WO1999033866A2 - Aus gelee royale isoliertes antiviral wirksames oligopeptid - Google Patents
Aus gelee royale isoliertes antiviral wirksames oligopeptid Download PDFInfo
- Publication number
- WO1999033866A2 WO1999033866A2 PCT/EP1998/007811 EP9807811W WO9933866A2 WO 1999033866 A2 WO1999033866 A2 WO 1999033866A2 EP 9807811 W EP9807811 W EP 9807811W WO 9933866 A2 WO9933866 A2 WO 9933866A2
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- virus
- antiviral
- royal jelly
- oligopeptides
- substances
- Prior art date
Links
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 title claims abstract description 17
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 title claims abstract description 17
- 229940109850 royal jelly Drugs 0.000 title description 27
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 claims abstract description 21
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 18
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 10
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims 1
- WBHQBSYUUJJSRZ-UHFFFAOYSA-M sodium bisulfate Chemical compound [Na+].OS([O-])(=O)=O WBHQBSYUUJJSRZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 229910000342 sodium bisulfate Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 abstract description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 abstract description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 abstract description 4
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 abstract description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 abstract description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 abstract description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 abstract description 2
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 abstract 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 abstract 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 abstract 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 39
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- 241000256844 Apis mellifera Species 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 241000219871 Ulex Species 0.000 description 10
- 235000010730 Ulex europaeus Nutrition 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 8
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 6
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 5
- 241000257303 Hymenoptera Species 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 5
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 241001092040 Crataegus Species 0.000 description 4
- 235000009917 Crataegus X brevipes Nutrition 0.000 description 4
- 235000013204 Crataegus X haemacarpa Nutrition 0.000 description 4
- 235000009685 Crataegus X maligna Nutrition 0.000 description 4
- 235000009444 Crataegus X rubrocarnea Nutrition 0.000 description 4
- 235000009486 Crataegus bullatus Nutrition 0.000 description 4
- 235000017181 Crataegus chrysocarpa Nutrition 0.000 description 4
- 235000009682 Crataegus limnophila Nutrition 0.000 description 4
- 235000004423 Crataegus monogyna Nutrition 0.000 description 4
- 235000002313 Crataegus paludosa Nutrition 0.000 description 4
- 235000009840 Crataegus x incaedua Nutrition 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 244000000009 viral human pathogen Species 0.000 description 3
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 3
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 235000003351 Brassica cretica Nutrition 0.000 description 2
- 235000003343 Brassica rupestris Nutrition 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UASDAHIAHBRZQV-YUMQZZPRSA-N Met-Arg Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N UASDAHIAHBRZQV-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000220259 Raphanus Species 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910052770 Uranium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N bis(2-chloroethyl) sulfide Chemical compound ClCCSCCCl QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- GNGACRATGGDKBX-UHFFFAOYSA-N dihydroxyacetone phosphate Chemical compound OCC(=O)COP(O)(O)=O GNGACRATGGDKBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 2
- 239000010438 granite Substances 0.000 description 2
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 201000006747 infectious mononucleosis Diseases 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 239000008274 jelly Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 235000010460 mustard Nutrition 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 230000000384 rearing effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- DNYWZCXLKNTFFI-UHFFFAOYSA-N uranium Chemical compound [U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U] DNYWZCXLKNTFFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- ZSLUVFAKFWKJRC-IGMARMGPSA-N 232Th Chemical compound [232Th] ZSLUVFAKFWKJRC-IGMARMGPSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- 241001115070 Bornavirus Species 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 description 1
- 101100314454 Caenorhabditis elegans tra-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000031229 Cardiomyopathies Diseases 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 235000013175 Crataegus laevigata Nutrition 0.000 description 1
- 244000265913 Crataegus laevigata Species 0.000 description 1
- 235000017156 Crataegus rhipidophylla Nutrition 0.000 description 1
- 201000010374 Down Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000246169 Genista Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 206010069767 H1N1 influenza Diseases 0.000 description 1
- 241001446459 Heia Species 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N L-leucine-L-tyrosine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000711828 Lyssavirus Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 241000819999 Nymphes Species 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 208000001388 Opportunistic Infections Diseases 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- 241000241413 Propolis Species 0.000 description 1
- 241000382353 Pupa Species 0.000 description 1
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 1
- NCDNCNXCDXHOMX-UHFFFAOYSA-N Ritonavir Natural products C=1C=CC=CC=1CC(NC(=O)OCC=1SC=NC=1)C(O)CC(CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)N(C)CC1=CSC(C(C)C)=N1 NCDNCNXCDXHOMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035286 Spontaneous Remission Diseases 0.000 description 1
- 241000245665 Taraxacum Species 0.000 description 1
- 108090001109 Thermolysin Proteins 0.000 description 1
- 150000001218 Thorium Chemical class 0.000 description 1
- 229910052776 Thorium Inorganic materials 0.000 description 1
- RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N Trifluoroethanol Chemical compound OCC(F)(F)F RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000037280 Trisomy Diseases 0.000 description 1
- 206010044688 Trisomy 21 Diseases 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- DEGUERSKQBRZMZ-FXQIFTODSA-N Val-Ser-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DEGUERSKQBRZMZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 241000895650 Varroa jacobsoni Species 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- -1 aromatic amino acid Chemical class 0.000 description 1
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229910052626 biotite Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000028683 bipolar I disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 1
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000002360 explosive Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000030414 genetic transfer Effects 0.000 description 1
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009277 hairy cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000000087 hemolymph Anatomy 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 229960001936 indinavir Drugs 0.000 description 1
- CBVCZFGXHXORBI-PXQQMZJSSA-N indinavir Chemical compound C([C@H](N(CC1)C[C@@H](O)C[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H]2C3=CC=CC=C3C[C@H]2O)C(=O)NC(C)(C)C)N1CC1=CC=CN=C1 CBVCZFGXHXORBI-PXQQMZJSSA-N 0.000 description 1
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 108010071185 leucyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000001906 matrix-assisted laser desorption--ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000003818 metabolic dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229940127073 nucleoside analogue Drugs 0.000 description 1
- 230000031787 nutrient reservoir activity Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- KLAKIAVEMQMVBT-UHFFFAOYSA-N p-hydroxy-phenacyl alcohol Natural products OCC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 KLAKIAVEMQMVBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 229910052655 plagioclase feldspar Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- HNDXKIMMSFCCFW-UHFFFAOYSA-N propane-2-sulphonic acid Chemical compound CC(C)S(O)(=O)=O HNDXKIMMSFCCFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940069949 propolis Drugs 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000036647 reaction Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229960000311 ritonavir Drugs 0.000 description 1
- NCDNCNXCDXHOMX-XGKFQTDJSA-N ritonavir Chemical compound N([C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C[C@H](O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)OCC=1SC=NC=1)CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N(C)CC1=CSC(C(C)C)=N1 NCDNCNXCDXHOMX-XGKFQTDJSA-N 0.000 description 1
- 229960001852 saquinavir Drugs 0.000 description 1
- QWAXKHKRTORLEM-UGJKXSETSA-N saquinavir Chemical compound C([C@@H]([C@H](O)CN1C[C@H]2CCCC[C@H]2C[C@H]1C(=O)NC(C)(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)C=1N=C2C=CC=CC2=CC=1)C1=CC=CC=C1 QWAXKHKRTORLEM-UGJKXSETSA-N 0.000 description 1
- 208000008864 scrapie Diseases 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006257 total synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 229910000442 triuranium octoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 108010036320 valylleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010021889 valylvaline Proteins 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
- C07K14/43572—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects from bees
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Definitions
- viruses can induce tumor formation and cause cell destruction by auto-immune reactions.
- Viruses and virus-assimilated particles are also involved in the development of slowly evolving diseases, such as multiple sclerosis, Parkinson's, Creutzfeld Jacob and cardiovascular syndromes (cardiomyopathy), which break out after long latency periods.
- diseases such as multiple sclerosis, Parkinson's, Creutzfeld Jacob and cardiovascular syndromes (cardiomyopathy), which break out after long latency periods.
