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WO1999005529A1 - Detection d'une proteine du cycle de tyrosination-detyrosination de la tubuline ainsi que ses applications - Google Patents

Detection d'une proteine du cycle de tyrosination-detyrosination de la tubuline ainsi que ses applications Download PDF

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WO1999005529A1
WO1999005529A1 PCT/FR1998/001644 FR9801644W WO9905529A1 WO 1999005529 A1 WO1999005529 A1 WO 1999005529A1 FR 9801644 W FR9801644 W FR 9801644W WO 9905529 A1 WO9905529 A1 WO 9905529A1
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WO
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tubulin
ttl
cells
proteins
tissue sample
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Application number
PCT/FR1998/001644
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Inventor
Didier Job
Laurence Lafanechere
Robert L. Margolis
Jürgen WEHLAND
Original Assignee
Commissariat A L'energie Atomique
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Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat A L'energie Atomique filed Critical Commissariat A L'energie Atomique
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57496—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving intracellular compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)

Definitions

  • the present invention relates to a method for screening and / or prognosis of cancer by detecting a protein of the tyrosination-detyrosination cycle of tubulin (absence of tubulin-tyrosine ligase (TTL) and / or presence of tubulin ⁇ 2) as well as a screening and / or prognosis kit (metastatic potential, invasiveness, speed of tumor development) of cancer.
  • TTL tubulin-tyrosine ligase
  • ⁇ 2 tubulin-tyrosine ligase
  • Microtubules form, with the filaments of actin and intermediate filaments, the cytoskeleton of eukaryotic cells.
  • Microtubules are protein organelles composed of tubulin molecules, assembled into tubular structures of about 25 nm in diameter, up to several tens of micrometers in length.
  • Microtubules play multiple roles in the cell. They play a central role in the genesis and maintenance of the shape of cells. During the interphase, they organize the intracellular space and are responsible for the intracellular transport of organelles. They are essential for cell division; in fact, during mitosis, they reorganize to form the mitotic spindle, responsible for the distribution of chromosomes between the two daughter cells. In the nervous system, microtubules are also directly involved in neurite growth and axonal transport.
  • tubulin formed of two subunits ( ⁇ and ⁇ ), exists in several isoforms. This diversity is generated at two levels: - the selective transcription of one or more genes coding for each subunit,
  • tubulin a variety of post-translational modifications of tubulin, such as its acetylation (Piperno G. et al., J. Cell Biol., 1985, 101, 2085-2094), its phosphorylation (Gard D. et al., 1985, J. Cell Biol., 1985, 100, 764-774), its glutamyation (Edmü B. et al., Science, 1990, 247, 83-85), its polyglycylation (Redeker V. and al., Science, 1994. 266, 1688-1691) or its tyrosination (Barra HS. et al., 1988, 2, 133-143).
  • tyrosination-detyrosination cycle of tubulin is illustrated in FIG. 1.
  • * p + 9Xtubulin exists in a tyrosine form (tyrosine tubulin or tubulin-tyr) and in a detyrosine form (dety- rosine tubulin or tubulin-glu); the passage from one to the other of these forms brings into play two specific enzymes which act at the level of the carboxy-terminal end of the ⁇ subunit of tubulin: the tyrosine residue is cleaved from the main polypeptide chain by a tubulin-carboxypeptidase (TCP) or added by a specialized enzyme, tubulin-tyrosine-ligase (TTL) (see Figure 1).
  • TCP tubulin-carboxypeptidase
  • TTL tubulin-tyrosine-ligase
  • This cycle which is absolutely specific to tubulin, includes the synthesis of a peptide bond without the participation of ribosomes.
  • tubulin isoform resistant to tyrosination
  • Tubulin ⁇ 2 tubulin ⁇ 2 + tubulin ⁇ 2
  • tubulin ⁇ 2 is present in neurons (Purkinje cells, granular neurons) but cannot be detected in glial cells. In non-neuronal cells, tubulin ⁇ 2 is normally absent, with the exception of spermatozoa and hair cells, where the microtubular structures are stabilized.
  • TTL tubulin-tyrosine ligase
  • the Applicant has set itself the goal of developing a test for screening and / or prognosis of tumors on the basis of these properties (function of TTL tumor suppressor and appearance of tubulin ⁇ 2 in cancer cells).
  • the subject of the present invention is a method for screening and / or prognosis of a tumor, characterized in that it comprises the detection, in a tissue sample or in a biological fluid, of a protein of the tyrosination-detyrosination cycle tubulin, selected from the group consisting of tubulin-tyrosine ligase, tubulin ⁇ 2 and / or an antibody directed against one of these proteins.
  • said detection comprises:
  • tissue sample concentrate and / or purify and / or dissolve the ⁇ 2 tubulin or the cytoplasmic TTL.
  • tissue sample or said fluid into contact with at least one reagent selected from the group consisting of tubulin-tyrosine ligase, ⁇ 2 tubulin, the immunoreactive peptides derived from said proteins and the antibodies directed against these proteins and - the revelation of the complex, possibly formed, by any appropriate means, such as EIA, RIA, immunofluorescence.
  • at least one reagent selected from the group consisting of tubulin-tyrosine ligase, ⁇ 2 tubulin, the immunoreactive peptides derived from said proteins and the antibodies directed against these proteins and - the revelation of the complex, possibly formed, by any appropriate means, such as EIA, RIA, immunofluorescence.
  • tissue sample is meant, within the meaning of the present invention, both a tissue homogenate and a tissue cut; this term also includes dissociated tissues, treated so as to return the cells to culture.
  • tissue sample is meant, within the meaning of the present invention, both a tissue homogenate and a tissue cut; this term also includes dissociated tissues, treated so as to return the cells to culture.
  • tissue sample is meant, within the meaning of the present invention, both a tissue homogenate and a tissue cut; this term also includes dissociated tissues, treated so as to return the cells to culture.
  • to detect the tubulin ⁇ 2 possibly present in a tissue biopsy it is possible and this, without limitation, to treat the tissue sample, according to one of the following protocols:
  • direct method a specific anti-tubulin ⁇ 2 antibody is labeled with a fluorescent compound and brought into contact with the tissue sample;
  • indirect method the unlabeled anti-tubulin ⁇ 2 antibody is applied to the tissue sample; a labeled antibody directed against the Ig of the species from which the specific antibody originates, reveals its fixation;
  • the technique is based on the link between the labeled ⁇ 2 tubulin or a specific peptide (reproducing the specific sequence of the ⁇ 2 tubulin) and a standard antibody specific for this tubulin.
  • the mixture of these two reagents leads to the formation of soluble immune complexes, dissociable by cold ⁇ 2 tubulin (or a specific cold peptide), possibly present in the sample to be analyzed.
  • This technique requires physical separation of the ⁇ 2 tubulin or of the free and bound radioactive peptide.
  • the principle is the same as that of radioimmunoassays, except that the antigen or antibody is covalently linked to an enzyme instead of being labeled as a radioisotope.
  • the enzyme usually horseradish peroxidase, alkaline phosphatase or ⁇ -galactosidase, is visualized by color reaction with the substrate.
  • a competition technique can be used to measure the ⁇ 2 tubulin. It is the tubulin ⁇ 2 or a specific peptide which is always fixed on the microplates. A mixture of tissue sample, optionally treated as specified above, and small amounts of anti-tubulin ⁇ 2 antibody is added. The the quantity of antibody fixed on the microplate is all the lower the more the ⁇ 2 tubulin molecules present in the sample to be analyzed have neutralized more antibody molecules;
  • sandwich methods can also be used to assay ⁇ 2 tubulin in tissue samples that may be treated: microplates are coated with anti-tubulin antibodies; the sample to be analyzed is added and then an anti-tubulin antibody, different from the antibody fixed on the microplates, coupled to an enzyme is applied and revealed by the addition of the substrate.
  • Immunotransfer or western blot This test is more specifically carried out on samples in which the protein to be detected is dissolved; it comprises a separation and a transfer of the proteins before contacting with the reagent; for example, the cell or tissue sample is prepared by lysing the cells or the tissue homogenate with an adequate buffer, in the presence of protease inhibitors to avoid any enzymatic degradation.
  • the electrophoresis is carried out in a polyacrylamide gel according to the Laemmli technique, then the proteins, including optionally the ⁇ 2 tubulin, of the gel are transferred to a nitrocellulose filter (or any other suitable filter); the nitrocellulose filter is recovered and incubated with the anti-tubulin antibody ⁇ 2, then the tubulin ⁇ 2-anti-tubulin antibody ⁇ 2 complex is revealed by an anti-immunoglobulin antibody (secondary antibody) labeled with peroxidase (or with any other enzyme suitable) or by a radioisotope.
  • a nitrocellulose filter or any other suitable filter
  • the nitrocellulose filter is recovered and incubated with the anti-tubulin antibody ⁇ 2
  • the tubulin ⁇ 2-anti-tubulin antibody ⁇ 2 complex is revealed by an anti-immunoglobulin antibody (secondary antibody) labeled with peroxidase (or with any other enzyme suitable) or by a radioisotope.
  • the indirect method is suitable for assaying anti-tubulin ⁇ 2 antibodies.
  • a specific peptide of tubulin ⁇ 2 or tubulin ⁇ 2 itself, is fixed on a microplate.
  • the serum to be assayed is first pre-incubated with a peptide specific for excess tubulin-tyr, so as to eliminate the non-specific anti-tubulin antibodies from tubulin ⁇ 2. Then, the serum to be assayed is added to the microplate and the binding of anti-tubulin ⁇ 2 antibodies is detected by the addition anti-IgG antibodies, coupled to an appropriate enzyme and quantitatively revealed on the spectrophotometer after addition of the enzyme substrate;
  • TTL tumor suppressor
  • the method may include only detecting TTL, it is more advantageous to detect tubulin ⁇ 2; indeed, a positive signal is easier to interpret than a negative signal (disappearance of TTL) and presents an amplification phenomenon.
  • tubulin-tyrosine ligase substrate namely tubulin-glu
  • tyrosine possibly radiolabelled and - detecting the tubulin-tyr produced, by any suitable means.
  • the present invention also relates to a kit or kit for screening and / or prognosis of a tumor, characterized in that it comprises, for the detection, in a tissue sample or in a biological fluid, of a protein the tyrosination-detyrosination cycle of tubulin, selected from the group consisting of tubulin-tyrosine ligase, tubulin ⁇ 2 and / or of an antibody directed against one of these proteins, in addition to useful quantities of buffers suitable for the implementation of said screening: - at least appropriate doses of a reagent selected from the group consisting of tubulin-tyrosine ligase, tubulin ⁇ 2, the immunoreactive peptides derived from said proteins and the antibodies directed against these proteins; and
  • the present invention also relates to a kit or kit for screening and / or prognosis of a tumor, characterized in that it comprises, for the detection of tubulin-tyrosine ligase in a tissue sample, in addition to useful quantities of appropriate buffers for the implementation of said screening:
  • a reagent selected from the group consisting of tubulin-glu, tubulin-tyr, the immunoreactive peptides derived from said proteins, the antibodies directed against these proteins and the reagents for assaying tyrosine; and, if necessary,
  • the present invention also relates to the use of the tubu- A ⁇ 2 as a tumor marker.
