WO1999004781A1 - Agent promoteur de protection et de survie des cellules du systeme nerveux central - Google Patents

Description

明 細 書 中枢神経細胞の保護及び生存促進剤 技術分野

本発明は中枢神経細胞の保護及び生存促進剤に関するものである。 背景技術

海馬ニューロンは、 実験室的に培養可能な中枢神経細胞として神経生理学の分 野で広く用いられているが、 この細胞を単独で初代培養すると、 培養開始から一 週間後にかなりのニューロンが死滅してしまうことが知られている。 海馬ニュー ロンを長期間培養するための方法として、 グリア細胞 （ニューロンとその突起の 間を埋める神経膠細胞） との共存下で培養する方法が知られているが、 この培養 系は単一の培養系ではないので、 海馬ニューロンだけの栄養要求性やタンパク性 因子に対するニューロンの応答などを研究するために適切な系ではない。 グリア 細胞の非共存下で海馬ニューロンを培養する方法として、 全ての非必須ァミノ酸 の存在下で培養を行う方法が知られているが、 細胞の生存期間や生存数はグリア 細胞の共存下で行う培養に比べて著しく低レ、。

海馬ニューロ ンの初代培養系において、 グリア細胞の培養上清 （ACM， astrocyte conditioned medium)を添カロすることによりニューロンカ長期間生存 すること知られており、 その培養方法として Gosl in らの方法が確立されている (Gosl m, K. and Banker, G. ， 'し ulturing Nerve し e丄丄 s, Ed. by Banker, G. et al. , p. 251-278, The MIP Press, England)。 しかしながら、 この培養上清中の いかなる物質がニューロンの生存を促進しているのかについては全く解明されて いない。

一方、 末梢神経細胞であるニヮ トリガングリオンの形態分化に対して L-セリ ンが重要な因子として作用することが知られている （Savoca, R. ， Ziegler, U. and Sonderegger, P. , Journal of Neuroscience Methods, 61， pp. 159-167, 1995)。 しかしながら、 この刊行物に開示された L-セリンの作用はもっぱらニューロン の形態形成に関するものであり、 L-セリンがニューロンの生存に対してなんらか の作用を有するか否かについては全く示唆ないし教示はない。 また、 この試験系 で用いられた細胞は末梢神経細胞であり、 海馬ニューロンなどの中枢神経細胞と は発生や機能が著しく相違しているために、 この刊行物の教示からは中枢神経細 胞に対する L-セリンの作用は不明である。 発明の開示

本発明の課題は、 ニューロンの生存を促進する物質を提供することにある。 本 発明の別の課題は、 脳機能の改善剤を提供することにある。

本発明者らは上記の課題を解決すベく鋭意研究を行った結果、 海馬ニューロン に対してグリア細胞が細胞生存促進物質を分泌しており、 その物質が海馬ニュー ロンでは生産されていないこと、 並びに、 この物質が L-セリンであることを見 出した。 また、 本発明者は L-セリン又はグリシンが、 海馬ニューロンのみなら ず、 小脳顆粒細胞やプルキンェ細胞などの中枢神経細胞に対しても細胞生存促進 作用を有することを見出した。 本発明はこれらの知見を基にして完成されたもの である。

すなわち本発明は、 L -セリン、 グリシン、 及びそれらの脂肪酸化合物からなる 群から選ばれる物質、 好ましくは L -セリン及び Z又はグリシン、 より好ましく は L-セリンを有効成分として含む中枢神経細胞の細胞生存促進剤を提供するも のである。 本発明の好ましい態様によれば、 L-セリンを有効成分として含む中枢 神経細胞の細胞生存促進剤が提供される。

