Classifications

• • C—CHEMISTRY; METALLURGY
  • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
  • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
  • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
  • C12N9/14—Hydrolases (3)
  • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
  • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
• • C—CHEMISTRY; METALLURGY
  • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
  • C12Y—ENZYMES
  • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
  • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
  • C12Y301/01007—Acetylcholinesterase (3.1.1.7)

Definitions

• the present invention relates to a new acetylcholinesterase gene responsible for resistance to insecticides, in particular in mosquitoes, to the products of this gene (cDNA, protein) and to their applications, in particular for the screening of new insecticides and genetic detection of resistance to organophosphates and / or carbamates in mosquito populations.
• Acetylcholinesterase (AChE, E.C. 3.1.1.7) is an essential enzyme which hydrolyzes acetylcholine in synapses, thereby ending cholinergic transmissions at neuronal or neuromuscular junctions. The inhibition of AChE prevents the deactivation of the synaptic signal, thus leading to a loss of control of cholinergic transmission.
• the first ace gene was identified in Drosophila (Drosophila melanogaster), by reverse genetics (Hall et al., EMBO J., 1986, 5, 2949-2954). Evidence that this gene was involved in insecticide resistance was provided by the demonstration of amino acid substitutions in the AChE of resistant Drosophila, conferring insensitivity to cholinergic insecticides (Mutéro et al., PNAS, 1994 , 91, 5922-5926). Studies in D. melanogaster therefore seemed to indicate the presence of a single ace gene in insects, coding for the AChE target of cholinergic insecticides.
• Musca domestica (Williamson et al., 1992, In Multidisciplinary approaches to cholinesterase functions, Eds Schaffer an A. & Velan B., Plénum Press, New York, pp 83 -86; Walsh et al., Biochem. J., 2001, 359, 175-181; Kozaki et al., Insect. Biochem. Mol.
• a second ace gene has been isolated from arachnids; however, this gene is not involved in resistance to insecticides (Hernandez et al., Baxter et al., cited above). - A second ace gene could not be isolated from insects despite numerous attempts in different species (Menozzi et al., Tomita et al., Mori et al, cited above; Severson et al, J. Hered., 1997, 88 , 520-524).
• the inventors identified a new locus of the ace gene in the genome of Anopheles gambiae and of 15 different species of mosquitoes and they showed that this new locus, non-homologous to the locus previously described in D. melanogaster, was involved in resistance. insecticides in mosquitoes.
• the inventors have also shown that resistance to insecticides, at least in mosquitoes of the species Culex pipiens and Anopheles gambiae, was linked to a single mutation in the acetylcholinesterase sequence encoded by this new gene, located in the vicinity of the catalytic site of the enzyme.
• This new gene represents a diagnostic tool for the genetic detection of resistance to insecticides (organophosphates, carbamates) in mosquito populations.
• the AChE encoded by this gene represents a target for the screening of new active molecules on mosquito populations resistant to the insecticides currently used.
• a subject of the present invention is therefore a protein, characterized in that it comprises a central catalytic region which has an amino acid sequence selected from the group consisting of the sequence SEQ ID NO: 1 and the sequences having at least 60% identity or 70% similarity with the sequence SEQ ID NO: 1, excluding the NCBI sequence AAK0973 corresponding to the acetylcholinesterase of Schizaphis graminum.
• the protein according to the invention represents a new insect acetylcholinesterase, hereinafter referred to as AchEl, responsible for resistance to organophosphates and / or to carbamates, at least in mosquitoes, in particular in C.
• ace-1 the locus coding for said AchEl is hereinafter called ace-1
• ace-2 represents the second ace locus, which is not involved in insecticide resistance in mosquitoes.
• said central catalytic region contains the catalytic domain of AChE and corresponds to that located at positions 70 and 593 of the AChEl sequence of Anopheles gambiae (SEQ ID NO: 3, 643 amino acids ); it corresponds to that located respectively at positions 100 and 629 of the AChEl sequence of Schizaphis graminum (NCBI AAK0973), 60 and 582 of the AChE 1 sequence of Culex pipiens (SEQ ID NO: 7), 34 and 593 of the sequence of Anopheles gambiae AChE2 (FIG. 1, SEQ ID NO: 53), and 41 and 601 of the AChE2 sequence of Drosophila melanogaster (NCBI AAF54915).
• This central region which contains the catalytic domain is conserved in vertebrates and invertebrates while the N- and C-terminal ends show a high variability between the different species.
• the identity of a sequence with respect to a reference sequence is assessed as a function of the percentage of amino acid residues which are identical, when the sequences corresponding to the catalytic region as defined above are aligned, so as to obtain the maximum correspondence between them.
• a protein having an amino acid sequence having at least X% identity with the reference sequence SEQ ID NO: 1 is defined, in the present invention as a protein whose sequence corresponds to the central catalytic region as defined above. above may include up to 100-X alterations per 100 amino acids of the sequence SEQ BD NO: 1.
• alteration includes deletions, substitutions or consecutive or dispersed insertions of amino acids in the reference sequence. This definition applies, by analogy, to nucleic acid molecules.
• the similarity of a sequence with respect to the reference sequence SEQ ID NO 1 is assessed according to the percentage of amino acid residues which are identical or which differ by conservative substitutions, when the sequences corresponding to the central catalytic region as defined above are aligned so as to obtain the maximum of conespondance between them.
• conservative substitution is intended to mean the substitution of one amino acid with another which has similar chemical properties (size, charge or polarity), which generally does not modify the functional properties of the protein.
• a protein having an amino acid sequence having at least X% similarity to the sequence SEQ ID NO: 1 is defined, in the present invention as a protein, the sequence of which corresponds to the central catalytic region as defined above. may include up to 100-X non-conservative alterations per 100 amino acids of the reference sequence.
• non-conservative alterations includes deletions, non-conservative substitutions or consecutive or dispersed insertions of amino acids in the sequence SEQ ID NO: 1.
• insect AChEl sequences have 65-97% identity (79-98% similarity) between them,
• the insect AChE2 sequences have 58-99% identity (73-99% similarity) to each other.
• the phylogenetic analysis of the AChEs of the different animal species shows that the protein sequences of AChEl form a significant autonomous group (bootstrap 795/1000), and that the insect AChEl form a significant distinct subgroup (bootstrap 856/1000).
• the AChE 1 comprises patterns characteristic of the AChE (FIG. 1) located at the following positions, respectively in the sequence SEQ ID NO: 3 and in the reference sequence of Tor proceedingsdo californica (SWISSPROT P04058): a canonical motif of the FGESAG type around the serine in position 266 (200), which is characteristic of the active site of AchE, a choline binding site (Tryptophan residue in position 151 (84)), three residues of the catalytic triad (residues serine, glutamic acid and histidine, respectively in positions 266 (200), 392 (327) and 506 (440)), six cysteine residues potentially involved in conserved disulfide bridges ( C ⁇ 34 ( tf7) -Ci6i (-; C 32 o (254) -C 333 (2, 15); 4 68 (02) - 5 s9 (52i)), aromatic residues bordering the throat of the active site (10 residues) and a phen
• AChE 1 is distinguished from the AChE of Drosophila
• the invention encompasses insect AChEl sensitive or resistant to organophosphates and / or carbamates.
• the AChEl sequences include both the primary sequences, as well as the secondary and tertiary sequences of said AChEl.
• sensitive AChE means an AChE whose acetylcholinesterase activity is inhibited in the presence of organophosphates or carbamates.
• resistant AChE means an AChE whose activity is not inhibited by concentrations of organophosphates or carbamates which inhibit 100% of the activity of the corresponding "sensitive AChE” of an individual of the same species; this "resistant AChE” differs from the previous one by the presence of one or more mutations in its amino acid sequence (amino acid substitutions) which modify its sensitivity to acetylcholinesterase inhibitors; among these mutations, the following can be cited F78S, I129V, G227A, F288Y, the amino acids being numbered with reference to the AChE sequence of Torpedo californica (SWISSPROT P04058).
• acetylcholinesterase activity and the catalytic parameters of AChE are measured by standard enzymatic techniques such as those described in Bourguet et al., Cited above.
• the proteins according to the invention include any natural, synthetic, semi-synthetic or recombinant protein of any prokaryotic or eukaryotic organism, comprising or consisting of an amino acid sequence of an AChEl protein as defined above. above. They include proteins isolated from any insect species, as well as recombinant proteins produced in an appropriate expression system.
• said AChEl corresponds to that of an insect which belongs to the order of diptera (Diptera); preferably, said insect is chosen from the family Culicidae, from the genera Culex, Aedes and Anopheles.
• said AChEl consists of the sequences SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 126 dAnopheles gambiae and the sequence SEQ ID NO: 7 of Culex pipiens (strain S - LAB), sensitive to organophosphates and / or carbamates.
• said central catalytic region of AChE 1 comprises a sequence selected from the group consisting of sequences SEQ ID NO: 8 to 21 representing a fragment of approximately 91 amino acids (fragment K , Figure 1), corresponding to that located between positions 445 and 535 of the sequence SEQ ID NO: 3.
• said AChEl is an acetylcholinesterase resistant to insecticides from the class of organophosphates and carbamates including a mutation of the glycine located in position 119, into serine (mutation or substitution of type G119S); said position being indicated with reference to the AChE sequence of Torpedo califomica (SWISSPROT P04058).
• the inventors have shown that the residue in position 119 is close to the residues of the catalytic site (serine 200 and histidine 440) and that the replacement of the glycine of AChE 1 of sensitive mosquitoes by a serine, in AChE 1 resistant mosquitoes, reduces the space of the catalytic site and prevents the insecticide from interacting with the catalytic serine (S200), due to the steric hindrance of the Van der Waals bonds of the side chain of the serine in position 119.
• the role of the Gl 19S mutation in insecticide resistance was confirmed by analysis of the acetylcholinesterase activity of the recombinant AChEl proteins produced from the cDNA of sensitive Culex pipiens (strain S-LAB having an AChEl including a glycine in position 119) or resistant (strain SR whose AchEl differs from the previous one only by the presence of a serine in position 119) against insecticides; 90% of the AChE 1 activity of the sensitive strain is inhibited in the presence of 10 ⁇ 3 M propoxur whereas the AChE 1 of the resistant strain retains 75% of its activity in the presence of concentrations 100 times higher of this insecticide (10 "1 M propoxur).
• this embodiment of said resistant AChEl corresponds to that of an insect (resistant to insecticides) which belongs to the order of diptera (Diptera); preferably, said insect is chosen from the family Culicidae, from the genera Culex, Aedes and Anopheles.
• said resistant AChEl has a sequence selected from the group consisting of:
• said AChEl is an acetylcholinesterase sensitive to insecticides from the class of organophosphates and carbamates comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 91, 92, 96, 102 to 112, 114, 115 and 117 to 119, representing a fragment of approximately 150 amino acids of the third exon coding for the ace-1 gene derived from an insect as defined above, sensitive to insecticides, said fragment including a glycine in position 119 with reference to the AChE sequence of Toroutheasterndo califomica (SWISSPROT P04058).
• the present invention also relates to a peptide, characterized in that it consists of a fragment of at least 7 amino acids of the protein AChEl, as defined above; these fragments are particularly useful for the production of antibodies specifically recognizing the AChE1 protein.
• the present invention also relates to antibodies, characterized in that they are directed against the AChEl protein or a fragment thereof, as defined above.
• said antibodies are either monoclonal antibodies or polyclonal antibodies.
• the present invention also relates to an isolated nucleic acid molecule, characterized in that it has a sequence selected from the group consisting of:
• the invention encompasses the sequences of the alleles of the ace-1 gene from any insect, as well as the sequences of natural mutants (sensitive and resistant alleles) or artificial mutants of the ace-1 gene coding for a sensitive AChEl protein. or resistant, as defined above.
• said sequence coding for an AChE1 protein is selected from the group consisting of: a) the sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 125,
• SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 56 and SEQ ID NO: 121 which correspond to the cDNA of the amino acid sequence protein AChEl, respectively SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 57 and SEQ ID NO: 122, as defined above, b) the sequences SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 127 which correspond the ace-1 gene of Anopheles gambiae encoding AChEl as defined above, which gene has an exon-infron organization comprising at least 9 exons (Table I), and C) the sequences comprising the sequence SEQ ID NO: 120 which corresponds to the almost complete sequence of the ace-1 gene of Anopheles gambiae encoding the resistant AChEl of sequence SEQ ID NO: 122, as defined above.
• ace-1 gene corresponds to that which is located between intron 4 and intron 5 in the sequence of An, gambiae (Table I), that is to say, in positions 7854 and 8393 of the sequence SEQ ID NO : 127.
• said fragment is selected from the group consisting of primers of sequence SEQ BD NO: 39 to 50, 54, 55, 58, 59, 123, 124, 128 and 129 and the fragments of sequences SEQ ID NO: 24 to 38 and 60 to 89.
• the nucleic acid molecules according to the invention are obtained by the conventional methods, known in themselves, by following standard protocols such as those described in Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc , Library of Congress, USA). For example, they can be obtained by amplification of a nucleic sequence by PCR or RT-PCR, by screening of genomic DNA libraries by hybridization with a homologous probe, or else by total or partial chemical synthesis.
• the nucleic acid molecules as defined above can be used as probes or as primers to isolate the ace-1 gene from other species or alleles of this gene, in particular by screening a genomic DNA library or cDNA, as well as to detect / amplify nucleic acid molecules (mRNA or genomic DNA) encoding an AChEl protein as defined above.
• mRNA or genomic DNA mRNA or genomic DNA
• the subject of the present invention is also a method for detecting insects carrying resistance to insecticides of the organophosphate and carbamate class, characterized in that it comprises:
• Said detection is carried out by conventional techniques which are known in themselves, for example: (i) by amplification of a region of said ace-1 gene capable of containing a mutation, then detection of said mutation by sequencing or by digestion with a appropriate restriction enzyme, of the PCR product obtained, or else (ii) by hybridization with a labeled probe specific for a region of said ace-1 gene capable of containing a mutation, then direct detection of the mismatches and / or digestion by an enzyme appropriate restriction.
• a fragment of approximately 320 bp is amplified using the primers SEQ LD NO: 39 and SEQ CD NO: 40.
• SEQ LD NO: 39 and SEQ CD NO: 40 For example, in mosquitoes one obtains a fragment of sequence SEQ BD NO: 24 to 38 which exhibits mutations between mosquitoes sensitive and resistant to insecticides.
• SEQ BD NO: 24 to 38 which exhibits mutations between mosquitoes sensitive and resistant to insecticides.
• C. pipiens there are 3 substitutions in the sequence of resistant individuals, one of which introduces an EcoRI site.
• the analysis of the restriction profile after PCR amplification of the fragment K and digestion of the products obtained by EcoRI makes it possible to rapidly detect the ace-1 genotype in a population of C.
• RR resistant homozygotes
• SS homozygous sensitive
• RS heterozygous resistant individuals
• the mutation G119S in the third exon encoding the ace-1 gene which is responsible for the resistance to insecticides of the organophosphorus and carbamate class in mosquitoes is detected according to one of the following alternatives, respectively in mosquitoes of the species C. pipiens and An. gambiae:
• a 520 bp fragment of the third coding exon is amplified from genomic DNA, by PCR using the pair of primers Ex3dir and Ex3rev (SEQ ID NO: 58 and 59); the PCR fragment is digested with Alu I and the digestion product is separated by agarose gel electrophoresis, then the restriction profile thus obtained is analyzed: the presence of a 520 bp fragment corresponds to homozygous SS sensitive individuals, the presence of two fragments (357 bp and 163 bp) correspond to RR resistant homozygous individuals and the presence of 3 fragments (520 bp, 357 bp and 163 bp) correspond to RS resistant heterozygous individuals,
• a 541 bp fragment of the third coding exon is amplified from genomic DNA, by PCR using the pair of primers Ex3AGdir and Ex3AGrev (SEQ ID NO: 123 and 124); the PCR fragment is digested with Alu I and the digestion product is separated by agarose gel electrophoresis, then the restriction profile thus obtained is analyzed: the presence of two fragments (403 bp and 138 bp) is suitable for sensitive homozygous individuals SS, the presence of 3 fragments (253 bp, 150 bp and 138 bp) corresponds to homozygous individuals resistant to RR and the presence of 4 fragments (403 bp, 253 bp, 150 bp and 138 bp) corresponds to heterozygous individuals resistant to RS; since the 150 bp and 138 bp fragments co-migrate, the resistant homozygous and heterozygous individuals are detected respectively by
• a 194 bp fragment containing codon 119 of the third coding exon is amplified from genomic DNA by PCR using the pair of primers Moustdirl and Moustrevl (SEQ ID NO: 128 and 129); the PCR fragment is digested with Alu I and the digestion product is separated by agarose gel electrophoresis, then the restriction profile thus obtained is analyzed: the presence of two fragments (74 bp and 120 bp) correspond to homozygous RR resistant individuals, the presence of a single fragment (no digestion) corresponds to SS homozygous susceptible individuals and the presence of three fragments (194 bp, 74 bp and 120 bp) corresponds to heterozygous RS resistant individuals.
• the present invention also relates to a reagent for detecting insects carrying a resistance to organophosphates and / or to carbamates, characterized in that it is selected from the group consisting of: nucleic acid molecules and their fragments as defined above (probes, primers) and antibodies as defined above.
• the present invention also relates to a recombinant vector, characterized in that it comprises an insert selected from the group consisting of the nucleic acid molecules encoding an AChEl protein and their fragments as defined above.
• said recombinant vector is an expression vector in which said nucleic acid molecule or one of its fragments are placed under the control of regulatory elements for appropriate transcription and translation.
• vectors are constructed and introduced into host cells by conventional recombinant DNA and genetic engineering methods, which are known per se.
• Many vectors into which a nucleic acid molecule of interest can be inserted in order to introduce and maintain it in a eukaryotic or prokaryotic host cell are known in themselves; the choice of an appropriate vector depends on the intended use for this vector (for example replication of the sequence of interest, expression of this sequence, maintenance of the sequence in extrachromosomal form or else integration into the chromosomal material of the host ), as well as the nature of the host cell.
• viral vectors such as baculoviruses or non-viral vectors such as plasmids can be used.
• the ace-1 cDNA can be placed under the control of a constitutive promoter such as the 5C actin promoter, in an appropriate vector and said recombinant vector is introduced into cells of insect such as Drosophila cells (Schneider S2 cells).
• a constitutive promoter such as the 5C actin promoter
• the present invention also relates to prokaryotic or eukaryotic cells, modified by a recombinant vector as defined above; preferably these cells are insect cells.
• the recombinant vectors and the modified cells as defined above are useful in particular for the production of the proteins and peptides AChE1 according to the invention.
• the present invention also relates to a transgenic invertebrate animal, characterized in that it contains cells modified with at least one nucleic acid molecule as defined above; preferably said animal is an insect.
• Transgenic animals and modified cells as defined above are useful in particular for the screening of insecticidal substances and for the biological control against vectors of pathogens and harmful insects.
• the present invention also relates to a method of screening an insecticidal substance, characterized in that it comprises: a) bringing the test substance into contact with an AChEl protein selected from: an AChEl protein isolated according to invention, an extract of modified cells or a biological sample of a transgenic animal containing said protein AChEl, as defined above, in the presence of acetylcholine or one of its derivatives, b) measurement by any suitable means , of the acetylcholinesterase activity of the mixture obtained in a), and c) the selection of the substances capable of inhibiting said activity.
• an AChEl protein selected from: an AChEl protein isolated according to invention, an extract of modified cells or a biological sample of a transgenic animal containing said protein AChEl, as defined above, in the presence of acetylcholine or one of its derivatives
• b) measurement by any suitable means of the acetylcholinesterase activity of the mixture obtained in a
• the selection of the substances capable of inhibiting said activity
• the present invention also relates to a method of screening for an insecticidal substance, characterized in that it comprises:
• said screening methods use AChEl resistant to organophosphates or to carbamates or else cells or transgenic animals containing them.
• the present invention also relates to a reagent for screening for insecticidal substances, characterized in that it is selected from the group consisting of AChEl proteins, recombinant vectors, modified cells and transgenic animals as defined above.
• Insecticidal substances capable of inhibiting the acetylcholinesterase activity of AChEl proteins resistant to insecticides of the organophosphorus and carbamate class commonly used have applications: in human and animal health, to combat vectors of pathogens (for example Aedes aegypti, vector of arboviruses such as dengue and yellow fever, Culex pipiens vector of the West-Nile virus, Anopheles gambiae African vector of the malaria agent, etc.) and in the field of agriculture, to fight against harmful insects which devastate crops (for example the Colorado potato beetle (Leptinotarsa decemlineata) which attacks potatoes, aphid pests such as Aphis gossypii and Myzus persicae, etc.).
• the invention further relates to a detection and / or screening kit for the implementation of the methods as defined above, characterized in that it includes at least one reagent as defined above.
• the present invention also relates to a method of screening for inhibitors of an AChEl as defined above, characterized in that it comprises:
• step (b) isolating the potential inhibitors identified in step (a);
• step (c) bringing the substance isolated in step (b) into contact with an AChEl as defined above, an extract of modified cells, a biological sample from a transgenic animal as defined above or a insect extract sensitive or resistant to the aforementioned insecticides, in the presence of acetylcholine or one of its derivatives;
• the method according to the invention comprises a step (step (a)) of computer simulation aimed at identifying peptide or chemical structures having a significant probability of binding to a target protein.
• step (c) of the process It is thus possible to isolate potential inhibitors of the resistant AChEl form without biochemically having the protein, then to directly test the inhibition capacity of each candidate on the AChEl activity of an extract of sensitive insects or resistant (step (c) of the process). This approach can therefore completely dispense with the purification and / or production of target protein.
• the significance of a probability of binding cannot be defined in an absolute manner: it may depend on the type of amino acids involved in the interaction, as well as on the software used for modeling. More precisely, the most commonly used methods select, for a given site of a target molecule, the compounds having the lowest binding energy. In general, the energy calculation takes into account the “hydrogen” bonds, the van der Waals, electrostatic and hydrophobic interactions, as well as the entropy penalties. It is therefore a priori impossible to give a limit of significance in absolute value beyond which a potential ligand will be accepted or rejected, since the energy will depend on the atoms engaged in the bond. However, three selection criteria can be applied: 1. an arbitrary selection of the compounds of lower binding energy. In general, the limit is set between 1% and 5% of the number of compounds tested.
• an estimate of the affinity of the bond based on energy calculations.
• An acceptable value as a starting point could be understood between 1 and 300 micromolar.
• the onchidal, an AChE inhibitor has an apparent affinity of 300 ⁇ M (Abramson et al., Mol. Pharmacol., 1989, 36, 349).
