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WO1999005522A1 - Utilisation de cellules appropriees pour le criblage d'inhibiteurs de la tubuline-carboxypeptidase et applications de ces derniers comme anticancereux - Google Patents

Utilisation de cellules appropriees pour le criblage d'inhibiteurs de la tubuline-carboxypeptidase et applications de ces derniers comme anticancereux Download PDF

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WO1999005522A1
WO1999005522A1 PCT/FR1998/001645 FR9801645W WO9905522A1 WO 1999005522 A1 WO1999005522 A1 WO 1999005522A1 FR 9801645 W FR9801645 W FR 9801645W WO 9905522 A1 WO9905522 A1 WO 9905522A1
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WO
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tubulin
cells
tcp
carboxypeptidase
screening
Prior art date
Application number
PCT/FR1998/001645
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Inventor
Didier Job
Laurence Lafanechere
Robert L. Margolis
Jürgen WEHLAND
Original Assignee
Commissariat A L'energie Atomique
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/9015—Ligases (6)
    • G—PHYSICS
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    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)

Definitions

  • the present invention relates to the use of cells, in which the tyrosination-detyrosination cycle of tubulin is modified, for the screening and selection of inhibitors of tubulin-carboxypeptidase, to the application of the latter as as anti-cancer as well as a screening process using said cells.
  • Microtubules along with actin filaments and intermediate filaments, form the cytoskeleton of eukaryotic cells.
  • Microtubules are protein organelles composed of tubulin molecules, assembled into tubular structures of about 25 nm in diameter, up to several tens of micrometers in length.
  • Microtubules play multiple roles in the cell. They play a central role in the genesis and maintenance of the shape of cells. During finterphase, they organize the intracellular space and are responsible for the intracellular transport of organelles. They are essential for cell division; in fact, during mitosis, they reorganize to form the mitotic spindle, responsible for the distribution of chromosomes between the two daughter cells. In the nervous system, microtubules are also directly involved in neurite growth and axonal transport.
  • tubulin formed of two subunits (and ⁇ ), exists in several isoforms. This diversity is generated at two levels: - the selective transcription of one or more genes coding for each subunit,
  • tubulin a variety of post-translational modifications of tubulin. as its acetylation (Piperno G. et al., J. Cell Biol., 1985, 101, 2085-2094). its phosphorylation (Gard D. et al., 1985. J. Cell Biol, 1985, 100, 764-774), its glutamylation (Edmü B. et al, Science. 1990, 247, 83-85), its polyglycylation (Redeker V. and al., Science, 1994, 266, 1688-1691) or its tyrosination (Barra HS. et al., 1988, 2, 133-143).
  • tubulin exists in a tyrosine form (tyrosine tubulin or tubulin-tyr) and in a detyrosine form (detyrosinated tubulin or tubulin-glu); the passage from one to the other of these forms brings into play two specific enzymes, which act at the level of the carboxy-terminal amino acid Tyr of the ⁇ subunit of tubulin: the tyrosine residue is cleaved from the main polypeptide chain by a tubulin-carboxypeptidase (TCP) or added by a specialized enzyme, tubulin-tyrosine-ligase (TTL) (see Figure 1).
  • TCP tubulin-carboxypeptidase
  • TTL tubulin-tyrosine-ligase
  • This cycle which is absolutely specific to tubulin, includes the synthesis of a peptide bond without the participation of ribosomes.
  • tubulin isoform resistant to tyrosination
  • Tubulin ⁇ 2 tubulin ⁇ 2 + tubulin ⁇ 2
  • TTL tubulin-tyrosine ligase
  • TTL acts preferentially on free tubulin and does not seem to have any action on tubulin in microtubules, while TCP preferably acts on polymerized tubulin (assembled microtubules). Consequently, the newly assembled microtubules, in interphase, are largely composed of tubulin-tyr while the stable microtubules are largely composed of tubulin-glu.
  • the inventors have also found that the absence of TTL is compatible with a residual cycle, in which tyrosine tubulin (tubulin-tyr) comes from the neosynthesis of tubulin, which results in the inhibition of the activity of the tubulin carboxypeptidase helps restore normal levels of tyrosine tubulin.