別の観点からは、 本発明により L -セリン、 グリシン、 及びそれらの脂肪酸化 合物からなる群から選ばれる物質、 好ましくは L-セリン及びノ又はグリシン、 より好ましくは L -セリンを有効成分として含む脳機能低下の予防及び/又は治 療剤が提供される。 また、 上記予防及び/又は治療剤の製造のための L-セリン、 グリシン、 及びそれらの脂肪酸化合物からなる群から選ばれる物質、 好ましくは L-セリン及び Z又はグリシン、 より好ましくは L-セリンの使用、 並びに脳機能 低下の予防及び Z又は治療方法であって、 L-セリン、 グリシン、 及びそれらの脂 肪酸化合物からなる群から選ばれる物質、 好ましくは L -セリン及び/又はダリ シン、 より好ましくは L-セリンの予防及び/又は治療有効量を患者に投与する 工程を含む方法が提供される。

さらに別の観点からは、 中枢神経細胞の細胞生存促進剤である L-セリン又は グリシンを含む中枢神経細胞培養用の培地組成物が提供される。 図面の簡単な説明

第 1図は、 海馬グリァ細胞とニューロンの培養上清中のァミノ酸濃度を示した 図である。

第 2図は、 海馬ニューロンの生存における非必須アミノ酸濃度の影響を示した 図である。

第 3図は、 グリァ細胞の培養上清中の非必須ァミノ酸濃度の経時変化を示した 図である。

第 4図は、 小脳プルキンェ細胞の初代培養におけるセリンの効果を示した図で ある。 白グラフはセリン非存在下；黒グラフは 200 μ Μ セリン存在下での結果 を示し、略号は以下のとおりである。 Ser : L-セリン； TNF :腫瘍壊死因子ひ； BDNF : 脳由来神経栄養因子； NT- 3 : ニューロ トロフィン- 3 ; NGF :神経成長因子； GDNF : グ リァ細胞株由来神経栄養因子 発明を実施するための最良の形態

本発明の細胞生存促進剤は L-セリン、 グリシン、 及びそれらの脂肪酸化合物 からなる群から選ばれる物質、 好ましくは L-セリン又はグリシン、 より好まし くは L-セリンを有効成分として含むことを特徴としている。 L -セリン又はダリ しては、 酸付加塩又は塩基付加塩を用いてもよレ、。 L-セリン又はグリシン の脂肪酸化合物は特に限定されないが、 例えばミリスチル化された L-セリン又 はグリシンなどを好適に用いることができる。 本発明の細胞生存促進剤は、 海馬 ニューロン、 小脳顆粒細胞、 及びプルキンェ細胞などの中枢神経細胞の細胞死を 抑制して、 これらの細胞を保護するとともに、 それらの長期生存を可能にする作 用を有している。 本発明の細胞生存促進剤の適用対象は特に限定されず、 中枢祌 経細胞であればいかなるものに適用してもよレ、。

本発明の細胞生存促進剤を培地に添加して中枢神経細胞の培養に用いることが できる。 このような培養系ではグリア細胞を共存させる必要はなく、 中枢神経細 胞を単一系で長期間培養することが可能になる。 本発明により提供される中枢神 経細胞培養用の培地組成物としては、 例えば、 イーグル MEM培地（25mM HEPES, 30 nM亜セレン酸ナトリウム， 500 μ Μ ピルビン酸ナトリウム， 3. 9 mMグルタミン， 16. 7 mM グノレコース， 100 μ Μ プトレシン， lO ^u g/ml ゲンタマイシン硫酸， 0. 1 mg/ml 牛血清アルブミンを最終濃度として含む） に対して、 L-セリン又はグリシ ン （好ましくはし-セリン） を 10〜200 μ Μ 、 好ましくは 50〜100 μ Μ 程度添加 した培地組成物を例示することができる。 もっとも、 本発明の培地組成物は上記 のものに限定されることはなく、 当業者に利用可能な適宜の培地に対して、 細胞 生存促進剤である L -セリン又はグリシン （好ましくは L-セリン） を例えば上記 の濃度で添加した培地組成物は、 いずれも本発明の範囲に包含されることはいう までもない。