• the invention also comprises other arrangements which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the ace-1 gene and its products (cDNA, protein) according to the present invention as well as the table summarizing the sequences of the Application and the accompanying drawings in which: - Figure 1 illustrates the alignment of the amino acid sequences of the AChEl proteins of Anopheles gambiae, Schizaphis graminum, An.
• amino acids are numbered with reference to the AChE sequence of torpedo fish (Tor proceedingsdo califomica; SWISSPROT P04058). The N- and C-terminal sequences are not shown because of their variability.
• Amino acids stored between AChEl and AChE2 are shown in gray. The specific amino acids of AChE2 are indicated in black.
• the 3 residues representing the catalytic triad (S 200 , E 32 and H 440 ) are framed.
• the choline binding site (W 84 ) is underlined.
• the circles represent the position of the 14 aromatic residues bordering the throat of the active site in the AChE of Toroutheasterndo, 10 of which are present in all the AChEl and AChE2 (solid circles), the others not being conserved (empty circles). Three intramolecular disulfide bonds between cysteine residues are indicated.
• the horizontal arrow indicates the position of fragment K (amplified using the primers PdirAGSG and PrevAGSG). The hypervariable region of ACbE2 which is absent in AChEl is surrounded.
• FIG. 2 illustrates the genetic detection of mosquitoes resistant to organophosphates and / or to carbamates by PCR-RFLP: .
• FIG. 2A represents the comparison of the amino acid sequence of the K fragment of different mosquito species: Cx Pip (Culex pipiens), Ae alb ( ⁇ edes albopictus), Ae aeg (Aedes aegypti), An alb (Anopheles albimanus), An gamb (Anopheles gambiae), An fun (Anopheles funestus), An nil (Anopheles nili), An sac (Anopheles sacharovi), An pse (Anopheles pseudopunctipennis).
• Variant amino acids are grayed out.
• the following sequences are identical: An. Darlingi and An. Albimanus; An. Sundaicus, An. Gambiae and An. Arbiensis; An. Moucheti, An. Funestus and An. Minimus; An. Stephensi and An. Saccharovi.
• FIG. 2B illustrates the comparison of the nucleotide sequences corresponding to the fragment K of the sensitive (S-LAB) and resistant (SR) strains.
• the variant nucleotides are grayed out (t - »c in position 3; a -» g in position 84: the site.
• FIG. 2C illustrates the restriction profiles obtained after agarose gel electrophoresis of the EcoRI digestion products of the fragment K amplified by PCR.
• the homozygous susceptible strain S-LAB has a profile characterized by 2 bands (214 bp and 106 bp), the resistant homozygous strain has a profile characterized by a single band of 320 bp and the resistant mosquitoes from the back crossing have a heterozygous profile characterized by 3 bands (320 bp, 214 bp and 106 bp).
• - Figure 3 illustrates the phylogenetic tree of AChE proteins.
• Lcup Lucilia cuprina: Mdom: Musca domestica: Ldec: Leptinotarsa decemli- neata; Amel Apis mellifera: Ncin: Nephotettix cincticeps; Sgra: Schizaphis grami- num; Rapp: Rhipicephalus appendiculatus; Bmic: Boophilus microplus; Bdec: Boophilus decoloratus; Hsap: Homo sapiens; Btau: Bos taurus; Fcat: Félix catus; Ocunus Oryctus Rnor: Rattus norvegicus; Mmus: Mus musculus; Ggal: Gallus gallus; Drer: Danio reno; Eele: Electrophorus electricus; Tamr.- Tortigdo marmorata; Tcal: Tor proceedingsdo califomica; Bfas: Bungarus fasciatus; Mglu: Myxine glutinosa; Bflo
• FIG. 4 illustrates the cladogram of proteins AChEl and AChE2.
• the sequences of the proteins AChE1 and AChE2 were treated as in FIG. 1.
• the sequence Bmic was added as an external sequence to define the origin of the tree.
• the boxes marked with an asterisk represent proteins encoded by a gene that segregates with resistance to insecticides.
• the empty boxes represent the proteins encoded by a gene that does not segregate with resistance to insecticides.
• the scale corresponds to a divergence of 10%.
• FIGS. 1 illustrates the comparison of the amino acid sequences of the AChEl protein of C. pipiens, infers a strain sensitive (S-LAB) and a strain resistant (SR) to insecticides.
• S-LAB strain sensitive
• SR strain resistant
• the unique glycine 247 (// 9) -> serine 24 (y / P ) mutation (shown in gray) is responsible for resistance to insecticides in mosquitoes of the species C. pipiens; it corresponds to the substitution of the glycine located at position 247 of the AChEl sequence of C. pipiens (or at position 119, with reference to the AChE sequence of torpedo fish), by a serine.
• FIGS. 6A and 6B illustrate the comparison of the nucleotide sequences coding for the AChEl protein of C. pipiens, between a strain sensitive (S-LAB) and a strain resistant (SR) to insecticides; all mutations are silent with the exception of the mutation in position 739 (G - »A) which results, on the one hand, in the substitution of the glycine codon (GGC) in position 247 of the sequence of the protein AchEl of the sensitive strain (S-LAB) by a serine codon (AGC) responsible for resistance to insecticides in the strain SR, and on the other hand, the appearance of an Alu I site (AGCT) in the sequence of the resistant strain, useful for the detection of the mutation.
• GGC glycine codon
• AAC serine codon
• FIG. 7A illustrates (i) the overall structure of the two proteins and (ii) and the steric hindrance of the Van der Waals bonds of serine 200 and histidine 440 of the catalytic site of the enzyme, as well as that of the amino acid at position 119 which is mutated in the case of resistance; the residue in position 119 is close to the residues S 20 o and H 440 of the catalytic site.
• FIGS. 7B and 7C illustrate the comparison of the steric hindrance of the Van der Waals bonds of the amino acids glycine (FIG. 7C) and serine (FIG. 7B) in position 119, of the sensitive and resistant strain respectively.
• the size of the side chain of Serine in position 119 in the resistant strain reduces the space of the catalytic site which probably prevents the insecticide from interacting with catalytic serine (S 200 ).
• FIG. 8 illustrates the detection by PCR-RFLP of the glycine -> serine mutation in the third exon coding for the ace-1 gene, in mosquitoes of the species C.
• 1 band (520 bp) is detected in SS homozygous susceptible individuals, 2 bands (357 bp and 163 bp) are detected in RR resistant homozygous individuals and 3 bands (520 bp, 357 bp and 163 bp) are detected in RS resistant heterozygous individuals.
• FIGS 9A and 9B illustrate the comparison of the sequences of the ace-1 gene of An, gambiae, infers a strain sensitive (KISUMU) and a strain resistant (YAO) to insecticides; all mutations are silent with the exception of two mutations: the first involves the replacement of valine (CGT) in position 33 of the AChEl sequence of the sensitive strain (SEQ ED NO: 5) with an alanine (CGC) in the resistant strain and the second is the same glycine mutation (GGC) - »serine (AGC) as that found in Culex pipiens.
• CCT valine
• CGC alanine
• GGC glycine mutation
• AAC glycine mutation
• the glycine (GGC) ⁇ serine (AGC) mutation causes the appearance of a second Alu I site (AGCT) in the sequence of the third exon encoding the resistant strain, useful for detecting the mutation.
• the coding sequences of the ace-1 gene are indicated in bold and the mutations are indicated in gray.
• the sequences of the primers Ex3AGdir and Ex3Agrev used to detect the glycine mutation (GGC) - ⁇ - serine (AGC), as well as the Alu I sites of the fried exon coding are indicated in bold and underlined.
• FIG. 10 illustrates the quantification of the acetylcholinesterase activity of the AChEl recombinant proteins of Culex pipiens, sensitive (S-LAB, white banas) and resistant (SR, gray banas), produced in S2 insect cells, by comparison with that shredded C. pipiens strain S-LAB (hatched white bananas) and strain SR (shaded gray bars).
• the acetylcholinesterase activity of the cell extracts and of the mosquito grinds was measured in the absence (C) and in the presence of ÎO ⁇ M and 10 "2 M of propoxur.
• the only glycine 247 mutation (7 / 9d -> serine 24 (7 / 9d makes acetylcholinesterase insensitive to insecticide.
• FIG. 11 illustrates the detection by PCR-RFLP of the glycine - »serine mutation in the third exon coding for the ace-1 gene, in mosquitoes of the species Culex pipiens, Anopheles gambiae and Anopheles albimanus: 1 band (194 bp ) is detected in homozygous susceptible SS individuals, 2 bands (74 bp and 120 bp) are detected in homozygous RR resistant individuals and 3 bands (194 bp, 74 bp and 120 bp) are detected in heterozygous SS resistant individuals.
• FIG. 12 illustrates the quantification of the acetylcholinesterase activity of the AChEl proteins of respectively Culex pipiens, Anopheles gambiae and Anopheles albimanus sensitive (SS, gray stripes) and resistant (RS, black bands and RR, white bands).
• FIG. 13 shows the alignment of the nucleotide sequences of the 194 bp fragment of Anopheles gambiae, Culex pipiens and Anopheles albimanus, sensitive (S) or resistant (R).
• Light gray background sequences corresponding to the primers Moustdirl and Moustrevl.
• Gray background Alu I site.
• Dark gray background Guanine from the Gly codon of susceptible individuals.
• FIG. 14 shows the nucleotide sequences of the 194 bp fragment of sensitive (S) and resistant (R) Anopheles albimanus.
• the codon specifying Gly (GGC) and Ser (AGC) is in bold.
• the Alu I site is underlined. Table II; List of sequences
• SEQ ID NO: 1 fragment of the central region of the AChEl protein Anopheles gambiae (positions 70 to 593 of SEQ ID NO: 3).
• SEQ ID NO: 7 AChEl protein Culex pipiens strain S-LAB (complete sequence)
• SEQ ID NO: 26 nucleotide fragment K AChEl Aedes aegypti
• SEQ ID NO: 28 nucleotide fragment K AChEl Anopheles darlingi (AJ 438599)
• SEQ ID NO: 37 nucleotide fragment K AChEl An. Albimanus (AJ 538608)
• SEQ ID NO: 38 nucleotide fragment K AChEl An. ⁇ /// (AJ 538609)
• SEQ ID NO: 64 Nucleotide fragment of the third exon encoding the Praias-P-R strain
• SEQ ID NO: 65 Nucleotide fragment of the third exon encoding Supercar-Q-R strain
• SEQ ID NO: 70 Nucleotide fragment of the third exon coding strain Martinique-Q-R
• SEQ ID NO 90 (D SEQ ID NO 91 (D SEQ ID NO 92 (D SEQ ID NO 93 (D
• nucleotide sequences SEQ ED NO: 27 to 38
• corresponding peptide sequences SEQ ED NO: 10 to 21
• EXAMPLE 1 Materials and Methods a) Strains and Crosses Five strains of C. pipiens were used: S-LAB, a standard strain sensitive to insecticides (Georghiou et al., 1966, Bull. Wld. Hlth Org., 35, 691 -708), SA1, SA4 and EDIT which have a single AChE sensitive to insecticides, and SR which is homozygous for an AChE insensitive to insecticides (Berticat et al., Genêt. Res., 2002, 79, 41-47). The strains having a sensitive and insensitive AChE are called respectively S and R.
• ace-1 represents the locus coding for a cholinergic AChE responsible for resistance to organophosphates and / or to carbamates in C. pipiens (AChEl), previously called Ace.l (Raymond et al., Genetica, 2001, 112/113, 287-296).
• ace-2 represents the second ace locus, which is not involved in insecticide resistance in C. pipiens (previously called Ace.2), whose function is unknown in C. pipiens.
• the unique ace gene present in Drosophila melanogaster, which is homologous to ace-2, is therefore also named.
• the AChE genomic sequences of sea squirts were assembled from raw sequences deposited in the databases of the NCBI (Ciona savignyi) and the Doe Joint Institute (Ciona intestinalis, http://www.igi.doe.gov/ programs / ciona / ciona mainage.html
• the searches in the Drosophila databases were carried out using Flybase (http://www.fruitfly.org/) e) Sequence comparisons
• sequences of the AChEl and AChE2 proteins of Anopheles gambiae deduced from the genomic sequences and the peptide sequences deduced from PCR fragments of C. pipiens and A. aegypti were aligned with those of the known AChEs, using the ClustalW software, using a BLOSUM matrix and default parameters (Thompson et al., NAR, 1994, 22, 4673-4680).
• a phylogenetic tree was constructed using the neighbor-joining algorithm of the DDBJ version of Clustal W (http: //hypernig.nig.ac.ip/homology/ex_clustalw-e.shtml). Bootstrap analysis (1000 counts and 111 input values) was used to assess the confidence levels for the tree topology. The construction of the trees was carried out using Treeview software (vl.6.6). f) Accession numbers
• sequence numbers used for genetic analysis are as follows.
• - Craniata Homo sapiens: NP_00046; Bos taurus: P23795; Félix catus: 06763; Oryctolagus cuniculus: Q29499; Rattus norvegicus: P36136; Mus musculus: P21836; Gallus gallus: CAC37792; Danio reno: Q9DDE3; Electrophorus electricus: 6730113; Tordozensdo marmorata: P07692; Tor proceedingsdo califomica: P04058; Bungarus fasciatus: Q92035; Hagfish glutinosa: Q92081.
• - Cephalocordates Branchiostoma ⁇ oridae: 076998 and 076999;
• Branchiostoma lanceolatum Q95000 and Q95001.
• Ciona intestinalis SEQ ID NO: 51
• Ciona savignyi SEQ ID NO: 52.
• Caenorhabditis elegans (1 to 4): P38433, 061371, 061459 and 061372; Caenorhabditis briggsae (1 to 4) Q27459, O61378Q9NDG9 and
• Anopheles gambiae (1 and 2): SEQ ED NO: 3 and SEQ ED NO: 53 (BM 629847 and BM 627478); Aedes aegypti (1 and 2): SEQ ID NO: 9 and AAB3500; An.
• 30 PCR amplification cycles were carried out under the following conditions: 94 ° C for 30 s, 50 ° C for 30 s to and 72 ° C for 30 s.
• the sequences were determined directly on the PCR products on an ABI prism 310 sequencer, using the Big Dye Terminator kit.
• the genotyping of ace-1 in Culex is carried out under the following conditions: The K fragments obtained as described above are digested with EcoRI and the digestion product is separated by electrophoresis on a 2% agarose gel. The restriction profiles show: 1 band (320 bp) in homozygous RR resistant mosquitoes, 2 bands (106 bp and 214 bp) in SS homozygous mosquitoes and 3 bands (103 bp, 214 bp and 320 bp) in heterozygous RS mosquitoes. h) Cloning of the ace-1 cDNA in sensitive and resistant individuals
• Culex pipiens ace-1 gene cDNA was obtained from RNA extracted from individuals of the sensitive reference strain S-LAB and the resistant strain SR, at the very early stage of L1 larval development. Reverse transcription was performed with an 18T oligonucleotide and SuperScriptlERNaseH (EN VITROGEN), according to the conditions recommended by the manufacturer.
• Two cDNA fragments were amplified by PCR using degenerate oligonucleotides obtained from the alignment of the sequences of the ace-1 genes of Anopheles gambiae and Schizaphis graminum:
• fragments b and k thus obtained were then cloned and sequenced, according to conventional techniques known in themselves to those skilled in the art, as described in Cunent Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library ofCongress, USA).
• a larger cDNA fragment was amplified by PCR, using primers specific for Culex pipiens deduced from the sequences of fragments b and k previously obtained. To know :
• the ends of the cDNAs were amplified by the RACE technique (Rapid Amplification ofcDNA Ends), using a commercial kit (from the Gene Racer kit (IN VITROGEN) according to the conditions indicated in the user manual. were cloned and then sequenced, as above, - strain SR
• the complete sequence of the cDNA of the ace-1 gene of the resistant strain SR was amplified by PCR using the primers culex-5'dir (5 - CCACACGCCAGAAGAAAAGA-3 ', SEQ ID NO: 54) and culex- 3'dir (5'- AAAAACGGGAACGGGAAAG-3, SEQ ID NO: 55) and the 2497 bp fragment thus obtained was cloned and sequenced, as above, i) Cloning of the ace-1 gene in susceptible and resistant individuals
• - fragment A (1130 bp) was amplified using the pair of primers AGl-Adir (5'CGACGCCACCTTCACA3 ⁇ SEQ ED NO: 45) and AGl-Arev (5'GATGGCCCGCTGGAACAGAT3 ', SEQ ED NO: 46), - fragment B (1167 bp) was amplified using the pair of primers AGl-Bdir (5'GGGTGCGGGACAACATTCAC3 ', SEQ BD NO: 47) and AGl-Brev (5'CCCCGACCGACGAAGGA3 ⁇ SEQ ED NO: 48), and
• sequences of fragments A, B and C were determined directly on the PCR products, using internal oligonucleotides, included in these fragments, using the Big Dye Terminator kit and an ABI prism 310 sequencer. J) detection of the mutation of the third coding exon responsible for resistance to insecticides in mosquitoes of the species C. pipiens and An. gambiae
• the mosquito DNA was extracted as described in Rogers et al., Supra, then a fragment of the crumbling exon coding was amplified by PCR, sequence and the mutation in the coding sequence of the third coding exon was detected by PCR-RFLP , according to the principle as described above for fragment K.
• a 520 bp fragment of the third coding exon was amplified from the genomic DNA of several mosquitoes, by PCR using the pair of primers: - Ex3dir 5 * -CGACTCGGACCCACTGGT-3 '(SEQ ED NO: 58 ) and
• the fragment thus obtained was digested with Alu I and the digestion product separated by electrophoresis on a 2% agarose gel.
• the expected restriction profiles are as follows: 1 fragment (520 bp) in SS-sensitive homozygous individuals, 2 fragments (357 bp and 163 bp) in RR-resistant homozygous individuals and 3 fragments (520 bp, 357 bp and 163 bp) in RS resistant heterozygous individuals.
• a 541 bp fragment of the third coding exon was amplified from the genomic DNA of several individuals, by PCR using the pair of primers:
• the fragment thus obtained was digested with Alu I and the product separated by elecfrophoresis on a 2% agarose gel.
• the expected restriction profiles are as follows: 2 fragments (403 bp and 138 bp) in SS homozygous susceptible individuals, 3 fragments (253 bp, 150 bp and 138 bp) in RR resistant homozygous individuals and 4 fragments (403 bp, 253 bp, 150 bp and 138 bp) in heterozygous individuals resistant to RS; since the 150 bp and 138 bp fragments co-migrate, the resistant homozygous and heterozygous individuals are detected respectively by the presence of 2 bands (253 bp and approximately 150 bp) and 3 bands (403 bp, 253 bp and approximately 150 bp) in agarose gel.
• a 174 bp fragment of the third coding exon was amplified from the genomic DNA of several mosquitoes, by PCR using the pair of primers: - Moustdirl: 5 'CCGGGNGCSACYATGTGGAA 3' (SEQ ED
• the fragment thus obtained was digested with Alu I and the digestion product separated by elecfrophoresis on a 2% agarose gel.
• the expected restriction profiles are as follows: 1 fragment (194 bp) in SS-sensitive homozygous individuals, 2 fragments (74 bp and 120 bp) in RR-resistant homozygous individuals and 3 fragments (194 bp, 74 bp and 120 bp) in RS resistant heterozygous individuals. The results are illustrated in Figure 11.
• FIG. 12 shows that the same inhibitory characteristics with propoxur are obtained with resistant mosquitoes An. Albimanus by conventional biochemical test as for the mosquitos An. Gambiae and C. pipiens.
• the cDNAs encoding the AchE1s of the S-LAB strain and the SR strain respectively were cloned into the eukaryotic expression vector pAc5.1 / V5-His (ENVITROGEN), according to conventional recombinant DNA techniques according to standard protocols. such as those described in Current Protocols in Molecular Biology, supra.
• Drosophila cells (Schneider S2 cells) were transfected with the recombinant vectors thus obtained, using the Fugen® reagent (ROCHE), following the manufacturer's instructions. 24 hours after transfection, the cells were harvested by centrifugation and then lysed in 0.25M phosphate buffer containing 1% Triton X-100.
• acetylcholinesterase activity of the cell extracts obtained was measured, in the presence or in the absence of insecticide (propoxur), by the method as described in Bourguet et al., Biochemical Genetics, 1996, 34, 351-362.
• Amino acid sequence analysis confirms that the AChEl and AChE2 proteins are very homologous to Drosophila AChE (BLASTP: P ⁇ e " 18 °) and contain a canonical FGESAG motif around the serine at position 200, with reference to the sequence of the Ache de Torcherdo (S 20 o figure 1), which is characteristic of the active AchE site.
• AChE characteristic patterns of AChE were also found in the two sequences (AChEl and AChE2): the choline binding site (Tryptophan residue at position 84, W84), the three residues of the catalytic triad (serine residues , glutamic acid and histidine, respectively in positions 200, 327 and 440: S 200 , E 327 and H 440 ), the six cysteine residues potentially involved in conserved disulfide bridges (C 67 -C 94 ; C 254 -C 265 ; C 4 o 2 -C 521 ), and aromatic residues bordering the throat of the active site (10 and 11 residues, respectively for AChEl and AChE2).
• the proteins AChEl and AChE2 of An, gambiae have 53% similarity between them and show respectively: 76% and 55% of similarity with the AChE of Schizaphis graminum (accession number NCBI AAK09373 or GENBANK 12958609), 53% and 98% similarity with AChE from An, stephensi (GENBANK 2494391), 54% and 95% similarity with AChE from Aedes aegypti (GENBANK 2133626), 52% and 83% similarity with AChE from Drosophila (GENBANK 17136862).
• EXAMPLE 4 Demonstration of at least two ace genes in other mosquito species
• the presence of the ace-1 gene in the genome of other mosquito species was analyzed by PCR using degenerate oligonucleotides (PdirAGSG and PrevAGSG, SEQ BD NO: 39 and 40) making it possible to amplify an exonic fragment (fragment K, of approximately 320 bp in figure 1), corresponding to sequences conserved between the AChEl sequences of An, gambiae and Schizaphis graminum but divergent violates the AChEl and AChE2 sequences of An, gambiae.
• degenerate oligonucleotides PdirAGSG and PrevAGSG, SEQ BD NO: 39 and 40
• EXAMPLE 5 Analysis of the binding between the ace-1 gene and insecticide resistance
• the fragment K amplified from the genomic DNA of C. resistant pipiens (strain R) has been sequenced.
• the comparison of the sequences of fragment K between the strains S and R shows differences at the level of 3 nucleotides (silent substitutions, FIG. 2B).
• the link between the ace-1 gene and resistance to propoxur was studied, in triplicate, as follows: back-crossing larvae (S x R) x S were treated with a lethal dose for individuals susceptible and the ace-1 genotype was analyzed in the survivors by PCR-RFLP.
• Phylogenetic trees were constructed from the sequences of the conserved regions of the AChEs of An gambiae (SEQ ED NO: 1 and fragment 34-393 of the sequence SEQ ED NO: 53, FIG. 1), K fragments of C. pipiens and Aedes aegypti (SEQ ED NO: 8 and 9) and 33 AChE sequences available in GENBANK, using the neighbor-joining method, as described in the materials and methods.
• Figure 3 illustrates the heterogeneity of the number of ace genes during the evolution of the animal kingdom. In strings, cephalocords have at least two ace genes while urocords have only one, as deduced from the analysis of their genome.
• the dipterans In arthropods, the dipterans have either a single ace gene (Drosophila of the suborder Brachycera) or two ace genes (mosquitoes of the Suborder nematocera). The topology of the tree shows that these two ace genes duplicated very early during evolution, probably before the separation between the protostomes and the deuterostomes. These results are supported by the fact that the AChE of molluscs, nematodes and arthropods branch out from the sequences of the cords (craniatia, cephalocordates and urocordes). The results show that arthropods and nematodes have a related AChE.
• the ace-1 cDNA was cloned from two strains of Anopheles gambiae (strain KISUMU sensitive and strain YAO resistant) and two strains of Culex pipiens (strain S-LAB sensitive and strain SR resistant), as described in materials and methods.
• the complete sequence of the cDNA of the KISUMU strain corresponds to the sequence SEQ ID NO: 125 which codes for a protein of 737 amino acids (SEQ ID NO: 126).
• the complete sequence of the cDNA and of the AChEl protein of the YAO strain corresponds respectively to the sequences SEQ BD NO: 121 and SEQ ED NO: 122.
• sequences SEQ ED NO: 4 and SEQ ED NO: 5 correspond to the quasi sequence -complete (with the exception of the first exon coding for the ace-1 gene), respectively of the cDNA and of the AChEl protein of the KISUMU strain.
• the complete cDNA sequence of the S-LAB and SR strains of C. pipiens corresponds respectively to the sequences SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 56 which code for a protein of 702 amino acids (SEQ ED NO: 7 and SEQ ID NO: 57, respectively for the strain S-LAB and the strain SR).
• EXAMPLE 8 Determination of the sequence of the ace-1 gene
• the sequence of the ace-1 gene was determined from the genomic DNA of two strains of Anopheles gambiae, the sensitive reference strain of West Africa (strain KISUMU) and a resistant strain of Côte d ' ivory (YAO strain), as described in the materials and methods.
• the complete sequence of An, gambiae corresponds to the sequence SEQ
• ID NO: 127 which presents an intron-exon organization comprising at least 9 exons and including two 5 'non-coding exons (Table I)
• the almost complete sequence (with the exception of the first two non-coding 5 ′ exons) of the ace-1 gene of the KISUMU strain corresponds to the sequence SEQ JD NO: 23.
• the almost complete sequence (with the exception of the first two 5 'non-coding exons and the first coding exon) of the ace-1 gene of the YAO strain corresponds to the sequence SEQ ED NO: 120.
• EXAMPLE 9 Identification of mutation (s) in the amino acid sequence of the protein AChEl, responsible for resistance to insecticides in mosquitoes of the species Culex pipiens e Anophactuates gambiae.
• the nucleotide sequence encoding the AChEl protein was determined from two strains of Anopheles gambiae (strain KISUMU sensitive and strain YAO resistant) and two strains of Culex pipiens (strain S-LAB sensitive and strain SR), as described in Example 7.
• FIG. 7A shows that the amino acid in position 119 is close to the residues of the catalytic site (S 00 and H 440 ).
• FIG. 7C shows that, by comparison with the glycine of the sensitive strain (FIG. 7B), the size of the side chain of the serine of the resistant strain, reduces the space of the catalytic site, which probably prevents the insecticide d '' interact with catalytic serine (S 200 ).
• GGC glycine
• APC glycine- serine
• Table III Strains and populations of the species C. pipiens analyzed
• Table IV Analysis of the origin of the glycine - serine mutation responsible for resistance to insecticides in mosquitoes of the species C. pipiens
• Sensitive strains KISUMU (sensitive reference strain from East Africa) and VK-PER (reference strain KDR from West Africa) as well as sensitive populations from the Yaoundé region were tested by the PCR-RFLP test as described above.
• the recombinant AchE1s of the S-LAB strain and the SR strain respectively were expressed in insect cells and the acetylcholinesterase activity was measured from the cell extracts as described in Example 1.

