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WO2006137469A1 - 代謝型グルタミン酸受容体活性化剤 - Google Patents

代謝型グルタミン酸受容体活性化剤 Download PDF

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WO2006137469A1
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metabotropic glutamate
glutamate receptor
group
diseases
acid
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Takeaki Ohsu
Sen Takeshita
Mitsuo Takahashi
Yuzuru Eto
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Ajinomoto Co., Inc.
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    • G01N2333/70571—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor

Definitions

  • the present invention relates to a metabotropic glutamate receptor activity inhibitor containing an amino acid other than glutamic acid.
  • the present invention also relates to a metabotropic glutamate receptor activator containing an amino acid other than glutamic acid, and a nucleic acid and Z or force thione.
  • the present invention further relates to a metabotropic glutamate receptor activator containing glutamic acid and nucleic acid, or glutamic acid, nucleic acid and cation.
  • glutamate In the central nervous system of mammals, glutamate, one of the amino acids, is a major excitatory neurotransmitter. Electrophysiological, anatomical, and biochemical analyzes enable rapid excitatory synaptic transmission, control of neurotransmitter release, long-term potentiation, learning 'memory, growth synaptic plasticity, hypoxic ischemic injury It has been shown that glutamate is involved in many-euron action processes, including neuronal cell death, epilepsy-like seizures, and the pathogenicity of several neurodegenerative disorders! / Speak.
  • glutamate acts not only as a neurotransmitter in the central nervous system but also promotes gastric acid secretion and gastrointestinal movement when acting on the digestive tract such as the stomach and intestine. It has begun to be recognized that it is useful not only in nerve cells but also in vivo.
  • Glutamate receptors are classified into ion channel receptors and metabotropic receptors.
  • the ion channel type glutamate receptor is a ligand-gated ion channel, and the cations flow into the cell when glutamate acts.
  • metabotropic glutamate receptors are G protein-coupled receptors, and by the action of dalutamic acid, extracellular signals are converted into intracellular second messengers according to the type of G protein.
  • Metabotropic glutamate receptors have eight types (mGluRl to mGluR8). Based on amino acid sequence homology, it is classified into three groups (Group I, II, III). The amino acid sequence homology within each group is about 70%, which is less than 50% among the conserved power groups. In addition, there are subtype-specific activators and inhibitors of metabotropic glutamate receptors that have been reported so far, but there are many cases where they are common within a group. It is considered to be approximate.
  • the metabotropic glutamate receptors belonging to Group I are subtypes 1 and 5 (mGluRl and mGluR5). When glutamate acts on these receptors, Gp is coupled to phospholipase C to produce IP3. To do. Metabotropic glutamate receptors belonging to Group II are subtypes 2 and 3 (mGluR2 and mGluR3), and when glutamate acts, it is coupled to Gi and inhibits adenylate cyclase, reducing intracellular cAMP. . Metabotropic glutamate receptors belonging to Group III are subtypes 4, 6, 7 and 8 (mGluR4, mGluR6, mGluR7 and mGluR8). When glutamate acts, it inhibits adenylate cyclase when coupled with Gi. Thus, intracellular cAMP is decreased.
  • the metabotropic glutamate receptor may act to promote in vivo functions or may act to suppress it.
  • therapeutic agents that act as activators and therapeutic agents that act as inhibitors are used according to the condition.
  • metabotropic glutamate receptors Since functional analysis of metabotropic glutamate receptors has been performed mainly on neuronal activity, applied research to date has mainly focused on neurological diseases. However, the results of gene expression analysis, etc. revealed that metabotropic glutamate receptors are widely distributed in living bodies other than the central nervous system, and may be involved in various biological functions and disease pathogenesis. Was raised. For example, group I metabotropic glutamate receptors are found in the liver, heart, and lymphocytes.
  • group ⁇ metabotropic glutamate receptors are expressed in the heart and small intestine, and group m metabotropic daltaminate receptors are expressed in the spleen and are involved in the function of each cell.
  • the present inventor has also confirmed that it is expressed in a wide range of tissues in vivo by RT-PCR analysis using RNA extracted from human and rat tissue forces. Based on the above, the application value of metabotropic glutamate receptor activators and inhibitors has rapidly increased. It's no exaggeration to say V! /.
  • Non-Patent Document 1 J Pharmacol Exp Ther. 2003 Apr; 305 (l): 131-42
  • Non-Patent Document 2 Epilepsia. 2003 Sep; 44 (9): 1153-9
  • Non-Patent Document 3 Chem Senses. 2000 Oct; 25 (5): 507-15.
  • Non-Patent Document 4 Ann N Y Acad Sci. 1998 Nov 30; 855: 398-406.
  • Non-Patent Document 5 Physiol Behav. 1991 May; 49 (5): 843-54.
  • Non-Patent Document 6 J Neurosci Res. 2004 Feb 15; 75 (4): 472-9.
  • Non-Patent Document 7 FEBS Lett. 2003 Jun 19; 545 (2-3): 233-8.
  • Non-Patent Document 8 Science. 1998 Mar 13; 279 (5357): 1722-5.
  • L-glutamic acid is the only known activator of metabotropic glutamate receptors, and there has been no activator based on amino acids other than L-glutamic acid.
  • the nerve action potential force elicited by L-glutamic acid caused by animal experiments using mice and rats is known to be enhanced by nucleotides such as S-inosinic acid and guanic acid. In these animal experiments, L-glutamic acid Confirmation of which biomolecules were evoked does not go beyond speculation.
  • an object of the present invention is to provide a novel metabotropic glutamate receptor active agent with high safety to living bodies.
  • the present inventors have shown that amino acids other than glutamic acid activate metabotropic glutamate receptors. Furthermore, it was shown that receptor activation by amino acids other than glutamic acid is enhanced by the coexistence of nucleic acids, particularly nucleotides such as inosinic acid and guanic acid, and cations, particularly metal divalent ions such as calcium and magnesium. . It was also found that activation of metabotropic glutamate receptors by glutamate is also enhanced by nucleic acids, or nucleic acids and cations. The present invention has been completed based on these findings.
  • the present invention is as follows.
  • Amino acid power other than glutamic acid A metabotropic glutamate receptor activator comprising at least one selected amino acid.
  • a group II metabotropic glutamate receptor activator comprising at least one amino acid selected from among taurine and hydroxyproliner.
  • Group m metabotropic glutamate receptor activator comprising cysteine.
  • the metabotropic glutamate receptor is a group II metabotropic glutamate receptor, and amino acids other than daltaminate are alanine, arginine, asparagine, aspartate, cystine, glutamine, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, (14)
  • a metabotropic glutamate receptor activator comprising (i) glutamic acid and a nucleic acid, or (ii) glutamic acid, a nucleic acid and a cation.
  • a group I metabotropic glutamate receptor activator comprising (i) glutamic acid and nucleic acid, or (ii) glutamic acid, nucleic acid and cation.
  • a group II metabotropic glutamate receptor activator comprising (i) glutamic acid and nucleic acid, or (ii) glutamic acid, nucleic acid and cation.
  • a group m metabotropic glutamate receptor activator comprising (i) glutamic acid and nucleic acid, or (ii) glutamic acid, nucleic acid and cation.
  • a method for screening an inhibitor of metabotropic glutamate receptor activation which comprises using (i) glutamic acid and nucleic acid, or (ii) glutamic acid, nucleic acid and cation.
  • FIG. 1 is a graph showing the action of glutamate on a group I metabotropic glutamate receptor.
  • MGluR5 cRNA was microinjected into Xenopus laevis oocytes and cultured at 18 ° C for 3 days. The intracellular current flowing when any concentration of glutamate was added was recorded. The maximum value of the intracellular current was taken as the response current value.
  • FIG. 2 is a diagram showing the action of amino acids and nucleic acids on group I metabotropic glutamate receptors.
  • Xenopus oocytes were microinjected with cRNA of mGluR5 and cultured at 18 ° C for 3 days. The flowing intracellular current was recorded when each amino acid at any concentration was added alone. When the same concentrations of each amino acid and nucleic acid (IMP) were added simultaneously, the flowing intracellular current was recorded. The response current value when amino acid alone is 1, and the response current value when nucleic acid (IMP) coexists is shown as a ratio.
  • FIG. 3 is a diagram showing the effects of amino acids and cations on group I metabotropic glutamate receptors.
  • Xenopus laevis oocytes were microinjected with mGluR5 cRNA and cultured at 18 ° C for 3 days.
  • the flowing intracellular current was recorded when each amino acid at any concentration was added alone.
  • the same concentration of each amino acid and cation (Ca 2+ ) was added simultaneously, the intracellular current flowing was recorded.
  • the response current value when amino acid alone is 1, and the response current value when cation (Ca 2+ ) coexists is shown as a ratio.
  • FIG. 4 Production of amino acids, nucleic acids and cations for group I metabotropic glutamate receptors
  • FIG. Xenopus laevis oocytes were microinduced with mGluR5 cRNA and cultured at 18 ° C for 3 days. The flowing intracellular current was recorded when each amino acid at any concentration was added alone. When the same concentration of each amino acid and nucleic acid (IMP) and cation (Ca 2+ ) were added simultaneously, the flowing intracellular current was recorded. The response current value when the amino acid alone is 1, and the response current value when the nucleic acid (IMP) and cation (Ca 2+ ) coexist is shown as a ratio.
  • FIG. 5 is a graph showing the action of glutamate on a group II metabotropic glutamate receptor.
  • MGluR3, GIRK1, and GIRK4 cRNA were microinjected into African Xenopus oocytes and cultured at 18 ° C for 3 days. The flowing intracellular current was recorded when any concentration of glutamate was added. The maximum value of the intracellular current was taken as the response current value.
  • FIG. 6 is a diagram showing the action of amino acids and nucleic acids on group II metabotropic glutamate receptors.
  • Xenopus laevis oocytes were microinduced with mGluR3, GIRK1 and GIRK4 cRNA and cultured at 18 ° C for 3 days.
  • the flowing intracellular current was recorded when each amino acid at any concentration was added alone.
  • the same concentrations of each amino acid and nucleic acid (IMP) were added simultaneously, the intracellular current flowing was recorded.
  • the response current value when amino acid alone is 1, and the response current value when nucleic acid (IMP) coexists is shown as a ratio.
  • FIG. 7 is a graph showing the effects of amino acids and cations on group II metabotropic glutamate receptors.
  • Xenopus oocytes were microincubated with mGluR3, GIRK1 and GIRK4 cRNA and cultured at 18 ° C for 3 days.
  • the flowing intracellular current was recorded when each amino acid at any concentration was added alone.
  • the same concentration of each amino acid and cation (Ca 2+ ) was added simultaneously, the flowing intracellular current was recorded.
  • the response current value when an amino acid alone is 1, and the response current value when a cation (Ca 2+ ) coexists is shown as a ratio.
  • FIG. 8 is a diagram showing the action of amino acids, nucleic acids and cations on group II metabotropic glutamate receptors.
  • Xenopus oocytes were microinjected with mGluR3, GIRK1, and GIRK4 cRNA and cultured at 18 ° C for 3 days.
  • the flowing intracellular current was recorded when each amino acid at any concentration was added alone.
  • the flowing intracellular current was recorded when the same concentrations of each amino acid and nucleic acid (IMP) and cation (Ca 2+ ) were added simultaneously.
  • the response current value when the amino acid alone is 1, and the response current value when nucleic acid (IMP) and cation (Ca 2+ ) coexist is shown as a ratio.
  • FIG. 8 is a diagram showing the action of amino acids, nucleic acids and cations on group II metabotropic glutamate receptors.
  • FIG. 9 is a graph showing the action of glutamate on a group III metabotropic glutamate receptor.
  • Xenopus laevis oocytes were microinduced with mGluR8, GIRK1 and GIRK4 cRNA and cultured at 18 ° C for 3 days. The flow of intracellular current was recorded when any concentration of glutamate was added. The maximum value of the intracellular current was taken as the response current value.
  • FIG. 10 is a diagram showing the action of amino acids and nucleic acids on group III metabotropic glutamate receptors.
  • Xenopus oocytes were microinjected with mGluR8, GIRK1 and GIRK4 cRNA and cultured at 18 ° C for 3 days.
  • the flowing intracellular current was recorded when each amino acid at any concentration was added alone.
  • the flowing intracellular current was recorded when the same concentrations of each amino acid and nucleic acid (IMP) were added simultaneously.
  • the response current value when amino acid alone is 1, and the response current value when nuclear acid (IMP) coexists is shown as a ratio.
  • FIG. 11 Diagram showing the effects of amino acids and cations on group III metabotropic glutamate receptors.
  • Xenopus oocytes were microinjected with mGluR8, GIRK1, and GIRK4 cRNA and cultured at 18 ° C for 3 days.
  • the flowing intracellular current was recorded when each amino acid at any concentration was added alone.
