a été circularise autour de la cible d'ADN double brin et par conséquent a été cadenassé au plasmide.
Les deux molécules restent associées dans des conditions fortement dénaturantes et ne peuvent être séparées qu'en rompant les liaisons chimiques.
Toutefois dans ce complexe, 1 ' oligonucleotide circulaire, capable de former une triple hélice, peut diffuser dans une dimension le long de la double hélice.
Exemple 3 : Dissociation des triple hélices en l'absence de magnésium dans un gel non dénaturant
Les échantillons sont préparés comme décrits ci-dessus en présence de magnésium et chargés sur un gel de polyacrylamide à 6 % dépourvu de magnésium.
La migration est réalisée à 37°C dans un tampon TBE en 1 ' absence de MgCl2.
Les résultats des essais sont donnés sur la figure 5.
On ne détecte pas de formation de triple hélice entre
1 'oligonucleotide de 89 mère linéaire et le plasmide pARl lorsqu'on fait migrer les échantillons incubés dans un tampon contenant du magnésium dans un gel non dénaturant, sans magnésium, (figure 5, piste 2) . L ' oligonucleotide radiomarqué ne reste associé avec le plasmide que lorsqu'il a été circularise en présence du plasmide et de magnésium avant de charger le gel (piste 4) .
Lorsque le plasmide est digéré par Xho I,
1 ' oligonucleotide circulaire reste associé au plasmide linéaire lorsque le gel contient du magnésium, mais se dissocie en l'absence de magnésium, bien que le site de clivage soit localisé à 200 pb du site cible de la triple hélice.
Dans la piste 6, le plasmide est ajouté après circularisation de 1 ' oligonucleotide de 89 mère, suivie d'une denaturation par la chaleur de l'ADN ligase.
L'absence de magnésium (ou de tout autre cation divalent) apparaît donc suffisante pour empêcher la formation de la triple hélice et permettre à 1 ' oligonucleotide circulaire de se déplacer autour du plasmide.
D'autres stratégies peuvent être utilisées pour marquer le plasmide de manière à perdre 1 ' interaction de la triple hélice après la ligation, par exemple en formant une triple hélice induite par un ligand ou une valeur donnée de pH.
Exemple 4 :Analyse des produits de ligation et de clivage par électrophorèse sur gel , en conditions dénaturantes avec la construction 2
Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 7 L' oligonucleotide, qui peut être un 59-mère (pistes 1 à 6) , un 69-mère (pistes 7 à 12) , ou un 89-mère (pistes 13 à 18) (lOfmol) est mis à incuber dans le milieu décrit en rapport avec
la figure 3 dans l'exemple 2, en l'absence de plasmide (pistes 1,2,7,8,13,14), en présence de pGAl (lμg) (pistes 4,5,6,10,11,12,16,17,18), ou en présence de plasmide pBluescript qui ne contient pas la cible pour la formation de la triple hélice (lμg) (pistes 3,9 et 15) et dans certains cas en présence de ligand SD46 (4μM) (pistes 3,5,6,9,11,12,15,17,18). Les échantillons sont chauffés à 70°C, puis refroidis à 37°C. La réaction de circularisation est effectuée à 37°C pendant lh, en utilisant 40 U de T4 ADN ligase. La matrice n'a pas été ajoutée dans les pistes 1,7 et 13. La ligase est inactivée par la chaleur. 10 μl d'une solution de formamide contenant des colorants de charge sont alors directement ajoutés aux échantillons. Le mélange réactionnel est chauffé à 90°C pendant 5 min, puis chargé sur un gel de polyacrylamide dénaturant à 5%.
On constate à l'examen de la figure 7 que, en présence de la matrice de 20 nucléotides , les oligonucleotides de 59, 69 et 89-mère sont transformés en des molécules circulaires de migration plus faible. L'apparition de produits de migration très lente n'est observée que si l' oligonucleotide a été préalablement incubé avec le plasmide pGAl contenant la séquence cible et le ligand SD46 . Cette espèce a été traitée avec l' endonucléase de restriction Hind III, ce qui permet de linéariser le plasmide pGAl . Ce traitement libère 1' oligonucleotide circulaire. Ces expériences démontrent que les oligonucleotides ont été circularisées autour du plasmide par formation d'une triple hélice inductible par le ligand SD46. Exemple 5: Radiomarquage d'un plasmide surenroulé à l'aide de 1 ' oligonucleotide 89-mère
Les résultats sont donnés sur la figure 8.
L' oligonucleotide 89-mère est incubé comme indiqué ci- dessus, en présence de plasmide pGAl (lμg) (pistes 1,2,4 et 5) ou pBluescript (pistes 3 et 6) , en présence de 2μM de ligand SD27 (pistes 1 à 3) ou SD46 (pistes 4 à 6) . Dans les pistes 1 et 4, la matrice est omise. Après réaction de circularisation et inactivation de la ligase, 2μl de glycérol ont été ajoutés aux échantillons qui ont été chargés sur un gel d'agarose 1% et migré pendant 30 min à 50V dans du tampon TBE . Le gel a été visualisé sous lampe UV. La présence de bromure d'éthidium dans le gel révèle la présence de plasmide surenroulé dans l'ensemble des puits (à droite) (les puits 7 et 8 contiennent respectivement les plasmides pBluescrpit et pGAl n'ayant subi aucun traitement) . Le gel a été ensuite séché et autoradiographié . Un signal radioactif important est détecté au niveau du plasmide lorsque la circularisation a été effectuée en présence de pGAl et de ligand SD27 ou SD46. Cette expérience démontre que l'état topologique du plasmide n'est pas affecté par les traitements effectués et qu'un oligonucleotide radiomarqué cadenassé à un plasmide permet de radiomarquer ce plasmide .
