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WO1999009194A1 - Adenovirus aviaire celo recombinant et son utilisation comme vecteur vaccinant - Google Patents

Adenovirus aviaire celo recombinant et son utilisation comme vecteur vaccinant Download PDF

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WO1999009194A1
WO1999009194A1 PCT/FR1998/001803 FR9801803W WO9909194A1 WO 1999009194 A1 WO1999009194 A1 WO 1999009194A1 FR 9801803 W FR9801803 W FR 9801803W WO 9909194 A1 WO9909194 A1 WO 9909194A1
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avian
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Patrick Langlois
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Agence Francaise De Securite Sanitaire Des Aliments
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    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Definitions

  • the invention relates to methods for the preparation of recombinant CliLO avian adenoviruses and their uses as a vector for expression of heterologous proteins for the preparation of vaccines, in particular for the protection of avian species against common infectious diseases, or as of expression vector of heterologous proteins involved in metabolism.
  • the presentation of an effective and durable antigen, capable of mobilizing short-term and long-term immunological memories, remains the major concern of any vaccine-based prophylaxis. For a long time, the latter were constituted by the presentation, in the case of viruses with pathogenic effects, of the entire virion, either dead (inactivated vaccine), or more or less defective (live attenuated vaccine).
  • Herpes viruses are double-stranded DNA viruses with capsids and envelopes, and are, for example, responsible for two important diseases: Aujesky's disease in pigs and Marck's disease in chicken. These viruses have complex genomes (150 kb on average) and obtaining the high titers necessary for industrial application is not always easy.
  • Retroviruses are capsid and envelope ⁇ RN viruses which, as recombinant vectors, are essentially studied and used for gene transfer in mammals, human gene therapy, or in avian species.
  • Adenovi s are double-stranded DNA viruses 30 to 44 kb in length. They are capsid viruses, not enveloped. In practice, one can insert, without any deletion, 1.5 kb in addition of exogenous material into an original genome of adenovirus without disturbing replication.
  • Adenovirus has the following advantages for it: it is, in general, a pathogenic agent, responsible for mild damage to the upper airways. It can infect a wide range of cells, whether or not they are dividing. It is thus possible to modify cells which divide little, such as lung cells or muscle cells.
  • this virus multiplies very easily, which allows the production of recombinant viruses at very high titers (10 11 to 10 13 viruses per milliliter), much higher than those of recombinant retroviruses and therefore to obtain a better rate of genetic transformation of target cells.
  • An additional advantage of the adenoviral vector is that its genome does not integrate into the cellular genome, minimizing the risks of activation of oncogenes, it remains in the state of episomes.
  • the nebulization or aerosol spraying of the recombinant virions associated with strong titles, should allow mass vaccinations, particularly interesting for avian species.
  • recombinant avian adenovirus as a recombinant vector for its application as a recombinant vaccine or for gene transfer requires the insertion of heterologous (exogenous) DNA of interest in nonessential regions of the viral genome.
  • the size of the heterologous DNA of interest to be inserted is greater than a value of approximately 1.5 kb, the insertion must be preceded by the deletion of one or more nonessential regions of the viral genome. This is why, only the precise knowledge of these nonessential regions of the genome of the adenovirus can make it possible to define a strategy in the preparation of such recombinant vectors.
  • One of the essential aims of the present invention is to obtain expression vectors of heterologous proteins for the preparation in particular of avian vaccine from preparation methods based on the discovery of nonessential and essential regions of the avian adelovirus CELO.
  • the present invention relates to methods for preparing a recombinant CELO avian adenovirus, characterized in that a DNA sequence coding for all or part of a polypeptide heterologous to the adenovirus is inserted into a non-essential part of its genome.
  • avian CELO said DNA sequence possibly comprising elements capable of ensuring the expression of said polypeptide in a cell infected with said recombinant adenovirus, preferably said nonessential part corresponding to a non-coding intergenic zone of avian adenovirus CELO.
  • the invention also relates to preparation methods according to the invention, characterized in that said methods are preceded by a deletion step of at least one non-essential part of the genome of the avian adelovirus CELO.
  • the invention further relates to preparation methods according to the invention, characterized in that said methods are preceded by a deletion step of at least one essential region of the genome of the avian adelovirus CELO.
  • the invention also relates to methods according to the invention, characterized in that said DNA sequence codes for a polypeptide of interest, preferably an antigenic polypeptide of an infectious agent responsible for disease in animals such as species avians.
  • the invention further relates to methods according to the invention, characterized in that the polypeptide of interest is a polypeptide which is involved in animal or human metabolism.
  • the vectors characterized in that they comprise a recombinant CELO avian adenovirus obtained by a method according to the invention, also form part of the invention.
  • the vaccines characterized in that they contain a vector according to the invention for the protection of avian species against infectious diseases.
  • the invention also relates to cells transformed with a vector according to the invention.
  • Another aspect of the invention relates to methods for the in vivo preparation of recombinant polypeptides of interest, characterized in that they involve the infection of an animal by a vector according to the invention, of which said sequence of inserted DNA encodes said polypeptide of interest.
  • the subject of the invention is processes for the preparation of recombinant polypeptides of interest, characterized in that they use the culture of cells transformed according to the invention.
  • the invention relates to a method for preparing a recombinant CELO avian adenovirus, characterized in that a DNA sequence coding for all or part of a polypeptide heterologous to the adenovirus is inserted into a non-essential part of its genome.
  • CELO avian a DNA sequence coding for all or part of a polypeptide heterologous to the adenovirus is inserted into a non-essential part of its genome.
  • the adenovirus family is divided into two groups: Mastadenoviradea, isolated from mammalian cells and Aviadenoviradea, isolated from bird cells.
  • the genus Aviadenovirus is itself divided into 5 species groups including FAV (“Fowl Adeno Virus”) poultry adenoviruses.
  • FAV Flural Adeno Virus
  • the CELO avian adenovirus (“Chickcn Embryo Lethal Orphan") represents serotype 1 (FAV-1) among the 1 1 distinct serotypes of FAV recognized.
  • the CELO adenovirus is a 43,804 bp long double-stranded DNA virus (CHIOCCA, S., et al.) ( Figure I). Its capsid is made up of elements of 3 types: hexons, pentons and free (proteins II, III, IV respectively according to their increasingly low molecular weight). Antigenic motifs (neutralizing epitopes) are carried mainly by hexons and fibers. The free is fixed by its NH 2 terminal end at the base of the penton, its COOH carboxyl end ending in a button zone, responsible for the attachment of the virion to a specific receptor. Between these two ends is the fiber shaft, made of a number of repeating patterns (from 20 to 26 amino acids depending on the adenovirus).
  • the particularly resistant capsid allows very good protection of viral DNA, which explains the persistence of this virus in the environment and its ubiquitous presence.
  • This capsid also has an essential role in the penetration of the virion inside the host cell by preventing lysc by the endosomes, as normally occurs for any infectious agent picked up by endocytosis by the cell.
  • the CELO adenovirus like the Aviadenoviruses, has two fibers whose role is not yet explained today, and is distinguished from mammalian adenoviruses (including human adenoviruses) which have a single fiber (except for human adenoviruses 40 and 41 which also have two fibers).
  • Each adenovirus consists of double stranded DNA, terminated by reverse repetitions of 50 to 150 bp (ITR: "Inverted Terminal Repeat").
  • ITR Inverted Terminal Repeat
  • the genome length varies from 30 to 44 kb (avian adenoviruses are generally longer than mammalian adenoviruses).
  • These inverted terminal repeats, containing the origins of virion DNA replication, are fundamental for virion replication. In any construction of recombinant adenovirus, it is imperative to keep at least one of these ends in order to ensure replication of the recombinant adenovirus.
  • TP terminal protein is associated
  • the adenovirus genes are distributed (more or less arbitrarily) into two groups:
  • adenovirus Whatever the adenovirus and its size, it is customary to partition its genome into 100 units (map unit: m. U.) And to position the genes according to these units.
  • E1 to E4 each with their own promoter, sometimes located on one strand, sometimes on the other. These genes are involved in the regulation of viral transcription, the transformation and replication of viral DNA (conversely, late genes essentially produce the virion's structural proteins).
  • E l . (1.3 to 1 1.2 mu): essential gene, because it is the initiator of the entire viral cycle. Its expression starts 20 to 30 minutes after the virion enters the cell, and its transcription depends on cellular factors specific to the host (host specificity of adenoviruses). This gene is broken down into two genes: E l A and E l 13, the first of which is essential for the establishment of viral infection.
  • EI ⁇ and E l 13 allow, by combined effects, cell multiplication and immortalization transformation of cells receiving them jointly by trans ection (if E l A allows immortalization, E1B avoids apoptosis and thus allows maintaining the immortalized phenotype).
  • E2 (3 1- 1 1 and 66.6-61.7 mu): its transcription is dependent on E 1 A (although the protein El A is not a DBP, "DNA binding Protein", protein which binds to the 'DNA).
  • This gene codes among others for a DNA polymerase of 140 kDa, a DBP of 58 kDa and TP ("Terminal Protein"), whose role has already been mentioned above for the efficiency of viral replication (precursor of 80 kDa ; 55 kDa mature protein).
  • E3 (76.6-86 m. U.): Gene not essential for viral multiplication in vitro. Its role in vivo would be to protect the virion from the host's immune defenses. It codes for several proteins, including a 19 kDa protein which blocks at the endoplasmic reticulum the exit of type I antigens from the MHC (Major Histocompatibility Complex), and also a 14.7 kDa protein which protects the infected cell. of the lyric action of TNF ("Tumor Necrosis Factor").
  • TNF Tumor Necrosis Factor
  • E4 (99-91.3 mu): gene which codes for proteins involved in the regulation of late genes, and in stopping the synthesis of cellular proteins, thus allowing the diversion of the possibilities of cell biosynthesis in favor of virus.
  • early genes indicates a predominance of certain genes at some point in the replication cycle of the virus.
  • a so-called early gene such as El A for example, can express itself throughout the viral cycle, or a gene known as late, like the promoter MLP ("Major Late Promoter"), can be expressed, although weakly, from the first hours following the infection.
  • Gjinciia.t iXs There are five of them: L1 to L5, coding for the various structural proteins (mainly capsid): L2 for the penton, L3 for the hexon, L5 for the fiber, etc.
  • RNAs start from the same promoter, the MLP (for Major Late Promoter), and all have the same 5 'end (TPL: "TriPartite Leader"), made of the first three exons: I, 2 and 3.
  • TPL TriPartite Leader
  • adenovirus fragments into plasmids, and by cotransfection of overlapping fragments representing the whole genome, by homologous recombination, to obtain recombinants reproducing the original virion.
  • two minimum constraints must be met in the constructions: i) a fragment must have a terminal repetition (ITR, necessary for the replication of the virus), and ii) the two fragments to be joined must have at least one unit (360 to 440 nucleotides) to allow homologous recombination.
  • Two circular plasmids each carrying two complementary fragments, having at least 400 to 500 nucleotides in common, which together represent the entire genome, can thus recombine to produce recombinant adenoviruses.
  • the deletion in the E3 region not essential for in vitro replication, can allow insertions up to 4 kb.
  • the deletion of the region E l may, with the previous ones, allow, a priori, insertions up to 7 kb.
  • Line 293 can be called “helpcr” line by analogy with what is happening for retroviruses, the principle remains the same, providing in trans genes that have been previously removed to make room for the exogenous genes that l 'we want to express in its viral construction.
  • the first case is more favorable allowing on the one hand the multiplication, therefore more numerous copies of the gene to be expressed.
  • the intervention of cis elements of replication promotes the transcription of late genes, thus, if the gene to be expressed is dependent on the MLP promoter, this also promotes the transcription of the latter.
  • the E3 promoter is chosen, which can also comprise the MLP promoter.
  • MLP + TLP (tripartite leader": formed of three exons present in 5 'of all late transcripts)
  • TLP allowing the recognition of adenoviral transcripts and their transfer from the nucleus to the cytoplasm, for their translation , transfer inhibited for all other cellular ⁇ RNs.
  • Viral RNAs are also preferentially translated, thanks to two
  • RNAs of the adenovirus transcribed by the RNA polymerase III of the host cell named: VAI and VAII (for "virus associated RNA”). These RNAs promote the translation of other viral RNAs by preventing the phosphorylation of the elf2 ⁇ elongation factor, phosphorylation which inhibits the activity of the latter.
  • helpcr a complementation cell line
  • E 1 A and EIB human kidney embryonic line
  • the recombinant adenoviruses obtained such as the recombinant retroviruses obtained from transcomplementing lines (Isolde type in avian, see Nigon, Verdier, Associated CNRS-INRA, Lyon-Villeurbanne) are incapable of reproducing by themselves, but are capable infect the target cells and synthesize the heterologous protein there, encoded by the gene introduced in place of El. If the introduced gene is placed in the E3 region, the transcomplementing line is not necessary, the recombinant vector retaining all power of autonomous replication.
  • transcomplementing lines Isolde type in avian, see Nigon, Verdier, Associated CNRS-INRA, Lyon-Villeurbanne
  • non-essential part of the genome of the avian adelovirus CELO into which a sequence coding for a heterologous polypeptide can be inserted is meant in particular the regions of the genome in which this insertion does not prevent the replication of said recombinant adenovirus.
  • the regions of the genome which after deletion do not prevent the replication of said recombinant adenovirus are also non-essential parts of the genome.
  • these nonessential parts of the genome we prefer the areas called non-coding intergene areas, which are naturally silent from a transcriptional point of view and where the insertion of a heterologous DNA sequence does not disturb the transcription of either of the two strands of genomic DNA. The deletion of these non-coding intergenic zones does not affect the replication of said recombinant adenovirus either.
  • essential parts of the genome of the avian adelovirus CELO is meant the parts of said genome consisting of at least one strictly essential part of said genome and which may also comprise one or more non-essential parts of said genome.
  • strictly essential part of said genome is meant a part in which the insertion of a heterologous DNA sequence disrupts the transcription of one or other of the two strands of genomic DNA, no longer allowing the autonomous replication of said genome.
  • recombinant adenovirus By strictly essential part of said genome is also meant the parts which are essential for the autonomous replication of said adenovirus, the deletion of at least one of said strictly essential parts preventing the autonomous replication of said recombinant adenovirus.
  • heterologous polypeptide means any polypeptide or any protein, polypeptide and protein having the same meaning in the present description, not expressed naturally by the avian adenovirus CELO or any polypeptide whose coding nucleic sequence is not included in the genome of said adenovirus.
  • heterologous polypeptides of interest whose nucleic sequence can be incorporated in the nonessential parts of the genome of the avian adenovirus CELO, there may be mentioned: a) Antigenic polypeptides
  • Antigenic polypeptides are polypeptides corresponding to antigenic determinants of organisms against which it is desirable to generate immunity by cell mediation or by the production of antibodies.
  • the antigenic determinants are preferably the antigenic determinants of infectious agent, viral or other types, which are responsible for infectious diseases in animals and in particular in avian species such as, for example, Marek's disease, infectious bronchitis, larynchotracheitis, gumboro, Ncwcastlc disease, mycoplasma infections, l anemia of chicken, avian encephalomyelitis, avian influenza or bursa disease of Fabricus of viral origin Gumboro. It is also possible to use the recombinant avian adelovirus CELO as a vaccine vector for mammals by replacing the original free ones (MICHAEL, SI, 1995, Gene Therapy, 660-668).
