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WO1999067282A2 - Recepteurs olfactifs et leurs utilisations - Google Patents

Recepteurs olfactifs et leurs utilisations Download PDF

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WO1999067282A2
WO1999067282A2 PCT/FR1999/001495 FR9901495W WO9967282A2 WO 1999067282 A2 WO1999067282 A2 WO 1999067282A2 FR 9901495 W FR9901495 W FR 9901495W WO 9967282 A2 WO9967282 A2 WO 9967282A2
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WO
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receptor
receptors
sequences
host
olfactory
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PCT/FR1999/001495
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WO1999067282A3 (fr
Inventor
Jean-Luc Clement
Alain Tirard
Marielle Renucci
Anne Belaich
Valéry MATARAZZO
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants

Definitions

  • the present invention relates to the discovery of new olfactory receptors in the groundhog, to the cloning and sequencing of the genes coding for these receptors as well as to the use thereof for the screening of ligands and the preparation of biosensors. .
  • odors are the result of a complex combination of several molecules. This complexity raises interesting questions about the characteristics of receptors to allow animals to recognize a myriad of odorous molecules (estimated at more than 10,000) at concentrations as low as 10 -12 M. It seems that recognition is based on a large multigene family of odor receptors comprising several hundreds or thousands of subtypes. These receptors are supposed to contain 7 trans-membrane domains, based on the hypothesis that odorous signals are transduced by cascades of reactions coupled to G proteins in sensory olfactory neurons. Transduction results in an increase in second messengers such as cyclic nucleotides or inositol triphosphate and in turn these messengers activate the ion-dependent channels and the phosphorylation of several proteins including the odor receptors themselves.
  • second messengers such as cyclic nucleotides or inositol triphosphate
  • Buck and Axel (3) first characterized rat odor receptors using amplification techniques (PCR) and degenerate primers corresponding to the most conserved domains of receptors coupled to G proteins. Since these early works, more than 339 receptors have been sequenced, most often partially, from a wide variety of species including humans, dogs, mice, chicken, two species of fish, two species of amphibians and a nematode. Many species remain to be studied, however, and it is estimated that more than 1,000 genes (or 1% of the genome) code for the olfactory receptor superfamily. The mechanisms underlying olfactory perception are singular and unique in comparison with other sensory systems and further study in this area which has important implications for the identification of these proteins is necessary.
  • PCR amplification techniques
  • oligonucleotides corresponding to the sequence of domains conserved in the second transmembrane domain, the second intracellular loop and the 7th transmembrane domain of olfactory receptors were used in pairs as primers for PCR from the complementary DNA obtained using 1 ′ Groundhog nasal epithelium mRNA.
  • the invention therefore relates to a purified groundhog olfactory receptor.
  • the distinction between tens of thousands of odors depends on a myriad of receptors located on the surface of the neuronal dendrites of the nasal epithelium.
  • the inventors Using the alpine marmot nasal epithelium and different sets of degenerate primers corresponding to consensus sequences of odor receptors, the inventors managed to amplify by reverse PCR (RT-PCR), clone and obtain the sequence partial of 23 new gene products encoding odor receptors.
  • RT-PCR reverse PCR
  • the invention therefore relates more particularly to a purified olfactory receptor constituted by or comprising the amino acid sequence chosen from those represented in the sequence list in the appendix under the numbers SEQ ID No: 1 to SEQ ID No: 23, or a functionally derived derivative equivalent of these.
  • equivalent derivative of these sequences is meant the sequences comprising a modification and / or a deletion and / or an addition of one or more amino acid residues but retaining approximately 75% and preferably at least 95% homology with the sequence from which it is derived.
  • the receptors of the invention have very conserved regions and very heterogeneous regions. It is considered that the very conserved regions are those which confer on the protein its receptor character, while the very heterogeneous regions are those which confer on each receptor its specificity. Thus, depending on the application envisaged, it is possible to prepare derivatives of the receptors of the invention whose specificity is modified but which remain within the scope of the present invention.
  • the subject of the invention is also poly or monoclonal antibodies directed against at least one receptor of the invention, a derivative or a fragment thereof.
  • These antibodies can be prepared by the methods described in the literature.
  • Polyclonal antibodies are formed according to conventional techniques by injecting proteins, extracted from epithelium or produced by genetic transformation of a host, in animals, then recovery of antisera and antibodies from antisera, for example by chromatography. 'affinity.
  • Monoclonal antibodies can be produced by fusing myeloma cells with spleen cells from animals previously immunized using the receptors of the invention. These antibodies are useful for searching for new olfactory receptors or the homologs of these receptors in other mammals or also for studying the relationship between receptors of different individuals or species.
  • the invention also relates to a nucleic acid molecule comprising or consisting of a nucleic sequence coding for a receptor as defined above. More particularly, the invention relates to a nucleic acid molecule comprising or consisting of a sequence chosen from those represented in the list of sequences in the appendix under the numbers SEQ ID No: 24 to SEQ ID No: 47, which code respectively for receptors whose amino acid sequences are represented in the sequence list in the appendix under the numbers SEQ ID No: 1 to SEQ ID No: 23.
  • the invention obviously also relates to the nucleotide sequences derived from the above sequences, for example due to the degeneracy of the genetic code, and which codes for proteins having characteristics and properties of olfactory receptors.
  • the invention also relates to a vector comprising at least one preceding nucleic acid molecule, advantageously associated with suitable control sequences, as well as a method of production or expression in a cellular host of a receptor of the invention. or a fragment of it.
  • the preparation of these vectors as well as the production or expression in a host of the proteins of the invention can be carried out by the techniques of molecular biology and genetic engineering well known to those skilled in the art.
  • a method for producing a receptor according to the invention consists in: transferring a nucleic acid molecule of the invention or a vector containing said molecule in a cellular host,
  • a method of expression of a receptor according to the invention consists in: transferring a nucleic acid molecule of the invention or a vector containing said molecule in a cellular host,
  • the cell host used in the above methods can be chosen from prokaryotes or eukaryotes and in particular from bacteria, yeasts, mammalian, plant or insect cells.
  • a nucleic acid molecule encoding an olfactory receptor or a vector according to the invention can also be used to transform animals and establish a line of transgenic animals.
  • the vector used is chosen according to the host to which it will be transferred; it can be any vector such as a plasmid.
  • the invention therefore also relates to cellular hosts expressing olfactory receptors obtained in accordance with the preceding methods.
  • the invention also relates to the nucleic acid probes and oligonucleotides prepared from the nucleic acid molecules of the invention.
  • probes are useful for the detection by hybridization of similar receptor sequences in other individuals or species.
  • these probes are brought into contact with a biological sample.
  • Different hybridization techniques can be implemented such as spot hybridization (Dot-blot) or hybridization on replicas (Southern technique) or other techniques (DNA chips).
  • Dot-blot spot hybridization
  • Southern technique hybridization on replicas
  • DNA chips DNA chips
  • the olfactory receptors are proteins with 7 transmembrane domains coupled with G proteins. of a ligand on the receptor causes a change in conformation of the receptor, and inside the cell, this signal is transduced via second messengers. Consequently, the subject of the invention is a method for screening for compounds capable of constituting ligands for the receptors described above, consisting in bringing a compound into contact with one or more of said receptors and in measuring by any appropriate means the affinity between said compound. and said receiver.
  • the contact between the compound to be tested and the olfactory receptor (s) of the invention can be carried out using hosts described above and expressing on their surface at least said receptors. It may be a line of immortalized olfactory cells or not, transfected with a vector carrying 1 ⁇ DNc making it possible to express on its surface and at a high level a functional recombinant olfactory receptor. If the test compound constitutes a ligand, bringing it into contact with transformed cells induces intracellular signals which result from the binding of said compound to the receptor.
  • the contacting of the compounds to be tested with the receptors of the invention can also be carried out by fixing one or more receptors on one or more membranes.
  • the olfactory receptors of the invention can therefore also be integrated into a biosensor. In such a system, it is possible to visualize in real time interactions between the test compound and the receptor.
