WO1999011818A1

WO1999011818A1 - Procede de detection d'acides nucleiques ou de polypeptides hautement fonctionnels

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Publication number: WO1999011818A1
Application number: PCT/JP1998/003854
Authority: WO
Inventors: Isao Karube; Yoichi Okabe; Koichi Sumikura
Original assignee: Isao Karube; Yoichi Okabe; Koichi Sumikura
Priority date: 1997-08-28
Filing date: 1998-08-28
Publication date: 1999-03-11
Also published as: WO1999011818A8; AU8886798A

Description

機能性の高いポリべプチド又は核酸を探索する方法技術分野

本発明は生物工学の分野、詳しくは、ポリペプチド又は核酸の設計に関する, 背景技術

蛋白質、 DNA、 RNAなどの生体高分子は、生理活性、分子認識、触媒活性といつた多様な機能を示す。もしこのような高分子の機能を自由にデザィンすることが可能になれば、全く新しい機能性高分子を創出することが可能になり、医薬、食品などの広範な分野に大きな影響を与えることが期待される。

ところで、最近、配列空間を探索して新しい機能性生体高分子を設計するという研究が精力的に行われている。 N種類の基本となるュニットが L個つながってできた分子に対しては、 N L種類の配列が可能であり、 L次元の配列空間を設定することができる。任意の配列は、この配列空間上の 1点として表される。特定の活性に注目すると、各配列はそれそれ異なる大きさの活性を示すので、配列空間上の各点の上に、対応する配列が示す当該活性の大きさをプロットすると、 L 次元の曲面が現れる。これが適応度の地形であり、配列空間の探索は、適応度の地形の歩行と言い換えることもできる。

SELEX法（Ell ington, A. D. & Szostak, J. W. , 1990, Nature 346, 818-822; Tuerk, C. & Gold, L.， 1990， Science 249, 505-510. )は、配列空間を探索する手法の一つである。 DNA又は RNAに関して、特定の長さの配列をすベて含むような分子集団を作っておき、特定の活性を指標とした選択と選択された分子の増幅を繰り返すことにより、目的の機能を持つ分子を濃縮するというものである。遺伝情報と表現型を対応づけることによってべプチドに対してこれと同じことを行うのが、ファージディスプレイ法（Scott， J. K. & Smith, G. P. , 1990, Science 249, 386- 390. )やポリソームディスプレイ法（Mattheakis, L. C. et. al.， 1994, Proc . Natl . Acad. Sci . USA 91, 9022-9026. )である。しかし、これらの手法においては、多数の分子の反応が同じ溶液内で起こり、実際には単一分子の反応の時は起こり得ない競争や阻害が生じるため、濃縮された配列が最適化された機能を持っているとは限らない。また、 2種類の異なる配列が同程度の活性を持っているとき、長い方の配列はもともと集団内の存在割合が低いために、最終的な塩基配列解読の段階で検出されにくいという欠点もある（Sumikura， K. et. al .， N ucleic Acids Symp. Ser. , in press. )。

それに対して、配列空間内の一つ一つの配列について別個に活性測定を行うのが、固相合成法（Fodor, S. P. A. et. al .， 1991， Science 251 , 767- 773. )である。これは、基板上のどの位置にどの配列が存在するかが分かるようにしておき、その基板上で反応を行って反応性の大小をモニタリングし、高活性な配列はどれかを知るというものである。この手法は、可能なすべての配列の活性をそれそれ個別に調べるため、扱える配列の長さに限界がある上、結合能などの固相上で確認できる活性についてしか調べることができない。また、プ一リング 'ストラテジ一（Kauffman, S. A. & Macready, W. G.， 1995, J. theor. Biol . 173, 427-4 40. )は、配列上の個々の残基について順に最適なュニットを決めてゆくことにより、左記の手法の長さや活性に関する制約を克服しょうとしたものであるが、この手法は個々の残基が活性に対してそれそれ独立に寄与している場合のみにしか有効ではない。

以上のように、分子集団をひとまとめに扱って選択と増幅を繰り返す戦略では、多くの配列を検証できるものの得られた配列が最適なものかどうかが疑わしく、一方、すべての配列の活性を個別に測定する戦略では、検証可能な条件が限られてしまう。そこで、配列空間の中の一部分の個体の活性を個別に調べ、その結果に基づいて次に活性を調べる配列を決める、という操作を何世代かにわたって繰り返して最適解に近づいてゆくという手法が考案された（Yokobayashi， Y. , 1996, J. Chem. Soc , Perkin Trans. 1, 2435-2437. )₀ この戦略が適切に働けば、配列空間の中のごくわずかな数の分子を調べるだけで最適な配列を知ることができ、しかも得られた配列の最適解としての信頼性も高いと考えられる。