  • the subject of the present invention is the use of cells originating from any tissue, in which the tyrosination-detyrosination cycle of tubulin is modified, which cells overproduce tubulin-glu, for the selection or screening of products.
  • inhibitors of tubulin-carboxypeptidase (TCP) activity are particularly obtained, or by inhibiting the renewal dynamics of the assembly of tubulin, or by inhibiting the activity TTL.
  • the renewal dynamics of the tubulin assembly is inhibited, either by a microtubule stabilizing agent, such as taxol, or by a periwinkle alkaloid, such as vinblastine.
  • a microtubule stabilizing agent such as taxol
  • a periwinkle alkaloid such as vinblastine.
  • taxol promotes the polymerization of tubulin, in vitro; added to the cells, it causes the assembly of a large proportion of free tubulin into stable microtubules.
  • Vinblastine or vincristine induce the formation of tubulin paracristalline aggregates.
  • Such cells overproducing tubulin-glu, when in the presence of a TCP inhibitor, must see tubulin-glu disappear and tubulin-tyr appear.
  • the cells in which the TTL activity is inhibited including an anti-TTL antibodies, but in which the TCP activity is intact, produce tubulin-glue, while when in the presence of inhibitor of TCP, a restoration of normal levels of tubulin-tyr should be observed.
  • the present invention also relates to the use of cells which do not produce tubulin-tyr (cells TTL "), for a screening or selection of inhibitors of tubulin carboxypeptidase.
  • Such cells in which the TCP activity is intact, produce tubulin-glu, whereas when in the presence of a TCP inhibitor, one must observe the appearance of tubulin-tyr by neosynthesis, and decrease or disappearance of tubulin-glu.
  • Such cells are in particular cells derived from NIH / 3T3 cells deposited under the ATCC number CRL 1658 (mouse embryonic fibroblasts) and are obtained after multiple passages in culture; these cells produce tubulin-glu and tubulin- ⁇ 2.
  • the present invention also relates to the use of a crude or semi-purified extract of TCP for the screening or selection of products that inhibit TCP activity.
  • Said crude extract or semi-purified TCP, catalyzing cleavage of the tyrosine of the main polypeptide chain is capable of being obtained by cold homogenizing in a selected organ, followed by fractionated precipitation of the proteins and stages of successive separations in particular by adsorption, dialysis and passage through different chromatography columns.
  • said selected organ is subjected to the separation steps described by TM Martensen (Methods in Cell Biology, 1982, 24, 265-269).
  • the enzymatic activity of TCP is measured by the disappearance of the C-terminal tyrosine present in microtubules, in which the tyrosine has been radiolabelled beforehand (for example, 14 C-tyrosine or 3 H-tyrosine, in accordance with TM Martensen, cited above).
  • the disappearance of tyrosine tubulin and the appearance of detyrosine tubulin can also be quantified in immunoassays using the antibodies specific for each of these forms of tubulin.
  • the subject of the present invention is, moreover, a method for screening and selecting tubulin-carboxypeptidase inhibitor products, characterized in that it comprises:
  • tubulin-tyr the measurement of tubulin-tyr and / or tubulin-glu by any appropriate means.
  • tubulin-tyr can be carried out, either by measuring the incorporation of the radiolabelled tyrosine, or by an immunoassay, in the presence of an antibody specific for tubulin-tyr; the detection of tubulin-glu can be carried out by an immunoassay in the presence of an antibody specific for tubulin-glu.
  • the applicable methods are as follows:
  • indirect method unlabeled anti-tubulin-tyr and anti-tubulin-glu antibodies are applied to the cell extract; the labeled antibodies directed against the Ig of the species from which the specific antibody originates, reveal its fixation.
  • the measurement is preferably carried out in immunofluorescence by double labeling of the tyrosine and detyrosine isotypes.
  • the technique is based on the link between tubulin-glu or tubulin-tyr and a standard antibody specific for these tubulins.