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Abstract

Description

NOUVEAU GENE DE L'ACETYLCHOLINESTERASE RESPONSABLE DE LA RESISTANCE AUX INSECTICIDES ET SES APPLICATIONS

La présente invention est relative à un nouveau gène de l'acétyl- cholinestérase responsable de la résistance aux insecticides, notamment chez les moustiques, aux produits de ce gène (ADNc, protéine) et à leurs applications, notamment pour le criblage de nouveaux insecticides et la détection génétique de la résistance aux organophosphorés et/ou aux carbamates dans les populations de moustiques. L'acétylcholinestérase (AChE, E.C. 3.1.1.7) est une enzyme essentielle qui hydrolyse l'acétylcholine dans les synapses, mettant ainsi fin aux transmis- sions cholinergiques au niveau des jonctions neuronales ou neuromusculaires. L'inhibition de l'AChE empêche la désactivation du signal synaptique, conduisant ainsi à une perte de contrôle de la transmission cholinergique. La biologie de l'acétylcholinestérase a été très étudiée chez les invertébrés, et en particulier les insectes, car cette enzyme est la cible des principales classes de pesticides utilisés, les organo- phosphores et les carbamates. Cependant, l'utilisation massive de pesticides au cours des dernières décennies a provoqué l'émergence d'espèces résistantes. Parmi les mécanismes de résistance, la sélection de mutations rendant l'AChE insensible aux insecticides a été observée dans de nombreux cas (Pour une revue, voir Fournier et al., Comp. Biochem. Physiol., 1994, 108, 19-31). Afin de déterminer avec précision, la nature de l'AChE cible des insecticides, ainsi que les mutations responsables de la résistance à ces derniers, les gènes codant pour des AChE (gènes ace) ont été isolés chez différentes espèces d'arthropodes (insectes et arachnides).

Le premier gène ace a été identifié chez la drosophile (Drosophila melanogaster), par génétique inverse (Hall et al., EMBO J., 1986, 5, 2949-2954). La preuve que ce gène était impliqué dans la résistance aux insecticides a été fournie par la mise en évidence de substitutions d'acides aminés dans l'AChE de drosophiles résistantes, conférant l'insensibilité aux insecticides cholinergiques (Mutéro et al., P.N.A.S., 1994, 91, 5922-5926). Les études chez D. melanogaster semblaient donc indiquer la présence d'un seul gène ace chez les insectes, codant pour l'AChE cible des insecticides cholinergiques. Toutefois, à l'exception du gène ace de deux autres insectes, Musca domestica (Williamson et al., 1992, In Multidisciplinary approaches to cholinesterase functions, Eds Schaffer an A. & Velan B., Plénum Press, New- York, pp 83-86 ; Walsh et al., Biochem. J., 2001, 359, 175-181 ; Kozaki et al., Insect. Biochem. Mol. Biol., 2001, 31, 991-997) et Bactrocera oleae (Vontas et al., Insect Molecular Biology, 2002, 11, 329-339), l'étude des gènes ace isolés chez d'autres insectes ou bien chez des arachnides, par homologie avec celui de la drosophile, indiquent qu'ils ne sont pas impliqués dans la résistance aux insecticides.

En effet, aucune mutation dans la séquence en acides aminés de l'AChE codée par le gène ace dΑphis gossypii, de Nephotettix cincticeps et de Boophilus microplus n'est observée entre les individus résistants et sensibles (Menozzi et al., Thèse de Doctorat de l'université Paul Sabatier, Toulouse, 2000 ; Tomita et al., Insect Biochem. Mol. Biol., 200, 30, 325-333 ; Baxter et al., Insect Biochem. Mol. Biol., 1998, 28, 581-589 ; Hernandez et al., J. Med. Entomol., 1999, 36, 764-770), et une ségrégation indépendante est observée entre le gène ace de Culex pipiens et C. tritaeniorynchus et la résistance aux insecticides (Malcolm et al., Insect. Mol. Biol., 1998, 7, 107-120; Mon et al., Insect Mol. Biol., 2001, 10, 197-203).

En ce qui concerne les autres gènes ace isolés chez d'autres insectes, leur rôle dans la résistance aux insecticides n'a pas été étudié (Lucilia cuprina : Chen et al., Insect. Biochem. Mol. Biol., 2001, 31, 805-816 ; Schizaphis graminum : Gao et al., Insect. Biochem. Mol. Biol., 2001, 31, 1095-1104) ou aucune forme d'AChE insensible aux insecticides n'a été décrite (Aedes aegypti, Anophèles gambiae et Anophèles stephensi : Anthony et al., FEBS letters, 1995, 368, 461-465 ; Malcolm et al., In Molecular Insect Science, Eds Hageborn et al., Plénum Press, New- York, pp 57- 65).

Deux hypothèses ont été émises pour expliquer la différence dans la résistance aux insecticides, observée entre Drosophila melanogaster ou Musca domestica et les autres insectes ou les arachnides qui ont été étudiés : la présence d'un "gène modificateur" responsable de modifications post-transcriptionnelles ou post- traductionnelles de l'AChE, conduisant à des formes d'AChE possédant des activités catalytiques différentes, et la présence d'un deuxième gène ace. Toutefois, aucune étude n'a permis de vérifier ces hypothèses et par conséquent de déterminer la nature du gène et celle de la cible (AChE) impliqués dans la résistance aux insecticides chez les insectes autres que Drosophila melanogaster et Musca domestica ou bien chez les arachnides : - La mise en évidence, chez C. pipiens, de deux formes d'AChE possédant des activités catalytiques distinctes supporte les deux hypothèses et l'analyse biochimique de ces AChE n'a pas permis de déterminer la nature de l'AChE impliquée dans la résistance aux insecticides (Bourguet et al., J. Neurochemistry, 1996, 67, 2115-2123). En effet, la description d'une activité AChEl insensible au propoxur dans des extraits d'insectes par Bourguet et al. (Pesticide Biochemistry and Physiology, 1996, 55, 2, 122-128) ne fournit aucune donnée sur l'existence effective d' AChEl chez Culex pipiens, ni sur la séparation de l'activité AChEl, de l'activité AChE2, dans le contexte des deux hypothèses précitées, à la lumière de l'article postérieur des mêmes Auteurs (Bourguet D. et al., Neurochemistry Internat., 1997, 3_i, 1, 65-72), dans lequel l'existence d'un deuxième gène chez de nombreux moustiques n'a pas pu être mis en évidence.

- Un deuxième gène ace a été isolé chez les arachnides ; toutefois ce gène n'est pas impliqué dans la résistance aux insecticides (Hernandez et al., Baxter et al., précités). - Un deuxième gène ace n'a pu être isolé chez les insectes malgré de nombreuses tentatives dans différentes espèces (Menozzi et al., Tomita et al., Mori et al, précités ; Severson et al, J. Hered., 1997, 88, 520-524).

Il ressort de ce qui précède que la nature du gène et de la cible (AChE), impliqués dans la résistance aux organophosphorés et/ou aux carbamates, n'a pas été identifiée chez la plupart des insectes et chez les arachnides, notamment chez ceux où ils ont été recherchés ; on peut citer les plus importants dans les domaines de la santé humaine ou animale et de l'agriculture comme les vecteurs de pathogènes et les nuisibles, notamment de nombreux moustiques comme Culex pipiens, Aedes aegypti, Anophèles gambiae, Anophèles albimanus, Anophèles stephensi, et des rava- geurs des cultures comme Aphis gossypii, Nephotettix cincticeps et Leptinotarsa decemlineata. Les Inventeurs ont identifié un nouveau locus du gène ace dans le génome d'Anophèles gambiae et de 15 espèces différentes de moustiques et ils ont montré que ce nouveau locus, non-homologue au locus précédemment décrit chez D. melanogaster, était impliqué dans la résistance aux insecticides chez les moustiques. Les Inventeurs ont également montré que la résistance aux insecticides, au moins chez les moustiques des espèces Culex pipiens et Anophèles gambiae, était liée à une unique mutation dans la séquence de l'acétylcholinestérase codée par ce nouveau gène, située au voisinage du site catalytique de l'enzyme.

Ce nouveau gène représente un outil de diagnostic pour la détection génétique de la résistance aux insecticides (organophosphorés, carbamates) dans les populations de moustiques. L'AChE codée par ce gène représente une cible pour le criblage de nouvelles molécules actives sur les populations de moustiques résistants aux insecticides actuellement utilisés.

La présente invention a, en conséquence, pour objet une protéine, caractérisée en ce qu'elle comprend une région catalytique centrale qui présente une séquence en acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par la séquence SEQ ID NO: 1 et les séquences présentant au moins 60 % d'identité ou 70 % de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 1, à l'exclusion de la séquence NCBI AAK0973 corces- pondant à l'acétylcholinestérase de Schizaphis graminum. La protéine selon l'invention représente une nouvelle acetylcholinesterase d'insecte, dénommée ci-après AchEl, responsable de la résistance aux organophosphorés et/ou aux carbamates, au moins chez les moustiques, notamment chez C. pipiens ; le locus codant pour ladite AchEl est dénommée ci-après ace-1 ; ace-2 représente le second locus ace, qui n'est pas impliqué dans la résistance aux insecticides chez les moustiques. L'unique gène ace présent dans Drosophila melanogaster, qui est homologue à ace-2, est donc également dénommé ace-2.

Conformément à l'invention, ladite région catalytique centrale contient le domaine catalytique de l'AChE et conespond à celle située enfre les positions 70 et 593 de la séquence de l'AChEl d'Anophèles gambiae (SEQ ID NO: 3, 643 acides aminés) ; elle coπespond à celle située respectivement enfre les positions 100 et 629 de la séquence d'AChEl de Schizaphis graminum (NCBI AAK0973), 60 et 582 de la séquence de l'AChE 1 de Culex pipiens (SEQ ID NO: 7), 34 et 593 de la séquence d'AChE2 d'Anophèles gambiae (figure 1, SEQ ID NO: 53), et 41 et 601 de la séquence d'AChE2 de Drosophila melanogaster (NCBI AAF54915). Cette région centrale qui contient le domaine catalytique est conservée chez les vertébrés et les invertébrés alors que les extrémités N- et C-terminales présentent une forte variabilité entre les diffé- rentes espèces.

Conformément à l'invention, l'identité d'une séquence par rapport à une séquence de référence (SEQ ID NO: 1) s'apprécie en fonction du pourcentage de résidus d'acides aminés qui sont identiques, lorsque les séquences conespondant à la région catalytique telle que définie ci-dessus sont alignées, de manière à obtenir le maximum de correspondance entre elles.

Une protéine ayant une séquence en acides aminés ayant au moins X % d'identité avec la séquence de référence SEQ ID NO: 1 est définie, dans la présente invention comme une protéine dont la séquence conespondant à la région catalytique centrale telle que définie ci-dessus peut inclure jusqu'à 100-X altérations pour 100 acides aminés de la séquence SEQ BD NO: 1. Au sens de la présente invention, le terme altération inclut les délétions, les substitutions ou les insertions consécutives ou dispersées d'acides aminés dans la séquence de référence. Cette définition s'applique, par analogie, aux molécules d'acide nucléique.

La similarité d'une séquence par rapport à la séquence de référence SEQ ID NO 1 s'apprécie en fonction du pourcentage de résidus d'acides aminés qui sont identiques ou qui différent par des substitutions conservatives, lorsque les séquences conespondant à la région catalytique centrale telle que définie ci-dessus sont alignées de manière à obtenir le maximum de conespondance entre elles. Au sens de la présente invention, on entend par substitution conservative, la substitution d'un acide aminé par un autre qui présente des propriétés chimiques similaires (taille, charge ou polarité), qui généralement ne modifie pas les propriétés fonctionnelles de la protéine.

Une protéine ayant une séquence en acides aminés ayant au moins X % de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 1 est définie, dans la présente inven- tion comme une protéine dont la séquence conespondant à la région catalytique centrale telle que définie ci-dessus peut inclure jusqu'à 100-X altérations non-conser- vatives pour 100 acides aminés de la séquence de référence. Au sens de la présente invention, le terme altérations non-conservatives inclut les délétions, les substitutions non-conservatives ou les insertions consécutives ou dispersées d'acides aminés dans la séquence SEQ ID NO: 1.