横林らは、上記の戦略をとる際に、「遺伝的アルゴリズム」を用いて次の世代の個体を決めるという実験を行った（Yokobayashi, Y.， 1996, J. Chem. Soc , P erkin Trans. 1， 2435-2437. ) ₀ 生命の進化においては、環境に適した遺伝子の選択、遺伝子の組み換え、それに突然変異が重要な役割を果たしていると考えられるが、遺伝的アルゴリズムとは、このような進化のメカニズムを数学的にモデル化したものである（Forrest, S. , 1993， Science 261 , 872-878. )。遺伝的ァルゴリズムにおいては、通常、電算機上で、遺伝子に見立てた一組の文字列の集合に対して、選択、組み換え、突然変異の 3つの過程をモデルとした数学的な演算を施すことによって、文字列の集合を目的に叶ったものへと進化させてゆく。

前述の横林らの実験では、 6アミノ酸からなるぺプチドのトリプシン阻害活性を、 1世代あたり 24配列、 6世代にわたって調べている。阻害活性の平均値は初期世代から最終世代までコンスタントに上昇したが、阻害活性の最大値に関しては、最終世代の値と初期世代の値の比が 1.03であり、ほとんど変わらない大きさであった。このことから、従来の遺伝的アルゴリズムは各世代の活性の平均値の上昇にはある程度機能するものの、最適解の探索効率は低いと考えられる。発明の開示

本発明は、効率的に、機能性の高い生体高分子を設計する手法を提供することを課題とする。

自然界におけるタンパク質の進化は、それをコードする遺伝子の突然変異、 2 つの親個体の遺伝子の間で生じる組み換え、そして環境に適応した個体の選択という過程を経て進むと考えられており、遺伝的アルゴリズムもこの過程をモデル化している。

一方、長期的なスパンでの進化の様子を眺めると、タンパク質は、ある程度の長さを持ったポリペプチドをコードする多種多様な遺伝子を基本ュニットとし、それらのュニットをつなぎ合わせることでより高い機能を獲得したと考えられている。真核生物の遺伝子の多くは、アミノ酸に翻訳される領域（ェキソン）とェキソン間の非翻訳領域（イントロン）から成り、タンパク質のアミノ酸配列は複数のェキソンに分かれてコードされている。長いスパンで見ると、ェキソンが夕ンパク質の進化の基本ユニットであり、イントロンはェキソンの切り混ぜ（ェキソン 'シャフリング）を行うための領域であると考えるのが、遺伝子のェキソン説（de Souza, S. J. et. al . , 1996, Genes Cel ls 1， 493- 505. )である。実際、上皮増殖因子蛋白質のあるドメインをコ一ドしているェキソンと同じものが、低密度リポ蛋白質受容体、血液凝固因子 IX及び Xという全く関連のない蛋白質に見出されており（Sudhof, T. C. et. al . , 1985, Science 228, 815-828. )、ェキソン

•シャフリングが夕ンパク質の進化の駆動力となったことを示唆している。アミノ酸を基本ユニットとして、可能な組み合わせをすベて検証するよりも、ェキソン ·シャフリングの方がより迅速に高機能のタンパク質を作り上げることができると考えられる。

本発明者らは、このェキソン ·シャフリングという進化のメカニズムに注目し、電算機を利用して複数の個体間でのェキソン ·シャフリング様の遺伝子の再編成を人工的に行うことを基本とする「シャフリング戦略」という分子設計法を開発した。この方法を用いることにより、従来の遺伝的アルゴリズムよりも劇的で迅速な分子の進化を行わせることができ、従って、より効率的に機能性高分子を検索することが可能となった。

すなわち、本発明は、以下のものを含む。

( 1 ) 以下の工程を含む、機能性の高いポリペプチド又は核酸を探索する方法。 ( a ) 互いに異なる配列を有する複数のポリぺプチド又は核酸を合成し、 (b) 合成されたポリべプチド又は核酸の適応度を実験室レベルで測定し、

(c) 工程（a) で合成されたポリペプチド又は核酸を適応度に応じて順位付けし、

(d) 順位に応じて選択した個体間で部分構造の切り混ぜ（シャフリング）を行うことにより得られた配列からなる「シャフリング ·ライブラリー」を作成し、

(e) 「シャフリング 'ライブラリー」に属するポリペプチド又は核酸を合成し、 (f ) 工程（e) で得られたポリペプチド又は核酸について、さらに工程（b) ないし工程（e) を任意の回数繰り返す。