  • FIG. 1 illustrates the tyrosination-detyrosination cycle of tubulin
  • FIG. 3 illustrates the immunofluorescent labeling of NIH / 3T3 cells, before the subcloning of TTL ' cells (without tubulin-tyrosine ligase activity):
  • FIG. 3A illustrates the double labeling of the Tyr and Glu microtubules, in the presence of 'monoclonal antibodies against tubulin-tyr (TYR) or polyclonal antibodies against tubulin-glu (GLU);
  • FIG. 3B illustrates the double labeling of the microtubules Tyr and ⁇ 2, in the presence of antibodies directed against tubulin-tyr (TYR) or of antibodies directed against tubulin ⁇ 2 ( ⁇ 2).
  • FIGS. 4 and 5 illustrate the comparative analysis in immunofluorescence of subclones of TTL cells " and of NIH / 3T3 TTL cells " , transfected stably with the TTL cDNA, for their content in ⁇ 2 tubulin, tubulin-glu and tubulin-tyr.
  • FIG. 4 illustrates the results obtained with the TTL " subclone
  • FIG. 5 illustrates the results obtained with the TTL ' cell lines transfected and expressing TTL, in a stable manner.
  • These different cells are subjected to double labeling, ie with a monoclonal anti-tubulin-tyr antibody (TYR) and a polyclonal anti-tubulin-glu antibody (GLU), or with a monoclonal anti-tubulin-tyr antibody (TYR) and a polyclonal anti-tubulin ⁇ 2 ( ⁇ 2) antibody ( 20 ⁇ m scale);
  • FIG. 6 illustrates the immunoblot analysis of the content of tubulin-tyr, tubulin-glu, tubulin- ⁇ 2 (FIG. 6 A) and TTL (FIG. 6B) of NIH / 3T3 cells (3T3), of TTL cells “ (TTL " ) and TTL cells " transfected with the TTL cDNA (TTL + ).
  • the cell extracts from the various cell lines are prepared as described below in Example 1.
  • Samples (5 ⁇ l) are analyzed by procedure immunoblot to detect tubulin- ⁇ , using a monoclonal anti-tubu- line- ⁇ antibody (DM1A: "Tub) (Amersham); tubulin-tyr, using a monoclonal antibody primary anti-tubulin-tyr (YL1 / 2: TYR); tubulin-glu, using a polyclonal antibody primary anti-tubulin-glu (L3: GLU) and tubulin ⁇ 2, using a primary polyclonal anti-tubulin ⁇ 2 antibody (L7: ⁇ 2).
  • the major 50 kDa band observed corresponds to tubulin.
  • samples (5 ⁇ l) of cellular extracts are analyzed using a anti-TTL monoclonal antibody (ID3: TTL).
  • ID3 anti-TTL monoclonal antibody
  • FIG. 7 illustrates an immunoblot analysis of the total tubulin- ⁇ and tubulin-tyr, tubulin-glu and tubulin ⁇ 2 content, of nude mouse tumors and of various normal mouse tissues.
  • FIG. 7A corresponds to control cell extracts and to tumor cell extracts. Samples (5 ⁇ l) are analyzed in western blot to detect tubulin- ⁇ , tubulin-tyr, tubulin-glu and tubulin ⁇ 2, under the conditions specified above for FIG. 6. 4 series experiments are carried out; the results obtained for each series include a control track representing the cell extracts used for the injection and two other tracks which correspond to the samples of tumors obtained from two different mice (mouse 1 and mouse 2).
  • the first track corresponds to an extract of TTL cells " , obtained before injection into two different mice.
  • the second track (mouse 1 (17B12)) and the third track (mouse 2 (17B12)) of this series of experiments correspond to samples of tumors, induced in these two mice after injection of the cells.
  • the other series of experiments use TTL ' cells transfected with a plasmid expressing TTL. In each of these three other series of experiments, each of the two mice (mice 3 and 4; mice 5 and 6; mice 7 and 8) was injected with TTL " cells transfected with TTL cDNA.
  • FIG. 8A illustrates the results obtained with cells transfected with TTL cDNA (clone 17F12, mice 7 and 8), cultured either in the presence (control) or in the absence ((-) G418) of geneticin for 6 weeks; tumors are generated by injecting cells from the same clone into two mice (mice 7 and mice 8). The samples (5 ⁇ l) are analyzed in western blot to detect tubulin- ⁇ , tubulin-tyr, tubulin-glu tubulin ⁇ 2, under the conditions specified above for FIG. 6.
  • FIG. 8A illustrates the results obtained with cells transfected with TTL cDNA (clone 17F12, mice 7 and 8), cultured either in the presence (control) or in the absence ((-) G418) of geneticin for 6 weeks; tumors are generated by injecting cells from the same clone into two mice (mice 7 and mice 8). The samples (5 ⁇ l) are analyzed in western blot to detect tubulin- ⁇ , tubulin-ty
  • FIG. 9A the cells of a human breast cancer cell line (Cal 51) are either grown in vitro (culture) or injected into nude mice to induce a tumor (tumor); the cells are extracted and 5 ⁇ l of samples are analyzed in western blot, to detect total tubulin- ⁇ , using a monoclonal anti-tubulin- ⁇ antibody (DM1A: ⁇ Tub) and tubulin ⁇ 2, to using a primary polyclonal anti-tubulin ⁇ 2 (L7: ⁇ 2) antibody.
  • D1A monoclonal anti-tubulin- ⁇ antibody
  • L7 a primary polyclonal anti-tubulin ⁇ 2
  • Figure 9B small biopsies of different human tumors placed in nude mice to induce tumor growth. Tumor samples are analyzed by western blot to detect total tubulin- ⁇ and tubulin ⁇ 2, under the conditions specified above.
  • Figure 9C samples (15 ⁇ l each), consisting either of a pool of a hundred cytosols (left lane), or by cytosols of different human breast tumors (one sample per lane) are analyzed in western blot for detect the tubulin ⁇ 2 under the conditions specified above. It should be understood, however, that these examples are given solely by way of illustration of the subject of the invention, of which they do not in any way constitute a limitation.
  • Example 1 Preparation of samples and reagents for the implementation of the method according to the invention * Preparation of anti-tubulin ⁇ 2 antibodies.
  • the antibodies are obtained according to the procedure described by Gundersen et al. (Cell, 1984, 38, 779-789).
  • the sequence of the peptide used as immunogen is EGEEEGE (7 amino acid residues of the C-terminal end of the ⁇ 2 tubulin). This peptide is conjugated to KLH and injected into rabbits.
  • the IgGs obtained are purified according to the method of McKinney et al. (J. Immunol. Meth., 1987, 96, 271-278) and their specificity with respect to the ⁇ 2 tubulin is verified by western blot analysis.
  • the anti-tubulin ⁇ 2 antibodies (L7 antibody) produced are detected by an ELISA (Gundersen et al., 1984, cited above), in which the titration microplates are coated with tubulin- ⁇ 2. * Preparation of anti-tubulin tyr antibodies
  • the anti-tubulin-tyr monoclonal antibody YL1 / 2 specifically recognizes the carboxy-terminal residue of the ⁇ subunit of tyrosine tubulin (Wehland J. et al., J. Cell Biol., 1983, 97, 1467-1475 ); it is obtained according to the procedure described by Kilmartin J.V. et al., J. Cell Biol., 1982, 93, 576-582).
  • the antibodies are obtained according to the procedure described by Gundersen et al. (Cell, 1984, 38, 779-789).
  • the sequence of the peptide used as immunogen is GEEEGEE (7 amino acid residues of the C-terminal end of tubulin-glu).
  • This peptide is conjugated to KLH and injected into rabbits.
  • the specificity of the antibodies obtained is verified by ELISA in accordance with the method described by Gundersen et al. cited above.
  • the IgGs obtained are purified according to the method of McKinney et al. (J. Immunol. Meth., 1987, 96, 271-278) and their specificity with respect to tubulin-glu is verified by analysis in western blot.
  • Anti-TTL antibodies are obtained according to the procedure described in Wehland et al., J. Cell Biol., 1987, 104, 1059-1067). * Preparation of tubulin ⁇ 2, tubulin-glu and tubulin-tyr purified
  • the different tubulins are isolated and purified from beef brains, as described in Paturle et al., 1989, cited above and Paturle-Lafanechère et al., 1991, cited above. * Preparation of biological samples.
  • tissue samples can be prepared, either in a denaturing buffer (containing SDS, for example), or in any other buffer, possibly described in the prior art, which makes it possible to isolate the soluble phase of cellular or tissue homogenates.
  • a denaturing buffer containing SDS, for example
  • any other buffer possibly described in the prior art, which makes it possible to isolate the soluble phase of cellular or tissue homogenates.
  • the choice of tampon depends on the subsequent use of the tissue sample.
  • samples (heart, brain, muscle, liver, kidney and spleen) are weighed and homogenized in 1% SDS (1 ml / g of tissue), brought to the boil for 5 minutes, then centrifuged (200,000 g, 15 minutes at 20 ° C).
  • deposition buffer consisting of 125 mM Tris-HCl, 2% SDS, 10% glycerol, 10% 2-mercaptoethanol, 10% bromophenol blue, pH 6.8.
  • a human tumor cell line called Cal 51 and described in J. Gioanni et al., Brit. J. Cancer, 1990, 62, 8-13
  • a DMEM medium supplemented with 10% calf serum
  • the cells are then injected into nude mice as follows: the cells are suspended in a growth medium and
  • each cell suspension 400 ⁇ l of each cell suspension (from 1 to 2.5 ⁇ 10 6 cells) is injected subcutaneously into the scapular zone of the nude mouse, under light ether anesthesia; the tissues are frozen in. liquid nitrogen, then reduced to powder (Freezer ® mill,
  • lysis buffer Pipes-KOH 80 mM, pH 6.8, 1 mM MgCl 2 , Triton-X-100 0.5% (vol / vol), glycerol 10% (vol / vol), CaCl 2 5 mM + cocktail of protease inhibitors).
  • the lysis is carried out for 10 min at 4 ° C.
  • add 1/20 of the same buffer without CaCl 2 but containing 200 mM EGTA (EGTA 10 mM final), so as to chelate the CaCl 2 .
  • the sample is then centrifuged (200,000 g, 15 min, 4 ° C).
  • the supernatant is added with a deposition buffer (as above), brought to the boil for 3 min and stored at -80 ° C. until use.
  • Another cell line namely cells derived from NIH / 3T3 cells (ATCC CRL 1658, mouse embryonic fibroblasts), obtained after multiple passages in culture, can be used to prepare tumor samples, under the conditions set out below in example 2.. human breast cancer samples.