Exemple 6 : Analyse des produits de ligation par électrophorèse sur gel , en conditions dénaturantes avec la construction 3
Les résultats sont donnés sur la figure 9. L' oligonucleotide 59-mère (10 fmol) est mis à incuber dans 10 μl de MES 50 mM (pH 6,0), MgCl2 20 mM, DTT 3 mM, ATP 1 mM, en l'absence de plasmide (pistes 1 et 2), en présence de pGAl (5 μg) (piste 4) ou pBluescript (piste 3) . Les échantillons sont chauffés à 70°C, puis refroidis à 4°C. Après 14 h environ, la réaction de circularisation est effectuée à température ambiante, pendant 2 h, en utilisant 40 U de T4 ADN ligase. La ligase est inactivée par la chaleur. 10 μl d'une solution de formamide contenant des colorants de charge sont alors directement ajoutés aux échantillons. Le mélange réactionnel est traité comme indiqué plus haut avec la figure 4. Dans ces conditions, 1 'oligonucleotide peut être circularise par l'ADN ligase du phage T4 (piste 2) . Il est circularise autour du plasmide lorsque celui-ci contient la séquence cible pour la formation de la triple hélice (puits 4) .
Exemple 7: Circularisation d'un oligonucleotide autour d'un plasmide avec des séquences triple-hélice et des oligonucleotides de longueur différente
On rapporte ci-après d'autres séquences d' oligonucleotides simple brin élaborés de manière à pouvoir être circularises autour de la séquence cible de la construction 2 , et comportant une partie centrale composée de G et de T pouvant être plus courte que celle utilisée dans les oligonucleotides décrits précédemment (SEQ ID N°ll, 18 nucléotides) . Ainsi cette partie centrale peut être de 14 nucléotides (SEQ ID N°19) pour 1 'oligonucleotide 57-mère (SEQ ID N°21) ou même 12 nucléotides (SEQ ID N°20) pour les oligonucleotides 54-mère (SEQ ID N°22) , 43-mère (SEQ ID N°23), 33-mère (SEQ ID N°24). Leur longueur varie de 31 à 57 nucléotides, et des espaceurs de type hexaéthylèneglycol peuvent être inclus dans la séquence . SEQ ID N°19: GTTTGGGTGTTGTG
SEQ ID N°20: GTGTTGTGGGTT
SEQ ID N°21: CGTACGGTCGACGCTAGCTTTTGTTTGGGTGTTGTGTTTTCACGTGGAGCTCGGATCC
SEQ ID N°22: CGTACGGTCGACGCTAGCTTTTGTGTTGTGGGTTTTCACGTGGAGCTCGGATCC
SEQ ID N°23 : CGTACGGTCGTTTTTTGTGTTGTGGGTTTTTTTGCTCGGATCC
SEQ ID N°24:
CGTACGGTCGTXGTGTTGTGGGTTXGCTCGGATCC (X est un espaceur hexaéthylèneglycol)
Les oligonucleotides SEQ ID N°21, 22, 23 et 24 peuvent être circularises autour de leur cible portée par le plasmide pGAl.
Exemple 8 : Dissociation des triple-hélices lorsqu'on extrait le ligand spécifique des triple-hélices avec un oligonucleotide piège formant une triple-hélice intramoléculaire : analyse de la mobilité de 1 ' oligonucleotide circulaire le long du plasmide.
Dans cet exemple, on utilise un oligonucleotide piège (SEQ ID N°25) , capable de former une triple hélice intramoléculaire,
afin de capturer le ligand intercalé dans les triple-hélices, et ainsi de les déstabiliser. SEQ ID N°25 CTTTCCTTCTCTCCTTTTTGGAGAGAAGGAAAGTTTTTGTTTGGTTGTGTGG
Pour ces expériences, on utilise le plasmide pGA2 qui est dérivé du plasmide pGAl par introduction de deux mutations qui font apparaître un site de restriction unique pour l'enzyme Bgl II. Ce site recouvre partiellement le site de fixation des oligonucleotides formant des triple-hélices, représenté par un trait noir (figure 10) . La formation d'une triple hélice inhibe la coupure par cette enzyme de restriction.
Les échantillons sont préparés de la façon suivante. L' oligonucleotide 59 mère (SEQ ID n°14) (1 μM) , est mis à incuber dans le tampon T4 ADN ligase (50 mM tris-HCl, 10 mM
MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, pH=7.5), en présence de plasmide pGA2
(1 μg dans 10 μl) et d'un ligand spécifique des triple-hélices, le BQQ (20 μM) . Les échantillons sont chauffés à 75°C, puis refroidis doucement à 37°C. La réaction de circularisation est effectuée pendant 1 h à 37°C, en ajoutant 3 μM de matrice et 20u de T4 ADN ligase. La ligase est inactivée par la chaleur. 2 μl de cette solution sont dilués dans 40 μl de tampon de réaction pour 1 ' endonucléase de restriction Bgl II (50 mM tris-HCl, 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, pH=7.9), puis 10 u de Bgl II sont ajoutées. La réaction est arrêtée après 20 minutes par ajout de 5 μL d'une solution SDS 1% - EDTA 0,4 M. Les échantillons sont alors précipités à 1 ' éthanol et chargés sur un gel d'agarose 1% migré dans un tampon 0.5x TBE .
Les résultats des essais sont donnés sur la figure 10.