(2) 工程（d) において、シャフリングを行うことにより得られた配列を有するポリべプチド又は核酸とは別個に、特定の配列に対して突然変異を導入した配列を作成し「シャフリング 'ライブラリ一」に加えることを特徴とする、（ 1) 記載の方法。

(3) 特定の配列を、工程（c) における一定以上の順位を有する配列とする、請求項 2記載の方法。

(4) 工程（d) において、シャフリングを行うことにより得られた配列の少なくとも 1つに対して、更に突然変異を導入した配列を作成し「シャフリング · ライブラリー」に加えることを特徴とする、（ 1) 記載の方法。

(5) 工程（d) において、一定の順位以上の個体間のみでシャフリングを行うことを特徴とする、（ 1) 〜（4) のいずれかに記載の方法。

(6) 工程（d) において、一定の順位以上の個体を更に、上位から下位に複数のグループとし、それそれのグループの中でシャフリングを行うことを特徴とする、（5) 記載の方法。

(7) ( 1) 〜（6) のいずれかに記載の方法により得られ一定以上の適応度を有する、天然には存在しないポリべプチド又は核酸。

なお、本明細書において、「シャフリング」とは、ポリべプチド又は核酸の配列を複数の特定のブロック（これを「仮想ェクソン」と名付ける）に分割し、複数の個体の間で仮想ェクソンを入れ替え、新しいポリべプチド又は核酸の配列を作成する操作を指す。また、本明細書において「シャフリング 'ライブラリ一」とは、特定のポリペプチド又は核酸の配列に対する「シャフリング」の操作を行つた結果生じた配列群を指す。

本発明において、ポリペプチド又は核酸を合成するには、当業者に知られた手段、例えばポリペプチドについては t-Boc法 (Merrifield, B.， 1986， Science 23 2, 34卜 347. )又は Fmoc法（Gorka， J. et. al .， 1989， Pept. Res. 2, 376-80. )、核酸についてはホスホアミダイト法（Itakura, K. et. al .， 1984, Ann. Rev. Bi ochem. 53， 323-356. )等を用いることができる。

本明細書において「適応度」とは、個々の配列を有するポリペプチド又は核酸が特定の生理活性をどれくらい示すかを表す指標であり、通常、実験室レベルでの測定により決定される。例えば、ポリペプチドの適応度としては、標的分子に対する結合活性又は抗生物質としての活性等があげられ、前者は EUSA法（Creigh ton, T. E. (Ed) , 1989, Protein Structure. A Practical Approach, IRL Pres s. )又は BIAcore(Griffiths, D. G. & Hall , G,， 1993, Tibtech 11 , 122- 130. )により、また後者は菌体に対する生育阻害能を調べることにより、測定することができる。また、核酸の適応度としては、タンパク質に対する結合活性又は特定の塩基配列を持つ核酸を切断する触媒活性等があげられ、前者は ELISA法、 BIAcore, 又はゲルシフト法（Latchman, D. S. , 1993, Transcription Factors, IRL pres s. )により、また後者は放射性ラベルを用いた方法（Santoro, S. W. & Joyce, G.

F. , 1997, Proc . Natl . Acad. Sci . USA 94, 4262- 4266. )又は電気泳動（Cantor,

C. R. & Schi翻 el， P. R.， 1980， Biophysical Chemistry, Chapter 12, Freem an. )により、測定することができる。

本発明において、活性測定とシャフリングのサイクルは通常 5回（世代）以上行い、好ましくは 8回以上行い、更に好ましくは 10回以上行う。また、シャフリングは適応度が上位の配列を対象に行うことが好ましく、通常上位 50%以内で行い、好ましくは上位 40 %以内で行い、更に好ましくは上位 25 %以内で行う。ただし、シャフリングを行う配列をあまりに限定しすぎると、最適解でなく局所解に行き着いてしまいやすいので、注意が必要である。

更に、一定の順位以上の個体を、順位に応じて複数のグループに分け、それそれのグループの中でシャフリングを行うこともできる。これにより、多数の配列の間の大域的なシャフリングと少数の配列の間の局所的シャフリングを並行して行うことができる。この場合、例えば、上位 20%以内、及び上位 40 %以内の 2つのグループを設定することが可能であるが、上位個体のグループからはより多数の次世代個体が生じるように設定すると、多くの場合において、より迅速に最適解探索を行うことができると考えられる。