- Adenovirus 36 causes a particularly severe, non-therapeutic form of obesity
- the equine Bornavirus can trigger behavioral disorders, depression and manic-depressive insanity in humans
- a type C retrovirus is responsible for certain forms of uvemlen diabetes. Contrary to previous beliefs, the viral origin of such diseases also includes their transferable character. The transmission can take place horizontally and / or vertically. Clinical names in connection with such and other serious illnesses, terms such as “familial accumulation” and “genetic pre-disposition” should be re-examined from the point of view of an increased viral load that has spread in the life of the person concerned.
- Viruses are transmitted horizontally by infection from individual to individual or vertically by genetic transfer of endogenous viruses from the genomes of the ancestors.
- Endogenous viruses can be activated, for example by other viruses, by transposons or by all kinds of stress factors.
- the highly active and non-eliminable tumor virus SV 40 which was subsequently introduced into the Simian cell cultures, and which subsequently became effective in multiple variations in the affected individual and in the subsequent generations becomes.
- the SV 40 is involved in the explosive spread of tumor diseases.
- Eppstein-Barr virus causes Pfeiffer's glandular fever (infectious mononucleosis) in adolescents of the white race, Burkitt's sarcoma in African children and Rhmo-Phar in Asian adults. ynx carcinoma. In mixed-race societies, Burkitt sarcoma also appears in whites after some time: the permissivity for the viral symptom expression has increased.
- Finding substances with a selective antiviral effect without cytotoxicity and with high resistance to premature body degradation is a question of survival for humans and animals on the increasingly overpopulated globe.
- the long-standing lack of success in efficient virus control without damaging the unaffected host cells is best characterized by the current situation in clinical AIDS treatment.
- the currently available tritherapy for HIV 1 and 2 consisting of two different nucleoside analogues such as AZT and 3 TC as inhibitors of reverse virus transknptase, combined with an inhibitor of the viral protease (indinavir, ritonavir or saqui- navir), allows a temporary reduction of the virus load in more or less advanced disease stages
- the discovered compounds can occur in the lifelong feed juice of the queen bee (royal jelly), from where the discovery and the first isolation according to the invention also took place.
- a condition for the occurrence of these compounds in amounts as were already required for the characterization and function assignment from the raw substance (royal jelly) is that the jellies are preferably produced selectively by the bees on the basis of certain plant species.
- the royal jelly products are mainly derived from plant pollen, which is selectively introduced by the working bees and processed by the allaitation bees into an emulsion of a highly complex composition.
- Apis mellifera which is the most massive glandular system of all known organisms in terms of dimensions.
- Apis mellifera is a flying enzyme factory, where the plant substances collected are immediately processed further. The highest mechanical, biochemical and reproductive performance as well as efficiency in the defense against parasites are combined in one organism.
- Apis mellifera is probably the best, evolutionarily oldest and longest proven system for solving the task according to the invention:
- Royal jelly is the key substance to the functioning of such a system.
- the first step was to look for optimal starting products.
- Virus / host systems were used both m-vitro and m-vivo as test systems with the help of which the selectively high antiviral activity of the royal jelly varieties obtained from hawthorn and gorse pollen were found:
- Influenza virus A2 (orthomyxovirus, pandemic flu,) / mouse: With peritoneal application of 200 mg jelly / kg body weight, a survival rate of 100% was achieved for the infection which was fatal in mice in a blind test.
- the survival rate could be significantly increased by pe ⁇ tonal, pre- and / or post-functional application of the described royal jellies in concentrations of 1-500 mg / kg body weight, with an intermediate amount of 50 mg / kg having a clear maximum effect in gorse jellies.
- sy toms suppression up to hm to spontaneous remission were observed in the following virus infections:
- Influenza B orthomyxo virus, non-pandemic flu
- Herpes-2-V ⁇ rus herpes virus
- Hepatitis B virus Hepadna virus
- some retroviruses HTLV-2 virus hairy cell leukemia
- the individual bee is permanently mapparent cerebrally infected with numerous viruses, in particular with the ubiquitously widespread paralysis virus APV (Picorna virus), without there being any symptom expressions under normal conditions.
- APV paralysis virus
- the beehive is pollen-maternity leave, d. that is, the starting product for obtaining the antiviral protein molecules is no longer available, or if these are removed from the hamolymph of the normally protected bee by parasites (the mite Varroa jacobsoni), the activated virus breaks through the brain-glandular barrier of the insect and infects the larvae via the protein-depleted juices. The entire beehive is affected by the epidemic.
- the climatic conditions are of importance: A high level of lumens and the absence of stress conditions such as excessive drought or pesticide demand the generation of all kinds of secondary metabolites, to which the antiviral oligopeptides according to the invention and their precursors also have to be paid.
- the species of plants to be flown by the bees are large-scale wild crops of hedgerows and bush landscapes, and their roots reach through the bedrock through the bedrock.
- the granite rock base is rich in gneiss (amphibiols, biotite, plagioclase), ferromagnesium, divalent cations of all kinds and sprinkling of pitchblende and thoanite mineral.
- the area contains several open pit mines for the extraction of uranium and thorium ores. Natural radioactivity is high, but is largely discriminated by the plants and is not found in royal bee products such as royal jelly, pollen, honey, wax and propolis.
- the optimum environmental conditions for the plant and insect for achieving the object according to the invention lead to a characteristic protein pattern which is significantly different from the average conditions in the royal jelly obtained.
- the definitive assignment was finally carried out by a variant of MALDI mass spectroscopy specializing in low-molecular proteins, with the aid of which ionized molecules in the range from m / z 1000 to 10,000 Daltons are quantified with high selectivity and clear reproducibility.
- ionized molecules in the range from m / z 1000 to 10,000 Daltons are quantified with high selectivity and clear reproducibility.
- approx. 1 mg was dissolved in 500 ⁇ l of water and acidified with a little acetic acid solution for better solubility.
- the corresponding amount of matrix (DHAP) was added to 2 ⁇ l of this clear solution. 0.5 ⁇ l of this was crystallized out on the sample holder. The sample prepared in this way could then be easily measured in the mass spectrometer.
- each peak in the spectrum corresponds to one molecule.
- royal jelly is like the composition of a living cell. This corresponds to its middle position as a post-cellular product of the plants and a pre-cellular mixture for the formation of the insect embryos.
- the queen bee produces her 2 million offspring exclusively from royal jelly, with no condensed metabolic excretions.
- the recently developed 2D electrophoresis proved to be the method of choice.
- the first dimension is isoelectric focusing with immobilized pH gradients, followed by gel electrophoresis carried out perpendicular to it.
- IPG strips immobilized pH gradient
- the IPG strips (4mm wide, 18cm long) are made of polyacrylamide, in which a pH gradient of 4-9 is built up using real estate (from the Pharmacia Biotech company). Make sure that the IPG strips have swollen for about 16 hours beforehand. The following is used as the source solution
- Deionized water is used to prepare the anode and cathode solution. Interfering C0 2 in the gas space of the electrophoresis chamber is bound by paper strips soaked with 3 M NaOH solution.
- a horizontal SDS-PAGE sodium n-dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis based on a T-15% polyacrylamide separating gel and a T-6% collecting gel is used for the second electrophoresis dimension.
- TRIS / HC1 serves as a buffer.
- the pH of the bulk gel is adjusted to 6, 8 and that of the separating gel to 8.8.
- Electrophoresis is stopped before the bromophenol blue front reaches the wick. Protein staining is done with Coomassie. In this way, spots with highly enriched and highly pure protein can be detected in the IPG strips. With the help of calibration proteins of different molecular weights, a low-molecular protein of molecular weight 5540 Daltons could be determined, localized and isolated by "blotting" or extraction using the running distance of a pronounced spot.
- the protein isolated in this way was of unusual purity, no by-products could be detected.
- the determined primary structure is just as unusual as the purity. It was determined by total sequencing: 52 amino acids are combined in a chain in the following way:
- composition shows a protein chain without Cys, His, Phe and Trp.
- hydrophilic and hydrophobic amino acid residues are present in approximately the same number, but are distributed unevenly.
- a strongly hydrophobic central area (9 Val. 5 Leu, 4 Ile, 3 Ala) is flanked by two hydrophilic areas.
- the high number of Ser residues (10) is striking, which explains the readily water-soluble character of the native oligopeptide.