  • the same concentration of each amino acid and cation (Ca 2+ ) was added simultaneously, the flowing intracellular current was recorded.
  • the response current value when the amino acid alone is 1, and the response current value when the cation (Ca 2+ ) coexists is shown as a ratio.
  • FIG. 12 is a diagram showing the action of amino acids, nucleic acids and cations on a group III metabotropic glutamate receptor.
  • MGluR8, GIRK1 and GIRK4 cRNA were mixed into Xenopus laevis oocytes and cultured at 18 ° C for 3 days.
  • the flowing intracellular current was recorded when each amino acid at any concentration was added alone.
  • the flowing intracellular current was recorded when the same concentrations of each amino acid and nucleic acid (IMP) and cation (Ca 2+ ) were added simultaneously.
  • the response current value when the amino acid alone is 1, and the response current value when nucleic acid (IMP) and cation (Ca 2+ ) coexist is shown as a ratio.
  • each amino acid means an L amino acid.
  • the metabotropic glutamate receptor activator of the present invention contains one or more amino acids selected from amino acids other than glutamic acid.
  • amino acids other than glutamic acid means tan It includes 19 amino acids other than glutamic acid among the 20 amino acids that make up the protein, and ortine, taurine, and hydroxyproline.
  • the metabotropic glutamate receptor activator of the present invention may contain glutamic acid as another component as long as it contains one or more of the above-mentioned “amino acids other than glutamic acid”.
  • Aspartate, Norin and Cystein activate metabotropic glutamate receptors belonging to Group I. Therefore, one or more amino acids selected from aspartic acid, phosphorous and cysteine ability can be used as active agents for metabotropic glutamate receptors belonging to Group I.
  • Metabotropic glutamate receptors belonging to Group I include metabotropic glutamate receptor subtype 1 (mGluRl) and metabotropic glutamate receptor subtype 5 (mGluR5).
  • mGluRl include mGluRl encoded by the human mGluRl gene registered under GenBank Accession No. NM # 000838.
  • mGluR 5 include mGluR5 encoded by the human mGluR 5 gene registered under GenBank Accession No. NM # 000842.
  • mGluRl or mGluR5 is not limited to the protein encoded by the gene of the above sequence, and as long as it encodes a protein having these receptor functions, 60% or more, preferably 80% or more of the above sequence. It may be a protein encoded by a gene having homology of preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more. Receptor function can be examined by expressing these genes in cells and measuring changes in current and calcium ion concentration during glutamate supplementation.
  • prolinkers are also selected can be used as activators of metabotropic glutamate receptors belonging to group ⁇ .
  • Metabotropic glutamate receptors belonging to Group II include metabotropic glutamate receptor subtype 2 (mGluR2) and metabotropic glutamate receptor subtype 3 (mGluR3).
  • mGluR2 include mGluR2 encoded by the human mGluR2 gene registered under GenBank Accession No. NM # 000839.
  • mGluR 3 include mGluR3 encoded by the human mGluR 3 gene registered under GenBank Accession No. NM # 000840.
  • MGluR2 or mGluR3 is not limited to the protein encoded by the gene of the above sequence, and as long as it encodes a protein having these receptor functions, it is 60% or more, preferably 80% or more, more preferably It may be a protein encoded by a gene having a homology of 90% or more, particularly preferably 95% or more.
  • Cysteine activates metabotropic glutamate receptors belonging to Group III. Therefore, cysteine can be used as an agonist of metabotropic glutamate receptors belonging to Group III.
  • Metabotropic glutamate receptors belonging to Group III include metabotropic glutamate receptor subtype 4 (mGluR4), metabotropic glutamate receptor subtype 6 (mGluR6), metabotropic glutamate receptor subtype 7 (mGluR7), and metabotropic type And glutamate receptor subtype 8 (mGluR8).
  • mGluR4 include mGluR4 encoded by the human mGluR4 gene registered under GenBank Accession No. NM # 000841.
  • Examples of mGluR6 include mGluR6 registered by GenBank Accession No. NM # 000843 and encoded by human mGluR6.
  • Examples of mGluR7 include mGluR7 encoded by the human mGluR7 gene registered under GenBank Accession No.
  • mGluR8 examples include mGluR8 encoded by the human mGluR8 gene registered under GenBank Accession No. NM # 000845.
  • MGluR4, mGluR6, mGluR7 or mGluR8 is not limited to the protein encoded by the gene of the above sequence, and as long as it encodes a protein having these receptor functions, 60% or more, preferably 80% of the above sequence. It may be a protein encoded by a gene having homology of at least%, more preferably at least 90%, particularly preferably at least 95%.
  • the metabotropic glutamate receptor activator of the present invention activates not only the above-mentioned human metabotropic glutamate receptors but also mammalian metabotropic glutamate receptors including mice, rats and innu. Even so.
  • An amino acid other than glutamic acid activates a metabotropic glutamate receptor as follows: a living cell expressing a metabotropic glutamate receptor or a fragment thereof, a cell membrane expressing a metabotropic glutamate receptor or a fragment thereof It can be confirmed using an in vitro system containing a metabotropic glutamate receptor or a protein fragment thereof.
  • metabotropic glutamate receptors are individually or simultaneously expressed in cultured cells such as Xenopus oocytes, hamster ovary cells and human fetal kidney cells. This can be achieved by introducing each of the eight metabotropic glutamate receptor genes cloned in a plasmid into a cell as it is or as a cRNA obtained by using the plasmid as a cage.
  • An electrophysiological technique or a fluorescent indicator reagent for increasing intracellular calcium can be used to detect a metabotropic glutamate receptor activation reaction.
  • conjugated G protein for example G protein ⁇ 15, ⁇ 16 or Gq and Gi chimeric G protein together.
  • GIRK G protein-dependent potassium channel
  • metabotropic glutamate receptors The expression of metabotropic glutamate receptors is first confirmed by a response with L-glutamic acid or a specific active agent.
  • L Measure the concentration dependence by changing the concentration of glutamic acid.
  • amino acids other than L-glutamic acid are prepared in solutions of about 1 ⁇ M to 100 mM and added to the oocytes or cultured cells, so that the amino acids are active against metabotropic glutamate receptors. Measure whether it acts as a glaze.
  • the metabotropic glutamate receptor activator of the present invention may contain a nucleic acid in addition to the amino acid other than glutamic acid. That is, according to the present invention, (1) a group I metabotropic glutamate receptor activator comprising (1) one or more amino acids selected from aspartic acid, parin, cystine and the like, and (2) alanine, arginine , Asnolagin, Aspartate, Cystine, Glycine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Felularanine, Proline, Serine, Threonine, Tryptophan, Tyrosin, Norin, Orthine, Taurine, Hydroxypro A group that contains one or more amino acids and nucleic acids that are also chosen as linkers. ⁇ Metabotropic glutamate receptor activators, (3) Groups that contain cysteine and nucleic acids m Metabotropic glutamate receptor activities An agent is provided.
  • the nucleic acid is more preferably inosine monophosphate, which is preferably a nucleotide such as inosinic acid or guanic acid.
  • nucleic acids By coexisting with nucleic acids, stronger receptor activity is observed. Alternatively, receptor activation can be seen even if a cell that has no receptor activity due to amino acid alone has the same concentration of amino acids due to the coexistence of nucleic acids.
  • the ratio of amino acid and nucleic acid in the metabotropic glutamate receptor activator of the present invention is not particularly limited as long as acceptor activity is possible.
  • the weight ratio of nucleic acid to amino acid is 1:10 to 10: 1. I prefer to do that!
  • the metabotropic glutamate receptor activator of the present invention may contain a cation in addition to an amino acid other than glutamic acid. That is, according to the present invention, (1) a group I metabotropic glutamate receptor activator comprising at least one amino acid selected from aspartic acid, parin, cystine, and a cation, (2) alanine, arginine , Asparagine, aspartic acid, cystine, glutamine, glycine, histidine, iso-oralicine, leucine, lysine, methionine, phenylalanin, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, norin, orthine, taurine, Group II metabotropic glutamate receptor activator containing at least one amino acid selected from hydroxyproline and cation, (3) Group m metabotropic dartamic acid receptor containing cysteine and cation An activator is provided.
  • the ratio of the amino acid and cation in the metabotropic glutamate receptor activator of the present invention is not particularly limited as long as the receptor activity is possible.
  • the weight ratio of cation to amino acid is 1:10 to 10: 1. I prefer to do that.
  • Activation of group I metabotropic glutamate receptor, group II metabotropic glutamate receptor or group III metabotropic glutamate receptor by glutamate may also be enhanced by nucleic acids, or nucleic acids and cations. Found by the inventors.
  • the metabotropic glutamate receptor activator of the present invention comprises (i) glutamic acid and nucleic acid, or (ii) group I metabotropic glutamate receptor activator, group ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ metabotropic type, comprising glutamic acid, nucleic acid and cation.
  • group I metabotropic glutamate receptor activator group ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ metabotropic type, comprising glutamic acid, nucleic acid and cation.
  • It may be an II metabotropic glutamate receptor activator.
  • Metabotropic glutamate receptors are expressed in various tissues and have various physiological functions.
  • activators of metabotropic glutamate receptors have been developed as therapeutic or prophylactic agents for many diseases including internal diseases and nervous system diseases (for example, Ann
  • the metabotropic glutamate receptor activator of the present invention can be used as an active ingredient of a medicament for preventing or treating a disease involving a metabotropic glutamate receptor.
  • Diseases involving metabotropic glutamate receptors include medical diseases, neurological diseases, cardiovascular diseases, surgical diseases, neurosurgery diseases, thoracic surgery diseases, orthopedic surgery diseases, obstetrics and gynecology Diseases, urological diseases, pediatric diseases, ophthalmic diseases, otolaryngological diseases, dermatological diseases, dental diseases, and the like.
  • Methods for applying the metabotropic glutamate receptor activator based on the present invention to medicine include oral administration or invasive administration using injection or the like, or suppository administration, or transdermal. Administration can be employed.
  • the active ingredient can be administered in the form of a conventional pharmaceutical preparation by mixing with a solid or liquid nontoxic pharmaceutical carrier suitable for administration methods such as oral and injection.
  • Such preparations include solid dosage forms such as tablets, granules, powders and capsules, liquid dosage forms such as solutions, suspensions and emulsions, and lyophilized forms.
  • These preparations can be prepared by conventional means on preparations. If necessary, conventional additives such as a stabilizer, a wetting agent, an emulsifier, a binder, and an isotonic agent can be appropriately added.
  • the dose of the medicament of the present invention is sufficient if it is effective for treatment or prevention.
  • the frequency of administration is not particularly limited, and can be administered once to several times per day.
  • the metabotropic glutamate receptor activator of the present invention can also be used as a food or drink having an effect on the treatment or prevention of a disease involving a metabotropic glutamate receptor.
  • the container or package may be a food or drink that indicates that it has a therapeutic or preventive effect on a disease involving a metabotropic glutamate receptor as described above.
  • the present invention also provides a method for screening a metabotropic dalutamate receptor activation inhibitor characterized by using an amino acid other than glutamic acid.
  • the intracellular current value or intracellular calcium Compound that inhibits group I metabotropic glutamate receptor activity (group I) by measuring the concentration and selecting a compound that inhibits the increase in current value or calcium concentration due to aspartate, palin or cysteine.
  • Metabotropic glutamate receptor antagonists can be screened.
  • cells expressing metabotropic glutamate receptors belonging to Group II were added to lanine, arginine, asparagine, aspartate, cysteine, glutamine, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, rudouracil, proline.
  • Serine, threonine, tryptophan, tyrosine, norline, orthotin, taurine, or hydroxypro Phosphorus and test compounds are added to measure intracellular current values and intracellular calcium concentration, and by selecting compounds that inhibit the increase in current value and calcium concentration caused by these amino acids, group II metabotropic glutamate A compound that inhibits receptor activity (group II metabotropic glutamate receptor antagonist) can be screened.
  • systemic and test compounds are added to cells expressing metabotropic glutamate receptors belonging to Group III, and the intracellular current value and intracellular calcium concentration are measured.
  • a compound that inhibits the activity a compound that inhibits group m metabotropic glutamate receptor activity (group in metastatic glutamate receptor antagonist) can be screened.
  • nucleic acid cation may be added to the screening system together with the amino acid.
  • Test compounds used for screening can be low molecular weight compounds, saccharides, peptides, proteins, and the like.
  • the method for screening a metabotropic glutamate receptor activity inhibitory substance of the present invention uses glutamate and a nucleic acid or glutamate, nucleic acid and a cation, and a substance that inhibits the receptor activity caused by them.
  • a screening method may be used.