更に、本発明においては、仮想ェクソンのシャフリングによる配列の再編成だけでは使用できる材料が限定されてしまうので、仮想ェクソンとして存在する配列に対して突然変異を導入することによって、より多くの多様性を配列群に与えることが重要となる。突然変異には、点突然変異、欠失変異、挿入変異、逆位、転座など、通常のあらゆる変異が含まれる。具体的には、シャフリングを行うことにより得られた配列を有するポリぺプチド又は核酸とは別個に、特定の個体に対して突然変異を導入した配列を作成し「シャフリング ·ライブラリー」に加えることができる。突然変異を導入する個体としては、適応度の高い個体を選択することが好ましい。また、別の方法として、シャフリングを行うことにより得られた配列を有するポリべプチド又は核酸に対して、更に突然変異を導入した配列を作成し「シャフリング 'ライブラリ一」に加えることができる。

なお、本発明においてシャフリングを行う対象となる配列として、適応度の高さに加えて、配列の「孤立度」の高い配列を優先的に選択することができる。ここで、配列の「孤立度」とは、特定の配列について、同一世代の他の配列との類似性の低さを示す指標であり、特定の配列と同一世代の他のそれそれの配列との「類似度」の総和に反比例するものとして定義することができる。なお、ここでいう配列の「類似度」とは、 2つの配列の間の類似性を示す指標のことであり、例えば、 2つの配列を比較して、同一位置に同一残基又は塩基が存在する時を 1 ポイントとし、合計のポイント数で定量化することが可能である。具体的には、同一世代の各配列を「適応度」と「孤立度」との積によって順位付けし、一定の順位以上の個体間のみでシャフリングを行うことができる。また、同一世代の各配列を「適応度」と「孤立度」との積によって順位付けし、一定の順位以上の個体を更に、順位に応じて複数のグループとし、それそれのグループの中でシャフリングを行うこともできる。

なお、本発明において、当初の（第 1回目のシャフリングを行うもととなる）配列集団は、天然に存在する配列を含んでいてもよい。この場合は、天然に存在する分子の機能を更に向上させることが可能となる。

また、本発明において、当初の配列として、ランダムな配列を用いることもできる。ランダムな配列を出発配列としても、「シャフリング戦略」によって適応度が顕著に上昇していくので、実用上何ら問題はない。むしろ、ランダムな配列を出発配列とする方が、天然型とは構造が大きく異なる高活性の生体高分子にたどり着く可能性が高くなるともいえる。

従来の生物工学においては、まず生体高分子を探索し、その後該分子の機能を解析していくという手法、又は、まず特定の生命現象を解析し、該現象を誘導している生体高分子を探索するという手法がとられていた。いずれの手法にせよ、得られる生体高分子は、生命現象に直接関与しているものに限られていた。本発明においては、生命現象に直接関与していないポリペプチド又は核酸も、探索の対象となる。即ち、本発明においては、生命現象のみならず、あらゆる化学反応、特定の機能を有する構造の形成などに関与するポリべプチド又は核酸を、自由に探索できるところが大きな特徴といえる。図面の簡単な説明図 1は、ペプチドと抗体の間の結合定数（KA) の比を表す図である。

図 2は、シャフリング戦略と遺伝的アルゴリズムを比較した図である。横軸は分子のバリエーション、縦軸は 100回の試行における最大値の平均を表す。

図 3は、ダブル Gカルテツトの構造を表す図である。

図 4は、トリプル Gカルテツトの構造を表す図である。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。

[実施例 1 ] 既知のタンパク質に結合する新規べプチドの設計のシミュレ一シヨン（赤血球凝集素由来のぺプチドとモノクローナル抗体との結合データに基づく、適応度の地形の探索）

シャフリング戦略による分子設計の特徴を明らかにするために、実際の測定デ一夕に基づいて適応度の地形を設定し、シャフリングを行い、インフルエンザゥィルスの赤血球凝集素（HA) と親和性の高いタンパク質の検索を行った。

( 1 ) 適応度の地形のもとになつた実験デ一夕

インフルエンザウイルスの赤血球凝集素（HA)は、ウィルスの膜面タンパク質であり、これを抗原として宿主の体内でウィルスに対する抗体が産生される。 HAは 550残基の同一サブユニットからなる三量体で、その単量体は、 HA1及び HA2という 2つのポリペプチド鎖から構成されている（Wi lson, I . A. et. al .， 1981, Natu re 289， 366-73. ) o