  • the samples, collected in the surgical wards of hospitals, are immediately frozen in liquid nitrogen and then pulverized as specified above.
  • the extraction buffer in this case consists of 100 mM Tris,
  • Cvtosolic extracts from cells in culture Recultivation of cells is not compulsory. Extracts can be produced on tissue homogenates as described above. However, the re-culture of the cells can allow, on the one hand, an amplification and, on the other hand, a subsequent sorting, by cloning for example, which can favor the detection. For example, in a tissue or in a mixed population of cells, it may be difficult to detect a decrease in TTL. If we subclone and amplify these cells without TTL (very reactive in immunofluorescence with the specific antibody of tubulin-glu and with the specific antibody of tubulin ⁇ 2), then we can detect by western blot, in ELISA, or in activity test, the decrease or loss of TTL.
  • the tissues are treated with collagenase II (200 IU / ml) for 15 h at 37 ° C in an incubator.
  • the dissociated cells are then washed 3 times with a growth medium without serum and a last time with a growth medium containing serum; the cells are transferred into 75 cm 2 flasks containing 20 ml of complete medium and readapted to cell culture.
  • the cells are trypsinized and washed twice with PB S.
  • lysis buffer containing 5 mM CaCl 2 50 ⁇ l of lysis buffer containing 5 mM CaCl 2 are added to the cell pellet and the mixture is incubated for 10 min at 4 ° C., to depolymerize the microtubules.
  • EGTA 10 mM, final concentration
  • An electrophoresis buffer (identical to the aforementioned deposition buffer) is added to the supernatant and the mixture is brought to the boil (100 ° C.) for 3 min. These samples are stored at -80 ° C. Such samples are preferably used to carry out western blots (soluble protein).
  • the protein content of the different samples varies from 1 to 3 mg / ml.
  • the pig's TTL cDNA is inserted into the eukaryotic expression vector pcDNA3 (Invitrogen), which contains a gene for resistance to neomycin.
  • the plasmids containing the insert are transfected into TTL cells " , according to the procedure described in Chen et al. (Mol. Cell. Biol., 1987, 7, 2745-2752). Briefly, cells in exponential growth are trypsinized , seeded in petri dishes at a rate of 5.10 5 cells / 10 cm and incubated overnight in 10 ml of growth medium.
  • plasmid DNA is mixed with 0.5 ml of CaCl 2 0, 25 M, 0.5 ml of 2 x BBS (BES 50 mM, NaCl 280 mM, Na 2 HPO 4 1.5 mM, pH 6.9) and the mixture is incubated for 15 min at room temperature.
  • DNA is added dropwise to the cells in culture which are maintained for 20 hours at 35 ° C., under an atmosphere enriched in CO 2 (3%).
  • the medium is then removed, the cells rinsed twice with the medium. growth, reseeded and incubated for 24 hours at 37 ° C., under an atmosphere enriched in CO 2 (6%).
  • the cells are then diluted according to a 1/10 ratio and incubated for 24 hours, before the selection of stable transformants using geneticin (750 ⁇ g / ml).
  • the isolated clones are selected using cloning rings and incubated separately in a growth medium comprising 750 ⁇ g / ml of geneticin for amplification and screening by immunofluorescence; * Antibody dilutions
  • the monoclonal antibody anti-tubulin-tyr (YL1 / 2) is used at a dilution of 1/1 000 for immunofluorescence and western words.
  • the secondary antibodies used with this antibody are rhodamine-conjugated anti-goat antibodies (1/250) for immunofluorescence or peroxidase-conjugated anti-mouse antibodies (1/5000) for western Words.
  • the purified polyclonal anti-tubulin-glu and anti-tubulin ⁇ 2 antibodies are diluted 1/500 and 1/1000 respectively for immunofluorescence and 1/100000 and 1/200000 for Western Words.
  • the secondary antibodies used with these antibodies are anti-rabbit antibodies conjugated to fluorescein (1/250) for immunofluorescence and anti-rabbit antibodies conjugated to peroxidase (1/5000) for Western Words.
  • total tubulin- ⁇ is detected using an anti-tubulin- ⁇ monoclonal antibody DM1 A (Amersham) diluted to 1/1000, which is detected using a secondary antibody anti-mouse conjugated to peroxidase (1 / 5,000).
  • the anti-TTL monoclonal antibody (ID3) is diluted to 1/1000 for its use in Western Words.
  • the cells transfected with the TTL cDNA are subcloned in a growth medium containing 750 ⁇ g / ml of geneticin, then the various tubulins (tyr, glu and ⁇ 2) are detected by immunofluorescence.
  • the pure clones (containing 100% tyr cells or 100% glue cells) are selected and amplified.
  • the cells in exponential growth are trypsinized and centrifuged (1250 rpm, 5 min, room temperature), the cells are resuspended in a growth medium and 400 ⁇ l of each cell suspension (from 1 to 2.5 ⁇ 10 6 cells) are injected subcutaneously into the scapular region of nude mice under light ether anesthesia.
  • TTL cells evidence of a correlation with the presence of ⁇ 2 tubulin and a tumorigenic state.
  • NIH / 3T3 cells derived from the ATCC CRL 1658 line, are cultured on DME medium supplemented with 10% calf serum and 1% fetal calf serum.
  • the TTL " subclones are obtained by limiting dilution, after 3 growth cycles.
  • TTL " subclones are those which do not produce tubulin-tyr.
  • the Glu microtubules represent almost all of the cytoplasmic microtubules, instead of the small subpopulation usually observed in the different cell types.
  • Tubulin-tyr is scarce and is diffuse in cytoplasmic microtubules.
  • microtubular networks of these inte ⁇ hase cells react substantially, with anti-tubulin-glu antico ⁇ s (Figure 3A).
  • FIG. 3B illustrates the NIH / 3T3 cells whose microtubules contain ⁇ 2 tubulin; this cell population is distinct from that containing tubulin-tyr ( Figure 3B, arrow).
  • tubulin ⁇ is approximately equivalent in the NIH / 3T3 cells and in the tubulin-glu subclone (FIG. 6A).
  • tubulin-glu subclone contains practically no tubulin-tyr, while it abundantly contains tubulin-glu and tubulin ⁇ 2 (FIG. 6 A).
  • the cellular extracts obtained, as specified above, are brought into contact with anti-TTL antibodies, to determine whether the abundance of microtubules containing tubulin-glu is correlated with l absence of TTL activity.
  • TTL subclone contains tubulin-tyr in abundance, very low levels of tubulin-glu (FIG. 5) and not ⁇ 2 tubulin (no reaction with anti-tubulin ⁇ 2 antico ⁇ s, Figure 5).
  • Both TTL cells "that TTL cells” containing the plasmid expressing cDNA TTL when injected into nude mice produces tumors.
  • mice injected with the same cell line give the same results.
  • tubulin ⁇ 2 As a marker for the loss of TTL activity, linked to the emergence of tumor cells.
  • tubulin-glu and tubulin ⁇ 2 are due to the loss of TTL activity, during the growth of the tumor (western blot in the presence of antico ⁇ s anti-TTL, FIG. 8B).
  • TTL can therefore be considered as a tumor suppressor.
  • Each well comprises 0.5 ⁇ g of tubulin ⁇ 2 in a carbonate / bicarbonate buffer (100 mM, pH 9.5).
  • microplates are incubated for 2 hours then washed 3 times with 0.1% PBS / Tween buffer (PBST), the anti-tubulin ⁇ 2 antibodies and frac- Tissue samples obtained from biopsies are mixed and preincubated for 45 min before 50 ⁇ l of the mixture is added / well.
  • PBST PBS / Tween buffer
  • the concentration of anti-tubulin ⁇ 2 antico ⁇ s is kept constant at 2.5 ⁇ g / well. These microplates are incubated for 1 h and washed 3 times with
  • the plates are washed 3 times with PBST and 50 ⁇ l of substrate (O-nitrophenyl- ⁇ -D-galactopyranoside or ONPG 0.8 mg / ml; 2- mercaptoethanol 7 ⁇ l / ml, in PBS) are added per well.
  • substrate O-nitrophenyl- ⁇ -D-galactopyranoside or ONPG 0.8 mg / ml; 2- mercaptoethanol 7 ⁇ l / ml, in PBS
  • the electrophoresis of the proteins obtained is carried out according to the method of Laemmli (Nature, 1970, 227, 680-685).
  • the separated proteins are transferred to nitrocellulose membranes (Schleicher and Schuell, CeraLabo), according to the method of Towbin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 4350-4344).
  • the anti-tubulin ⁇ 2 IgGs are diluted to 1/200 000.
  • Pieces of tumors are transferred just after surgical excision, in PBS containing 4% paraformaldehyde (pH 7.4), for 12 hours at 4 ° C.
  • the fixed tissue is then incubated for 12 h in PBS containing 20% of sucrose and frozen for 1 min in isopentane, at -30 ° C.
  • Sections are prepared using a cryotome at -18 ° C.
  • Immunofluorescence is carried out on floating sections, as described in Paturle-Lafanechère et al. (J. Cell. Sci., 1994). In routine, a double labeling is carried out, using simultaneously the antico ⁇ s YL1 / 2, rat monoclonal specific for tubulin-tyr (Kilmartin JV et al., 1982, cited above), and the antico ⁇ s L7, polyclonal produced in rabbit, specific for tubulin ⁇ 2 (Gundersen et al., 1984, cited above). The quality of the detection of tubulin ⁇ 2 has been greatly improved by the purification of the antico ⁇ s L7 on the heptapeptide corresponding to the C-terminal end of tubulin ⁇ 2.
  • the procedure is as follows: the cells are cultured for 1-4 days on glass coverslips, rinsed in PBS at 37 ° C., fixed for 6 min in anhydrous methanol at -20 ° C, then washed in PBS / Tween 20 at 0.1% (v / v). The cells are then incubated with suitable primary and secondary antibodies, diluted in PBS containing 0.1% BSA. The nuclei are stained with Hoechst 33258 at 1 ⁇ g / ml in PBS containing 0.1% BSA. The coverslips are mounted and observed under a microscope.
  • results illustrated below are those obtained in immunofluorescence and western blot; similar results are obtained in ELISA, when the procedure described above is followed.
  • the cell line contains normal levels of tubulin-tyr and tubulin-glu; it does not contain ⁇ 2 tubulin, as illustrated in western blot ( Figure 9 A), IF or ELISA.
  • Figure 9 A Western blot
  • IF or ELISA - Nude mouse with cancer after injection of the Cal 51 cell line.
  • tubulin ⁇ 2 is observed when there is actually development of a tumor (FIG. 9A), this indicating the loss of TTL activity.
  • FIG. 9A Various human tumors: human biopsies were analyzed, from tissues of various origins after passage through nude mice ( Figure 9B).
  • the different tumors tested are as follows: synovial sarcoma, liposarcoma, osteosarcoma, hemangiopericytome; all have tubulin ⁇ 2, with the exception of osteosarcoma.