  • infectious agents particular preference is given to the infectious agents responsible for Marek's disease, infectious bronchitis, larynchotracheitis, gumboro or Newcastle disease.
  • the present invention also includes the methods according to the invention in which the DNA sequence coding for a heterologous polypeptide of interest results from the combination of several DNA sequences each coding for a heterologous polypeptide of interest.
  • the present invention also includes the methods according to the invention into which several DNA sequences are each coded for a heterologous polypeptide of interest. b) The polypeptides involved in metabolism
  • the invention also aims to produce in vivo, in particular in poultry, polypeptide factors involved in the metabolism of the animal infected with the recombinant CELO avian adenovirus.
  • polypeptide factors involved in the metabolism of the animal infected with the recombinant CELO avian adenovirus include, for example, of the polypeptides involved in the metabolism of fats such as ⁇ 9 desaturase, acetyl coA carboxylase, lipase, etc., growth hormones or their inducing factor (such as GRF). or immunopotentiators such as cytokines, interleukins, etc.
  • the polypeptide of interest can be an intracellular, membrane polypeptide present on the surface of the host cell or secreted out of the host cell. Its nucleic acid sequence can therefore also comprise appropriate additional elements such as, for example, a sequence coding for a secretion signal, these signals being known to those skilled in the art.
  • the invention further relates to the use of the recombinant CELO avian adenovirus as a vector for expression of heterologous protein in the context of treatment by gene therapy applied to humans, the recombinant CELO avian adenovirus being in fact very unlikely to recombine with the human adenoviruses usually used.
  • the polypeptides of interest which can be expressed in the context of gene therapy treatment applied to humans, very particularly preferred are those capable of inhibiting or delaying the establishment and / or the development of a genetic or acquired disease such as for example cystic fibrosis, hemophilia A or B, Duchenne or Becker's myopathy, cancer, AIDS or infectious diseases caused by a pathogenic organism.
  • the following polypeptides of interest are particularly preferred:
  • cytokine and in particular an interleukinc, an interferon, a tissue necrosis factor and a growth factor and in particular hematopoietic (G-CSF, GM-CSF),
  • factor VIII a factor or cofactor involved in coagulation and in particular factor VIII, von Willebrand factor, antithrombin III, protein C, thrombin and hirudin,
  • an enzyme inhibitor such as viral protease inhibitors
  • thimidine kinase of the HSV virus (herpes virus) type 1 an expression product of a suicide gene such as thimidine kinase of the HSV virus (herpes virus) type 1,
  • a polypeptide whose absence, modification or deregulation of expression is responsible for a genetic disease, such as the CFTR protein, dystrophin or minidystrophin, insulin, FADA (adenosine diaminose), glucocerebrosidase and phenylhydroxylase, a polypeptide capable of inhibiting the initiation or progression of cancers, such as the expression products of tumor suppressor genes, for example the P53 genes,
  • - a polypeptide capable of stimulating an immune response or an antibody - a polypeptide capable of inhibiting a viral infection or its development, for example the antigenic epitopes of the virus in question or altered variants of viral proteins likely to enter into competition with native viral proteins.
  • a polypeptide of interest in use in the present invention can also be a selection marker making it possible to select or identify the host cells transfected with a vector according to the invention.
  • Mention may be made, for example, of the polypeptide encoded by the n ⁇ o gene (neomycin) conferring resistance to the antibiotic G418, by the dhfr gene (dihydrofolate reductase), by the CAT gene (Chloramphcnicol Trans ferase) or also by the gpt gene (xanthinc phosphoribosyl).
  • polypeptide of interest is also meant the recombinant polypeptides of industrial or therapeutic interest which may be prepared either // vitro by culturing cells, in particular avian, transformed with the recombinant adenovirus CELO, or either / '// vivo the animal.
  • the nucleic sequence can code for a polypeptide of interest corresponding to all or part of a native protein as found in nature. It can also be a chimeric protein, for example originating from the fusion of polypeptides of various origins or a mutant exhibiting improved and / or modified biological properties. Such a mutant can be obtained by conventional biological techniques by substitution, deletion and / or addition of one or more amino acid residues.
  • Part of the polypeptide is understood to mean a biologically active fragment of the polypeptide capable of fully or partially exercising the biological activity of the polypeptide from which it is derived.
  • the invention also relates to a method according to the invention, characterized in that said DNA sequence further comprises the elements capable of ensuring the expression of said heterologous polypeptide in a cell infected with said recombinant adenovirus.
  • the DNA sequence encoding a polypeptide of interest can be associated with a promoter or a leader sequence in order to express the DNA sequence with the best possible efficiency. Any promoter which makes it possible to express the DNA sequence efficiently can be used.
  • promoters or leader sequences there may be mentioned those of human adenoviruses, SV40 virus, cytomegalo or avian adenoviruses, particularly preferred is the MLP promoter of avian adenovirus CELO, the TPL leader sequence (here bipartite: L 1 + L3).
  • the invention also relates to methods according to the invention, characterized in that the non-essential part corresponds to a non-coding intergenic zone of the avian adelovirus CELO, preferably said non-essential part is chosen from the following sites, identified by coordinates numerical values (bp) relating to the published sequence of 43,804 bp (CHIOCCA, S.
  • the invention also includes methods according to the invention characterized in that they comprise a step of deletion of at least one non-essential part of the genome of the avian adenovirus CELO, preferably said non-essential part is chosen from among the parts following, identified in numerical coordinates (bp) relating to the sequence as defined in Figure I: a) part between 1 970 and 2 850, b) part between 1 970 and 3 000, c) part between 3 130 and 3,520, d) part between 33,210 and 33,450.
  • bp numerical coordinates
  • the invention also includes methods according to the invention, characterized in that they comprise a step of deletion of at least one essential part of the genome of the avian adenovirus CELO, preferably said essential part is chosen from the following parts, identified in numerical coordinates (pb) relative to the sequence as defined in Figure 1: a) part between 300 and 5 300, b) part between 10 170 and 1 1280, c) part between 15 100 and 17 560, d) part between 15 100 and 21 800, e) part between 16 050 and 17 540, f) part between 16 050 and 21 800, g) part between 16 050 and 23 170, h) part included between 17 540 and 21 800, i) part between 21 800 and 23 170, j) part between 23 180 and 27 960, k) part between 23 670 and 27 050, 1) part between 24 800 and 27 060 , m) part between 27 100 and 31 790, n) part between 28 100 and 31 800, o) part between 35,620
  • the invention also relates to methods according to the invention, characterized in that the deletion step results in the production of a recombinant CELO avian adenovirus comprising at least 2 nucleic acid sequences coding for an ITR and a sequence d 'nucleic acid coding for an packaging signal M'.
  • Such vectors are especially preferred as a vector for heterologous gene transfer into mammalian cells in the context of treatment by gene therapy.
  • the principle of obtaining such vectors is known to those skilled in the art (PARKS, R.J. et al., 1996, PNAS, 93, 13565-13570, WANG, P. et al., 1995, Somalia
  • the principle is based on Crc-rccombinase which recognizes the LoxP sequence and makes it possible to excise any gene between 2 LoxP sites.
  • Recombinant defective adenovirus vectors are thus created, which can be reduced to their simplest expression (2 ITR (inverted terminal repeat) and an encapsidation signal ⁇ ), which in the case of avian adelovirus CELO, leaves room for approximately 43 kb of exogenous DNA.
  • LMH line (Kawaguchi T., Nomura K., Hirayama Y., Kitagawa T. (1987): Establishment and characterization of a chicken hepatocellular carcinoma cell Une, LMH. Cancer Research, 47, pp. 4460-4464) is obtained with Cre-recombinase by conventional recombinant retrovirus, the helper virus having on both sides of the packaging site ⁇ LoxP sequences.
  • the recombinant virion is then deleted from the chosen number of non-essential and essential parts of the genome with the exception of the following elements: the two terminal ITRs and the packaging sequence (the first allowing replication of the recombinant avian adenovirus and the second sequence allowing the packaging of said recombinant adenovirus).
  • the presence of two LoxP sites on either side of the packaging sequence in the helper virus prevents it from being packaged in the transcompliant line LMI I / Crc-rccoinbinase.
  • the helper virus is, apart from the LoxP sites, identical to the wild-type adelovirus CELO.
  • transcomplementing cell lines necessary for the replication of defective CELO avian adenoviruses obtained by the preparation methods according to the invention, make it possible to construct safer recombinant helper viruses.
  • the invention also relates to methods according to the invention, characterized in that the DNA sequence codes for a polypeptide of interest, preferably an antigenic polypeptide corresponding to an antigenic determinant of an infectious agent responsible for infectious diseases in animals, especially in avian species.
  • Marek's disease infectious bronchitis
  • larynchotracheitis larynchotracheitis
  • gumboro Newcastle disease
  • the invention also includes methods according to the invention, characterized in that the polypeptide of interest is a polypeptide intervening in animal, preferably avian, or human metabolism. Also forming part of the invention are the vectors, characterized in that they comprise a recombinant CELO avian adenovirus obtained by a method according to the invention.
  • the invention also relates to vaccines characterized in that they contain a vector according to the invention, in particular vaccines for the protection of avian species against infectious diseases.
  • a vaccine according to the invention can be manufactured in a conventional manner.
  • a therapeutically effective amount of such a vector is associated with an acceptable support, diluent or adjuvant. It can be administered by any route of administration and this in a single or repeated dose after a certain period of interval. Nebulization, aerosol spraying or administration via solid or liquid food are the preferred modes of administration, in particular for avian species.
  • the amount to be administered will be chosen according to certain criteria, in particular. the route of administration, the animal, the type of disease to be treated and its state of evolution, the duration of the treatment, etc.
  • a vaccine according to the invention comprises between 10 1 1 and 10 1 adenoviral particles / ml, preferably between 10 9 and 10 12 pfu / ml (plate forming unit).
  • the invention also relates to cells transformed with a vector according to the invention.
  • cells transformed with a vector according to the invention are preferred.
  • cells characterized in that they are eukaryotic cells allowing the replication of a defective recombinant avian adelovirus CELO are preferred.
  • transcomplementing cells The eukaryotic cells allowing the replication of a defective recombinant avian adelovirus CELO, that is to say normally incapable of replicating, are called transcomplementing cells. These cells make it possible to obtain sufficiently high titers of defective recombinant avian CELO adenovirus having integrated the DNA coding for the heterologous polypeptide of interest.
  • the methods for obtaining such transcomplementing cells are known to those skilled in the art and are based in particular on the knowledge of the essential and nonessential parts of the genome of the virus which one wants to replicate.
  • the defective recombinant adenovirus is a vector capable of triggering an initial immune reaction when it enters the target cell, without the possibility of reaching other neighboring cells.
  • the vector is inol ⁇ ensive, because more or less deleted, and incapable of dissemination in animals and between animals.
  • GMO genetically modified organism
  • it is possible to free up more and more space, even all of the genes of the virus to provide a maximum of exogenous information ("gutless viais", virus "disoyoyed” and Cre-recombinase). This is an advantage that can more than offset the disadvantages of non-autonomous replication.
  • the effectiveness of the first vaccination is essential, but it is not necessarily necessary to increase the number of injections.
  • CELO Defective recombinant CELO, transcomplementing cell lines of avian origin, LMH or QT6 type are preferred (ATCC CRL 1708-fibrosarcoma-Moscovici et al. 1977).
  • transcomplementing cell lines of avian origin such as the LMH or QT6 line or those whose immortalization is made at the base by the T antigen of SV40 (Institut Mérieux).
  • transcomplementing cell lines of avian origin preferably require the use of avian retroviruses making it possible to obtain avian CELO-transcomplementing lines.
  • Avian retroviruses can carry 3 to 7 kb of exogenous DNA. These retroviruses easily infect LMH lines (possibly carrying the avian retrovirus receptor to facilitate their infectability) and integrate into the genome of the host cell. The transcomplementing cells are obtained quickly and then selected on their efficiency in producing the genes of the avian adenovirus CELO.
  • the invention further comprises methods of preparing / '// vivo a recombinant polypeptide of interest, characterized in that they implement the infection of an animal with a vector according to the invention, which vector said inserted DNA sequence codes for said polypeptide of interest.
  • the invention finally relates to methods for preparing a recombinant polypeptide of interest, characterized in that they implement the culture of cells according to the invention.
  • Transformation techniques / '; / vivo or /' // vitro cells from recombinant adenovirus vectors to prepare the recombinant polypeptides are well known to those skilled in the art and will not be described.
  • Figure 1 complete nucleotide sequence of the CELO viral genome.
  • the 5 ′ to 3 ′ strand of the genome is also represented by SEQ ID No. 1.
  • Figure 2 construction of the plasmid pPOLY II / CELO ends.
  • the plasmid ppoly II ext celo of 3964 bp is obtained by carrying out a triple ligation between ppoly II, the Bamhl-Spel fragment, and the Spel-Hindlll fragment; These two fragments ⁇ being previously amplified by PCR and purified.
  • FIG. 3 construction of the plasmid ppoly 1I / CELO recombining with the entire genome of the adenovirus celo, by homologous recombination between the total DNA of the CELO virus and the plasmid ppoly II / CELO ends.
  • Figure 4 ppoly II / CELO plasmid recombining with the entire adenovirus celo genome with its 4 constituent fragments A, B, C and D.
  • Figure 5 Potential sites of insertion or deletion of the viral genome of the avian adenovirus CELO.
  • 1 cm corresponds approximately to 2kb.
  • the arrows on the top diagram represent the potential insertion sites and the arrows on the bottom diagram frame the potential areas of deletion.
  • FIG. 6A represents the homologous recombination between identical regions of the plasmid ZZ and of the recombinant adenovirus ppoly / celo rec 45.8 Kb.
  • FIG. 6B represents the plasmid pPolyllCelo Rec with a gene of interest introduced by homologous recombination as indicated in FIG. 6A.
  • Figure 7 the four plasmids A, B, C and D representing the entire CELO genome and allowing the construction of recombinants (deleted and / or by insertion) by successive subcloning.
  • Figure 8 diagram of the four plasmids A, B, C and D as well as of the recombinant ppoly 1I / CELO plasmid carrying the entire viral CELO genome.
  • Figure 8A shows the presence of fragment A of celo in pBS / KS + Amp Resistant.
  • Figure 8B shows the presence of fragment B of celo in pBS / KS + Amp Resistant.
  • Figure 8C shows the presence of fragment C of celo in pBS / KS + Amp Resistant.
  • Figure 8D shows the presence of fragment D of celo in pBS / KS + ligand.
  • FIG. 8E shows the plasmid p Polyll Amp R recombining with the entire genome of celo.
  • FIG. 9A corresponds to the recombinant L2 retrovirus
  • FIG. 9B corresponds to the recombinant L3 retrovirus
  • FIG. 9C corresponds to the recombinant L4 retrovirus
  • FIG. 9D corresponds to the recombinant L5 retrovirus.