  • Metabotropic glutamate receptor subtype 5 (mGluR5) as group I metabotropic glutamate receptor
  • metabotropic glutamate receptor subtype 3 (mGluR3) as representative of group II metabotropic glutamate receptor
  • group III metabotropic glutamate receptor Representative glutamate receptor subtype 8 (mGluR8) was used as a representative.
  • GIRK1 G protein-dependent potassium channel 1
  • GIRK4 G protein-dependent potassium channel 4
  • mGluR8- N ACTAATACGACTCACTATAGGGAAAATGGTATGCGAGGGAAAG mGluR8-C TTCAGATTGAATGATTGCTGTAAC
  • GIRK1-C TTATGTGAAGCGATCAGAGTTCA
  • GIRK4-N ACTAATACGACTCACTATAGGGATGGCTGGCGATTCTAGGA
  • GIRK4-C AGGAGGTCTTAGGGAGGCT.G
  • PCR was performed under the following conditions using Pfo ultra DNA Polymerase (Stratagene) using cDNA derived from human brain (Clontech) as a material. After 3 minutes at 94 ° C, the reaction was repeated 35 times at 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 2 minutes, and then reacted at 72 ° C for 7 minutes. Amplification by PCR was performed by agarose electrophoresis, stained with a DNA staining reagent, and then detected by ultraviolet irradiation. The chain length of the PCR product was confirmed by comparison with a DNA marker of known size that was electrophoresed at the same time.
  • the plasmid vector pBR322 was cleaved with the restriction enzyme EcoRV (Takara). Each gene fragment amplified by PCR was ligated to the cleavage site using Ligation Kit (Promega). Escherichia coli DH5 ⁇ strain was transformed with this reaction solution, and a transformant carrying a plasmid in which a PCR amplification product was cloned was selected. Each PCR amplification product was confirmed by DNA nucleotide sequence analysis. These recombinant plasmids were used as cages, and cRNA for each receptor gene was prepared using a cRNA preparation kit (Ambion).
  • L-type amino acids As L-type amino acids, alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, gnoletamine, gnoletamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenyllauranin, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, varieties Special grades of 23 types of urine, orthine, taurine and hydroxyproline were used. Special grades of inosine and calcium chloride were used. Glutamine and cystine were prepared for use, and other reagents were stored at -20 ° C after preparation.
  • Amino acid, nucleic acid, catholyte lysate, solution for preparing Xenopus laevis oocytes, and solution for culturing oocytes used the following compositions.
  • the signal transduction via the metabotropic glutamate receptor was measured using the Ca concentration ion-dependent C1 ion current measurement method using an African megalelle oocyte expression system.
  • the abdomen of Xenopus laevis was incised, and the egg mass was taken out and then treated with a 1% collagenase solution at 20 ° C. for 2 hours to obtain individual oocytes.
  • Each oocyte was introduced with 50 nl of 1 ⁇ l receptor cRNA or 50 nl of sterilized water using a micromouth glass capillary and cultured at 18 ° C. for 2 to 3 days.
  • Example 2 the solution shown in Example 2 containing 2 mM pyruvic acid, lOU / ml penicillin, and 10 g / ml streptomycin was used.
  • a ligand solution was added to oocytes injected with cRNA or oocytes injected with sterilized water. Electrophysiological measurements were performed using an amplifier Geneclamp 500 (Axon) and recording software AxoScope 9.0 (Axon). The oocyte was fixed at -70 mV by the two-electrode membrane potential fixation method, and the intracellular current via Ca concentration ion-dependent C1 ions was measured. The maximum value of the intracellular current was taken as the response current value.
  • Example 7 shows the effects of amino acids containing glutamate and nucleic acids on group I metabotropic glutamate receptors.
  • Fig. 2 shows the results of enhancing the action of cysteine (3 mM) by the coexistence of inosinic acid (ImM).
  • the amino acid concentration was the same, the response current value increased due to the coexistence of nucleic acids.
  • the amino acid concentration is strong enough to cause no response current, the response due to the coexistence of nucleic acids.
  • Example 3 Using the method described in Example 3, the effects of amino acids containing glutamate and cations on group I metabotropic glutamate receptors were examined.
  • the amino acid concentration was the same, the response current value increased due to the coexistence of cations.
  • the amino acid concentration was strong enough to cause no response current, the response current was detected due to the coexistence of cations.
  • Group II metabotropic glutamate receptor subtype 3 mGluR3 cRNA and G protein-dependent potassium channel 1 (GIRK1) and G protein-dependent potassium channel 4 (GIRK4) cRNA (V, both of which are 2.5 ng)
  • mGluR3 G protein-dependent glutamate receptor subtype 3
  • GIRK1 G protein-dependent potassium channel 1
  • GIRK4 G protein-dependent potassium channel 4
  • alanine, algin, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, Norrin, ornithine, taurine, and hydroxyproline have been shown to have a stimulatory effect on group II metabotropic glutamate receptors.
  • Example 3 Using the method described in Example 3, the effects of amino acids containing glutamate and nucleic acids on group II metabotropic glutamate receptors were examined.
  • Fig. 6 shows the results of enhancing the action of glutamic acid (3 M), aspartic acid (300 ⁇ ), norrin (ImM), and leucine (ImM) in the presence of inosinic acid (ImM).
  • FIG. 5 shows the results of reaction of glutamic acid (3 / ⁇ ⁇ , 10 / ⁇ ⁇ , 30 / ⁇ ⁇ , 100 / ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ) for oocytes injected with medium and oocytes injected with sterile water as a control. Shown in 9.
  • the response current value increased due to the coexistence of cations.
  • the response current was detected by adding the other of cation or nucleic acid.
  • mGluR5 was used as the group I metabotropic glutamate receptor
  • mGluR3 was used as the group II metabotropic glutamate receptor
  • group III metabotropic glutamate was used.
  • receptor activity were performed using mGluR8 as a receptor, and other metabotropic glutamate receptors in each group were thought to be activated by amino acids other than glutamate as well.
  • RNA preparation from rat tissues was performed as follows.
  • RNA synthesis was performed using OligodT primer and Superscriptlll reverse transcriptase (Invitrogen).
  • RT-PCR of metabotropic glutamate receptor subtypes 1 to 8 was carried out as follows by synthesizing primers (SEQ ID NOs: 11 to 26) shown in Table 3.
  • the expression level of metabotropic glutamate receptor gene was analyzed by quantitative PCR using SYBR Green Realtime PCR Master Mix (manufactured by TOYOBO) and ABI PRISM 7700 Sequence Detector, using cDNA of each tissue as a template.
  • the tissue expression distribution is shown in Table 4. From these results, it was confirmed that metabotropic glutamate receptors are widely expressed in the living body, not only in the brain. This suggests that metabotropic glutamate receptors are involved in various organizing functions of peripheral tissues and organs, not just central functions.
  • GRM5- -f CCCCAAACTCTCCAGTCTC.
  • Receptor activators for GPCR treat various diseases Can be universally applied as a medicine.
  • GPCR G protein-coupled receptors
  • Acetylcholine receptor activator (Alzheimer's disease treatment), adrenergic receptor activator (bronchial asthma treatment, obesity treatment), opioid receptor activator (pain disease treatment), receptor activator (pain disease treatment), Calcitonin receptor activator (treatment of osteoporosis), cholecystokinin receptor activator (diabetes treatment), serotun receptor activator (migraine treatment), dopamine receptor activator (parkinson's disease treatment, sedative) , Melatonin receptor activator (primary insomnia treatment), melanocortin receptor activator (obesity treatment), etc.
  • metabotropic glutamate receptor activators belonging to GPCRs As shown in Example 19 and Table 3, the range of therapeutic drug application of metabotropic glutamate receptor activators belonging to GPCRs is that each subtype of metabotropic glutamate receptor is distributed in a wide range of tissues. Therefore, it is foreseen that it can be applied to a wide range of diseases. In addition, since metabotropic glutamate receptors are also distributed in the tongue and gastrointestinal tract, they can be applied to food areas that are not only therapeutic agents.

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Abstract

グルタミン酸以外のアミノ酸を代謝型グルタミン酸受容体活性化剤として用いる。より好ましくは、アスパラギン酸、バリン、又はシステインをグループI代謝型グルタミン酸受容体活性化剤として用い、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、オルニチン、タウリン、又はヒドロキシプロリンをグループII代謝型グルタミン酸受容体活性化剤として用い、システインをグループIII代謝型グルタミン酸受容体活性化剤として用いる。

Description

代謝型グルタミン酸受容体活性化剤
技術分野
[0001] 本発明はグルタミン酸以外のアミノ酸を含有する代謝型グルタミン酸受容体活性ィ匕 剤に関する。本発明はまた、グルタミン酸以外のアミノ酸、並びに核酸及び Z又は力 チオンを含有する代謝型グルタミン酸受容体活性化剤に関する。本発明はさらに、グ ルタミン酸及び核酸、又はグルタミン酸、核酸及びカチオンを含有する代謝型グルタ ミン酸受容体活性化剤に関する。
背景技術
[0002] 哺乳動物の中枢神経系にお 、て、アミノ酸の一つであるグルタミン酸は興奮性神経 伝達物質の中で主要なものである。電気生理学的、解剖学的、生化学的な分析によ り、急速な興奮性シナプス伝達、神経伝達物質放出の制御、長期増強、学習'記憶、 成長性シナプス可塑性、低酸素性虚血傷害 ·ニューロン細胞の死、てんかん様発作 、いくつかの神経変性障害の病変性など多くの-ユーロン作用過程には、グルタミン 酸が関与して ヽることが示されて！/ヽる。
さらに、最近、グルタミン酸が中枢神経系の神経伝達物質としてはたらくだけでなく 、例えば、胃や腸等の消化管に作用した場合、胃酸の分泌や消化管の動きを促進 することが示された。神経細胞に留まらず生体内で広く有用に作用することが認めら れ始めている。
[0003] 近年、グルタミン酸の作用機構を解明するため、グルタミン酸受容体に関する研究 が進行した (非特許文献 1〜8参照)。グルタミン酸受容体はイオンチャンネル型受容 体と代謝型受容体に分類される。イオンチャンネル型グルタミン酸受容体がリガンド ゲートのイオンチャネルであり、グルタミン酸が作用することで細胞内に陽イオンが流 れ込む。一方、代謝型グルタミン酸受容体は Gタンパク質結合受容体であり、ダルタミ ン酸が作用することで、 Gタンパク質の種類に応じて、細胞外シグナルを細胞内第 2メ ッセンジャーに変換する。
[0004] 代謝型グルタミン酸受容体には、 8種類 (mGluRl〜mGluR8)のサブタイプが存在し 、アミノ酸配列の相同性に基づき、 3つのグループ（グループ I、 II、 III)に分類されて いる。各グループ内のアミノ酸配列相同性は、 70%程度と保存されている力 グルー プ相互では 50%以下となる。また、これまで報告されている代謝型グルタミン酸受容 体の活性化剤や阻害剤はサブタイプ固有のものが存在するものの、グループ内で共 通する場合が多 、ことからも、グループ内の構造は近似して 、ると考えられて 、る。
[0005] グループ内では結合する Gタンパク質の種類も共通している。グループ Iに属する代 謝型グルタミン酸受容体は、サブタイプ 1及び 5 (mGluRl及び mGluR5)であり、この 受容体へグルタミン酸が作用すると、 Gqに共役してホスホリパーゼ Cを活性ィ匕し、 IP3 を産生する。グループ IIに属する代謝型グルタミン酸受容体は、サブタイプ 2及び 3 ( mGluR2及び mGluR3)で、グルタミン酸が作用すると、 Giに共役してアデ-ル酸シク ラーゼを阻害して、細胞内 cAMPが減少する。グループ IIIに属する代謝型グルタミン 酸受容体は、サブタイプ 4、 6、 7及び 8 (mGluR4、 mGluR6、 mGluR7及び mGluR8)で 、グルタミン酸が作用すると、 Giに共役してアデ二ル酸シクラーゼを阻害して、細胞内 cAMPが減少する。
[0006] 代謝型グルタミン酸受容体は、生体内機能に促進的にはたらく場合もあれば、抑制 的にはたらく場合もある。神経疾患、肝臓疾患、循環器疾患、消化器疾患、その他の 疾患において、活性化剤作用の治療薬と抑制剤作用の治療薬が病態に応じて使い 分けられる。
代謝型グルタミン酸受容体の機能解析は、主として神経細胞活動に関して行われ てきたため、今日までの応用研究も神経疾患が中心であった。しかし、遺伝子発現解 析などの結果から、代謝型グルタミン酸受容体が中枢神経系以外の生体内に広く分 布していることが明らかになり、様々な生体機能、疾患病因に関わっている可能性が 提起された。例えば、グループ I代謝型グルタミン酸受容体は肝臓、心臓、リンパ球に
、グループ Π代謝型グルタミン酸受容体は心臓、小腸に、グループ m代謝型ダルタミ ン酸受容体は脾臓に発現し、各細胞の機能に関わることが報告されている。本発明 者もヒト及びラットの各組織力ゝら抽出した RNAを材料とした、 RT-PCRによる解析から 、生体内において広範囲の組織に発現していることを確認した。以上のことから、現 在、代謝型グルタミン酸受容体の活性化剤や阻害剤の応用価値が急速に高まって V、ると言っても過言ではな!/、。
非特許文献 1 : J Pharmacol Exp Ther. 2003 Apr;305(l):131- 42
非特許文献 2 : Epilepsia. 2003 Sep;44(9): 1153-9
非特許文献 3 : Chem Senses. 2000 Oct;25(5):507- 15.