本発明により提供される細胞生存促進剤は、 脳機能低下の予防及びノ又は治療 剤の有効成分として用いることができる。 本発明の医薬は、 脳細胞を保護して細 胞死を抑制するとともに細胞の寿命を延長する作用を有している。 従って、 本発 明の医薬は脳機能の低下を防止することができ、 及び Ζ又は脳細胞の生存性の低 下により惹起された脳機能低下を改善することができる。 本発明の医薬の適用対 象は特に限定されず、 脳機能低下を伴う各種の疾患の予防及び/又は治療に用い ることができる。 例えば、 脳出血、 脳梗塞、 及び頭部外傷などに伴う脳浮腫や脳 内温度の上昇によって引き起こされる脳細胞死を抑制することが可能である。 ま た、 老化に伴う脳細胞数の減少を抑制して、 老人性痴呆の発症を予防することも できる。 さらに、脳細胞の変性に起因するアルツハイマー病、 パーキンソン氏病、 又はハンチントン舞踏病などの予防及び z又は治療に有用である。

本発明の医薬としては、 L-セリン、 グリシン、 及びそれらの脂肪酸化合物から なる群から選ばれる物質の 1種又は 2種以上を用いることができる。 本発明の医 薬としては、 これらの物質の生理学的に許容される塩を用いてもよく、 また、 遊 離形態の物質又は生理学的に許容される塩の形態の物質の水和物又は溶媒和物を 用いてもよい。

本発明の医薬としては上記の物質それ自体を用いてもよいが、 通常は、 当業者 に利用可能な製剤用添加物を用いて上記の物質を有効成分として含む医薬組成物 を製造して用いることが好ましい。 薬理学的及び製剤学的に許容しうる製剤用添 加物としては、 例えば、 賦形剤、 崩壊剤ないし崩壊補助剤、 結合剤、 滑沢剤、 コ 一ティング剤、 色素、 希釈剤、 基剤、 溶解剤ないし溶解補助剤、 等張化剤、 p H 調節剤、 安定化剤、 噴霧剤、 又は粘着剤などを用いることができる。 経口投与に 適する製剤としては、 例えば、 錠剤、 カプセル剤、 細粒剤、 顆粒剤、 液剤、 また はシロップ剤などを挙げることができる。 また、 非経口投与に適する製剤として は、 例えば、 注射剤、 点滴剤、 坐剤、 吸入剤、 経粘膜吸収剤、 経皮吸収剤、 点鼻 剤、 点耳剤、 又は貼付剤などを挙げることができる。

経口投与、 あるいは経皮または経粘膜投与に適する製剤には、 薬理学的及び製 剤学的に許容しうる製剤用添加物として、 例えば、 ブドウ糖などの賦形剤；カル ボキシメチルセルロースなどの崩壊剤ないし崩壊補助剤； ヒ ドロキシメチルセル ロースなどの結合剤； ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤； ヒ ドロキシプロ ピルメチルセルロースなどのコーティング剤； ワセリンなどの基剤を用いること ができる。 また、 製剤用添加物として、 例えば、 圧縮ガスなどの噴霧剤； ポリア クリル酸ナトリゥムなどの粘着剤；木綿などの基布を用いてもよい。 注射又は点 滴用に適する製剤には、 製剤用添加物として、 注射用蒸留水などの水性媒体；用 時溶解型注射剤を構成しうる溶解剤ないし溶解補助剤 ； ブドウ糖などの等張化 剤；無機酸、 有機酸、 無機塩基、 又は有機塩基などの pH調節剤を用いることが できる。

本発明の医薬の投与量は、 対象となる疾患の種類、 患者の症状や年齢、 予防や 治療の目的など種々の条件に応じて適宜増減されるべきであり、 その量は当業者 がこれらの因子を考慮して適宜選択できる。 また、 中枢神経細胞の好適な生存に は L-セリン又はグリシン （好ましくは L-セリン） を 10〜200 μ Μ 、 好ましくは 50〜100 μ Μ程度が必要であることが本発明者により確認されており、 生体内の 生理的な条件下ではグリア細胞からこの濃度の L-セリンが供給されているもの と考えられる。 従って、 脳細胞の細胞死を抑制するためには、 脳細胞が上記濃度 の L-セリン又はグリシン （好ましくは L-セリン） に接触できるように投与量を 適宜調節することが望ましい。 なお、 本発明の脳機能低下の予防及び Ζ又は治療 剤を食品添加物として用いてもよく、 健康食品やドリンク剤の成分として用いて もよい。 実施例