- the specified sequence leads to a molecular weight of 5414 D, in accordance with the values estimated by the MALDI measurements and the values found by the 2D electrophoresis separation using calibration proteins.
- the peptide shows extreme resistance to all proteases and other enzymes tested: trypsin, chymotrypsin, pancreatic elastase, thermolysin, pepsin, collagenase, enzyme Glu C. and even pronase and proteinase K.
- the molar ratio of the enzyme was able to / Substrate (normally 1/1000) can be increased by a thousand times (1/1) without the slightest proteolysis occurring:
- the peptide according to the invention is exceptionally biologically stable, which, when used as a medicament, has good transport properties Serum and intestinal tract guaranteed.
- the good solubility of the oligopeptide according to the invention in its native form is a good precondition for its bioavailability.
- the oligopeptide according to the invention proved to be non-toxic to humans: in the form of royal jelly enriched thereon, test animals or test subjects were injected or administered mg amounts thereof or orally, without the slightest side effect being observed.
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Botany (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Die Erfindung betrifft eine Familie von Oligopeptiden mit völlig neuartiger Struktur, die in selektiv gewonnenen Gelées royales bestimmten pflanzlichen Ursprungs auftritt und mit ausgeprägten antiviralen Wirkungen korreliert ist. Die Pilotstruktur ist ein Molekül mit 52 Aminosäuren. Satellitenartig dazu existieren zahlreiche analoge fast-identische Moleküle. Die Substanzen haben ein breites antivirales Wirkungsspektrum, Retrovieren inbegriffen und sind selbst in hohen Dosen human-untoxisch. Überraschend ist ebenfalls ihre extreme Resistenz gegen alle gesteuerten Proteasen und anderen Enzyme. Die Moleküle sind hochgradig verknäult und unangreifbar. Trotz der Verknäulung sind sie geometrisch hoch flexibel und können mehrere Konformere bilden. Im nativen Zustand liegt eine gut wasserlösliche Form vor. Aus der chemischen Synthese resultiert eine wasserunlösliche Form, die jedoch in ein lösliches, der nativen Form nahestehende, bioaktives Konformeres umgewandelt werden kann. Die neuen Oligopeptide vereinen somit erstmalig und in optimaler Weise alle Eigenschaften, die von einer potentiell antiviralen Wirkstoffklasse gefordert werden müssen.
Description
Oligopeptide
Die Gesamtheit der lebenden Organismen, von den niedrigst bis zu den höchst organisierten, wird standig von v ralen Infektionen bedroht. Man kennt zur Zeit 7000 Viren. 500 davon sind human- pathogen und verursachen direkte Infektionskrankheiten, von denen ein Teil unheilbar ist.
Virale Infektionen, auch solche, die von den Abwehrsystemen anscheinend problemlos überwunden werden, hinterlassen zum Teil tiefgreifende Veränderungen im Genom und Metabolismus des Wirtes.
Insbesondere können Viren Tumorbildung induzieren und Zerstörung von Zellen durch Auto-Immunreaktionen verursachen.
Weiterhin sind Viren und virus-assimilierte Partikel an der Entwicklung langsam evoluierender Krankheiten beteiligt, wie Multiple Sklerose, Parkinson, Creutzfeld Jacob sowie kardiovaskuläre Syndrome (Kardiomyopathie) , die nach langen Latenzzeiten zum Ausbruch kommen.
Auch Krankheiten wie Alzheimer sowie genetische Krankheiten und Trisomie (Mongolismus) scheinen virale Aktivität zu mvolvieren.
In unerwarteter Weise wurden kürzlich auch bei anderen, völlig verschiedenartigen Krankheiten Viren als Verursacher identifiziert:
- Adenovirus 36 verursacht eine besonders schwere, nicht thera- pierbare Form von Obesitat
- das equine Bornavirus kann beim Menschen Verhaltensstörungen, Depressionen und manisch-depressives Irresein auslosen
- für gewisse Formen der uvemlen Diabetis zeichnet ein Retrovi- rus des Typ C verantwortlich.
Der virale Ursprung solcher Krankheiten beinhaltet entgegen früheren Ansichten auch ihren übertragbaren Charakter. Die Übertragung kann horizontal und/oder vertikal stattfinden. Klinischen Bezeichnungen im Zusammenhang mit derartigen und anderen schweren Erkrankungen, Ausdrücke wie „familiale Häufung" und „genetische Prä-Disposition" sind unter dem Gesichtspunkt einer erhöhten viralen Belastung , die sich im Lebenskreis der betroffenen Personen ausgebreitet hat, neu zu überprüfen.
Man kann bei dem heutigen Kenntnisstand in der Virologie davon ausgehen, daß die Mehrzahl der schwerwiegenden und mit dem augenblicklichen Stand der Technik (Antibiotika) nicht heilbaren Krankheiten virale oder para-virale Aktivität kurzfristig oder über längere Zeiträume als Auslöser haben. Die morphologischen, genetischen und/oder metabolischen Dysfunktionen sind dann als Spätfolge und Endergebnis einer Virus-Intrusion zu betrachten. Es wurde wiederholt der Fehler begangen, die spektakulären Endergebnisse solcher Dys-Funktionsreihen als deren Verursacher anzusehen (siehe Prion-Protein bei BSE, dem in Umkehrung einer noch nicht verstandenen Ereignis-Reihe autonom-replikative Erreger-Eigenschaften zugeordnet werden) . Dies führt zu erfolglosen Therapie-Ansätzen und zur Vernachlässigung der Prävention. In der Tat steht das Virus bei Mensch, Tier und Pflanze im Zentrum von Krankheiten aller Art.
Viren werden horizontal durch Infektion von Inviduum zu Individuum oder vertikal durch genetische Übernahme endogener Viren aus den Genomen der Vorfahren übertragen.
Endogene Viren können aktiviert werden, beispielsweise durch andere Viren, durch Transposonen oder durch Streßfaktoren aller Art.
Zahlreiche Viren sind über die Atemluft übertragbar: Grippe- und Rhino-Viren, Adeno-und Papilloma-Tumorviren; bei hohen Konzentrationen sogar Lyssa-Viren (Tollwut) . Die rasche oder langsame Verbreitung solcher Viren kann zu weltweiten Epidemien führen.
1919 starben 20 Mill. Menschen an dem Influenza-Virus A H1N1. Zugelassene Impfstoffe existieren bisher nur gegen 25 human- pathogene Viren.
Alimentare und latrogene Unfälle können virale Infektionen unübersehbaren Ausmaßes verursachen. So wurde in einem enormen Impfunfall in England der Erreger der Scrapie-Erkrankung der Schafe weltweit verbreitet und anschließend durch fahrlässige Artenpassage zunächst auf Rinder übertragen (BSE) und dann über den gesamten Saugetierbereich einschließlich des Menschen verschleppt.
Einem großen Teil der Menschheit wurde in den sechziger Jahren bei der weltweiten Schutzimpfungsaktion gegen das Poliovirus simultan das akzidentell in die Simian-Zellkulturen eingeschleppte hochaktive und nicht elimmierbare Tumorvirus SV 40 mokkuliert, das anschließend in multiplen Variationen im betroffenen Individuum und in den Nachfolgegenerationen wirksam wurde und wird. An der explosiven Ausbreitung von Tumorkrankheiten ist das SV 40 mitbeteiligt .
Die konzentrationare Ansammlung von Mensch und Tier, die Misere und die Abwesenheit von Hygiene in der dritten Welt, die modernen Transportmittel und der unbeschrankte Welthandel mit seiner sakralen Priorität vor allen anderen Erwägungen der Vorsicht und der Vernunft sorgen dafür, daß den viralen Erregern immer mehr und immer schnellere Übertragungsvektoren zur Verfügung stehen.
Aber nicht nur Viren werden rascher transportiert, übertragen, gemischt und rekombiniert.
Auch die Terrain-Mischung durch alternierende Passagen der Erreger über verschiedene Rassen kann zur Virulenzverstarkung beitragen. So verursacht bekanntlich das Eppstein-Barr-Virus (EBV) bei Jugendlichen der weißen Rasse das Pfeiffersche Drusenfieber (Infektiöse Mononucleose) , bei afrikanischen Kindern das Burkitt-Sarkom und bei asiatischen Erwachsenen ein Rhmo-Phar-
ynx-Karzinom. In rassengemischten Gesellschaften tritt nach einiger Zeit auch bei Weißen das Burkitt-Sarkom auf: Die Permis- sivitat für die virale Symptom-Ausprägung hat sich erweitert.