非特許文献 4 : Ann N Y Acad Sci. 1998 Nov 30;855:398- 406.
非特許文献 5 : Physiol Behav. 1991 May;49(5):843- 54.
非特許文献 6 : J Neurosci Res. 2004 Feb 15;75(4):472-9.
非特許文献 7 : FEBS Lett. 2003 Jun 19;545(2- 3):233- 8.
非特許文献 8 : Science. 1998 Mar 13;279(5357):1722-5.
発明の開示
これまでに代謝型グルタミン酸受容体活性化剤として、多くの特異的活性化剤が開 発されている力 グルタミン酸とシスティン酸など生体内に存在する化合物は少ない 。そのため、これらの活性化剤を含有してなる各種疾患に対する治療薬は、副作用 や透過性の点で大きな問題があった。
これまで代謝型グルタミン酸受容体の活性化剤としては、アミノ酸の中では唯一 L グルタミン酸が知られ、活性化剤開発でも L グルタミン酸以外のアミノ酸に基づ いたものはなかった。また、マウス、ラットを用いた動物実験により、 L—グルタミン酸 によって惹起される神経活動電位力 Sイノシン酸、グァニン酸等のヌクレオチドによって 増強されることが知られる力 これらの動物実験では、 L グルタミン酸によって惹起 された生体分子が、どれであるかの確認は、推測の域を出ない。カルシウム、マグネ シゥム等の金属二価イオン力 S、代謝型グルタミン受容体に対して単独あるいは Lーグ ルタミン酸と協調して応答を引き起こすことが示されている力 これらの実験で用いら れたアミノ酸は L グルタミン酸のみに留まり、他のアミノ酸にも同様な作用を示すか はわからな!ヽ。グルタミン酸以外のアミノ酸が代謝型グルタミン酸受容体活性化剤と して有用であることは知られて ヽな 、。
まして核酸およびカチオンで増強されると!/、うことは知られて 、な!/、。
すなわち、本発明は生体への安全性の高い新規な代謝型グルタミン酸受容体活性 ィ匕剤を提供することを課題とする。 [0008] 本発明者らは、グルタミン酸以外のアミノ酸が代謝型グルタミン酸受容体を活性ィ匕 することを示した。さらにグルタミン酸以外のアミノ酸による受容体活性化が、核酸、 特にイノシン酸、グァニン酸等のヌクレオチド、及びカチオン、特にカルシウム、マグ ネシゥム等の金属二価イオンが共存することにより増強されることを示した。また、グ ルタミン酸による代謝型グルタミン酸受容体活性化も核酸、又は核酸及びカチオンに よって増強されることを見出した。これらの知見に基づいて本発明を完成させた。
[0009] すなわち、本発明は以下のとおりである。
(1)グルタミン酸以外のアミノ酸力 選ばれる 1種類以上のアミノ酸を含有してなる代 謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
(2)さらに核酸を含有する、 (1)の代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
(3)さらにカチオンを含有する、 (1)又は（2)の代謝型グルタミン酸受容体活性化剤
(4)ァスパラギン酸、パリン、システィン力 選ばれる 1種類以上のアミノ酸を含有して なるグループ I代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
(5)さらに核酸を含有する、（4)のグループ I代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
(6)さらにカチオンを含有する、（4)又は（5)のグループ I代謝型グルタミン酸受容体 活性化剤。
(7)ァラニン、アルギニン、ァスパラギン、ァスパラギン酸、システィン、グルタミン、グリ シン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチォニン、フエ二ルァラニン、プロリ ン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、ノ リン、オル-チン、タウリン、ヒドロキ シプロリンカゝら選ばれる 1種類以上のアミノ酸を含有してなるグループ II代謝型グルタ ミン酸受容体活性化剤。
(8)さらに核酸を含有する、 (7)のグループ II代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
(9)さらにカチオンを含有する、 (7)又は（8)のグループ II代謝型グルタミン酸受容体 活性化剤。
do)システィンを含有してなるグループ m代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。 (11)さらに核酸を含有する、 do)のグループ m代謝型グルタミン酸受容体活性ィ匕 剤。 (12)さらにカチオンを含有する、（10)又は（11)のグループ m代謝型グルタミン酸受 容体活性化剤。
(13) (1)〜（12)の代謝型グルタミン酸受容体活性化剤を有効成分としてなる内科 系疾患、神経内科系疾患、循環器科系疾患、外科系疾患、脳神経外科系疾患、胸 部外科系疾患、整形外科系疾患、産婦人科系疾患、泌尿器科系疾患、小児科系疾 患、眼科系疾患、耳鼻咽喉科系疾患、皮膚科系疾患、または歯科系疾患を予防また は治療するための医薬。
(14)グルタミン酸以外のアミノ酸を用いることを特徴とする、代謝型グルタミン酸受容 体の活性ィ匕阻害物質をスクリーニングする方法。
(15)代謝型グルタミン酸受容体がグループ I代謝型グルタミン酸受容体であり、ダル タミン酸以外のアミノ酸がァスパラギン酸、ノ リン、又はシスティンである、（14)の方 法。
(16)代謝型グルタミン酸受容体がグループ II代謝型グルタミン酸受容体であり、ダル タミン酸以外のアミノ酸がァラニン、アルギニン、ァスパラギン、ァスパラギン酸、シス ティン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチォニン、 フエ二ルァラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、ノ リン、オル 二チン、タウリン、又はヒドロキシプロリンである、（14)の方法。
(17)代謝型グルタミン酸受容体がグループ III代謝型グルタミン酸受容体であり、グ ルタミン酸以外のアミノ酸がシスティンである、（14)の方法。
(18) (i)グルタミン酸及び核酸、又は (ii)グルタミン酸、核酸及びカチオンを含有して なる代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
(19) (i)グルタミン酸及び核酸、又は (ii)グルタミン酸、核酸及びカチオンを含有して なるグループ I代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
(20) (i)グルタミン酸及び核酸、又は (ii)グルタミン酸、核酸及びカチオンを含有して なるグループ II代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
(21) (i)グルタミン酸及び核酸、又は (ii)グルタミン酸、核酸及びカチオンを含有して なるグループ m代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
(22) (19)〜（21)のいずれかの活性化剤を有効成分としてなる内科系疾患、神経 内科系疾患、循環器科系疾患、外科系疾患、脳神経外科系疾患、胸部外科系疾患 、整形外科系疾患、産婦人科系疾患、泌尿器科系疾患、小児科系疾患、眼科系疾 患、耳鼻咽喉科系疾患、皮膚科系疾患、または歯科系疾患を予防または治療するた めの医薬。
(23) (i)グルタミン酸及び核酸、又は (ii)グルタミン酸、核酸及びカチオンを用いるこ とを特徴とする、代謝型グルタミン酸受容体の活性化阻害物質をスクリーニングする 方法。
(24)代謝型グルタミン酸受容体力 グループ I代謝型グルタミン酸受容体、グループ I I代謝型グルタミン酸または受容体グループ III代謝型グルタミン酸受容体である、 (23 )の方法。
図面の簡単な説明
[図 1]グループ I代謝型グルタミン酸受容体に対するグルタミン酸の作用を示す図。ァ フリカツメガエル卵母細胞に mGluR5の cRNAをマイクロインジェクションし、 18°Cにて 3 日間培養した。任意の濃度のグルタミン酸を添加した時に、流れる細胞内電流を記 録した。細胞内電流の最大値を応答電流値とした。
[図 2]グループ I代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸と核酸の作用を示す図。 アフリカッメガエル卵母細胞に mGluR5の cRNAをマイクロインジェクションし、 18°Cに て 3日間培養した。任意の濃度の各アミノ酸を単独で添加した時に、流れる細胞内電 流を記録した。同じ濃度の各アミノ酸と核酸 (IMP)を同時に添加した時に、流れる細 胞内電流を記録した。アミノ酸単独時の応答電流値を 1として、核酸 (IMP)が共存する 時の応答電流値を比で示した。
[図 3]グループ I代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸とカチオンの作用を示す 図。アフリカッメガエル卵母細胞に mGluR5の cRNAをマイクロインジェクションし、 18°C にて 3日間培養した。任意の濃度の各アミノ酸を単独で添加した時に、流れる細胞内 電流を記録した。同じ濃度の各アミノ酸とカチオン (Ca2+)を同時に添加した時に、流れ る細胞内電流を記録した。アミノ酸単独時の応答電流値を 1として、カチオン (Ca2+)が 共存する時の応答電流値を比で示した。
[図 4]グループ I代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸と核酸及びカチオンの作 用を示す図。アフリカッメガエル卵母細胞に mGluR5の cRNAをマイクロインジエタショ ンし、 18°Cにて 3日間培養した。任意の濃度の各アミノ酸を単独で添加した時に、流 れる細胞内電流を記録した。同じ濃度の各アミノ酸と核酸 (IMP)及びカチオン (Ca2+)を 同時に添加した時に、流れる細胞内電流を記録した。アミノ酸単独時の応答電流値 を 1として、核酸 (IMP)及びカチオン (Ca2+)が共存する時の応答電流値を比で示した。
[図 5]グループ II代謝型グルタミン酸受容体に対するグルタミン酸の作用を示す図。ァ フリカツメガエル卵母細胞に mGluR3と GIRK1と GIRK4の cRNAをマイクロインジェクシ ヨンし、 18°Cにて 3日間培養した。任意の濃度のグルタミン酸を添加した時に、流れる 細胞内電流を記録した。細胞内電流の最大値を応答電流値とした。
[図 6]グループ II代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸と核酸の作用を示す図。 アフリカッメガエル卵母細胞に mGluR3と GIRK1と GIRK4の cRNAをマイクロインジエタ シヨンし、 18°Cにて 3日間培養した。任意の濃度の各アミノ酸を単独で添加した時に、 流れる細胞内電流を記録した。同じ濃度の各アミノ酸と核酸 (IMP)を同時に添加した 時に、流れる細胞内電流を記録した。アミノ酸単独時の応答電流値を 1として、核酸 (I MP)が共存する時の応答電流値を比で示した。
[図 7]グループ II代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸とカチオンの作用を示す 図。アフリカッメガエル卵母細胞に mGluR3と GIRK1と GIRK4の cRNAをマイクロインジ ヱクシヨンし、 18°Cにて 3日間培養した。任意の濃度の各アミノ酸を単独で添加した時 に、流れる細胞内電流を記録した。同じ濃度の各アミノ酸とカチオン (Ca2+)を同時に 添加した時に、流れる細胞内電流を記録した。アミノ酸単独時の応答電流値を 1とし て、カチオン (Ca2+)が共存する時の応答電流値を比で示した。
[図 8]グループ II代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸と核酸及びカチオンの作 用を示す図。アフリカッメガエル卵母細胞に mGluR3と GIRK1と GIRK4の cRNAをマイ クロインジェクションし、 18°Cにて 3日間培養した。任意の濃度の各アミノ酸を単独で 添加した時に、流れる細胞内電流を記録した。同じ濃度の各アミノ酸と核酸 (IMP)及 びカチオン (Ca2+)を同時に添加した時に、流れる細胞内電流を記録した。アミノ酸単 独時の応答電流値を 1として、核酸 (IMP)及びカチオン (Ca2+)が共存する時の応答電 流値を比で示した。 [図 9]グループ III代謝型グルタミン酸受容体に対するグルタミン酸の作用を示す図。 アフリカッメガエル卵母細胞に mGluR8と GIRK1と GIRK4の cRNAをマイクロインジエタ シヨンし、 18°Cにて 3日間培養した。任意の濃度のグルタミン酸を添加した時に、流れ る細胞内電流を記録した。細胞内電流の最大値を応答電流値とした。
[図 10]グループ III代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸と核酸の作用を示す図 。アフリカッメガエル卵母細胞に mGluR8と GIRK1と GIRK4の cRNAをマイクロインジェ クシヨンし、 18°Cにて 3日間培養した。任意の濃度の各アミノ酸を単独で添加した時に 、流れる細胞内電流を記録した。同じ濃度の各アミノ酸と核酸 (IMP)を同時に添加し た時に、流れる細胞内電流を記録した。アミノ酸単独時の応答電流値を 1として、核 酸 (IMP)が共存する時の応答電流値を比で示した。