  • the rectangles with black and white tiles and those with a tile pattern represent the Neo gene and the hygromycin gene respectively
  • the striated rectangles and those with up arrows define the promoter CMV and SV40 respectively.
  • CELO recombinant vaccines I) The X and Y genes of the celo adenovirus are integrated on each side of an IRE (Entry
  • Neo gene Internal Ribosomal
  • CMV promoter Internal Ribosomal
  • LMH line Cells of the LMH line are infected with retroviruses carrying the X and Y genes produced by the cells of step 2.
  • a LMH line transcomplementing for the X and Y genes is selected.
  • the LMH line isolated in 3) is transfected with the recombinant Celo DNA carrying the genes of interest 1 and 2.
  • viruses produced carrying the genes of interest are purified.
  • Figure 1 1 creation of CELO “gutless” recombinant through CRE-recombinase.
  • An Isolde line is transfected with a retrovirus carrying the CRE recombinase gene.
  • the rectangle with diagonal lines represents an inducible promoter.
  • the grid rectangle is an NLS (Nuclear Location Signal), the rectangle with diamonds is an IRE and the Neo gene is represented as in Figure 9.
  • An LMH line is infected with the retrovirus expressing Cre recombinase produced by a line of step 1).
  • An LMH line expressing the CRE recombinase protein is selected.
  • the selected LMH line is co-transfected with a Celo Helper DNA comprising two LoxP sites flanking the viral packaging signal and a recombinant celo DNA in which genes of interest of type X, Y, Z are inserted in a region available from 43 kb. 4)
  • the LMH line possessing CRE recombinase produces non-replicative vias and carriers of genes of interest.
  • EOPS embryos 19-day chicken kidney embryo cells (EOPS embryos) are cultured in 75 cm 2 flasks at the rate of 106 cells / ml in 20 ml of BHK21 / 5% FCS medium (fetal calf serum) at 37 ° C and 2% CO 2 .
  • FCS medium fetal calf serum
  • RNAnow is used at a rate of 1 ml / 10 cm 2 (or 1 to 5,106 cells). The homogenate is coupled to 0.2 volumes of chloroform. The RNAs are precipitated in the presence of isopropanol (V / V) then washed with 70% ethanol and taken up in a Tris-EDTA 10: 0.1 (RNAse free). Each extraction is followed by an analysis on agarose gel of the quality of the RNAs.
  • the first library is constructed in the plasmid pSPORT1 from the kit
  • the cDNAs with oligo (dT) primers associated with primers-adapters with four restriction sites Spel.Xbal, NruI, Notl, in the presence of SuperScript II RT were synthesized.
  • the second strand is synthesized using the E. coli DNApol + RNAse H + DNA ligase cocktail at 16 ° C.
  • a Sali adapter is attached to the ends after treatment with T4 DNApol.
  • the cDNAs are then digested with NotI and subcloned into pSPORTl by SalI / NotI.
  • the second library is constructed in the plasmid pBluescript BS / KS +
  • the first strand is synthesized in the presence of oligo (dT) 1 primers and hcxanucleotides.
  • the second strand is made according to the previous protocol.
  • An EcoRi / NotI adapter is attached to the ends of the cDNAs which are then subcloned into pBS / KS + without orientation.
  • the plasmids are then amplified in competent XL1 Blue bacteria.
  • the DIG high Prime DNA labeling and detection starter kit 11 from Boehringer was used to detect positive clones in XL 1 blue.
  • the probe was produced by labeling total CELO DNA digested with Hind III or SalI with digoxige-nine-dUTP.
  • the clones are transferred and fixed on special nylon membranes for colonies (Boehringer).
  • the hybridization and detection steps are carried out under the conditions described by the manufacturer. Hybridization is done in a 50% formamide buffer at a temperature of 42 ° C overnight. The revelation is made by chemiluminiscence. Clones found positive on autoradiographs are screened a second time. Positive disorders are amplified and then sequenced.
  • RNA-PCR Kinetics by RT-PCR (transcriptasc reverse and PCR)
  • An RNA-PCR is carried out with a treatment prior to DNase I.
  • the cDNAs are synthesized in a reaction of 20 ⁇ l (Huang, 1996) containing for 1 ⁇ g RNA: 1 x PCR buffer II (Boehringer), 5 mM MgC12, 1 mM dNTP mix, 1U DNAsel 20U RNase inhibitor, 2.5 ⁇ M oligo (dt) 15, 1 ⁇ M hexanucleotides.
  • the DNAsel reaction is placed for 2 hours at 37 ° C and then 5 minutes at 75 ° C to destroy the enzyme.
  • a microliter of 50U / ⁇ l murine leukemia virus (MuLV) reverse transcriptase is added followed by a cycle of 42 ° C for 30 minutes of RT, 5 minutes at 90 ° C and a return to 4 ° C.
  • reverse transcriptase is replaced by 2 ⁇ l of RNase free H2O.
  • Two microliters of this stock diluted to 1: 30 are added to 23 ⁇ l of PCR reaction, for a final volume of 25 ⁇ l containing: lx PCR bu proud 11, 2 mM MgCI2, 25 pmol of each primer, I mM dNTP mix, and 0.5U Taq polymerase (Boehringer).
  • the amplification conditions vary depending on the primers chosen. The number of cycles varies between 25 and 34.
  • the Clontech Marathon cDNA amplification kit was used. First, single-stranded cDNAs from 1 ⁇ g of RNA extracted from infected cells were produced. O! Igo (dT) primers ligated to an EcoRi-NotI adapter and MuLV reverse transcriptase were used. After the synthesis of the second strand, the cDNAs are made blunt-ended by means of T4DBA polymerase. A specific Notl-Sfrl-Xmal adapter is attached to the ends. Amplifications were then carried out by PCR (polymerase chain reaction) with a primer sense A I specific for this adapter and an antisense primer chosen 5 ′ of our ORFs (generally in the ATG region). The amplification products are then sequenced and analyzed on MacDNasis.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Example 1 The genomic DNA of the avian adenovirus CELO (serotype 1), double-stranded DNA virus, is completely sequenced (cf. FIG. 1). The DNA is obtained after culture on embryonic S.PF eggs (free of specific pathogen) and harvested a few days after infection with allantoic fluid. It is purified by conventional virus purification protocols. Approximately 300 ⁇ g of viral DNA (approximately 150 infected embryonic eggs) are isolated for one liter of infected allantoic fluid. The DNA of the avian adelovirus CELO (serotype 1) thus comprises 43,804 bp and codes for at least forty genes.
  • avian adenovirus CELO embryonic chicken kidney cells SPF
  • the messenger RNAs produced by these infected cells are extracted at various post-infection times and used to build cDNA libraries. Screening is then carried out using a kit digoxygenin hybridization. Under these conditions, a transcriptional model is established for the avian adenovirus CELO.
  • the various promoter zones have been localized, mainly for the ORF1, ORF2 genes (promoter located around 350-510), for late genes with the major late promoter (major late promoter: MLP, located around 7 3 10 - 7,520) and its two "leaders" L1 and L3 (located respectively at 7,533 - 7,545 (22 bp), and 1,1285 - 1,113 (129 bp), for the ORF22 gene (promoter around 43,400 - 43,700), for OR l 8 and 1 genes (promoter around 36 460 - 36 770)
  • the encapsidation capacity is 105%, for the avian adenovirus CELO of 43,804 kb, it is possible to insert a maximum of 2.4 kb of exogenous DNA, either a gene of vaccinating or therapeutic interest, or an enzyme involved in a metabolic pathway and approximately 400 bp of a specific promoter (placed in the direction or antisense of the natural transcription in this zone).
  • the exogenous DNA is inserted at the chosen site, taking into account the unique restriction sites around the insertion zone (CHIOCCA, S. et al., 1996); b) or by conventional construction: from plasmids carrying the insertion region, then reintegration in successive stages in increasingly large plasmids.
  • the last step consists in replacing the wild fragment in the plasmid carrying the entire genome of the avian adenovirus CELO with the new one.
  • This route is also possible from 4 plasmids which represent the entire genome of the avian adelovirus CELO divided into 4 fragments (cf. FIGS.
  • fragment A (Pacl / Pmel): 7 430 bp fragment B (Pmel / Notl): 9,956 bp fragment C (Notl / Fsel): 18,298 bp fragment D (Fsel / Pacl): 8,116 bp, allowing each time, whatever the site of insertion, to artificially reconstitute the adenovirus recombinant wanted.
  • the M zone to be modified is surrounded by two unique restriction sites in the fragment: X and Y.
  • the XY subfragment is subcloned into a plasmid and rectified by mutation, deletion or insertion.
  • deletions are based essentially on the results concerning the study of the transcription of the genome of the avian adenovirus CELO obtained previously.
  • the cellular model chosen for said study (embryonic chicken kidney cells) makes it possible to obtain the complete lyrical replicative cycle of the adenovirus, demonstrating that the non-shredded genes are not essential for the "in vitro" survival of adenovirus and that it is possible to delete them.
  • Deleted replicative vectors are then obtained capable of carrying one or more genes of interest.
  • this zone is more critical, because it includes the leader of IORF22 (from 33,070 to 33,204: 135 bp) to be respected so that its transcription is accomplished normally (important gene, because it belongs to the early genes appearing as early as 4 hours post-infection).
  • IORF20 the leader of IORF22
  • PORF5 the termination zone of IORF20
  • this last gene has never been highlighted with the various technical means used until now. Taking these various elements into account, we can delete the area between 33,210 and 33,450 (i.e. 240 bp, which, along with the increase in size, allows the addition of approximately 2.5 kb of exogenous DNA) .
  • FIG. 10 shows as an example the general diagram of the process for the preparation of recombinant defective CELO vaccine vectors from Isolde-type retroviral transcomplementing cells, the replication of the vaccine vector being provided by the LMH cell line, previously transformed by the retrovirus, after transfection with the recombinant vaccine vector.
  • Deletion of 1ORF7 it is then necessary to supplement with the products of the ORF 18 and ORF 19 genes located on the opposite strand (strand down) highlighted in cDNA and RT-PCR bank (genes very early to early from 2 hours and 4 hours after injection and whose role is therefore essential for the viral cycle. Deletion of 1ORF7 can be done from 35,620 to 36,440 (or 820 bp released; with the size increase of 5%, possibility of insertion of 'around 3 kb).
  • transcomplementing line a pTP transcomplementing line: pTP binds to the ends of the DNA of the avian adenovirus genome
  • CELO (or any other recombinant carrying ITR at its ends) and by its presence promotes replication of the viral matrix, by promoting the binding of DNA polymerase and DBP ("DNA Binding Protein", vital for elongation with pol DNA of the viral matrix).
  • This line can therefore in this way promote the production of the recombinant CELO avian adenovirus constructs to provide very high titers.
  • the retrovirus carrying pTP the latter can be placed under the control of an inducible promoter (heat-shock promoter, hormone-dependent or dependent tetracycline; in the latter case, the promoter will function in the presence of tetracycline in the medium) .
  • pTP uses the leader of 1ORF12, and the ⁇ leader of DBP, we can thus make an appropriate construction to have, with these elements, maximum production efficiency of pTP.
  • the genomic DNA of the avian adenovirus CELO is released from 10,170 to 1,128, or 1.1 kb, in order not to touch the leader 3 used by the late genes.
  • the recombinant CELO avian adenovirus can use the entire coding part of pTP (from 10,170 to 12,050 or 1,880 bp), provided that leader 3 is reinserted into the construction of the recombinant so that late genes can express themselves without problem.
  • DBP transcomplementing line DBP transcomplementing line:
  • DBP extending (on the “down” strand) from: 21,800 to 23,170, or a place of 1.37 kb on the recombinant CELO avian adenovirus and this without affecting any other gene
  • L2 or L3, or L2 + L3, even L2 + L3 + D.B.P.
  • entity L2 (penton at pX): 16,050 to 17,540, release of approximately 1.5 kb.
  • L2 + L3 entities (penton to E.P.): 16,050 to 21,800, release of approximately 5 kb.
  • L2 + L3 + DBP entities 16,050 to 23,170, release of around 7 kb.
  • the L2 entity (15,100 to 17,560) is 2,460 bp
  • the L3 entity (17,540 to 21,800) is 4,260 bp.
  • L4 pVIII, 100 K, between ORF 12 and 22: 27 100 and 31 790: 4 690 bp
  • L5 fibers 1 and 2
  • L4 + L5 according to schemes equivalent to those used previously: 100 K start: 23,180 to 27,960 (end pVIII): 4,780 bp.
  • E1A and E1B Like human adenoviruses with the immortalizing genes E1A and E1B, there may be equivalents of these genes in the avian adelovirus CELO. There would therefore be an immortalizing gene equivalent to E1A, promoting cell multiplication (to be sought among very early genes) and a gene preventing apoptosis such as does E1B. According to a recent publication (CHIOCCA, S. et al, 1997, J. Virol., 71, 3 168-3 177) it is known that it is known that it is IORF8 (gene with anti-apoptosis effect, of Bcl2 type in its mode of action).
  • IORF8 gene with anti-apoptosis effect, of Bcl2 type in its mode of action.
  • ORF4 ORF5
  • ORF 16 ORF 18
  • ORF20 ORF21
  • ORF21 ORF20 and ORF21
  • ORF4 and ORF 18 seem to be the most relevant for this.
  • ORF8 + ORF4 (most relevant combination), ORF8 + ORF4, ORF8 + ORF18, ORF8 + ORF 19, ORF8 + ORF5, ORF8 + ORF 16, ORF8 + ORF20 and ORF8 + ORF21 are tested on embryonic liver cells. or chicken kidney. Then we retain the combination allowing to obtain immortalization which offers the possibility of having a system equivalent to the line 293 of GRAHAM (GRAHAM, FL et al., 1977, J. Gen. Virol., 36, 59- 72, SHAAK, Omony1995, J. Virol., 69, 4079-4085).
  • FIG. 11 shows as an example the general diagram of the process for the preparation of recombinant defective CELO vaccine vectors according to the Cre-recombinase system, from Isolde type retroviral transcomplementing cells. Replication or production of the vaccine vector is ensured by the LMH cell line, previously transformed by a recombinant Cre-recombinase retrovirus, after co-transfection with the recombinant vaccine vector and an assistant adenovirus.

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Abstract

L'invention concerne des méthodes de préparation d'adénovirus aviaires CELO recombinants et leurs utilisations à titre de vecteur d'expression de protéines hétérologues pour la préparation de vaccins, notamment pour la protection d'espèces aviaires contre les maladies infectieuses communes, ou à titre de vecteur d'expression de protéines hétérologues impliquées dans le métabolisme.