以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、 本発明の範囲は下記 の実施例に限定されることはない。

(1) 材料及び方法

(a) 材料

確定妊娠 18 日目の Wistar/STラットは日本 SLC社から購入した。ィ一ダル MEM培 地、 牛胎児血清は Gibco 社、 培養用プレートは住友べ一クライ ト社と Becton Dickinson社より購入した。 ァミノ酸はいずれもレアミノ酸を用いた。

(b) ラッ ト海馬ニューロン及びグリア細胞の初代培養

ラット海馬ニューロンの初代培養は、既に報告されている方法に従った （Enokido, Y.， and Hatanaka, H. , Neuroscience, 57， pp. 965-972, 1993) ₀ 培地はィーグ ノレ MEM 培地 （25mM HEPES, 30 nM 亜セレン酸ナトリウム， 500 μ M ピルビン酸 ナトリ ウム， 3. 9 mMグノレタミン， 16. 7 mM グルコース， 100 μ Μ プ卜レシン， 10 /z g/ml ゲンタマイシン硫酸， 0. 1 mg/ml 牛血清アルブミンを最終濃度として含 む） を用いた。 また、 培養プレートはあらかじめポリエチレンィミンでコーティ ングしたものを用いた。

細胞数の計数及び細胞の形態観察の場合は、 直径 35腿 の 6穴プレート 1 well にっき、 200 μ ΐ の 10% 熱非働化牛胎児血清を含む培地に 2 X 10⁵ の細胞を懸 濁してプレーティングした。 脂質抽出の場合は、 直径 100 mm の培養プレートに つき 2 X 10⁶の細胞を 2 mlの培地中に懸濁してプレーティングした。 2時間 5% C0₂ インキュベータ中で保温した後、 1 ml (35 mm プレート） または、 6 ml (100 mm プレート） の無血清培地 （熱非働化牛胎児血清の代わりに、 10 / g/ml インシュ リン， 100 / g/mlアポトランスフェリン， 20 nM プロジェステロンを含む） に、 非必須ァミノ酸等の添加物を加えた無血清培地に交換して一晩培養した。 翌日、 グリア細胞の増殖を防止するために 1 μ Μ シトシンァラビノシドを含む無血清 培地に交換して培養を続けた。

グリア細胞は、 上と同じ方法で分散した細胞を 10% 熱非働化牛胎児血清を含 むイーグル MEM 培地に懸濁して、 未コーティングのプレートにまき、 コンフル ェントになるまで培養した。その後、 トリプシン- EDTAで細胞を分散して 1〜2回、 同培地で継代培養した。 再びコンフルェントになったところで上述の無血清培地 に交換した。

(c) 小脳ニューロンの初代培養

小脳顆粒細胞とプルキンェ細胞の初代培養は、 それぞれ の ら （Kubo， T. , Nonomura, T.， Enokido, Y. , ana riatanaka, Η. , Dev. Brain Res.， 85, pp. 249-258, 1995)及び Furuyaら (Furuya, S. , 0no, K.， and Hirabayashi, Y. , J. Neurochem.， 65, pp. 1551-1561, 1995)の方法に従った。

(d) 免疫染色

fji MAP2 (Microtubule— associated protein 2) モ ノ ク ロ 一 ナノレ 体 (Boehringer Mannheim社) と、 抗カノレビンテ-インモノクロ——ナノレ抗体 (Sigma社) によるニューロンの染色は、 それぞれ Enokido ら （Enokido, Y. , and Hatanaka, H. , Neuroscience, 57， pp. 965-972, 1993)及び Furuyaら (Furuya, S. , Ono, K. , and Hirabayashi, Y. , J. Neurochem. , 65, pp. 1551-1561, 1995)の方法で行つ た。