Le puits 1 montre le plasmide surenroulé pGA2 , dont le profil de migration révèle le plasmide surenroulé (se) avec la présence d'une petite quantité de plasmide relâché (oc) . Le puits 2 montre le plasmide pGA2 linéarisé (1) après coupure par l'enzyme Bgl II. La réaction de circularisation telle que décrite ci- dessus a été effectuée dans les puits 3 à 8. Les puits 9 à 14 ont subi le même traitement, mais la matrice et la ligase n'ont pas été ajoutées. Les puits 4, 5, 7, 10, 11 et 13 ont été traités par l'enzyme Bgl II (B) , les puits 8 et 14 par l'enzyme Hind III (H) . Dans les puits 5, 6, 7, 11, 12 et 13, 1 Oligonucleotide piège (TRAP) (SEQ ID N°25) a été ajouté. Dans les puits 6, 7, 12 et 13, on a ajouté le ligand SD46 après 1 'oligonucleotide piège. On constate à l'examen de cette figure que lorsque la réaction de circularisation a été effectuée, la coupure par l'enzyme de restriction Bgl II est inhibée (puits 4), alors que la coupure par Hind III n'est pas inhibée (puits 8) . Lorsqu'on ajoute un oligonucleotide piège, la coupure par Bgl II est à nouveau observée (puits 5). Enfin, si l'on ajoute SD46 (voir figure 6) , la coupure par Bgl II est à nouveau inhibée (puits 7). La coupure par l'enzyme Bgl II n'est jamais inhibée en absence de circularisation (puits 10, 11, 13, 14) .
Ces résultats démontrent que 1 ' oligonucleotide circulaire forme une triple hélice plus stable que 1' oligonucleotide linéaire et reste fixé sur sa cible après dilution, ce qui aboutit à l'inhibition de la coupure enzymatique. Il est possible de dissocier ce complexe en ajoutant un oligonucleotide piège, ce qui se traduit par la restauration de la coupure par l'enzyme de restriction. Après cette dissociation, l'ajout d'un nouveau ligand spécifique des triple hélices permet de repositionner 1 'oligonucleotide circulaire sur sa cible et d'inhiber à nouveau la coupure enzymatique. .Constructions de triple hélice 4 et 5
La séquence cible utilisée dans les expériences données ci-après est une séquence oligopurine . oligopyrimidine de 18
paires de bases (SEQ ID N°26 et son complémentaire SEQ ID N°27) qui est présente dans l'origine de réplication du phage fl, et à ce titre dans de nombreux plasmides couramment utilisés dans les laboratoires de recherche, par exemple les plasmides pBluescript (vendus par Stratagène) , les plasmides de la famille pUC, les plasmides de la famille pGFP (vendus par Clontech) , les plasmides de la famille pGL (vendus par Proméga) . Cette séquence n'est pas présente dans le plasmide pBR322.
SEQ ID N°26 AGAAAGGAAGGGAAGAAA SEQ ID N°27 TTTCTTCCCTTCCTTTCT
Deux types d ' oligonucleotides ont été élaborés de manière à pouvoir être circularises autour de cette séquence cible.
.Construction 4
Les oligonucleotides de la construction 4 comportent une partie centrale composée de G et T (SEQ ID N°28) . Ils peuvent également porter une ou deux molécules de biotine greffées en position 5 d'une thymine . SEQ ID N°28 TTTGTTGGGTTGGTTTGT Les oligonucleotides suivant ont été élaborés:
SEQ ID N°29
CGTACGGTCGACGCTAGCTTTTTGTTGGGTTGGTTTGTTTTCACGTGGAGCTCGGATCC
SEQ ID N°30
CGTACGGTCGACGCXAGCTTTTTGTTGGGTTGGTTTGTTTTCACGTGGAGCTCGGATCC (X représente une thymine portant une biotine en position 5) .
SEQ ID N°31
CGTACGGTCGACGCXAGCTTTTTGTTGGGTTGGTTTGTTTTCACGXGGAGCTCGGATCC (X représente une thymine portant une biotine en position 5) .
Construction 5
Les oligonucleotides de la construction 5 comportent une partie centrale composée de C et T (SEQ ID N°32) SEQ ID N°32 TCTTTCCTTCCCTTCTTT
Les oligonucleotides suivants ont été élaborés:
SEQID N°33
SEQID N°34
CGTACGGTCGACGTTTTGTTTGGTGTTGTGGGTTTTCTTTCCTTCCCTTCTTTTTGGAGCTCGG
ATCC
Exemple 9 : Analyse des produits de ligation par électrophorèse sur gel dans des conditions dénaturantes, avec la construction 4.
On vérifie qu'il est possible de circulariser les oligonucleotides de la construction 4 autour des plasmides pBluescript SK+ et pEGFPCl. Les résultats sont représentés sur la figure 11.
Les oligonucleotides de séquence SEQ ID N°29, SEQ ID
N°30 et SEQ ID N°31 sont utilisés respectivement dans les puits 1 à 5, 6 à 10 et 11 à 15. Les oligonucleotides radiomarqués en 5' (10 nM) sont mis à incuber en absence de plasmide (puits 1, 2, 6, 7, 11 et 12) , avec 1 μg de plasmide pBluescript (puits 3, 8 et 13), 1 μg de plasmide pEGFPCl (puits 4, 9 et 14), ou 1 μg de plasmide pBR322 (puits 5, 10 et 15), dans un tampon d'incubation T4 ADN ligase en présence de 20 μM BQQ . Après avoir chauffé les échantillons à 65°C, puis refroidi jusqu'à 37°C, on rajoute 1 ' oligonucleotide matrice 20-mère et 4u de T4 ADN ligase. La réaction se fait à 45°C pendant 1 h.