HA1の 100〜108番に相当するペプチドは、 Fab 17/9というモノクローナル抗体と結合することが知られている（Rini, J. M. et. al . , 1992, Science 255 , 959-96 5. ) o Churchil lらは、 HA1の 101〜107番に相当するペプチド（101D- 102V- 103P-104 D- 105Y- 106A- 107S)のすベての 1アミノ酸置換体（計 113個）について、 Fab 17/9 に対する結合能を競合 ELISA法によって調べ、 IC 5 0の値をそれそれについて計算した（Churchill, M. E. A. et. al. , 1994, J. Mol. Biol. 241， 534-556. )₀ IC 50は、ここでは、野生型の配列を持つコントロ一ル .ぺプチドの Fab 17/9に対する結合を 50%阻害するのに必要なそれそれのアナ口グの濃度のことである。

( 2 ) 適応度の計算

IC50はべプチドと抗体の間の解離定数（KD)に比例すると考えてよいので（A ita, T. & Husimi, Y.， 1996, J. theor. Biol. 182, 469-485. )、 IC50の逆数は、ペプチドと抗体の間の結合定数（KA)に比例する。図 1 (Churchillらの Fig ure 7をもとにして作成）は、各アナログの IC 50の逆数をコントロール ·ぺプチドの IC 50の逆数で割った値を示す（なお、図 1中の英文字は、アミノ酸の 1文字コードを表す）。上の理由によりこれらの値はアナログとコントロール 'ぺプチドの K A値の比であると考えて良い。

タンパク質同士の相互作用やタンパク質と DNAの結合に関しては、統計的に見て、自由エネルギー変化の加算性が成り立つ（Wells， J. Aリ 1990, Biochem. 29, 85 09-8517.)。そこで、 7アミノ酸から成るペプチドの Fab 17/9に対する結合能についても、すべての部位のアミノ酸置換は、概ね、結合能に対してれそれ独立に作用すると考えることができる。つまり、野生型配列に対するある 1アミノ酸置換体を X、それとは別の部位に 1アミノ酸置換が入った配列を Y、それら 2つのァミノ酸置換を合わせ持つ配列を（X, Υ) で表すと、

△△G (X, Y) =AAG (X) +AAG (Y)

と考えられる（なお AGは結合による自由エネルギー変化を表し、 AAGは野生型に対するアミノ酸置換による AGの変化量を表す）。結合定数 KAと自由エネルギー AGとの関係は、

KA=exp (-AG/RT)

で表される（Aita， T. & Husimi, Y., 1996, J. theor. Biol. 182, 469- 485.)ので、上の仮定のもとでは、

KA (置換型)/ KA (野生型） = exp (— AAG (置換型）/ RT) が成り立つ。従って、

八， )/!^八（野生型）= 6 (-AAG(X,Y)/RT)

= exp (- (AAG(X) + AAG(Y)) / T)

= exp (-AAG(X)/RT) · exp (-AAG(Y)/RT)

二（KA(X)/KA (野生型）） · （KA(Y)/KA (野生型））

となり、任意のアミノ酸配列について、図 1の値を掛け合わせることにより、 Fa b 17/9に対する平衡結合定数（ K A)の相対値を求めることができる。

(3) コンピュータ一 'シミュレーションの条件

シャフリング戦略及び単純な遺伝的ァルゴリズムによる分子設計のシミュレ一シヨンを行った。条件の詳細は次の通りである。

[シャフリング戦略]

最初に、ランダムな配列を持つ 20個のペプチドを生成させた。それぞれのぺプチドの適応度（Fab 17/9に対する結合能）は、（2) により、図 1の値に基づく計算から求められる。この結合能に従って、ペプチドを順位付けした。次に、 7 つのアミノ酸を 2-2- 3に分割して 3つの仮想ェクソンを設定し、上位 8個体の間で仮想ェクソンのシャフリングを行って次の世代の個体を 8個体作製した。シャフリングにあたっては、適応度に比例して仮想ェクソンを残しやすくした。上位 2 個体については、仮想ェクソンのすべての組み合わせが生じるようにして 6個体を作製した。それに加えて、上位 3個体のそれそれに対して、 1個体につき 1残基の突然変異が生じるようにして新しい個体を作製した。 1個体から 2つの突然変異体が生じるものとした。このようにして、ある世代の 20個の個体から、次の世代の 20個の個体が作られた。

このような、適応度の計算とその結果に基づく次世代個体の作製を 40世代にわたって行った。また、この 40世代にわたる探索を 1回の試行と数え、 100回の試行を行って結合能の定向進化の様子を調べた。