Description

ADENOVIRUS AVIAIRE CELO RECOMBINANT ET SON UTILISATION COMME VECTEUR VACCINANT
L'invention concerne des méthodes de préparation d'adénovirus aviaires CliLO recombinants et leurs utilisations à titre de vecteur d'expression de protéines hétérologues pour la préparation de vaccins, notamment pour la protection d'espèces aviaires contre des maladies infectieuses communes, ou a titre de vecteur d'expression de protéines hétérologues impliquées dans le métabolisme. La présentation d'un antigène efficace et durable, susceptible de mobiliser les mémoires immunologiques à court terme et long terme, reste la préoccupation majeure de toute prophylaxie à base de vaccins. Pendant longtemps, ces derniers ont été constitués par la présentation, dans le cas des virus à effets pathogènes, de la totalité du virion, soit mort (vaccin inactivé), soit plus ou moins défectif (vaccin vivant atténué). Au cours des dernières années, plusieurs stratégies sont apparues pour pallier des déficiences de ces vaccins classiques, telles que la pathogénicité plus ou moins persistante, l'impossibilité d'obtenir le virion par culture in vitro pour obtenir suffisamment d'antigènes vaccinants. Parmi ces stratégies, deux sont, à l'heure actuelle, prédominantes : l'une est la présentation de peptides de synthèse à propriétés antigeniques, issus de la connaissance des protéines immunogenes des virus ou des bactéries étudiés ; l'autre est l'utilisation de vecteurs viraux susceptibles de porter des gènes codant pour des protéines immunogenes issues de virus totalement différents ou pour d'autres agents infectieux. Le vecteur viral est utilisé pour sa capacité à pénétrer des cellules cibles afin d'y faire pénétrer l'antigène étranger et, par ce biais, déclencher 5 les réactions immunitaires de type humorale ou à médiation cellulaire. De plus, le vecteur viral « vaccinant » peut, dans certaines options, se répliquer et augmenter ainsi la production in situ des déterminants antigeniques et entraîner une stimulation du système immunitaire à plus long terme.
0 Parmi les particules virales recombinantes pouvant être utilisées comme vecteur d'expression de protéines hétérologues et notamment comme vecteur vaccinant, on trouve les herpcsvirus, les rétrovirus et les adénovirus. Les herpesviais sont des virus à ADN double brin à capside et enveloppe, et sont, par exemple, responsables de deux maladies importantes : la maladie d'Aujesky chez le porc et la maladie de Marck chez le poulet. Ces virus possèdent des génomes complexes ( 150 kb en moyenne) et l'obtention de titres élevés nécessaires pour une application industrielle n'est pas toujours facile. Les rétrovirus sont des virus à ΛRN à capside et enveloppe qui, comme vecteurs recombinants, sont essentiellement étudiés et utilisés pour le transfert de gènes chez le mammifère, thérapie génique humaine, ou dans les espèces aviaires. Leur utilisation comme vecteur recombinant vaccinant est limitée par leur faible capacité de matériel exogène transmissible (environ 3 kb d'ADN), par la difficulté d'obtenir des titres élevés, par leur instabilité (recombinaison des reconstructions). D'autre part, le rétrovirus s'intégrant dans le génome du rétrovirus, il exige que la cellule cible soit une cellule en division et impose une grande sûreté sans son utilisation compte tenu du passage possible de la construction dans les lignées gcrminalcs.
Les adénovi s sont des virus à ADN double brin de 30 à 44 kb de long. Ce sont des virus à capside, non enveloppés. En pratique, on peut insérer, sans délétion aucune, 1,5 kb en plus de matériel exogène dans un génome originel d'adénovirus sans perturber la réplication. L'adénovirus possède pour lui les avantages suivants : c'est, en général, un agent peu pathogène, responsable d'atteintes bénignes des voies aériennes supérieures. Il peut infecter une large gamme de cellules, qu'elles soient ou non en division. 11 est ainsi possible de modifier des cellules qui se divisent peu, comme les cellules pulmonaires ou les cellules musculaires. De plus, ce virus se multiplie très facilement, ce qui permet la production de virus recombinants à des titres très élevés (1011 à 1013 virus par millilitre), bien supérieurs à ceux des rétrovirus recombinants et donc d'obtenir un meilleur taux de transformation génétique des cellules cibles. Un avantage supplémentaire du vecteur adénoviral est que son génome ne s'intègre pas dans le génome cellulaire, minimisant les risques d'activation d'oncogènes, il reste à l'état d'épisomes. Enfin, vue la résistance de la capside aux agents extérieurs, la nébulisation ou la pulvérisation par voie d'aérosols des virions recombinants, associée aux forts titres, devrait permettre des vaccinations de masse, particulièrement intéressantes pour les espèces aviaires.
Il existe en effet aujourd'hui un besoin réel de disposer de vecteurs vaccinants peu coûteux, efficaces et faciles à administrer, permettant de protéger en particulier les élevages industriels de volaille contre les maladies infectieuses, notamment d'origine virale, qui sont responsables chaque année de pertes estimées à plusieurs centaines de millions de dollars. Des vecteurs vaccinants viraux recombinants ont déjà été décrits comme les poxvirus (AU- A-34353/93) ou les adénovirus aviaires recombinants de sérotypes FAV -4, -9 ou -10 (WO 94 24268), le sérotype I -FAV (sérotype CELO) n'ayant pas été retenu dans ce document car présenté à cette date comme vecteur de nature potentiellement oncogénique (SAR A, P. S., et al., 1965, Science, 149, 1 108) malgré les résultats publiés postérieurement montrant l'innocuité de l'infection de poulets par cet adénovirus (COWEN, B.R.W., et al., 1978, Avian Diseases, 22, 459- 470).
La séquence nucléotidique complète ainsi que l'organisation générale du génome de l'adénoviais aviaire CELO (sérotype 1 -FAV) ont été publiés récemment par CHIOCCA (CHIOCCA, S., 1996, J. Virol. 70, 5, 2939-2949) (voir Figure 1). Dans ce document, l'analyse comparative entre la séquence nucléotidique complète de l'adénovirus aviaire CELO et celles connues d'autres adénovirus, a permis d'établir d'une part, par homologie, la présence ou l'absence d'un certain nombre de gènes codant pour des protéines virales déjà caractérisées et d'autre part, basée sur la position des codons ATG et d'arrêt, la présence d'au moins un certain nombre de cadres de lecture ouverte (ORF). De ces informations, il n'est pas possible de prévoir quels sont les gènes réellement transcrits et exprimés par le virus, et donc indispensables aux fonctions essentielles du virus comme celle de la réplication. La génération d'adénovirus aviaire recombinant comme vecteur recombinant pour son application comme vaccin recombinant ou pour le transfert de gène nécessite l'insertion d'un ADN hétérologue (exogène) d'intérêt dans des régions non essentielles du génome viral. Lorsque la taille de l'ADN hétérologue d'intérêt à insérer est supérieure à une valeur d'environ 1,5 kb, l'insertion doit être précédée de la délétion d'une ou plusieurs régions non essentielles du génome virale. C'est pourquoi, seule la connaissance précise de ces régions non essentielles du génome de l'adénovirus peut permettre de définir une stratégie dans la préparation de tels vecteurs recombinants.
Un des buts essentiels de la présente invention est d'obtenir des vecteurs d'expression de protéines hétérologues pour la préparation notamment de vaccin aviaire à partir de méthodes de préparation basée sur la découverte de régions non essentielles et essentielles de l'adénovirus aviaire CELO.
La présente invention concerne des méthodes de préparation d'un adénovirus aviaire CELO recombinant, caractérisées en ce qu'on insert dans une partie non essentielle de son génome une séquence d'ADN codant pour tout ou partie d'un polypeptide hétérologue à l'adénovirus aviaire CELO, ladite séquence d'ADN pouvant comporter en outre des éléments susceptibles d'assurer l'expression dudit polypeptide dans une cellule infectée par ledit adénovirus recombinant, de préférence ladite partie non essentielle correspondant à une zone intergénique non codante de l'adénovirus aviaire CELO.
L'invention concerne également des méthodes de préparation selon l'invention, caractérisées en ce que lesdites méthodes sont précédées d'une étape de délétion d'au moins une partie non essentielle du génome de l'adénovirus aviaire CELO.
L'invention concerne en outre des méthodes de préparation selon l'invention, caractérisées en ce que lesdites méthodes sont précédées d'une étape de délétion d'au moins une région essentielle du génome de l'adénovirus aviaire CELO.
L'invention a également pour objet des méthodes selon l'invention, caractérisées en ce que ladite séquence d'ADN code pour un polypeptide d'intérêt, de préférence un polypeptide antigénique d'agent infectieux responsable de maladie chez les animaux tels que les espèces aviaires. L'invention concerne en outre des méthodes selon l'invention, caractérisées en ce que le polypeptide d'intérêt est un polypeptide inteivenant dans le métabolisme animal ou humain.
Les vecteurs, caractérisés en ce qu'ils comprennent un adénovirus aviaire CELO recombinant obtenu par une méthode selon l'invention, font également partie de l'invention.
Sont compris également dans l'invention, les vaccins caractérisés en ce qu'ils contiennent un vecteur selon l'invention pour la protection d'espèces aviaires contre les maladies infectieuses.
L'invention concerne également les cellules transformées par un vecteur selon invention.
Un autre aspect de l'invention est relatif à des procédés de préparation in vivo de polypeptides d'intérêt recombinants, caractérisés en ce qu'ils mettent en oeuvre l'infection d'un animal par un vecteur selon l'invention, dont ladite séquence d'ADN insérée code pour ledit polypeptide d'intérêt.
Enfin, l'invention a pour objet des procédés de préparation de polypeptides d'intérêt recombinants, caractérisés en ce qu'ils mettent en oeuvre la culture de cellules transformées selon l'invention.
L'invention concerne une méthode de préparation d'un adénovirus aviaire CELO recombinant, caractérisée en ce qu'on insert dans une partie non essentielle de son génome une séquence d'ADN codant pour tout ou partie d'un polypeptide hétérologue à l'adénovirus aviaire CELO.
La famille des adénovirus est divisée en deux groupes : les Mastadenoviradea, isolés à partir de cellules de mammifères et les Aviadenoviradea, isolés à partir de cellules d'oiseaux. Le genre Aviadénovirus est lui-même divisé en 5 groupes d'espèce dont les adénovirus de volaille FAV ("Fowl Adeno Virus"). L'adénovirus aviaire CELO ("Chickcn Embryo Lethal Orphan") représente le sérotype 1 (FAV- 1) parmi les 1 1 sérotypes distincts de FAV reconnus.
L'adénovirus CELO est un virus à ADN double brin de 43 804 pb e long (CHIOCCA, S., et al.) (Figure I ). Sa capside est formée d'éléments de 3 types : des hexons, des pentons et des libres (protéines II, III, IV respectivement selon leur poids moléculaire de plus en plus faible). Les motifs antigeniques (épitopes neutralisants) sont portés essentiellement par les hexons et les fibres. La libre se fixe par son extrémité NH2 terminale à la base du penton, son extrémité carboxyle COOH se terminant en une zone en bouton, responsable de la fixation du virion à un récepteur spécifique. Entre ces deux extrémités, se trouve la hampe de la fibre, faite d'un certain nombre de motifs répétés (de 20 à 26 acides aminés selon les adénovirus).
La capside, particulièrement résistante, permet une très bonne protection de l'ADN viral ce qui explique la persistance de ce virus dans l'environnement et sa présence ubiquitaire. Cette capside a aussi un rôle essentiel dans la pénétration du virion à l'intérieur de la cellule hôte en évitant la lysc par les endosomes, comme cela se produit normalement pour tout agent infectieux capté par endocytose par la cellule. L'adénovirus CELO, comme les Aviadénovirus, possède deux fibres dont le rôle n'est pas encore aujourd'hui expliqué, et se distingue des adénovirus de mammifère (dont les adénovirus humains) qui possèdent une fibre unique (sauf pour les adénovirus humains 40 et 41 qui possèdent également deux fibres).
Génome et transcription des gènes chez l'adénovirus
Pour une meilleure compréhension, la description ci-dessous a pour objet essentiel d'introduire les notions et vocabulaire qui seront par la suite utilisés dans la présente invention, relatifs à l'organisation du génome de l'adénovirus, la transcription des gènes et leur fonction, à partir d'adénovirus connus de mammifères.
Au niveau des mammifères, il semble que la structure des génomes des divers adénovirus soit voisine, avec des homologies importantes de gènes codant pour des protéines données (de structure essentiellement) : hexon, penton, fibre, endopeptidase, etc. Pour des adénovirus aviaires, des homologues faibles, de 30 à 50 % au mieux, existent avec des adénovirus mammifères.
Chaque adénovirus est constitué d'un ADN double brin, terminé par des répétitions inversées de 50 à 150 pb (ITR : "Inverted Terminal Repeat"). La longueur du génome varie de 30 à 44 kb (les adénovirus aviaires étant en général plus longs que les adénovirus de mammifères). Ces répétitions terminales inversées, contenant les origines de réplication de l'ADN du virion, sont fondamentales pour la réplication du virion. Dans toute construction d'adénovirus recombinant, il faut impérativement conserver au moins une de ces extrémités afin d'assurer la réplication de l'adénovirus recombinant. In vivo, à ces ITR, une protéine terminale est associée (TP) de 87 kDa à l'état de préprotéine terminale, de 55 kDa à l'état mature (encapsidée à l'intérieur du virion mature). La présence de cette TP permet d'améliorer la réplication du virion d'un facteur 100 à I 000.
Comme pour de nombreux virus, les gènes d'adénovirus sont répartis (plus ou moins arbitrairement) en deux groupes :
- des gènes dits précoces (Early gencs) s'exprimant avant la réplication de l'ADN ; - des gènes dits tardifs (Late gènes) exprimés après la réplication de l'ADN et nécessitant impérativement la transcription antérieure des gènes précoces.
Quels que soient l'adénovirus et sa taille, il est de coutume de partitionner son génome en 100 unités (map unit : m. u.) et de positionner les gènes selon ces unités.
Gènes précoces :
Pour les adénovirus humains, ils sont au nombre de quatre : El à E4, avec chacun leur propre promoteur, situé tantôt sur un brin, tantôt sur l'autre. Ces gènes sont impliqués dans la régulation de la transcription virale, la transformation et la réplication de l'ADN viral (à l'inverse, les gènes tardifs produisent essentiellement les protéines de structure du virion). E l. ( 1,3 à 1 1,2 m. u.) : gène essentiel, car il est l'initiateur de tout le cycle viral. Son expression démarre 20 à 30 minutes après l'entrée du virion dans la cellule, et sa transcription dépend de facteurs cellulaires propres à l'hôte (spécificité d'hôte des adénovirus). Ce gène est décomposé en deux gènes : E l A et E l 13, dont le premier est essentiel pour l'établissement de l'infection virale. Ces deux gènes E I Λ et E l 13 permettent, par des effets conjugués, la multiplication cellulaire et l'immortalisation transformation de cellules les recevant conjointement par trans ection (si E l A permet l'immortalisation, E1B évite l'apoptose et permet ainsi le maintien du phénotype immortalisé).
E2 (3 1- 1 1 et 66,6-61 ,7 m. u.) : sa transcription est sous dépendance de E 1 A (quoique la protéine El A ne soit pas une DBP, "DNA binding Protein", protéine se fixant à l'ADN). Ce gène code entre autres pour une ADN polymérase de 140 kDa, une DBP de 58 kDa et la TP ("Terminal Protein"), dont le rôle a déjà été signalé plus haut pour l'efficacité de la réplication virale (précurseur de 80 kDa ; protéine mature de 55 kDa).