On constate à l'examen de la figure 11 que, en présence de la matrice de 20 nucléotides, les oligonucleotides sont transformés en des molécules circulaires de migration plus faible. L'apparition de produits de migration très lente est observée lorsque 1 'oligonucleotide a été préalablement incubé avec le plasmide pBluescript ou pEGFPCl, contenant la séquence cible. Elle n'est pas observée lorsque 1 'oligonucleotide est préincubé avec le plasmide pBR322 qui ne contient pas la séquence cible . Ces expériences démontrent que les oligonucleotides de la construction 4 peuvent être circularises autour de plasmides contenant l'origine de réplication du phage fl. Exemple 10 : Analyse des produits de ligation par électrophorèse sur gel dans des conditions dénaturantes, avec la construction 5.
On vérifie qu'il est possible de circulariser les oligonucleotides de la construction 5 autour du plasmide pBluescript SK+ . Les résultats sont représentés sur la figure 12.
L ' oligonucleotide 68-mère (SEQ ID N°34) phosphorylé en 5' et radiomarqué (3.9 pmol) est mis à incuber avec 10 μg de plasmide pBluescript (5 pmol) (puits 3, 5, 6, 7 et 8) ou 10 μg de plasmide pBR322 (puits 4), dans un tampon d'incubation 20 mM Acétate d'ammonium pH=4.5, 20 mM MgC12 , 3 mM DTT, 1 mM ATP
(volume d'incubation 7 μl) . Après une incubation d'une nuit à température ambiante (20°C) , on rajoute 1 'oligonucleotide matrice 20-mère (1 μl) , puis 1 μl d'une solution 250 mM Tris pH=8.0 et 1 μl (4u) de T4 ADN ligase (puits 2, 3, 4, 5, 7, 8). La réaction se fait à température ambiante pendant 2 heures . La matrice n'a pas été ajoutée dans les puits 1 et 5. Dans le puits 7, on a ajouté de l'eau à la place de la solution de Tris. Dans le puits 8, on a réalisé l'incubation dans du tampon T4 ADN ligase.
On constate à l'examen de la figure 12 que, lorsque 1 'oligonucleotide a été préincubé à pH acide, la réaction de circularisation ne peut s'effectuer que si l'on ajoute la solution de Tris pH=8.0 (comparer puits 2 et 7). L'apparition de produits de migration très lente est observée si 1 'oligonucleotide a été préincubé à pH acide avec le plasmide pBluescript SK+ . Elle n'est pas observée lorsque 1 'oligonucleotide est préincubé avec le plasmide pBR322 qui ne contient pas la séquence cible.
Ces expériences démontrent qu'un oligonucleotide dont la partie centrale formant une triple hélice est composée de T et C peut être circularise autour du plasmide dans des conditions de pH voisines de la neutralité à condition d'avoir prêformé la triple hélice à pH acide.
Exemple 11 : Autre séquence utilisée pour circulariser un oligonucleotide autour d'un ADN en double-brin.
.Construction 6:
La séquence cible utilisée est une séquence oligopurine. oligopyrimidine de 23 paires de bases (SEQ ID N°35 pour la partie oligopurine) qui est présente dans le promoteur du gène de 1 ' IGF1 murin. Dans les expériences rapportées ci- après, cette séquence est portée par le plasmide pl71lb/luc. Ce plasmide est construit par clonage de la séquence (-1711, +328) du gène IGF1 murin dans le plasmide pGL2 (Proméga) .
SEQ ID N° 35 AGAAGAGGGAGAGAGAGAGAAGG
L' oligonucleotide de la construction 6 comporte une partie centrale composée de G et T (SEQ ID N°36) capable de
former une triple hélice de 18 triplets de bases en se fixant sur la cible ci-dessus. SEQ ID N° 36 GGTTGTGTGTGTGTGGGT
L' oligonucleotide monobrin (SEQ ID N°37) utilisé pour les expériences de circularisation est élaboré à partir de cette séquence de la même manière que l 'oligonucleotide SEQ ID N° 14 est conçu à partir de la séquence SEQ ID N° 11.
SEQ ID N° 37
CGTACGGTCGACGCTAGCTTTGGTTGTGTGTGTGTGGGTTTCACGTGGAGCTCGGATCC
Des expériences ont montré que 1 ' oligonucleotide SEQ ID N°37 peut être circularise autour de sa cible portée par le plasmide pl711b/luc.
.Constructions 7 et 8
La mise en oeuvre de la réaction chimique nécessite l'utilisation d'un oligonucleotide 5 '-iodo et 3'- phosphorothioate. Les oligonucleotides ayant une thymine 5 '-iodo étant actuellement seuls disponibles, la séquence de la matrice a été modifiée.
SEQ ID N°38
GACCGTACGATATCGCGAGC
Deux types d' oligonucleotides ont été élaborés de manière à pouvoir être circularises à l'aide d'une méthode chimique. .Construction 7
L ' oligonucleotide de la construction 7 comporte une partie centrale composée de G et T (SEQ ID N°ll) capable de se
fixer sur le plasmide pGA2 grâce à la séquence cible SEQ ID N°10.
SEQ ID N° 39
5' -Iodo- TCGTACGGTCGACGCTAGTTTTGTTTGGTGTTGTGGGTTTTCACGTGGAGCTCGCGATA 3 ' - phosphorothioate
.Construction 8
L' oligonucleotide de la construction 8 (SEQ ID N°40) comporte une partie centrale composée de C et T (SEQ ID N°32) capable de se fixer sur le plasmide pBluescript SK+ grâce à la séquence cible (SEQ ID N°26 et son complémentaire SEQ ID N°27) .