[図 11]グループ III代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸とカチオンの作用を示 す図。アフリカッメガエル卵母細胞に mGluR8と GIRK1と GIRK4の cRNAをマイクロイン ジヱクシヨンし、 18°Cにて 3日間培養した。任意の濃度の各アミノ酸を単独で添加した 時に、流れる細胞内電流を記録した。同じ濃度の各アミノ酸とカチオン (Ca2+)を同時 に添加した時に、流れる細胞内電流を記録した。アミノ酸単独時の応答電流値を 1と して、カチオン (Ca2+)が共存する時の応答電流値を比で示した。
[図 12]グループ III代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸と核酸及びカチオンの 作用を示す図。アフリカッメガエル卵母細胞に mGluR8と GIRK1と GIRK4の cRNAをマ イク口インジヱクシヨンし、 18°Cにて 3日間培養した。任意の濃度の各アミノ酸を単独で 添加した時に、流れる細胞内電流を記録した。同じ濃度の各アミノ酸と核酸 (IMP)及 びカチオン (Ca2+)を同時に添加した時に、流れる細胞内電流を記録した。アミノ酸単 独時の応答電流値を 1として、核酸 (IMP)及びカチオン (Ca2+)が共存する時の応答電 流値を比で示した。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明について説明する。本明細書中において各アミノ酸は特に断わらな い限り、 L アミノ酸を意味するものとする。
本発明の代謝型グルタミン酸受容体活性化剤は、グルタミン酸以外のアミノ酸から 選ばれる 1種類以上のアミノ酸を含有する。「グルタミン酸以外のアミノ酸」とは、タン パク質を構成する 20種類のアミノ酸のうちグルタミン酸以外の 19種類のアミノ酸、及び オル-チン、タウリン、ヒドロキシプロリンを含む。
なお、本発明の代謝型グルタミン酸受容体活性化剤は、上記「グルタミン酸以外の アミノ酸」の 1種類以上を含んでいればよぐその他の成分として、グルタミン酸を含ん でも構わない。
[0012] ァスパラギン酸、ノ リンおよびシスティンはグループ Iに属する代謝型グルタミン酸 受容体を活性化する。したがって、ァスパラギン酸、ノ《リンおよびシスティン力 選ば れる 1種類以上のアミノ酸はグループ Iに属する代謝型グルタミン酸受容体の活性ィ匕 剤として用いることができる。
グループ Iに属する代謝型グルタミン酸受容体としては、代謝型グルタミン酸受容体 サブタイプ 1 (mGluRl)及び代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ 5 (mGluR5)が挙げ られる。 mGluRlとしては、例えば、 GenBank Accession No. NM#000838で登録されて いるヒト mGluRl遺伝子によってコードされる mGluRlなどが挙げられる。また、 mGluR 5としては、例えば、 GenBank Accession No. NM#000842で登録されているヒト mGluR 5遺伝子によってコードされている mGluR5などが挙げられる。なお、 mGluRlまたは mG luR5は上記配列の遺伝子によってコードされるタンパク質に制限されず、これらの受 容体機能を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記配列と 60%以上、好ま しくは 80%以上、より好ましくは 90%以上、特に好ましくは 95%以上の相同性を有 する遺伝子によってコードされるタンパク質であってもよい。なお、受容体機能はこれ らの遺伝子を細胞に発現させ、グルタミン酸添カ卩時の電流の変化やカルシウムイオン 濃度の変化を測定することによって調べることができる。
[0013] ァラニン、アルギニン、ァスパラギン、ァスパラギン酸、システィン、グルタミン、グリシ ン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチォニン、フエ二ルァラニン、プロリン 、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、ノ リン、オル-チン、タウリン、ヒドロキシ プロリンはグループ IIに属する代謝型グルタミン酸受容体を活性ィ匕する。したがって、 ァラニン、アルギニン、ァスパラギン、ァスパラギン酸、システィン、グルタミン、グリシ ン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチォニン、フエ二ルァラニン、プロリン 、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、ノ リン、オル-チン、タウリン、ヒドロキシ プロリンカも選ばれる 1種類以上のアミノ酸はグループ πに属する代謝型グルタミン酸 受容体の活性化剤として用いることができる。
グループ IIに属する代謝型グルタミン酸受容体としては、代謝型グルタミン酸受容 体サブタイプ 2 (mGluR2)及び代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ 3 (mGluR3)が挙 げられる。 mGluR2としては、例えば、 GenBank Accession No. NM#000839で登録され ているヒト mGluR2遺伝子によってコードされる mGluR2などが挙げられる。また、 mGluR 3としては、例えば、 GenBank Accession No. NM#000840で登録されているヒト mGluR 3遺伝子によってコードされる mGluR3などが挙げられる。なお、 mGluR2または mGluR3 は上記配列の遺伝子によってコードされるタンパク質に制限されず、これらの受容体 機能を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記配列と 60%以上、好ましく は 80%以上、より好ましくは 90%以上、特に好ましくは 95%以上の相同性を有する 遺伝子によってコードされるタンパク質であってもよい。
システィンはグループ IIIに属する代謝型グルタミン酸受容体を活性ィ匕する。したが つて、システィンはグループ IIIに属する代謝型グルタミン酸受容体の作動薬として用 いることがでさる。
グループ IIIに属する代謝型グルタミン酸受容体としては、代謝型グルタミン酸受容 体サブタイプ 4 (mGluR4)、代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ 6 (mGluR6)、代謝 型グルタミン酸受容体サブタイプ 7 (mGluR7)及び代謝型グルタミン酸受容体サブタ ィプ 8 (mGluR8)が挙げられる。 mGluR4としては、例えば、 GenBank Accession No. N M#000841で登録されているヒト mGluR4遺伝子によってコードされる mGluR4などが挙 げられる。 mGluR6としては、例えば、 GenBank Accession No. NM#000843で登録され て!、るヒト mGluR6によってコードされる mGluR6などが挙げられる。 mGluR7としては、 例えば、 GenBank Accession No. NM#000844で登録されているヒト mGluR7遺伝子に よってコードされる mGluR7などが挙げられる。また、 mGluR8としては、例えば、 GenBa nk Accession No. NM#000845で登録されているヒト mGluR8遺伝子によってコードさ れる mGluR8などが挙げられる。なお、 mGluR4、 mGluR6、 mGluR7または mGluR8は上 記配列の遺伝子によってコードされるタンパク質に制限されず、これらの受容体機能 を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記配列と 60%以上、好ましくは 80 %以上、より好ましくは 90%以上、特に好ましくは 95%以上の相同性を有する遺伝 子によってコードされるタンパク質であってもよい。
[0015] 本発明の代謝型グルタミン酸受容体活性化剤は、上記ヒトの代謝型グルタミン酸受 容体のみならず、マウス、ラット、ィヌなど含めたほ乳類の代謝型グルタミン酸受容体 を活性ィ匕するものであってもよ 、。
[0016] 上記グルタミン酸以外のアミノ酸が代謝型グルタミン酸受容体を活性ィ匕することは、 代謝型グルタミン酸受容体又はその断片を発現した生きた細胞、代謝型グルタミン 酸受容体又はその断片を発現した細胞膜、代謝型グルタミン酸受容体又はその断 片のタンパク質を含むインビトロの系などを利用して確認することが出来る。
以下に生きた細胞を用いた一例を示すが、この一例に限定されるものではない。 代謝型グルタミン酸受容体の 8つサブタイプを個別にもしくは複数同時に、アフリカ ッメガエル卵母細胞やハムスター卵巣細胞ゃヒト胎児腎臓細胞等の培養細胞に発現 させる。これは、プラスミドにクローユングされた 8つそれぞれの代謝型グルタミン酸受 容体遺伝子を、そのままの状態もしくはプラスミドを铸型にして得られる cRNAとして 細胞に導入することで可能となる。代謝型グルタミン酸受容体活性化反応の検出に は電気生理学的手法や細胞内カルシウム上昇の蛍光指示試薬を用いることができる 。グループ II及びグループ III代謝型グルタミン酸受容体の機能解析を行うには、共役 Gタンパク質などを同時に用いることが好ましぐ例えば Gタンパク質 α 15や α 16もし くは Gqと Giのキメラ Gタンパク質を一緒に発現させる手法、もしくはアフリカッメガエル 卵母細胞の場合は Gタンパク質依存性カリウムチャネル (GIRK)を一緒に発現させる 手法も用いることが出来る。
[0017] 代謝型グルタミン酸受容体の発現は、初めに L グルタミン酸もしくは特異的活性 ィ匕剤による応答で確認する。 10 M程度の濃度の L グルタミン酸に対して、細胞 内電流 (nA)が見られた卵母細胞もしくは蛍光指示試薬の蛍光が見られた培養細胞 を使用する。 L グルタミン酸の濃度を変えて濃度依存性を測定する。次に、 L グ ルタミン酸以外のアミノ酸を 1 μ M〜100mM程度の各溶液に調製し、卵母細胞もし くは培養細胞に添加することで、アミノ酸が代謝型グルタミン酸受容体に対して活性 ィ匕剤として作用するかを測定する。 [0018] 本発明の代謝型グルタミン酸受容体活性化剤は、上記グルタミン酸以外のアミノ酸 に加えて、核酸を含むものであってもよい。すなわち、本発明によって、（1)ァスパラ ギン酸、パリン、システィンカゝら選ばれる 1種類以上のアミノ酸、及び核酸を含有して なるグループ I代謝型グルタミン酸受容体活性化剤、（2)ァラニン、アルギニン、ァス ノ ラギン、ァスパラギン酸、システィン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リ ジン、メチォニン、フエ二ルァラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロ シン、ノ リン、オル-チン、タウリン、ヒドロキシプロリンカも選ばれる 1種類以上のアミ ノ酸、及び核酸を含有してなるグループ Π代謝型グルタミン酸受容体活性化剤、 (3) システィン、及び核酸を含有してなるグループ m代謝型グルタミン酸受容体活性化剤 が提供される。
ここで、核酸としてはイノシン酸、グァニン酸等のヌクレオチドが好ましぐイノシンモ ノリン酸がより好ましい。
核酸が共存することによって、より強い受容体活性ィ匕が見られる。またはアミノ酸単 独では受容体活性ィ匕が見られな力つた細胞が、核酸が共存することによって同じ濃 度のアミノ酸であっても、受容体活性化が見られる。
本発明の代謝型グルタミン酸受容体活性化剤におけるアミノ酸と核酸の割合は受 容体活性ィ匕が可能である限り特に制限されないが、例えば、核酸とアミノ酸の重量比 が 1： 10〜10： 1とすることが好まし!/、。
[0019] 本発明の代謝型グルタミン酸受容体活性化剤は、グルタミン酸以外のアミノ酸に加 えて、カチオンを含むものであってもよい。すなわち、本発明によって、（1)ァスパラギ ン酸、パリン、システィンカゝら選ばれる 1種類以上のアミノ酸、及びカチオンを含有し てなるグループ I代謝型グルタミン酸受容体活性化剤、（2)ァラニン、アルギニン、ァ スパラギン、ァスパラギン酸、システィン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソ口イシ ン、ロイシン、リジン、メチォニン、フエ二ルァラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリ プトファン、チロシン、ノ リン、オル-チン、タウリン、ヒドロキシプロリンから選ばれる 1 種類以上のアミノ酸、及びカチオンを含有してなるグループ II代謝型グルタミン酸受 容体活性化剤、（3)システィン、及びカチオンを含有してなるグループ m代謝型ダル タミン酸受容体活性化剤が提供される。 ここでカチオンとしては、金属カチオンが好ましぐカルシウムイオンやマグネシウム イオンなどの 2価のカチオンがより好ましぐカルシウムイオンが特に好ましい。
カチオンが共存することによって、より強い受容体活性化が見られる。またはァミノ 酸単独では受容体活性ィ匕が見られな力つた細胞が、カチオンが共存することによつ て同じ濃度のアミノ酸であっても、受容体活性ィ匕が見られる。
本発明の代謝型グルタミン酸受容体活性化剤におけるアミノ酸とカチオンの割合は 受容体活性ィ匕可能である限り特に制限されないが、例えば、カチオンとアミノ酸の重 量比が 1： 10〜10： 1とすることが好まし 、。
[0020] グルタミン酸による、グループ I代謝型グルタミン酸受容体、グループ II代謝型グルタ ミン酸受容体又はグループ III代謝型グルタミン酸受容体の活性化もまた、核酸、又 は核酸及びカチオンによって増強されることが本発明者らによって見出された。