  • TTL The disappearance of TTL constitutes a negative signal for screening for a tumor.
  • the cell extracts are produced as specified above.
  • the TTL is purified by immunoaffinity chromatography using a monoclonal antico ants specific for the ligase (antico ⁇ s LA / C4) as described in Schroeder et al. (J. Cell Biol., 1985, 100, 276-281).
  • the enzyme is then eluted with 3M MgCl 2 in 25 mM KXMES stabilization buffer, pH 6.8, 100 mM KCl, 2 mM MgCl 2 , 1 mM EGTA, 0.5 mM DTT, 20% glycerol ( v / v) and dialyzed against the stabilization buffer. We then proceed as specified above.
  • the enzymatic measurements are carried out in 50 ⁇ l of a buffer for measuring the TTL activity containing mo ⁇ holinoethanesulfonic acid K +
  • tyrosine inco ⁇ oration is measured in the presence of 3 H-tyrosine (2 ⁇ Ci / 50 ⁇ l).
  • tyrosine tubulin formed by immunodetection (ELISA or immunofluorescence), under the conditions specified above.
  • ELISA immunodetection
  • an antico ⁇ s is used which specifically recognizes the carboxy-terminal residue of the ⁇ subunit of tyrosinated tubulin (Wehland et al., J. Cell Biol., 1983, 97, 1467-1475) at a dilution of 1 / 1 OOOuß for immunofluorescence or western words.
  • the secondary antico ⁇ s used is an anti-rat goat Ig conjugated with rhodamine (1/250) for immunofluorescence or an anti-mouse goat IgG (or anti-rat) conjugated with peroxidase for western words (1 / 5,000).
  • the secondary antico ⁇ s used is an anti-mouse or anti-rat goat IgG conjugated to ⁇ -galactosidase (1/2 00 in 1% PBST / SAB).
  • EXAMPLE 5 Detection of Circulating Anti-Tubulin ⁇ 2 Antibodies
  • Example 6 In vivo study of the relationship between loss of TTL and metastases in animal models. Tumor lines are injected into the nude mouse. Tumor cells, originating from. the primary tumor and any metastases are then recovered, analyzed, readapted to in vitro culture and cloned.
  • TTL cells are much more abundant in metastases than in the primary tumor. After cloning of these cells, TTL cells " seem to have major adhesion defects. Restoration of a normal adhesion phenotype should be possible, by transferring these cells stably with the TTL cDNA.

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Abstract

Procédé de dépistage et/ou de pronostic d'un cancer par détection d'une protéine du cycle de tyrosination-détyrosination de la tubuline (absence de tubuline-tyrosine-ligase (TTL) et/ou présence de tubuline Δ2) ainsi que kit de dépistage et/ou de pronostic (potentialité métastatique, caractère invasif, vitesse de développement de la tumeur) d'un cancer. Ledit procédé comprend la détection, dans un échantillon tissulaire ou dans un fluide biologique, d'une protéine du cycle de tyrosination-détyrosination de la tubuline, sélectionnée dans le groupe constitué par la tubuline-tyrosine-ligase et la tubuline Δ2 et/ou d'un anticorps dirigé contre l'une de ces protéines.

Description

DETECTION D'UNE PROTEINE DU CYCLE DE TYROSINATION-DETYROSINATION DE LA TUBULINE AINSI QUE SES APPLICATIONS
La présente invention est relative à un procédé de dépistage et/ou de pronostic d'un cancer par détection d'une protéine du cycle de tyrosination- detyrosination de la tubuline (absence de tubuline-tyrosine-ligase (TTL) et/ou présence de tubuline Δ2) ainsi qu'à un kit de dépistage et/ou de pronostic (potentialité métastatique, caractère invasif, vitesse de développement de la tumeur) d'un cancer.
Les microtubules forment, avec les filaments d'actine et les fila- ments intermédiaires, le cytosquelette des cellules eucaryotes. Les microtubules sont des organelles protéiques composées de molécules de tubuline, assemblées en structures tubulaires d'environ 25 nm de diamètre, d'une longueur pouvant atteindre plusieurs dizaines de micromètres.
Les microtubules jouent de multiples rôles dans la cellule. Ils ont un rôle central dans la genèse et le maintien de la forme des cellules. Lors de l' interphase, ils organisent l'espace intracellulaire et sont responsables du transport intracellulaire d'organelles. Ils sont essentiels à la division cellulaire ; en effet, lors de la mitose, ils se réorganisent pour former le fuseau mitotique, responsable de la répartition des chromosomes entre les deux cellules filles. Dans le système nerveux, les microtubules sont aussi directement impliqués dans la pousse des neurites et le transport axonal.
Enfin, ils jouent un rôle central dans la motilité de cellules différenciées, comme par exemple les spermatozoïdes.
Dans les cellules, la tubuline formée de deux sous-unités (α et β), existe sous plusieurs isoformes. Cette diversité est générée à deux niveaux : - la transcription sélective d'un ou plusieurs gènes codant pour chaque sous-unité,
- une variété de modifications post-traductionnelles de la tubuline, comme son acétylation (Piperno G. et al., J. Cell Biol., 1985, 101, 2085-2094), sa phosphorylation (Gard D. et al., 1985, J. Cell Biol., 1985, 100, 764-774), sa glutamy- lation (Eddé B. et al., Science, 1990, 247, 83-85), sa polyglycylation (Redeker V. et al., Science, 1994. 266, 1688-1691) ou sa tyrosination (Barra HS. et al., 1988, 2, 133- 143).
Cette dernière modification est connue sous le nom de cycle de tyrosination-detyrosination de la tubuline et est illustré à la figure 1. Conformément à ce cycle, la *p+9Xtubuline existe sous une forme tyrosi- née (tubuline tyrosinée ou tubuline-tyr) et sous une forme détyrosinée (tubuline déty- rosinée ou tubuline-glu) ; le passage de l'une à l'autre de ces formes met en jeu deux enzymes spécifiques qui agissent au niveau de l'extrémité carboxy-terminale de la sous-unité α de la tubuline : le résidu tyrosine est clivé de la chaîne polypeptidique principale par une tubuline-carboxypeptidase (TCP) ou rajouté par une enzyme spécialisée, la tubuline-tyrosine-ligase (TTL) (voir figure 1).
Ce cycle, qui est absolument spécifique de la tubuline, inclut la synthèse d'une liaison peptidique sans participation des ribosomes.
Une autre isoforme de la tubuline, résistante à la tyrosination, a également été mise en évidence (Paturle-Lafanechère L. et al., J. Cell. Science, 1994, 107, 1529-1543 et Biochemistry, 1991, 30, 10523-10528). Il s'agit d'une forme particulière de tubuline, représentant environ 35 % de la tubuline cérébrale, qui a été dénommée tubuline Δ2. Elle comprend deux aminoacides en moins (Glu450-Tyr451), par rapport à la tubuline-tyr (voir figure 2). Cette modification de la tubuline porte sur le site d'action de la TTL, ce qui explique pourquoi cette forme de tubuline ne peut pas être tyrosinée (Rϋdiger M. et al., Eur. J. Biochem., 1994, 220, 309-320). Une étude de la localisation de la tubuline Δ2 a été réalisée (Paturle-Lafanechère et al., 1994, précité) ; elle a montré que la tubuline Δ2 est présente dans les neurones (cellules de Purkinje, neurones granulaires) mais n'est pas détectable dans les cellules gliales. Dans les cellules non-neuronales, la tubuline Δ2 est normalement absente, à l'exception des spermatozoïdes et des cellules ciliées, où les structures microtubulaires sont stabilisées.
La Demanderesse a trouvé, de manière surprenante qu'il existe une suppression sélective de la tubuline-tyrosine-ligase (TTL) dans les tumeurs, qui est directement corrélée à l'apparition de tubuline Δ2. La génération de tubuline Δ2, lors de la croissance tumorale, associée à la suppression d'activité de la TTL est patho- logique ; la tubuline Δ2 constitue donc un marqueur tumoral, particulièrement intéressant.
En conséquence, la Demanderesse s'est donné pour but de développer un test de dépistage et/ou de pronostic des tumeurs sur la base de ces propriétés (fonction de suppresseur de tumeur de la TTL et apparition de tubuline Δ2 dans les cellules cancéreuses).
La présente invention a pour objet un procédé de dépistage et/ou de pronostic d'une tumeur, caractérisé en ce qu'il comprend la détection, dans un échantillon tissulaire ou dans un fluide biologique, d'une protéine du cycle de tyrosination- détyrosination de la tubuline, sélectionnée dans le groupe constitué par la tubuline- tyrosine-ligase, la tubuline Δ2 et/ou d'un anticorps dirigé contre l'une de ces protéines.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, ladite détection comprend :
- le traitement de l'échantillon tissulaire pour concentrer et/ou puri- fier et/ou solubiliser la tubuline Δ2 ou la TTL cytoplasmiques.
- la mise en contact dudit échantillon tissulaire ou dudit fluide, avec au moins un réactif sélectionné dans le groupe constitué par la tubuline-tyrosine- ligase, la tubuline Δ2, les peptides immunoréactifs issus desdites protéines et les anticorps dirigés contre ces protéines et - la révélation du complexe, éventuellement formé, par tout moyen approprié, tel que EIA, RIA, immunofluorescence.
On entend par échantillon tissulaire, au sens de la présente invention, aussi bien un homogénat de tissu qu'une coupe de tissu ; ce terme inclut également les tissus dissociés, traités de manière à remettre les cellules en culture. De manière avantageuse, pour détecter la tubuline Δ2 éventuellement présente dans une biopsie de tissu, il est possible et ce, de manière non limitative, de traiter l'échantillon tissulaire, selon l'un des protocoles suivants :
- effectuer des coupes du tissu, fixé de manière adéquate, et immunodétecter la protéine d'intérêt ; - soumettre, après congélation et broyage dudit tissu, la poudre obtenue à un tampon d'extraction convenable ;
FΞUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) - purifier éventuellement et transférer la protéine d'intérêt ;
- dissocier les cellules et les remettre en culture, immunodétecter la protéine d'intérêt dans ces cellules, remises en culture.
Toutes les méthodes d'immunodétection et de mesure des inter- actions entre les anticorps et les antigènes peuvent être utilisées : Application à la détection de la tubuline Δ2 :
* Méthodes fluorimétriques :
. méthode directe : un anticorps spécifique anti-tubuline Δ2 est marqué par un composé fluorescent et mis en contact avec l'échantillon tissulaire ; . méthode indirecte : l'anticorps anti-tubuline Δ2, non marqué est appliqué sur l'échantillon tissulaire ; un anticorps marqué dirigé contre les Ig de l'espèce d'où provient l'anticorps spécifique, révèle sa fixation ;
* Dosages radio-immunologiques
La technique est fondée sur la liaison entre la tubuline Δ2 marquée ou un peptide spécifique (reproduisant la séquence spécifique de la tubuline Δ2) marqué, et un anticorps standard spécifique de cette tubuline. Le mélange de ces deux réactifs entraîne la formation de complexes immuns solubles, dissociables par la tubuline Δ2 froide (ou un peptide spécifique froid), éventuellement présente dans l'échantillon à analyser. Cette technique nécessite une séparation physique de la tubu- line Δ2 ou du peptide radioactif libre et lié.