La comparaison de l'AChE 1 selon l'invention avec les AChE d'insecte disponibles sur les bases de données, par alignement des séquences conespondant à la région centrale telle que définie ci-dessus, à l'aide du logiciel BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, paramètres par défaut, filtre inactivé) montre que :

- les séquences d'AChEl et d'AChE2 d'insecte présentent 36-39% d'identité (53-57% similarité) entre elles.

- les séquences d'AChEl d'insecte présentent 65-97% d'identité (79- 98% similarité) entre elles,

- les séquences d'AChE2 d'insecte présentent 58-99% d'identité (73- 99% similarité) entre elles, En outre, l'analyse phylogénétique des AChE des différentes espèces animales montre que les séquences protéiques d'AChEl forment un groupe autonome significatif (bootstrap 795/1000), et que les AChEl d'insecte forment un sous-groupe distinct significatif (bootstrap 856/1000).

L'AChE 1 selon l'invention comprend des motifs caractéristiques des AChE (figure 1) situés aux positions suivantes, respectivement dans la séquence SEQ ID NO: 3 et dans la séquence de référence de Torpédo californica (SWISSPROT P04058) : un motif canonique du type FGESAG autour de la serine en position 266 (200), qui est caractéristique du site actif des AchE, un site de liaison à la choline (résidu Tryptophane en position 151 (84)), trois résidus de la triade catalytique (rési- dus serine, acide glutamique et histidine, respectivement en positions 266 (200), 392 (327) et 506 (440)), six résidus cystéine potentiellement impliqués dans des ponts disulfures conservés (Cι₃₄(_tf7)-Ci6i( - ; C₃₂o(254)-C₃₃₃(2,î5); ₄68( 02)- ₅s9(52i)), des résidus aromatiques bordant la gorge du site actif (10 résidus) et un résidu phénylalanine en position 355 (290) mais pas en position 353 (288), qui distingue les AChE d'inverté- brés de celles de vertébrés. Elle possède également un peptide C-terminal hydrophobe conespondant à un signal d'addition d'un glycolipide, indiquant le clivage post- traductionnel d'un fragment C-terminal et l'addition d'une résidu d'ancrage glycolipi- dique comme chez Drosophila ; le résidu cystéine dans la séquence C-terminale précédant le site potentiel de clivage du peptide hydrophobe pounait être impliqué dans une liaison disulfure intermoléculaire, liant les deux sous-unités catalytiques du dimère d'AChE. L'AChE 1 selon l'invention se distingue de l'AChE de Drosophila

(AChE2) par l'absence d'une insertion hydrophile de 31 acides aminés entre les résidus situés aux positions 174 et 175 de la séquence SEQ ID NO: 3 (figure 1) ; cette insertion hydrophile pounait être caractéristique de l'AChE2, au moins chez les diptères.

L'invention englobe les AChEl d'insecte sensibles ou résistantes aux organophosphorés et/ou aux carbamates.

Au sens de la présente invention, les séquences d'AChEl incluent aussi bien les séquences primaires, que les séquences secondaires et les séquences tertiaires desdites AChEl.

Au sens de la présente invention on entend par "AChE sensible", une AChE dont l'activité acetylcholinesterase est inhibée en présence d'organophosphorés ou de carbamates.

Au sens de la présente invention on entend par "AChE résistante", une AChE dont l'activité n'est pas inhibée par des concentrations en organophosphorés ou en carbamates qui inhibent 100 % de l'activité de "l'AChE sensible" conespondante issue d'un individu de la même espèce ; cette "AChE résistante" diffère de la précédente par la présence d'une ou plusieurs mutations dans sa séquence en acides aminés (substitutions d'acides aminés) qui modifient sa sensibilité aux inhibiteurs de l'acétylcholinestérase ; parmi ces mutations on peut citer les suivantes F78S, I129V, G227A, F288Y, les acides aminés étant numérotés en référence à la séquence de l'AChE de Torpédo californica (SWISSPROT P04058).

L'activité acetylcholinesterase et les paramètres catalytiques des AChE sont mesurés par les techniques enzymatique classiques telles que celles décrites dans Bourguet et al., précité.

Les protéines selon l'invention incluent toute protéine naturelle, synthétique, semi-synthétique ou recombinante de n'importe quel organisme proca- ryote ou eucaryote, comprenant ou consistant en une séquence d'acides aminés d'une protéine AChEl telle que définie ci-dessus. Elles incluent notamment les protéines naturelles isolées chez n'importe quelle espèce d'insecte, ainsi que les protéines recombinantes produites dans un système d'expression approprié.

Selon un mode de réalisation avantageux de ladite AChEl, elle coπespond à celle d'un insecte qui appartient à l'ordre des diptères (Diptera) ; de manière préférée, ledit insecte est choisi dans la famille des Culicidae, parmi les genres Culex, Aedes et Anophèles.

Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite AChEl est constituée par les séquences SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 126 dAnopheles gambiae et la séquence SEQ ID NO: 7 de Culex pipiens (souche S- LAB), sensibles aux organophosphorés et/ou aux carbamates.

Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite région centrale catalytique de l'AChE 1 comprend une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 8 à 21 représentant un fragment d'environ 91 acides aminés (fragment K, figure 1), conespondant à celui situé entre les positions 445 et 535 de la séquence SEQ ID NO: 3.

Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite AChEl est une acetylcholinesterase résistante aux insecticides de la classe des organophosphorés et des carbamates incluant une mutation de la glycine située en position 119, en serine (mutation ou substitution de type G119S) ; ladite position étant indiquée en référence à la séquence de l'AChE de Torpédo califomica (SWISSPROT P04058).

En effet, les Inventeurs ont montré que le résidu en position 119 est proche des résidus du site catalytique (serine 200 et histidine 440) et que le remplacement de la glycine de l'AChE 1 des moustiques sensibles par une serine, dans l'AChE 1 des moustiques résistants, réduit l'espace du site catalytique et empêche l'insecticide d'interagir avec la serine catalytique (S200), du fait de l'encombrement stérique des liaisons de Van der Waals de la chaîne latérale de la serine en position 119. Le rôle de la mutation Gl 19S dans la résistance aux insecticides a été confirmé par l'analyse de l'activité acetylcholinesterase des protéines AChEl recombinantes produites à partir de l'ADNc de Culex pipiens sensibles (souche S-LAB possédant une AChEl incluant une glycine en position 119) ou résistants (souche SR dont l' AchEl diffère de la précédente uniquement par la présence d'une serine en position 119) aux insecticides ; 90 % de l'activité de l'AChE 1 de la souche sensible est inhibée en présence de 10^"3 M de propoxur alors que l'AChE 1 de la souche résistante conserve 75 % de son activité en présence de concentrations 100 fois plus élevées de cet insecticide (10^"1 M de propoxur). Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation de ladite AChEl résistante, elle conespond à celle d'un insecte (résistant aux insecticides) qui appartient à l'ordre des diptères (Diptera) ; de manière préférée, ledit insecte est choisi dans la famille des Culicidae, parmi les genres Culex, Aedes et Anophèles.

De préférence, ladite AChEl résistante présente une séquence sélec- tionnée dans le groupe constitué par :

- la séquence SEQ ID NO: 57, conespondant à la séquence complète de la souche SR de C. pipiens, résistante aux insecticides,

- la séquence SEQ ED NO: 122, conespondant à la séquence complète de l'AChE 1 de la souche YAO d!An. gambiae (isolée en Côte d'ivoire), résistante aux insecticides, et

- les séquences comprenant un fragment de séquence SEQ ID NO: 90, 93, 94, 95, 97 à 101, 113 et 116 représentant un fragment peptidique d'environ 150 acides aminés codé par le troisième exon codant du gène ace-1 d'un insecte résistant tel que défini ci-dessus, contenant la substitution de type G119S, en référence à la séquence de l'AChE de Torpédo califomica (SWISSPROT P04058).

Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite AChEl est une acetylcholinesterase sensible aux insecticides de la classe des organophosphorés et des carbamates comprenant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les SEQ ID NO: 91, 92, 96, 102 à 112, 114, 115 et 117 à 119, représentant un fragment d'environ 150 acides aminés du troisième exon codant du gène ace-1 issu d'un insecte tel que défini ci-dessus, sensible aux insecticides, ledit fragment incluant une glycine en position 119 en référence à la séquence de l'AChE de Torpédo califomica (SWISSPROT P04058).

La présente invention a également pour objet un peptide, caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment d'au moins 7 acides aminés de la protéine AChEl, telle que définie ci-dessus ; ces fragments sont particulièrement utiles pour la production d'anticorps reconnaissant spécifiquement la protéine AChEl. La présente invention a également pour objet des anticorps, caractérisés en ce qu'ils sont dirigés contre la protéine AChEl ou un fragment de celle-ci, tels que définis ci-dessus.

Conformément à l'invention, lesdits anticorps sont soit des anticorps monoclonaux, soit des anticorps polyclonaux.

Ces anticorps peuvent être obtenus par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes, comprenant notamment l'immunisation d'un animal avec une protéine ou un peptide conforme à l'invention, afin de lui faire produire des anticorps dirigés contre ladite protéine ou ledit peptide. La présente invention a également pour objet une molécule d'acide nucléique isolée, caractérisée en ce qu'elle présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par :

- les séquences codant pour une protéine AChEl telle que définie ci- dessus (ADNc et fragment d'ADN génomique conespondants au gène ace-1), et - les séquences complémentaires des précédentes, sens ou anti-sens.

- les fragments d'au moins 8 pb, de préférence de 15 pb à 500 pb des séquences précédentes.

L'invention englobe, les séquences des allèles du gène ace-1 issues de n'importe quel insecte, ainsi que les séquences des mutants naturels (allèles sensi- blés et résistants) ou artificiels du gène ace-1 codant pour une protéine AChEl sensible ou résistante, telle que définie ci-dessus.

Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite séquence codant pour une protéine AChEl est sélectionnée dans le groupe constitué par : a) les séquences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO :4, SEQ ID NO: 125,

SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 56 et SEQ ID NO: 121 qui conespondent à l'ADNc de la protéine AChEl de séquence en acides aminés, respectivement SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 57 et SEQ ID NO: 122, telles que définie ci-dessus, b) les séquences SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 et SEQ ID NO: 127 qui conespondent au gène ace-1 d'Anophèles gambiae codant les AChEl telles que définies ci-dessus, lequel gène présente une organisation exon-infron comprenant au moins 9 exons (Tableau I), et 11 c) les séquences comprenant la séquence SEQ ID NO: 120 qui conespond à la séquence quasi-complète du gène ace-1 d'Anophèles gambiae codant l'AChEl résistante de séquence SEQ ID NO: 122, telle que définie ci-dessus.

Tableau I : Organisation Intron-Exon du gène ace-1

gène ace-1 conespond à celui qui est situé entre l'intron 4 et l'intron 5 dans la séquence d'An, gambiae (Tableau I) , c'est à dire enfre les positions 7854 et 8393 de la séquence SEQ ID NO: 127.

Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit fragment est sélectionné dans le groupe constitué par les amorces de séquence SEQ BD NO: 39 à 50, 54, 55, 58, 59, 123, 124, 128 et 129 et les fragments de séquences SEQ ID NO: 24 à 38 et 60 à 89.

Les molécules d'acide nucléique selon l'invention sont obtenues par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes, en suivant les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL,2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA). Par exemple, elles peuvent être obtenues par amplification d'une séquence nucléique par PCR ou RT- PCR, par criblage de banques d'ADN génomique par hybridation avec une sonde homologue, ou bien par synthèse chimique totale ou partielle. Les molécules d'acides nucléiques telles que définies ci-dessus peuvent être utilisées comme sondes ou comme amorces pour isoler le gène ace-1 d'autres espèces ou des allèles de ce gène, notamment par criblage d'une banque d'ADN génomique ou d'ADNc, ainsi que pour détecter/amplifier des molécules d'acide nucléique (ARNm ou ADN génomique) codant une protéine AChEl telle que définie ci-dessus. Ces différentes molécules d'acides nucléiques permettent de mettre en évidence le gène ace-1, des variants alléliques de ce gène, une altération fonctionnelle de ce gène ace-1 (changement substantiel de la sensibilité aux insecticides) résultant d'une mutation (insertion, délétion ou substitution) d'un ou plusieurs nucléo- tides au niveau dudit gène.

La présente invention a également pour objet une méthode de détection d'insectes porteurs d'une résistance aux insecticides de la classe des organophosphorés et des carbamates, caractérisée en ce qu'elle comprend :

- la préparation d'un échantillon d'acides nucléiques à partir d'insec- tes à tester, et

- la détection par tout moyen approprié de la présence, dans ledit échantillon d'acides nucléiques, d'une mutation dans le gène ace-1 tel que défini ci- dessus.

Ladite détection est réalisée par les techniques classiques qui sont connues en elles mêmes, par exemple : (i) par amplification d'une région dudit gène ace-1 susceptible de contenir une mutation, puis détection de ladite mutation par séquençage ou par digestion par une enzyme de restriction appropriée, du produit de PCR obtenu, ou bien (ii) par hybridation avec une sonde marquée spécifique d'une région dudit gène ace-1 susceptible de contenir une mutation, puis détection directe des mésappariements et/ou digestion par une enzyme de restriction appropriée.

Selon un premier mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, un fragment d'environ 320 pb (fragment K) est amplifié à l'aide des amorces SEQ LD NO: 39 et SEQ CD NO: 40. Par exemple, chez les moustiques on obtient un fragment de séquence SEQ BD NO: 24 à 38 qui présente des mutations entre les moustiques sensibles et résistants aux insecticides. Par exemple, chez C. pipiens on observe 3 substitutions dans la séquence des individus résistants dont l'une introduit un site EcoRI. L'analyse du profil de restriction après amplification PCR du fragment K et digestion des produits obtenus par EcoRI (analyse RFLP), permet de détecter rapidement le génotype ace-1 dans une population de C. pipiens ; la présence d'un seul frag- ment conespond aux homozygotes résistants (RR), la présence de 2 fragments d'environ 106 pb et 214 pb conespond aux individus homozygotes sensibles (SS) et la pré- sence de 3 fragments de 106 pb, 214 pb et 320 pb conespond aux individus hétérozygotes résistants (RS).

Selon un second mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, la mutation G119S dans le froisième exon codant du gène ace-1 qui est responsable de la résistance aux insecticides de la classe des organophosphorés et des carbamates chez les moustiques est détectée selon l'une des alternatives suivantes, respectivement chez les moustiques des espèces C. pipiens et An. gambiae :

- chez les moustiques de l'espèce Culex pipiens, un fragment de 520 pb du troisième exon codant est amplifié à partir de l'ADN génomique, par PCR à l'aide du couple d'amorces Ex3dir et Ex3rev (SEQ ID NO: 58 et 59) ; le fragment PCR est digéré par Alu I et le produit de digestion est séparé par électrophorèse en gel d'agarose, puis le profil de restriction ainsi obtenu est analysé : la présence d'un fragment de 520 pb conespond aux individus homozygotes sensibles SS, la présence de deux fragments (357 pb et 163 pb) conespond aux individus homozygotes résistants RR et la présence de 3 fragments (520 pb, 357 pb et 163 pb) conespond aux individus hétérozygotes résistants RS,

- chez les moustiques de l'espèce Anophèles gambiae, un fragment de 541 pb du troisième exon codant est amplifié à partir de l'ADN génomique, par PCR à l'aide du couple d'amorces Ex3AGdir et Ex3AGrev (SEQ ID NO: 123 et 124) ; le fragment PCR est digéré par Alu I et le produit de digestion est séparé par électrophorèse en gel d'agarose, puis le profil de restriction ainsi obtenu est analysé : la présence de deux fragments (403 pb et 138 pb) conespond aux individus homozygotes sensibles SS, la présence de 3 fragments (253 pb, 150 pb et 138 pb) conespond aux individus homozygotes résistants RR et la présence de 4 fragments (403 pb, 253 pb, 150 pb et 138 pb) conespond aux individus hétérozygotes résistants RS ; étant donné que les fragments de 150 pb et 138 pb co-migrent, les individus homozygotes et hétérozygotes résistants sont détectés respectivement par la présence de 2 bandes (253 pb et environ 150 pb) et de 3 bandes (403 pb, 253 pb et environ 150 pb),

- chez les moustiques de l'espèce Culex pipiens, Anophèles gambiae ou Anophèles albimanus, un fragment de 194 pb contenant le codon 119 du troisième exon codant est amplifié à partir de l'ADN génomique par PCR à l'aide du couple d'amorces Moustdirl et Moustrevl (SEQ ID NO: 128 et 129) ; le fragment PCR est digéré par Alu I et le produit de digestion est séparé par électrophorèse en gel d'agarose, puis le profil de restriction ainsi obtenu est analysé : la présence de deux fragments (74 pb et 120 pb) conespond aux individus homozygotes résistants RR, la présence d'un seul fragment (pas de digestion) conespond aux individus homozygotes sensibles SS et la présence de trois fragments (194 pb, 74 pb et 120 pb) conespond aux individus hétérozygotes résistants RS.

La présente invention a également pour objet un réactif de détection d'insectes porteurs d'une résistance aux organophosphorés et/ou aux carbamates, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par : les molécules d'acide nucléique et leurs fragments tels que définis ci-dessus (sondes , amorces) et les anticorps tels que définis ci-dessus.

La présente invention a également pour objet un vecteur recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend un insert sélectionné dans le groupe constitué par les molécules d'acides nucléiques codant une protéine AChEl et leurs fragments tels que définis ci-dessus.

De préférence, ledit vecteur recombinant est un vecteur d'expression dans lequel ladite molécule d'acide nucléique ou l'un de ses fragments sont placés sous le contrôle d'éléments régulateurs de la transcription et de la traduction appropriés.

Ces vecteurs sont construits et introduits dans des cellules hôtes par les méthodes classiques d'ADN recombinant et de génie génétique, qui sont connues en elles-mêmes. De nombreux vecteurs dans lesquels on peut insérer une molécule d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte eucaryote ou procaryote, sont connus en eux-mêmes ; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de la séquence sous forme extrachromosomique ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte. Par exemple, on peut utiliser des vecteurs viraux comme les baculovirus ou non-viraux comme des plasmides. Pour exprimer l'AChE 1, l'ADNc d'ace-1 peut être placé sous le contrôle d'un promoteur constitutif comme le promoteur de l'actine 5C, dans un vecteur approprié et ledit vecteur recombinant est introduit dans des cellules d'insecte telles que des cellules de drosophile (cellules de Schneider S2). La présente invention a également pour objet des cellules procaryo- tes ou eucaryotes, modifiées par un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus ; de préférence ces cellules sont des cellules d'insectes.

Les vecteurs recombinants et les cellules modifiées telles que défi- nies ci-dessus, sont utiles notamment pour la production des protéines et des peptides AChEl selon l'invention.

La présente invention a également pour objet un animal invertébré transgénique, caractérisé en ce qu'il contient des cellules modifiées par au moins une molécule d'acide nucléique telle que définie ci-dessus ; de préférence ledit animal est un insecte.

Les animaux transgéniques et les cellules modifiées telles que définis ci-dessus, sont utiles notamment pour le criblage de substances insecticides et pour la lutte biologique contre les vecteurs de pathogènes et les insectes nuisibles.

La présente invention a également pour objet une méthode de criblage d'une substance insecticide, caractérisée en ce qu'elle comprend : a) la mise en contact de la substance à tester avec une protéine AChEl sélectionnée parmi : une protéine AChEl isolée selon l'invention, un extrait de cellules modifiées ou un échantillon biologique d'un animal transgénique contenant ladite protéine AChEl, tels que définis ci-dessus, en présence d'acétylcholine ou de l'un de ses dérivés, b) la mesure par tout moyen approprié, de l'activité acetylcholinesterase du mélange obtenu en a), et c) la sélection des substances capables d'inhiber ladite activité.

La présente invention a également pour objet une méthode de criblage d'une substance insecticide, caractérisée en ce qu'elle comprend :

- la mise en contact d'un animal transgénique tel que défini ci-dessus, avec la substance à tester, et

- la mesure de la survie de l'animal.