したがって、本発明の代謝型グルタミン酸受容体活性化剤は、（i)グルタミン酸及び 核酸、又は (ii)グルタミン酸、核酸及びカチオンを含む、グループ I代謝型グルタミン 酸受容体活性化剤、グループ Π代謝型グルタミン酸受容体活性化剤、又はグループ I
II代謝型グルタミン酸受容体活性化剤であってもよい。
[0021] 代謝型グルタミン酸受容体は様々な組織で発現しており、様々な生理作用を担つ ている。また、代謝型グルタミン酸受容体の活性化剤が内科系疾患や神経系疾患な どをはじめとした数多くの疾患の治療又は予防薬として開発されている（例えば、 Ann
N Y Acad Sci. 2003 Nov; 1003 :12-21. ； Annu Rev Pharmacol Toxicol. 1997;37:205-
37. ; J Med Chem. 2000 Jul 13;43(14):2609- 45.など）。
したがって、本発明の代謝型グルタミン酸受容体活性化剤は代謝型グルタミン酸受 容体が関与する疾患を予防又は治療するための医薬の有効成分として用いることが できる。代謝型グルタミン酸受容体が関与する疾患としては、内科系疾患、神経内科 系疾患、循環器科系疾患、外科系疾患、脳神経外科系疾患、胸部外科系疾患、整 形外科系疾患、産婦人科系疾患、泌尿器科系疾患、小児科系疾患、眼科系疾患、 耳鼻咽喉科系疾患、皮膚科系疾患、歯科系疾患などが挙げられる。
[0022] 本発明に基づく代謝型グルタミン酸受容体活性化剤を医薬へ適用する方法として は、経口投与あるいは注射等を利用した侵襲的投与ある 、は座薬投与ある 、は経皮 投与を採用することが出来る。有効成分を経口、注射などの投与方法に適した固体 または液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬製剤の形態で投与すること が出来る。このような製剤としては例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの固 形剤の形態、溶液剤、懸濁剤、乳剤などの液剤の形態、凍結乾燥剤などの形態が挙 げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することが出来る。また、必 要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤などの慣用の添加剤を 適宜添加することも出来る。
本発明の医薬の投与量は治療や予防に有効な量であればよぐ患者の年齢、性別
、体重、症状などに応じて適宜調節される力 例えば、 1回の投与において lkg体重 あたり、アミノ酸の量として、 0.01g〜10gが好ましぐ lkg体重あたり、 0.1g〜lgがより好 ましい。投与回数は特に制限されず、 1日あたり 1回〜数回投与することができる。
[0023] 本発明の代謝型グルタミン酸受容体活性化剤はまた、代謝型グルタミン酸受容体 が関与する疾患の治療や予防に効果を有する飲食品として用いることもできる。例え ば、容器や包装に上記のような代謝型グルタミン酸受容体が関与する疾患に対する 治療効果や予防効果がある旨を表示した飲食品とすることができる。
[0024] 本発明はまた、グルタミン酸以外のアミノ酸を用いることを特徴とする代謝型ダルタミ ン酸受容体活性化阻害物質のスクリーニング方法を提供する。
例えば、グループ Iに属する代謝型グルタミン酸受容体を発現させたアフリカッメガ エル卵母細胞や哺乳動物由来培養細胞に、ァスパラギン酸、パリン又はシスティン 及び試験化合物を添加して細胞内の電流値や細胞内カルシウム濃度を測定し、ァス ノ ラギン酸、パリン又はシスティンによる電流値やカルシウム濃度の上昇を阻害する 化合物を選択することにより、グループ I代謝型グルタミン酸受容体活性ィ匕を阻害す る化合物（グループ I代謝型グルタミン酸受容体拮抗薬)をスクリーニングすることがで きる。
また、グループ IIに属する代謝型グルタミン酸受容体を発現させた細胞に、了ラニン 、アルギニン、ァスパラギン、ァスパラギン酸、システィン、グルタミン、グリシン、ヒスチ ジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチォニン、フエ二ルァラニン、プロリン、セリン、 トレオ-ン、トリプトファン、チロシン、ノ リン、オル-チン、タウリン、又はヒドロキシプロ リン、及び試験化合物を添加して細胞内の電流値や細胞内カルシウム濃度を測定し 、これらのアミノ酸による電流値やカルシウム濃度の上昇を阻害する化合物を選択す ることにより、グループ II代謝型グルタミン酸受容体活性ィ匕を阻害する化合物（グルー プ II代謝型グルタミン酸受容体拮抗薬)をスクリーニングすることができる。
また、グループ IIIに属する代謝型グルタミン酸受容体を発現させた細胞に、システ イン及び試験化合物を添加して細胞内の電流値や細胞内カルシウム濃度を測定し、 システィンによる電流値やカルシウム濃度の上昇を阻害する化合物を選択することに より、グループ m代謝型グルタミン酸受容体活性ィ匕を阻害する化合物（グループ in代 謝型グルタミン酸受容体拮抗薬)をスクリーニングすることができる。
なお、上記スクリーニング系には、核酸ゃカチオンを上記アミノ酸とともに添加しても よい。
スクリーニングに用いる試験化合物は、低分子化合物、糖類、ペプチド、タンパク質 などを用いることができる。
[0025] さらに、本発明の代謝型グルタミン酸受容体活性ィ匕阻害物質のスクリーニング方法 は、グルタミン酸及び核酸、又はグルタミン酸、核酸及びカチオンを用い、これらによ る受容体活性ィ匕を阻害する物質をスクリーニングする方法であってもよい。
[0026] く実施例〉
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例 に限定されるものではない。
実施例 1
[0027] 遺伝子（cRNA)の調製
グループ I代謝型グルタミン酸受容体として代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ 5 ( mGluR5)、グループ II代謝型グルタミン酸受容体の代表として代謝型グルタミン酸受 容体サブタイプ 3 (mGluR3)、グループ III代謝型グルタミン酸受容体の代表として代 謝型グルタミン酸受容体サブタイプ 8 (mGluR8)を用いた。これら 3種類の代謝型ダル タミン酸受容体の遺伝子、および Gタンパク質依存性カリウムチャネル 1 (GIRK1)、 G タンパク質依存性カリウムチャネル 4 (GIRK4)の調製は以下のように行った。 NCBI ( National Center for Biotechnology Information)に登録された DNA配列（mGluR5 :NM #000842、 mGluR3 :NM#000840、 mGluR8 :NM#000845、 GIRK1 :NM#002239, GIRK4 ： NM#002239)を元に、 PCRに使う合成オリゴ DNA (フォワードプライマー（N)、及びリ バースプライマー (C) )を設計した (表 1) (配列番号 1 10)。
[0028] [表 1] 名称 配列 (5'-3')
mGluR5-N ACTAATACGACTCACTATAGGGCCTAAAATGGTCCTTCTGTTG mGluR5 - C TTCACAACGACGAGGAGCT
mGluR3-N ACTAATAC GACTCAC TATAGGGAAGAT GTT GACAAGACTGCAAG mGluR3-C ATCACAGAGATGAGGTGGTGG
mGluR8- N ACTAATACGACTCACTATAGGGAAAATGGTATGCGAGGGAAAG mGluR8-C TTCAGATTGAATGATTGCTGTAAC
GIRK1-N ACTAATACGACTCACTATAGGGATGTCTGCACTCCGAAGGA
GIRK1-C TTATGTGAAGCGATCAGAGTTCA
GIRK4-N ACTAATACGACTCACTATAGGGATGGCTGGCGATTCTAGGA
GIRK4-C AGGAGGTCTTAGGGAGGCT.G
[0029] ヒト脳由来の cDNA(Clontech社製）を材料として、 Pfo ultra DNA Polymerase (Strat agene社製)を用い、以下の条件で PCRを実施した。 94°Cで 3分の後、 94°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 2分を 35回繰り返した後、 72°Cで 7分の反応をした。 PCRによ つて増幅がなされたかをァガロース電気泳動法を行 ヽ、 DNA染色試薬で染色した 後、紫外線照射によって検出した。同時に電気泳動したサイズ既知の DNAマーカ 一と比較することで、 PCR産物の鎖長を確認した。プラスミドベクター pBR322を制限 酵素 EcoRV(Takara社製)によって切断した。その切断部位に PCRによって増幅された 各遺伝子断片を Ligation Kit (Promega社製)を用いて連結した。この反応溶液でェ シエリヒア'コリ DH5 α株を形質転換し、 PCR増幅産物がクローユングされたプラスミド を保持する形質転換体を選抜した。各々の PCR増幅産物を DNA塩基配列解析によ つて確認した。これらの組換えプラスミドを铸型とし、 cRNA作製キット (Ambion社)を用 V、て各受容体遺伝子の cRNAを作製した。
実施例 2
[0030] アミノ酸、核酸、カチオンの調製
L型アミノ酸として、ァラニン、アルギニン、ァスパラギン、ァスパラギン酸、システィン 、グノレタミン、グノレタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチ ォニン、フエ二ルァラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリ ン、オル-チン、タウリン、ヒドロキシプロリンの 23種類について特級グレードのものを 用いた。イノシン、塩ィ匕カルシウムは特級グレードのものを用いた。グルタミン、システ インは用事調製し、他の試薬は調製後、— 20°Cに保存した。アミノ酸、核酸、カチォ ンの溶解液、アフリカッメガエル卵母細胞の調製用の溶液、卵母細胞の培養用の溶 液は、以下の組成のものを使用した。 NaCl 96mM / KC1 2mM / MgCl
2
ImM / CaCl 1. 8mM / Hepes 5mM / pH = 7. 2。
2
実施例 3
[0031] アフリカッメガエル卵母細胞を用いた電気生理学的測定法
代謝型グルタミン酸受容体を介したシグナル伝達の測定方法は、アフリカッメガエ ル卵母細胞発現系を用いた Ca濃度イオン依存性 C1イオン電流測定法を用いた。ァ フリカツメガエル腹部を切開し、卵塊を取り出した後、 1%コラゲナーゼ溶液により 20 °Cで 2時間処理することで個々の卵母細胞を得た。 1個あたりの卵母細胞に、マイク 口ガラスキヤピラリーを用いて 50nlの 1 μ 1受容体 cRNAもしくは 50nlの滅菌水を 導入し、 18°Cで 2〜3日培養した。培養時には、実施例 2で示した溶液に 2mMピル ビン酸と lOU/mlペニシリンと 10 g/mlストレプトマイシンをカ卩えたものを使用した。培 養後、 cRNAを注入した卵母細胞もしくは滅菌水を注入した卵母細胞に対し、リガン ド溶液を添加した。電気生理学的測定は、増幅器 Geneclamp500 (Axon社製）および 記録用ソフト AxoScope9.0 (Axon社製）を用いて行った。卵母細胞を 2電極膜電位固 定法により― 70mVに膜電位固定し、 Ca濃度イオン依存性 C1イオンを介した細胞内 電流を測定した。細胞内電流の最大値を応答電流値とした。
実施例 4
[0032] グループ I代謝型グルタミン酸受容体に対するグルタミン酸の作用
実施例 3に記載した方法を用い、グループ I代謝型グルタミン酸受容体に対するグ ルタミン酸の作用を調べた。グループ I代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ 5 (mGlu R5)の cRNAもしくは滅菌水を注入した卵母細胞にっ 、て、グルタミン酸（3 M、 10 M、 30 /ζ Μ、 100 /ζ Μ)で反応した結果を図 1に示した。この結果より、卵母細胞に注入 した各代謝型グルタミン酸受容体の cRNAが機能的に発現して 、ることが確認された 。また、水を注入した卵母細胞は、高い濃度のグルタミン酸にも反応していないことか ら、卵母細胞自身には代謝型グルタミン酸受容体が発現して 、な 、ことが確認された 実施例 5
[0033] グループ I代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸の作用
実施例 3に記載した方法を用い、グループ I代謝型グルタミン酸受容体に対するグ ルタミン酸以外のアミノ酸の作用を調べた。グループ I代謝型グルタミン酸受容体サブ タイプ 5 (mGluR5)の cRNAもしくは滅菌水を注入した卵母細胞について、ァラニン（10 mM)、アルギニン（10mM)、ァスパラギン（10mM)、ァスパラギン酸 (300 μ Μ)、システ イン（ImM)、グルタミン（10mM)、グリシン（10mM)、ヒスチジン（10mM)、イソロイシン（ 10mM)、ロイシン（10mM)、リジン（10mM)、メチォ-ン（10mM)、フエ-ルァラニン（10 mM)、プロリン（10mM)、セリン（10mM)、トレオ-ン（10mM)、トリプトファン（10mM)、 チロシン（10mM)、 ノ リン（3mM)、オル-チン（10mM)、タウリン（10mM)、ヒドロキシプ 口リン（10mM)で反応した結果を表 2に示した。この結果より、グルタミン酸だけではな ぐァスパラギン酸、システィン、ノ《リンがグループ I代謝型グルタミン酸受容体に対す る促進作用を有することが示された。