* Dosages immuno-enzymatiques
Le principe est le même que celui des dosages radio-immunologiques, à la réserve près que l'antigène ou l'anticorps est lié de façon covalente à une enzyme au lieu d'être marqué paru un radio-isotope. L'enzyme, habituellement la peroxydase du raifort, la phosphatase alcaline ou la β-galactosidase, est visualisée par réaction colorée avec le substrat. Plusieurs modalités techniques peuvent être utilisées :
. une technique de compétition peut être utilisée pour doser la tubuline Δ2. C'est la tubuline Δ2 ou un peptide spécifique qui est toujours fixé sur les microplaques. Un mélange d'échantillon tissulaire, éventuellement traité comme précisé ci-dessus, et de faibles quantités d'anticorps anti-tubuline Δ2 est ajouté. La quantité d'anticorps fixée sur la microplaque est d'autant plus faible que les molécules de tubuline Δ2 présentes dans l'échantillon à analyser ont neutralisé plus de molécules d'anticorps ;
. des méthodes sandwich peuvent aussi être utilisées pour doser la tubuline Δ2 dans les échantillons tissulaires éventuellement traités : des microplaques sont recouvertes d'anticorps anti-tubuline ; l'échantillon à analyser est ajouté puis un anticorps anti-tubuline, différent de l'anticorps fixé sur les microplaques, couplé à une enzyme est appliqué et révélé par l'addition du substrat. * Immunotransfert ou western blot Cet essai est plus spécifiquement réalisé à partir d'échantillons dans lesquels la protéine à détecter est solubilisée ; il comprend une séparation et un transfert des protéines avant la mise en contact avec le réactif ; par exemple, l'échantillon cellulaire ou tissulaire est préparé en lysant les cellules ou l'homogénat tissulaire avec un tampon adéquat, en présence d'inhibiteurs de protéases pour éviter toute dégradation enzymatique.
L'électrophorèse est effectuée dans un gel de polyacrylamide selon la technique de Laemmli, puis les protéines, dont éventuellement la tubuline Δ2, du gel sont transférées sur un filtre de nitrocellulose (ou tout autre filtre adéquat) ; le filtre de nitrocellulose est récupéré et incubé avec l'anticorps anti-tubuline Δ2, puis le complexe tubuline Δ2-anticorps anti-tubuline Δ2 est révélé par un anticorps anti- immunoglobuline (anticorps secondaire) marqué à la peroxydase (ou avec toute autre enzyme convenable) ou par un radio-isotope.
Application à la détection des anticorps anti-tubuline Δ2 circulants : * Méthode immuno-enzymatique
. la méthode indirecte est adaptée au dosage des anticorps anti- tubuline Δ2. Un peptide spécifique de la tubuline Δ2 ou la tubuline Δ2 elle-même, est fixé sur une microplaque. Le sérum à doser est d'abord pré-incubé avec un peptide spécifique de la tubuline-tyr en excès, de façon à éliminer les anticorps anti-tubuline non spécifiques de la tubuline Δ2. Ensuite, le sérum à doser est ajouté sur la microplaque et la fixation des anticorps anti-tubuline Δ2 est détectée par l'addition d'anticorps anti-IgG, couplés à une enzyme appropriée et révélée quantitativement au spectrophotomètre après addition du substrat de l'enzyme ;
Application à la détection de la tubuline-tyrosine-ligase :
L'ensemble des méthodes exposées ci-dessus peuvent être mises en œuvre pour doser la TTL.
Dans les cellules tumorales, la TTL (suppresseur de tumeur) disparaît (signal négatif) alors que la tubuline Δ2 peut être simultanément détectée (- apparition d'un signal positif).
Bien que le procédé puisse ne comprendre que la détection de la TTL, il est plus avantageux de détecter la tubuline Δ2 ; en effet, un signal positif est d'interprétation plus aisée qu'un signal négatif (disparition de TTL) et présente un phénomène d'amplification.
Selon un autre mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, il comprend : - le traitement de l'échantillon tissulaire pour obtenir la phase solu- ble contenant éventuellement la TTL (en présence d'un tampon non dénaturant),
- la mise en contact dudit échantillon tissulaire, avec le substrat de la tubuline-tyrosine-ligase, à savoir la tubuline-glu, en présence de tyrosine, éventuellement radiomarquée et - la détection de la tubuline-tyr produite, par tout moyen approprié.
Cette détection peut être effectuée, soit par mesure de l'incorporation de la tyrosine radiomarquée, soit par un immunodosage, du type de celui décrit ci-dessus pour la tubuline Δ2, en présence d'un anticorps spécifique de la tubuline-tyr. La présente invention a également pour objet un kit ou trousse pour le dépistage et/ou le pronostic d'une tumeur, caractérisé en ce qu'il comprend, pour la détection, dans un échantillon tissulaire ou dans un fluide biologique, d'une protéine du cycle de tyrosination-detyrosination de la tubuline, sélectionnée dans le groupe constitué par la tubuline-tyrosine-ligase, la tubuline Δ2 et/ou d'un anticorps dirigé contre l'une de ces protéines, outre des quantités utiles de tampons appropriés pour la mise en œuvre dudit dépistage : - au moins des doses appropriées d'un réactif sélectionné dans le groupe constitué par la tubuline-tyrosine-ligase, la tubuline Δ2, les peptides immunoréactifs issus desdites protéines et les anticorps dirigés contre ces protéines ; et
- des doses appropriées d'un réactif de révélation. La présente invention a également pour objet un kit ou trousse pour le dépistage et/ou le pronostic d'une tumeur, caractérisé en ce qu'il comprend, pour la détection de tubuline-tyrosine-ligase dans un échantillon tissulaire, outre des quantités utiles de tampons appropriés pour la mise en œuvre dudit dépistage :
- au moins des doses appropriées d'un réactif sélectionné dans le groupe constitué par la tubuline-glu, la tubuline-tyr, les peptides immunoréactifs issus desdites protéines, les anticorps dirigés contre ces protéines et les réactifs de dosage de la tyrosine ; et, si nécessaire,
- des doses appropriées d'un réactif de révélation.
La présente invention a également pour objet l'utilisation de la tubu- Une Δ2 comme marqueur tumoral.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre du procédé objet de la présente invention, avec référence aux dessins annexés, dans lesquels : - la figure 1 illustre le cycle tyrosination-detyrosination de la tubuline ;
- la figure 2 illustre les différences de séquences en C-terminal des différentes isoformes de tubuline ;
- la figure 3 illustre le marquage immunofluorescent de cellules NIH/3T3, avant le sous-clonage des cellules TTL' (sans activité tubuline-tyrosine- ligase) : la figure 3A illustre le double-marquage des microtubules Tyr et Glu, en présence d'anticorps monoclonaux dirigés contre la tubuline-tyr (TYR) ou d'anticorps polyclonaux dirigés contre la tubuline-glu (GLU) ; la figure 3B illustre le double- marquage des microtubules Tyr et Δ2, en présence d'anticorps dirigés contre la tubu- line-tyr (TYR) ou d'anticorps dirigés contre la tubuline Δ2 (Δ2). Certaines des cellules se colorent faiblement avec les anticorps anti-tubuline-tyr et fortement avec soit les anticorps anti-tubuline-glu ou les anticorps anti-tubuline Δ2 comme indiqué par les flèches (échelle 20 μm) ;
- les figures 4 et 5 illustrent l'analyse comparative en immuno- fluorescence des sous-clones de cellules TTL" et des cellules NIH/3T3 TTL", trans- fectées de manière stable avec l'ADNc de la TTL, pour leur contenu en tubuline Δ2, tubuline-glu et tubuline-tyr. La figure 4 illustre les résultats obtenus avec le sous-clone TTL" et la figure 5 illustre les résultats obtenus avec les lignées cellulaires TTL' transfectées et exprimant la TTL, de manière stable. Ces différentes cellules sont soumises à un double-marquage, soit avec un anticorps monoclonal anti-tubuline-tyr (TYR) et un anticorps polyclonal anti-tubuline-glu (GLU), soit avec un anticorps monoclonal anti-tubuline-tyr (TYR) et un anticorps polyclonal anti-tubuline Δ2 (Δ2) (échelle 20 μm) ;
- la figure 6 illustre l'analyse en immunoblot du contenu en tubuline- tyr, tubuline-glu, tubuline-Δ2 (figure 6 A) et TTL (figure 6B) de cellules NIH/3T3 (3T3), de cellules TTL" (TTL") et de cellules TTL" transfectées avec l'ADNc de la TTL (TTL+). Les extraits cellulaires des différentes lignées cellulaires sont préparés comme décrit ci-après à l'exemple 1. Des échantillons (5 μl) sont analysés par procédure immunoblot pour détecter la tubuline-α, à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-tubu- line-α (DM1A : « Tub) (Amersham) ; la tubuline-tyr, à l'aide d'un anticorps mono- clonal primaire anti-tubuline-tyr (YL1/2 : TYR) ; la tubuline-glu, à l'aide d'un anticorps polyclonal primaire anti-tubuline-glu (L3 : GLU) et la tubuline Δ2, à l'aide d'un anticorps polyclonal primaire anti-tubuline Δ2 (L7 : Δ2). La bande de 50 kDa majeure observée correspond à la tubuline. A la figure 6B, des échantillons (5 μl) d'extraits cellulaires sont analysés en utilisant un anticorps monoclonal anti-TTL (ID3 : TTL). La bande majeure obtenue de 43 kDa est la TTL ;
- la figure 7 illustre une analyse en immunoblot du contenu en tubuline-α totale et en tubuline-tyr, tubuline-glu et tubuline Δ2, de tumeurs de souris nude et de différents tissus de souris normaux. La figure 7A correspond à des extraits cellulaires contrôles et à des extraits cellulaires tumoraux. Des échantillons (5 μl) sont analysés en western blot pour détecter la tubuline-α, la tubuline-tyr, la tubuline-glu et la tubuline Δ2, dans les conditions précisées ci-dessus pour la figure 6. 4 séries d'expériences sont réalisées ; les résultats obtenus pour chaque série, comprennent une piste contrôle représentant les extraits cellulaires utilisés pour l'injection et deux autres pistes qui correspondent aux échantillons de tumeurs obtenus à partir de deux souris différentes (souris 1 et souris 2). Dans la première série d'expériences, qui utilise des cellules TTL" pour induire des tumeurs, la première piste (contrôle 17B12) correspond à un extrait de cellules TTL", obtenu avant l'injection dans deux souris différentes. La deuxième piste (souris 1 (17B12)) et la troisième piste (souris 2 (17B12)) de cette série d'expériences correspond à des échantillons de tumeurs, induites chez ces deux souris après injection des cellules. Les autres séries d'expériences utilisent des cellules TTL' transfectées par un plasmide exprimant la TTL. Dans chacune de ces trois autres séries d'expériences, chacune des deux souris (souris 3 et 4 ; souris 5 et 6 ; souris 7 et 8) a été injectée avec des cellules TTL" transfectées par de l'ADNc de TTL. 3 sous-clones différents de lignées cellulaires transfectées ont été plus particulièrement testés (GT4 (souris 3 et 4), 22C5 (souris 5 et 6) et 17F 12 (souris 7 et 8)). Figure 7B : plusieurs échantillons tissulaires de souris (cœur, cerveau, muscle, foie, rein et rate) sont chargés sur un gel SDS à 8 % à des taux équivalents à ceux de la tubuline-α totale. Les protéines séparées sont soumises à une analyse en western Mot, à l'aide soit d'un anticorps anti-tubuline-α (DM1A : α Tub), soit à l'aide d'un anticorps anti-tubuline Δ2 (L7 : Δ2) ; - la figure 8 montre les différentes isoformes de tubuline et les taux de TTL dans des cellules. TTL" transfectées par un ADNc de TTL, mises en croissance in vitro ou in situ (émergence de sarcomes). La figure 8A illustre les résultats obtenus avec des cellules transfectées par de l'ADNc de TTL (clone 17F12, souris 7 et 8), mises en culture soit en présence (contrôle), soit en l'absence ((-)G418) de généticine pendant 6 semaines ; les tumeurs sont générées par injection des cellules à partir du même clone dans deux souris (souris 7 et souris 8). Les échantillons (5 μl) sont analysés en western blot pour détecter la tubuline-α, la tubuline-tyr, la tubuline-glu la tubuline Δ2, dans les conditions précisées ci-dessus pour la figure 6. Figure 8B : les mêmes échantillons sont analysés en western blot pour détecter la TTL, à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-TTL (ID3) ; - la figure 9 illustre l'analyse en immunoblot de la tubuline Δ2 de différentes tumeurs humaines. Figure 9A : les cellules d'une lignée cellulaire humaine cancéreuse du sein (Cal 51) sont, soit mises en croissance in vitro (culture), soit injectées à des souris nude pour induire une tumeur (tumeur) ; les cellules sont extraites et 5 μl d'échantillons sont analysés en western blot, pour détecter la tubuline-α totale, à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-tubuline-α (DM1A : α Tub) et la tubuline Δ2, à l'aide d'un anticorps polyclonal primaire anti-tubuline Δ2 (L7 : Δ2). Figure 9B : petites biopsies de différentes tumeurs humaines placées dans des souris nude pour induire une croissance tumorale. Des échantillons tumoraux sont analysés en western blot pour détecter la tubuline-α totale et la tubuline Δ2, dans les conditions précisées ci-dessus. Figure 9C : des échantillons (15 μl chacun), constitués soit par un pool d'une centaine de cytosols (piste de gauche), soit par des cytosols de différentes tumeurs de sein humaines (un échantillon par piste) sont analysés en western blot pour détecter la tubuline Δ2 dans les conditions précisées ci-dessus. II doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
Exemple 1 : Préparation des échantillons et des réactifs pour la mise en œuvre du procédé selon l'invention * Préparation des anticorps anti-tubuline Δ2.