(e) 脂質解析

培養細胞を回収し、 クロ口ホルム/メタノール（1/2， 体積比） で総脂質を抽出 した。 Folchの分配法 （Folch, J. , Lees, M.， and Sloane- Stanley, G. H.， J. Biol. Chem. , 226, pp. 497-509, 1957)で二層分配した後、 HPTLCプレート （Silica Gel 60 HPTLC plate, Merck 社） を用いて薄層クロマトグラフィーを行った。 展開溶 媒として、 リン脂質 （クロ口ホルム層） の展開にはクロ口ホルム/メタノール/ ギ酸ノ酢酸/ 1M塩化マグネシウム（60/30/6. 5/4. 5/0. 1，体積比）、 糖脂質 （水層） の展開にはクロロホルム/メタノール /l2mM塩化マグネシウム（5/4/1,体積比） を用いた。 バンドの検出は、 プリムリン試薬 （非特異的）、 ヨウ素蒸気 （非特異 的）、 ニンヒ ドリン （ァミノ基）、 Ryu-MacCoss の試薬 （リン酸基） を用いた （井 上圭三，永井克孝，脊山洋右,新生化学実験講座, 4， pp. 37-47, 1991)。

(f) アミノ酸分析及び質量分析

培養上清中のアミノ酸は、 溶液を 5% トリクロ口酢酸、 あるいは 5%過塩素酸 で処理して遠心後、 上清をアミノ酸分析用の試料とした。 脂質中のアミノ酸は、 脂質を薄層クロマトグラフィーで展開後、 脂質を抽出し、 6 N塩酸で加水分解し たものをアミノ酸分析用の試料とした。 ァミノ酸分析は日立 S- 8500A アミノ酸 分析計を用いて行った。 TLC ブロッテイングによる脂質の精製、 及び質量分析

(SIMS分析） は既に報告されている方法に従った （Taki, Τ·， Kasama, T. , Handa, S. ' and Ishikawa, D. , Anal. Biochem. , 223, pp. 232-238, 1994 ; Kasama, T. , Hisano, Y.， Nakajima, M， Handa, S. , and Taki, T. , Glycoconj. J. , 13, pp. 461-469, 1996)。 なお、 タンパク質定量は牛血清アルブミンを基準として Pierce社の BCA タンパク量測定キットを用いて行った。 (2) 結果

(a) ィーグノレ MEM (minimum essential medium)中には、 非必須アミノ酸 （ァラ ニン、 ァスハ。ラギン酸、 グノレタミン酸、 グリシン、 ァスパラギン、 プロリン、 セ リン） が含まれていない。 この培地では海馬ニューロンを長期間培養することは 不可能であるため、 生体内ではこれらの非必須ァミノ酸がニューロンと共存する 細胞であるグリア細胞から供給されている可能性が示唆された。 そこで、 まず二 ユーロンとグリア細胞からどのようなァミノ酸が放出されているのかを調べた。 ラッ ト海馬のニューロンとグリア細胞とを無血清ィーグ MEM で別々に培養し、 一週間後に培養上清を回収して酸可溶性画分の非必須ァミノ酸濃度を測定した。 その結果、 グリア細胞の培養上清 （Astrocyte conditioned medium, ACM)にはセ リン、 グリシン、 ァスパラギン酸が他のアミノ酸に比べて高濃度に存在すること が判明した （図 1 )。

海馬ニューロンを種々の非必須アミノ酸存在下又は非存在下で 6日間培養した 後、 抗 MAP2 抗体で細胞を染色してニューロンの形態を調べたところ、 セリンと グリシンを加えた場合には樹状突起の伸長と生存率の増進が認められた。 ァスパ ラギン酸、 ァスパラギン、 プロリン、 ァラニン、 グルタミン酸には全く生存促進 活性が見られなかった。 海馬ニューロンの生存における非必須ァミノ酸濃度の影 響を調べるために、 海馬ニューロンを種々の非必須アミノ酸存在下で 6日間培養 し、 抗 MAP2 抗体で細胞を染色した後に細胞数を数えた。 結果を図 2に示す。 グ ラフには 3回の実験結果の平均と土標準誤差を示した。 この結果、 セリンとダリ シンはともに約 50〜100 μ Μ で最も生存促進活性が高かった。