SEQ ID N" 40
5'-Iodo- TCGTACGGTCGACGCTAGTTTTCTTTCCTTCCCTTCTTTTTCACGTGGAGCTCGCGATA 3 ' - phosphorothioate
Exemple 12: Analyse des produits de ligation chimique et de clivage par électrophorèse sur gel dans des conditions non dénaturantes, avec la construction 7.
L' oligonucleotide 59-mère (SEQ ID N°39) (puits 2 à 10) a été incubé avec 1 μg de plasmide pGA2 (puits 3, 4, 7 à 10) dans un tampon d'incubation 50 mM tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, pH=7.5, en présence de 20 μM BQQ. Après avoir chauffé les échantillons à 65°C, puis refroidi jusqu'à 37°C, on rajoute l 'oligonucleotide matrice SEQ ID N° 37) radiomarqué en 5 ' . La réaction se fait à 37°C pendant 1 h, sauf dans les puits 4 et 5 (2 minutes). Ensuite, on digère par 1 ' endonucléase de restriction Hind III (puits 9 et 10) . Les échantillons des puits 8 et 10 sont chauffés en présence d'un oligonucleotide piège SEQ ID N°24. Le puits 1 montre la matrice radiomarquée seule.
Les résultats sont représentés sur la figure 13.
On constate à l'examen de la figure que la matrice ne s 'hybride sur 1 'oligonucleotide 59-mère que lorsque l'incubation est suffisamment longue. D'autres expériences de ligation
enzymatique ont montré que ceci est dû au fait que la matrice ne comigre avec le 59-mère que lorsque celui-ci a été circularise. La formation d'un lien internucléosidique entre les extrémités 5 '-iodo et 3 ' -phosphorothioate de 1 ' oligonucleotide nécessite une incubation de 1 heure avec la matrice. Lorsque la circularisation est effectuée en présence du plasmide pGA2 , une espèce qui migre très lentement dans le gel apparaît (puits 3, 7, 8 et 9) . Lorsque cette espèce est digérée par Hind III, la comigration de la matrice est encore observée (puits 9) . Ceci révèle que la triple hélice formée par 1 ' oligonucleotide circulaire et le plasmide linéaire ne se dissocie pas dans le gel. Cependant, en ajoutant un oligonucleotide piège (SEQ ID N°25) , le BQQ est éliminé du complexe, ce qui a pour effet la déstabilisation de la triple hélice et la libération d'un oligonucleotide circulaire (puits 10) . Le même traitement effectué sur le plasmide non digéré ne permet pas cette libération (puits 9) . Ces expériences démontrent que la circularisation chimique de 1 ' oligonucleotide autour du plasmide pGA2 aboutit bien à la formation d'un complexe caténé .
De la même manière, il a été démontré que l 'oligonucleotide de la construction 8 (SEQ ID N°40) peut être circularise autour du plasmide pBluescript SK+ dans le tampon acétate à pH 4.5 décrit dans l'exemple 10.
Exemple 13 : fixation de streptavidine à un plasmide portant un oligonucleotide biotinylé.
Les oligonucleotides 59-mère biotinylé (SEQ ID N°30) (puits 1 à 9) ou non biotinylé (SEQ ID N°29) (puits 10 à 12), radiomarqués en 5', ont été circularises comme décrit dans l'exemple 9, en absence (puits 3 et 4) ou en présence (puits 5 à 12) du plasmide pGA2. On a alors ajouté de la streptavidine (200 nM) dans les puits 2, 4, 6, 9, 11 et 12. Les complexes ont alors été précipités (puits 7, 8, 9 et 12) afin d'éliminer les oligonucleotides qui ne sont pas circularises autour du plasmide, puis éventuellement digérés par 1 ' endonucléase de restriction Hind III (puits 8, 9 et 11) .
La figure 14 résume les résultats obtenus . O désigne la position de migration des oligonucleotides seuls. O-S désigne la position de migration des complexes oligonucléotides- streptavidine, et P la position de migration des plasmines . La complexation de streptavidine ralentit la migration de 1' oligonucleotide linéaire (puits 2) ou circulaire (puits 4). La précipitation permet d'éliminer les oligonucleotides gui ne sont pas liés au plasmide (puits 7) . Après digestion par Hind III, on peut observer que 1 ' oligonucleotide biotinylé circulaire est libéré du plasmide, seul (puits 8) ou lié à la streptavidine (puits 9). Si 1 'oligonucleotide biotinylé radiomarqué est ajouté après précipitation d'un complexe formé avec le 59-mère non biotinylé en présence de streptavidine, la migration de cet oligonucleotide n'est pas retardée (puits 12), ce qui démontre que la précipitation de la streptavidine est bien due à sa fixation sur 1 ' oligonucleotide biotinylé attaché au plasmide.