  • One of the partners of the receptor / ligand couple is attached to an interface which may contain a matrix covered with aliphatic chains. This hydrophobic matrix can be easily covered with a lipid layer by spontaneous fusion of liposomes injected in contact with it. Olfactory receptors inserted into liposomes or vesicles can thus be integrated into biosensors.
  • the ligands are thus analyzed with respect to one or more different olfactory receptors.
  • the above methods are used to determine whether a compound activates or inhibits receptors.
  • the invention therefore also relates to a compound not yet known constituting a ligand of an olfactory receptor, identified and selected by the above method.
  • FIG. 2 shows the alignment of 14 of the 23 putative groundhog olfactory receptor sequences. 14 different sequences (AMOR 1 to AMOR 14) were analyzed using Clustalw software. The shaded regions indicate the consensus domains containing the amino acids almost (.) Or totally (*) conserved. The transmembrane domains (DU to
  • FIG. 3 represents the hydropathy profiles of the long sequences obtained with the primer set ct (AMOR 1 to AMOR 7) and the short sequences obtained with the primer set 3-2 (AMOR 8 to AMOR 14) were obtained as described in Material and Methods
  • the long sequences contain 6 regions of strong hydrophobicity (peaks) separated by 5 more hydrophilic valleys.
  • the short sequences have only 4 regions of high hydrophobicity and 3 hydrophilic regions.
  • FIG. 4 represents the analysis of the variability of the 14 new uninterrupted marmot olfactory receptor sequences.
  • FIG. 5 represents a dendrogram showing the similarities between olfactory receptors of different species.
  • the olfactory receptor sequences of other species come from the NCBI database. There are five families (noted on the left). The asterisks indicate the sequences for which the percentage of similarity between species exceeds 70%.
  • H male; F: fish; C: chicken; N: nematode; B: bee; A: amphibians; D: dog; M: mouse and MM: groundhog.
  • the olfactory epithelium was taken from a dead wild groundhog. During the dissection, the head was kept frozen in dry ice. The fabrics were kept at -80 ° C until used.
  • the poly (A) + mRNA was transcribed into cDNA using a reverse transcriptase and then amplified by PCR. To increase the production of the first strand of complete cDNA, the cDNA Cycle Kit was used. Reverse transcription was made from 150 ng of poly (A) + mRNA using oligo dT primers or rando pri ers. After extraction with phenol / H2O / EDTA (v / v / v: 1/20/80), the cDNA of the aqueous phase was precipitated in the presence of ammonium acetate and entrained glycogen in glacial ethanol at -80 ° C.
  • Primer 4 5 '-CC (CT) ATG TA (TC) TTI TT (TC) CT (CT) I (GC) (CT) AA (TC) (TC) TI TC.
  • Primer C 5'-CC (CT) ATG TA (TC) TTG TT (TC)
  • CT CT
  • G GC
  • CT CT
  • TC TC
  • TC- TC-
  • Primer 1 5 '- (AG) TT (TC) C (TG) IA (AG) (AG) (CG) (AT) (AG) TA IAT (GA) A (AT) IGG (AG) TT.
  • Primer T 5 '-GCA CTG CAG AT (AG) AAI GG (AG) TTI A (AG) ATI GG.
  • Primer 3 5 '-CAC AAG CTT TIG CIT A (TC) GA (CT) AG (AG) T (TA) (TC) (TCG) TIG C.
  • Primer 2 5' -GCA CTG CAG AT (AG) AAI GG (AG)
  • TTI A (AG) C ATI GG TTI A (AG) C ATI GG.
  • primer combinations have been designed to amplify products of the order of 520 bp.
  • the amplification was carried out in 50 microliters of a solution containing 5 microliters of cDNA, 2 mM dNTP, 100 ⁇ l of each degenerate primer, 1.5 U of Taq polymerase (Boehringer Mannheim, Germany), 50 mM KC1, 2.5 mM MgC12, 10 mM Tris / HCl pH8, 3 and 0.01 gelatin. To avoid evaporation, the surface of the mixture was covered with 35 microliters of mineral oil (Sigma, France).
  • thermocycler Hybaid, Omnigene, USA
  • the PCR was carried out using a thermocycler (Hybaid, Omnigene, USA) according to the following protocol: one cycle at 94 ° C for 90 s, 40 cycles at 94 ° C for 20 s, 50 ° C for 25 s and 72 ° C for 90 s, and a cycle at 72 ° C for 120 s.
  • each white colony was resuspended in 10 microliters of TE buffer.
  • the PCR was carried out in 10 microliters of a solution containing 1 microliters of colony suspension, 3 pmol of each universal primer U19 and T7, 10 mM dNTP, 50 mM KC1 and 2.5 mM MgC12 in a Tris HC1 pH 8 buffer, 3 with 0.25 U of Taq polymerase.
  • the protocol for PCR was as follows: one cycle at 94 ° C for 270 s, 30 cycles at 94 ° C for 30 s, 48 ° C for 30 s and 72 ° C for 50 s, and one cycle at 72 ° C for 120 s.
  • 10 microliters of the reaction product were analyzed on a 2% agarose gel.
  • the positive clones were cultured in liquid LB medium containing 0.1 mg / ml of 1 ampicillin.
  • the plasmid cDNA was extracted and purified using the Wizard miniprep kit (Promega). The samples were sequenced by Génome Express (Grenoble, France).
  • the PCR amplification was carried out with 150 ng of mRNA using the three sets of specific degenerate primers (ct, 4-1, 3-2) described previously in Materials and Methods. Analysis of the electrophoresis carried out with 5 microliter aliquots of the PCR products revealed single bands of the expected size (FIG. 1). With the "T” cDNA, a 520 bp band was obtained with the primers 3-2 and a 720 bp band with the primers ct. With cDNA "R”, a band of 720 bp was obtained using the primers ct. No bands were observed in the other three runways. In the control PCRs, in which a single primer was used, no band of the expected length was observed.
  • the electrophoresis was repeated using the remaining 45 microliters of the sample, and the 550 and 720 bp fragments were extracted. Given the diversity of olfactory receptors, it has been assumed that the population of cDNAs in a band was heterogeneous and therefore no attempt was made to directly sequence the PCR-amplified cDNA fragments. These fragments were cloned into E. coli as described above.
  • the agarose gel electrophoresis of the PCR products showed that 5 R c-t clones, 10 T c-t clones and 22 T 3-2 clones had fragments of the expected size. These 37 positive clones were cultured again for mass production.
  • the average percentage of identical residues was 64%. Seven (AMOR 1-7) of the new marmot sequences were amplified from a pair of primers designed from the transmembrane domains II and VII and are 234 to 237 residues long. Seven other sequences (AMOR 8-14) were obtained with the primers designed from intracellular loop 2 (i2) and the transmembrane domain VII and contain 176 residues. The percentage of identical residues between these 14 new sequences is between 33% (AMOR 4 / AMOR 8) and 79% (AMOR 8 / AMOR 11).
  • the inventors also sought to locate the positions involved in the specific odor binding site by applying an analysis previously introduced for the molecules which bind the antigens.
  • the reasoning is that if these olfactory receptors are supposed to specifically bind odorous molecules, the residues which constitute the specific binding site could show more variability than those which are involved in the core structure and in the signaling function.
  • Figure 4 shows the variability profiles obtained with the alignment of Figure 2. Four peaks of variability are clearly visible.
  • the average hydropathy plot profile shown in parallel indicates that they are not only located within hydrophilic loops as expected (position 210), but also in hydrophobic regions ( eg position 148).
  • the center of the most variable segments is located at positions 30, 100, 148 and 210, the mapping respectively inside the 1st extracytoplasmic loop El, the 4th and 5th transmembrane regions DIV and DV, and the middle of the 3rd loop extracytoplasmic E3.
  • residues at these positions could be involved in the binding site of unknown odor molecules corresponding to these receptors.