Andererseits bewirken die Umweltzerstorung, die Toxizitat der Nahrungsmittel und ihre Verarmung an pflanzlichen Sekundarme- taboliten, die letztlich in Pflanze und Tier der Parasitenabwehr dienen, eine zunehmende Schwächung der Immunsysteme der betroffenen Wirts-Organismen, insbesondere des Menschen.
Immer mehr und immer virulentere Viren stehen zunehmend ab- wehrgeschwachten Wirten gegenüber.
Die Situation evoluiert in Richtung auf einen kollektiven Immunkollaps aller höheren Lebewesen.
Das Auffinden von Substanzen mit selektiv antiviraler Wirkung ohne Zytotoxizitat und mit hoher Resistenz gegen vorzeitigen körpereigenen Abbau ist eine Uberlebensfrage für Mensch und Tier auf dem zunehmend uberbevolkerten Globus.
Derartige Substanzen konnten von der überwiegend chemisch-synthetisch orientierten Forschung trotz enormer Sucharbeit bisher nicht geliefert werden.
Die Diskrepanz zwischen den enormen Fortschritten in der Kenntnis der Detektion, der Morphologie und der Genetik der Viren einerseits und der klinischen Hilflosigkeit gegenüber dem virus-mflzierten Individuum andererseits war noch nie so groß.
Das jahrelange Ausbleiben von Erfolgen in der effizienten Virus- bekampfung ohne Schädigung der nichtbefallenen Wirtszellen wird am besten durch die augenblickliche Situation in der klinischen AIDS-Behandlung charakterisiert. Die zur Zeit beispielsweise angebotene Tritherapie gegen HIV 1 und 2, bestehend aus zwei verschiedenen Nukleosidanalogika wie AZT und 3 TC als Inhibitoren der reversen Virus-Transknptase, kombiniert mit einem Hemmer der viralen Protease (Indinavir, Ritonavir oder Saqui-
navir) , erlaubt zwar eine vorübergehende Reduzierung der Virus- belastung in mehr oder weniger fortgeschrittenen Krankheitsstadien
- greift aber nur bei einem Teil der Patienten, bei denen ein ansprechbarer Virus-Serotyp dominiert
- fuhrt früher oder spater zur Resistenzbildung durch das Erscheinen hochaggressiver, nicht therapierbarer Virus-Stamme, die wahrend des medikamentiven Selektionslaufs im Wirt die durch die Therapie eleminierten Stamme ersetzen und schließlich das Terrain des Infizierten für sich beherrschen.
- Die Übertragung solcher Virusstamme an Dritte fuhrt bei den Neuinfizierten zu besonders fulguranten Krankheitsverlaufen
- ist zudem von gravierenden klinischen Nebenwirkungen begleitet, deren Endeffekte heute noch nicht absehbar sind
- um unter den gegenwartigen Bedingungen einen Erkrankten einigermaßen komfortabel und bei maximaler Restlebenszeit bis zum Tode zu therapieren, ist ein enormer Aufwand an Kosten (Medikamente gegen das Virus selbst und gegen opportunistische Infektionen) und an hochqualifizierter Arbeitsleistung (laufende PCR-Dosierung der Viren Sequenzierung der neugebildeten Virus-Varianten und ihrer Proteine) erforderlich, ein „Luxus", der für die Mehrzahl der weltweit ca. 100 Mill. Aids- Infizierten kaum zur Debatte stehen durfte.
Ebenso ungelöst ist das Problem bei der postinfektionellen Therapie, die gegen die anderen bis jetzt bekannten 500 human- pathogenen Viren zu richten ist.
Noch undurchsichtiger ist die Situation bei epidemischen neuro- degenerativen Krankheiten wie BSE, deren Erreger mangels adäquater Detektionsmethoden bisher noch nicht aufgefunden werden konnten.
Ein Schritt zur Lösung des Problems: antivirale Oligopeptide mit neuartiger Struktur und überraschenden Eigenschaften
Bei dem systematischen Absuchen nach antiviralen Naturstoffen, die an der Grenzfläche Pflanze/Insekt insbesondere im Lebensbereich und in den Produkten des Sozial-Insekts Apis mellifera zur Wirkung gelangen, wurde eine bisher unbeschriebene, einfache Substanzklasse aufgefunden, die zentral mit der antiviralen Abwehrstrategie dieses hochbevölkerten Lebenssystems (50 000 Individuen auf 100 dm3) korreliert ist.
Generell sind derartige Substanzen am Epidemieschutz im gesamten Bienenstaat beteiligt und dort ubiquitär verbreitet, wie z.B. in den Hämolymphen der Insekten und ihrer metamorphotischen Entwicklungsstadien (Larve, Puppe, Nymphe) sowie in den embryonalen Futtersäften für die 3 Klassen Arbeiterinnen, Drohnen und Königin.
Angereichert und in größeren Mengen verfügbar können die entdeckten Verbindungen im lebenslänglich verabreichten Futtersaft der Bienenkönigin (Gelee royale) auftreten, von wo aus auch die erfindungsgemäße Entdeckung und die Erst-Isolierung erfolgten.
Bedingung für das Auftreten dieser Verbindungen in Mengen, wie sie für die Charakterisierung und Funktionszuordnung bereits von der Rohsubstanz aus (Gelee royale) erforderlich waren, ist, daß die Gelees von den Bienen vorzugsweise selektiv auf der Basis bestimmter Pflanzenarten hergestellt werden.
In der Tat sind die Gelees Royales Folgeprodukte hauptsächlich von Pflanzenpollen, die von den Arbeitsbienen selektiv eingebracht und von den Allaitationsbienen zu einer Emulsion von hoch-komplexer Zusammensetzung prozessiert werden. Dies geschieht in den verschiedenen Sekretionsdrüsen von Apis mellifera, das dimensionsbezogen das gewaltigste Drüsensystem aller bekannten Lebewesen darstellt.
Apis mellifera ist eine fliegende Enzymfabrik, wo die gesammelten Pflanzenmhaltsstoffe sofort weiterprozessiert werden. Höchste mechanische, biochemische und reproduktive Leistungsfähigkeit sowie Effizienz m der Parasitenabwehr sind hier m einem Organismus vereinigt. Apis mellifera ist das wahrscheinlich beste, evolutiv älteste und am längsten erprobte System zur Losung der erf dungsgemaßen Aufgabe:
- nebenwirkungsfrei die Eliminierung viraler Erreger zu bewirken,
- oder zumindest ihre Symptomauspragung soweit zu unterdrucken, daß der befallene Wirt in Gegenwart des seiner Virulenz entledigten Virus einen normalen Lebens- und Reproduktionszyklus realisieren kann
- dafür Sorge zu tragen, daß die Erreger nicht durch Resistenzbildung und
- durch Wiederaufleben virulenter Stamme das Terrain zurückerobern.
Gelee royale ist die Schlusselsubstanz zum Funktionieren eines solchen Systems.
Zur Auffindung der erf dungsgemaßen antiviralen Wirkstoffe wurde zunächst nach optimalen Ausgangsprodukten gesucht.
Auswahl der Rohstubstanzen
60 quasi-monoflorale Gelees Royales wurden auf der Basis von 60 verschiedenen bienentrachtigen Pflanzenarten hergestellt.
Ihre Wirkung wurde im Bienenstock selbst, in dem permanent map- parente virale Infektionen ohne oder mit lediglich schwacher Symptomauspragung vorliegen, beobachtet.
Anschließend wurde die antivirale Aktivität der aus monofloralen Quellen stammenden Rohstubstanzen in-vitro, m-vivo und im Humanbereich getestet.
Unter den monofloralen Gelees wiesen besonders 2 davon selektiv überraschend hohe antivirale Aktivität aus: solche, die Crataegus oxyacantha (Weißdorn) und Genista tinctoπa (Farbergmster) als Pollen- und damit als Proteinquelle zur Basis hatten. Eine Reihe von weiteren Pflanzenarten folgte in gewissem Abstand: Brassica nappus, Taraxacum officmale, insbesondere zahlreiche Raphanus-Arten, Senf-Gewachse und andere Kreuzblütler, fast ausschließlich Wildpflanzen.