  • the antigen or antibody is covalently linked to an enzyme.
  • the enzyme usually horseradish peroxidase, alkaline phosphatase or ⁇ -galactosidase, is visualized by color reaction with the substrate.
  • tubulin-tyr and tubulin-glu are the tubulin-tyr and tubulin-glu or peptides reproducing the specific sequences of each of these forms of tubulin, which are always attached to the microplates.
  • a mixture of cell extract, and small amounts of anti-tubulin-tyr and anti-tubulin-glu antibodies are added.
  • the quantity of antibody fixed on the microplate is all the lower when the tubulin-tyr and tubulin-glu molecules present in the sample to be analyzed have neutralized more antibody molecules.
  • the subject of the present invention is, moreover, a method for screening and selecting tubulin-carboxypeptidase inhibitor products, characterized in that it comprises:
  • the present invention further relates to the use of an inhibitor of tubulin-carboxypeptidase, as defined above, to obtain an anti-cancer drug.
  • FIG. 1 illustrates the tyrosination-detyrosination cycle of tubulin
  • EXAMPLE 1 Use of normal cells overproducing tubulin-glu (action of taxol or vinblastine), to screen for inhibitors of TCP.
  • HeLa cells are cultured routinely in RPMI medium
  • the treatment is carried out at 37 ° C. Taxol (5 ⁇ M, 10 ⁇ M or 50 ⁇ M) or vinblastine (10 ⁇ M) are added to the culture medium.
  • a TCP inhibitor is added to the culture medium (or it is microinjected into the cells); the cells are fixed by incubation in pure methanol, 6 min, at -20 ° C. Fixed cells are incubated with anti-tubulin-glu antibodies (1/500) and anti-tubulin-tyr antibodies (YL1 / 2, 1/1000), followed by a second incubation with goat anti-rat antibodies conjugated to rhodamine (Jackson) (to detect anti-tubulin-tyr antibodies) and a goat anti-rabbit antibody (Cappel) (1/250) to detect anti-tubulin-glu antibodies.
  • Jackson goat anti-rat antibodies conjugated to rhodamine
  • Cappel goat anti-rabbit antibody
  • the anti-tubulin-glu antibodies are obtained according to the procedure described in Gundersen et al. (Cell, 1984, 38, 779-789).
  • the peptide used as immunogen sequence is GEEEGEE (7 amino acid residues from the C-terminus of tubulin-glu). This peptide is conjugated to KLH and injected into rabbits.
  • the specificity of the antibodies obtained is verified by ELISA in accordance with the method described by Gundersen et al. cited above.
  • the IgGs obtained are purified according to the method of McKinney et al. (J. Immunol. Meth. 1987, 96, 271-278) and their specificity with respect to tubulin-glu is verified by analysis in western blot.
  • the anti-tubulin-tyr monoclonal antibody YL1 / 2 specifically recognizes the carboxy-terminal residue of the ⁇ subunit of tyrosine tubulin (Wehland J. et al., J. Cell Biol., 1983, 97, 1467-1475 ); it is obtained according to the procedure described in Kilmartin JV et al., J. Cell Biol., 1982, 93, 576-582).
  • tubulin-tyr In the presence of TCP, detyrosination is observed and only tubulin-glu is detected, whereas when the cells are in the presence of a TCP inhibitor, tubulin-tyr is measured.
  • EXAMPLE 2 Use of normal cells in which TTL is inhibited.
  • An antibody which inhibits TTL is microinjected as described in J. Wehland et al., J. Cell Science, 1987, 88, 185-203.
  • tubulin-glu In the absence of an inhibitor, one will essentially measure tubulin-glu, while in the presence of an inhibitor, one will be able to measure the tubulin-tyr that check the disappearance of tubulin-glu by double labeling as specified in Example 1.
  • the cells derived from the abovementioned NIH / 3T3 cells are cultured on DME medium supplemented with 10% calf serum and 1% fetal calf serum.
  • the TTL " subclones are obtained by limiting dilution, after 3 growth cycles.