  • Figure 5 shows a structural classification of 122 olfactory receptors from the EMBL database found in different species as well as the 14 complete sequences and the 3 incomplete sequences identified in the marmot within the framework of the present invention. With the exception of fish receptors, the receptors are not grouped by species. There are 5 families containing a varied number of receptors. Groundhog olfactory receptors were classified into subfamilies 1, 2 and 5. 12 sequences were classified into subfamily 2.
  • Olfactory receptors include a large multigene family. Their study requires a combination of approaches. A reverse PCR strategy with several different primers has been implemented in the context of the present invention. This approach has been successful since 28 putative sequences of olfactory receptors, 14 of which could allow a comparative analysis have been obtained. It is possible to obtain more sequences by simply changing the PCR conditions.
  • the family of genes cloned in the context of the present invention codes for olfactory receptors for two reasons. On the one hand, the hydropathy profiles of the sequences are in agreement with the receptors for the superfamily of receptors with seven transmembrane domains.
  • the presence of a deep binding site in the transmembrane calyx is not a specific characteristic of the receptor olfactory receptors but is common among receptors with 7 transmembrane domains of biogenic amines.
  • the main site of interaction between receptors with 7 transmembrane domains and the related protein G is the third intracellular loop.
  • the most conserved segment is located between positions 180 to 193, ie the end of this loop and the beginning of the 6th transmembrane domain.
  • the results obtained indicate a remarkable analogy between the marmot olfactory receptor and the rat olfactory receptor.
  • the length (18 residues) of the 3rd intracellular loop (i3) was short.
  • the IVSSI consensus sequence (or a close sequence) was at the N-terminus of the 3rd intracellular loop in 75% of the clones of the invention.
  • the third intracellar loop is rich in Serine residues and can therefore constitute phosphorylation sites for GRK.
  • Receivers with 7 transmembrane domains are classified into several groups.
  • the olfactory receptors are supposed to belong to group I, which is characterized by the presence of a DRY sequence strictly conserved on the N-terminal side of i2.
  • the DRY sequence is present in 4 of the clones of the invention but is replaced by a DRF sequence in the remaining 10.
  • a single groundhog olfactory receptor had a similarity percentage of this order with a rat receptor (AM0R14 73%). In general, we found few strong homologies. This discovery could indicate that either the number of olfactory receptors was too small to allow the identification of true orthologous receptors, or the percentage of similarity between orthologous olfactory receptors may become less than 68%.
  • the Alpine marmot (Marmota marmota) was chosen as a model in this study on the assumption that, given the importance of olfaction to survive in nature, olfaction would be strongly developed.
  • the Alpine marmot marks its territory with secretions produced by the jugal glands.
  • the sense of smell is of the greatest importance because this species has a high level of sociability: it lives in family groups formed by a pair of adult breeding residents and their offspring of several successive litters which remain in the natal group until the age of 2 years or more. Each groundhog has a different combination of odor molecules that members of the same group or of a different group can smell.
  • the olfactory system requires a myriad of different receptors. As mammals are generally believed to have about a thousand genes, the clones identified in this study probably represent only part of the family of groundhog olfactory receptors. In addition to the contribution to the number of receptors identified, our results also support the existence of orthologous receptors between species and the notion that the local variability observed in some of the transmembrane domains could be crucial for the specificity of a receptor. How even a thousand receptors could be able to distinguish among the tens of thousands of odors found in nature is not yet clear. Final confirmation of the nature and olfactory specificity of these receptors will not be possible until the entire sequence has been obtained and specific binding with one or more odorous molecules demonstrated.
  • a novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell, 65, 175-187.

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Abstract

La présente invention concerne de nouveaux récepteurs olfactifs, ainsi que les gènes codant ces récepteurs. L'invention se rapporte aussi à l'utilisation de ces récepteurs pour la détection d'arômes, le contrôle de qualité, l'analyse d'échantillons, l'analyse ou la comparaison de parfums, la détection de substances toxiques, ou le piégeage d'odeurs.

Description

NOUVEAUX RECEPTEURS OLFACTIFS ET LEURS UTILISATIONS.
La présente invention se rapporte à la mise en évidence de nouveaux récepteurs olfactifs chez la marmotte, au clonage et au séquençage des gènes codant pour ces récepteurs ainsi qu'à l'utilisation de ceux-ci pour le criblage de ligands et la préparation de biocapteurs.
La découverte récente de récepteurs olfactifs de vertébrés bouleverse les stratégies initialement envisagées pour la conception et la réalisation de nez artificiel avec des capteurs physico- chimiques. En effet, au début des années 1990, les biologistes sont parvenus à isoler à partir d'épithélium olfactif de mammifères et à séquencer les premières protéines constituant des récepteurs olfactifs (3), et c'est en 1993 que le premier récepteur olfactif a été exprimé (7) . Or, il est admis que l'hommme, qui est réputé avoir un odorat limité, est capable de différencier plus de 10 000 molécules odorantes et que 1% de son génome est composé de gènes codant pour les récepteurs olfactifs (1) . On conçoit donc le champ d'investigation formidable qui s'ouvre aux chercheurs en matière de capteurs biologiques potentiels. En outre, il apparaît déjà que ces capteurs biologiques ont une sensibilité supérieure d'environ 100 000 fois aux meilleurs capteurs physico-chimiques existants (4, 6). Des travaux plus récents ont montré que ces détecteurs sont également sensibles à des molécules non biologiques (5) .
Tous les organismes vivants dépendent d'informations sensorielles pour leur survie. Les perceptions sensorielles sont transmises par les organes des sens qui reçoivent des stimuli physiques (vue, ouie, toucher) et chimiques (goût, odorat) . Dans la plupart des espèces, la perception des stimuli chimiques est essentielle pour l'accomplissement de plusieurs taches vitales comme localiser la nourriture, identifier des partenaires, identifier la progéniture et détecter les prédateurs ou d'autres dangers. Dans certaines espèces, l'odorat permet aussi la communication, à des distances pouvant atteindre plusieurs kilomètres, entre individus et permettre de rassembler le groupe, les réactions d'attaque et de défense, l'activité de reproduction et l'allaitement. Les molécules odorantes peuvent aussi induire des changements physiologiques.
Dans la plupart des cas les odeurs résultent d'une combinaison complexe de plusieurs molécules. Cette complexité soulève d'intéressantes questions sur les caractéristiques des récepteurs pour permettre aux animaux de reconnaître une myriade de molécules odorantes (estimées à plus de 10 000) à des concentrations aussi basses que 10 -12 M. Il semble que la reconnaissance est basée sur une large famille multigénique de récepteurs d'odeurs comprenant plusieurs centaines ou milliers de sous types . Ces récepteurs sont supposés contenir 7 domaines trans-membranaires , à partir de l'hypothèse selon laquelle les signaux odorants sont transduits par des cascades de réactions couplées aux protéines G dans les neurones olfactifs sensitifs. La transduction résulte en une augmentation de seconds messagers comme les nucleotides cycliques ou 1 ' inositol triphosphate et à leur tour ces messagers activent les canaux iono- dépendants et la phosphorylation de plusieurs protéines parmi lesquelles les récepteurs d'odeurs eux-mêmes.
Buck et Axel (3) ont d'abord caractérisé des récepteurs d'odeurs de rat à l'aide de techniques d'amplification (PCR) et d'amorces dégénérées correspondant aux domaines les plus conservés des récepteurs couplés aux protéines G. Depuis ces premiers travaux, plus de 339 récepteurs ont été séquences, le plus souvent partiellement, parmi une grande variété d'espèces dont l'homme, le chien, la souris, le poulet, deux espèces de poisson, deux espèces d'amphibiens et un nématode. Beaucoup d'espèces restent cependant encore à étudier et on estime que plus de 1000 gènes (soit 1% du génome) codent pour la superfamille des récepteurs olfactifs. Les mécanismes sous-jacents à la perception olfactivee sont singuliers et uniques en comparaison avec d'autres systèmes sensoriels et une étude plus poussée dans ce domaine qui a d'importantes implications pour l'identification de ces protéines est nécessaire. Plusieurs travaux ont souligné 1 ' importance de l'olfaction pour la marmotte des Alpes (2) . Des études ethologiques et analytiques ont montré qu'un groupe de 40 composés, produits par les glandes jugales, était utilisés pour marquer le territoire et identifier le groupe social. Les travaux réalisés dans le cadre de la présente invention sur l'épithélium olfactif de la marmotte des Alpes visaient notamment à obtenir un nombre suffisant de séquences de récepteurs olfactifs pour permettre une comparaison significative avec les séquences de vertébrés précédemment déterminées . Une stratégie basée sur la RT-PCR a été utilisée pour identifier des séquences putatives de récepteurs olfactifs de marmotte. Des oligonucléotides dégénérés correspondant à la séquence des domaines conservés dans le second domaine transmembranaire, la seconde boucle intracellulaire et le 7ème domaine transmembranaire de récepteurs olfactifs ont été utilisés par paires comme amorces pour des PCR à partir de l'ADN complémentaire obtenu en utilisant 1 ' ARNm de l'épithélium nasal de marmotte .
Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de la présente invention ont ainsi permis pour la première fois d'identifier, de cloner et de séquencer de nouveaux récepteurs olfactifs chez la marmotte. Ces récepteurs sont utiles pour la conception et la mise au point de biocapteurs ou la préparation de cellules transf ectées . Ainsi, ces récepteurs peuvent être associés à des membranes artificielles qui seront utilisées dans différents biocapteurs disposés en parallèle, chacun possédant un type particulier de récepteur, l'ensemble étant géré par un logiciel de réseaux de neurones formels pour constituer un système de détection de type nez électronique dont les capteurs sont des capteurs bioélectroniques .
L'invention se rapporte donc à un récepteur olfactif purifié de marmotte. La distinction entre des dizaines de milliers d'odeurs dépend d'une myriade de récepteurs situés à la surface des dendrites neuronales de l'épithélium nasal. En utilisant l'épithélium nasal de la marmottes des Alpes et différents jeux d'amorces dégénérées correspondant à des séquences consensus de récepteurs d'odeurs, les inventeurs sont parvenus à amplifier par PCR- inverse (RT-PCR) , cloner et obtenir la séquence partielle de 23 nouveaux produits de gènes codant pour des récepteurs d'odeurs. Après consultation par le programme blast des banques de données du NCBI, leur traduction en séquences d'acides aminés montre une forte similarité avec des séquences protéiques de récepteurs d'odeurs précédemment rapportées, et les classe sans ambiguité dans la même superfamille de récepteurs à 7 domaines transmembranaires . Les régions hélicoïdales transmembranaires III, IV et V, ainsi que les boucles intra et extracellulaires ont été définies par l'établissement d'un profil d ' hydropathie et la prédiction par ordinateur de la structure secondaire. Dans une première tentative de cartographie des sites de fixation d'odeur, les inventeurs ont réalisé une analyse de variabilité du type de celle décrite par Wu et Kabat (8) sur les régions déterminant la complémentarité (CDR) des immunoglobulines . Quatre pics principaux de variabilité sont localisés à l'intérieur des 1ère et 3ème boucles extracellulaires prédites, et à l'intérieur des 4ème et 5ème domaines transmembranaires prédits . Ces positions feraient donc partie du site spécifique de liaison des molécules odorantes. Les comparaisons avec la séquence de récepteurs olfactifs d'autres espèces suggèrent que les séquences de la marmotte déterminées dans cette étude appartiennnent à trois familles différentes .
L'invention concerne donc plus particulièrement un récepteur olfactif purifié constitué par ou comprenant la séquence en acides aminés choisie parmi celles représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéro SEQ ID No:l à SEQ ID No: 23, ou un dérivé fonctionnellement équivalent de celles-ci. On entend par dérivé équivalent de ces séquences, les séquences comprenant une modification et/ou une suppression et/ou une addition d'un ou plusieurs résidus d'acides aminés mais conservant environ 75% et de préférence au moins 95% d'homologie avec la séquence dont elle est dérivée. Les récepteurs de l'invention présente des régions très conservée et des régions très hétérogènes. On considère que les régions très conservées sont celles conférant à la protéine son caractère de récepteur, alors que les régions très hétérogènes sont celles qui confèrent à chaque récepteur sa spécificité. Ainsi, selon l'application envisagée, il est possible de préparer des dérivés des récepteurs de l'invention dont la spécificité est modifiée mais qui restent dans le cadre de la présente invention.
L'invention a également pour objet les anticorps poly ou monoclonaux dirigés contre au moins un récepteur de l'invention, un dérivé ou un fragment de ceux-ci. Ces anticorps peuvent être préparés par les méthodes décrites dans la littérature. Les anticorps polyclonaux sont formés selon les techniques classiques par injection des protéines, extraites à partir d'épithélium ou produite par transformation génétique d'un hôte, à des animaux, puis récupération des antisérums et des anticorps à partir des antisérums par exemple par chromatographie d'affinité. Les anticorps monoclonaux peuvent être produits en fusionnant des cellules de myélomes avec des cellules de rates d'animaux préalablement immunisés à l'aide des récepteurs de l'invention. Ces anticorps sont utiles' pour rechercher de nouveaux récepteurs olfactifs ou les homologues de ces récepteurs chez d'autres mammifères ou encore pour étudier la parenté entre des récepteurs de différents individus ou espèces.
L'invention se rapporte également à une molécule d'acide nucléique comprenant ou constituée par une séquence nucléique codant pour un récepteur tel que défini précédemment. Plus particulièrement, l'invention se rapporte à une molécule d'acide nucléique comprenant ou constituée par une séquence choisie parmi celles représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéro SEQ ID No: 24 à SEQ ID No: 47, lesquelles codent respectivement pour les récepteurs dont les séquences en acides aminés sont représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéro SEQ ID No : 1 à SEQ ID No: 23.
L'invention concerne bien entendu aussi les séquences nucléotidiques dérivées des séquences ci- dessus, par exemple du fait de la dégénérescence du code génétique, et qui code pour des protéines présentant des caractéristiques et propriétés de récepteurs olfactifs. L ' invention concerne également un vecteur comprenant au moins une molécule d'acide nucléique précédente, avantageusement associée à des séquences de contrôle adaptés, ainsi qu'un procédé de production ou d'expression dans un hôte cellulaire d'un récepteur de l'invention ou d'un fragment de celui-ci. La préparation de ces vecteurs ainsi que la production ou 1 ' expression dans un hôte des protéines de 1 ' invention peuvent être réalisées par les techniques de biologie moléculaire et de génie génétique bien connues de l'homme du métier.
A titre d'exemple, un procédé de production d'un récepteur selon l'invention consiste : à transférer une molécule d'acide nucléique de 1 ' invention ou un vecteur contenant ladite molécule dans un hôte cellulaire,
- à cultiver ledit hôte cellulaire dans des conditions permettant la production de la protéine constituant le récepteur,
- à isoler, par tous moyens appropriés les dites protéines .
A titre d'exemple, un procédé d'expression d'un récepteur selon l'invention consiste : à transférer une molécule d'acide nucléique de 1 ' invention ou un vecteur contenant ladite molécule dans un hôte cellulaire,
- à cultiver ledit hôte cellulaire dans des conditions permettant l'expression desdites récepteurs à la surface de l'hôte.
L'hôte cellulaire mis en oeuvre dans les procédés précédents peut être choisi parmi les procaryotes ou les eucaryotes et notamment parmi les bactéries, les levures, les cellules de mammifères, de plantes ou d'insectes.
L'expression dans des cellules eucaryotes est préférable pour que les récepteurs puissent subir les modifications post-traductionnelles nécessaires à leur fonction.
Une molécule d'acide nucléique codant pour un récepteur olfactif ou un vecteur selon 1 ' invention peuvent aussi être utilisés pour transfomer des animaux et établir une lignée d'animaux transgéniques.
Le vecteur utilisé est choisi en fonction de l'hôte dans lequel il sera transféré; il peut s'agir de tout vecteur comme un plasmide .