グリア細胞の培養上清中の非必須ァミノ酸濃度の時間経過を調べるために、 経 時的にグリァ細胞の培養上清を採取し、 酸可溶性画分の非必須ァミノ酸濃度を測 定した。 結果を図 3に示す。 グラフには 3回の実験データの平均と土標準誤差を プロッ トした。 この結果、 セリンは他のァミノ酸に比べて速やかに細胞外に放出 されており、 培養 2日後に約 70 / Μ で平衡に達することが判明した。 この濃度 は、 ニューロンの生存を維持できる濃度であることから、 生理的にも意味のある 現象だと考えられる。 一方、 グリシンはニューロンの生存維持に必要な量は放出 されていなかった。 以上の結果から、 セリンは海馬ニューロンの生存に必須であ り、 その必要量がグリア細胞から放出されていることが判明した。

(b) 以上の結果から、 セリンがニューロンに生存を促進するシグナルを送ってい る力、 あるいはニューロン中ではセリンが合成できずに枯渴している可能性が考 えられる。 前者の可能性は、 セリン添加前後ではタンパク質のリン酸化に変化が 認められなかったことから否定された。 そこで、 ニューロン中ではセリンが合成 できずに枯渴している可能性を検証するために、 ニューロンの細胞膜に存在する セリン含有脂質について検討した。

海馬ニューロンを 100 μ Μ のセリン若しくはグリシンの存在下、 又は非存在 下で 6日間培養した後、 脂質を抽出して Folch 分配した。 クロ口ホルム層及び 水層を TLCで展開した後、 それぞれニンヒ ドリン及びプリムリン試薬で発色させ て脂質を検出した。 この結果、 クロ口ホルム層の脂質成分のうち、 セリン非存在 下で培養した細胞ではホスファチジルセリンの量が少なく、 ホスファチジルセリ ンよりもやや上側に新たな脂質 （X- 3)の生成が認められた。 また、 水層の画分に は、 セリンの存在下において認められる GTlb ガングリオシドゃ未同定脂質が、 セリン非存在下では消失していた。

そこで、 セリンの非存在下において出現した脂質 (X-3)の構造解析を行った。 この脂質は Ryu- MacCoss 反応及びニンヒ ドリン反応に対して共に陽性であり、 アミノ基含有リン脂質であることが示唆された。 また、 TLC 上の脂質（X - 3)のバ ンドをヨウ素蒸気で検出して精製し、 加水分解した後、 TLC プレートのよう素で 染色されない部分をコントローノレとしてァミノ酸分析を行ったところ、 トレオニ ンの存在が確認された。 さらに、 TLC -プロティング法により脂質 (X-3)を精製し て SIMS 分析した結果、 この脂質が 2つのナトリウムが結合した脂肪酸の長さの 違う 2つのピーク （846, 18 : 1/18 : 0、 870, 20 : 3/18 : 0) として検出され、 ホスフ ァチジルトレオニンであることが確認できた。

以上の結果は、 セリンの供給が絶たれた場合には、 卜レオニンが代替物として 利用されてホスファチジルトレオニンが生合成されることを示している。従って、 ニューロン自身にはセリンを合成する能力が欠けており、 ホスファチジルセリン の合成に必要なセリンの供給は、 グリア細胞に大きく依存しているものと考えら れる。 ホスファチジルセリンは、 ニューロンの生存に必須であるプロテインキナ ーゼ Cの活性化に必須の脂質であり (Kaibuchi, K. , Takai, Y. , and Nishizuka, Y. , J. Biol. Chem. , 256, pp. 7146-7149, 1981)、 この脂質の欠乏は細胞の生存 を脅かす一つの要因であると考えられる。 なお、 従来、 ホスファチジルトレオニ ンが神経に存在しているとの報告は全くない。

セリンは、 一般的にグルコースから解糖系の代謝中間体である 3-ホスホグリ セリン酸から、 3段階の酵素反応、 すなわち、 3-ホスホダリセリン酸→ (ホスホ グリセリン酸デヒ ドロゲナーゼ） →3 -ホスホヒ ドロキシピルビン酸— （ホスホセ リントランスアミナーゼ） —ホスホセリン→ (ホスホセリンホスファターゼ） → セリンを経て生合成される。 上記の結果から、 グリア細胞はこの経路で生合成し たセリンを速やかに細胞外に分泌していることが明らかになつたが、 海馬ニュー 口ンでは何らかの理由でセリンの合成が非常に少なく、 グリア細胞からの供給に 頼っているものと考えられる。