[遺伝的アルゴリズム] 最初に、ランダムな配列を持つ 60個のペプチドを生成させた。それそれの配列の適応度の計算に関しては、上に同じである。次世代個体の作製の際には、結合能に比例した確率で 2つの親個体を選び、それらの間でランダムな位置での組換えを生じさせることにより新たな 2つの個体を作製した。また、 0. 1の確率で突然変異が入るものとした。このようにして次の世代の 60個体が作製された。

( 4 ) コンビュ一夕一'シミュレーションの結果

各世代における適応度の最大値を 100回の試行に関して平均した値、各世代における適応度の平均値を 100回の試行に関して平均した値、各世代における適応度の最小値を 100回の試行に関して平均した値、その世代にいたるまでに集団中に存在したした分子のバリエーション（つまり、実際に合成しなくてはならない分子は何種類か、を示す値）を 100回の試行に関して平均した値、をそれそれ算出した。図 2は、横軸に分子のバリエーション、縦軸に 100回の試行における最大値の平均をとり、シャフリング戦略と遺伝的アルゴリズムを比較したものである。これを見ると、シャフリング戦略の方が遺伝的アルゴリズムよりも効率よく最適解を探索していることが分かる。同様にして、各世代における適応度の平均値を 100回の試行に関して平均した値、各世代における適応度の最小値を 100回の試行に関して平均した値についても、シャフリング戦略の方が遺伝的アルゴリズムよりも効率よく最適解を探索していることが判明した。また、適応度が初めて 1を超えるまでにいくつの個体を合成しなくてはならないか、について比較してみると、シャフリング戦略の場合は 129個体、遺伝的ァルゴリズムが 155個体となり、ここからも遺伝的アルゴリズムに対するシャフリング戦略の探索効率の高さを見て取ることができる。

( 5 ) 別の条件によるシャフリングシャフリング戦略の探索効率の再現性を確かめるために、上とは別の条件でシャフリングを行ってみた。上と異なる点は、シャフリングにあたって、適応度に比例して仮想ェクソンを残す際に、個体間の適応度の差が激しい初期世代においても配列の多様性が保たれるよう、適応度に関してシグマ ·スケ一リングを行つたことである。本実施例においては、もとの適応度を f、変換後の適応度を f ' 、その世代の個体の適応度の平均値を f avr、適応度の標準偏差をびとすると、 f = f - ( f avr- 3 x σ )

という式で変換を行った。 100回の試行の平均を取ると、適応度が初めて 1を超えるまでに合成した分子の数は、 119個体となり、シャフリング戦略の探索効率の高さが確かめられた。

[実施例 2 ] トロンビンに結合する一本鎖 DNAの配列の最適化

実施例 1では、統計的な知見に従って、自由エネルギー変化の加算性が完全に成立するという仮定に基づき、適応度の地形を設定してコンピューター ·シミュレーシヨンを行った。一方、実際に実験室レベルで適応度を測定して分子設計を行うにあたっては、複数のァミノ酸置換ゃ塩置換が相関して適応度に影響している場合もあると考えられる。また、測定機器に検出限界によりすベての配列の適応度を測定できるとは限らないなど、シミュレーションとは異なる状況が生じる。そこで、実際に分子を合成して適応度を測定するという過程を含む、次のような実験を行った。

( 1 ) トロンビンとトロンビン .ァプ夕マ一

トロンビンは、セリンプロテアーゼの一種のタンパク質であり、血液凝固をはじめとする様々な機能を担っている。 5' - GGTTGGTGTGGTTGG- 3，（配列番号： 1) という 15残基から成る一本鎖 DNAは、トロンビン ·アブ夕マ一と呼ばれ、トロンビンに結合しその生理活性を阻害することが知られている（Bock， L. C. et. al .， 19 92, Nature 355, 564-566. ) ₀ またこの分子は、図 3のように、 2つの G—カルテット構造によって安定化される立体構造をとっている（Wang, K. Y. et. al .， 19 93, Biochemistry 32, 1899-1904. )。

今回、トロンビン 'アブ夕マーの 2つの G—カルテツト構造以外の 3つの部分を仮想ェクソンとして設定し、これらの部分がどのような配列に最適化されるかを調べた。すなわち、

5' -GGNNGGNNNGGNNGG-3' (Nは、 A、 C、 Gヽ又は Tを表す）

なる 20個のォリゴヌクレオチドを出発点とし、シャフリング戦略による次世代の設計と合成 ·適応度の測定を繰り返し、生じてくる配列を追跡したのである。

( 2 ) 適応度の測定法

それそれの配列の適応度（トロンビンに対する親和性）の測定は、表面プラズモン共鳴の原理を利用した実験装置である BIAcore2000 (BIAcore AB社）を用いて行った。