Les anticorps sont obtenus selon la procédure décrite par Gundersen ét al. (Cell, 1984, 38, 779-789).
La séquence du peptide utilisé comme immunogène est EGEEEGE (7 résidus d'aminoacides de l'extrémité C-terminale de la tubuline Δ2). Ce peptide est conjugué à la KLH et injecté à des lapins.
Les IgG obtenus sont purifiées selon la méthode de McKinney et al. (J. Immunol. Meth., 1987, 96, 271-278) et leur spécificité vis-à-vis de la tubuline Δ2 est vérifiée par analyse en western blot.
Les anticorps anti-tubuline Δ2 (anticorps L7) produits sont détectés par un ELISA (Gundersen et al., 1984, précité), dans lequel les microplaques de titra- tion sont recouvertes de tubuline-Δ2. * Préparation des anticorps anti-tubuline tyr
L'anticorps monoclonal anti-tubuline-tyr YL1/2 reconnaît spécifiquement le résidu carboxy-terminal de la sous-unité α de la tubuline tyrosinée (Wehland J. et al., J. Cell Biol., 1983, 97, 1467-1475) ; il est obtenu selon la procédure décrite par Kilmartin J.V. et al., J. Cell Biol., 1982, 93, 576-582).
* Préparation des anticorps anti-tubuline-glu
Les anticorps sont obtenus selon la procédure décrite par Gundersen ét al. (Cell, 1984, 38, 779-789).
La séquence du peptide utilisé comme immunogène est GEEEGEE (7 résidus d'aminoacides de l'extrémité C-terminale de la tubuline-glu).
Ce peptide est conjugué à la KLH et injecté à des lapins.
La spécificité des anticorps obtenus est vérifiée par ELISA conformément à la méthode décrite par Gundersen et al. précité.
Les IgG obtenues sont purifiées selon la méthode de McKinney et al. (J. Immunol. Meth., 1987, 96, 271-278) et leur spécificité vis-à-vis de la tubuline-glu est vérifiée par analyse en western blot.
* Préparation d'anticorps anti-TTL
Les anticorps anti-TTL sont obtenus selon la procédure décrite dans Wehland et al., J. Cell Biol., 1987, 104, 1059-1067). * Préparation de tubuline Δ2, de tubuline-glu et de tubuline-tyr purifiées
Les différentes tubulines sont isolées et purifiées à partir de cerveaux de boeuf, comme décrit dans Paturle et al., 1989, précité et Paturle-Lafanechère et al., 1991, précité. * Préparation des échantillons biologiques.
D'une manière générale, les échantillons tissulaires peuvent être préparés, soit dans un tampon dénaturant (contenant du SDS, par exemple), soit dans n'importe quel autre tampon, éventuellement décrit dans l'art antérieur, qui permette d'isoler la phase soluble des homogénats cellulaires ou tissulaires. Le choix du tampon dépend de l'usage ultérieur qui sera fait de l'échantillon tissulaire. - Echantillons tissulaires :
. échantillons tissulaires de souris normales.
Ils sont disséqués et conservés dans l'azote liquide jusqu'à utilisation. Les échantillons (coeur, cerveau, muscle, foie, rein et rate) sont pesés et homogé- néisés dans du SDS 1 % (1 ml/g de tissu), portés à ébullition pendant 5 minutes, puis centrifugés (200 000 g, 15 minutes à 20°C).
Après addition d'un tampon dit tampon de « dépôt » (constitué de Tris-HCl 125 mM, SDS 2 %, glycérol 10 %, 2-mercaptoéthanol 10 %, bleu de bromo- phénol 10 %, pH 6,8), l'échantillon est à nouveau porté à ébullition pendant 3 minutes, puis stocké à -80°C jusqu'à son utilisation.
. échantillons tumoraux.
Ils sont obtenus par injection de cellules tumorales humaines à des souris nude ; la tumeur induite est récupérée à différentes phases de son évolution.
De manière plus précise, une lignée cellulaire tumorale humaine, dénommée Cal 51 et décrite dans J. Gioanni et al., Brit. J. Cancer, 1990, 62, 8-13) est cultivée sur un milieu DMEM complémenté en sérum de veau 10 % ; les cellules sont ensuite injectées à des souris nude comme suit : les cellules sont mises en suspension dans un milieu de croissance et
400 μl de chaque suspension cellulaire (de 1 à 2,5.106 cellules) est injectée en sous- cutané dans la zone scapulaire de la souris nude, sous anesthésie légère à l' éther ; les tissus sont congelés dans. de l'azote liquide, puis réduits en poudre (moulin Freezer®,
Spex, Bioblock).
On ajoute 1 ml de tampon de lyse/g d'homogénat cellulaire (tampon de lyse : Pipes-KOH 80 mM, pH 6,8, MgCl2 1 mM, Triton-X-100 0,5 % (vol/vol), glycérol 10 % (vol/vol), CaCl2 5 mM + cocktail d'inhibiteurs de protéases). La lyse s'effectue pendant 10 min à 4°C. Ensuite, on rajoute 1/20 du même tampon sans CaCl2, mais contenant de l'EGTA 200 mM (EGTA 10 mM final), de façon à chélater le CaCl2.
L'échantillon est ensuite centrifugé (200 000 g, 15 min, 4°C). Le surnageant est additionné d'un tampon de dépôt (comme ci-dessus), porté à ébullition pendant 3 min et stocké à -80°C jusqu'à utilisation. Une autre lignée cellulaire, à savoir des cellules dérivées des cellules NIH/3T3 (ATCC CRL 1658, fibroblastes embryonnaires de souris), obtenues après de multiples passages en culture, peuvent être utilisées pour préparer des échantillons tumoraux, dans les conditions exposées ci-après à l'exemple 2. . échantillons de cancer du sein humain.
Les échantillons, récoltés aux services de chirurgie des hôpitaux, sont immédiatement congelés dans de l'azote liquide, puis réduits en poudre comme précisé ci-dessus. Le tampon d'extraction est, dans ce cas, constitué de Tris 100 mM,
EDTA 1 mM, MgCl2 2,5 mM, glycérol 10 %, leupeptine 25 μg/ml, PMSF 0,5 mM, vanadate 1 mM et DTT 0,5 mM à pH 7,4.
Extraits cvtosoliques à partir de cellules en culture La remise en culture des cellules n'est pas obligatoire. On peut réaliser les extraits sur homogénats de tissu comme décrit ci-dessus. Toutefois, la remise en culture des cellules peut permettre, d'une part, une amplification et, d'autre part, un tri ultérieur, par clonage par exemple, ce qui peut favoriser la détection. Par exemple, dans un tissu ou dans une population mixte de cellules, il peut être difficile de détecter une diminution de la TTL. Si on sous-clone et que l'on amplifie ces cellules sans TTL (très réactives en immunofluorescence avec l'anticorps spécifique de la tubuline-glu et avec l'anticorps spécifique de la tubuline Δ2), alors on pourra détecter en western blot, en ELISA, ou en test d'activité, la diminution ou la perte de TTL.
Par exemple, pour produire des extraits cytosoliques, à partir de cellules en culture, les tissus sont traités à la collagénase II (200 Ul/ml) pendant 15 h à 37°C dans un incubateur. Les cellules dissociées sont alors lavées 3 fois avec un milieu de croissance sans sérum et une dernière fois avec un milieu de croissance contenant du sérum ; les cellules sont transférées dans des flacons de 75 cm2 contenant 20 ml de milieu complet et réadaptées à la culture cellulaire. Pour réaliser l'extrait cytosolique, les cellules sont trypsinisées et lavées deux fois avec du PB S.