Constructions de triple-hélices pour le système utilisant un oligonucleotide boucle
Le principe du procédé de circularisation utilisé est donné sur la figure 15 dont l'examen révèle la partie centrale de 1 ' oligonucleotide linéaire (1) qui peut se lier dans le grand sillon d'une séquence spécifique à l'intérieur du plasmide (2) pour former un complexe en triple-hélice (3) , et des extrémités 5' et 3' capables de s'hybrider l'une à l'autre en formant une courte double-hélice (4) . Une extrémité dépasse de la courte séquence en double-brin par une séquence en simple brin (5) . Cette extrémité peut former un double-brin avec une séquence en simple-brin complémentaire (6) dépassant d'un oligonucleotide qui a une forme de boucle ou d'épingle à cheveux (7) . La formation de ce double-brin aboutit à la juxtaposition des extrémités 5' et 3' des oligonucleotides monobrins et boucle. Ces extrémités sont alors reliées par un agent de ligation pour former un oligonucleotide circulaire cadenassé à l'ADN plasmidique ou à un fragment d'ADN. L ' oligonucleotide boucle peut être modifié chimiquement de manière à porter par exemple une molécule de biotine, ou bien une fonction aminé que l'on peut utiliser pour relier covalemment un peptide à cet oligonucleotide . Conformément à ce schéma, plusieurs types de triple- hélices différentes ont été réalisés
. Construction 9
Cette construction est illustrée sur la figure 15 qui représente la séquence cible située sur le plasmide pBluescript SK+ (SEQ ID N°26 et 27) . La figure donne également la séquence complète de 1 ' oligonucleotide 63 mère (SEQ ID N°41) sur lequel on a indiqué le site se fixant sur la cible ("site triplex") et qui correspond à SEQ ID N°28, et la séquence de 1 'oligonucleotide boucle de 32 nucléotides (SEQ ID N°42) .
L ' oligonucleotide 63 mère comporte :
- une séquence centrale capable de former une triple hélice,
- deux linkers reliant cette partie centrale à des séquences terminales, l'une (l'extrémité 3') de 6 nucléotides, l'autre (l'extrémité 5') de 12 nucléotides, situées aux extrémités, pouvant former 6 paires de bases en s ' hybridant l'une à l'autre. L'extrémité 5' dépasse de cette courte séquence en double-brin sous la forme d'un simple-brin de 6 nucléotides. L' oligonucleotide est phosphorylé en 5' afin de permettre la ligation enzymatique.
SEQ ID N°41 CATCGACCTAGTTCGACGCTAGCTTTTTGTTGGGTTGGTTTGTTTTCACGTGGAGCTACTAGG
L' oligonucleotide 32 -mère comporte :
- deux séquences complémentaires qui forment un double-brin de 11 paires de bases, reliées entre elles par un linker de 4 nucléotides, - une extrémité 5 ' phosphorylée en simple brin de 6 nucléotides complémentaire de celle de 1 'oligonucleotide 63 -mère.
SEQ ID N°42
TCGATGTCCGGATTGGCTTTTGCCAATCCGGA
Une construction de structure analogue a été réalisée en utilisant comme séquence cible de la formation d'une triple hélice celle des constructions 2 et 3 (SEQ ID N°10) , en utilisant un oligonucleotide 63 mère (SEQ ID N°43) ou 73 mère (SEQ ID N°44) dont la partie centrale formant une triple hélice contient de G et des T (SEQ ID N°ll) .
SEQ ID N°43
CATCGACCTAGTTCGACGCTAGCTTTTGTTTGGTGTTGTGGGTTTTCACGTGGAGCTACTAGG
SEQ ID N°44
CATCGACCTAGTTCGACGCTAGCTTTTTTTTTGTTTGGTGTTGTGGGTTTTTTTTTCACGTGGA GCTACTAGG
Une autre construction de structure analogue a été réalisée en utilisant comme séquence cible de la formation d'une triple hélice celle des constructions 4 et 5 (SEQ ID N°26 et 27) , en utilisant un oligonucleotide 63 mère (SEQ ID N°45) dont la partie centrale contient des uraciles et des thymines portant un groupement méthoxy en position 2' des riboses .
SEQ ID N°45 CATCGACCTAGTTCGACGCTAGCTTTUGUUUGGUUGGGUUGUUUTTCACGTGGAGCTACTAGG (les nucléotides soulignés sont des 2'0-méthyl nucléotides) Exemple 14 : Analyse des produits de ligation par électrophorèse sur gel dans des conditions dénaturantes, avec la construction 9.
L' oligonucleotide 63 -mère radiomarqué (SEQ ID N°41) est incubé dans le tampon T4 ADN ligase, l'échantillon est chauffé à 80°C avant l'étape ultérieure de ligation utilisant l'ADN ligase du phage T4. La réaction de ligation est effectuée à 37°C, pendant une heure, en ajoutant 1 ' oligonucleotide boucle et 40 u de T4 ADN ligase (New England Biolabs) . La réaction est alors arrêtée par ajout d'un volume équivalent d'une solution de charge contenant du formamide à 80%, NaOH 10 mM et EDTA 1 mM. Le mélange réactionnel est chauffé à 90°C pendant 5 minutes, puis chargé sur un gel de polyacrylamide dénaturant à 8%.
Les résultats des différents essais sont donnés sur la figure 16. Dans les pistes 3 et 4, les plasmides pBluescript SK+ et pEGFPCl, respectivement, sont présents dans la réaction de ligation. Dans la piste 1, 1 ' oligonucleotide boucle n'est pas ajouté .
On constate à l'examen de la figure qu'en présence de 1 'oligonucleotide boucle de 32 nucléotides, 1 ' oligonucleotide linéaire 63 -mère est transformé en une molécule circulaire de 95 nucléotides. La bande intermédiaire de faible intensité correspond à un 95-mère linéaire, obtenu lorsqu'une seule des deux réactions de ligation est réalisée. Lorsque la réaction est effectuée en présence d'un plasmide contenant la séquence cible, dans des conditions permettant la formation de la triple hélice, 1 'oligonucleotide radiomarqué est transformé en une espèce ayant une très faible vitesse de migration, similaire à celle du plasmide lui-même.
Exemple 15 : Synthèse d'un conjugué peptide- oligonucléotide boucle.