Avantageusement, lesdites méthodes de criblage mettent en œuvre des AChEl résistantes aux organophosphorés ou aux carbamates ou bien des cellules ou des animaux transgéniques les contenant. La présente invention a également pour objet un réactif de criblage de substances insecticides, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par les protéines AChEl, les vecteurs recombinants, les cellules modifiées et les animaux transgéniques tels que définis ci-dessus. Des substances insecticides capables d'inhiber l'activité acetylcholinesterase des protéines AChEl résistantes aux insecticides de la classe des organophosphorés et des carbamates couramment utilisés ont des applications :en santé humaine et animale, pour lutter contre les vecteurs de pathogènes (par exemple Aedes aegypti, vecteur d'arboviroses comme la dengue et la fièvre jaune, Culex pipiens vecteur du virus West-Nile, Anophèles gambiae vecteur africain de l'agent du paludisme, etc) et dans le domaine de l'agriculture, pour lutter contre les insectes nuisibles qui dévastent les récoltes (par exemple le doryphore (Leptinotarsa decemlineata) qui s'attaque aux pommes-de-tene, les pucerons ravageurs comme Aphis gossypii et Myzus persicae, etc.). L'invention a en outre pour objet une trousse de détection et/ou de criblage pour la mise en œuvre des méthodes telles que définies ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle inclut au moins un réactif tel que défini ci-dessus.

La présente invention a également pour objet une méthode de criblage d'inhibiteurs d'une AChEl telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend :

(a) l'identification de molécules (peptides ou autres structures chimiques) présentant une probabilité de liaison significative à ladite AChEl ;

(b) l'isolement des inhibiteurs potentiels identifiés à l'étape (a) ;

(c) la mise en contact de la substance isolée à l'étape (b) avec une AChEl telle que définie ci-dessus, un extrait de cellules modifiées, un échantillon biologique d'un animal transgénique tels que définis ci-dessus ou un extrait d'insecte sensible ou résistant aux insecticides précités, en présence d'acétylcholine ou de l'un de ses dérivés ;

(d) la mesure par tout moyen approprié, de l'activité acétyl- cholinestérase du mélange obtenu en (c) ; et

(e) la vérification que les molécules isolées en (b) inhibent l'activité AChEl. La structure 3D de l'acétylcholinestérase du poisson torpille a permis de modéliser la structure 3D de l'AChEl de C. pipiens. La mutation G247S [conespondant à une substitution G119S chez la protéine de torpille] entraîne une réduction de l'espace du site catalytique due à l'encombrement de la chaîne latérale de la serine. La modélisation de la structure de l'AChEl de C. pipiens ou d'An, gambiae permet ainsi le criblage d'inhibiteurs de l'AChEl par criblage virtuel ("Docking"). Le procédé selon l'invention comporte une étape (étape (a)) de simulation informatique visant à identifier des structures peptidiques ou chimiques présentant une probabilité de liaison significative à une protéine cible. Différents programmes informatiques permettent ainsi de simuler et d'estimer les probabilités d'interactions. On peut notamment citer les algorithmes élaborés pour la recherche d'interactions potentielles décrits dans Schneider et al. (Drug Discovery Today, 2002, 7, 1, 64-71). De manière plus précise, les outils les plus couramment utilisés jusqu'à présent sont FlexX (Tripos, StLouis, Missouri, USA), DOCK (UCSF, San Francisco, California, USA) et GOLD (Cambridge Crystallographic Data Centre, Cambridge, Royaume-Uni).

Il est ainsi possible d'isoler des inhibiteurs potentiels de la forme d'AChEl résistante sans disposer biochimiquement de la protéine, puis de tester directement la capacité d'inhibition de chaque candidat sur l'activité AChEl d'un extrait d'insectes sensibles ou résistants (étape (c) du procédé). Cette approche peut donc s'affranchir totalement de la purification et/ou de la production de protéine cible.

Au sens de la présente invention, la significativité d'une probabilité de liaison ne peut être définie de manière absolue : cela peut dépendre du type d'acides aminés impliqués dans l'interaction, ainsi que des logiciels utilisés pour la modélisa- tion. De manière plus précise, les méthodes les plus couramment utilisées sélectionnent, pour un site donné d'une molécule cible, les composés présentant l'énergie de liaison la plus faible. En général, le calcul de l'énergie prend en compte les liaisons « hydrogène », les interactions de van der Waals, électrostatiques et hydrophobes, ainsi que les pénalités d'entropie. Il est donc a priori impossible de donner une limite de significativité en valeur absolue au-delà de laquelle un ligand potentiel sera accepté ou rejeté, puisque l'énergie dépendra des atomes engagés dans la liaison. Cependant, trois critères de sélection peuvent être appliqués : 1. une sélection arbitraire des composés de moindre énergie de liaison. En général, la limite est fixée entre 1 % et 5 % du nombre de composés testés.

2. une estimation de l'affinité de la liaison, en fonction des calculs d'énergie. Une valeur acceptable comme base de départ pounait être comprise enfre 1 et 300 micromolaires. A titre d'exemple, l'onchidal, un inhibiteur d'AChE, présente une affinité apparente de 300 μM (Abramson et al., Mol. Pharmacol., 1989, 36, 349).

3. une sélection statistique des composés, en estimant la probabilité qu'un score identique ou supérieur pour un composé soit obtenu au hasard. En général, le composé est accepté lorsque la probabilité estimée est < 0,05. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre du gène ace-1 et de ses produits (ADNc, protéine) selon la présente invention ainsi qu'au tableau résumant les séquences de la Demande et aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 illustre l'alignement des séquences en acides aminés des protéines AChEl d'Anophèles gambiae, Schizaphis graminum, An. stephensi, Aedes aegypti, Drosophila melanogaster, Lucilia cuprina, Musca domestica et Culex pipiens. Par convention, les acides aminés sont numérotés en référence à la séquence de l'AChE du poisson torpille (Torpédo califomica; SWISSPROT P04058). Les séquences N- et C- terminales ne sont pas représentées en raison de leur variabilité. Les acides aminés conservés entre AChEl et AChE2 sont indiqués en gris. Les acides aminés spécifiques d'AChE2 sont indiqués en noir. Les 3 résidus représentant la triade catalytique (S₂₀₀, E₃₂ et H₄₄₀) sont encadrés. Le site de liaison à la choline (W₈₄) est souligné. Les cercles représentent la position des 14 résidus aromatiques bordant la gorge du site actif dans l'AChE de Torpédo, dont 10 sont présents dans toutes les AChEl et AChE2 (cercles pleins), les autres n'étant pas conservés (cercles vides). Trois liaisons disulfures intramoléculaires entre des résidus cystéines sont indiquées. La flèche horizontale indique la position du fragment K (amplifié à l'aide des amorces PdirAGSG et PrevAGSG). La région hypervariable d'ACbE2 qui est absente dans AChEl est entourée.

- la figure 2 illustre la détection génétique des moustiques résistants aux organophosphorés et/ou aux carbamates par PCR-RFLP : . la figure 2 A représente la comparaison de la séquence en acides aminés du fragment K de différentes espèces de moustiques: Cx Pip (Culex pipiens), Ae alb (Âedes albopictus), Ae aeg (Aedes aegypti), An alb (Anophèles albimanus), An gamb (Anophèles gambiae), An fun (Anophèles funestus), An nil (Anophèles nili), An sac (Anophèles sacharovi), An pse (Anophèles pseudopunctipennis). Les acides aminés variants sont grisés. Les séquences suivantes sont identiques: An. darlingi et An. albimanus; An. sundaicus, An. gambiae et An. arbiensis ; An. moucheti, An. funestus et An. minimus; An. stephensi et An. saccharovi.

. la figure 2B illustre la comparaison des séquences nucléotidiques conespondant au fragment K des souches sensibles (S-LAB) et résistantes (SR). Les nucléotides variants sont grisés (t — » c en position 3 ; a — » g en position 84 : le site.EcoRI (gaattc) situé autour de cette position, utilisé pour l'analyse PCR-RFLP, est présent uniquement dans la souche S-LAB ; c → t en position 173). La figure 2C illustre les profils de restriction obtenus après électrophorèse en gel d'agarose des produits de digestion par EcoRI, du fragment K amplifié par PCR. La souche homozygote sensible S-LAB présente un profil caractérisé par 2 bandes (214 pb et 106 pb), la souche homozygote résistante présente un profil caractérisé par une seul bande de 320 pb et les moustiques résistants issus du croisement en retour présentent un profil hétérozygote caractérisé par 3 bandes (320 pb, 214 pb et 106 pb). - la figure 3 illustre l'arbre phylogénétique des protéines AChE.

L'analyse phylogénétique a été réalisée à partir de 47 séquences de protéines AChE de 35 espèces différentes provenant de la base de données ESTHER (frttp://www.ensam.inra.fr/cgi-bin/ace/index . Les séquences ont été alignées et un arbre a été construit comme décrit à l'exemple 1. Seuls les nœuds conespondant à des valeurs de "bootstrap" > 50% (c'est à dire des scores supérieurs à 500) sont indiqués. L'échelle représente une divergence de 10 %. Agam: An. gambiae ; Aeg: Aedes aegypti ; Aste: Anophèles stephensi; Cp: Culex pipiens; Dmel: Drosophila melanogaster. Lcup: Lucilia cuprina: Mdom: Musca domestica: Ldec: Leptinotarsa decemli- neata; Amel: Apis mellifera: Ncin: Nephotettix cincticeps ; Sgra: Schizaphis grami- num ; Rapp: Rhipicephalus appendiculatus ; Bmic: Boophilus microplus; Bdec: Boophilus decoloratus; Hsap: Homo sapiens ; Btau: Bos taurus ; Fcat: Félix catus ; Ocun: Oryctolagus cuniculus ; Rnor : Rattus norvegicus ; Mmus: Mus musculus ; Ggal: Gallus gallus ; Drer: Danio reno ; Eele: Electrophorus electricus ; Tamr.- Torpédo marmorata ; Tcal: Torpédo califomica ; Bfas: Bungarus fasciatus ; Mglu: Myxine glutinosa ; Bflo: Branchiostoma floridae ; Blan: Branchiostoma lanceolatum ; Cint: Ciona intestinalis ; Csav: Ciona savignyi ; Celé: Caenorhabditis elegans ; Cbrig: Caenorhabditis briggsae ; Dviv: Dictyocaulus viviparus; Lopa: Loligo opalescens.

- la figure 4 illustre le cladogramme des protéines AChEl et AChE2. Les séquences des protéines AChEl et AChE2 ont été traitées comme à la figure 1. La séquence Bmic a été ajoutée comme séquence externe pour définir l'origine de l'arbre. Les cadres marqués d'une astérisque représentent les protéines codées par un gène qui ségrège avec la résistance aux insecticides. Les cadres vides représentent les protéines codées par un gène qui ne ségrègue pas avec la résistance aux insecticides. L'échelle conespond à une divergence de 10 %.

- la figure 5 illustre la comparaison des séquences en acides aminés de la protéine AChEl de C. pipiens, enfre une souche sensible (S-LAB) et une souche résistante (SR) aux insecticides. L'unique mutation glycine ₂₄₇(//9) — > serine ₂₄ (y/P₎ (indiquée en grisée) est responsable de la résistance aux insecticides chez les moustiques de l'espèce C. pipiens ; elle conespond à la substitution de la glycine située en position 247 de la séquence de l'AChEl de C. pipiens (ou en position 119, en référence à la séquence de l'AChE du poisson torpille), par une serine. - les figures 6A et 6B illustrent la comparaison des séquences nucléotidiques codant pour la protéine AChEl de C. pipiens, entre une souche sensible (S-LAB) et une souche résistante (SR) aux insecticides ; toutes les mutations sont silencieuses à l'exception de la mutation en position 739 (G -» A) qui entraîne, d'une part la substitution du codon glycine (GGC) en position 247 de la séquence de la protéine AchEl de la souche sensible (S-LAB) par un codon serine (AGC) responsable de la résistance aux insecticides dans la souche SR, et d'autre part, l'apparition d'un site Alu I (AGCT) dans la séquence de la souche résistante, utile pour la détection de la mutation. La mutation (G - A) en position 739 de la séquence nucléotidique et la mutation glycine — > serine en position 247 de la séquence en acides aminés sont indiquées en grisé. Les séquences des amorces utilisées pour détecter la mutation en position 739 (amorce Ex3dir et Ex3rev), ainsi que le site Alu I sont indiqués en gras et soulignés. - la figure 7 (A, B et C) illustre la structure tridimensionnelle de l'AchEl de C. pipiens, obtenue par modélisation moléculaire à partir de la structure de l'AchE du poisson torpille :

La figure 7A illustre (i) la structure globale des deux protéines et (ii) et l'encombrement stérique des liaisons de Van der Waals de la serine 200 et de l'histidine 440 du site catalytique de l'enzyme, ainsi que celui de l'acide aminé en position 119 qui est muté dans les cas de résistance ; le résidu en position 119 est proche des résidu S₂₀o et H₄₄₀ du site catalytique.

Les figures 7B et 7C illustrent la comparaison de l'encombrement stérique des liaisons de Van der Waals des acides aminés glycine (figure 7C) et serine (figure 7B) en position 119, de respectivement la souche sensible et résistante. L'encombrement de la chaîne latérale de la Serine en position 119 dans la souche résistante, réduit l'espace du site catalytique ce qui empêche vraisemblablement l'insecticide d'interagir avec la serine catalytique (S₂₀₀). - la figure 8 illustre la détection par PCR-RFLP de la mutation glycine —> serine dans le froisième exon codant du gène ace-1, chez des moustiques de l'espèce C. pipiens : 1 bande (520 pb) est détectée chez les individus homozygotes sensibles S S, 2 bandes (357 pb et 163 pb) sont détectées chez les individus homozygotes résistants RR et 3 bandes (520 pb, 357 pb et 163 pb) sont détectées chez les individus hétérozygotes résistants RS.

- les figures 9A et 9B illustrent la comparaison des séquences du gène ace-1 d'An, gambiae, enfre une souche sensible (KISUMU) et une souche résistante (YAO) aux insecticides ; toutes les mutations sont silencieuses à l'exception de deux mutations : la première conespond au remplacement de la valine (CGT) en posi- tion 33 de la séquence de l'AChEl de la souche sensible (SEQ ED NO: 5) par une alanine (CGC) dans la souche résistante et la seconde est la même mutation glycine (GGC)— » serine (AGC) que celle trouvée chez Culex pipiens. La mutation glycine (GGC)→ serine (AGC) entraîne l'apparition d'un second site Alu I (AGCT) dans la séquence du troisième exon codant de la souche résistante, utile pour la détection de la mutation. Les séquences codantes du gène ace-1 sont indiquées en gras et les mutations sont indiquées en grisé. Les séquences des amorces Ex3AGdir et Ex3Agrev utilisées pour détecter la mutation glycine (GGC)-→- serine (AGC), ainsi que les sites Alu I du froisième exon codant sont indiqués en gras et soulignés.

- la figure 10 illustre la quantification de l'activité acetylcholinesterase des protéines recombinantes AChEl de Culex pipiens, sensibles (S-LAB, banes blanches) et résistantes (SR, banes grisées), produites en cellules d'insecte S2, par comparaison avec celle de broyats de C. pipiens de souche S-LAB (banes blanches hachurées) et de souche SR (banes grisées hachurées). L'activité acetylcholinesterase des extraits cellulaires et des broyats de moustiques a été mesurée en l'absence (C) et en présence de ÎO^M et 10^"2M de propoxur. L'unique mutation glycine_247(7/9j- >sérine_{24 (7/9j} rend l'acétylcholinestérase insensible à l'insecticide.

- la figure 11 illustre la détection par PCR-RFLP de la mutation glycine — » serine dans le troisième exon codant du gène ace-1, chez des moustiques de l'espèce Culex pipiens, Anophèles gambiae et Anophèles albimanus : 1 bande (194 pb) est détectée chez les individus homozygotes sensibles S S, 2 bandes (74 pb et 120 pb) sont détectées chez les individus homozygotes résistants RR et 3 bandes (194 pb, 74 pb et 120 pb) sont détectées chez les individus hétérozygotes résistants SS.

- la figure 12 illustre la quantification de l'activité acetylcholinesterase des protéines AChEl de respectivement Culex pipiens, Anophèles gambiae et Anophèles albimanus sensibles (SS, banes grisées) et résistantes (RS, bandes noires et RR, bandes blanches).

- la figure 13 représente l'alignement des séquences nucléotidiques du fragment de 194 pb d Anophèles gambiae, de Culex pipiens et d'Anophèles albimanus, sensibles (S) ou résistants (R). Fond grisé clair : séquences conespondant aux amorces Moustdirl et Moustrevl. Fond grisé : site Alu I. Fond grisé foncé : Guanine du codon Gly des individus sensibles.

- la figure 14 représente les séquences nucléotidiques du fragment de 194 pb d'Anophèles albimanus sensible (S) et résistant (R). Le codon spécifiant Gly (GGC) et Ser (AGC) est en gras. Le site Alu I est souligné. Tableau II; Liste des séquences

Numéro Séquence d'identification

SEQ ID NO: 1 fragment de la région centrale de la protéine AChEl Anophèles gambiae (positions 70 à 593 de la SEQ ID NO: 3).

SEQ ID NO:2 ADNc AChEl Anophèles gambiae

SEQ ID NO: 3 Protéine AChEl Anophèles gambiae

SEQ ID NO: 4 ADNc AChEl Anophèles gambiae (souche KISUMU)

SEQ ID NO: 5 Protéine AChEl Anophèles gambiae (souche KISUMU)

SEQ ID NO: 6 ADNc AChEl Culex pipiens souche S-LAB (séquence complète)

SEQ ID NO: 7 Protéine AChEl Culex pipiens souche S-LAB (séquence complète)

SEQ ID NO: 8 fragment peptidique K AChEl Culex pipiens

SEQ ID NO: 9 fragment peptidique K AChEl Aedes aegypti

SEQ ID NO: 10 fragment peptidique K AChEl Aedes albopictus

SEQ ID NO: 11 fragment peptidique K peptidique AChEl Anophèles darlingi

SEQ ID NO: 12 fragment peptidique K AChEl An. sundaicus

SEQ ID NO: 13 fragment peptidique K AChEl An. minimus

SEQ ID NO: 14 fragment peptidique K AChEl An. moucheti

SEQ ID NO: 15 fragment peptidique K AChEl An. arabiensis

SEQ ID NO: 16 fragment peptidique K AChEl An. funestus

SEQ ID NO: 17 fragment peptidique K AChEl An. pseudopunctipennis

SEQ ID NO: 18 fragment peptidique K AChEl An. sacharovi

SEQ ID NO: 19 fragment peptidique K AChEl An. stephensi

SEQ ID NO: 20 fragment peptidique K AChEl An. albimanus

SEQ ID NO: 21 fragment peptidique K AChEl An. nili

SEQ ID NO: 22 gène ace-1 An. gambiae

SEQ ID NO: 23 gène ace-1 An. gambiae KISUMU

SEQ ID NO: 24 fragment nucleotidique K AChEl C. pipiens (souche S-LAB)

SEQ ID NO: 25 fragment nucleotidique K AChEl C. pipiens (souche SR)

SEQ ID NO: 26 fragment nucleotidique K AChEl Aedes aegypti

SEQ ID NO: 27 fragment nucleotidique K AChEl Aedes albopictus (AJ 438598)

SEQ ID NO: 28 fragment nucleotidique K AChEl Anophèles darlingi (AJ 438599)

SEQ ID NO: 29 fragment nucleotidique K AChEl An. sundaicus (AJ 438600)

SEQ ID NO: 30 fragment nucleotidique K AChEl An. minimus (AJ 438601)

SEQ ID NO: 31 fragment nucleotidique K AChEl An. moucheti (AJ 438602)

SEQ ID NO: 32 fragment nucleotidique K AChEl An. arabiensis (AJ 438603)

SEQ ID NO: 33 fragment nucleotidique K AChEl An. funestus (AJ 438604)

SEQ ID NO: 34 fragment nucleotidique K AChEl An. pseudopunctipennis (AJ 538605)

SEQ ID NO: 35 fragment nucleotidique K AChEl An. sacharovi (M 538606)

SEQ ID NO: 36 fragment nucleotidique K AChEl An. stephensi (AJ 538607)

SEQ ID NO: 37 fragment nucleotidique K AChEl An. albimanus (AJ 538608)

SEQ ID NO: 38 fragment nucleotidique K AChEl An. π///(AJ 538609)

SEQ ID NO: 39 amorce PkdirAGSG

SEQ ID NO: 40 amorce PkrevAGSG

SEQ ID NO: 41 amorce PbdirAGSG

SEQ ID NO: 42 amorce PbrevAGSG

SEQ ID NO: 43 amorce culex-bdirl SEQ ID NO: 44 amorce culex-krevl

SEQ ID NO: 45 amorce AG1-Adir

SEQ ID NO: 46 amorce AG1-Arev

SEQ ID NO: 47 amorce AG1-Bdir

SEQ ID NO: 48 amorce AG1-Brev

SEQ ID NO: 49 amorce AG1-Cdir

SEQ ID NO: 50 amorce AG1-Crev

SEQ ID NO: 51 Protéine AChEl Ciona intestinalis

SEQ ID NO: 52 Protéine AChEl Ciona savignyi

SEQ ID NO: 53 Protéine AChE2 Anophèles gambiae

SEQ ID NO: 54 Amorce culex-5'dir

SEQ ID NO :55 Amorce culex-3'dir

SEQ ID NO: 56 ADNc AChEl C. pipiens souche SR (séquence codante complète)