50 μl de tampon de lyse contenant du CaCl2 5 mM sont ajoutés au culot cellulaire et le mélange est incubé 10 min à 4°C, pour dépolymériser les micro- tubules. De l'EGTA (10 mM, concentration finale) est alors ajouté à partir d'une solution mère et l'échantillon est centrifugé (200 000 g, 15 min, à 4°C). Un tampon d'électrophorèse (identique au tampon de dépôt précité) est ajouté au surnageant et le mélange est porté à ébullition (100°C) pendant 3 min. Ces échantillons sont conservés à -80°C . De tels échantillons sont de préférence utilisés pour effectuer les western blots (protéine soluble).
Le contenu protéique des différents échantillons varie de 1 à 3 mg/ml.
* Transfection cellulaire L'ADNc de TTL de porc est inséré dans le vecteur d'expression eucaryote pcDNA3 (Invitrogen), qui contient un gène de résistance à la néomycine. Les plasmides contenant l' insert sont transfectés dans des cellules TTL", conformément à la procédure décrite dans Chen et al. (Mol. Cell. Biol., 1987, 7, 2745-2752). Brièvement, des cellules en croissance exponentielle sont trypsinisées, ensemencées dans des boîtes de Pétri à raison de 5.105 cellules/ 10 cm et incubées une nuit dans 10 ml de milieu de croissance. Pour la transfection, 25 μg d'ADN plasmidique est mélangé avec 0,5 ml de CaCl2 0,25 M, 0,5 ml de 2 x BBS (BES 50 mM, NaCl 280 mM, Na2HPO4 1,5 mM, pH 6,9) et le mélange est incubé 15 min à température ambiante. Une solution calcium-phosphate-ADN est ajoutée goutte-à-goutte aux cellules en culture qui sont maintenues pendant 20 heures à 35°C, sous atmosphère enrichie en CO2 (3 %). Le milieu est ensuite retiré, les cellules rincées deux fois avec le milieu de croissance, réensemencées et incubées 24 heures à 37°C, sous atmosphère enrichie en CO2 (6 %). Les cellules sont ensuite diluées selon un rapport 1/10 et incubées pendant 24 heures, avant la sélection des transformants stables à l'aide de généticine (750 μg/ml).
Après deux semaines de sélection, les clones isolés sont sélectionnés à l'aide d'anneaux de clonage et incubés séparément dans un milieu de croissance comprenant 750 μg/ml de généticine pour l'amplification et le criblage par immuno- fluorescence; * Dilutions des anticorps
L'anticorps monoclonal anti-tubuline-tyr (YL1/2) est utilisé à une dilution de 1/1 000 pour l' immunofluorescence et les western Mots. Les anticorps secondaires utilisés avec cet anticorps sont les anticorps de chèvre anti-rat conjugués à la rhodamine (1/250) pour l' immunofluorescence ou les anticorps anti-souris conjugués à la peroxydase (1/5 000) pour les western Mots.
Les anticorps polyclonaux purifiés anti-tubuline-glu et anti-tubuline Δ2 sont dilués respectivement au 1/500 et au 1/1 000 pour l' immunofluorescence et au 1/100 000 et au 1/200 000 pour les western Mots. Les anticorps secondaires utilisés avec ces anticorps sont les anticorps anti-lapin conjugués à la fluorescéine (1/250) pour l' immunofluorescence et les anticorps anti-lapin conjugués à la peroxydase (1/5 000) pour les western Mots.
Pour les western Mots, la tubuline-α totale est détectée à l'aide d'un anticorps anti-tubuline-α monoclonal DM1 A (Amersham) dilué au 1/1 000, qui est détecté à l'aide d'un anticorps secondaire anti-souris conjugué à la peroxydase (1/5 000).
L'anticorps monoclonal anti-TTL (ID3) est dilué au 1/1 000 pour son utilisation dans les western Mots.
* Expériences in vivo Les cellules transfectées avec l'ADNc de TTL (ou avec le plasmide seul) sont sous-clonées dans un milieu de croissance contenant 750 μg/ml de généticine, puis les différentes tubulines (tyr, glu et Δ2) sont détectées par immunofluorescence. Les clones purs (contenant 100 % de cellules tyr ou 100 % de cellules glu) sont sélectionnés et amplifiés. Les cellules en croissance exponentielle sont trypsinisées et centrifugées (1 250 rpm, 5 min, température ambiante), les cellules sont remises en suspension dans un milieu de croissance et 400 μl de chaque suspension cellulaire (de 1 à 2,5.106 cellules) sont injectés en sous-cutané dans la région scapulaire de souris nude sous anesthésie légère à l'éther. Pour chaque clone différent, deux souris sont simultané- ment injectées. Les animaux sont observés chaque jour et le jour de l'apparition de la tumeur est noté. Les animaux sont tués par dislocation cervicale après une période de croissance tumorale, puis les tumeurs sont extraites, pesées et découpées et traitées comme précisé ci-dessus. Exemple 2 : Etude de cellules TTL" : mise en évidence d'une corrélation avec la présence de tubuline Δ2 et un état tumorigène. - Sélection de cellules TTL"
Les cellules NIH/3T3 précitées, dérivées de la lignée ATCC CRL 1658, sont cultivées sur milieu DME supplémenté avec du sérum de veau à 10 % et du sérum de veau foetal à 1 %.
Les sous-clones TTL" sont obtenus par dilution limite, après 3 cycles de croissance.
Ils sont sélectionnés en fonction de l'uniformité de leur phénotype, par double coloration en immunofluorescence, en utilisant soit des anticorps anti- tubuline-glu, soit des anticorps anti-tubuline Δ2, en combinaison avec un anticoφs anti-tubuline-tyr.
Les sous-clones TTL" sont ceux qui ne produisent pas de tubuline- tyr.
Dans ces cellules, les microtubules Glu représentent la quasi-totalité des microtubules cytoplasmiques, au lieu de la petite sous-population habituellement observée dans les différents types cellulaires. La tubuline-tyr est peu abondante et est présente de manière diffuse dans les microtubules cytoplasmiques.
De plus, ces cellules possèdent spontanément, en quantité importante, des microtubules formés de tubuline Δ2. - Mise en évidence de la présence de tubuline-glu et de tubuline Δ2
Les réseaux microtubulaires de ces cellules en inteφhase réagissent de manière substantielle, avec des anticoφs anti-tubuline-glu (figure 3A).
Des expériences de double-marquage, comparant la distribution des microtubules contenant de la tubuline-glu et des microtubules contenant de la tubuline-tyr montrent que les cellules qui réagissent avec les anticoφs anti-tubuline- glu ne réagissent pas avec les anticoφs anti-tubuline-tyr (figure 3A, flèche). La figure 3B illustre les cellules NIH/3T3 dont les microtubules contiennent de la tubuline Δ2 ; cette population cellulaire est distincte de celle contenant de la tubuline-tyr (figure 3B, flèche).
Parmi les cellules qui présentent un signal tubuline-glu fort, on observe une présence abondante de tubuline Δ2 dans les microtubules (figure 4).
Les résultats obtenus en immunochimie sont en corrélation avec l'analyse en western blot.
Lorsque les gels sont chargés sur une même base en protéine, la tubuline α est approximativement équivalente dans les cellules NIH/3T3 et dans le sous-clone tubuline-glu (figure 6A).
Cependant ces lignées diffèrent par la séquence C-terminale de la tubuline α. Le sous-clone tubuline-glu ne contient pratiquement pas de tubuline-tyr, alors qu'il contient en abondance de la tubuline-glu et de la tubuline Δ2 (figure 6 A).
- Mise en évidence de l'absence de TTL Les extraits cellulaires obtenus, comme précisé ci-dessus, sont mis en contact avec des anticoφs anti-TTL, pour déterminer si l'abondance de microtubules contenant de la tubuline-glu est corrélée avec l'absence d'une activité TTL.
Après incubation des anticoφs, on ne détecte aucune TTL dans les sous-clones contenant de la tubuline-glu (figure 6B). Des essais de transfection de ces cellules TTL" avec un plasmide comprenant l'ADNc de la TTL restaure une expression et une activité TTL (figure 6B) à des taux apparemment normaux, ce qui a pour conséquence la disparition de tubuline-glu et de tubuline Δ2 (figure 6A).
Ceci illustre la corrélation qui existe entre l'absence de TTL et la présence de tubuline-glu et de tubuline Δ2.
Cet effet de la transfection avec un plasmide contenant l'ADNc de la TTL est également illustré par immunofluorescence : un sous-clone TTL" contient de la tubuline-tyr en abondance, des taux très faibles de tubuline-glu (figure 5) et pas de tubuline Δ2 (pas de réaction avec les anticoφs anti-tubuline Δ2, figure 5). - Relation entre l'absence d'expression de TTL. la présence de tubuline Δ2 et l'émergence d'une tumeur.
Aussi bien les cellules TTL" que les cellules TTL" contenant le plasmide exprimant l'ADNc de TTL, lorsqu'elles sont injectées dans des souris nude produisent des tumeurs.
Dans le cas des tumeurs dérivées des cellules TTL" contenant le plasmide exprimant la TTL, on observe, en western blot, que les cellules contiennent de la tubuline-glu et de la tubuline Δ2 en abondance (figure 7A).
Le résultat est tout à fait reproductible : 2 souris injectées avec la même lignée cellulaire donnent les mêmes résultats.
Ceci démontre l'intérêt et la spécificité de la détection de la tubuline Δ2, comme marqueur de la perte d'une activité TTL, liée à l'émergence de cellules tumorales.
En effet, les résultats en western blot de biopsies de tissus normaux montrent qu'ils contiennent de la tubuline-tyr et de la tubuline-glu, mais jamais de tubuline Δ2 sauf dans le cerveau (figure 7B).
La présence accrue de tubuline-glu et de tubuline Δ2 est due à la perte de l'activité TTL, pendant la croissance de la tumeur {western blot en présence d'anticoφs anti-TTL, figure 8B). II en résulte que la présence de tubuline Δ2 dans un tissu est le résultat direct de la suppression de l'activité TTL ; la TTL peut donc être considérée comme un suppresseur de tumeur. Exemple 3 : Détection de la tubuline Δ2 dans des cellules cancéreuses
Test ELISA Effectué sur des microplaques de titration comprenant 96 puits.
Toutes les incubations sont réalisées à 37°C.
Chaque puits comprend 0,5 μg de tubuline Δ2 dans un tampon carbonate/bicarbonate (100 mM, pH 9,5).
Les microplaques sont incubées pendant 2 heures puis lavées 3 fois avec un tampon PBS/Tween 0,1 % (PBST), les anticoφs anti-tubuline Δ2 et des frac- tions d'échantillons tissulaires obtenus à partir de biopsies sont mélangés et préincubés pendant 45 min avant que 50 μl du mélange soit ajouté/puits.
La concentration en anticoφs anti-tubuline Δ2 est maintenue constante à 2,5 μg/puits. Ces microplaques sont incubées pendant 1 h et lavées 3 fois avec du
PBST, avant d'introduire 50 μl d'IgG de chèvre anti-lapin conjuguée à de la β- galactosidase (dilution 1 :2 000 dans du PBST/BSA 1 %) dans chaque puits.