[0034] [表 2]
mGluR5 mGluR3 mGluR8 ァラニン 活性化
アルギニン 活性化
ァスパラギン 活性化
ァスパラギン酸 活性化 活性化
システィン 活性化 活性化 活性化
グルタミン 活性化
グルタミン酸 活性化 活性化 活性化
グリシン 活性化
ヒスチジン 活性化
イソロイシン 活性化
ロイシン 活性化
リジン 活性化
メチォニン 活性化
フエ二ルァラニン 活性化
プロリン 活性化
セリン 活性化
卜レオニン 活性化
トリプ卜ファン 活性化
チロシン 活性化
パリン 活性化 活性化
オル二チン 活性化
タウリン 活性化
ヒドロキシプロリン 活性化 実施例 6
グループ I代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸と核酸の作用
実施例 3に記載した方法を用い、グループ I代謝型グルタミン酸受容体に対するグ ルタミン酸を含むアミノ酸と核酸の作用を調べた。グループ I代謝型グルタミン酸受容 体サブタイプ 5 (mGluR5)の cRNAもしくは滅菌水を注入した卵母細胞にっ 、て、グル タミン酸（3 M)、ァスパラギン酸 (300 μ Μ)、ノ リン（3mM)、システィン（3mM)の作用 がイノシン酸（ImM)が共存することによって増強した結果を図 2に示した。このとき、 アミノ酸濃度が同じであっても、核酸が共存することで応答電流値が大きくなつた。ま た、応答電流を惹起しな力つたアミノ酸濃度であっても、核酸が共存することで応答 実施例 7
[0036] グループ I代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸とカチオンの作用
実施例 3に記載した方法を用い、グループ I代謝型グルタミン酸受容体に対するグ ルタミン酸を含むアミノ酸とカチオンの作用を調べた。グループ I代謝型グルタミン酸 受容体サブタイプ 5 (mGluR5)の cRNAもしくは滅菌水を注入した卵母細胞にっ ヽて、 グルタミン酸（3 M)、ァスパラギン酸 (300 μ Μ)、 ノ リン（3mM)、システィン（3mM)の 作用がカルシウムイオン（10mM)が共存することによって増強した結果を図 3に示した 。このとき、アミノ酸濃度が同じであっても、カチオンが共存することで応答電流値大 きくなつた。また、応答電流を惹起しな力つたアミノ酸濃度であっても、カチオンが共 存することで応答電流が検出された。
実施例 8
[0037] グループ I代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸、核酸、カチオンの作用
実施例 3に記載した方法を用い、グループ I代謝型グルタミン酸受容体に対するグ ルタミン酸を含むアミノ酸と核酸およびカチオンの作用を調べた。グループ I代謝型グ ルタミン酸受容体サブタイプ 5 (mGluR5)の cRNAもしくは滅菌水を注入した卵母細 胞について、グルタミン酸（3 μ Μ)、ァスパラギン酸（300 μ Μ)、 ノ リン（3mM)、システ イン（3mM)の作用がイノシン酸（ImM)及びカルシウムイオン（10mM)の両方が共存 することによって増強した結果を図 4に示した。このとき、アミノ酸濃度が同じであって も、カチオンが共存することで応答電流値が大きくなつた。また、応答電流を惹起しな 力つたアミノ酸濃度が同じで核酸もしくはカチオンの一方が含まれている溶液あって も、カチオンもしくは核酸の他方を追加することで応答電流が検出された。
実施例 9
[0038] グループ II代謝型グルタミン酸受容体に対するグルタミン酸の作用
実施例 3に記載した方法を用い、グループ II代謝型グルタミン酸受容体に対するグ ルタミン酸の作用を調べた。グループ II代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ 3 (mGlu R3)の cRNAと同時に Gタンパク質依存性カリウムチャネル 1 (GIRK1)及び Gタンパク 質依存性カリウムチャネル 4 (GIRK4)の cRNA (いずれも 2.5ng)を中注入した卵母細 胞と、対照として滅菌水を注入した卵母細胞について、グルタミン酸（3 /ζ Μ、 10 /ζ Μ、 30 /ζ Μ、 100 /z M)で反応した結果を図 5に示した。この結果より、卵母細胞に注入し た各代謝型グルタミン酸受容体の cRNAが機能的に発現していることが確認された。 また、水を注入した卵母細胞は、高い濃度のグルタミン酸にも反応していないことから 、卵母細胞自身には代謝型グルタミン酸受容体が発現して 、な 、ことが確認された。 実施例 10
[0039] グループ II代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸の作用
実施例 3に記載した方法を用い、グループ II代謝型グルタミン酸受容体に対するァ ミノ酸の作用を調べた。グループ II代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ 3 (mGluR3) の cRNAと同時に Gタンパク質依存性カリウムチャネル 1 (GIRK1)及び Gタンパク質依 存性カリウムチャネル 4 (GIRK4)の cRNA (V、ずれも 2.5ng)を中注入した卵母細胞と、 対照として滅菌水を注入した卵母細胞について、 ImMの濃度の、ァラニン、アルギ ニン、ァスパラギン、ァスパラギン酸、システィン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ィ ソロイシン、ロイシン、リジン、メチォニン、フエ二ルァラニン、プロリン、セリン、トレオニ ン、トリプトファン、チロシン、ノ リン、オル-チン、タウリン、ヒドロキシプロリンで反応し た結果を表 2に示した。この結果より、グルタミン酸だけではなぐァラニン、アルギ- ン、ァスパラギン、ァスパラギン酸、システィン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソ ロイシン、ロイシン、リジン、メチォニン、フエ二ルァラニン、プロリン、セリン、トレオニン 、トリプトファン、チロシン、ノ リン、オル二チン、タウリン、ヒドロキシプロリンがグループ II代謝型グルタミン酸受容体に対する促進作用を有することが示された。
実施例 11
[0040] グループ II代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸と核酸の作用
実施例 3に記載した方法を用い、グループ II代謝型グルタミン酸受容体に対するグ ルタミン酸を含むアミノ酸と核酸の作用を調べた。グループ II代謝型グルタミン酸受容 体サブタイプ 3 (mGluR3)及び Gタンパク質依存性カリウムチャネル 1 (GIRK1)及び G タンパク質依存性カリウムチャネル 4 (GIRK4)の cRNAもしくは滅菌水を注入した卵母 細胞にっ 、て、グルタミン酸（3 M)、ァスパラギン酸 (300 μ Μ)、 ノ リン（ImM)、ロイ シン（ImM)の作用がイノシン酸（ImM)が共存することによって増強した結果を図 6に 示した。このとき、アミノ酸濃度が同じであっても、核酸が共存することで応答電流値 が大きくなつた。また、応答電流を惹起しな力つたアミノ酸濃度であっても、核酸が共 存することで応答電流が検出された。実施例 10で示された、グループ II代謝型ダル タミン酸受容体に対して作用する 23種類のアミノ酸の中から、任意に選んだ 4種類の アミノ酸に対して、同様の核酸の増強作用が認められたことから、この核酸による増 強作用はアミノ酸に対して普遍的であることが示唆された。
実施例 12
[0041] グループ II代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸とカチオンの作用
実施例 3に記載した方法を用い、グループ II代謝型グルタミン酸受容体に対するグ ルタミン酸以外のアミノ酸とカチオンの作用を調べた。グループ II代謝型グルタミン酸 受容体サブタイプ 3 (mGluR3)の cRNAと同時に Gタンパク質依存性カリウムチャネル 1 (GIRK1)及び Gタンパク質依存性カリウムチャネル 4 (GIRK4)の cRNA (V、ずれも 2.5ng )を中注入した卵母細胞と、対照として滅菌水を注入した卵母細胞について、グルタ ミン酸（3 M)、ァスパラギン酸 (300 μ Μ)、ロイシン（ImM)、システィン（ImM)の作用 がカルシウムイオン（10mM)が共存することによって増強した結果を図 7に示した。こ のとき、アミノ酸濃度が同じであっても、カチオンが共存することで応答電流値が大き くなつた。また、応答電流を惹起しな力つたアミノ酸濃度であっても、カチオンが共存 することで応答電流が検出された。実施例 10で示された、グループ II代謝型ダルタミ ン酸受容体に対して作用する 23種類のアミノ酸の中から、任意に選んだ 4種類のアミ ノ酸に対して、同様のカチオンの増強作用が認められたことから、このカチオンによる 増強作用はアミノ酸に対して普遍的であることが示唆された。
実施例 13
[0042] グループ II代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸、核酸、カチオンの作用
実施例 3に記載した方法を用い、グループ II代謝型グルタミン酸受容体に対するグ ルタミン酸を含むアミノ酸と核酸及びカチオンの作用を調べた。グループ II代謝型グ ルタミン酸受容体サブタイプ 3 (mGluR3)の cRNAと同時に Gタンパク質依存性力リウ ムチャネル 1 (GIRK1)及び Gタンパク質依存性カリウムチャネル 4 (GIRK4)の cRNA ( いずれも 2.5ng)を中注入した卵母細胞と、対照として滅菌水を注入した卵母細胞に っ 、て、グルタミン酸（3 M)、ァスパラギン酸 (300 μ Μ)、ロイシン（ImM)、システィ ン（ImM)の作用がイノシン酸（ImM)及びカルシウムイオン（10mM)が共存することに よって増強した結果を図 8に示した。このとき、アミノ酸濃度が同じであっても、核酸及 びカチオンが共存することで応答電流値が大きくなつた。また、応答電流を惹起しな 力つたアミノ酸濃度であっても、イノシン酸及びカチオンが共存することで応答電流が 検出された。実施例 10で示された、グループ II代謝型グルタミン酸受容体に対して作 用する 23種類のアミノ酸の中から、任意に選んだ 4種類のアミノ酸に対して、同様の イノシン酸及びカチオンの増強作用が認められたことから、この核酸及びカチオンに よる増強作用はアミノ酸に対して普遍的であることが示唆された
実施例 14
[0043] グループ m代謝型グルタミン酸受容体に対するグルタミン酸の作用
実施例 3に記載した方法を用い、グループ III代謝型グルタミン酸受容体に対するグ ルタミン酸の作用を調べた。グループ III代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ 8 (mGl uR8)の cRNAと同時に Gタンパク質依存性カリウムチャネル 1 (GIRK1)及び Gタンパク 質依存性カリウムチャネル 4 (GIRK4)の cRNA (V、ずれも 2.5ng)を中注入した卵母細 胞と、対照として滅菌水を注入した卵母細胞について、グルタミン酸（3 /ζ Μ、 10 /ζ Μ、 30 /ζ Μ、 100 /ζ Μ)で反応した結果を図 9に示した。この結果より、卵母細胞に注入し た各代謝型グルタミン酸受容体の cRNAが機能的に発現していることが確認された。 また、水を注入した卵母細胞は、高い濃度のグルタミン酸にも反応していないことから 、卵母細胞自身には代謝型グルタミン酸受容体が発現して 、な 、ことが確認された。 実施例 15
[0044] グループ III代謝型グルタミン酸受容体に対するアミノ酸の作用
実施例 3に記載した方法を用い、グループ III代謝型グルタミン酸受容体に対するグ ルタミン酸以外のアミノ酸の作用を調べた。グループ m代謝型グルタミン酸受容体サ ブタイプ 8 (mGluR8)の cRNAと同時に Gタンパク質依存性カリウムチャネル 1 (GIRK1) 及び Gタンパク質依存性カリウムチャネル 4 (GIRK4)の cRNA (いずれも 2.5ng)を中注 入した卵母細胞と、対照として滅菌水を注入した卵母細胞について、ァラニン（10mM )、アルギニン（10mM)、ァスパラギン（10mM)、ァスパラギン酸（300 μ Μ)、システィン (ImM)、グルタミン（10mM)、グリシン（10mM)、ヒスチジン（10mM)、イソロイシン（10m M)、ロイシン（lOmM)、リジン（lOmM)、メチォ-ン（lOmM)、フエ-ルァラニン（lOmM )、プロリン（10mM)、セリン（10mM)、トレオ-ン（10mM)、トリプトファン（10mM)、チロ シン（10mM)、ノ リン（3mM)、オル-チン（10mM)、タウリン（10mM)、ヒドロキシプロリ ン（10mM)で反応した結果を表 2に示した。この結果より、グルタミン酸だけではなぐ システィンがグループ III代謝型グルタミン酸受容体に対する促進作用を有することが 示された。
実施例 16
[0045] グループ m代謝型グルタミン酸受容体に対するシスティンと核酸の作用
実施例 3に記載した方法を用い、グループ III代謝型グルタミン酸受容体に対するグ ルタミン酸を含むアミノ酸と核酸の作用を調べた。グループ m代謝型グルタミン酸受 容体サブタイプ 8 (mGluR8)の cRNAと同時に Gタンパク質依存性カリウムチャネル 1 ( GIRK1)及び Gタンパク質依存性カリウムチャネル 4 (GIRK4)の cRNA (V、ずれも 2.5ng) を中注入した卵母細胞と、対照として滅菌水を注入した卵母細胞について、ダルタミ ン酸（3 M)、システィン（ImM)の作用がイノシン酸（ImM)が共存することによって増 強した結果を図 10に示した。このとき、システィン濃度が同じであっても、核酸が共存 することで応答電流値が大きくなつた。また、応答電流を惹起しな力つたシスティン濃 度であっても、核酸が共存することで応答電流が検出された。