SEQ ID NO: 57 Protéine AChEl C. pipiens souche SR (séquence complète)

SEQ ID NO: 58 Amorce Ex3dir

SEQ ID NO: 59 Amorce Ex3rev

SEQ ID NO: 60 Fragment nucleotidique du troisième exon codant souche Espro -P*-R****

SEQ ID NO: 61 Fragment nucleotidique du troisième exon codant souche Pro-R-Q**-S

SEQ ID NO: 62 Fragment nucleotidique du troisième exon codant souche S-LAB-Q-S*****

SEQ ID NO: 63 Fragment nucleotidique du troisième exon codant souche Padova-P-R

SEQ ID NO: 64 Fragment nucleotidique du troisième exon codant souche Praias-P-R

SEQ ID NO: 65 Fragment nucleotidique du troisième exon codant souche Supercar-Q-R

SEQ ID NO: 66 Fragment nucleotidique du troisième exon codant souche BrugesA-P-S

SEQ ID NO: 67 Fragment nucleotidique du troisième exon codant souche BQ-Q-R

SEQ ID NO: 68 Fragment nucleotidique du troisième exon codant souche DJI-Q-R

SEQ ID NO: 69 Fragment nucleotidique du troisième exon codant souche Harare-Q-R

SEQ ID NO: 70 Fragment nucleotidique du troisième exon codant souche Martinique-Q-R

SEQ ID NO: 71 Fragment nucleotidique du troisième exon codant souche Barriol-P-R

SEQ ID NO: 72 Fragment nucleotidique du troisième exon codant souche Bleuet-P-S

SEQ ID NO: 73 Fragment nucleotidique du troisième exon codant souche BrugesB-P-S

SEQ ID NO: 74 Fragment nucleotidique du troisième exon codant souche Heteren-P-S

SEQ ID NO: 75 Fragment nucleotidique du troisième exon codant souche Ling-Q-S

SEQ ID NO: 76 Fragment nucleotidique du troisième exon codant souche Mao-Q-S

SEQ ID NO: 77 Fragment nucleotidique du troisième exon codant souche TemR-Q-S

SEQ ID NO: 78 Fragment nucleotidique du troisième exon codant souche Uppsala-T***-S

SEQ ID NO: 79 Fragment nucleotidique du troisième exon codant souche Trans-Q-S

SEQ ID NO: 80 Fragment nucleotidique troisième exon codant souche BEQ-Q-S

SEQ ID NO: 81 Fragment nucleotidique troisième exon codant souche BSQ-Q-S

SEQ ID NO: 82 Fragment nucleotidique troisième exon codant souche Brazza-Q-S

SEQ ID NO: 83 Fragment nucleotidique du troisième exon codant souche Bouaké-Q-R

SEQ ID NO: 84 Fragment nucleotidique du troisième exon codant souche Thai-Q-S

SEQ ID NO: 85 Fragment nucleotidique du troisième exon codant souche Madurai-Q-S

SEQ ID NO: 86 Fragment nucleotidique du troisième exon codant souche Recife-Q-R

SEQ ID NO: 87 Fragment nucleotidique du troisième exon codant souche Brésil Q-S SEQ ID NO: 88 Fragment nucleotidique du troisième exon codant souche Moorea Q-S SEQ ID NO: 89 Fragment nucleotidique du troisième exon codant souche Killcare P-S

SEQ ID NO 90 (D SEQ ID NO 91 (D SEQ ID NO 92 (D SEQ ID NO 93 (D

** Q = Culex pipiens quinquefαsciαtus (sous espèce quinquefasciatus)

*** T = Culex torrentium

**** R = résistant

***** S = sensible

(1) fragments peptidiques du troisième exon codant conespondants aux fragments nucléotidiques SEQ ED NO:60 à 89

Les séquences nucléotidiques (SEQ ED NO:27 à 38) et les séquences peptidiques conespondantes (SEQ ED NO: 10 à 21) ont été soumises le 8 mars 2002 à différentes banques de séquences, mais n'ont été rendues accessibles que le 30 novembre 2002 dans la base de séquences EMBL et le 11 janvier 2003 dans la base de séquences GENBANK.

EXEMPLE 1 : Matériels et méthodes a) Souches et croisements Cinq souches de C. pipiens ont été utilisées: S-LAB, une souche standard sensible aux insecticides (Georghiou et al., 1966, Bull. Wld. Hlth Org., 35, 691-708), SA1, SA4 et EDIT qui possèdent une seule AChE sensible aux insecticides, et SR qui est homozygote pour une AChE insensible aux insecticides (Berticat et al., Genêt. Res., 2002, 79, 41-47). Les souches possédant une AChE sensible et insensible sont dénommées respectivement S et R. b) Nomenclature des gènes ace et numérotation des séquences d'acides aminés ace-1 représente le locus codant pour une AChE cholinergique responsable de la résistance aux organophosphorés et/ou aux carbamates chez C. pipiens (AChEl), précédemment dénommé Ace.l (Raymond et al., Genetica, 2001, 112/113, 287-296). ace-2 représente le second locus ace, qui n'est pas impliqué dans la résistance aux insecticides chez C. pipiens (précédemment dénommé Ace.2), dont la fonction est inconnue chez C. pipiens. L'unique gène ace présent dans Drosophila melanogaster, qui est homologue à ace-2, est donc dénommé de même.

Dans les analyses qui suivent, les positions des résidus d'acides aminés sont indiquées en référence à la séquence de l'AChE du poisson torpille [Torpédo califomica; GENBANK P04058], selon la nomenclature recommandée par Massoulié et al., 1992, In Multidisciplinary approaches to cholinesterase functions, eds, Schafferman, A. & Velan, B. (Plénum Press New York), p 285-288]. c) Analyse de la transmission du gène ace-1 Les femelles étant indiquées en premier, des croisements FI (S X R) et des croisements en retour (FI X S-LAB et S-LAB X FI) ont été obtenus par croisement en masse d'adultes. Quelques larves issues des croisements en retour ont été traitées avec une dose de carbamate (propoxur, 4mg/L) qui tue 100 % des larves sensibles. La liaison enfre ace-1 et la résistance au propoxur a été étudiée par RFLP chez les larves survivantes, à partir d'un produit PCR de 320 pb permettant d'identifier les allèles S et R. Les expériences ont été réalisées de façon indépendante, avec S = SA S = SA4 et S = EDIT. d) Analyse des séquences et assemblage des gènes

Toutes les analyses de séquences ont été effectuées à partir des séquences brutes d'Anophèles gambiae disponibles sur le serveur INFOBIOGEN (http://www.infobiogen.fr) et des outils disponibles sur le site (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast). Les séquences génomiques codant une AChE ont été identifiées à l'aide des logiciels TBLASTN et BLAST (Altschul et al., J. Biol. Mol., 1990, 215, 403-410). Les séquences génomiques identifiées ont été assemblées à l'aide du logiciel ABI Prism Auto- Assembler (v2.1, PERKLN ELMER). Les séquences ont été vérifiées et corrigées à l'aide du logiciel Ensembl Trace Server (http: // trace.ensembl.org/). Deux concaténations de respectivement 5195 et 6975 paires de bases, codant respectivement pour AChEl et AChE2 ont été assemblées à partir de respectivement 64 et 74 séquences indépendantes (redondance moyenne de 10,5 et 6,5). Les exons et les séquences protéiques ont été identifiés à l'aide d'une combinaison entre les logiciels FGENESH (http ://www. sanger.uk) et BLASTX (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Les séquences génomiques d'AChE d'ascidies ont été assemblées à partir de séquences brutes déposées dans les bases de données du NCBI (Ciona savignyi) et du Doe Joint Institute (Ciona intestinalis, http://www.igi.doe.gov/programs/ciona/ciona mainage.html . Les recherches dans les bases de données de Drosophila ont été effectuées à l'aide de Flybase (http://www.fruitfly.org/). e) Comparaisons de séquences

Les séquences des protéines AChEl et AChE2 d'Anophèles gambiae déduites des séquences génomiques et les séquences peptidiques déduites de fragments PCR de C. pipiens et A. aegypti ont été alignées avec celles des AChE connues, à l'aide du logiciel ClustalW, en utilisant une matrice BLOSUM et des paramètres par défaut (Thompson et al., N.A.R., 1994, 22, 4673-4680).

Un arbre phylogénétique a été construit en utilisant l'algorithme du plus proche voisin (neighbour-joining algorithm) de la version DDBJ de Clustal W (http://hypernig.nig.ac.ip/homology/ex_clustalw-e.shtml). L'analyse de type Bootstrap (1000 comptages et 111 valeurs d'entrée) a été utilisée pour évaluer les degrés de confiance pour la topologie de l'arbre. La construction des arbres a été réalisée à l'aide du logiciel Treeview (vl.6.6). f) Numéros d'accession

Les numéros des séquences (numéros d'accession dans les bases de données ou les numéros d'identification dans la liste de séquences) ayant servi à l'analyse génétique sont les suivants. - Craniata : Homo sapiens : NP_00046 ; Bos taurus : P23795 ; Félix catus : 06763 ; Oryctolagus cuniculus : Q29499 ; Rattus norvegicus : P36136 ; Mus musculus : P21836 ; Gallus gallus : CAC37792 ; Danio reno : Q9DDE3 ; Electropho- rus electricus : 6730113 ; Torpédo marmorata : P07692 ; Torpédo califomica : P04058 ; Bungarus fasciatus : Q92035 ; Myxine glutinosa : Q92081. - Cephalocordés : Branchiostoma βoridae : 076998 et 076999 ;

Branchiostoma lanceolatum : Q95000 et Q95001.

- Urocordés : Ciona intestinalis : SEQ ID NO : 51 ; Ciona savignyi : SEQ ID NO : 52.

- Nématodes : Caenorhabditis elegans (1 à 4) : P38433, 061371, 061459 et 061372 ; Caenorhabditis briggsae (1 à 4) Q27459, O61378Q9NDG9 et

Q9NDG8 ; Dictyocaulus viviparus : Q9GPLO.

- Insectes : Anophèles gambiae (1 et 2) : SEQ ED NO:3 et SEQ ED NO: 53 (BM 629847 et BM 627478); Aedes aegypti (1 et 2) : SEQ ID NO: 9 et AAB3500 ; An. stephensi :P56161 ; Culex pipiens : SEQ BD NO: 7 (ace-1) et Esther data base pour ace-2 ; Drosophila melanogaster :P07140 ; Lucilia cuprina : P91954 ; Musca domestica : AAK69132.1 ; Leptinotarsa decemlineata : Q21611 ; Apis mellifera : AAG43568 ; Nephotettix cincticeps : AF145235_1 ; Schizaphis graminum : Q9BMJ1.

- Arachnides : Rhipicephalus appendiculatus : 062563 ; Boophilus microplus (1 et 2) : 045210 et 061864 ; Boophilus decoloratus : 061987 ;

- Mollusques : Loligo opalescens : 097110. g) Clonage du fragment K et génotvpage d' ace-1 chez Culex pipiens

L'ADN de moustique a été extrait comme décrit dans Rogers et al.,

[Plant Molecular Biology manual, 1988, eds. Gelvin, S.B.l Schilperoot, R.A. (Kluwer Académie Publishers, Boston), VolAό, pl-10]. Les oligonucleotides PkdirAGSG ( 5'-

ATMGWGTTYGAGTACACSGAYTGG-3', SEQ BD NO: 39) et PkrevAGSG (5'-

GGCAAARTTKGWCCAGTATCKCAT-3', SEQ ED NO: 40) amplifient un fragment de 320 pb (fragment K) à partir de l'ADN génomique de plusieurs moustiques. 30 cycles d'amplification PCR ont été réalisés dans les conditions suivantes : 94°C pendant 30s, 50°C pendant 30s à et 72°C pendant 30s. Les séquences ont été déterminées directement sur les produits PCR sur un séquenceur ABI prism 310, à l'aide du kit Big Dye Terminator.

Le génotypage d'ace-1 chez Culex est réalisé dans les conditions suivantes : Les fragments K obtenus comme décrit précédemment sont digérés par EcoRI et le produit de digestion est séparé par électrophorèse sur un gel d'agarose à 2%. Les profils de restriction montrent : 1 bande (320 pb) chez les moustiques homo- zygotes résistants RR, 2 bandes (106 pb et 214 pb) chez les moustiques homozygotes SS et 3 bandes (103 pb, 214 pb et 320 pb) chez les moustiques hétérozygotes RS. h) Clonage de l'ADNc d' ace-1 chez les individus sensibles et résistants

L'ADNc du gène ace-1 de Culex pipiens a été obtenu à partir de l'ARN extrait d'individus de la souche sensible de référence S-LAB et de la souche résistante SR, au tout premier stade de développement larvaire Ll. La transcription inverse a été réalisée avec un oligonucléotide 18T et la SuperScriptlERNaseH (EN VITROGEN), selon les conditions recommandées par le fabricant.

- souche S -LAB

Deux fragments d'ADNc ont été amplifiés par PCR à l'aide d'oligo- nucléotides dégénérés obtenus à partir de l'alignement des séquences des gènes ace-1 d Anophèles gambiae et de Schizaphis graminum :

- un fragment b (193pb) a été amplifié à l'aide du couple d'amorces PbdirAGSG (5'GGYGCKACMATGTGGAAYCC3\ SEQ BD NO: 41) et PbrevAGSG (5ΑCCAMRATCACGTTYTCYTCCGAC3', SEQ ED NO: 42). - un fragment k (320pb) a été amplifié à l'aide du couple d'amorces PkdirAGSG (5ΑTMGWGTTYGAGTACACSGAYTGG3', SEQ ED NO: 39) et PkrevAGSG (5'GGCAAARTTKGWCCAGTATCKCAT3\ SEQ ID NO: 40).

Les fragments b et k ainsi obtenus ont ensuite été clones et séquences, selon les techniques classiques connues en elles-mêmes de l'Homme du métier, telles que décrites dans Cunent Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library ofCongress, USA). Un fragment d'ADNc de plus grande taille a été amplifié par PCR, à l'aide d'amorces spécifiques de Culex pipiens déduites des séquences des fragments b et k précédemment obtenues. A savoir :

- un fragment Culex A (1127 pb) a été amplifié par PCR à l'aide du couple d'amorces amorces: culex-bdirl (5'TACATCAACGTGGTCGTGCCACG3', SEQ ID NO: 43) et culex-krevl (5'GTCACGGTTGCTGTTCGGG3', SEQ ID NO: 44). Le fragment Culex A de 1127 pb ainsi obtenu a ensuite été clone et séquence, comme ci-dessus.

Les extrémités des ADNc ont été amplifiées par la technique RACE (Rapid Amplification ofcDNA Ends), à l'aide d'un kit commercial (du kit Gène Racer (IN VITROGEN) selon les conditions indiquées dans le manuel d'utilisation. Ensuite elles ont été clonées puis séquencées, comme ci-dessus, - souche SR

La séquence complète de l'ADNc du gène ace-1 de la souche résistante SR a été amplifiée par PCR à l'aide des amorces culex-5'dir (5 - CCACACGCCAGAAGAAAAGA-3', SEQ ID NO: 54) et culex-3'dir (5'- AAAAACGGGAACGGGAAAG-3, SEQ ID NO: 55) et le fragment de 2497 pb ainsi obtenu a été clone et séquence, comme ci-dessus, i) Clonage du gène ace-1 chez les individus sensibles et résistants

L'ADN génomique de la souche KISUMU (souche sensible de réfé- rence de l'Afrique de l'Ouest) et de la souche YAO (souche résistante isolée en Côte d'ivoire) d'Agambiae a été extrait à partir d'individus homozygotes comme décrit dans

Rogers et al., [Plant Molecular Biology manual, 1988, eds. Gelvin, S.B.1 Schilperoot,

R.A. (Kluwer Académie Publishers, Boston), VolAό, pl-10],

3 fragments chevauchants (A, B et C) ont été amplifiés dans les conditions suivantes : 94°C pendant 30s, 50°C pendant 30s à et 72°C pendant 30s (30 cycles), à l'aide d'amorces synthétisées à partir de la séquence du gène ace-1. A savoir :

- le fragment A (1130pb) a été amplifié à l'aide du couple d'amorces AGl-Adir (5'CGACGCCACCTTCACA3\ SEQ ED NO: 45) et AGl-Arev (5'GATGGCCCGCTGGAACAGAT3', SEQ ED NO: 46), - le fragment B (1167pb) a été amplifié à l'aide du couple d'amorces AGl-Bdir (5'GGGTGCGGGACAACATTCAC3', SEQ BD NO: 47) et AGl-Brev (5'CCCCGACCGACGAAGGA3\ SEQ ED NO: 48), et

- le fragment C (876pb) a été amplifié à l'aide du couple d'amorces AGl-Cdir (5ΑGATGGTGGGCGACTATCAC3', SEQ ED NO: 49) et AGl-Crev

(5'CTCGTCCGCCACCACTTGTT3', SEQ DD NO: 50).

Les séquences des fragments A, B et C ont été déterminées directement sur les produits PCR, à l'aide d'oligonucléotides internes, inclus dans ces fragments, en utilisant le kit Big Dye Terminator et un séquenceur ABI prism 310. j) détection de la mutation du troisième exon codant responsable de la résistance aux insecticides chez les moustiques des espèces C. pipiens et An. gambiae

L'ADN de moustique a été extrait comme décrit dans Rogers et al., précité, puis un fragment du froisième exon codant a été amplifié par PCR, séquence et la mutation dans la séquence codante du troisième exon codant a été détectée par PCR-RFLP, selon le principe tel que décrit ci-dessus pour le fragment K.

- Q, ipiens

Un fragment de 520 pb du troisième exon codant a été amplifié à partir de l'ADN génomique de plusieurs moustiques, par PCR à l'aide du couple d'amorces : - Ex3dir 5*-CGACTCGGACCCACTGGT-3 ' (SEQ ED NO: 58) et

- Ex3rev 5'-GTTCTGATCAAACAGCCCCGC-3' (SEQ ID NO: 59).

Le fragment ainsi obtenu a été digéré par Alu I et le produit de digestion séparé par électrophorèse sur un gel d'agarose à 2%. Les profils de restriction attendus sont les suivants : 1 fragment (520 pb) chez les individus homozygotes sensibles SS, 2 fragments (357 pb et 163 pb) chez les individus homozygotes résistants RR et 3 fragments (520 pb, 357 pb et 163 pb) chez les individus hétérozygotes résistants RS.

- An._gafnbia.e_

Un fragment de 541 pb du troisième exon codant a été amplifié à partir de l'ADN génomique de plusieurs individus, par PCR à l'aide du couple d'amorces :

- Ex3 AGdir 5'- GATCGTGGACACCGTGTTCG -3 ' (SEQ DD NO: 123) et - Ex3AGrev 5'- AGGATGGCCCGCTGGAACAG -3' (SEQ ID NO: 124).

Le fragment ainsi obtenu a été digéré par Alu I et le produit de séparé par elecfrophorese sur un gel d'agarose à 2%. Les profils de restriction attendus sont les suivants : 2 fragments (403 pb et 138 pb) chez les individus homozygotes sensibles SS, 3 fragments (253 pb, 150 pb et 138 pb) chez les individus homozygotes résistants RR et 4 fragments (403 pb, 253 pb, 150 pb et 138 pb) chez les individus hétérozygotes résistants RS ; étant donné que les fragments de 150 pb et 138 pb co- migrent, les individus homozygotes et hétérozygotes résistants sont détectés respectivement par la présence de 2 bandes (253 pb et environ 150 pb) et de 3 bandes (403 pb, 253 pb et environ 150 pb) en gel d'agarose.

- C βipienSj An. ga^

Un fragment de 174 pb du troisième exon codant a été amplifié à partir de l'ADN génomique de plusieurs moustiques, par PCR à l'aide du couple d'amorces : - Moustdirl : 5' CCGGGNGCSACYATGTGGAA 3' (SEQ ED

NO : 128), et

- Moustrevl : 5' ACGATMACGTTCTCYTCCGA 3' (SEQ ED NO: 129).

Le fragment ainsi obtenu a été digéré par Alu I et le produit de digestion séparé par elecfrophorese sur un gel d'agarose à 2 %. Les profils de restriction attendus sont les suivants : 1 fragment (194 pb) chez les individus homozygotes sensibles SS, 2 fragments (74 pb et 120 pb) chez les individus homozygotes résistants RR et 3 fragments (194 pb, 74 pb et 120 pb) chez les individus hétérozygotes résistants RS. Les résultats sont illustrés à la figure 11.