Verwendete Testsysteme
Als Testsysteme, mit deren Hilfe die selektiv hohe antivirale Aktivität der aus Weißdorn- und Ginsterpollen erzielten Gelee royale-Sorten herausgefundene wurden, dienten Virus/Wirt-Systeme sowohl m-vitro als auch m-vivo:
- Coxsackie B 3 Virus (Picorna-Virus) /Heia-Zellen im klassischen Plaque-essai : Bei einer Konzentration von 200 ppm Gelee royale in der üblichen Nährlösung erfolgte eine totale Virus-Titer-Re- duktion (keine Infektionshofe auf der Test-Plaque mehr)
- Influenza-Virus A2 (Orthomyxo-Virus , Pandemie-Grippe, ) /Maus : Bei peritonaler Applikation von 200 mg Gelee/kg Korpergewicht wurde eine Überlebensrate von 100% f r die bei Mausen im Blindversuch todlich verlaufende Infektion erzielt.
- Virus der vesikularen Stomatitis (Rhabdo-Virus) /Maus :
Die Uberlebensrate konnte durch peπtonale, pra- und/oder postmfektionelle Applikation der beschriebenen Gelees royales in Konzentrationen von 1-500 mg/kg Korpergewicht deutlich gesteigert werden, wobei bei Ginster-Gelees eine Zwischenmenge von 50 mg/kg ein deutliches Wirkungsmaximum aufwies.
In punktuellen Human-Applikationen wurden bei folgenden Virusm- fektionen Sy ptomsuppression bis hm zu spontaner Remission beobachtet :
Influenza B (Orthomyxo-Virus , nicht pandemische Grippe) Herpes-2-Vιrus (Herpes-Virus) Hepatitis B Virus (Hepadna-Virus) ansatzweise gewisse Retroviren HTLV-2-Virus (Haarzellen-Leukamie)
Mit diesen Versuchen sind 6 hauptsachliche der zur Zeit bekannten 24 human-pathogenen Virusfamilien abgedeckt.
Schließlich wurde auch der Bienenstock selbst als virologisches Test- und Expenmentalsysterα herangezogen:
- Die einzelne Biene ist in den meisten Fallen permanent mappar- ent zerebral mit zahlreichen Viren infiziert, insbesondere mit dem ubiquitär verbreiteten Paralysie-Virus APV (Picorna-Virus) , ohne daß es unter Normalbedingungen zu irgendwelchen Symptomexpressionen kommt. Wird der Bienenstock pollen-karenziert, d. h., das Ausgangsprodukt zur Erlangung der antiviralen Protein- molekule steht nicht mehr zur Verfugung, oder werden diese durch Parasiten (die Milbe Varroa jacobsoni) aus der Hamolymphe der normalerweise geschützten Biene abgezogen, durchbricht das aktivierte Virus die Hirn-Drusen-Barriere des Insekts und infiziert über die proteinverarmten Aufzuchtsafte die Larven. Der gesamte Bienenstock wird von der Epidemie erfaßt.
- Erneute Pollenzufuhr und/oder die Elimmierung des hamolymph- saugenden Parasiten fuhrt zum sofortigen Abbruch der Epidemie und zu einer raschen Regenerierung des Bienenvolkes. Dabei sind gewisse Pollenarten effizienter als andere. Die Wirkung der Pollen im Bienenstock korreliert mit den m-vitro und m-vivo erzielten Effekten der entsprechenden daraus gewonnenen Gelees Royales.
Gewinnung der Rohstubstanzen
Zur Gewinnung der beschriebenen besonders antiviral aktiven Gelee royales wurden insgesamt 50 Bienenstocke m üblicher Weise auf die im beruflichen Stand der Technik der Imker bekannte Königmnenaufzucht umfunktioniert (Trenngitter für Konigin, 20 bis 60 larvenbesteckte Weiselzeilen pro Stock) . Die Stocke wurden zum zweckmäßigen Zeitpunkt in den zu befliegenden Vegetationen plaziert, wobei auf die Abwesenheit von gleichzeitig blühenden, bienen-attraktiven Konkurrenzkulturen geachtet wurde. 10 bis 120 Stunden, vorzugsweise 72 Stunden, nach der Anzuchtung der Königmnenlarven wurden die in den Zellen enthaltenen Gelees abgesaugt .
Zwecks optimaler Konservierung der antiviralen Eigenschaften hat es sich für alle Gelee royales als vorteilhaft erwiesen, in jedem Fall das Absaugen aus den Weiselzellen und die Aufbewahrung (5°C) unter Schutzgas, z. B. Argon (Europaisches Patent Nr. DE 42 32 732, EP 0 663 831, PCT 93 025 62, USA 5 580 297) vorzunehmen und auf das übliche Einfrieren bzw. Lyophilisieren zu verzichten.
Die Authentizität des pflanzlichen Ursprungs wurde durch pollenmorphologische Analyse der so erhaltenen Gelee royale-Sorten kontrolliert und bestätigt. Da Ginsterbluten nur eine beschrankte Attraktion auf die befliegenden Bienen ausüben, sammeln diese davon immer nur einen begrenzten, aber regelmäßigen Anteil. Dies spiegelt sich durch einen natürlicherweise niedrigen Gehalt von Ginsterpollen-Rohmaterial in den Aufzuchtsekreten (Gelee royales) wider. Um eine fast ausschließlich auf Ginster- Tracht beruhende Gelee royale-Sorte zu erlangen, wurde ein 2- Phasen-Prozeß angewendet:
- Zuerst wurden mit Hilfe von normalen mit Pollenabstreifgittern versehenen Bienenstocken mehrere kg Ginsterpollen gewonnen, was meist m abgelegenen Wildregionen erfolgte
- dieses Material wurde in Honiglösung-Suspension pollenkaren- zierten Gelee royale-Bienenvölkern angeboten, die es rückstandslos aufbereiteten.
Auf diese Weise wurde eine Gelee royale-Sorte mit einer fast ausschließlich aus Ginsterpollen hervorgehenden Proteinfraktion erhalten, wie sie natürlicherweise nicht erreichbar ist.
Simultan dazu fand allerdings eine Anreicherung von Ginster-Al- kaloiden statt, was der therapeutischen Anwendung des so erhaltenen Gelee royale-Rohmaterials gewisse Grenzen setzte.
Unverbrauchte Urgestein-Böden
Von besonderer Wichtigkeit für die Erlangung der aktiven antiviralen Gelee royale-Sorten sind die Natur und Beschaffenheit der Böden, die z.T. bereits durch natürliche Standortbedingungen für die selektionierten Pflanzenarten definiert sind.
Es wurde festgestellt, daß dazu saure, unverbrauchte, pestizid- freie aus granitenem ggf. uraniziferem Urgestein hervorgehende und sich ständig erneuernde Böden notwendig sind. Für Ginsterbüsche und Weißdornhecken stellen solche Böden von sich aus die bevorzugten Standorte dar, die Pflanzen wachsen auf kalkhaltigen Kulturböden kaum, die daraus resultierenden Gelees Royales sind von mäßiger Aktivität.
Voruntersuchungen zeigten an, daß dabei gewisse, bisher nur mit biologisch negativen Aspekten belastete Spurenelemente wie Cad- mium und die Elemente der Uran- und Thoriumreihe beim Zustandekommen der beschriebenen antiviralen Eigenschaften bzw. für die pflanzliche Biosynthese der sie verursachenden Substanzen eine wichtige Rolle spielen (eine hoch spezifische Wirkung üben solche Metalle beispielsweise in den kürzlich entdeckten Metallo- Proteasen aus) .
Eine gute Borversorgung, die in Urgestein-Boden von sich aus gewährleistet ist, spielt ebenfalls eine wichtige Rolle (Patent Nr.: DE 44 41 483, EP 95 93 82 85, PCT 95 044 94).