実施例 17
[0046] グループ III代謝型グルタミン酸受容体に対するシスティンとカチオンの作用
実施例 3に記載した方法を用い、グループ III代謝型グルタミン酸受容体に対するグ ルタミン酸を含むアミノ酸とカチオンの作用を調べた。グループ m代謝型グルタミン酸 受容体サブタイプ 8 (mGluR8)の cRNAと同時に Gタンパク質依存性カリウムチャネル 1 (GIRK1)及び Gタンパク質依存性カリウムチャネル 4 (GIRK4)の cRNA (V、ずれも 2.5ng )を中注入した卵母細胞と、対照として滅菌水を注入した卵母細胞について、グルタ ミン酸（3 μ Μ)、システィン（ImM)の作用がカルシウムイオン（10mM)が共存すること によって増強した結果を図 11に示した。このとき、システィン濃度が同じであっても、 カチオンが共存することで応答電流値が大きくなつた。また、応答電流を惹起しなか つたシスティン濃度であっても、カチオンが共存することで応答電流値が検出された 実施例 18
[0047] グループ III代謝型グルタミン酸受容体に対するシスティン、核酸、カチオンの作用 実施例 3に記載した方法を用い、グループ I代謝型グルタミン酸受容体に対するグ ルタミン酸を含むアミノ酸と核酸およびカチオンの作用を調べた。グループ m代謝型 グルタミン酸受容体サブタイプ 8 (mGluR8)の cRNAと同時に Gタンパク質依存性力リウ ムチャネル 1 (GIRK1)及び Gタンパク質依存性カリウムチャネル 4 (GIRK4)の cRNA ( いずれも 2.5ng)を中注入した卵母細胞と、対照として滅菌水を注入した卵母細胞に ついて、グルタミン酸（3 M)、システィン（ImM)の作用がイノシン酸（ImM)及びカル シゥムイオン（10mM)の両方が共存することによって増強した結果を図 12に示した。 このとき、システィン濃度が同じであっても、カチオンが共存することで応答電流値が 大きくなつた。また、応答電流を惹起しな力つたシスティン濃度が同じで核酸もしくは カチオンの一方が含まれている溶液あっても、カチオンもしくは核酸の他方を追加す ることで応答電流が検出された。
[0048] なお、代謝型グルタミン酸受容体の I、 II、 IIIの各グループ内では、受容体構造と受 容体特性が近似していること、グループ内に共通な活性化剤、阻害剤が利用できる ことがよく知られている。代表例は、下記のとおりである。
グループ I代謝型グルタミン酸受容体活性化剤： DHPG
グループ I代謝型グルタミン酸受容体阻害剤： AIDA
グループ II代謝型グルタミン酸受容体活性化剤： DCG-IV
グループ II代謝型グルタミン酸受容体阻害剤： LY341195
グループ III代謝型グルタミン酸受容体活性化剤： L-AP4
グループ III代謝型グルタミン酸受容体阻害剤： CPPG
参^"文献； Psycnopharmacology Springer- Verlag 2005,「Review; Ionotropic and met abotropic glutamate receptor structure and pharmacologyj James N. C. Kew and Joh n A. Kemp。
したがって、本実施例ではグループ I代謝型グルタミン酸受容体として mGluR5を、グ ループ II代謝型グルタミン酸受容体として mGluR3を、グループ III代謝型グルタミン酸 受容体として mGluR8を用いて受容体活性ィ匕実験を行ったが、各グループ内のその 他の代謝型グルタミン酸受容体も同様に上記グルタミン酸以外のアミノ酸によって活 性化されると考えられた。
実施例 19
[0049] 代謝型グルタミン酸受容体の生体内分布
代謝型グルタミン酸受容体の生体内分布を示すために、ラットから得た RNAを材 料として、 RT—PCR法を用い、代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ 1〜8の組織発 現を以下のように調べた。ラット組織からの RNA調製は以下のように行った。 15週令 の雄 F344ラットから、大脳、小脳、肺、心臓、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、副甲状腺、 脾臓、脾臓、食道、胃上部、胃底部、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、精 巣、副精巣、膀胱、骨髄、ヒフク筋、ヒラメ筋、骨格筋、脂肪、前立腺、舌、舌下腺、胸 腺を単離した。 Total RNAの調製は Isogen (日本ジーン社製）を用いて行った。 Fast P rep (BIO101)またはポリトロンホモジェナイザーを用いて各組織をホモジェナイズし、 ホモジェネートから Total RNAを抽出した。 Total RNAをテンプレートとし、 OligodTプ ライマー、 Superscriptlll逆転写酵素（Invitrogen社製）を用いて cDNA合成を行った 。代謝型グルタミン酸受容体サブタイプ 1〜8の RT-PCRは、表 3に示すプライマー（ 配列番号 11 - 26)を合成し、以下のように行った。各組織の cDNAをテンプレートとし 、 SYBR Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO社製）、 ABI PRISM 7700 Sequen ce Detectorを用いた定量 PCR法により、代謝型グルタミン酸受容体遺伝子の発現量 を解析した。組織発現分布を表 4に示した。この結果より、代謝型グルタミン酸受容体 が脳だけではなぐ生体内に広く発現していることが確認された。このことから、代謝 型グルタミン酸受容体が中枢機能だけではなぐ末梢組織、末梢臓器の様々な整理 機能に関わっていることが示唆された。
[0050] [表 3] 名称 配列 (5'-3')
GR l- -f TATCTGAGTCGGTCCTCTGCAC
GR 1- -r ACACACTACAGGGTGGAAGAGC
GR 2' -f CAAGTGCCCGGAGAACTTCAAC
GRM2- -r CAC TGGAGG GACATAGAAGATAG
GR 3- - f CAAC GAAGCATGCC TATGC
GR 3- -r ACTGTAACCTTACCCTGTA
GR 4- -f GCTAC CAAACAGAC CTACG
GRM4. -r CCAATGTGCCATCCTCAGA
GRM5- -f CCCCAAACTCTCCAGTCTC.
GRM5- -r T CACAAC GAT GAAGAAC C
GR 6- - f CCAAACCACCACACTAACTGTGTC
GR 6- -r GGATGGAACAGGATGACGTAGG
GRM7' - f TCTAACCTGTTCCATGCCA
GR 7' -r ATAGGAAGCGGGCAGGAC
GRM8- -f CGCAAGAGAAGCTTCAAGGCTG
GRM8- -r TCACCTCGCCATTTGGTCTGTC ]
Figure imgf000030_0001
産業上の利用の可能性
GPCR(Gタンパク質共役型受容体)に対する受容体活性化剤は各種疾患の治療 薬として普遍的に応用できる。現在までに上巿もしくは研究中の治療薬の代表例を あげると、
アセチルコリン受容体活性化剤 (アルツハイマー病治療）、アドレナリン受容体活性 化剤 (気管支喘息治療、肥満治療)、ォピオイド受容体活性化剤 (疼痛病治療)、受 容体活性化剤 (疼痛病治療)、カルシトニン受容体活性化剤 (骨粗鬆症治療)、コレ シストキニン受容体活性化剤 (糖尿病治療)、セロチュン受容体活性化剤 (片頭痛治 療)、ドーパミン受容体活性化剤 (パーキンソン病治療、鎮静剤）、メラトニン受容体活 性化剤 (原発性不眠症治療)、メラノコルチン受容体活性化剤 (肥満治療)などがある
GPCRに属する代謝型グルタミン酸受容体の活性化剤の治療薬応用の範囲は、実 施例 19、表 3に示すように、代謝型グルタミン酸受容体の各サブタイプが広範な組織 に分布していることから、幅広い疾患に対して適用可能であることが予見される。また 、代謝型グルタミン酸受容体が舌や消化管にも分布することから、治療薬としてのみ でなぐ食品領域への応用も可能である。

Claims

請求の範囲
[I] グルタミン酸以外のアミノ酸力 選ばれる 1種類以上のアミノ酸を含有してなる代謝型 グルタミン酸受容体活性化剤。
[2] さらに核酸を含有する、請求項 1に記載の代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
[3] さらにカチオンを含有する、請求項 1又は 2に記載の代謝型グルタミン酸受容体活性 化剤 Q
[4] ァスパラギン酸、パリン、システィン力も選ばれる 1種類以上のアミノ酸を含有してなる グループ I代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
[5] さらに核酸を含有する、請求項 4に記載のグループ I代謝型グルタミン酸受容体活性 化剤 Q
[6] さらにカチオンを含有する、請求項 4又は 5に記載のグループ I代謝型グルタミン酸受 容体活性化剤。
[7] ァラニン、アルギニン、ァスパラギン、ァスパラギン酸、システィン、グルタミン、グリシ ン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチォニン、フエ二ルァラニン、プロリン 、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、ノ リン、オル-チン、タウリン、ヒドロキシ プロリンカゝら選ばれる 1種類以上のアミノ酸を含有してなるグループ Π代謝型ダルタミ ン酸受容体活性化剤。
[8] さらに核酸を含有する、請求項 7に記載のグループ II代謝型グルタミン酸受容体活性 化剤 Q
[9] さらにカチオンを含有する、請求項 7又は 8に記載のグループ II代謝型グルタミン酸 受容体活性化剤。
[10] システィンを含有してなるグループ III代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
[II] さらに核酸を含有する、請求項 10に記載のグループ III代謝型グルタミン酸受容体活 性化剤。
[12] さらにカチオンを含有する、請求項 10又は 11に記載のグループ m代謝型グルタミン 酸受容体活性化剤。
[13] 請求項 1〜12のいずれか一項に記載する代謝型グルタミン酸受容体活性化剤を有 効成分としてなる内科系疾患、神経内科系疾患、循環器科系疾患、外科系疾患、脳 神経外科系疾患、胸部外科系疾患、整形外科系疾患、産婦人科系疾患、泌尿器科 系疾患、小児科系疾患、眼科系疾患、耳鼻咽喉科系疾患、皮膚科系疾患、または 歯科系疾患を予防または治療するための医薬。
[14] グルタミン酸以外のアミノ酸を用いることを特徴とする、代謝型グルタミン酸受容体の 活性ィ匕阻害物質をスクリーニングする方法。
[15] 代謝型グルタミン酸受容体がグループ I代謝型グルタミン酸受容体であり、グルタミン 酸以外のアミノ酸がァスパラギン酸、パリン、又はシスティンである、請求項 14に記載 の方法。
[16] 代謝型グルタミン酸受容体がグループ II代謝型グルタミン酸受容体であり、グルタミン 酸以外のアミノ酸がァラニン、アルギニン、ァスパラギン、ァスパラギン酸、システィン 、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチォニン、フエ二 ルァラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、ノ リン、オル二チン 、タウリン、又はヒドロキシプロリンである、請求項 14に記載の方法。
[17] 代謝型グルタミン酸受容体がグループ m代謝型グルタミン酸受容体であり、ダルタミ ン酸以外のアミノ酸がシスティンである、請求項 14に記載の方法。
[18] (i)グルタミン酸及び核酸、又は (ii)グルタミン酸、核酸及びカチオンを含有してなる 代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
[19] (i)グルタミン酸及び核酸、又は (ii)グルタミン酸、核酸及びカチオンを含有してなる グループ I代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
[20] (i)グルタミン酸及び核酸、又は (ii)グルタミン酸、核酸及びカチオンを含有してなる グループ II代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
[21] (i)グルタミン酸及び核酸、又は (ii)グルタミン酸、核酸及びカチオンを含有してなる グループ m代謝型グルタミン酸受容体活性化剤。
[22] 請求項 18〜21のいずれかに記載する活性化剤を有効成分としてなる内科系疾患、 神経内科系疾患、循環器科系疾患、外科系疾患、脳神経外科系疾患、胸部外科系 疾患、整形外科系疾患、産婦人科系疾患、泌尿器科系疾患、小児科系疾患、眼科 系疾患、耳鼻咽喉科系疾患、皮膚科系疾患、または歯科系疾患を予防または治療 するための医薬。
[23] (i)グルタミン酸及び核酸、又は (ii)グルタミン酸、核酸及びカチオンを用いることを特 徴とする代謝型グルタミン酸受容体の活性化阻害物質をスクリーニングする方法。
[24] 代謝型グルタミン酸受容体が、グループ I代謝型グルタミン酸受容体、グループ II代 謝型グルタミン酸、または受容体グループ III代謝型グルタミン酸受容体である、請求 項 23に記載の方法。
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