L'invention concerne donc aussi les hôtes cellulaires exprimant des récepteurs olfactifs obtenus conformément aux procédés précédents .
L'invention concernent également les sondes nucléiques et oligonucléotides préparés à partir des molécules d'acide nucléique de l'invention.
Ces sondes, avantageusement marquées, sont utiles pour la détection par hybridation de séquences similaires de récepteurs chez d'autres individus ou espèces. Selon les techniques classiques, ces sondes sont mises en contact avec un échantillon biologique. Différentes techniques d'hybridation peuvent être mises en oeuvre telles que l'hybridation sur taches (Dot-blot) ou l'hybridation sur répliques (technique de Southern) ou autres techniques (DNA chips) . De telles sondes constituent des outils permettant de détecter rapidement des séquences similaires dans les gènes codant pour des récepteurs olfactifs ce qui permet d'étudier la présence, l'origine et la conservation de ces protéines. Les oligonucléotides sont utiles pour des expériences de PCR par exemple pour rechercher des gènes dans d'autres espèces ou dans un but de diagnostic.
Comme indiqué précédemment, les récepteurs olfactifs sont des protéines à 7 domaines transmembranaires couplées aux protéines G. La fixation d'un ligand sur le récepteur entraîne un changement de conformation du récepteur, et à l'intérieur de la cellule, ce signal est transduit par l'intermédiaire de seconds messagers. En conséquence, l'invention a pour objet un procédé de criblage de composés susceptibles de constituer des ligands des récepteurs décrits précédemment consistant à mettre en contact un composé et un ou plusieurs desdits récepteurs et à mesurer par tout moyen approprié l'affinité entre ledit composé et ledit récepteur.
La mise en contact entre le composé à tester et le ou les récepteurs olfactifs de 1 ' invention peut être réalisée en utilisant des hôtes décrits précédemment et exprimant à leur surface au moins desdits récepteurs. Il peut s'agir d'une lignée de cellules immortalisées olfactives ou non, transfectée par un vecteur portant 1 ΑDNc permettant d'exprimer à sa surface et à un niveau élevé un récepteur olfactif recombinant fonctionnel. Si le composé testé constitue un ligand, sa mise en contact avec des cellules transformées , induit des signaux intracellulaires qui découlent de la fixation dudit composé sur le récepteur.
La mise en contact des composés à tester avec les récepteurs de l'invention peut aussi être réalisée en fixant un ou plusieurs récepteurs sur une ou plusieurs membranes. Les récepteurs olfactifs de l'invention peuvent donc aussi être intégrés à un biocapteur. Dans un tel système, il est possible de visualiser en temps réel des interactions entre le composé testé et le récepteur. L'un des partenaires du couple récepteur/ligand est fixé sur une interface qui peut contenir une matrice recouverte de chaînes aliphatiques . Cette matrice hydrophobe peut être facilement recouverte d'une couche lipidique par fusion spontannée de liposomes injectés à son contact. Des récepteurs olfactifs insérés dans des liposomes ou des vésicules peuvent ainsi être intégrés à des biocapteurs. Les ligands sont ainsi analysés vis-à-vis d'un ou plusieurs récepteurs olfactifs différents.
Les méthodes ci-dessus permettent de déterminer si un composé active ou inhibe les récepteurs. Dans ce mode de réalisation, il est avantageux de disposer d'un ligand connu qui permet des mesures par compétition.
L'invention se rapporte donc aussi à un composé non encore connu constituant un ligand d'un récepteur olfactif, identifié et sélectionné par le procédé ci-dessus.
Les récepteurs de 1 ' invention trouvent des applications dans des domaines très variés comme :
L'industrie agroalimentaire, pour la détection d'arômes, le contrôle de qualité, l'analyse d ' échant i 1 Ions .
La parfumerie, pour l'analyse ou la comparaison de parfums.
- L'environnement, pour la détection de substances toxiques, comme des gaz ou le piégeage d ' odeurs .
D'autres avantages et caractéristiques de
1 ' invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent concernant l'identification et le clonage des receteurs olfactifs de marmotte, et qui se réfèrent aux dessins en annexe dans lesquels : - La figure 1 représente l'analyse des produits de PCR réalisée à partir de deux types d ΑDNc
(R et T) et 3 jeux d'amorces (c-t, 4-1 et 3-2) . Les produits de la réaction ont été analysés par électrophorèse sur un gel d'agarose 2 %, comme décrit ci-après dans matériel et méthode. La taille des fragments a été estimée par comparaison avec un standard de taille connue (côté droit) . Les dépôts dans les pistes marquées d'une astérisque contiennent les fragments de la taille attendue.
- La figure 2 représente l'alignement de 14 des 23 séquences de récepteurs olfactifs putatifs de marmotte. 14 séquences différentes (AMOR 1 à AMOR 14) ont été analysées à l'aide du logiciel Clustalw. Les régions ombrées indiquent les domaines consensus contenant les acides aminés presque ( . ) ou totalement (*) conservés. Les domaines transmembranaires (DU à
DVII) , les boucles extracellulaires (El à E3 ) et les boucles intracellulaires (i2 à i3 ) ont été délimitées après la détermination des domaines hydrophobes .
La figure 3 représente les profils d' hydropathie des séquences longues obtenues avec le jeu d'amorces c-t (AMOR 1 à AMOR 7) et les séquences courtes obtenues avec le jeu d'amorces 3-2 (AMOR 8 à AMOR 14) ont été obtenues comme décrit dans Matériel et Méthodes Les séquences longues contiennent 6 régions de forte hydrophobicité (pics) séparées par 5 valléees plus hydrophiles. Les séquences courtes présentent seulement 4 régions de forte hydrophobicité et 3 régions hydrophiles . Ces graphes sont compatibles avec la présence de 6 ou 4 domaines transmembranaires , pour les séquences longues et courtes respectivement. Cette architecture est confirmée par les prédictions d'hélices transmembranaires du programme PHD.
La figure 4 représente 1 ' analyse de la variabilité des 14 nouvelles séquences ininterrompues de récepteur olfactif de marmotte. Graphe du haut variabilité des résidus calculée pour l'alignement de la figure 2. La localisation des pics (positions les plus variables) et la forme globale de la courbe sont indépendantes de la formule utilisée (Wu & Kabat, complexité ou nombre de résidus pris en compte) . Graphe du bas : index moyen d ' hydropathie des séquences alignées. Les pics correspondent aux régions hydrophiles (boucles) et les vallées aux régions hydrophobes (domaines transmembranaires) . Le graphe minimise 1 ' hydrophobicité du fragment 1 à 59 car la moitié des séquences manque à ces positions. Alors que la position 210 illustre la variabilité habituelle des boucles hydrophiles exposées, la position 148 présente la forte variabilité la plus surprenante dans une région fortement hydrophobe (hélicoïdale) de la molécule. La figure 5 représente un dendrogramme montrant les similarités entre des récepteurs olfactifs de différentes espèces. Les séquences de récepteurs olfactifs d'autres espèces proviennnent de la banque de données NCBI . Il y a cinq familles (notées à gauche) . Les astérisques indiquent les séquences pour lesquelles le pourcentage de similarité entre espèce excède 70 %. Abréviations : H : homme ; F : poisson ; C : poulet ; N : nématode ; B : abeille ; A : amphibiens ; D : chien ; M : souris et MM : marmotte.
MATERIEL ET METHODES.
1) Préparation des tissus .
L'épithélium olfactif a été prélevé sur une marmotte sauvage morte. Pendant la dissection, la tête a été maintenue congelée dans de la carboglace . Les tissus ont été gardés à -80°C jusqu'à leur utilisation.
2) Isolement de l'ARNm. Les tissus cgelés ont été réduits en poussière en les concassant avec un pilon dans un mortier. Le pilon et le mortier étaient refroidis dans de la carboglace et tout l'équipement était stérile. L'ARNm poly(A)+ a été isolé en utilisant le Micro-Fast Track Kit (Invitrogen) puis testé avec le DNA DipStick Kit (Invitrogen) . 3 ) Transcription de l'ADNc.