Weiterhin sind die klimatischen Bedingungen von Wichtigkeit: Eine hohe Lummositat sowie die Abwesenheit von Streßbedingungen wie exzessive Trockenheit oder Pestizidbelastung fordern die Erzeugung von Sekundarmetaboliten aller Art, zu denen auch die erfmdungsgemaßen antiviralen Oligopeptide bzw. ihre Vorstufen zu zahlen sind.
All diese Bedingungen finden sich in der letztlich selektionier- ten Versuchs-Landschaft vereinigt: ein weites Heckenland- schaftsgebiet ohne landwirtschaftliche Großflachennutzung in Westfrankreich, zwischen Cholet, Nantes und La Röche sur L'Yon gelegen. Das Gebiet umfaßt die bretonische Festlandsplatte und den Urgestein-Sockel der Vendee. Es gibt regelmäßige, über das ganze Jahr verteilte Niederschlage. Trotzdem ist die jahrliche Sonnenscheindauer hoch und mit der des Mittelmeerklimas vergleichbar. Das Klima ist mild und ausgeglichen: Es gibt weder extreme Hitze noch extremen Frost. Die Atlantik-Nahe mit den vorherrschenden Westwinden sorgt für eine regelmäßige Ventilation. Die Atmospahre ist die des Atlantiks und keinerlei lokaler und kumulativer Umweltbelastung ausgesetzt. Die Wildpflanzenweit ist voll intakt. Alles m allem handelt es sich um ein wahrscheinlich einmalig begünstigtes, von der globalen Umweltbedrohung anscheinend vergessenes Groß-Biotop.
Die von den Bienen zu befliegenden Pflanzenarten liegen als großflächige Wildkulturen Hecken- und Buschlandschaften vor und greifen mit ihren Wurzeln durch die Bodenkrume m das Urgestein.
Der Graniturgesteinsockel ist reich an Gneisen (Amphibiole, Bi- otit, Plagioklase) , Ferromagnesium, bivalenten Kationen aller Art und Einsprenkelungen von Pechblenden und Thoπanit-Mme- ralien.
Das Gebiet enthält mehrere Tagebaugruben zum Abbau von Uran- und Thoriumerzen. Die natürliche Radioaktivität ist hoch, wird jedoch von den Pflanzen weitgehend diskriminiert und findet sich in den Bienenprodukten Gelee royale, Pollen, Honig, Wachs, Pro- polis nicht wieder.
Die für die Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe optimalen Umweltbedingungen für Pflanze und Insekt führen in den erzielten Gelee royales zu einem gegenüber Durchschnittsbedingungen deutlich veränderten, charakteristischen Protein-Muster.
Vom aktiven Rohprodukt zum aktiven Molekül
Aus den erfindungsgemäß optimierten Rohprodukten (= selektiv gewonnenen Gelee royales) galt es nun, die für die antiviralen Wirkungen hauptsächlich verantwortlichen Substanzen zu erkennen und zu definieren. Dazu wurden die zur Untersuchung komplexer Naturstoffgemische üblichen Analysenmethoden herangezogen:
klassische Säulenchromatographie
HPLC eindimensionale Elektrophorese
Kapillarelektrophorese
Daraus konnte nur andeutungsweise die Zugehörigkeit der antiviralen Aktivität zu einer Proteinfraktion niederen Molekulargewichts erkannt werden.
Ein Erkennungs-Peak in der MALDI-Spektroskopie
Die eindeutige Zuordnung erfolgte schließlich durch eine auf nieder-molekulare Proteine spezialisierte Variante der MALDI- Massen-Spektroskopie, mit deren Hilfe ionisierte Moleküle im Bereich von m/z 1000 bis 10 000 Dalton mit hoher Trennschärfe und eindeutiger Reproduzierbarkeit quantifiziert werden.
Dazu wurden ca. 1 mg in 500 ul Wasser gelost und zur besseren Loslichkeit mit etwas Essigsaurelosung angesäuert. Von dieser klaren Losung wurden 2 ul mit der entsprechenden Menge an Matrix (DHAP) versetzt. 0,5 ul davon wurden auf dem Probentrager auskristallisiert . Die so präparierte Probe konnte dann im Mas- senspektrometer problemlos gemessen werden.
Da mit der MALDI-MS Methode keine Fragmentierung beobachtet wird, entspricht jeder Peak im Spektrum einem Molekül.
Im Gegensatz zu den hoher molekularen Proteinen von Gelee royale, die in großer Anzahl (einige 100) vorliegen und sich in artenbedingten Variationen um ein Speicher-Haupt-Protem von 55 000 D gruppieren, gibt es im niedermolekularen Bereich lediglich em Dutzend Haupt-Oligopeptide . Ihre relativen Mengen sind ungefähr konstant zu den Hauptpeptiden. Satellitenartig existieren zahlreiche analoge, fast-identische Moleküle, deren Konzentration jedoch in Funktion des pflanzlichen Ausgangsmateials und des Alters der Gelee royale-Emulsion schwankt. Dieses einigermaßen konstante Analysenschema der niederen Proteine wurde durch 2-D-Gel-Elektrophorese bestätigt .
Zu dieser festen Regel im Peptid-Schema gibt es eine Ausnahme: Bei 5450 D liegt ein gut charakterisierter MALDI-Peak, dessen Intensität von einer Gelee royale-Sorte zur anderen außerordentlich stark schwankt. Am stärksten ausgeprägt liegt dieserSelek- tions-Peak in Spektren vor, die aus nativen Gelees royales mit hohem Anteil an Ginster-, Weißdorn- und gewissen Wildpflanzen- Kreuzblutler-Pollen-Protemen (z.B. Raphanus-Arten, Senf- Gewachse) hervorgehen. Es handelt sich um dieselben Rohsubstanzen, die im Test die intensivste anti-virale Aktivität entwickeln. Die dem Peak zuzuordnende Substanz ist also direkt oder indirekt mit der gesuchten antiviralen Wirkung korreliert.
Ein ungewöhnliches Oligopeptid in ungewöhnlicher Reinheit
Die ausgewählten Gelee-Rohprodukte konnten in großen Mengen dargestellt werden, wobei ein Teil davon für direkte Thera- pierversuche verwendet werden konnte.
Hingegen bereitete die Isolierung der Zielmoleküle wie im vorangehenden analytischen Suchverfahren große Schwierigkeiten. Dies liegt an der hoch-komplexen Zusammensetzung des Rohproduktes: einige 1000 nachgewiesene oder nachweisbare Verbindungen; insgesamt wahrscheinlich einige Millionen z. T. ephemere, ineinander umwandelbare Spurenbestandteile.
In der Tat gleicht Gelee royale der Zusammensetzung einer lebenden Zelle. Dies entspricht seiner Mittler-Position als postzelluläres Produkt der Pflanzen und prä-zelluläre Mixtur zur Bildung der Insekten-Embryonen. Die Bienenkönigin erzeugt ihre 2 Mill. Nachkommen ausschließlich aus Gelee royale, wobei es zu keinerlei kondensierten Stoffwechselausscheidungen kommt.
Klassische Methoden wie Side-exclusion-Chromatographie (Sephades G 50) , Ionenaustauschchromatographie und eindimensionale Elektrophorese führten zu Substanzgemischen wechselnder Zusammensetzung.
Das, was in der Analyse mit MALDI erzielt wurde, scheidet als Trennmethode im präparativen Maßstab aus.
Als Methode der Wahl erwies sich die kürzlich entwickelte 2D- Elektrophorese. Dabei ist die erste Dimmension eine isoelektrische Fokussierung mit immobilisierten pH-Gradienten, gefolgt von einer senkrecht dazu durchgeführten Gel-Elektrophorese.
Auf diese Weise wurde das Peptid in höchster Reinheit isoliert, jedoch mußte dies mit den der Methode inhärenten Nachteilen erkauft werden:
geringste Substanzmengen reduzierte biologische Aktivität
Im einzelnen wurde dabei wie nachfolgend beschrieben vorgegangen:
Zunächst wird Gelee royale mit Wasser versetzt (1:2 Verhältnis von Gelee royale zu Wasser) . Dann werden die unlöslichen Bestandteile abzentrifugiert (15 Minuten lang bei 15000 Umdrehungen/Minute) . Der Überstand wird mit Pharmalyte pH 3-10 (for IEF, Fa. Pharmacia Biotech) und DTT (Dithioerythrit) versetzt. Dabei betragen die Mengen an diesen Additiva jeweils 1%.