  • They are selected according to the uniformity of their phenotype, by double staining in immunofluorescence, using an anti-tubulin-glu antibody, or an anti-tubulin ⁇ 2 antibody, in combination with an anti-tubulin-tyr antibody.
  • the TTL " subclones are those which produce tubulin-glu and tubulin ⁇ 2 in abundance.
  • the Glu microtubules represent almost all of the cytoplasmic microtubules, instead of the small sub-population usually observed in different cell types: Tubulin-tyr is scarce and diffuse in cytoplasmic microtubules.
  • tubulin-Tyr In the presence of an inhibitor of TCP, we can measure appeared tubulin-Tyr and check the disappearance of tubulin-glue double-marking as specified in Example 1.

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Abstract

Utilisation de cellules, dans lesquelles le cycle de tyrosination-détyrosination de la tubuline est modifié, pour le criblage et la sélection d'inhibiteurs de la tubuline-carboxypeptidase, application de ces derniers en tant qu'anticancéreux ainsi que le procédé de criblage mettant en oeuvre lesdites cellules. Lesdites cellules, qui surproduisent de la tubuline-glu, sont adaptées à la sélection ou au criblage de produits inhibiteurs de l'activité de la tubuline-carboxypeptidase (TCP).

Description

UTILISATION DE CELLULES APPROPRIEES POUR LE CRIBLAGE D'INHIBITEURS DE LA TUBULINE-CARBOXYPEPTIDASE ET APPLICATIONS DE CES DERNIERS COMME ANTI-CANCEREUX.
La présente invention est relative à l'utilisation de cellules, dans lesquelles le cycle de tyrosination-detyrosination de la tubuline est modifié, pour le criblage et la sélection d'inhibiteurs de la tubuline-carboxypeptidase, à l'application de ces derniers en tant qu' anticancéreux ainsi qu'à un procédé de criblage mettant en œuvre lesdites cellules.
Les microtubules forment, avec les filaments d'actine et les filaments intermédiaires, le cytosquelette des cellules eucaryotes. Les microtubules sont des organelles protéiques composées de molécules de tubuline, assemblées en structures tubulaires d'environ 25 nm de diamètre, d'une longueur pouvant atteindre plusieurs dizaines de micromètres.
Les microtubules jouent de multiples rôles dans la cellule. Ils ont un rôle central dans la genèse et le maintien de la forme des cellules. Lors de finterphase, ils organisent l'espace intracellulaire et sont responsables du transport intracellulaire d' organelles. Ils sont essentiels à la division cellulaire ; en effet, lors de la mitose, ils se réorganisent pour former le fuseau mitotique, responsable de la répartition des chromosomes entre les deux cellules filles. Dans le système nerveux, les microtubules sont aussi directement impliqués dans la pousse des neurites et le transport axonal.
Enfin, ils jouent un rôle central dans la motilité de cellules différenciées, comme par exemple les spermatozoïdes.
Dans les cellules, la tubuline, formée de deux sous-unités ( et β), existe sous plusieurs isoformes. Cette diversité est générée à deux niveaux : - la transcription sélective d'un ou plusieurs gènes codant pour chaque sous-unité,
- une variété de modifications post-traductionnelles de la tubuline. comme son acétylation (Piperno G. et al., J. Cell Biol., 1985, 101, 2085-2094). sa phosphorylation (Gard D. et al., 1985. J. Cell Biol, 1985, 100, 764-774), sa glutamy- lation (Eddé B. et al, Science. 1990, 247, 83-85), sa polyglycylation (Redeker V. et al., Science, 1994, 266, 1688-1691) ou sa tyrosination (Barra HS. et al., 1988, 2, 133- 143).
Cette dernière modification est connue sous le nom de cycle de tyrosination-detyrosination de la tubuline et est illustré à la figure 1. Conformément à ce cycle, la tubuline existe sous une forme tyrosinée (tubuline tyrosinée ou tubuline-tyr) et sous une forme détyrosinée (tubuline détyrosinée ou tubuline-glu) ; le passage de l'une à l'autre de ces formes met en jeu deux enzymes spécifiques, qui agissent au niveau de l'acide aminé carboxy-terminal Tyr de la sous-unité α de la tubuline : le résidu tyrosine est clivé de la chaîne polypeptidique principale par une tubuline-carboxypeptidase (TCP) ou rajouté par une enzyme spécialisée, la tubuline-tyrosine-ligase (TTL) (voir figure 1).