Un peptide NLS a été conjugué à un oligonucléotide-boucle par la réaction décrite à l'aide de la figure 17. L' oligonucleotide (6 nmol) portant un groupement amino greffé en position 5 d'une thymine est repris dans 50 μl d'une solution 100 mM Borate pH 8.5. On ajoute 50 μl d'une solution à 30 mM de SMCC (catalogue Sigma) dans le DMF et on laisse incuber pendant lh30. Ceci conduit à un conjugué oligonucleotide-maléimide capable de réagir avec une cystéine portée par un peptide. Le SMCC en excès est éliminé par passge sur une colonne nick-spin (Amersham Pharmacio Biotech) pré-équilibrée avec du tampon PBS (GibcoBRL) . On ajoute alors le peptide NLS (100 nmol) et on laisse la réaction se dérouler pendant la nuit à température ambiante en agitant . Le produit de la réaction est purifié sur gel de polyacrylamide 12% dénaturant.

Claims

REVENDICATIONS
1/ Procédé de circularisation d' oligonucleotides autour d'un acide nucléique en double brin, caractérisé en ce qu'il comprend - l'incubation d'un acide nucléique double brin comprenant une séquence cible, avec un oligonucleotide simple brin comprenant une partie centrale capable de se fixer sur ladite séquence cible, reliée par des séquences espaceurs à des séquences terminales en 5 ' et 3 ' , ces séquences étant
. soit a) complémentaires de la séquence d'une matrice oligonucléotidique , soit x) partiellement complémentaires l'une de l'autre, de manière à pouvoir s'hybrider l'une à l'autre en formant un double brin tout en conservant une extrémité en simple brin, laquelle est capable de s'hybrider à la séquence terminale d'un autre oligonucleotide, dit oligonucléotide- boucle, qui possède une structure en épingle à cheveux, avec une partie en simple brin et une partie repliée qui forme un double brin, ladite étape d'incubation étant réalisée dans des conditions permettant la fixation de 1 ' oligonucleotide simple brin au niveau de la séquence cible par formation de liaisons réversibles, ce qui conduit à l'enroulement de 1 'oligonucleotide autour de sa cible, et dans le cas x) , après une étape de chauffage, afin de permettre l'ouverture de 1 'oligonucleotide et son enroulement autour de l'ADN cible avant réhybridation de ses extrémités,
- la mise en contact dans le premier cas a) du complexe formé avec ladite matrice oligonucléotidique, dans des conditions permettant l'hybridation des extrémités 5' et 3 ' , de manière adjacente, à la matrice, et dans le cas x) , la mise en contact du complexe formé avec ledit oligonucléotide-boucle, dans des conditions permettant, par l'hybridation des extrémités libres de 1 'oligonucleotide simple brin et de 1 'oligonucléotide-boucle, la juxtaposition des extrémités 5' et 3' de ces oligonucleotides , la ligation des extrémités hybridées, de manière à circulariser 1 ' oligonucleotide, simple brin (cas a) ou 1 'oligonucleotide simple brin et 1 ' oligonucleotide boucle (cas x) , autour de l'acide nucléique double brin et, si on le souhaite,
- l'isolement de la structure circularisée, où l'acide nucléique cible est cadenassé par 1 ' oligonucleotide circulaire, suivi le cas échéant de sa purification.
2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'acide nucléique mis en œuvre est un ADN en double hélice.
3/ Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'acide nucléique est un plasmide, notamment un plasmide surenroulé .
4/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que 1 ' oligonucleotide simple brin comporte plus de 20 nucléotides, en particulier de 20 à 300 nucléotides, notamment de 30 à 100, avec comme partie centrale, destinée à se lier à la cible d'acide nucléique, une séquence de 10 à 25 nucléotides.
5/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on utilise des oligonucleotides simple brin dans lesquels l'enchaînement de bases nucléiques comporte des liaisons autres que des liaisons phosphodiester, comprenant des liaisons de type phosphorothiate, phosphoramidate, méthylphosphonate ou acide nucléique peptidique, ou des mélanges de ces liaisons ou, en variante, ces oligolinucléotides sont modifiés chimiquement au niveau des sucres ou au niveau des bases, ou sont reliés covalemment à un ou plusieurs ligands de faible masse moléculaire, ou comportent une ou plusieurs liaisons non-nucléosidiques .
6/ Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que 1 ' oligonucleotide simple brin se lie à la séquence cible d'acide nucléique et s'enroule autour du double brin d'acide nucléique constitué, le cas échéant, par un ADN en double hélice.
7/ Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la fixation de 1' oligonucleotide simple brin s'effectue sur une séquence cible d'ADN en double hélice et conduit à la formation d'une triple hélice .
8/ Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la séquence cible sur l'ADN double brin est une séquence oligopurine .oligopyrimidine .
9/ Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la liaison de 1 'oligonucleotide sur l'acide nucléique en double brin, notamment la formation d'une triple hélice, est induite en ajoutant au milieu réactionnel un ligand de faible poids moléculaire . 10/ Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la matrice oligonucléotidique sur laquelle vont s'hybrider les extrémités de 1 ' oligonucleotide simple brin (cas a) renferme 10 à 36 nucléotides ou que 1 'oligonucleotide boucle sur lequel va s'hybrider l'extrémité libre de l 'oligonucleotide simple brin (cas x) contient de 16 à 100 nucléotides.
11/ Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape d'incubation de l'acide nucléique avec 1 ' oligonucleotide est réalisée à un pH de 3 à 9, notamment de 4,5 à 8,5, en particulier de 6 à 8, avec ou sans chauffage.
12/ Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape d'hybridation et la ligation sont effectuées après l'étape d'incubation, dans un tampon identique ou différent de celui utilisé pour l'incubation.