L'ARNm poly(A)+ a été transcrit en ADNc à l'aide d'une transcriptase inverse puis amplifié par PCR. Pour augmenter la production du premier brin d'ADNc complet le kit cDNA Cycle Kit a été utilisé. La transcription inverse a été faite à partir de 150 ng d'ARNm poly(A)+ en utilisant des amorces oligo dT ou des rando pri ers . Après extraction avec phénol / H20 / EDTA (v/v/v : 1/20/80), l'ADNc de la phase aqueuse a été précipité en présence d'acétate d'ammonium et de glycogène entraîneur dans de 1 ' éthanol glacial à -80°C.
4) PCR. Trois jeux d ' oligonucléotides dégénérés spécifiques de récepteurs olfactif sont été synthétisés pour amplifier ces récepteurs de marmotte.
A partir de résultats antérieurs obtenus chez le rat (3) , deux jeux d'amorces ont été synthétisées contre des régions conservées du second et du septième domaine transmembranaire des récepteurs olfactifs .
Amorce 4 : 5 ' -CC (CT) ATG TA(TC) TTI TT(TC) CT (CT) I(GC)(CT) AA(TC) (TC)TI TC . Amorce C : 5'-CC(CT) ATG TA(TC) TTG TT(TC)
CT(CT) G(GC) (CT) AA(TC) (TC)TG TC-.
Amorce 1 : 5'-(AG)TT (TC)C(TG) IA(AG) (AG) (CG) (AT) (AG)TA IAT (GA)A(AT) IGG (AG)TT.
Amorce T : 5 ' -GCA CTG CAG AT(AG) AAI GG(AG) TTI A(AG) ATI GG.
Ces combinaisons d'amorces ont été conçues pour permettre d'amplifier des produits de l'ordre de 720 pb.
A partir de résultats antérieurs obtenus chez le rat (3) et le poisson-chat, le 3ème jeu d' oligonucléotides dégénérés a été synthétisé à partir des régions conservées de la 2ème boucle intracellulaire et du 7ème domaine transmembranaire.
Amorce 3 : 5 ' -CAC AAG CTT TIG CIT A(TC)G A(CT)A G(AG)T (TA) (TC) (TCG) TIG C. Amorce 2 : 5 ' -GCA CTG CAG AT(AG) AAI GG(AG)
TTI A(AG)C ATI GG.
Ces combinaisons d'amorces ont été conçues pour permettre d'amplifier des produits de l'ordre de 520 pb. L'amplification a été réalisée dans 50 microlitres d'une solution contenant 5 microlitres d'ADNc, 2 mM dNTP, 100 p ol de chaque amorce dégénérée, 1,5 U de polymérase Taq (Boehringer Mannheim, Allemagne), 50 mM KC1, 2,5 mM MgC12, 10 mM Tris/HCl pH8 , 3 et 0,01 de gélatine. Pour éviter 1 ' évaporâtion, la surface du mélange a été couverte par 35 microlitres d'huile minérale (Sigma, France) . La PCR a été réalisée à l'aide d'un thermocycler (Hybaid, Omnigene, USA) selon le protocole suivant : un cycle à 94°C pendant 90 s, 40 cycles à 94°C pendant 20 s, 50°C pendant 25 s et 72°C pendant 90 s, et un cycle à 72°C pendant 120 s.
Après la PCR, 5 microlitres du produit de la réaction ont été analysés sur gel d'agarose Seaplaque 2%, pour vérifier que la présence du fragment (Tebu) . S'il était présent, les 45 microlitres restant ont été soumis à électrophorèse et l'ADNc a été extrait du gel d'agarose à l'aide du kit QIARX II (Qiagen) . L'ADNc extrait a été inséré dans le vecteur pMOSBlue qui a été utilisé pour infecter les cellules de E.coli MOSBlue compétentes en utilisant le kit pMOSBlue T-vector selon le protocole du fournisseur (Amersham) . Les bactéries infectées ont ensuite été cultivées sur un milieu sélectif (Xgal/IPTG) .
Les clones recombinants ont été testés par PCR directe sur colonie. En bref, chaque colonie blanche a été resuspendue dans 10 microlitres de tampon TE. La PCR a été réalisée dans 10 microlitres d'une solution contenant 1 microlitres de suspension de colonie, 3 pmoles de chaque amorce universelle U19 et T7 , 10 mM dNTP, 50 mM KC1 et 2 , 5 mM MgC12 dans un tampon Tris HC1 pH 8 , 3 avec 0,25 U de polymérase Taq. Le protocole pour la PCR était le suivant : un cycle à 94°C pendant 270 s, 30 cycles à 94°C pendant 30 s, 48°C pendant 30 s et 72°C pendant 50 s, et un cycle à 72°C pendant 120 s. Après la PCR, 10 microlitres du produit de la réaction ont été analysés sur un gel à 2% d'agarose. Les clones positifs ont été cultivés en milieu LB liquide contenant 0,1 mg / ml d1 ampicilline .
5 ) Extraction et purification des fragments d' ADNc .
L'ADNc plasmidique a été extrait et purifié en utilisant le kit Wizard miniprep (Promega) . Les échantillons ont été séquences par Génome Express (Grenoble, France) .
6) Analyse des séquences .
La comparaison des séquences de récepteur olfactif de marmotte de l'invention avec d'autres séquences disponibles dans GenBank / GenPept a été réalisée en utilisant le programme Blast sur le serveur NCBI . ClustalW a été utilisé pour construire les alignements multiples et réaliser l'analyse phylogénétique . Les domaines hydrophobes ont été délimités en utilisant un simple profil d' hydropathie, et la prédiction des domaines transmembranaires α- hélicoidaux en utilisant le serveur PHD. Enfin, la variabilité des 14 séquences de marmotte alignées, ainsi que leur hydropathie moyenne, ont été déterminées et traduites sous forme graphique à l'aide du programme Rav3. Les domaines transmembranaires ont été prédits avec le logiciel Top Pred II. II - RESULTATS .
1) Isolement de l'ARNm. Un échantillon d ' approximativement 2 g, contenant principalement de l'épithélium olfactif et le cartilage le supportant a été retiré de la tête congelée d'une marmotte. Cet échantillon a été utilisé pour la purification et les tests d'ARNm selon la description de la section Matériel et Méthodes. Au total, 1,95 microgramme d'ARNm ont été obtenus. Pour augmenter les chances de cloner des récepteurs olfactifs, la moitié de l'ARNm obtenu a été transcrit en présence de l'amorce oligo d(T) et l'autre moitié en présence de l'amorce random (R) .
2 ) Amplification des séquences de récepteurs olfactifs.
L'amplification par PCR a été réalisée avec 150 ng d'ARNm en utilisant les trois jeux d'amorces spécifiques dégénérées (c-t, 4-1, 3-2) décrites précédemment dans Matériel et Méthodes. L'analyse de 1 ' électrophorèse réalisée avec des aliquotes de 5 microlitres des produits de la PCR a révélé des bandes uniques de la taille attendue (Fig.l). Avec l'ADNc "T" , une bande 520 pb a été obtenue avec les amorces 3-2 et une bande de 720 pb avec les amorces c-t. Avec l'ADNc "R" , une bande de 720 pb a été obtenue en utilisant les amorces c-t. Aucune bande n'a été observée dans les trois autres pistes. Dans les PCR de contrôle, dans lesquelles une seule amorce était utilisée, aucune bande de la longueur attendue n'a été observée. L ' électrophorèse a été répétée en utilisant les 45 microlitres restant de l'échantillon, et les fragments de 550 et 720 pb ont été extraits. Etant donnée la diversité des récepteurs olfactifs, il a été supposé que la population d'ADNcdans une bande était hétérogène et il n'a donc pas été essayé de séquencer directement les fragments d ' ADNc amplifiés par PCR. Ces fragments ont été clones dans E. coli comme décrit précédemment.
3 ) Clonage.