なお、 グリシンもニューロンの細胞死を抑制したが、 これは、 グリシンが細胞 内に取り込まれるとセリンヒ ドロキシメチルトランスフェラーゼによって容易に セリンが合成されることから説明できる。 もっとも、 セリンは、 セリンヒ ドロキ シメチルトランスフェラーゼによって触媒されるグリシンの de novo 合成の前 駆体としても用いられるので、 セリンの枯渴はグリシンの枯渴をもたらす。 従つ て、 これらの 2種のアミノ酸が無い状態では、 タンパク質合成も当然影響を受け るものと考えられる。

(c) セリンの生存促進効果は、 海馬ニューロンのみならず小脳の顆粒細胞におい ても観測された。 小脳顆粒細胞は、 培養一週間後にセリンを含有しない無血清培 地に全交換して培養を継続すると 7日目にはほとんど全てが細胞死を引き起こし ていたが、 200 μ Μ のセリンを加えた培地に全交換した後に 7日間培養した場合 には細胞死が完全に抑制されており、 細胞の形態も維持されていた。 同様に、 小 脳プルキンェ細胞においても、セリンが生存促進効果を有することが確認された。 従って、 中枢神経細胞一般にセリン合成は生存に十分な程度行われていないと考 えられる。

小脳プルキンェ細胞の初代培養におけるセリンの効果を確認するために、 小脳 プルキンェ細胞に対して図 4に記載されたそれぞれの処理を施し、 6日間（A) 又 は 12 日間（B) 培養した後、 抗カルビンディン抗体でプルキンェ細胞を染色して 細胞数を数えた。 結果を図 4に示す。 図中、 白グラフはセリンの非存在下での結 果を示し、 黒グラフは 200 // M セリン含有培地での結果を示す。 セリンは腫瘍壊 死因子一 a (TNF- a ) や脳由来神経栄養因子 （BDNF : brain-derived nerotrofic factor)などのタンパク性栄養因子の活性を増強する活性を有することが明らか になった。 産業上の利用可能性

本発明の医薬は、 脳細胞を保護して細胞死を抑制するとともに細胞の寿命を延 長する作用を有している。 従って、 本発明の医薬は脳機能の低下を防止すること ができ、 及び/又は脳細胞の生存性の低下により惹起された脳機能低下を改善す ることができる。

Claims

請 求 の 範 囲

1 . L-セリン、 グリシン、 及びそれらの脂肪酸化合物からなる群から選ばれる物 質を有効成分として含む中枢神経細胞の細胞生存促進剤。

2 . L-セリンを有効成分として含む請求の範囲第 1項に記載の中枢神経細胞の細 胞生存促進剤。

3 . L-セリン、 グリシン、 及びそれらの脂肪酸化合物からなる群から選ばれる物 質を有効成分として含む脳機能低下の予防及び/又は治療剤。

4 . 請求項 3に記載の脳機能低下の予防及び/又は治療剤の製造のための L -セ リン、 ダリシン、及びそれらの脂肪酸化合物からなる群から選ばれる物質の使用。

5 . 脳機能低下の予防及び Z又は治療方法であって、 L-セリン、 グリシン、 及び それらの脂肪酸化合物からなる群から選ばれる物質の有効量を患者に投与するェ 程を含む方法。

6 . 細胞生存促進剤である L-セリン又はグリシンを含む中枢神経細胞培養用の 培地組成物。

第 1図

第 2図

アミノ酸濃度 (μΜ)

2/4 第 3図

ァラニン ァスパラギン酸 グリシン ァスパラギン プロリン セリン

培養期間 （日）

3/4 プルキンェ細胞の数/ 10⁵小脳ニューロンの数 § 細胞の数 /105小脳二ユーロンの