Ce cycle, qui est absolument spécifique de la tubuline, inclut la synthèse d'une liaison peptidique sans participation des ribosomes.
Une autre isoforme de la tubuline, résistante à la tyrosination, a également été mise en évidence (Paturle-Lafanechère L. et al., J. Cell. Science, 1994, 107, 1529-1543 et Biochemistry, 1991, 30, 10523-10528). Il s'agit d'une forme particulière de tubuline, représentant environ 35 % de la tubuline cérébrale, qui a été dénommée tubuline Δ2. Elle comprend deux aminoacides en moins (Glu450-Tyr451), par rapport à la tubuline-tyr (voir figure 2). Les Inventeurs ont maintenant constaté, de manière surprenante, qu'il existe une suppression sélective de la tubuline-tyrosine-ligase (TTL) dans les tumeurs, qui est directement corrélée à l'apparition de tubuline Δ2, normalement absente des cellules non-neuronales. La génération de tubuline Δ2, lors de la croissance tumorale, associée à la suppression d'activité de la TTL est pathologique ; la tubuline Δ2 constitue donc un marqueur tumoral, particulièrement intéressant.
La TTL agit préférentiellement sur la tubuline libre et ne semble pas avoir d'action sur la tubuline des microtubules, alors que la TCP agit de préférence sur la tubuline polymérisée (microtubules assemblés). En conséquence, les microtubules nouvellement assemblés, en interphase, sont largement composés de tubuline-tyr tandis que les microtubules stables sont largement composés de tubuline-glu. Les Inventeurs ont également trouvé que l'absence de TTL est compatible avec un cycle résiduel, dans lequel la tubuline tyrosinée (tubuline-tyr) provient de la néosynthèse de tubuline, ce qui a pour conséquence que l'inhibition de l'activité de la tubuline carboxypeptidase permet de restaurer des niveaux normaux de tubuline tyrosinée.
C'est pourquoi les Inventeurs se sont donné pour but d'utiliser des cellules permettant de cribler des substances capables d* inhiber l'activité de la tubuline-carboxypeptidase et en conséquence de compenser V élimination de l'activité TTL au cours de la croissance tumorale et donc d'inhiber cette croissance. La présente invention a pour objet l'utilisation de cellules issues de n'importe quel tissu, dans lesquelles le cycle de tyrosination-detyrosination de la tubuline est modifié, lesquelles cellules surproduisent de la tubuline-glu, pour la sélection ou le criblage de produits inhibiteurs de l'activité de la tubuline- carboxypeptidase (TCP). Lesdites cellules produisant de la tubuline-glu en excès, sont notamment obtenues, soit par inhibition de la dynamique de renouvellement de l'assemblage de tubuline, soit par inhibition de l'activité TTL.
La dynamique de renouvellement de l'assemblage de tubuline est inhibée, soit par un agent de stabilisation des microtubules, tel que le taxol, soit par un alcaloïde de la pervenche, tel que la vinblastine.
En effet, l'addition de taxol favorise la polymérisation de la tubuline, in vitro ; ajouté aux cellules, il provoque l'assemblage d'une grande proportion de la tubuline libre en microtubules stables. La vinblastine ou la vincristine induisent la formation d'agrégats paracristallins de tubuline. De telles cellules, surproductrices de tubuline-glu, lorsqu'elles sont en présence d'un inhibiteur de la TCP, doivent voir la tubuline-glu disparaître et la tubuline-tyr apparaître.