E3 (76,6-86 m. u.) : gène non essentiel pour la multiplication virale in vitro. Son rôle in vivo serait de protéger le virion des défenses immunitaires de l'hôte. Il code pour plusieurs protéines, dont une protéine de 19 kDa qui bloque au niveau du reticulum endoplasmique la sortie des antigènes de type I du CMH (Complexe Majeur d'Histocompatibilité), et aussi une protéine de 14,7 kDa qui protège la cellule infectée de l'action lyrique du TNF ("Tumor Necrosis Factor").
E4 (99-91,3 m. u.) : gène qui code pour des protéines impliquées dans la régulation des gènes tardifs, et dans l'arrêt de la synthèse des protéines cellulaires, permettant ainsi le détournement des possibilités de biosynthèse de la cellule au profit du virus.
La distinction gènes précoces et gènes tardifs indique une prédominance de certains gènes à un moment donné dans le cycle de réplication du virus. Un gène dit précoce, comme par exemple El A, peut s'exprimer pendant tout le cycle viral, ou un gène dit tardif, comme le promoteur MLP ("Major Late Promoter"), peut s'exprimer, quoique faiblement, dès les premières heures suivant l'infection.
Gjinciia.t iXs : Ceux-ci sont au nombre de cinq : Ll à L5, codant pour les diverses protéines de structure (capside essentiellement) : L2 pour le penton, L3 pour l'hexon, L5 pour la fibre, etc.
Tous ces transcrits démarrent à partir d'un même promoteur, le MLP (pour Major Late Promoter : promoteur majeur tardif), et possèdent tous une même extrémité 5' (TPL : "TriPartite Leader"), faite des trois premiers exons : I , 2 et 3. Ces ARN sont produits par épissages alternatifs. Leur transcription augmente de 1 000 lors de la phase tardive de réplication du virion. Cette extraordinaire augmentation de transcription réalisée par le MLP fait de ce dernier un promoteur privilégié dans toute construction d'adénovirus recombinant vue son efficacité.
Il est à signaler dans cette phase tardive, la transcription du gène de la protéine IX, unité transcriptionnellc juste en 3' de E 1 B, dont la synthèse est essentielle pour l'assemblage du virion (entrée de l'ADN dans le capside).
Il est possible de sous cloner des fragments d'adénovirus dans des plasmides, et par cotransfection de fragments se chevauchant et représentant le génome entier, par recombinaison homologue, obtenir des recombinants reproduisant le virion d'origine. Pour réussir, deux contraintes minimales sont à réunir dans les constructions : i) un fragment doit posséder une répétition terminale (ITR, nécessaire à la réplication du virus, et ii) les deux fragments à joindre doivent avoir au moins une unité (360 à 440 nucléotides) de recouvrement pour permettre la recombinaison homologue. Deux plasmides circulaires portant chacun deux fragments complémentaires, ayant au moins de 400 à 500 nucléotides en commun, représentant à eux deux la totalité du génome, peuvent ainsi recombiner pour produire des adénovirus recombinants. La délétion dans la région E3, non indispensable pour la réplication in vitro, peut permettre des insertions jusqu'à 4 kb. Enfin, la délétion de la région E l peut, avec les précédentes, permettre, a priori, des insertions jusqu'à 7 kb.
Quatre sites d'insertion sont possibles : 1 ) après le MLP, 2) dans E l , 3) dans 03 ou 4) à droite de E4, à environ 150 nucléotides de l'ITR droite (entre E4 et ITR). Le plus souvent l'insertion se fait dans la région E l , avec conservation des 50 bases terminales qui représentent l'origine gauche de réplication de l'ADN, du signal d'encapsidation (entre 194 et 358 nucléotides) et de la séquence à droite de E 1 B qui code pour la protéine IX permettant l'ajustement de l'ADN à la capside. Dans ce dernier cas, les fonctions de El A et E l B sont fournies en trans dans des lignées de type 293 dans lesquelles les gènes E l A et E 1 B ont été transfectés et s'expriment de façon permanente. La construction adénovirale recombinante est alors à son tour transfectée dans de telles lignées transcomplémentantcs et le virion recombinant peut alors être produit dans de telles lignées. La lignée 293 peut être appelée lignée « helpcr » par analogie avec ce qui se passe pour les rétrovirus, le principe reste le même, fournir en trans des gènes que l'on a précédemment enlevés pour libérer de la place pour les gènes exogènes que l'on veut exprimer dans sa construction virale.
Deux possibilités de vecteurs existent :
i) Réplicatifs ou ii) non réplicatifs (défectif). A priori, le premier cas est plus favorable permettant d'une part la multiplication, donc des copies plus nombreuses du gène à exprimer. D'autre part on sait que l'intervention d'éléments cis de réplication favorise la transcription des gènes tardifs, ainsi, si le gène à exprimer est sous dépendance du promoteur MLP, cela favorise aussi la transcription de ce dernier.
Choix des promoteurs :
Habituellement, pour un gène inséré dans la région E3, on choisit le promoteur de E3, pouvant comporter en outre le promoteur MLP. Pour un gène inséré dans la région El, on peut choisir soit un tout autre promoteur, ou soit plus généralement une combinatoire artificiellement recréée en cette place : MLP + TLP ("tripartite leader" : formée de trois exons présents en 5' de tous les transcrits tardifs), le TLP permettant la reconnaissance des transcrits adénoviraux et leur transfert du noyau au cytoplasme, pour leur traduction, transfert inhibé pour tous les autres ΛRN cellulaires.
Contrôle de la. traduction :
Les ARN viraux sont également préférentiellement traduits, et cela grâce à deux
ARNs de l'adénovirus transcrits par l' ARN polymérase III de la cellule hôte, nommée : VAI et VAII (pour "virus associated RNA"). Ces ARNs favoriseraient la traduction des autres ARNs viraux en empêchant la phosphorylation du facteur d'élongation elF2γ, phosphorylation qui inhibe l'activité de ce dernier.
Le développement de ces vecteurs adénoviraux a démarré en 1977 par l'établissement d'une lignée cellulaire de complémentation (cellule « helpcr ») qui contient les gènes essentiels à la réplication virale (1 1 % du génome de l'adénovirus humain de type 5, essentiellement les gènes E l A et E I B, lignée embryonnaire de rein d'homme, 293, GRAHAM, F.L. et al., 1977, J. Gcn. Virol., 36, 59-72). Les adénovirus recombinants obtenus, comme les rétrovirus recombinants obtenus à partir des lignées transcomplémentantes (type Isolde en aviaire, voir Nigon, Verdier, Lab. CNRS-INRA associés, Lyon-Villeurbanne) sont incapables de se reproduire par eux-mêmes, mais sont capables d'infecter les cellules cibles et d'y synthétiser la protéine hétérologue, codée par le gène introduit en lieu et place de El . Si le gène introduit est placé dans la région E3, la lignée transcomplémentante n'est pas nécessaire, le vecteur recombinant conservant tout pouvoir de réplication autonome.
Par partie non essentielle du génome de l'adénovirus aviaire CELO dans laquelle peut être insérée une séquence codant pour un polypeptide hétérologue, on entend particulièrement les régions du génome dans lesquelles cette insertion n'empêche pas la réplication dudit adénovirus recombinant. Les régions du génome qui après délétion n'empêchent pas la réplication dudit adénovirus recombinant sont également des parties non essentielles du génome. Parmi ces parties non essentielles du génome, on préfère les zones dénommées zones intergéniques non codantes, qui sont naturellement silencieuses d'un point de vue transcriptionncl et où l'insertion d'une séquence d'ADN hétérologue, ne perturbe pas la transcription de l'un ou l'autre des deux brins de l'ADN génomique. La délétion de ces zones intergéniques non codantes n'affecte pas non plus la réplication dudit adénovirus recombinant.
Par parties essentielles du génome de l'adénovirus aviaire CELO, on entend les parties dudit génome constituées d'au moins une partie strictement essentielle dudit génome et pouvant comporter en outre une ou plusieurs parties non essentielles dudit génome. On entend par partie strictement essentielle dudit génome une partie dans laquelle l'insertion d'une séquence d'ADN hétérologue perturbe la transcription de l'un ou l'autre des deux brins de l'ADN génomique, ne permettant plus la réplication autonome dudit adénovirus recombinant. Par partie strictement essentielle dudit génome, on entend également les parties qui sont indispensables à la réplication autonome dudit adénovirus, la délétion de l'une au moins desdites parties strictement essentielles empêchant la réplication autonome dudit adénovirus recombinant. Ces parties non essentielles et essentielles dont la découverte est la base de la présente invention sont décrites dans les exemples de la présente description.
Par polypeptide hétérologue, on entend tout polypeptide ou toute protéine, polypeptide et protéine ayant la même signification dans la présente description, non exprimée naturellement par l'adénovirus aviaire CELO ou tout polypeptide dont la séquence nucléique codante n'est pas incluse dans le génome dudit adénovirus.
Parmi les polypeptides hétérologues d'intérêt dont la séquence nucléique peut être incorporée dans les parties non essentielles du génome de l'adénovirus aviaire CELO, on peut citer : a) Les polypeptides antigeniques
Les polypeptides antigeniques sont les polypeptides correspondant à des déterminants antigeniques d'organismes contre lesquels il est désirable de générer une immunité par médiation cellulaire ou par la production d'anticorps. Les déterminants antigeniques sont de préférence les déterminants antigeniques d'agent infectieux, de type viral ou autres, et qui sont responsables de maladies infectieuses chez les animaux et notamment chez les espèces aviaires comme par exemple la maladie de Marek, les bronchites infectieuses, la larynchotrachéitc, le gumboro, la maladie de Ncwcastlc, les infections à mycoplasmes, l'anémie du poulet, l'cncéphalomyélitc aviaire, l'influcnza aviaire ou la maladie de la bourse de Fabricus d'origine virale Gumboro. II est possible également d'utiliser l'adénovirus aviaire CELO recombinant comme vecteur vaccinant pour les mammifères en substituant les libres originelles (MICHAEL, S.I., 1995, Gène Thérapie, 660-668).
Parmi ces agents infectieux, on préfère particulièrement les agents infectieux responsables de la maladie de Marek, des bronchites infectieuses, de la larynchotrachéite, du gumboro ou de la maladie de Newcastle.
La présente invention comprend également les méthodes selon l'invention dans lesquelles la séquence d'ADN codant pour un polypeptide hétérologue d'intérêt résulte de la combinaison de plusieurs séquences d'ADN codant chacune pour un polypeptide hétérologue d'intérêt.
11 est bien entendu que la présente invention comprend également les méthodes selon l'invention dans lesquelles on insert plusieurs séquences d'ADN codant chacune pour un polypeptide hétérologue d'intérêt. b) Les polypeptides intervenant dans le métabolisme
Sous un autre aspect, l'invention vise également à produire in vivo, notamment dans la volaille, des facteurs polypeptidiques intervenant dans le métabolisme de l'animal infecté par l'adénovirus aviaire CELO recombinant. Parmi ces polypeptides d'intérêt, on peut citer par exemple les polypeptides impliqués dans le métabolisme des graisses tels que Δ9 désaturase, l'acétyl coA carboxylase, la lipase, etc., les hormones de croissance ou leur facteur inducteur (comme le GRF) ou des immunopotentiateurs comme les cytokines, les interleukines, etc..
Dans le cadre de la présente invention, le polypeptide d'intérêt peut être un polypeptide intracellulaire, membranaire présent à la surface de la cellule hôte ou sécrété hors de la cellule hôte. Sa séquence d'acide nucléique peut donc comprendre en outre des éléments additionnels appropriés comme, par exemple, une séquence codant pour un signal de sécrétion, ces signaux étant connus de l'homme de l'art.
L'invention vise en outre l'utilisation de l'adénovirus aviaire CELO recombinant comme vecteur d'expression de protéine hétérologue dans le cadre de traitement par thérapie génique appliqué à l'homme, l'adénovirus aviaire CELO recombinant étant en effet très peu susceptible de se recombiner avec les adénovirus humains habituellement utilisés. Parmi les polypeptides d'intérêt pouvant être exprimés dans le cadre de traitement par thérapie génique appliqué à l'homme, on préfère tout particulièrement ceux capables d'inhiber ou retarder l'établissement et/ou le développement d'une maladie génétique ou acquise comme par exemple la mucoviscidose, l'hémophilie A ou B, la myopathie de Duchenne ou de Becker, le cancer, le SIDA ou des maladies infectieuses dues à un organisme pathogène. On préfère tout particulièrement les polypeptides d'intérêt suivants :
- une cytokine et notamment une interleukinc, un interféron, un facteur de nécrose tissulaire et un facteur de croissance et notamment hématopoïétiquc (G-CSF, GM-CSF),
- un facteur ou cofacteur impliqué dans la coagulation et notamment le facteur VIII, le facteur von Willebrand, l'antithrombine III, la protéine C, la thrombine et l'hirudine,
- une enzyme et notamment la trypsine, une ribonucléase et la β-galactosidase,
- un inhibiteur d'enzyme tel les inhibiteurs de protéases virales,
- un produit d'expression d'un gène suicide comme la thimidine kinase du virus HSV (virus de l'herpès) de type 1,
- un activateur ou un inhibiteur de canaux ioniques,
- un polypeptide dont l'abscence, la modification ou la dérégulation de l'expression est responsable d'une maladie génétique, telle que la protéine CFTR, la dystrophine ou minidystrophine, l'insuline, FADA (adénosine diaminose), la glucocérébrosidase et la phénylhydroxylase, - un polypeptide capable d'inhiber l'initiation ou la progression de cancers, tel que les produits d'expression des gènes suppresseurs de tumeurs, par exemple les gènes P53,
- un polypeptide capable de stimuler une réponse immunitaire ou un anticorps, - un polypeptide capable d'inhiber une infection virale ou son développement, par exemple les épitopes antigeniques du virus en cause ou des variants altérés de protéines virales susceptibles d'entrer en compétition avec les protéines virales natives.
Par ailleurs, un polypeptide d'intérêt en usage dans la présente invention, peut être également un marqueur de sélection permettant de sélectionner ou d'identifier les cellules hôtes transfectées par un vecteur selon l'invention. On peut citer par exemple le polypeptide codé par le gène nύo (néomycine) conférant une résistance à l'antibiotique G418, par le gène dhfr (dihydrofolate réductase), par le gène CAT (Chloramphcnicol Trans férase) ou encore par le gène gpt (xanthinc phosphoribosyl).
Par polypeptide d'intérêt, on entend également les polypeptides recombinants d'intérêt industriel ou thérapeutique qui peuvent être préparés soit // vitro par culture de cellules, notamment aviaires, transformées par l'adénovirus CELO recombinant, ou soit /'// vivo chez l'animal.
Conformément aux buts poursuivis par la présente invention, la séquence nucléique peut coder pour un polypeptide d'intérêt correspondant à tout ou partie d'une protéine native telle que trouvée dans la nature. Il peut également s'agir d'une protéine chimérique, par exemple provenant de la fusion de polypeptides d'origines diverses ou d'un mutant présentant des propriétés biologiques améliorées et/ou modifiées. Un tel mutant peut être obtenu par des techniques de biologie classiques par substitution, délétion et/ou addition d'un ou plusieurs résidus acides aminés.