La figure 12 montre que l'on obtient avec des moustiques An. albimanus résistants par test biochimique classique, les mêmes caractéristiques d'inhibition par le propoxur que pour les moustiques An. gambiae et C. pipiens.

L'application du test diagnostique, également dénommé "G119S", à l'aide de l'amplimère Moustdirl et Moustrevl révèle la présence d'un site AluI associé à la résistance (Figure 11). Le séquençage des fragments amplifiés d'An, albimanus confirme la substitution du codon Gly GGC chez les individus SS en codon Ser AGC chez les individus RR (figures 13 et 14). k) Mesure de l'activité acetylcholinesterase

Les ADNc codant les AchEl de respectivement la souche S-LAB et la souche SR ont été clonées dans le vecteur d'expression eucaryote pAc5.1/V5-His (ENVITROGEN), selon les techniques classiques d'ADN recombinant en suivant les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology, précité. Des cellules de drosophile (cellules de Schneider S2) ont été trans- fectées par les vecteurs recombinants ainsi obtenus, à l'aide du réactif Fugen® (ROCHE), en suivant les instructions du fabricant. 24 heures après la transfection, les cellules ont été récoltées par centrifugation puis lysées dans du tampon phosphate 0.25M contenant 1% Triton X-100. L'activité acetylcholinesterase des extraits cellulaires obtenus a été mesurée, en présence ou en l'absence d'insecticide (propoxur), par la méthode telle que décrite dans Bourguet et al., Biochemical Genetics, 1996, 34, 351-362.

EXEMPLE 2 : Mise en évidence de 2 gènes ace chez Anophèles gambiae

Des gènes homologues des gènes d'acétylcholinestérases humaines et de drosophiles ont été recherchés à partir de fragments de séquences déposées dans les bases de données, en utilisant le logiciel TBLASTN. Deux groupes de fragments distincts codant pour une AChE très similaire à celle de la drosophile ont été identifiés. Deux gènes de respectivement 6975 pb (ace-1) et 5195 pb (ace-2) ont été reconstruits à partir de fragments chevauchants de chaque groupe. L'analyse des gènes à l'aide des logiciels FGENESH et BLASTX montre que les gènes ace-1 et ace-2 sont constitués respectivement d'au moins 7 et 8 exons codant pour des protéines d'environ 534 et 569 acides aminés, dénommées respectivement AChEl et AChE2. Toutefois, cette analyse n'a pas permis de déterminer avec certitude la séquence des extrémités 5' et 3' de l'ADNc et les séquences NH2 et COOH des protéines conespondantes, qui ne sont pas conservées entre les différentes AChE.

L'analyse des séquences en acides aminés confirme que les protéines AChEl et d'AChE2 sont très homologues à l'AChE de Drosophila (BLASTP : P < e^{" l8}°) et contiennent un motif canonique FGESAG autour de la serine en position 200, en référence à la séquence de l'Ache de Torpédo (S₂₀o figure 1), qui est caractéristique du site actif des AchE. En outre d'autres motifs caractéristiques des AChE ont également été retrouvés dans les deux séquences (AChEl et AChE2): le site de liaison à la choline (résidu Tryptophane en position 84, W84), les trois résidus de la triade catalytique (résidus serine, acide glutamique et histidine, respectivement en positions 200, 327 et 440 : S₂₀₀, E₃₂₇ et H₄₄₀), les six résidus cystéine potentiellement impliqués dans des ponts disulfures conservés (C₆₇-C₉₄; C₂₅₄-C₂₆₅; C₄o₂-C₅₂₁), et des résidus aromatiques bordant la gorge du site actif (10 et 11 résidus , respectivement pour AChEl et AChE2).

Dans les deux séquences, on observe la présence d'un résidu phénylalanine en position 290 (F290) mais pas en position 288 ; cette caractéristique commune aux AChE d'invertébrés est responsable d'une plus large spécificité de substrat des AChE d'invertébrés, par rapport à celles de vertébrés.

L'analyse des séquences C-terminales des AChE de diptère montre la présence d'un peptide hydrophobe conespondant à un signal d'addition d'un glyco- lipide, indiquant le clivage post-traductionnel d'un fragment C-terminal et l'addition d'une résidu d'ancrage glycolipidique comme chez Drosophila et d'autres espèces de moustiques. Dans toutes les séquences on observe également la présence d'un résidu cystéine dans la séquence C-terminale précédant le site potentiel de clivage du peptide hydrophobe. Ce résidu cystéine pounait être impliqué dans une liaison disulfure intermoléculaire, liant les deux sous-unités catalytiques du dimère d'AChE.

Les protéines AChEl et AChE2 d'An, gambiae présentent 53 % de similarité entre elles et montrent respectivement : 76 % et 55 % de similarité avec l'AChE de Schizaphis graminum (numéro d'accession NCBI AAK09373 ou GENBANK 12958609), 53 % et 98 % de similarité avec l'AChE d'An, stephensi (GENBANK 2494391), 54 % et 95 % de similarité avec l'AChE d'Aedes aegypti (GENBANK 2133626), 52 % et 83 % de similarité avec l'AChE de Drosophila (GENBANK 17136862).

La différence majeure enfre AChEl et AChE2 réside dans une insertion de 31 acides aminés dans la séquence d'AChE2 (figure 1). Cette séquence, dénommée "insertion hydrophilique" dans l'AChE de Drosophila, est absente dans les AChEs de vertébrés et de nématodes et pounait être caractéristique de l'AChE2, au moins chez les diptères. Ces résultats démontrent la présence de deux gènes ace dans le génome d'Anophèles gambiae, l'un codant pour AChEl qui est apparentée à l'AChE de Schizaphis graminum, et l'autre pour AChE2 qui est apparentée à l'AChE de Drosophila et aux AChEs connues de moustiques. La présence d'autres gènes ace chez An. gambiae est très improbable dans la mesure où des recherches complémentaires dans les bases de données du génome d'An gambiae, en utilisant des paramètres moins stringents, ont détecté uniquement des séquences codant pour des alpha-estéra- ses (EC 3.1.1) et des carboxylestérases (EC 3.1.1.1). EXEMPLE 3 : Mise en évidence d'un unique gène ace chez Drosophila melano- gaster

La présence d'un gène homologue du gène ace-1 a été recherchée dans le génome de Drosophila. Les recherches TBLASTN ont permis de détecter le gène ace précédemment identifié, homologue du gène ace-2 d'Anophèles gambiae mais n'ont pas permis de détecter d'autres séquences homologues du gène ace-1. Des recherches à l'aide de paramètres moins stringents ont permis de détecter uniquement des alpha et des carboxylestérases. Ces résultats démontrent que le génome de la drosophile contient un unique gène ace (ace-2).

EXEMPLE 4 : Mise en évidence d'au moins deux gènes ace chez les autres espèces de moustiques La présence du gène ace-1 dans le génome d'autres espèces de moustiques a été analysée par PCR à l'aide d'oligonucléotides dégénérés (PdirAGSG et PrevAGSG, SEQ BD NO: 39 et 40) permettant d'amplifier un fragment exonique (fragment K, d'environ 320 pb figure 1), conespondant à des séquences conservées entre les séquences d'AChEl d'An, gambiae et Schizaphis graminum mais divergentes enfre les séquences d'AChEl et AChE2 d'An, gambiae.

La séquence des produits PCR obtenus à partir de l'ADN génomique de différentes espèces de moustiques, montre un pourcentage d'identité très élevé enfre les séquences d'Anophèles, Culex et Aedes. En outre, la plupart des substitutions sont silencieuses puisque les séquences en acides aminés déduites de ces séquences nucléotidiques ne diffèrent entre elles que par 5 à 6 acides aminés (Figure 2A). Le fragment K a également été amplifié par RT-PCR à partir de l'ARNm de C. pipiens, indiquant que le gène ace-1 est exprimé sous forme d'ARNm ; ce résultat est en accord avec l'existence, chez C. pipiens, de deux AChEs possédant des propriétés catalytiques distinctes.

EXEMPLE 5 : Analyse de la liaison entre le gène ace-1 et la résistance aux insecticides Afin d'analyser la liaison enfre le gène ace-1 et la résistance aux insecticides, le fragment K amplifié à partir de l'ADN génomique de C. pipiens résistants (souche R), a été séquence. La comparaison des séquences du fragment K entre les souches S et R montre des différences au niveau de 3 nucléotides (substitutions silencieuses, Figure 2B). L'une de ces substitutions affecte un site EcoRI, ce qui permet de différencier facilement le locus ace-1 des souches S et R par PCR-RFLP : les profils de restriction montrent 1 bande (320 pb) chez les individus homozygotes résistants, 2 bandes (106 pb et 214 pb) chez les moustiques homozygotes SS et 3 bandes (103 pb, 214 pb et 320 pb) chez les moustiques hétérozygotes RS (figure 2C).

La liaison entre le gène ace-1 et la résistance au propoxur a été étu- diée, en triple, de la façon suivante : des larves de croisement en retour (S x R) x S ont été traitées par une dose létale pour les individus sensibles et le génotype d 'ace-1 a été analysé chez les survivants, par PCR-RFLP.

Les résultats montrent que l'exposition au propoxur tue 50 % des larves dans tous les croisements en retour, c'est à dire tous les individus sensibles. Toutes les larves survivantes (100 pour chaque croisement en retour, 300 au total) montrent un profil hétérozygote en RFLP, indiquant qu'elles possèdent toutes une copie du gène ace-1 de la souche R.

Ces résultats démontrent que le gène ace-1 est lié de façon très étroite avec la résistance aux insecticides (moins de 1 % de recombinaison avec un degré de confiance de 0,05).

EXEMPLE 6 : Analyse de la phylogénie des gènes ace-1 et ace-2.

Des arbres phylogénénétiques ont été construits à partir des séquences des régions conservées des AChE d'An gambiae (SEQ ED NO: 1 et fragment 34- 393 de la séquence SEQ ED NO: 53, figure 1), des fragments K de C. pipiens et Aedes aegypti (SEQ ED NO: 8 et 9) et de 33 séquences d'AChE disponibles dans GENBANK, à l'aide de la méthode du plus proche voisin (neighbour-joining method), comme décrit dans le matériels et méthodes. La figure 3 illustre l'hétérogénéité du nombre de gènes ace au cours de l'évolution du règne animal. Chez les cordés, les cephalocordés possèdent au moins deux gènes ace alors que les urocordés n'en possèdent qu'un seul, comme déduit de l'analyse de leur génome. Chez les arthropodes, les diptères possèdent, soit un seul gène ace (Drosophila du sous-ordre des brachycères) ou deux gènes ace (moustiques du sous-ordre des nématocères). La topologie de l'arbre montre que ces deux gènes ace se sont dupliqués très précocement au cours de l'évolution, probablement avant la séparation entre les protostomes et les deutérostomes. Ces résultats sont supportés par le fait que les AChE de mollusques, de nématodes et d'arthropodes se ramifient à partir des séquences des cordés (craniatia, cephalocordés et urocordés). Les résultats montrent que les arthropodes et les nématodes possèdent une AChE apparentée.

Ces résultats indiquent que les gènes ace-1 et ace-2 identifiés chez les insectes proviennent d'un événement de duplication très ancien et que l'absence du gène ace-1, au moins chez certaines espèces du sous-ordre des brachycères (Drosophila ) résulte de la perte d'un gène ace plutôt que d'une duplication récente du gène ace chez les nématocères. Ces résultats suggèrent également que les extrapolations faites à partir d'études chez D. melanogaster sont à considérer avec réserve dans la mesure où la situation de Drosophila n'est ni représentative des diptères ni de l'ensemble de la classe des insectes. EXEMPLE 7 : Détermination de la séquence d'ADNc du gène ace-1

L'ADNc d'ace-1 a été clone à partir de deux souches d'Anophèles gambiae (souche KISUMU sensible et souche YAO résistante) et de deux souches de Culex pipiens (souche S-LAB sensible et souche SR résistante), comme décrit dans le matériels et méthodes. La séquence complète de l'ADNc de la souche KISUMU conespond à la séquence SEQ ID NO: 125 qui code pour une protéine de 737 acides aminés (SEQ ID NO: 126). La séquence complète de l'ADNc et de la protéine AChEl de la souche YAO conespondent respectivement aux séquences SEQ BD NO: 121 et SEQ ED NO: 122. Les séquences SEQ ED NO :4 et SEQ ED NO :5 conespondent à la séquence quasi-complète (à l'exception du premier exon codant du gène ace-1), respectivement de l'ADNc et de la protéine AChEl de la souche KISUMU. La séquence complète de l'ADNc des souches S-LAB et SR de C. pipiens conespond respectivement aux séquences SEQ ID NO: 6 et SEQ ID NO: 56 qui codent pour une protéine de 702 acides aminés (SEQ ED NO: 7 et SEQ ID NO: 57, respectivement pour la souche S-LAB et la souche SR). EXEMPLE 8 : Détermination de la séquence du gène ace-1

La séquence du gène ace-1 a été déterminée à partir de l'ADN génomique de deux souches d'Anophèles gambiae, la souche sensible de référence de l'Afrique de l'Ouest (souche KISUMU) et une souche résistante de Côte d'ivoire (souche YAO), comme décrit dans le matériels et méthodes. La séquence complète d'An, gambiae conespond à la séquence SEQ

ID NO: 127 qui présente une organisation intron-exon comprenant au moins 9 exons et incluant deux exons 5' non-codants (Tableau I)

La séquence quasi-complète (à l'exception des deux premiers exons 5' non-codants) du gène ace-1 de la souche KISUMU conespond à la séquence SEQ JD NO: 23.

La séquence quasi- complète (à l'exception des deux premiers exons 5' non-codants et du premier exon codant) du gène ace-1 de la souche YAO conespond à la séquence SEQ ED NO: 120.

EXEMPLE 9 : Identification de mutation(s) dans la séquence en acides aminés de la protéine AChEl, responsable(s) de la résistance aux insecticides chez les moustiques des espèces Culex pipiens e Anophèles gambiae.

La séquence nucleotidique codant la protéine AChEl (ADNc) a été déterminée à partir de deux souches d'Anophèles gambiae (souche KISUMU sensible et souche YAO résistante) et de deux souches de Culex pipiens (souche S-LAB sensible et souche SR résistante), comme décrit à l'exemple 7.

Les séquences en acides aminés de la protéine AChEl des souches sensibles et résistantes, déduites des séquences précédentes, ont ensuite été alignées (figures 5, 6 et 9).

La comparaison des séquences en acides aminés de la protéine AChEl de C. pipiens (figure 5 et 6) montre qu'il existe une seule mutation non-silencieuse enfre la souche sensible (S-LAB, SEQ BD NO: 7) et la souche résistante aux insecticides (souche SR, SEQ ID NO: 57), située dans la région codée par le troisième exon codant du gène ace-1 : la glycine (GGC) en position 247 (ou en position 119, en référence à la séquence de l'AChE du poisson torpille) de la souche sensible est remplacée par une serine (AGC) dans la souche résistante (G_{247 (//}$>) -> S_{247 (}ugj-),

La localisation de l'acide aminé en position 247 dans la structure de racétylcholinestérase de C. pipiens et l'effet de la substitution glycine ->• serine sur cette structure ont été analysées par modélisation moléculaire à partir de la structure de l'acétylcholinestérase du poisson torpille. Les résultats sont illustrés dans la figure 7 (A, B et C). La figure 7A montre que l'acide aminé en position 119 est proche des résidus du site catalytique (S ₀₀ et H₄₄₀). La figure 7C montre que, par comparaison avec la glycine de la souche sensible (figure 7B), l'encombrement de la chaîne latérale de la serine de la souche résistante, réduit l'espace du site catalytique ce qui empêche vraisemblablement l'insecticide d'interagir avec la serine catalytique (S₂₀₀).

La comparaison des séquences en acides aminés de la protéine AChEl d'An, gambiae montre qu'il existe deux mutations non-silencieuses enfre la souche sensible (KISUMU, SEQ ED NO: 5) et la souche résistante aux insecticides (souche YAO, SEQ ED NO: 122) : la première conespond au remplacement de la valine (CGT) en position 33 de la séquence de la souche sensible (SEQ ED NO: 5) par une alanine (CGC) dans la souche résistante et la seconde est la même mutation glycine — serine que celle trouvée chez Culex pipiens. Etant donnée la position externe de la valine dans la structure de l'acétylcholinestérase, cette mutation n'est certainement pas impliquée dans la résistance chez Anophèles gambiae et seule la serine doit être responsable de la résistance aux insecticides, à la fois chez Anophèles gambiae et Culex pipiens. EXEMPLE 10 : Détection de la mutation dans le troisième exon codant du gène ace-1 responsable de la résistance aux insecticides chez les moustiques des espèces Culex pipiens et Anophèles gambiae.

Le profil de restriction du troisième exon codant du gène ace-1 contenant la mutation glycine - serine, a été vérifié dans de nombreuses populations et souches de moustiques des espèces C. pipiens et An. gambiae, sensibles et résis- tantes aux insecticides de la classe des organophosphorés et des carbamates, par PCR- RFLP selon le protocole tel que décrit à l'exemple 1. De manière plus précise :

- chez C. pipiens, la mutation glycine (GGC)- serine (AGC) introduit un site Alu I (AGCT) unique dans la séquence de la souche résistante, qui est mis en évidence à partir d'un produit PCR de 520 pb, amplifié à l'aide des amorces Ex3dir et Ex3rev, comme illustré dans la figure 6.

- chez An. gambiae, la mutation glycine (GGC) — >• serine (AGC) introduit un deuxième site Alu I (AGCT) dans la séquence de la souche résistante, qui est mis en évidence à partir d'un produit PCR de 541 pb, amplifié à l'aide des amorces Ex3AGdir et Ex3 AGrev, comme illustré dans la figure 9. Les résultats de PCR-RFLP ont ensuite été vérifiés par séquençage du fragment PCR de 520 pb ou 541 pb du froisième exon codant. - Espèce Ç._pipiens

Les populations et souches de Culex pipiens, résistants (R) ou sensibles (S) qui ont été analysées sont présentées dans le Tableau HI ci-dessous :

Tableau III: Souches et populations de l'espèce C. pipiens analysées

* R S résistant ou sensible aux insecticides de la classe des organophosphorés et des carbamates

L'analyse par PCR-RFLP de l'ensemble des moustiques du Tableau

Eli montre qu'il existe une conélation parfaite entre la résistance aux insecticides et le profil de restriction par PCR-RFLP, à savoir : 1 bande (520 pb) est détectée chez les individus homozygotes sensibles SS, 2 bandes (357 pb et 163 pb) sont détectées chez les individus homozygotes résistants RR et 3 bandes (520 pb, 357 pb et 163 pb) sont détectées chez les individus hétérozygotes résistants RS (figure 8). Ces résultats ont été confirmés par le séquençage du produit PCR de

520 pb pour l'ensemble des moustiques du Tableau ELI analysés par PCR-RFLP.

L'alignement des séquences obtenues (SEQ ED NO: 60 à 89), illustré dans le Tableau

IV ci-dessous montre que chez les moustiques de l'espèce C. pipiens, la mutation glycine -> serine, située en position 739 en référence à la séquence de l'ADNc du gène ace-1 de la souche sensible de référence (souche S-LAB), qui est responsable de la résistance aux insecticides, provient de deux groupes de mutations indépendantes, respectivement chez C. pipiens pipiens et C. pipiens quiquefasciatus.