Zur isoelektrischen Fokussierung (IEF) werden von dieser Lösung je 30 μl auf IPG-Streifen (Immobilisierter pH-Gradient) an der anodischen Seite aufgetragen. Die IPG-Streifen (4mm breit, 18cm lang) bestehen aus Polyacrylamid, in denen mit Immobilien (derFa. Pharmacia Biotech) ein pH-Gradient von 4-9 aufgebaut wird. Es ist darauf zu achten, daß die IPG-Streifen zuvor ca. 16 h lang gequollen haben. Als Quellösung wird dazu die folgende
Mischung hergestellt: 0,5% CHAPS (=3-[ (3-Cholamidopropyl) -Dime- thylammonio]-Propansulfat) , 0,2% Pharmalyte (pH 3-10), 20 mM DTT und 8M Harnstoff.
Zur Herstellung der Anoden- und Kathoden-Lösung wird entionisiertes Wasser verwendet. Störendes C02 im Gasraum der Elektrophoresekammer wird durch Papierstreifen gebunden, die mit 3 M NaOH- Lösung getränkt sind.
Nach der isoelektrischen Fokussierung (IEF) werden mehrere IPG- Streifen für je 15 Minuten mit zwei Pufferlösungen equilibriert . Die Pufferlösungen (50mM TRIS/HCI; pH=8,8) enthalten 6M Harnstoff, 30% Glycerin und 2% SDS . Der ersten Pufferlösung werden DTT (Endkonzentration 90mM) und der zweiten Jodacetamid (260mM) gesondert zugesetzt. Für die Anoden- und Kathoden-Lösung wird eine Pufferlösung mit 1,4% Glycin, 0,3% TRIS und 0,1% SDS eingesetzt.
Für die 2. Elektrophorese-Dimension wird eine horizontale SDS- PAGE (Sodium n-Dodecyl Sulphate-Polyacrylamid Gel Elektrophorese) auf der Basis eines T-15%-Polyacrylamid-Trenngels und eines T-6%-Sammelgels verwendet. Als Puffer dient TRIS/HC1. Dabei wird der pH-Wert des Sammelgels auf 6, 8 und der des Trenngels auf 8,8 eingestellt.
Bevor die Bromphenolblaufront das Wick erreicht, wird die Elektrophorese abgebrochen. Die Proteinfärbung wird mit Coomassie durchgeführt. In dieser Weise können in den IPG-Streifen Spots mit hochangereichertem und hochreinem Protein nachgewiesen werden. Mit Hilfe von Kalibrierproteinen unterschiedlicher Molmasse konnte an Hand der Laufstrecke eines ausgeprägten Spots ein niedermolekulares Protein der Molmasse 5540 Dalton festgestellt, lokalisiert und durch „blotting" bzw. Extraktion isoliert werden.
Das so isolierte Protein erwies sich von ungewöhnlicher Reinheit, es konnten keinerlei Nebenprodukte nachgewiesen werden. Ebenso ungewöhnlich wie die Reinheit ist die ermittelte Primärstruktur. Sie wurde durch Totalsequenzierung ermittelt: 52 Aminosäuren sind in einer Kette in folgender Weise zusammengefügt:
Lys(l) - Thr - Ser - -Ile - -Ser(5)
- Val - Lys - Gly - Glu - Ser (10) -
- Asn - Val - Asp - Val - Val (15) -
- Ser - Gin - Ile - Asn -Ser (20) -
- Leu - Val - Ser - Ser - Ile (25;
- Val - Ser - Gly - Ala - Asn (30!
Val - Ser - Ala - Val - Leu (35]
- Leu - Ala - Gin - Thr - Leu (40)
.- Val - Asn - Ile - Leu - Tyr (45)
- Thr - Asp - Ser - Asp - Pro (50)
Met - Arg (52)
Die Zusammensetzung zeigt eine Proteinkette ohne Cys, His, Phe und Trp.
Da mit zunehmender Sequenzierung die Signalhöhen der von der Proteinkette abgespaltenen und derivatisierten Aminosäure aufgrund der Sequenzierungstechnik ständig abnehmen, läßt sich in der Regel eine sichere Sequenzierung nicht über 40 Aminosäuren hinaus durchführen. Trotzdem gelang die vollständige Sequenzierung des erfindungsgemäßen Oligopeptides, das sich aus 52 Aminosäuren zusammensetzt. Allerdings konnten die letzten ca. 3 Aminosäuren nicht mit absoluter Sicherheit identifiziert werden, sodaß eventuelle Hormologe ebenfalls biologisch aktiv sein können.
Die Suche nach Homologien zur angegebenen Sequenz in den Datenbanken ergab keinerlei Übereinstimmung mit bekannten Sequenzen: die Substanz hat folglich eine völlig neuartige Struktur.
Die Strukturbetrachtung ergibt, daß hydrophile und hydrophobe Aminosäurereste in ungefähr in gleicher Anzahl vorhanden, jedoch ungleichmäßig verteilt sind. Ein stark hydrophober Zentralbereich (9 Val. 5 Leu, 4 Ile, 3 Ala) wird von zwei hydrophilen Bereichen flankiert. Auffallend ist die hohe Anzahl von Ser- Resten (10) , was den gut wasserlöslichen Charakter des nativen Oligopeptides erklärt. Es gibt nur eine aromatische Aminosäure (Typ 45) . Die angegebene Sequenz führt rechnerisch zu einer Molmasse von 5414 D, im Einklang mit den durch die MALDI-Messungen abgeschätzten und den durch die 2D-Elektrophorese-Trennung anhand von Kalibrierproteinen gefundenen Werten.
Trotz der Abwesenheit stabilisierender Disulfidbrücken zeigt das Peptid eine extreme Resistenz gegen alle getesteten Proteasen und sonstige Enzyme: Trypsin, Chymotrypsin, Pankreas-Elastase, Thermolysin, Pepsin, Kollagenase, Enzym Glu C. und selbst Pronase und Proteinase K. Dabei konnte das molare Verhältnis Enzym/Substrat (normalerweise 1/1000) um das Tausendfache gesteigert werden (1/1), ohne daß die geringste Proteolyse auftrat: Das erfindungsgemäße Peptid ist trotz seiner guten Löslichkeit im physiologischen Milieu biologisch außergewöhnlich stabil, was bei seiner Verwendung als Medikament gute Transporteigenschaften in Serum und Intestinaltrakt garantiert.
Neben seiner biologischen Stabilität ist die gute Löslichkeit des erfindungsgemäßen Oligopeptides in seiner nativen Form eine gute Vorbedingung für seine Bioverfügbarkeit.
Das erfindungsgemäße Oligopeptid erwies sich selbst in hohen Dosen als human-untoxisch: In Form von daran angereicherten Gelees royales haben Versuchstiere bzw. Probanden mg-Mengen davon injiziert bzw. oral verabreicht bekommen, ohne daß die geringste Nebenwirkung beobachtet werden konnte.
Um über größere Mengen des Peptides verfügen zu können, wurde seine Totalsynthese nach einer modifizierten Merrifield-Methode durchgeführt. Das synthetische Produkt war praktisch wasserunlöslich und zeigte in dieser Form keinerlei biologische Aktivität. Um es der nativen Form anzunähern, wie es aus den Sekretionsdrüsen von Apis mellifera ausgeschieden wird, wurde das Syntheseprodukt in Trifluorethanol aufgenommen und anschließend behutsam in wässriges Milieu übergeführt (5 mg Peptid in 5 ml Wasser) , wobei keine Ausfällung mehr stattfan d. Durch Gefriertrocknung wurde ein Lyophilisat erhalten, das sich in Gegenwart von Natriumhydrogencarbonat (pH = 8) ausgezeichnet löste und sich in seinen biologischen und physikochemischen Eigenschaften dem nativen Produkt annäherte.