Par ailleurs, les cellules dans lesquelles l'activité TTL est inhibée, notamment par un anticorps anti-TTL, mais dans lesquelles l'activité TCP est intacte, produisent de la tubuline-glu, alors que lorsqu'elles sont en présence d'un inhibiteur de TCP, on doit observer une restauration de niveaux normaux de tubuline-tyr. La présente invention a également pour objet l'utilisation de cellules qui ne produisent pas de tubuline-tyr (cellules TTL"), pour un criblage ou une sélection d'inhibiteurs de la tubuline-carboxypeptidase.
De telles cellules, dans lesquelles l'activité TCP est intacte, produisent de la tubuline-glu, alors que lorsqu'elles sont en présence d'un inhibiteur de TCP, on doit observer l'apparition de tubuline-tyr par néosynthèse, et une diminution ou une disparition de tubuline-glu.
De telles cellules sont notamment des cellules dérivées de cellules NIH/3T3 déposées sous le N° ATCC CRL 1658 (fibroblastes embryonnaires de souris) et sont obtenues après de multiples passages en culture ; ces cellules produisent de la tubuline-glu et de la tubuline-Δ2.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un extrait brut ou semi-purifié de TCP pour le criblage ou la sélection de produits inhibiteurs de l'activité TCP. Ledit extrait brut ou semi-purifié de TCP, catalysant le clivage de la tyrosine de la chaîne polypeptidique principale est susceptible d'être obtenu par homogénéisation à froid d'un organe sélectionné, suivie de précipitations fractionnées des protéines et d'étapes de séparations successives notamment par adsorption, dialyse et passage sur différentes colonnes de chromatographie. De manière préférée, ledit organe sélectionné est soumis aux étapes de séparation décrites par TM Martensen (Methods in Cell Biology, 1982, 24 , 265- 269).
L'activité enzymatique de la TCP est mesurée par la disparition de la tyrosine C-terminale présente dans des microtubules, dans lesquels la tyrosine a été préalablement radiomarquée (par exemple, 14C-tyrosine ou 3H-tyrosine, conformément à TM Martensen, précité).
La disparition de la tubuline tyrosinée et l'apparition de tubuline détyrosinée peuvent aussi être quantifiées en immunodosages en utilisant les anticorps spécifiques de chacune de ces formes de tubuline. La présente invention a, en outre, pour objet un procédé de criblage et de sélection de produits inhibiteurs de la tubuline-carboxypeptidase, caractérisé en ce qu'il comprend :
- la mise en contact de l'inhibiteur potentiel avec une cellule ou un extrait brut ou semi-purifié de TCP, tels que définis ci-dessus et
- la mesure de la tubuline-tyr et/ou de la tubuline-glu par tout moyen approprié.
Par exemple, la détection de la tubuline-tyr peut être effectuée, soit par mesure de l'incorporation de la tyrosine radiomarquée, soit par un immunodosage, en présence d'un anticorps spécifique de la tubuline-tyr ; la détection de la tubuline- glu peut être effectuée par un immunodosage en présence d'un anticorps spécifique de la tubuline-glu. Les méthodes applicables sont les suivantes :
* Méthodes fluorimétriques :
. méthode directe : les anticorps spécifiques anti-tubuline-tyr et anti- tubuline-glu sont marqués par un composé fluorescent et mis en contact avec l'extrait cellulaire ;
. méthode indirecte : les anticorps anti-tubuline-tyr et anti-tubuline- glu, non marqués sont appliqués sur l'extrait cellulaire ; les anticorps marqués dirigés contre les Ig de l'espèce d'où provient l'anticorps spécifique, révèlent sa fixation. La mesure est de préférence réalisée en immunofluorescence par double-marquage des isotypes tyrosinés et détyrosinés.