On entend par partie de polypeptide, un fragment biologiquement actif du polypeptide capable d'exercer en totalité ou partiellement l'activité biologique du polypeptide dont il est dérivé. L'invention concerne également une méthode selon l'invention, caractérisée en ce que ladite séquence d'ADN comprend en outre les éléments susceptibles d'assurer l'expression dudit polypeptide hétérologue dans une cellule infectée par ledit adénovirus recombinant. La séquence d'ADN codant pour un polypeptide d'intérêt peut être associée à un promoteur ou à une séquence leader dans le but d'exprimer la séquence d'ADN avec la meilleure efficacité possible. Tout promoteur permettant d'exprimer la séquence d'ADN avec efficacité peut être utilisé. Parmi les promoteurs ou séquences leader préférés, on peut citer ceux des adénovirus humains, du virus SV40, du cytomégaloviais ou des adénovirus aviaires, particulièrement préféré est le promoteur MLP de l'adénovirus aviaire CELO, la séquence leader TPL (ici bipartite : L l + L3).
L'invention concerne également des méthodes selon l'invention, caractérisées en ce que la partie non essentielle correspond à une zone intergénique non codante de l'adénovirus aviaire CELO, de préférence ladite partie non essentielle est choisie parmi les sites suivants, repérés en coordonnées numériques (pb) relatives à la séquence publiée de 43 804 pb (CHIOCCA, S. et al., 1996) et telle que définie à la Figure 1 : a) entre 600 et 650, b) entrc750 et 780, c) entre 3 380 et 3 520, d) entre 10 160 et 10 260, e) entre 12 160 et 12 180, entre 21 775 et 21 818, g) entre 26 650 et 27 060, h) entre 27 970 et 28 170, i) entre 30 500 et 30 510, j) entre 32 480 et 32 730, k) entre 33 720 et 33 880,
1) entre 36 210 et 36 340, m) entre 36 640 et 36 740, n) entre 37 220 et 37 380, o) entre 38 280 et 38 650, p) entre 42 380 et 43 040.
L'invention comprend également des méthodes selon l'invention caractérisées en ce qu'elles comportent une étape de délétion d'au moins une partie non essentielle du génome de l'adénovirus aviaire CELO, de préférence ladite partie non essentielle est choisie parmi les parties suivantes, repérées en coordonnées numériques (pb) relatives à la séquence telle que définie à la Figure I : a) partie comprise entre 1 970 et 2 850, b) partie comprise entre 1 970 et 3 000, c) partie comprise entre 3 130 et 3 520, d) partie comprise entre 33 210 et 33 450.
L'invention comprend également des méthodes selon l'invention caractérisées en ce qu'elles comportent une étape de délétion d'au moins une partie essentielle du génome de l'adénovirus aviaire CELO, de préférence ladite partie essentielle est choisie parmi les parties suivantes, repérées en coordonnées numériques (pb) relatives à la séquence telle que définie à la Figure 1 : a) partie comprise entre 300 et 5 300, b) partie comprise entre 10 170 et 1 1 280, c) partie comprise entre 15 100 et 17 560, d) partie comprise entre 15 100 et 21 800, e) partie comprise entre 16 050 et 17 540, f) partie comprise entre 16 050 et 21 800, g) partie comprise entre 16 050 et 23 170, h) partie comprise entre 17 540 et 21 800, i) partie comprise entre 21 800 et 23 170, j) partie comprise entre 23 180 et 27 960, k) partie comprise entre 23 670 et 27 050, 1) partie comprise entre 24 800 et 27 060, m) partie comprise entre 27 100 et 31 790, n) partie comprise entre 28 100 et 31 800, o) partie comprise entre 35 620 et 36 440.
L'invention concerne également des méthodes selon l'invention, caractérisées en ce que l'étape de délétion conduit à l'obtention d'un adénovirus aviaire CELO recombinant comportant au moins 2 séquences d'acide nucléique codant pour un ITR et une séquence d'acide nucléique codant pour un signal d'encapsidation M'.
La préparation de tels vecteurs, basée en particulier sur la localisation des signaux d'encapsidation de l'adénovirus aviaire CELO, permet de générer des vecteurs à grande capacité d'incorporation d'ADN hétérologue, plus sûrs et à immunogénicité réduite. De tels vecteurs sont notamment préférés comme vecteur de transfert de gène hétérologue dans des cellules de mammifère dans le cadre de traitement par thérapie génique. Le principe d'obtention de tels vecteurs est connu de l'homme de l'art (PARKS, R.J. et al., 1996, PNAS, 93, 13565-13570, WANG, P. et al., 1995, Somalie
Cell and Mol. Gcn., 21 , 6, 429-4 1 ). Le principe repose sur la Crc-rccombinase qui reconnaît la séquence LoxP et permet d'exciser tout gène compris entre 2 sites LoxP.
Des vecteurs adénovirus défectifs recombinants sont ainsi créés, pouvant être réduits à leur plus simple expression (2 ITR (inverted terminal repeat) et un signal d'encapsidation ψ), ce qui dans le cas de l'adénovirus aviaire CELO, laisse une place pour environ 43 kb d'ADN exogène.
Le principe est décrit ci-contre. Une lignée LMH (Kawaguchi T., Nomura K., Hirayama Y., Kitagawa T. (1987) : Establishment and characterization of a chicken hepatocellular carcinoma cell Une, LMH. Cancer Research, 47, pp. 4460-4464) est obtenue avec la Cre-recombinase par rétrovirus recombinant classique, le virus assistant (« helper ») possédant de part et d'autre du site d'encapsidation ψ des séquences LoxP. Le virion recombinant est ensuite délété du nombre choisi de parties non essentielles et essentielles du génome à l'exception des éléments suivants : les deux ITR terminales et la séquence d'encapsidation (les premières permettant la réplication de l'adénovirus aviaire recombinant et la deuxième séquence permettant l'encapsidation dudit adénovirus recombinant). La présence de deux sites LoxP de part et d'autre de la séquence d'encapsidation dans le virus assistant l'empêche d'être encapsidé clans la lignée transcomplcmcntantc LMI I/Crc-rccoinbinase. Le virus assistant est, en dehors des sites LoxP, identique à l'adénovirus sauvage CELO.
De telles constructions sont obtenues avec le plasmide ppoly Il/extrémités CELO (Figures 2, 3 et 4), ainsi qu'avec le plasmide CELO/rec.
Les lignées de cellules transcomplémentantcs nécessaires à la réplication d'adénovirus aviaires CELO défectifs, obtenues par les méthodes de préparation selon l'invention, permettent de construire des virus assistants recombinants plus sûrs.
Par ce biais, il est possible d'envisager de produire un adénovirus aviaire CELO recombinant porteur de gènes à intérêt vaccinant, dans une configuration identique aux gènes sauvages : promoteurs, leaders, épissages, etc., afin d'avoir une efficacité maximale.
L'invention a également pour objet des méthodes selon l'invention, caractérisées en ce que la séquence d'ADN code pour un polypeptide d'intérêt, de préférence un polypeptide antigénique correspondant à un déterminant antigénique d'agent infectieux responsable de maladies infectieuses chez les animaux, notamment chez les espèces aviaires.
Parmi les maladies infectieuses, on préfère la maladie de Marek, la bronchite infectieuse, la larynchotrachéite, le gumboro ou la maladie de Newcastle.
L'invention comprend également des méthodes selon l'invention, caractérisées en ce que le polypeptide d'intérêt est un polypeptide intervenant dans le métabolisme animal, de préférence aviaire, ou humain. Font également partie de l'invention, les vecteurs, caractérisés en ce qu'ils comprennent un adénovirus aviaire CELO recombinant obtenu par une méthode selon l'invention.
L'invention concerne également des vaccins caractérisés en ce qu'ils contiennent un vecteur selon l'invention, notamment des vaccins pour la protection d'espèces aviaires contre les maladies infectieuses.
Un vaccin selon l'invention peut être fabriqué de manière conventionnelle. En particulier, on associe une quantité thérapeutiquement efficace d'un tel vecteur à un support, un diluant ou un adjuvant acceptable. Il peut être administré selon n'importe quelle voie d'administration et ceci en dose unique ou répétée après un certain délai d'intervalle. La nébulisation, la pulvérisation par aérosol ou l'administration par l'intermédiaire d'aliments solides ou liquides, sont les modes d'administration préférés, en particulier pour les espèces aviaires La quantité à administrer sera choisie en fonction de certains critères, en particulier la voie d'administration, l'animal, le type de maladie à traiter et son état d'évolution, la durée du traitement, etc.. A titre indicatif, un vaccin selon l'invention, comprend entre 101 1 et 101 de particules adénovirales/ml, de préférence, entre 109 et 1012 pfu/ml (plaque forming unit).
L'invention concerne également des cellules transformées par un vecteur selon l'invention. Parmi lesdites cellules, on préfère les cellules caractérisées en ce qu'elles sont des cellules eucaryotes permettant la réplication d'un adénovirus aviaire CELO recombinant défectif.
Les cellules eucaryotes permettant la réplication d'un adénovirus aviaire CELO recombinant défectif, c'est-à-dire incapable, normalement, de se répliquer, sont appelées cellules transcomplémentantcs. Ces cellules permettent d'obtenir des titres suffisamment élevés d'adénovirus aviaire CELO recombinant défectif ayant intégré l'ADN codant pour le polypeptide hétérologue d'intérêt. Les méthodes d'obtention de telles cellules transcomplémentantes sont connues de l'homme de l'art et sont basées notamment sur la connaissance des parties essentielles et non essentielles du génome du virus que l'on veut répliquer.
L'adénovirus recombinant défectif est un vecteur susceptible de déclencher une première réaction immunitaire en cas d'entrée dans la cellule cible, sans possibilité d'atteindre d'autres cellules voisines. Le vecteur est inolïensif, car plus ou moins délété, et incapable de dissémination dans l'animal et entre animaux. En plus de l'innocuité de cet OGM (organisme génétiquement modifié), on peut libérer de plus en plus de place, voire la totalité des gènes du virus pour apporter un maximum d'informations exogènes (« gutless viais », virus « déboyauté » et Cre-recombinase). C'est un avantage qui peut compenser très largement les inconvénients liés à la non réplication autonome. De plus, en vaccination, l'efficacité de la première prise vaccinale est essentielle mais il n'est pas forcément nécessaire de multiplier les injections.
Parmi les cellules eucaryotes permettant la réplication d'un adénovirus aviaire
CELO recombinant défectif, on préfère les lignées cellulaires transcomplémentantcs d'origine aviaire, type LMH ou QT6 (ATCC CRL 1708-fibrosarcoma-Moscovici et al. 1977).
On préfère également les lignées cellulaires transcomplcmentantes d'origine aviaire telle que la lignée LMH ou QT6 ou celles dont l'immortalisation est faite à la base par l'antigène T de SV40 (Institut Mérieux). De telles lignées cellulaires transcomplémentantes d'origine aviaire nécessitent de préférence l'utilisation de rétrovirus aviaires permettant d'obtenir des lignées aviaires CELO- transcomplémentantes.
Les rétrovirus aviaires peuvent porter de 3 à 7 kb d'ADN exogène. Ces rétrovirus infectent facilement les lignées LMH (portant éventuellement le récepteur des rétrovirus aviaires pour faciliter leur infectabilité) et s'intègrent dans le génome de la cellule hôte. Les cellules transcomplémentantcs sont obtenues rapidement puis sélectionnées sur leur efficacité à produire les gènes de l'adénovirus aviaire CELO. L'invention comprend de plus des procédés de préparation /'// vivo d'un polypeptide d'intérêt recombinant, caractérisés en ce qu'ils mettent en oeuvre l'infection d'un animal par un vecteur selon l'invention, vecteur dont ladite séquence d'ADN insérée code pour ledit polypeptide d'intérêt.
L'invention concerne enfin des procédés de préparation d'un polypeptide d'intérêt recombinant, caractérisés en ce qu'ils mettent en oeuvre la culture de cellules selon l'invention.
Les techniques de transformation /';/ vivo ou /'// vitro de cellules à partir de vecteurs adénovirus recombinants visant à préparer des polypeptides recombinants, sont bien connues de l'homme de l'art et ne seront pas décrites.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et les figures dont les légendes sont représentées ci-après.
Légendes des figures
• Figure 1 : séquence nucléotidique complète du génome viral CELO. Le brin 5' vers 3' du génome est également représenté par la SEQ ID n° 1.
• Figure 2 : construction du plasmide pPOLY II /extrémités CELO.
Le plasmide ppoly II ext celo de 3964 bp est obtenu en réalisant une triple ligation entre ppoly II, le fragment Bamhl-Spel, et le fragment Spel-Hindlll ; ces deux fragments^ étant préalablement amplifiés par PCR et purifiés.
• Figure 3 : construction du plasmide ppoly 1I/CELO recombinant avec l'intégralité du génome de l'adénovirus celo, par recombinaison homologue entre l'ADN total du virus CELO et la plasmide ppoly Il/extrémités CELO.
Figure 4 : plasmide ppoly II/CELO recombinant avec l'intégralité du génome de l'adénovirus celo avec ses 4 fragments constitutifs A, B, C et D. • Figure 5 : sites potentiels d'insertion ou de délétion sur le génome viral de l'adénovirus aviaire CELO.
1 cm correspond environ à 2kb. Les flèches sur le schéma du haut représentent les sites potentiels d'insertion et les flèches sur le schéma du bas encadrent les zones potentielles de délétion.
• Figure 6 : principe de recombinaison homologue entre deux plasmides pour la création d'adénovirus CELO recombinants. La figure 6A représente la recombinaison homologue entre régions identiques du plasmide ZZ et de l'adénovirus recombinant ppoly/celo rec 45.8 Kb. La figure 6B représente le plasmide pPolyllCelo Rec avec un gène d'intérêt introduit par recombinaison homologue comme indiqué en figure 6A.
• Figure 7 : les quatre plasmides A, B, C et D représentant la totalité du génome du CELO et permettant la construction de recombinants (délétés et/ou par insertion) par sous clonages successifs .
• Figure 8 : schéma des quatre plasmides A, B, C et D ainsi que du plasmide ppoly 1I/CELO recombinant porteur de la totalité du génome viral CELO .
La figure 8A montre la présence du fragment A de celo dans pBS/KS+Amp Résistant. La figure 8B montre la présence du fragment B de celo dans pBS/KS+Amp Résistant. La figure 8C montre la présence du fragment C de celo dans pBS/KS+Amp Résistant. La figure 8D montre la présence du fragment D de celo dans pBS/KS+ ligand. La figure 8E montre le plasmide p Polyll Amp R recombinant avec l'intégralité du génome de celo.
• Figure 9 : création de lignées transcomplémentantcs pour les gènes tardifs du CELO. La figure 9A correspond au rétrovirus recombinant L2, la figure 9B correspond au rétrovirus recombinant L3, la figure 9C correspond au rétrovirus recombinant L4, et la figure 9D correspond au rétrovirus recombinant L5. Les rectangles comportant des carreaux noirs et blancs et ceux avec un motif en tuile représentent le gène Neo et le gène hygromycine respectivement, les rectangles striés et ceux avec des flèches vers le haut définissent le promoteur CMV et SV40 respectivement.