合成された一本鎖 DNAを BIAcore2000用のセンサーチップ上にカルボキシメチルデキストラン及びストレブトアビジンを介して固定化し、それに対して 20 Mのトロンビンを流し、応答を調べた。 BIAcoreにおいては、固定化された物質に分子が結合すると、センサーチップ付近の屈折率が変化し、それがレゾナンス 'ュニッ卜の変化として検出されるようになっている。

( 3 ) シャフリング戦略の実際

最初の世代の 20個体を合成し、適応度を測定したところ、上位 8個体は次のようになつた。なお、配列の右の数値は、 BIAcore2000によって得られた、適応度の高さを表す数値である。

0-12 : GG TC GG GTG GG TT GG (配列番号： 2) 1299.9

0 - 8: GG CC GG TTC GG TT GG (配列番号： 3) 1281.5

0-15 : GG TG GG TAC GG CT GG (配列番号： 4) 1101.9

0-17: GG CG GG GCG GG TG GG (配列番号： 5) 1077.8

0- 3 : GG CA GG TAG GG TA GG (配列番号： 6) 1000. 1

0- 9 : GG GC GG GTC GG AT GG (配列番号： 7) 740.3 0-10: GG GC GG TTA GG CA GG (配列番号： 8) 526.5

0- 14: GG TA GG GCA GG AG GG (配列番号： 9) 452.3

適応度が高かった上位 2個体間でシャフリングを行うことにより、新たに以下のような 6個体を作製した。なお、以下で左から数えて 1番目、 2番目、 3番目の仮想ェクソンを（1),(2)，（3)と表す。

- 1: GG TC GG GTG GG TT GG :0-12(1)， 0-12(2)， 0- 8(3) (配列番号： 2) - 2: GG TC GG TTC GG TT GG :0-12(1)， 0- 8(2), 0- 8(3) (配列番号： 10) ― 3: GG CC GG TTC GG TT GG :0- 8(1), 0- 8(2), 0-12(3) (配列番号： 3) - 4: GG CC GG GTG GG TT GG :0 - 8(1), 0-12(2), 0-12(3) (配列番号： 11) ― 5: GG TC GG TTC GG TT GG :0-12(1), 0 - 8(2), 0-12(3) (配列番号： 10) - 6: GG CC GG GTG GG TT GG :0- 8(1)， 0-12(2)， 0- 8(3) (配列番号： 11) また、適応度が高かった上位 8個体間で、適応度の大きさに比例して仮想ェクソンを残しやすいようにシャフリングを行うことにより、新たに以下のような 8個体を作製した。

1- 7: GG GC GG TTC GG TT GG :0-10(1)， 0- 8(2), 0-12(3) (配列番号： 12) 1 - 8: GG TC GG TAC GG AG GG :0-12(1)， 0-15(2), 0-14(3) (配列番号： 13) 1- 9: GG CG GG GCA GG AT GG :0-17(1), 0-14(2), 0- 9(3) (配列番号： 14) 1-10: GG TG GG TAC GG TT GG :0-15(1)， 0-15(2), 0- 8(3) (配列番号： 15) 1-11: GG CG GG TAG GG AT GG :0-17(1), 0 - 3(2), 0- 9(3) (配列番号： 16) 1-12: GG TC GG TAC GG TT GG :0-12(1), 0-15(2), 0- 8(3) (配列番号： 17) 1-13: GG GC GG GCG GG TT GG :0- 9(1), 0-17(2), 0- 8(3) (配列番号： 18) 1-14: GG CG GG GCG GG CT GG :0-17(1), 0-17(2)， 0-15(3) (配列番号： 19) さらに、上位 3個体に対して 2/7の確率で突然変異を導入し、新たに以下のような 6個体を作製した。

1-15: GG TC GG GTT GG TA GG :0-12に変異を導入（配列番号： 20)

1-16: GG TG GG GGG GG TT GG :0 - 12に変異を導入 (配列番号： 21) 1-17: GG CC GG TCC GG TG GG :0- 8に変異を導入（配列番号： 22) 1-18: GG CC GG CTC GG AT GG :0- 8に変異を導入（配列番号： 23)

1-19: GG TG GG TAA GG AT GG :0-15に変異を導入（配列番号： 24)

1-20: GG TT GG TAT GG CT GG :0-15に変異を導入（配列番号： 25)