* Dosages immuno-enzvmatiques
La technique est fondée sur la liaison entre la tubuline-glu ou la tubuline-tyr et un anticorps standard spécifique de ces tubulines. L'antigène ou l'anticorps est lié de façon covalente à une enzyme. L'enzyme, habituellement la peroxydase du raifort, la phosphatase alcaline ou la β-galactosidase, est visualisée par réaction colorée avec le substrat. Plusieurs modalités techniques peuvent être utilisées :
. une technique de compétition peut être utilisée pour doser la tubuline-tyr et la tubuline-glu. Ce sont les tubuline-tyr et tubuline-glu ou des peptides reproduisant les séquences spécifiques de chacune de ces formes de tubuline, qui sont toujours fixées sur les microplaques. Un mélange d'extrait cellulaire, et de faibles quantités d'anticorps anti-tubuline-tyr et anti-tubuline-glu est ajouté. La quantité d'anticorps fixée sur la microplaque est d'autant plus faible que les molécules de tubuline-tyr et de tubuline-glu présentes dans l'échantillon à analyser ont neutralisé plus de molécules d'anticorps.
La présente invention a, de plus, pour objet un procédé de criblage et de sélection de produits inhibiteurs de la tubuline-carboxypeptidase, caractérisé en ce qu'il comprend :
- la mise en contact de l'inhibiteur potentiel avec un extrait brut ou semi-purifié de TCP, tel que défini ci-dessus, dont la tyrosine a été préalablement radiomarquée, et
- la mesure de la tyrosine radiomarquée libre.
La présente invention a, en outre, pour objet l'utilisation d'un inhibiteur de la tubuline-carboxypeptidase, tel que défini ci-dessus, pour l'obtention d'un médicament anti-cancéreux.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre du procédé objet de la présente invention, avec référence aux dessins annexés, dans lesquels : - la figure 1 illustre le cycle tyrosination-detyrosination de la tubuline ;
- la figure 2 illustre les différences de séquences en C-terminal des différentes isoformes de tubuline.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 : Utilisation de cellules normales surproduisant de la tubuline-glu (action du taxol ou de la vinblastine), pour cribler des inhibiteurs de la TCP.
- Préparation des cellules Des cellules HeLa sont cultivées en routine dans un milieu RPMI
1640 supplémenté avec 10 % de sérum de veau foetal. - Traitement des cellules
Le traitement est réalisé à 37°C. Du taxol (5 μM, 10 μM ou 50 μM) ou de la vinblastine (10 μM) sont ajoutés au milieu de culture.
- Test : On ajoute un inhibiteur de TCP au milieu de culture (ou on le microinjecte aux cellules) ; on fixe les cellules par incubation dans du méthanol pur, 6 min, à -20°C. Les cellules fixées sont incubées avec des anticorps anti-tubuline-glu (1/500) et des anticorps anti-tubuline-tyr (YL1/2, 1/1000), suivie d'une deuxième incubation avec des anticorps de chèvre anti-rat conjugués à de la rhodamine (Jackson) (pour détecter les anticorps anti-tubuline-tyr) et un anticorps de chèvre antilapin (Cappel) (1/250) pour détecter les anticorps anti-tubuline-glu.
Les anticorps anti-tubuline-glu sont obtenus selon la procédure décrite dans Gundersen et al. (Cell, 1984, 38, 779-789). La séquence du peptide utilisé comme immunogène est GEEEGEE (7 résidus d'aminoacides de l'extrémité C- terminale de la tubuline-glu). Ce peptide est conjugué à la KLH et injecté à des lapins. La spécificité des anticorps obtenus est vérifiée par ELISA conformément à la méthode décrite par Gundersen et al. précité. Les IgG obtenus sont purifiées selon la méthode de McKinney et al. (J. Immunol. Meth.. 1987, 96. 271-278) et leur spécificité vis-à-vis de la tubuline-glu est vérifiée par analyse en western blot. L'anticorps monoclonal anti-tubuline-tyr YL1/2 reconnaît spécifiquement le résidu carboxy-terminal de la sous-unité α de la tubuline tyrosinée (Wehland J. et al., J. Cell Biol., 1983, 97, 1467-1475) ; il est obtenu selon la procédure décrite dans Kilmartin J.V. et al., J. Cell Biol., 1982, 93. 576-582).
En présence de TCP, on observe une détyrosination et seule la tubuline-glu est détectée, alors que lorsque les cellules sont en présence d'un inhibiteur de TCP, on mesure la tubuline-tyr.