• Figure 10 : utilisation des lignées transcomplémentantcs pour la fabrication de virus
CELO recombinants vaccinants. I ) Les gènes X et Y de l'adénovirus celo sont intégrés de chaque côté d'un IRE (Entrée
Ribosomale Interne) pour former un rétrovirus recombinant. Le gène Neo et le promoteur CMV sont représentés comme à la figure 9. 2) Une lignée isolde est transfectée par l'ADN rétroviral présenté en étape I ).
3) On infecte des cellules de la lignée LMH par les rétrovirus porteurs des gènes X et Y produits par les cellules de l'étape 2. On sélectionne une lignée LMH transcomplémentante pour les gènes X et Y.
4) On transfecte la lignée LMH isolée en 3) avec l'ADN Celo recombinant porteur des gènes d'intérêts 1 et 2.
5) On purifie les virus produits porteurs des gènes d'intérêts.
• Figure 1 1 : création de CELO « gutless » recombinant par le biais de la CRE- recombinase. 1) Une lignée Isolde est transfectée avec un rétrovirus porteur du gène de la CRE recombinase. Le rectangle possédant des lignes en diagonale représente un promoteur inductible. Le rectangle quadrillé est un NLS (Signal de Localisation Nucléaire), le rectangle avec des losanges est un IRE et le gène Neo est représenté comme à la figure 9. 2) On infecte une lignée LMH par le rétrovirus exprimant la recombinase Cre produite par une lignée de l'étape 1). On sélectionne une lignée LMH exprimant la protéine CRE recombinase. 3) On co-transfecte la lignée LMH sélectionnée avec un ADN Celo Helper comportant deux sites LoxP encadrant le signal d'encapsidation viral et un ADN celo recombinant dans lequel des gènes d'intérêts de type X, Y, Z sont insérés dans une région disponible de 43 kb. 4) La lignée LMH possédant la CRE recombinase produit des viais non réplicatifs et porteurs de gènes d'intérêts.
EXEMPLES
Matériel et méthodes
Cultures cellulaires et infections Des cellules embryonnaires de reins de poulet (embryons EOPS) de 19 jours sont cultivées en fiasques de 75 cm2 à raison de 106 cellules/ml dans 20 ml de milieux BHK21/5 % SVF (sérum de veau foetale) à 37 °C et 2 % CO2.
Un jour après, les cellules sont lavées et infectées à 20 pfu 5PLAGES FORMANT DES UNIT2S° par cellule dans un volume minimal (= 4 ml) pendant 1 heure à 37°C CO2 2 %. Le milieu est ensuite ajusté à 20 ml.
Extraction des ARNs totaux
Le protocole RNAnow avec phénol de Biogcntcx a été suivi. Le RNAnow est utilisé à raison de 1 ml / 10 cm2 (ou 1 à 5 106 cellules). L'homogénat est couplé à 0,2 volume de chloroforme. Les ARNs sont précipités en présence d'isopropanol (V/V) puis lavés à l'éthanol 70 % et repris dans un Tris-EDTA 10:0, 1 (RNAse free). Chaque extraction est suivie d'une analyse sur gel d'agarose de la qualité des ARNs.
Construction des banques d'ADNc La première banque est construite dans le plasmide pSPORTl à partir du kit
SuperScript Plasmid System for cDNA synthesis and plasmid cloning de Life Technologies. Les ADNc avec des amorces oligo(dT) associées à des primers- adaptateurs avec quatre sites de restriction Spel.Xbal, NruI, Notl, en présence de SuperScript II RT ont été synthétisés. Le deuxième brin est synthétisé au moyen du cocktail E. coli DNApol + RNAse H + DNA ligase à 16°C. Un adaptateur Sali est fixé aux extrémités après traitement à la T4 DNApol. Les ADNc sont ensuite digérés par Notl et sous clones dans pSPORTl par Sall/Notl. La deuxième banque est construite dans le plasmide pBluescript BS/KS+
(Stratagène). Le premier brin est synthétisé en présence d'amorces oligo(dT) 1 et d'hcxanucléotides. Le deuxième brin est réalisé selon le protocole précédent. Un adaptateur de EcoRi/Notl est fixé aux extrémités des ADNc qui sont ensuite sous clones dans pBS/KS+ sans orientation.
Les plasmides sont ensuite amplifiés dans des bactéries XL1 Blue compétentes.
Criblage des banques
Le Kit DIG high Prime DNA labeling and détection starter kit 11 de Boehringer a été utilisé pour détecter les clones positifs dans XL 1 blue. La sonde a été réalisée par marquage d'ADN CELO total digéré par Hind III ou Sali avec du digoxige-nine-dUTP. Les clones sont transférés et fixés sur membranes de nylon spéciales pour colonies (Boehringer). Les étapes d'hybridation et de détection sont effectuées dans les conditions décrites par le fabricant. L'hybridation est faite dans un tampon 50 % formamide à une température de 42°C sur une nuit. La révélation se fait par chemiluminiscence. Les clones repérés positifs sur les autoradiographies sont rccriblés une deuxième fois. Les troubles positifs sont amplifiés puis séquences.
Analyse des séquences Les séquences nucléiques sont analysées à partir du logiciel MacDNASIS version 3.5 Hitachi Software par comparaison avec la séquence du CELO (Chiocca, 1996, u46933) représentée à la Figure 1.
Cinétique par RT-PCR (transcriptasc reverse et PCR) On effectue une ARN-PCR avec un traitement préalable à la DNase I. Dans un premier temps, les ADNc sont synthétisés dans une réaction de 20 μl (Huang, 1996) contenant pour 1 μg d'ARN : 1 x PCR buffer II (Boehringer), 5 mM MgC12, 1 mM dNTP mix, 1U DNAsel 20U RNase inhibiteur, 2,5 μM oligo(dt)15, 1 μM hexanucléotides. La réaction de DNAsel est placée 2 heures à 37°C puis 5 minutes à 75°C pour détruire l'enzyme. Un microlitre de 50U/μl murine leukemia virus (MuLV) reverse transcriptase est ajouté suivi d'un cycle de 42°C pendant 30 minutes de RT, de 5 minutes à 90°C et d'un retour à 4°C. Dans les contrôles négatifs la reverse transcriptase est remplacée par 2 μl d'H20 RNase free. Deux microlitres de ce stock dilué au 1 :30 sont ajoutés à 23 μl de réaction PCR, pour un volume final de 25 μl contenant : l x PCR bu fier 11, 2 mM MgCI2, 25 pmol de chaque primer, I mM dNTP mix, et 0,5U Taq polymérase (Boehringer). Les conditions d'amplification varient en fonction des amorces choisies. Le nombre de cycles varie entre 25 et 34.
5' race
Le kit Marathon cDNA amplification de Clontech a été utilisé. Dans un premier temps, des ADNc simples brins à partir d' 1 μg d'ARN extraits de cellules infectées ont été réalisés. Des amorces o!igo(dT)15 liguées à un adaptateur EcoRi-Notl et la reverse transcriptase MuLV ont été utilisées. Après la synthèse du deuxième brin les ADNc sont rendus à bouts francs au moyen de la T4DBA polymérase. Un adaptateur Notl- Sfrl-Xmal spécifique est fixé aux extrémités. Des amplifications ont ensuite été effectuées par PCR (réaction en chaîne à la polymérase) avec une amorce sens A I spécifique de cet adaptateur et une amorce antisens choisie en 5' de nos ORFs (généralement dans la région de l'ATG). Les produits d'amplification sont ensuite séquences et analysés sur MacDNasis.
Exemple 1 L'ADN génomique de l'adénovirus aviaire CELO (sérotype 1 ), virus à ADN double brin, est séquence entièrement (cf. Figure 1). L'ADN est obtenu après culture sur des oeufs S. P. F. (exempts de pathogène spécifique) embryonnés et récoltés quelques jours après infection de liquide allantoïdien. Il est purifié par les protocoles classiques de purification de virus. Environ 300 μg d'ADN viral (soit environ 150 oeufs embryonnaires infectés) sont isolés pour un litre de liquide allantoïdien infecté. L'ADN de l'adénovirus aviaire CELO (sérotype 1) comporte ainsi 43 804 pb et code pour au moins une quarantaine de gènes.
La transcription de son génome est étudiée de façon détaillée. Pour cela, on utilise un modèle de culture cellulaire infectée in vitro par l'adénovirus aviaire CELO (cellules embryonnaires de reins de poulet S.P.F.). Les ARNs messagers produits par ces cellules infectées sont extraits à divers temps post-infection et employés à la constitution de banques d'ADNc. Le criblage est ensuite effectué au moyen d'un kit d'hybridation à la digoxygénine. Dans ces conditions, il est établi un modèle transcriptionnel pour l'adénovirus aviaire CELO.
Les diverses zones promotrices ont été localisées, principalement pour les gènes ORFl, ORF2 (promoteur situé vers 350-510), pour les gènes tardifs avec le promoteur majeur tardif (major late promoter : MLP, situé vers 7 3 10 - 7 520) et ses deux « leaders » Ll et L3 (situés respectivement à 7 533 - 7 545 (22 pb) ; et 1 1 285 - 1 1 13 (129 pb), pour le gène ORF22 (promoteur vers 43 400 - 43 700), pour les gènes OR l 8 et 1 (promoteur vers 36 460 - 36 770)
La connaissance précise des épissages des ARNs messagers déduite du modèle transcriptionnel permet de localiser les parties non essentielles et essentielles du génome de l'adénovirus aviaire CELO et de prédire les zones d'insertion d'ADN exogène et/ou de délétion d'ADN adénoviral. Cette connaissance précise permet d'établir les méthodes de préparation de vecteurs adénoviraux aviaires recombinants suivantes : A) Insertions, adénovirus aviaire CELO recombinant réplicatif (cf. Figure 5). Les résultats obtenus précédemment sur la transcription permettent de déterminer les sites putatifs d'insertion d'ADN exogènes (de 2,5 kb au maximum). Les sites suivants sont repérés en coordonnées numériques (pb) relatives à la séquence de la figure 1.
1/ vers ORF 1 : entre 600 et 650, entre 750 et 780, pas de perturbation sur l'autre brin,
2/ vers ORF3 : entre 3 380 et 3 520, pas de perturbation pour la transcription d'ORF3,
3/ après l'ADN polymérase : entre 10 160 et 10 260 (éviter éventuellement un signal poly A), 4/ entre pTP et 52K : 12 160 à 12 180,
5/ entre les deux signaux de polyadénylation et DBP : 21 775 à 21 818, 6/ entre le codon stop 100K et la réinitiation de pVHI (en respectant le leader d'ORF12) : 26 650 à 27 060,
7/ entre poly A pVIII (27 970) et début d'initiation fibre 1 (28 170), 8/ entre 30 500 et 30 510 (entre les deux fibres ; en antisens par rapport aux deux fibres),
9/ entre démarrage OFR22 et stop ORF21 : 32 480 à 32 730, 10/ entre initiation ORF20 : 33 720 à 33 880,
1 1/ entre a/ 36 210 et 36 340 : zone non transcrite, b/ 36 640 et 36 740, 12/ entre fin d'ORF7 et début d'ORF8 : 37 220 à 37 380, 13/ entre 38 280 à 38 650 ; rien de transcrit dans cette zone,
14/ entre 42 380 à 43 040.
Si l'on suppose que la capacité d'encapsidation est de 105 %, pour l'adénovirus aviaire CELO de 43 804 kb on peut insérer au maximum 2,4 kb d'ADN exogène, soit un gène à intérêt vaccinant, ou thérapeutique, ou une enzyme impliquée dans une voie métabolique et environ 400 pb d'un promoteur spécifique (placé en sens ou en antisens de la transcription naturelle dans cette zone).
L'incorporation de cet ADN exogène est faite selon les méthodes bien connues de l'homme de l'art. On peut citer par exemple : a) soit par recombinaison homologue (cf. Figure 6) : la totalité du génome de l'adénovirus CELO a été sous clonée dans un plasmide par ce type de méthode
(CHART1ER, C. et al., 1996, J. of Virology, 70, 7, 4805-4810). De la même façon, on insère l'ADN exogène au site choisi en tenant compte des sites de restriction unique autour de la zone d'insertion (CHIOCCA, S. et al., 1996) ; b) soit par construction classique : à partir de plasmides porteurs de la région d'insertion, puis réintégration par étapes successives dans des plasmides de plus en plus larges. La dernière étape consiste à substituer le fragment sauvage dans le plasmide portant la totalité du génome de l'adénovirus aviaire CELO par le nouveau. Cette voie est également possible à partir de 4 plasmides qui représentent la totalité du génome de l'adénovirus aviaire CELO divisé en 4 fragments (cf. Figures 7 et 8) : fragment A (Pacl/Pmel) : 7 430 pb fragment B (Pmel/Notl) : 9 956 pb fragment C (Notl/Fsel) : 18 298 pb fragment D (Fsel/Pacl) : 8 116 pb, permettant à chaque fois, quel que soit le site d'insertion, de reconstituer artificiellement l'adénovirus recombinant voulu.
La zone M à modifier est entourée de deux sites de restriction unique dans le fragment : X et Y. Le sous fragment XY est sous clone dans un plasmide et rectifié par mutation, délétion ou insertion.
Après la modification XY est réintégré dans pBS/KS+ fragment A. Possibilité de recombinaison homologue avec le plasmide ppolyll/cclo rec qui contient tout le génome CELO (cf. Figures 2, 3 et 4).
Possibilité de remplacer le fragment A de ppolyll/celo rec par le fragment A modifié.
Tous ces cas d'insertion reposent sur les résultats de la précédente étude de transcription du génome de l'adénovirus aviaire CELO. Le promoteur utilisé pour la construction exogène est choisi parmi les promoteurs suffisamment forts pour exprimer l'ADN exogène. L'adénovirus recombinant restant réplicatif, permet d'utiliser des doses d'administration en titre de virus moyennes à faibles. La taille de l'insert est cependant limitée dans ce cas à un maximum de 2,4 kb. B) Délétions, virus réplicatif (cf. Figure 5)
Ces délétions sont basées essentiellement sur les résultats concernant l'étude de la transcription du génome de l'adénovirus aviaire CELO obtenus précédemment. Le modèle cellulaire choisi pour ladite étude (cellules embryonnaires de reins de poulet) permet d'obtenir le cycle réplicatif et lyrique complet de l'adénovirus, mettant en évidence que les gènes non trancrits ne sont pas indispensables à la survie « in vitro » de l'adénovirus et qu'il est possible de les déléter. On obtient alors des vecteurs réplicatifs délétés susceptibles de porter un ou plusieurs gènes d'intérêt.
Ces constructions, très similaires au virus naturel, déclenchent des réactions immunitaires classiques contre ce type d'adénovirus recombinant, ce qui permet d'utiliser ces vecteurs recombinants comme vaccin. Il existe donc 3 sites de délétions possibles, les gènes correspondants n'ayant pas été détectés ni en banque ADNc, ni par RT-PCR (« Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction » : l'une des techniques d'identification les plus sensibles disponibles à l'heure actuelle).