Après insertion dans le vecteur p-Mosblue et l'infection de E. coli MOSBlue compétentes, 139 clones bactériens ont été obtenus au total, dont 58 à partir de la PCR réalisée à partir de l'ADNc "R" et les amorces c- t (clones R c-t), 31 à partir de la PCR réalisée à partir de l'ADNc "T" et les amorces c-t (clones T c-t) et 50 à partir de la PCR réalisée à partir de l'ADNc "T" et les amorces 3-2 (clones T 3-2) . Pour confirmer la présence du fragment attendu, nous avons réalisé une autre PCR sur chacun des 139 clones en utilisant des amorces correspondant aux zones du vecteur situées sur chaque côté du fragment. L ' électrophorèse sur gel d'agarose des produits de la PCR a montré que 5 clones R c-t, 10 clones T c-t et 22 clones T 3-2 possédaient des fragments de la taille attendue. Ces 37 clones positifs ont été cultivés à nouveau pour une production de masse.
4) Séαuencaqe . L'ADN plamsidique a été extrait, purifié et séquence, comme décrit précédemment. Les séquences nucléotidiques ont été comparées avec celles trouvées dans les banques de données. Sur les 28 séquences présentant des scores élevés de similarité avec les récepteurs olfactifs, 14 étaient différentes et ininterrompues (AMOR 1 à 14) et pouvaient coder pour des récepteurs olfactifs. Les autres 14 séquences étaient identiques (n=8), inutilisables (n=3) ou incomplètes pour nos conditions expérimentales (116, 153, 159 acides aminés) . Les 14 séquences utilisables avaient un seul cadre ouvert de lecture permettant leur traduction en acides aminés. L'attribution de la séquence de lecture correcte a été confirmée par la similarité de ces traductions putatives avec les séquences en acides aminés d'autres récepteurs olfactifs disponibles dans Gen Bank / GenPept . Le pourcentage de résidus identiques dans les meilleurs alignements s'étendait entre 84% (entre AM0R4 et une séquence partielle de Xenopus laevis No d'accession #: 1617233) et 46 % (entre AM0R5 et la séquence de Rattus norvegicus No d' accession! : 1016362 ) . 7 des 14 séquences de marmotte présentaient le meilleur alignement avec différents récepteurs de rat, 3 avec le même récepteur humain (accession : #AC002988), 3 avec la même séquence de chien (accession #:X89660) et un avec la séquence de Xénope citée précédemment. Le pourcentage moyen de résidus identiques était 64%. Sept (AMOR 1-7) des nouvelles séquences de marmotte ont été amplifiées à partir d'un couple d'amorces conçu à partir des domaines transmembranaires II et VII et sont longs de 234 à 237 résidus. Sept autres séquences (AMOR 8-14) ont été obtenues avec les amorces conçues à partir de la boucle intracellulaire 2 (i2) et le domaine transmembranaire VII et contiennent 176 résidus. Le pourcentage de résidus identiques entre ces 14 nouvelles séquences est compris entre 33 % (AMOR 4 / AMOR 8) et 79 % (AMOR 8 / AMOR 11) .
5 ) Structure du domaine du récepteur olfactif putatif de marmotte.
L'homologie globale entre les 14 nouvelles séquences de marmotte et les séquences de récepteurs précédemment identifiées laisse peu de doutes quant à leur appartenance à la même superfamille des récepteurs à 7 domaines transmembranaires. Selon la localisation des amorces utilisées pour les amplifier, les séquences partielles AMOR 1-7 et AMOR 8-14 devraient présenter 6 ou 4 domaines transmembranaires respectivement. La Figure en annexe 3 montre que le profil d' hydrophobicité de ces séquences est compatible avec une telle organisation. Afin de délimiter plus précisément les régions transmembranaires a-hélicoidales , l'alignement de la Figure 2 a aussi été soumise au serveur PHD. 5 régions transmembranaires ont été assignées sans ambiguité dans les régions respectives (38-62), (86- 103), (140-164), (186-203) et (216-232), qui correspondent aux domaines DIII, DIV, DV, DVI et DVII dans la figure 2.
Les inventeurs ont également chercher à situer les positions impliquées dans le site de fixation spécifique de l'odeur en appliquant une analyse précédemment introduite pour les molécules qui lient les antigènes. Ici, le raisonnement est que si ces récepteurs olfactifs sont supposés lier spécifiquement des molécules odorantes, les résidus qui constituent le site spécifique de liaison pourraient montrer plus de variabilité que ceux qui sont impliqués dans la structure core et dans la fonction de signalement.
La Figure 4 montre les profils de variabilité obtenus avec l'alignement de la Figure 2. Quatre pics de variabilité sont clairement visibles. Le profil moyen d ' hydropathie (average hydropathy plot) montré en parallèle (Figures 2 et 4) indique qu'ils ne sont pas uniquement situés à 1 ' intérieur de boucles hydrophiles comme escompté (position 210), mais aussi dans des régions hydrophobes (e.g. position 148) . Le centre des segments les plus variables est situé aux positions 30, 100, 148 et 210, la cartographie respectivement à 1 ' intérieur de la 1ère boucle extracytoplasmique El, les 4ème et 5ème régions transmembranaires DIV et DV, et le milieu de la 3ème boucle extracytoplasmique E3. Nous proposons que les résidus à ces positions pourraient être impliqués dans le site de liaison de molécules odorantes inconnues correspondant à ces récepteurs. Ces positions sont compatibles avec l'hypothèse selon laquelle les régions transmembranaires pourraient s'assembler en un calice ouvert vers 1 ' extérieur pouvant recevoir une molécule odorante. Un tel modèle est aussi en accord avec le fait que beaucoup de molécules odorantes présentent un caractère hydrophobe .
6) Classification structurale des récepteurs olfactifs.
Nous avons tenté de classer les récepteurs clones de marmotte par rapport aux séquences précédemment décrites pour d'autres espèces. La Figure 5 montre une classification structurale de 122 récepteurs olfactifs de la banque de données EMBL trouvés dans différentes espèces ainsi que les 14 séquences complètes et les 3 séquences incomplètes identifiées chez la marmotte dans le cadre de la présente invention. A l'exeption des récepteurs de poisson, les récepteurs ne sont pas regroupés par espèces. Il y a 5 familles contenant un nombre varié de récepteurs . Les récepteurs olfactifs de marmotte ont été classés en sous-familles 1, 2 et 5. 12 séquences ont été rangées dans la sous famille 2. Le plus fort pourcentage d'homologies interespèces (plus de 70 % de résidus identiques) entre récepteurs olfactifs a été observé dans 9 cas indiqués par une astérisque : entre le rat et la souris (jusqu'à 95 %) dans 5 cas, entre le rat et l'homme (80 %) dans un cas, entre le chien et l'homme (jusqu'à 85 %) dans deux cas, et entre le récepteur de marmotte et celui de rat dans un cas (73 %) . L'homologie entre les récepteurs humains et de marmotte ne dépasse jamais 75 % de résidus identiques .
III - DISCUSSION. Les récepteurs olfactifs comprennent une large famille multigénique . Leur étude demande une combinaison d'approches. Une stratégie de PCR inverse avec plusieurs amorces différentes a été mise en oeuvre dans le cadre de la présente invention. Cette approche a été couronnée de succès puisque 28 séquences putatives de récepteurs olfactifs dont 14 pouvaient permettre une analyse comparative ont été obtenues. Il est possible d'obtenir plus de séquences en changeant simplement les conditions de PCR. La famille de gènes clones dans le cadre de la présente invention code pour des récepteurs olfactifs pour deux raisons. D'une part les profils d' hydropathie des séquences sont en accord avec les récepteurs de la superfamille des récepteurs à sept domaines transmembranaires. D'autre part, la comparaison avec les séquences de banques de données montre un fort degré de similarité avec les récepteurs olfactifs précédemment identifiés. Les sites potentiels de reconnaissance des ligands sur les récepteurs olfactifs putatifs de marmotte ont été identifiés. Comme l'olfaction requiert la reconnaissance spécifique d'une grande variété de molécules odorantes, il a été postulé que le site de liaison du récepteur olfactif avec son ligand présenterait une plus grande variabilité entre résidus que les autres parties de la séquence responsables de la structure core et de la fonction de transduction. Il a été observé la plus forte variabilité à 1 ' intérieur de deux domaines transmembranaires (DIV et DV) et à l'intérieur de deux boucles extracellulaires (El et E3 ) . Il a donc été conclu que ces régions pourraient être impliquées dans la reconnaissance du ligand.