このようにして、第 2世代の 20個体が準備された。この中で、 1-2と卜 5、及び 1 - 4と卜 6はそれそれ同じものである。また、 1-1と卜 3は前の世代に存在したのと同じものである。従って、実際には、 16種類の配列を新たに合成した。

以下同様にして、新世代の設計 ·合成と適応度の測定が繰り返された。

(4) 結果

以上のようにして世代を重ねてゆくと、トロンビン ·アブ夕マーとして知られている配列（5' - GGTTGGTGTGGTTGG- 3， /配列番号： 1)に近いものが上位を占めるようになつてきたが、同時に、それにあまり近くない Gリッチな配列も一定の割合で残った。それらの Gリッチな配列をよく見てみると、上に示した 0-12や 0-17のように、本来存在する 2つの G—カルテツトとは別のもうひとつの G—カルテツト構造を部分的に組み得るような配列であると予想された。このことから、 G— カルテットを 3つ持つような配列も、トロンビンに対して高い結合能を持っているのではないかと推測された。

そこで、 5， -GGGTTGGGTTGGGTTGGG-3' (配列番号： 26) という、図 4のような形で 3つの G—カルテットを組むと予想される配列（「tril8」と呼ぶ）を合成し、トロンビンとの結合を BIAcore2000で調べた。血中に近いイオン条件のバッファー (lOmM Hepes(pH 7.4), 150mM NaCl, 5mM KCl, 2mM CaC12 , ImM MgCl 2 ) のもと、 37°Cで、「tril8」とトロンビンを相互作用させ、解析ソフト（BIAevaluation v er2.1/Biocore AB社）を用いて平衡解離定数を求めたところ、この条件下で、プロトタイプのトロンビン 'アブ夕マ一と「tril8」はほぼ等しい KD値（8.96x1 0— 8 M及び 9.16x10— 8 M、「tril8」の KD値はプロトタイプの KD値の 1. 02倍）を示した。 3つの G—カルテットによってもたらされる構造の安定性の高さを考慮すると、「tril8」はプロトタイプをしのく、有効なトロンビン阻害剤として臨床応用されると期待される。

このように、シャフリング戦略による分子設計の過程で得られた配列の情報に基づいて、これまで知られていなかった配列が、既知のものとほぼ等しいトロンビン結合能を示すことが明らかになった。産業上の利用可能性

本発明によって、機能の高いポリべプチド又は核酸を効率的に探索することが可能となった。例えば、天然に存在するポリぺプチド又は核酸の機能を飛躍的に向上させることが可能となった。更に、特定の機能を有し、天然には存在しない新規な構造を有するポリべプチド又は核酸を、自由に探索することが可能となつた。

Claims

請求の範囲

1. 以下の工程を含む、機能性の高いポリペプチド又は核酸を探索する方法。

(a) 互いに異なる配列を有する複数のポリべプチド又は核酸を合成し、

(b) 合成されたポリべプチド又は核酸の適応度を実験室レベルで測定し、

(d) 順位に応じて選択した個体間で部分構造の切り混ぜ（シャフリング）を行うことにより得られた配列からなる「シャフリング ·ライブラリ一」を作成し、

(e) 「シャフリング 'ライブラリ一」に属するポリペプチド又は核酸を合成し、 (f ) 工程（e) で得られたポリペプチド又は核酸について、さらに工程（b) ないし工程（e) を任意の回数繰り返す。

2. 工程（d) において、シャフリングを行うことにより得られた配列を有するポリべプチド又は核酸とは別個に、特定の配列に対して突然変異を導入した配列を作成し「シャフリング ·ライブラリー」に加えることを特徴とする、請求項

1記載の方法。

3. 特定の配列を、工程（c) における一定以上の順位を有する配列とする、請求項 2記載の方法。

4. 工程（d) において、シャフリングを行うことにより得られた配列の少なくとも 1つに対して、更に突然変異を導入した配列を作成し「シャフリング -ライブラリー」に加えることを特徴とする、請求項 1記載の方法。

5. 工程（d) において、一定の順位以上の個体間のみでシャフリングを行うことを特徴とする、請求項 1〜4のいずれかに記載の方法。

6. 工程（d) において、一定の順位以上の個体を更に、上位から下位に複数のグループとし、それそれのグループの中でシャフリングを行うことを特徴とする、請求項 5記載の方法。

7 . 請求項 1〜 6のいずれかに記載の方法により得られ一定以上の適応度を有する、天然には存在しないポリべプチド又は核酸。