1/ Elimination de 1ORF2 : de 1 970 à 2 850 (880 pb libérées) Cette délétion permet avec une augmentation de taille de 5 % de disposer théoriquement d'environ 3 kb pour une insertion) ; ce gène sur le brin « up » n'a pas de contrepartie sur le brin « down ». Il semble être une des positions privilégiées pour les délétions, même si les signaux de polyadénylation pour pTP, DNA pol. et IV a2 peuvent passer par cette zone. On ne ferait qu'augmenter la taille des ARNs messagers correspondants dans leur partie 3' non traduite
2/ Elimination de PORF6 : cette zone est plus critique, car elle comporte le leader de IORF22 (de 33 070 à 33 204 : 135 pb) à respecter pour que sa transcription s'accomplisse normalement (gène important, car il appartient aux gènes précoces apparaissant dès 4 heures post-infection). On trouve aussi la zone de terminaison de IORF20, et une partie de PORF5 (dans sa partie codante, néanmoins ce dernier gène n'a jamais été mis en évidence avec les divers moyens techniques utilisés jusqu'alors). Tenant compte de ces divers éléments, on peut déléter la zone entre 33 210 et 33 450 (soit 240 pb, ce qui, joint à l'augmentation de taille, permet l'adjonction d'environ 2,5 kb d'ADN exogène).
3/ ORF14 : ce gène situé sur le brin « down » n'a pas été décelé par nos techniques (banques ADNc et RT-PCR). On pourrait ainsi supprimer une zone allant de 1 970 à 3 520 (1 550 pb). Il semble cependant que la zone 3 000 à 3 120 serve de promoteur à 1ORF3. En tenant compte de la délétion sur IORF2, on peut donc déléter deux zones : de 1 970 à 3 000 et de 3 130 à 3 520, libérant 1 030 pb et 390 pb respectivement.
C) Lignées transcomplémentantes et virus défectif, système Cre-recombinase Avec ces techniques bien connues de l'homme de l'art (voir par exemple
WANG, Q.J.X. et al., 1995, Gène Thérapie, 2, 775-783 et ZHOU, B., 1996, J. Virol., 70, 7030-7038) et la connaissance de la localisation des parties essentielles et non essentielles sur le génome de l'adénovirus aviaire CELO, il est possible d'obtenir des vecteurs adénovirus aviaires CELO recombinants défectifs, de titre suffisant, à grande capacité d'insertion d'ADN exogène pouvant atteindre 43 kb, notamment par la méthode Cre-recombinase d'excision de gène.
Les gènes à remplacer dans les cellules transcomplémentantes sont plus ou moins longs, fonction de la délétion choisie et de la longueur de l'ADN exogène à insérer. La figure 10 représente comme exemple le schéma général du procédé de préparation de vecteurs vaccinants CELO défectifs recombinants à partir de cellules transcomplémentantes rétrovirales de type Isolde, la réplication du vecteur vaccinant étant assurée par la lignée cellulaire LMH, préalablement transformée par le rétrovirus, après transfection par le vecteur vaccinant recombinant.
On peut citer l'exemple ci-après, comme exemple de délétion de parties essentielles nécessitant l'utilisation de cellules transcomplémentantcs pour obtenir la réplication de l'adénoviais aviaire CELO recombinant.
Délétion de 1ORF7 : il faut alors complémenter avec les produits des gènes ORF 18 et ORF 19 situés sur le brin opposé (brin down) mis en évidence en banque ADNc et RT-PCR (gènes très précoces à précoces dès 2 heures et 4 heures après injection et dont, par conséquent, le rôle est essentiel pour le cycle viral. La suppression de 1ORF7 peut se faire de 35 620 à 36 440 (soit 820 pb libérées ; avec l'augmentation de taille de 5 %, possibilité d'insertion d'environ 3 kb).
Exemples de lignée transcomplémentante a) Lignée transcomplémentante pTP : La pTP se fixe aux extrémités de l'ADN du génome de l'adénovirus aviaire
CELO (ou de tout autre recombinant porteur des ITR à ses extrémités) et par sa présence favorise la réplication de la matrice virale, en favorisant la fixation de la l'ADN polymérase et de la DBP (« DNA Binding Protein », vitale pour l'élongation avec l'ADN pol de la matrice virale). Cette lignée peut donc de cette manière favoriser la production des constructions d'adénovirus aviaire CELO recombinant pour fournir des titres très élevés. Dans le rétrovirus porteur de la pTP, on peut placer cette dernière sous le contrôle d'un promoteur inductible (heat-shock promoter, hormono-dépendant ou tétracycline dépendant ; dans ce dernier cas, le promoteur fonctionnera en présence de tétracycline dans le milieu). Nous avons montré que la pTP utilise le leader de 1ORF12, et le leader γ de la DBP, on peut faire ainsi une construction appropriée pour avoir, avec ces éléments, une efficacité de production maximale de la pTP. On libère ainsi sur l'ADN génomique de l'adénovirus aviaire CELO de 10 170 à 1 1 280, soit 1, 1 kb, ceci afin de ne pas toucher au leader 3 utilisé par les gènes tardifs. Néanmoins, l'adénovirus aviaire CELO recombinant peut utiliser la totalité de la partie codante de la pTP (de 10 170 à 12 050 soit 1 880 pb), à condition de réinsérer le leader 3 dans la construction du recombinant afin que les gènes tardifs puissent s'exprimer sans problème. Lignée transcomplémentante DBP :
La connaissance exacte de la transcription de la DBP permet d'envisager 3 constructions possibles : l'ORF DBP seul, l'ORF DBP + leaders ε et γ et, l'ORF DBP avec tous ses leaders : α, β, ε et γ. La stabilité de l'ARNm correspondant pourrait être supérieure avec les leaders. Dans tous les cas, on libère la zone correspondante dans la
DBP s'étendant (sur le brin « down ») de : 21 800 à 23 170, soit une place de 1 ,37 kb sur l'adénovirus aviaire CELO recombinant et ceci sans toucher à aucun autre gène
(juste entre EP endopeptidase et 100 K).
Lignées transcomplémentantes et gènes tardifs : On transcomplémente des unités tardives en totalité à l'aide de rétrovirus dont les constructions sont représentées selon la figure 9 les schémas ci-contre. Les entités
L2, ou L3, ou L2 + L3, voire L2 + L3 + D.B.P.
- Dans le premier cas : entité L2 (penton à pX) : 16 050 à 17 540, libération d'environ 1,5 kb. - Dans le deuxième cas : entités L2 + L3 (penton à E.P.) : 16 050 à 21 800, libération d'environ 5 kb.
- Dans le troisième cas : entités L2 + L3 + DBP : 16 050 à 23 170, libération de 7 kb environ.
(En fait, du début réel du penton vers 15 100 à E.P. ; 21 800, il y a 6 700 pb, soit envirion 7 kb). L'entité L2 (15 100 à 17 560) fait 2.460 pb, l'entité L3 (17 540 à 21 800) fait 4 260 pb.
De même, selon les mêmes schémas, on peut effectuer les délétions des entités suivantes : L4 (pVIII, 100 K, entre les ORF 12 et 22 : 27 100 et 31 790 : 4 690 pb). L5 (fibres 1 et 2) et L4 + L5, selon des schémas équivalents à ceux utilisés précédemment : 100 K début : 23 180 à 27960 (fin pVIII) : 4 780 pb.
Fibre 1, début : 28 100 à 31 800 (fin fibre 2) : 3 700 pb, d'où une libération totale de 8 480 pb. Lignées transcomplémentantes de type 293 :
Comme les adénovirus humains avec les gènes immortalisants E1A et E1B, il peut exister des équivalents de ces gènes chez l'adénovirus aviaire CELO. Il y aurait donc un gène immortalisant équivalent à E1A, favorisant la multiplication cellulaire (à rechercher parmi les gènes très précoces) et un gène empêchant l'apoptose comme le fait E1B. D'après une publication récente (CHIOCCA, S. et al, 1997, J. Virol., 71, 3 168-3 177) on sait qu'il s'agit de IORF8 (gène à effet anti-apoptose, de type Bcl2 dans son mode d'action).
- Parmi les gènes candidats très précoces, il y a : ORF4, ORF5, ORF 16, ORF 18, ORF 19, ORF20 et ORF21. Les ORF4 et ORF 18 semblent les plus pertinents pour ce faire.
On teste les combinaisons ORF8 + ORF4 (combinaison la plus pertinente), ORF8 + ORF4, ORF8 + ORFl 8, ORF8 + ORF 19, ORF8 + ORF5, ORF8 + ORF 16, ORF8 + ORF20 et ORF8 + ORF21, sur cellules embryonnaires de foie ou de rein de poulet. Puis on retient la combinaison permettant d'obtenir l'immortalisation ce qui offre la possibilité d'avoir un système équivalent à la lignée 293 de GRAHAM (GRAHAM, F.L. et al., 1977, J. Gen. Virol., 36, 59-72, SHAAK, O„ 1995, J . Virol., 69, 4079-4085).
Autres lignées transcomplémentantes particulières : 100 K : libère en tenant compte du leader β de l'ORF 12 : 24 800 à 27 060, soit environ 2,2 kb.
En enlevant la totalité de la 100 K : 23 670 à 27 050, environ 3,38 kb sont libérés, à condition de recréer artificiellement le leader β de l'ORF 12 (27 068 à 27 095 : 28 pb) pour obtenir une transcription fonctionnelle de ce dernier cadre de lecture. Partie gauche du Celo : de 300 à 5 300, environ 5 kb libérés, complémentant pour les ORFs 1, 2, 3, 14 et 15 avec obligation de recréer un promoteur pour ORF4 dans la construction et pour ORF 15, décelé comme précoce dès 4 h après injection en RT- PCR).
Lignées transcomplémentantes. système Cre-recombinase La figure 11 représente comme exemple le schéma général du procédé de préparation de vecteurs vaccinants CELO défectifs recombinants suivant le système Cre-recombinase, à partir de cellules transcomplémentantes rétrovirales de type Isolde. La réplication ou production du vecteur vaccinant est assurée par la lignée cellulaire LMH, préalablement transformée par un rétrovirus recombinant Cre-recombinase, après co-transfection par le vecteur vaccinant recombinant et un adénovirus assistant.

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode de préparation d'un adénovirus aviaire CELO recombinant, caractérisée en ce qu'on insert dans une partie non essentielle de son génome une séquence d'ADN codant pour tout ou partie d'un polypeptide hétérologue à l'adénovirus aviaire CELO.
2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite séquence d'ADN comprend en outre les éléments susceptibles d'assurer l'expression dudit polypeptide hétérologue dans une cellule infectée par ledit adénovirus recombinant.
3. Méthode selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisée en ce que la partie non essentielle correspond à une zone intergénique non codante de l'adénovirus aviaire CELO.
4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la partie non essentielle correspond à une zone choisie parmi les sites suivants, repérés en coordonnées numériques (pb) relatives à la séquence telle que définie à la figure 1 : a) entre 600 et 650, b) entre 750 et 780, c) entre 3 380 et 3 520, d) entre 10 160 et 10 260, e) entre 12 160 et 12 180, f) entre 21 775 et 21 818, g) entre 26 650 et 27 060, h) entre 27 970 et 28 170, i) entre 30 500 et 30 510, j) entre 32 480 et 32 730, k) entre 33 720 et 33 880, 1) entre 36 210 et 36 340, m) entre 36 640 et 36 740, n) entre 37 220 et 37 380, o) entre 38 280 et 38 650, p) entre 42 380 et 43 040.
5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle comporte en outre une étape de délétion d'au moins une partie non essentielle du génome de l'adénovirus aviaire CELO.
6. Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que ladite partie non essentielle est choisie parmi les parties suivantes, repérées en coordonnées numériques (pb) relatives à la séquence telle que définie à la figure 1 : a) partie comprise entre 1 970 et 2 850, b) partie comprise entre 1 970 et 3 000, c) partie comprise entre 3 130 et 3 520, d) partie comprise entre 33 210 et 33 450.
7. Méthode selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle comporte en outre une étape de délétion d'au moins une partie essentielle du génome de l'adénovirus aviaire CELO.
8. Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite partie essentielle du génome de l'adénovirus aviaire CELO est choisie parmi les parties suivantes, repérées en coordonnées numériques (pb) relatives à la séquence telle que définie à la figure 1 : a) partie comprise entre 300 et 5 300, b) partie comprise entre 10 170 et 11 280, c) partie comprise entre 15 100 et 17 560, d) partie comprise entre 15 100 et 21 800, e) partie comprise entre 16 050 et 17 540, f) partie comprise entre 16 050 et 21 800, g) partie comprise entre 16 050 et 23 170, h) partie comprise entre 17 540 et 21 800, i) partie comprise entre 21 800 et 23 170, j) partie comprise entre 23 180 et 27960, k) partie comprise entre 23 670 et 27 050, 1) partie comprise entre 24 800 et 27060, m) partie comprise entre 27 100 et 31 790, n) partie comprise entre 28 100 et 31 800, o) partie comprise entre 35 620 et 36440.
9. Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que l'étape de délétion conduit à l'obtention d'un adénovirus aviaire CELO recombinant comportant au moins 2 séquences d'acide nucléique codant pour un ITR et une séquence d'acide nucléique codant pour un signal d'encapsidation T.
10. Méthode selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que la séquence d'ADN code pour un polypeptide hétérologue d'intérêt.
1 1. Méthode selon la revendication 10, caractérisée en ce que le polypeptide hétérologue d'intérêt est un polypeptide antigénique.
12. Méthode selon la revendication 11, caractérisée en ce que le polypeptide antigénique est un déterminant antigénique d'agent infectieux responsable de maladie infectieuse chez les animaux, de préférence chez les espèces aviaires.
13. Méthode selon la revendication 12, caractérisée en ce que la maladie infectieuse est choisie parmi la maladie de Marek, la bronchite infectieuse, la larynchotrachéite, le gumboro ou la maladie de Newcastle.
14. Méthode selon la revendication 10, caractérisée en ce que le polypeptide hétérologue d'intérêt est un polypeptide intervenant dans le métabolisme, de préférence aviaire, ou humain.
15. Vecteur, caractérisé en ce qu'il comprend un adénovirus aviaire CELO recombinant obtenu par une méthode selon l'une des revendications 1 à 14.
16. Vaccin caractérisé en ce qu'il contient un vecteur selon la revendication 15.
17. Vaccin selon la revendication 16, pour la protection d'espèces aviaires contre les maladies infectieuses.
18. Cellule transformée par un vecteur selon la revendication 15.
19. Cellule selon la revendication 18, caractérisée en ce qu'elle est une cellule eucaryote permettant la réplication d'un adénovirus aviaire CELO recombinant défectif.
20. Procédé de préparation in vivo d'un polypeptide d'intérêt recombinant, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre l'infection d'un animal par un vecteur selon la revendication 15 dont ladite séquence d'ADN insérée code pour ledit polypeptide d'intérêt, et en ce que ledit polypeptide d'intérêt est ensuite extrait dudit animal.
21. Procédé de préparation d'un polypeptide d'intérêt recombinant, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre la culture de cellules selon la revendication 18.
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