La présence d'un site de liaison profond dans le calice transmembranaire n'est pas un caractère spécifique des récepteurs olfactifs récepteur mais est commun parmi les récepteurs à 7 domaines transmembranaires des aminés biogènes .
Le site principal d'interaction entre les récepteurs à 7 domaines transmembranaires et la protéine G apparentée est la troisième boucle intracellulaire. Pour les séquences présentées ici, le segment le plus conservé est situé entre les positions 180 à 193, c'est à dire la fin de cette boucle et le début du 6ème domaine transmembranaire . Les résultats obtenus indique une analogie remarquable entre le récepteur olfactif de marmotte et le récepteur olfactif de rat. La longueur (18 résidus) de la 3ème boucle intracellulaire (i3) était courte. La séquence consensus IVSSI (ou une séquence proche) était à l'extrémité N-terminale de la 3ème boucle intracellulaire dans 75 % des clones de l'invention. La troisième boucle intracellaire est riche en résidus Serine et peut donc constituer des sites de phosphorylation pour GRK. Les récepteurs à 7 domaines transmembranaires sont classés en plusieurs groupes. Les récepteurs olfactifs sont supposés appartenir au groupe I, qui est caractérisé par la présence d'une séquence DRY strictement conservée du côté N-terminal de i2. La séquence DRY est présente dans 4 des clones de 1 ' invention mais est remplacée par une séquence DRF dans les 10 restant.
La reconnaissance des mêmes odeurs par des espèces différentes soulève une intéressante question. On peut s ' attendre à ce que ces espèces aient des récepteurs orthologues . En utilisant le logiciel clustalw (figure 5), les inventeurs ont chercher à déterminer si certains des récepteurs olfactifs de marmotte étaient bonafide orthologues de récepteurs olfactifs d'autres espèces, en particulier d'autres rongeurs. Pour les récepteurs couplés aux protéines G, les pourcentages d'identité entre les récepteurs orthologues de différentes espèces allaient de 68 % (pour le récepteur CSN entre le chien et l'homme) à 98 % (pour le récepteur cannabinoide du rat et de l'homme) . Des récepteurs olfactifs avec des pourcentages de similitude de cet ordre ont été observés entre rat et souris, rat et homme, et chien et homme. Un seul récepteur olfactif de marmotte présentait un pourcentage de similitude de cet ordre avec un récepteur de rat (AM0R14 73%) . En général, nous avons trouvé peu d'homologies fortes. Cette découverte pourrait indiquer que, soit le nombre de récepteurs olfactifs était trop petit pour permettre l'identification de vrais récepteurs orthologues, soit le pourcentage de similarité entre récepteurs olfactifs orthologues peut devenir inférieur à 68 %.
Une autre alternative serait que les animaux sauvages expriment de récepteurs pour davantage d'odeurs que les animaux de laboratoire. La marmotte des Alpes (Marmota marmota) a été choisie comme modèle dans cette étude à partir de l'hypothèse selon laquelle, étant donnée l'importance de l'olfaction pour survivre dans la nature, l'olfaction serait fortement développée. La marmotte des Alpes marque son territoire avec des sécrétions produites par les glandes jugales. De plus, pour cet animal, le sens olfactif est de la plus grande importance parce que cette espèce possède un fort niveau de sociabilité : il vit dans des groupes familiaux formés par une paire d'adultes résidents reproductifs et leur progéniture de plusieurs portées successives qui restent dans le groupe natal jusqu'à l'âge de 2 ans ou plus. Chaque marmotte a une combinaison différente de molécules odorantes que les membres du même groupe ou d'un groupe différent peuvent flairer.
Contrairement à d'autres systèmes sensoriels, le système olfactif requiert une myriade de récepteurs différents. Comme les mammifères sont généralement supposés avoir environ un millier de gènes, les clones identifiés dans cette étude représentent probablement seulement une partie de la famille des récepteurs olfactifs de marmotte. En plus de la contribution au nombre de récepteurs identifiés, nos résultats supportent aussi l'existene de récepteurs orthologues entre espèces et la notion selon laquelle la variabilité locale observée dans certains des domaines transmembranaires pourrait être capitales pour la spécificité d'un récepteur. Comment même un millier de récepteurs pourrait être capable de distinguer parmi la dizaine de milliers d'odeurs trouvées dans la nature n'est pas encore clair. La confirmation finale de la nature et de la spécificité olfactive de ces récepteurs ne sera pas possible tant que la séquence entière n'a pas été obtenue et la liaison spécifique avec une ou plusieurs molécules odorantes démontrée.
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Claims

REVENDICATIONS
Un récepteur olfactif purifié de marmotte.
2) Un récepteur olfactif constitué par ou comprenant une séquence en acides aminés choisie parmi celles représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéro SEQ ID No : 1 à SEQ ID No: 23, ou un dérivé fonctionnellement équivalent de celles-ci.
3 ) Un récepteur selon la revendication 2 constitué par ou comprenant une séquence en acides aminés présentant environ 75% et de préférence au moins 95% d'homologie avec une séquence en acides aminés choisie parmi celles représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéro SEQ ID No : 1 à SEQ ID No: 23.
4) Un récepteur selon l'une des revendications 2 ou 3 , constitué par ou comprenant une séquence en acides aminés choisie parmi celles représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéro SEQ ID No:l à SEQ ID No: 23 dont une ou plusieurs des régions très hétérogènes est modifiée.
5) Un anticorps poly ou monoclonal dirigé contre au moins un récepteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou un dérivé ou un fragment de ceux-ci .
6) Une molécule d'acide nucléique comprenant ou constituée par une séquence nucléique codant pour un récepteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 4. 7) Une molécule d'acide nucléique selon la revendication 6, comprenant ou constituée par une séquence choisie parmi celles représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéro SEQ ID No: 24 à SEQ ID No: 47.
8) Un vecteur comprenant au moins une molécule d'acide nucléique selon l'une des revendications 6 ou 7, avantageusement associée à des séquences de contrôle.
9) Procédé de production d'un récepteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il consiste : à transférer une molécule d'acide nucléique selon l'une des revendications 6 ou 7 ou un vecteur selon la revendication 8 dans un hôte,
- à cultiver ledit hôte cellulaire dans des conditions permettant la production de la protéine constituant le récepteur,
- à isoler, par tous moyens appropriés les dites protéines .
10) Procédé d'expression d'un récepteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 chez un hôte, caractérisé en ce qu'il consiste : à transférer une molécule d'acide nucléique selon l'une des revendications 6 ou 7 ou un vecteur selon la revendication 8 dans un hôte, - à cultiver ledit hôte dans des conditions permettant l'expression desdites récepteurs à la surface de 1 ' hôte .
11) Un hôte transformé par une molécule d'acide nucléique selon l'une des revendications 6 ou 7 ou par un vecteur selon la revendication 8. 12) Procédé de criblage de composés susceptibles de constituer des ligands d'un récepteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact un composé et un ou plusieurs desdits récepteurs puis à mesurer par tout moyen approprié l'affinité entre ledit composé et ledit récepteur.
13) Une membrane sur laquelle est fixée un ou plusieurs récepteurs selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 utile pour la mise en oeuvre d'un procédé selon la revendication 12.
14) Un composé constituant un ligand d'un récepteur olfactif, identifié et sélectionné par le procédé selon la revendication 13.
15) Utilisation d'un récepteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, d'un hôte selon la revendication 11 ou d'une membrane selon la revendication 13, pour la détection d'arômes, le contrôle de qualité, l'analyse d'échantillons, l'analyse ou la comparaison de parfums, la détection de substances toxiques, ou le piégeage d'odeurs.
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