Die 2D-Gelelektrophorese der niedermolekularen Proteine in den untersuchten Gelees royales zeigte, daß das beschriebene Hauptpeptid in den meisten Fällen in geringen Mengen variabel von quasi-identischen Trabanten flankiert ist. In den Molekularmassen sind keine Unterschiede festzustellen, jedoch differieren die isoelektrischen Punkte um jeweils bis zu einigen Zehntel pH- Einheiten. Es scheint, daß in der antiviralen Wirkung diesen Begleitsubstanzen eine Funktion in der Weise zuzuordnen ist, daß durch eine Art „Oligo-Therapie" den Viren ein Ausweichen durch Bildung resistenter Stämme erschwert wird.
Es wird vorgeschlagen, dieses von der Natur vorgezeichnete Wirkungsschema erfindungsgemäß zu verwenden, indem die Pilotstruktur des Hauptpeptides gezielt modifiziert und auf die biologische Wirkung gegen das eine oder andere Virus optimiert wird.
Als ein möglicher Angriffspunkt des erfindungsgemäßen Oligopeptides und ggf. seiner Trabanten an den viralen Cyclus ist beim augenblicklichen Kenntnisstand eine Verminderung der Wirksamkeit der Virus-Proteasen am nächstliegenden.
Claims
1. Oligopeptid mit antiviraler Wirkung dadurch gekennzeichnet, daß dieses aus mindestens 52 Aminosäureresten mit der in der Beschreibung angegebenen Sequenzfolge besteht.
2. Oligopeptide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Aminosäurereste durch andere insbesondere ab der Position 48 der Sequenz ausgetauscht werden können.
3. Oligopeptide nach nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß ihre antivirale Wirkung durch gezielten Austausch jeglichen Aminosäurerestes optimiert wird.
4. Verfahren zur Herstellung von Oligopeptiden nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß Gelees royales in der beschriebenen Weise unter den angegebenen Bedingungen selektiv gewonnen werden, die diese Substanzen in besonderem Maße enthalten.
5. Verfahren zur Aktivierung eines synthetischen Peptides nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es durch stufenweise Wechsel des Lösungsmittels, gefolgt von Lyophyli- sation und anschließende Aufnahme in Natriumhydrogensulfat- Lösung von einer unlöslichen inaktiven in eine lösliche aktive, der biologischen Form nahestehende Konformation umgewandelt wird.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP98965731A EP1042364A2 (de) | 1997-12-27 | 1998-12-02 | Aus gelee royale isoliertes antiviral wirksames oligopeptid |
| BR9814506-1A BR9814506A (pt) | 1997-12-27 | 1998-12-02 | Oligopetìdios |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19757932.9 | 1997-12-27 | ||
| DE1997157932 DE19757932C2 (de) | 1997-12-27 | 1997-12-27 | Oligopeptide |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO1999033866A2 true WO1999033866A2 (de) | 1999-07-08 |
| WO1999033866A3 WO1999033866A3 (de) | 1999-09-10 |
Family
ID=7853425
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/EP1998/007811 WO1999033866A2 (de) | 1997-12-27 | 1998-12-02 | Aus gelee royale isoliertes antiviral wirksames oligopeptid |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1042364A2 (de) |
| BR (1) | BR9814506A (de) |
| DE (1) | DE19757932C2 (de) |
| WO (1) | WO1999033866A2 (de) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008208088A (ja) * | 2007-02-27 | 2008-09-11 | Ehime Univ | 口内炎処置用組成物 |
| WO2018188714A3 (en) * | 2018-09-06 | 2020-07-23 | El Fiky Salem Ismaeil Salem | Anti-leukemic, anti-hiv, and sialidase activities of royal-jelly proteins |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10344561B4 (de) * | 2003-09-25 | 2011-12-22 | Eberhard Bengsch | Verwendung eines Tetra-, Penta- und Octapeptids aus Gelée Royale |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1048323A (zh) * | 1989-06-28 | 1991-01-09 | 北京朝阳三益日用化学厂 | 防治艾滋病、性病洗液的制备方法 |
| GB8917295D0 (en) * | 1989-07-28 | 1989-09-13 | Ruffles Graham K | Anti-viral compositions |
| DE4232732C1 (de) * | 1992-09-30 | 1994-02-03 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Standardisiertes Gelee Royale, Verfahren zu seiner Gewinnung und seine Verwendung |
-
1997
- 1997-12-27 DE DE1997157932 patent/DE19757932C2/de not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-12-02 WO PCT/EP1998/007811 patent/WO1999033866A2/de not_active Application Discontinuation
- 1998-12-02 BR BR9814506-1A patent/BR9814506A/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-12-02 EP EP98965731A patent/EP1042364A2/de not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008208088A (ja) * | 2007-02-27 | 2008-09-11 | Ehime Univ | 口内炎処置用組成物 |
| WO2018188714A3 (en) * | 2018-09-06 | 2020-07-23 | El Fiky Salem Ismaeil Salem | Anti-leukemic, anti-hiv, and sialidase activities of royal-jelly proteins |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1999033866A3 (de) | 1999-09-10 |
| EP1042364A2 (de) | 2000-10-11 |
| DE19757932A1 (de) | 1999-07-08 |
| BR9814506A (pt) | 2000-10-10 |
| DE19757932C2 (de) | 2000-01-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Olivera et al. | Peptide neurotoxins from fish-hunting cone snails | |
| Markkula et al. | Changes in the concentration of free amino acids in plants induced by virus diseases and the reproduction of aphids | |
| DE69034085T2 (de) | Lytsche und proliferative Peptide und deren Verwendung als Pharmaka und Phytopharmaka | |
| Kalushkov et al. | The effects of thirteen species of aphids on some life history parameters of the ladybird Coccinella septempunctata | |
| DE69936514T2 (de) | Heliomycin-kodierendes gen und seine verwendung | |
| DE69219590T2 (de) | BPC-Peptide, deren Herstellung und Verwendung | |
| US20140187478A1 (en) | Peptide toxin formulation | |
| DE68911498T2 (de) | Polypeptide, isoliert aus dem Gift von Hololena curta. | |
| Quicke et al. | Spider toxins as lead structures for novel pesticides | |
| DE19757932C2 (de) | Oligopeptide | |
| Ginevan et al. | Ambient air concentration of sulfur dioxide affects flight activity in bees | |
| WO2001087346A2 (de) | Mit toxischen substanzen beladene dendritische zellen | |
| Saunders | Ovaries of Glossina morsitans | |
| Orphanides | Competitive displacement between Aphytis spp.[Hym. Aphelinidae] parasites of the California red scale in cyprus | |
| Moss et al. | Marking pink bollworm (Lepidoptera: Gelechiidae) with cesium | |
| DE69331955T2 (de) | Insektizides toxin der netztrichterspinne (atrax oder hadronyche) | |
| DE69325709T2 (de) | Insektentötende Toxine von der parasitischen Wespe Bracon Hebetor | |
| Perret | The venom of the East African spider Pterinochilus sp. | |
| DE69407771T2 (de) | Mollusk-toxine enthaltende biologische kontrolsubstanzen | |
| Seufi et al. | Electrophoretic analysis of salivary gland proteins of adult Culex antennatus (Diptera: Culicidae) | |
| Varlez et al. | Effects of Bacillus thuringiensis on parasitoids of the olive moth, Prays oleae Bern.(Lep., Yponomeutidae) | |
| KR100496456B1 (ko) | 식물에서 추출한 살비제 조성물 | |
| DE69736828T2 (de) | Antimikrobielles protein | |
| EP1709177B1 (de) | Dna-sequenz und rekombinante herstellung von gruppe-4 majorallergenen aus getreiden | |
| Ross et al. | Toxic and antifeeding actions of melittin in the corn earworm, heliothis zea (boddie): comparisons to bee venom and the insecticides chlorpyriphos and cyromazine |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| AK | Designated states |
Kind code of ref document: A2 Designated state(s): BR |
|
| AL | Designated countries for regional patents |
Kind code of ref document: A2 Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE |
|
| DFPE | Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101) | ||
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application | ||
| AK | Designated states |
Kind code of ref document: A3 Designated state(s): BR |
|
| AL | Designated countries for regional patents |
Kind code of ref document: A3 Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE |
|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 1998965731 Country of ref document: EP |
|
| WWP | Wipo information: published in national office |
Ref document number: 1998965731 Country of ref document: EP |
|
| WWW | Wipo information: withdrawn in national office |
Ref document number: 1998965731 Country of ref document: EP |