Après 1 h d'incubation, les plaques sont lavées 3 fois avec du PBST et 50 μl de substrat (O-nitrophényl-β-D-galactopyranoside ou ONPG 0,8 mg/ml ; 2- mercaptoéthanol 7 μl/ml, dans du PBS) sont ajoutés par puits.
Après 30 min d'incubation, la réaction est arrêtée par addition de 50 μl de Na2CO3 0,5 M, pH 9,5. L'absorbance est mesurée à 405 nm. Western blot
On peut, soit extraire la fraction soluble des cellules par n'importe quelle procédure de l'art antérieur, soit lyser les cellules dans un tampon dénaturant comme précisé ci-dessus.
L'électrophorèse des protéines obtenues est réalisée selon la méthode de Laemmli (Nature, 1970, 227, 680-685). Les protéines séparées sont transférées sur des membranes de nitrocellulose (Schleicher et Schuell, CeraLabo), confor- mément à la méthode de Towbin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 4350- 4354). Les IgG anti-tubuline Δ2 sont diluées au 1/200 000.
La révélation est effectuée par incubation des membranes, pendant 30 min avec des anticoφs secondaires conjugués à de la peroxydase, suivie de 3 lavages (Kit ECC Amersham). Immunofluorescence (IF)
- Sections :
Des morceaux de tumeurs sont transférés juste après l'exérèse chirurgicale, dans du PBS contenant 4 % de paraformaldéhyde (pH 7,4), pendant 12 heures à 4°C. Le tissu fixé est alors incubé 12 h dans du PBS contenant 20 % de saccharose et congelé 1 min dans de l'isopentane, à -30°C. Des sections (épaisseur 10 μm) sont préparées à l'aide d'un cryo- tome à -18°C.
L' immunofluorescence est réalisée sur coupes flottantes, comme décrit dans Paturle-Lafanechère et al. (J. Cell. Sci., 1994). En routine, on procède à un double marquage, en utilisant simultanément l'anticoφs YL1/2, monoclonal de rat spécifique de la tubuline-tyr (Kilmartin J.V. et al., 1982, précité), et l'anticoφs L7, polyclonal produit chez le lapin, spécifique de la tubuline Δ2 (Gundersen et al., 1984, précité). La qualité de la détection de la tubuline Δ2 a été très améliorée par la purification de l'anticoφs L7 sur l'heptapeptide correspondant à l'extrémité C-terminale de la tubuline Δ2.
On procède ensuite comme décrit dans Paturle-Lafanechère et al. (J. Cell. Science, 1994, précité).
- Cellules :
Pour l'analyse en IF des cellules, on procède comme suit : les cellules sont mises en culture 1-4 jours sur des lamelles en verre, rincées dans du PBS à 37°C, fixées pendant 6 min dans du méthanol anhydre à -20°C, puis lavées dans du PBS/Tween 20 à 0,1 % (v/v). Les cellules sont ensuite incubées avec les anticoφs primaires et secondaires convenables, dilués dans du PBS contenant de la SAB à 0,1 %. Les noyaux sont colorés avec de l'Hoechst 33258 à 1 μg/ml dans du PBS contenant de la SAB à 0,1 %. Les lamelles sont montées et observées au microscope.
Résultats
Les résultats illustrés ci-après sont ceux obtenus en immunofluorescence et en western blot ; des résultats similaires sont obtenus en ELISA, lorsque l'on suit la procédure décrite ci-dessus.
- Lignée cellulaire transformée (— ^tumeur humaine) Cal 51 en culture.
En culture, la lignée cellulaire contient des taux normaux de tubuline-tyr et de tubuline-glu ; elle ne contient pas de tubuline Δ2, comme illustré en western blot (figure 9 A), IF ou ELISA. - Souris nude présentant un cancer après injection de la lignée cellulaire Cal 51.
On observe la production de tubuline Δ2 lorsqu'il y a effectivement développement d'une tumeur (figure 9A), ceci indiquant la perte de l'activité TTL. - Tumeurs humaines diverses : des biopsies humaines ont été analysées, à partir de tissus d'origines variées après passage par souris nude (figure 9B).
Les différentes tumeurs testées sont les suivantes : sarcome synovial, liposarcome, ostéosarcome, hemangiopericytome ; toutes présentent de la tubuline Δ2, à l'exception de l' ostéosarcome. - Tumeurs humaines primaires de sein : un pool de 100 extraits de biopsies humaines et 7 extraits individuels ont été analysés ; la tubuline Δ2 est clairement détectée (figure 9C, colonne de gauche), sauf dans un extrait individuel.
On observe ainsi clairement, dans de nombreuses tumeurs, des cellules, soit sous forme d'ilôts, soit isolées, riches en tubuline Δ2 et pauvres en tubuline-tyr.
Exemple 4 : Absence de TTL détectable dans les cellules cancéreuses
La disparition de la TTL constitue un signal négatif de dépistage d'une tumeur.
- Dosage par ELISA . les extraits cellulaires sont réalisés comme précisé ci-dessus.
La TTL est purifiée par chromatographie d'immunoaffinité en utilisant un anticoφs monoclonal spécifique de la ligase (anticoφs LA/C4) tel que décrit dans Schroeder et al. (J. Cell Biol., 1985, 100, 276-281).
L'enzyme est ensuite éluée avec du MgCl2 3 M dans un tampon de stabilisation KXMES 25 mM, pH 6,8, KCl 100 mM, MgCl2 2 mM, EGTA 1 mM, DTT 0,5 mM, glycérol à 20 % (v/v) et dialysée contre le tampon de stabilisation. On procède ensuite comme précisé ci-dessus.
- Mesure de l'activité enzymatique
Les mesures enzymatiques sont effectuées dans 50 μl d'un tampon de mesure de l'activité TTL contenant de l'acide moφholinoéthanesulfonique K+
100 mM (MES-KOH) (pH 6,8), EGTA 1 mM, MgCl2 25 mM, ATP 5 mM, KCl 100 mM, tyrosine 100 μM et de la tubuline-glu (4,5 mg/ml au maximum) ; l'incoφoration de tyrosine est mesurée en présence de 3H-tyrosine (2 μCi/50 μl).
En variante, on peut doser la tubuline tyrosinée formée par immuno- détection (ELISA ou immunofluorescence), dans les conditions précisées ci-dessus. On utilise par exemple un anticoφs qui reconnaît spécifiquement le résidu carboxy-terminal de la sous-unité α de la tubuline tyrosinée (Wehland et al., J. Cell Biol., 1983, 97, 1467-1475) à une dilution au 1/1 OOOème pour l' immunofluorescence ou les western Mots.
L'anticoφs secondaire utilisé est une Ig de chèvre anti-rat conjuguée à la rhodamine (1/250) pour l' immunofluorescence ou une IgG de chèvre anti-souris (ou anti-rat) conjuguée à la peroxydase pour les western Mots (1/5 000).
Pour l'ELISA, l'anticoφs secondaire utilisé est une IgG de chèvre anti-souris ou anti-rat conjuguée à de la β-galactosidase (1/2 00 dans du PBST/SAB 1 %). Exemple 5 : Détection des anticorps anti-tubuline Δ2 circulants
Par ELISA ou par western blot, dans les conditions exposées ci- dessus.
Exemple 6 : Etude in vivo de la relation entre perte de TTL et métastases sur des modèles animaux. Des lignées tumorales sont injectées à la souris nude. Les cellules tumorales, provenant de. la tumeur primitive et des métastases éventuelles sont ensuite récupérées, analysées, réadaptées à la culture in vitro et clonées.
L'analyse montre que les cellules TTL" sont beaucoup plus abondantes dans les métastases que dans la tumeur primitive. Après clonage de ces cellules, les cellules TTL" semblent présenter des défauts majeurs d'adhésion. Le rétablissement d'un phénotype d'adhésion normal devrait s'avérer possible, en transfec- tant ces cellules de manière stable avec l'ADNc de la TTL.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en œuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS
1°) Procédé de dépistage et ou de pronostic d'une tumeur, caractérisé en ce qu'il comprend la détection, dans un échantillon tissulaire ou dans un fluide biologique, d'une protéine du cycle de tyrosination-detyrosination de la tubuline, sélectionnée dans le groupe constitué par la tubuline-tyrosine-ligase et la tubuline Δ2 et/ou d'un anticoφs dirigé contre l'une de ces protéines.
2°) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite détection comprend :
- le traitement de l'échantillon tissulaire pour concentrer et ou puri- fier et/ou solubiliser la tubuline Δ2 ou la TTL cytoplasmiques ;
- la mise en contact dudit échantillon tissulaire ou dudit fluide biologique, avec au moins un réactif sélectionné dans le groupe constitué par la tubuline- tyrosine-ligase, la tubuline Δ2, les peptides immunoréactifs issus desdites protéines et les anticoφs dirigés contre ces protéines ; et - la révélation du complexe éventuellement formé par tout moyen approprié.
3°) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend :
- le traitement de l'échantillon tissulaire pour obtenir la phase soluble contenant éventuellement la TTL ;
- la mise en contact dudit échantillon tissulaire, avec le substrat de la tubuline-tyrosine-ligase, à savoir la tubuline-glu, en présence de tyrosine, éventuellement radiomarquée et
- la détection de la tubuline-tyr produite, par tout moyen approprié. 4°) Kit ou trousse pour le dépistage et/ou le pronostic d'une tumeur, caractérisé en ce qu'il comprend, pour la détection, dans un échantillon tissulaire ou dans un fluide biologique, d'une protéine du cycle de tyrosination-detyrosination de la tubuline, sélectionnée dans le groupe constitué par la tubuline-tyrosine-ligase et la tubuline Δ2 et/ou d'un anticoφs dirigé contre l'une de ces protéines, outre des quanti- tés utiles de tampons appropriés pour la mise en œuvre dudit dépistage : - au moins des doses appropriées d'un réactif sélectionné dans le groupe constitué par la tubuline-tyrosine-ligase, la tubuline Δ2, les peptides immunoréactifs issus desdites protéines et les anticoφs dirigés contre ces protéines ; et
- des doses appropriées d'un réactif de révélation. 5°) Kit ou trousse pour le dépistage et/ou le pronostic d'une tumeur, caractérisé en ce qu'il comprend, pour la détection de tubuline-tyrosine-ligase dans un échantillon tissulaire, outre des quantités utiles' de tampons appropriés pour la mise en œuvre dudit dépistage :
- au moins des doses appropriées d'un réactif sélectionné dans le groupe constitué par la tubuline-glu, la tubuline-tyr, les peptides immunoréactifs issus desdites protéines, les anticoφs dirigés contre ces protéines et les réactifs de dosage de la tyrosine ; et, si nécessaire,
- des doses appropriées d'un réactif de révélation.
6°) Utilisation de la tubuline Δ2 comme marqueur tumoral.
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