13/ Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les extrémités de
1 'oligonucleotide simple brin (cas a) ou simple brin et boucle (cas x) sont reliées par un procédé enzymatique.
14/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que les extrémités de 1 'oligonucleotide simple brin (cas a) ou simple brin et boucle (cas x) sont reliées par un procédé chimique .
15/ Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'isolement et la purification de la structure circularisée sont effectués sur gel, par chromatographie , colonne d'exclusion, ou à l'aide de billes, en utilisant éventuellement un récepteur pour un ligand fixé sur l' oligonucleotide simple brin, 1 ' oligonucleotide boucle ou 1 ' olignucléotide matrice.
16/ Structure complexe d'acides nucléiques, caractérisée en ce qu'elle comprend un oligonucleotide simple brin tel que mis en oeuvre dans le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, fixé par liaisons réversibles sur la séquence cible d'acide nucléique, notamment sur un ADN en double hélice.
17/ Structure selon la revendication 16, caractérisée en ce que, 1' oligonucleotide est fixé à la cible d'acide nucléique, enroulé autour de cette cible.
18/ Structure selon la revendication 16, caractérisé en ce que 1' oligonucleotide est fixé à un ADN en double hélice, en formant une triple hélice.
19/ Structure selon la revendication 18, caractérisée en ce que la séquence cible de l'ADN double brin est une séquence oligopurine . oligopyrimidine .
20/ Structure selon l'une quelconque des revendications 16 à 19, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence à 10 à 25 triplets, formée par la séquence oligopurine-oligopyrimidine de la cible sur laquelle est fixé 1 ' oligonucleotide .
21/ Structure selon l'une quelconque des revendications 16 à 20, caractérisée en ce que les 2 extrémités de 1 ' oligonucleotide sont hybridées, cas a) sur la matrice oligonucléotidique, ou cas x) l'une à l'autre et également à 1 'oligonucleotide boucle, les extrémités juxtaposées des oligonucleotides étant le cas échéant reliées entre elles par voie enzymatique ou chimique.
22/ Structure complexe d'acides nucléiques comprenant un acide nucléique double brin encerclé par un anneau formé par un oligonucleotide simple brin, l'anneau étant le cas échéant libre de se déplacer le long de l'acide nucléique cible.
23/ Structure selon la revendication 22, caractérisée en ce que le mouvement de l'anneau est contrôlé par l'addition ou la suppression d'un ligand spécifique du complexe formé entre la séquence de l' oligonucleotide et celle de la séquence cible.
24/ Structure selon la revendication 22 ou 23, caractérisée en ce que l'acide nucléique est un ADN en double hélice, notamment un plasmide, en particulier un plasmide surenroulê .
25/ Application du procédé de circularisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, pour le marquage ou la détection d'acides nucléiques en double brin, notamment de plasmides, comprenant l'utilisation d'un oligonucleotide simple brin (cas a) ou d'un oligonucleotide boucle (cas x) , relié covalemment ou non à une molécule d'intérêt, la liaison non covalente pouvant notamment être obtenue par 1 ' intermédiaire de 1 ' interaction biotine/streptavidine .
26/ Application du procédé de circularisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, pour la détection d'une séquence spécifique présente sur l'acide nucléique cible en double brin, comprenant l'utilisation de molécules couplées à l' oligonucleotide simple brin (cas a) ou boucle (cas x) , ou la mise en œuvre d'un procédé de réplication en boucle.
27/ Application du procédé de circularisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, pour différencier deux séquences différant par seulement 1 ou 2 mutations, en détectant l' oligonucleotide circulaire fixé sur l'une de ces deux séquences grâce à la molécule portée par cet oligonucleotide ou par un procédé de réplication en boucle.
28/ Application du procédé de circularisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, pour sélectionner, par exemple parmi des séquences d'acides nucléiques simple brin dégénérées, des séquences d'acides nucléiques capables de se fixer sur un acide nucléique double brin, et notamment des séquences capables de favoriser la pénétration d'acides nucléiques en double brin dans des cellules, ou le ciblage de ces acides nucléiques vers des compartiments cellulaires spécifiques, en particulier vers le noyau.
29/ Application du procédé de circularisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, pour la purification d'acides nucléiques double-brin, notamment de plasmides, comprenant l'utilisation d'un oligonucleotide simple brin ou d'un oligonucleotide boucle relié covalemment à une molécule qui peut interagir avec une autre molécule attachée à un support solide, notamment une colonne d'affinité.
30/ Application du procédé de circularisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, pour la purification d'acides nucléiques en double-brin, notamment de plasmides, comprenant l'utilisation d'un oligonucleotide simple brin circularise autour d'un plasmide et d'une matrice reliée covalemment à une molécule qui peut interagir avec une autre molécule attachée à un support solide, notamment une colonne d'affinité.
31/ Application des structures selon l'une quelconque des revendications 16 à 24, en thérapie génique, pour l'inhibition spécifique d'un gène porté par un acide nucléique en double brin, en particulier par un plasmide, par fixation de 1' oligonucleotide circulaire sur l'acide nucléique, et contrôle de cette fixation par des molécules de faible masse moléculaire, notamment par un ligand spécifique des triple hélices.
32/ Application des structures selon l'une quelconque des revendications 16 à 24, dans laquelle l' oligonucleotide simple brin (cas a) ou 1 ' oligonucleotide boucle (cas x) est couplé de façon covalente ou non covalente à une molécule permettant de faire pénétrer un acide nucléique dans une cellule, ou encore permettant le ciblage de la structure vers un compartiment cellulaire et/ou nucléaire.
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