EXEMPLE 2 : Utilisation de cellules normales dans lesquelles la TTL est inhibée. On microinjecte un anticorps qui inhibe la TTL comme décrit dans J. Wehland et al., J. Cell Science, 1987, 88, 185-203. En l'absence d'inhibiteur, on mesurera essentiellement la tubuline- glu, alors qu'en présence d'un inhibiteur, on pourra mesurer la tubuline-tyr apparue et vérifier la disparition de la tubuline-glu par double-marquage comme précisé à l'exemple 1.
EXEMPLE 3 : Utilisation de cellules TTL
Les cellules dérivées des cellules NIH/3T3 précitées, sont cultivées sur milieu DME complémenté avec du sérum de veau à 10 % et du sérum de veau foetal à 1 %.
Les sous-clones TTL" sont obtenus par dilution limite, après 3 cycles de croissance.
Ils sont sélectionnés en fonction de l'uniformité de leur phénotype, par double coloration en immuno fluorescence, en utilisant un anticorps anti-tubuline- glu, ou un anticorps anti-tubuline Δ2, en combinaison avec un anticorps anti-tubuline- tyr.
Les sous-clones TTL" sont ceux qui produisent de la tubuline-glu et de la tubuline Δ2 en abondance. Dans ces cellules, les microtubules Glu représentent la quasi-totalité des microtubules cytoplasmiques, au lieu de la petite sous-population habituellement observée dans les différents types cellulaires. La tubuline-tyr est peu abondante et est présente de manière diffuse dans les microtubules cytoplasmiques.
En présence d'un inhibiteur de la TCP, on pourra mesurer la tubuline-tyr apparue et vérifier la disparition de la tubuline-glu par double-marquage comme précisé à l'exemple 1.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS
1°) Utilisation de cellules issues de n'importe quel tissu, dans lesquelles le cycle de tyrosination-detyrosination de la tubuline est modifié, lesquelles cellules surproduisent de la tubuline-glu, pour la sélection ou le criblage de produits inhibiteurs de l'activité de la tubuline-carboxypeptidase (TCP).
2°) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que lesdites cellules sont obtenues soit par inhibition de la dynamique de renouvellement de l'assemblage de tubuline, soit par inhibition de l'activité TTL.
3°) Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, carac- térisée en ce que la dynamique de renouvellement de l'assemblage de tubuline est inhibée, soit par un agent de stabilisation des microtubules, soit par un alcaloïde de la pervenche.
4°) Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que l'activité TTL est inhibée par mise en contact desdites cellules avec au moins un anticorps anti-TTL.
5°) Utilisation de cellules ne produisant pas de TTL, pour un criblage ou une sélection d'inhibiteurs de la tubuline-carboxypeptidase.
6°) Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que les cellules TTL" sont des cellules dérivées des cellules NIH/3T3 déposées sous le N° ATCC CRL 1658, par multiples passages en culture, et dans lesquelles les microtubules Glu représentent la quasi totalité des microtubules cytoplasmiques.
7°) Utilisation d'un extrait brut ou semi-purifié de TCP, pour le criblage ou la sélection de produit inhibiteurs de l'activité TCP.
8°) Procédé de criblage et de sélection de produits inhibiteurs de la tubuline-carboxypeptidase, caractérisé en ce qu'il comprend :
- la mise en contact de l'inhibiteur potentiel avec une cellule ou un extrait brut ou semi-purifié de TCP, selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 et
- la mesure de la tubuline-tyr et/ou de la tubuline-glu.
9°) Procédé de criblage et de sélection de produits inhibiteurs de la tubuline-carboxypeptidase, caractérisé en ce qu'il comprend : - la mise en contact de l'inhibiteur potentiel avec un extrait brut ou semi-purifié de TCP, selon la revendication 7, dont la tyrosine est préalablement radiomarquée, et
- la mesure de la tyrosine radiomarquée libre.
10°) Utilisation d'un inhibiteur de la tubuline-carboxypeptidase, sélectionné selon le procédé de la revendication 8 ou de la revendication 9, pour l'obtention d'un médicament anti-cancéreux.
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