Tableau IV: Analyse de l'origine de la mutation glycine — » serine responsable de la résistance aux insecticides chez les moustiques de l'espèce C. pipiens

Position des mutations en référence à la séquence d'ADNσ du gène ace-1 de la souche S-LAB (SEQ ID NO: 6)

4 4 4 4 5 5 5 5 5 6 6 6 6 6 6 6 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 8 8 5 5 7 9 1 2 6 7 9 0 5 6 8 8 9 9 1 3 3 4 4 5 6 7 7 8 9 9 1 4

0 3 1 8 3 8 4 3 7 3 1 0 1 4 1 6 4 2 9 1 7 6 3 4 7 0 0 8 3 6 Souches de C pipiens C. pipiens quiquefascia BO(R)* T C A T C G G G G C G G G C C C C C A C C T C C C C G G A T Harare (_R) _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

Supercar (R₎ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

D_JI ₍R₎ _ _ _ _ _ _ _

Martinique (R) _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

Recife ₍R₎ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

ProR₍S₎* _ _τ _ _c _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _G _ _ _ _ _G

_S-_Lab (S) - T - C - - - _ _ _ _ _ _G _ _ _ _ _ _ _G

TemR _(S) _ _T _ _ _._ _ _A _ _ _ _ _ _ _G _ _ _ _ _ _A _

Trans (S) - T - A - - - G A ing (S - T C C - G T

T ai (S) - T C C - - G G

Mao (S) - T - C _ _ _G _

Madurai (S) - T - C A _ _ _ _ _G _ _G

BSQ (S) - T C C - - - - - - _ _ _ _ _G _ _ _ _ _ _ _G BE (S) - T A G

Boualse (_S) - T - C _ _ _ _ - _ _ _ - _ - - _G _ - _ _ _ _ _

Brazza (_S) - T C C - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _G _ _ _ _ - - _G Brésil (S) - T - C G - T G

Moorea _(S) _ _τ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _G _ _ _ _ _ _ _G

C. pipiens pipiens

Espro (R) A T - C - - - A - - C - - - A G T T A - - - T - T T G

Praias (R) A T - C - - - A - - C - - - A G T T A - - - T - T T G

Padova (R) A T - c - - - A - - C - - - A G T T A - - - T - T T - - G

Barriol (R) A T — c - A - - C - - - A G T T A - - - T - T T - - G

BrugeA (S) A T - c - - - A - - C - _ - A G T T G - - - T - T T - - G

BrugesB (S) A T - c - - - A - - C - - - A G T T G - - - T - T T - - G

Killcare (S) A T - c - A - A C - - - A G T T G - - - T - T T - - G

Bleuet (S) A T - c - - - A - - C - - - A G T T G - - - T - T T G

Heteren (S) A T - c - A - A - A C - - - A G T - G - - - T - - T - A G

*(R) résistant aux insecticides *(S) sensible aux insecticides

Des souches sensibles KISUMU (souche sensible de référence de l'Afrique de l'est) et VK-PER (souche de référence KDR de l'Afrique de l'ouest) ainsi que des populations sensibles de la région de Yaoundé ont été testées par le test PCR-RFLP comme décrit ci-dessus.

Les résultats du test PCR-RFLP, montrent qu'il existe pour l'ensemble des moustiques An. gambiae analysés, une conélation parfaite entre la résistance aux insecticides et le profil de restriction par PCR-RFLP, à savoir : 2 bandes (403 pb et 138 pb) sont détectées chez les individus homozygotes sensibles SS, 2 bandes (253 pb et environ 150 pb) ou 3 bandes (403 pb, 253 pb et environ 150 pb) sont détectées chez les individus résistants, respectivement chez les individus homozygotes (RR) et hétérozygotes (RS). EXEMPLE 11 : Analyse de l'activité acetylcholinesterase des protéines AChEl sensibles et résistantes aux insecticides.

Les AchEl recombinantes de respectivement la souche S-LAB et la souche SR ont été exprimées dans des cellules d'insecte et l'activité acetylcholinesterase a été mesurée à partir des extraits cellulaires comme décrit à l'exemple 1.

Les résultats illustrés dans la figure 10 montrent que l'unique mutation glycine_247(7/9j->sérine_{247( /} rend l'acétylcholinestérase insensible à l'insecticide. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en œuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS

1°) Acetylcholinesterase d'insecte, caractérisée en ce qu'elle comprend une région catalytique centrale qui présente une séquence en acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par la séquence SEQ ED NO: 1 et les séquences présentant au moins 60 % d'identité ou 70 % de similarité avec la séquence SEQ BD

NO: 1, à l'exclusion de l'acétylcholinestérase de séquence NCBI AAK0973.

2°) Acetylcholinesterase d'insecte selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle inclut une mutation de la glycine située en position 119, en serine, en référence à la séquence de l'acétylcholinestérase de Torpédo califomica (SWISSPROT P04058).

3°) Acetylcholinesterase selon la revendication 1 ou la revendication

2, caractérisée en ce qu'elle conespond à celle d'un insecte de la famille des Culicidae, choisi parmi les genres Culex, Aedes et Anophèles.

4°) Acetylcholinesterase selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle est sensible aux insecticides de la classe des organophosphorés et des carbamates et en ce qu'elle présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par :

- les séquences SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 126 $ Anophèles gambiae, - la séquence SEQ BD NO: 7 de Culex pipiens (souche S-LAB), et

- les séquences comprenant une région catalytique centrale telle que définie à la revendication 1, lesquelles séquences présentent une glycine en position 119, en référence à la séquence de l'acétylcholinestérase de Torpédo califomica (SWISSPROT P04058), incluse dans un fragment de séquence SEQ ID NO :91, 92, 96, 102 à 112, 114, 115 et 117 à 119.

5°) Acetylcholinesterase selon la revendication 3, caractérisée en ce que ladite région catalytique centrale comprend une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 8 à 21. 6°) Acetylcholinesterase selon la revendication 2 ou la revendication

3, caractérisée en ce qu'elle est résistante aux insecticides et en ce qu'elle présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ED NO: 57, SEQ ED NO: 122 et les séquences comprenant un fragment de séquence SEQ ED NO: 90, 93, 94, 95, 97 à 101, 113 et 116 représentant un fragment peptidique d'environ 150 acides aminés codé par le troisième exon codant du gène ace-1 d'un insecte résistant tel que défini ci-dessus, contenant la substitution de type G119S, en référence à la séquence de l'AChE de Torpédo califomica (SWISSPROT P04058).

7°) Acetylcholinesterase selon la revendication 3, caractérisée en ce que ladite région catalytique centrale comprend une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ BD NO: 90, 93, 94, 95, 97 à 101, 113 et 116.

8°) Peptide, caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment d'au moins 7 acides aminés de l'acétylcholinestérase selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.

9°) Molécule d'acide nucléique isolée, caractérisée en ce qu'elle présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par :

- les séquences codant pour une acetylcholinesterase selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 (ADNc et fragment d'ADN génomique conespondant au gène ace-1),

- les séquences complémentaires des séquences précédentes, sens ou anti-sens, et

- les fragments d'au moins 8 pb, de préférence de 15 pb à 500 pb des séquences précédentes.

10°) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par : a) les séquences SEQ ED NO: 2, SEQ ID NO :4, SEQ ED NO: 125, SEQ BD NO: 6, SEQ BD NO: 56 et SEQ DD NO: 121 qui conespondent à l'ADNc de la protéine AChEl de séquence en acides aminés, respectivement SEQ DD NO: 3, SEQ DD NO: 5, SEQ BD NO: 126, SEQ DD NO: 7, SEQ DD NO: 57 et SEQ DD NO: 122, telles que définie ci-dessus, b) les séquences SEQ DD NO: 22, SEQ DD NO: 23 et SEQ BD NO: 127 qui conespondent au gène ace-1 d'Anophèles gambiae codant les AChEl telles que définies à la revendication 4, et c) les séquences comprenant la séquence SEQ ED NO: 120 qui conespond à la séquence quasi-complète du gène ace-1 d'Anophèles gambiae codant O 2004/000994

46 l'AChEl résistante de séquence SEQ DD NO: 122, telle que définie à la revendication 5.

11°) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par les amorces de séquence SEQ DD NO: 39 à 50, 54, 55, 58, 59, 123, 124, 128 et 129 et les fragments de séquences SEQ DD NO: 24 à 38 et 60 à 89.

12°) Méthode de détection d'insectes porteurs d'une résistance aux insecticides de la classe des organophosphorés et des carbamates, caractérisée en ce qu'elle comprend : - la préparation d'un échantillon d'acides nucléiques à partir d'insectes à tester, et

- la détection par tout moyen approprié, de la présence dans ledit échantillon d'acides nucléiques, d'une mutation dans le gène ace-1 tel que défini à la revendication 9 ou à la revendication 10. 13°) Méthode selon la revendication 12, caractérisée en ce que ladite détection comprend :

- l'amplification d'un fragment d'environ 320 pb à l'aide du couple d'amorces SEQ DD NO: 39 et 40,

- la digestion dudit fragment à l'aide d'une enzyme de restriction appropriée, et

- l'analyse du profil de restriction obtenu.

14°) Méthode selon la revendication 13, caractérisée en ce que ladite enzyme de restriction est EcoRI.

15°) Méthode selon la revendication 12, caractérisée en ce que ladite détection comprend :

- l'amplification d'un fragment d'environ 520 pb à l'aide du couple d'amorces SEQ DD NO: 58 et 59,

- la digestion dudit fragment à l'aide d'une enzyme de restriction appropriée, et - l'analyse du profil de restriction obtenu.

16°) Méthode selon la revendication 12, caractérisée en ce que ladite détection comprend : - l'amplification d'un fragment d'environ 541 pb à l'aide du couple d'amorces SEQ BD NO: 123 et 124,

- la digestion dudit fragment à l'aide d'une enzyme de restriction appropriée, et - l'analyse du profil de restriction obtenu.

17°) Méthode selon la revendication 12, caractérisée en ce que ladite détection comprend :

- l'amplification d'un fragment d'environ 194 pb à l'aide du couple d'amorces SEQ ED NO: 128 et 129, - la digestion dudit fragment à l'aide d'une enzyme de restriction appropriée, et

- l'analyse du profil de restriction obtenu.

18°) Méthode selon l'une quelconque des revendications 15 à 17, caractérisée en ce que ladite enzyme de restriction est Alu I. 19°) Vecteur recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend un insert sélectionné dans le groupe constitué par les molécules d'acides nucléiques selon l'une quelconque des revendications 9 à 11.

20°) Cellules, caractérisées en ce qu'elles sont modifiées par un vecteur recombinant selon la revendication 19. 21°) Anticorps, caractérisés en ce qu'ils sont dirigés contre l'acétylcholinestérase selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou le peptide selon la revendication 8.

22°) Réactif de détection d'insectes porteurs d'une résistance aux insecticides de la classe des organophosphorés et des carbamates, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par les molécules d'acides nucléiques et leurs fragments selon l'une quelconque des revendications 9 à 11 et les anticorps selon la revendication 21.

23°) Animal invertébré transgénique, caractérisé en ce qu'il contient des cellules transformées par au moins une molécule d'acide nucléique selon la reven- dication 9 ou la revendication 10.

24°) Méthode de criblage d'une substance insecticide, caractérisée en ce qu'elle comprend : a) la mise en contact de la substance à tester avec une acetylcholinesterase selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, un extrait de cellules modifiées telles que définies à la revendication 20 ou un échantillon biologique d'un animal transgénique tel que défini à la revendication 23, en présence d'acétylcholine ou de l'un de ses dérivés, b) la mesure par tout moyen approprié, de l'activité acetylcholinesterase du mélange obtenu en a), et c) la sélection des substances capables d'inhiber ladite activité.

25°) Méthode de criblage de substances insecticides, caractérisée en ce qu'elle comprend :

- la mise en contact d'une substance à tester avec un animal transgénique selon la revendication 23, et

- la mesure de la survie de l'animal.

26°) Réactif de criblage de substances insecticides, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par les acétylcholinestérases selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, les vecteurs recombinants selon la revendication

18, les cellules modifiées selon la revendication 20 et les animaux transgéniques selon la revendication 23.

27°) Trousse de détection et/ou de criblage, caractérisée en ce qu'elle inclut au moins un réactif selon la revendication 22 ou la revendication 26.

28°) Méthode de criblage d'inhibiteurs d'une AChEl selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle comprend :

(a) l'identification de molécules présentant une probabilité de liaison significative à ladite AChEl ; (b) l'isolement des inhibiteurs potentiels identifiés à l'étape (a) ;

(c) la mise en contact de la substance isolée à l'étape (b) avec une AChEl selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, un extrait de cellules modifiées tel que défini à la revendication 20, un échantillon biologique d'un animal transgénique tel que défini à la revendication 23 ou un extrait d'insecte sensible ou résistant aux insecticides de la classe des organophosphorés et des carbamates, en présence d'acétylcholine ou de l'un de ses dérivés ; (d) la mesure par tout moyen approprié, de l'activité acetylcholinesterase du mélange obtenu en (c) ; et

(e) la vérification que les molécules isolées en (b) inhibent l'activité AChEl.

1 / 14

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FIGURE 1 2/14

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1 80

Ae alb TEPDNPNSNR DALDKMVGDY HFTCNVNEFA QRYAEEGNNV YMYLYTHRSK GNPWPRWTGV MHGDEINYVF GEP_NSEJLGY

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An alb TEPDNPNSNR DALDKMVGDY HFTCNVNEFA QRYAEEGNNV YMYLYTHRSK GNPWPRWTGV MHGDEINYVF GEPLNϋLGY

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An sac TEPDNPNSNR DALDKMVGDY HFTCNVNEFA QRYAEEGNNV YMYLYTHRSK GNPWPRWTGV MHGDEINYVF GEPLNIjSLGY

An pse TEPDNPNSNR DALDKMVGDY HFTCNVNEFA QRYAEEGNNV YMYLYTHRSK GNPWPRWTGV MHGDEINYVF GEPLNÈGLGY

Cx Pip gEPDNPNSNR DALDKMVGDY HFTCNVNEFA QRYAEEGNNV fMYLYTHRSK GNPWPRWTGV MHGDEINYVF GEPLNS GY

81 91

Ae alb ^DDEKDFSRK I

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B

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Acei-SLAB ATSGAACCGGACAACCCGAACAGCAACCGTGACGCGCTGGACAAGATGGTCGGGGATTATCACTTCACCTGCAACGTGAA

Acel-SR ATfGAACCGGACAACCCGAACAGCAACCGTGACGCGCTCGACAAGATGGTCGGGGATTATCACTTCACCTGCAACGTGAA

EcoRI • 100 • 120 • 140 • 160

Acei-SLAB CGAITTCGCCCAGCGGTACGCCGAGGAGGGCAACAACGTGTTCATGTACCTGTACACGCACAGAAGCAAAGGAAATCCCT Acei-SR CGAJTTCGCCCAGCGGTACGCCGAGGAGGGCAACAATGTGTTCATGTACCTGTACACGCACAGAAGCAAAGGAAATCCCT

• 180 • 200 • 220 • 240

Acei-SLAB GGCCGAGGTGGAC|GGCGTGATGCACGGCGACGAGATCAACTACGTGTTTGGCGAACCGCTGAACTCGGCCCTCGGCTAC Acei-SR GGCCGAGGTGGAC§GGCGTGATGCACGGCGACGAGATCAACTACGTGTTTGGCGAACCGCTGAACTCGGCCCTCGGCTAC

• 260 •

Acei-SLAB CAGGACGACGAGAAGGACTTTAGCCGGAAAATT Acel-SR CAGGACGACGAGAAGGACTTTAGCCGGAAAATT

S-LAB SR Croisement en retour

FIGURE 2 3/14

FIGURE 3 4/14

Uj

-C -C

O O

5 /14

1 80

SR MEIRGLITRL LGPCHLRHLI LCSLGLYSIL VQSVHCRHHD IGSSVAHQLG SKYSQSSSLS SSSQSSSSLA EEATLNKDSD

S-LAB MEIRGLITRL LGPCHLRHLI LCSLGLYSIL VQSVHCRHHD IGSSVAHQLG SKYSQSSSLS SSSQSSSSLA EEATLNKDΞD

81 160

SR AFFTPYIGHG DSVRIVDAEL GTLEREHIHS TTTRRRGLTR RESSSDATDS DPLVITTDKG KIRGTTLEAP SGKKVDAWMG S-LAB AFFTPYIGHG DSVRIVDAEL GTLEREHIHS TTTRRRGLTR RESSSDATDS DPLVITTDKG KIRGTTLEAP SGKKVDAWMG

161 240

SR IPYAQPPLGP LRFRHPRPAE RWTGVLNATK PPNSCVQIVD TVFGDFPGAT MWNPNTPLSE DCLYINVVVP RPRPKNAAVM S-LAB IPYAQPPLGP LRFRHPRPAE RWTGVLNATK PPNSCVQIVD TVFGDFPGAT MWNPNTPLSE DCLYINVVVP RPRPKNAAVM

241 ₃20

SR LWIFGGSFYS GTATLDVYDH RTLASEENVI VVSLQYRVAS LGFLFLGTPE APGNAGLFDQ NLALRWVRDN IHRFGGDPSR

S-LAB LWIFGGGFYS GTATLDVYDH RTLASEENVI VVSLQYRVAS LGFLFLGTPE APGNAGLFDQ NLALRWVRDN IHRFGGDPSR

₃21 400

SR VTLFGESAGA VSVSLHLLSA LSRDLFQRAI LQSGSPTAPW ALVSREEATL RALRLAEAVN CPHDATKLSD AVECLRTKDP S-LAB VTLFGESAGA VSVSLHLLSA LSRDLFQRAI LQSGSPTAPW ALVSREEATL RALRLAEAVN CPHDATKLSD AVECLRTKDP

401 480

SR NELVDNEWGT LGICEFPFVP VVDGAFLDET PQRSLASGRF KKTDILTGSN TEEGYYFI I YLTELLRKEE GVTVTREEFL

S-LAB NELVDNEWGT LGICEFPFVP VVDGAFLDET PQRSLASGRF KKTDILTGSN TEEGYYFI IY YLTELLRKEE GVTVTREEFL

481 560

SR QAVRELNPYV NGAARQAIVF EYTDWIEPDN PNSNRDALDK MVGDYHFTCN VNEFAQRYAE EGNNVFMYLY THRSKGNPWP

S-LAB QAVRELNPYV NGAARQAIVF EYTDWIEPDN PNSNRDALDK MVGDYHFTCN VNEFAQRYAE EGNNVFMYLY THRSKGNPWP

561 640

SR RWTGVMHGDE INYVFGEPLN SALGYQDDEK DFSRKIMRYW SNFAKTGNPN PSTPSVDLPE WPKHTAHGRH YLELGLNTTF

S-LAB RWTGVMHGDE INYVFGEPLN SALGYQDDEK DFSRKIMRYW SNFAKTGNPN PSTPSVDLPE WPKHTAHGRH YLELGLNTTF

64 1 702

SR VGRGPRLRQC AFWKKYLPQL VAATSNLQVT PAPSVPCESS STSYRSTLLL IVTLLLVTRF Kl

S-LAB VGRGPRLRQC AFWKKYLPQL VAATSNLQVT PAPSVPCESS STSYRSTLLL IVTLLLVTRF Kl

Figure 5 6/14

1 80

M E I R G L I T R L L G P C H L R H L I L C S L G L Y S-Lab ATGGAGATCCGAGGCCTAATAACCCGATTACTGGGTCCATGTCACCTGCGACATCTGATACTGTGCAGTTTGGGGCTGTA

SR

160 S I L V Q S V H C R H H D I G S S V A H Q L G S K Y S S-LAB CTCCATCCTCGTGCAGTCGGTCCATTGCCGGCATCATGACATCGGTAGTTCGGTGGCACACCAGCTAGGATCGAAATACT

SR

240 Q S S S L S S S S Q S S S S L A E E A T L N K D S D S-LAB CACAATCATCCTCGTTATCGTCATCCTCGCAATCGTCATCGTCGTTAGCTGAAGAGGCCACGCTGAATAAAGATTCAGAT _SR

320 A F F T P Y I G H G D S V R I V D A E L G T L E R E H S-LAB GCATTTTTTACACCATATATAGGTCACGGAGATTCTGTTCGAATTGTAGATGCCGAATTAGGTACATTAGAGCGCGAGCA

SR

400 I H S T T T R R R G L T R R E S S S D A T D S D P L V S-LAB TATCCATAGCACTACGACCCGGCGGCGTGGCCTGACCCGGAGGGAGTCCAGCTCCGATGCCACCGACTCGGACCCACTGG

SR

Amorce Ex3dir 480 I T T D K G K I R G T T L E A P S G K K V D A W M G S-LAB fCATAACGACGGACAAGGGCAAAATCCGTGGAACGACACTGGAAGCGCCTAGTGGAAAGAAGGTGGACGCATGGATGGGC

SR -A A

560 I P Y A Q P P L G P L R F R H P R P A E R T G V L N S-LAB ATTCCGTACGCGCAGCCCCCGCTGGGTCCGCTCCGGTTTCGACATCCGCGACCCGCCGAAAGATGGACCGGTGTGCTGAA

SR

640 A T K P P N S C V Q I V D T V F G D F P G A T M N P S-LAB CGCGACCAAACCGCCCAACTCCTGCGTCCAGATCGTGGACACCGTGTTCGGTGACTTCCCGGGGGCCACCATGTGGAACC

SR A C — G

720 N T P L S E D C L Y I N V V V P R P R P K N A A V M S-LAB CGAACACACCGCTCTCGGAGGACTGTCTGTACATCAACGTGGTCGTGCCACGGCCCAGGCCCAAGAATGCCGCCGTCATG

SR C ^• A G T

800

L W I F G G G F Y S G T A T L D V Y D H R T L A S E E

S-LAB CTGTGGATCTTCGGGGGT|GG TCTACTCCGGGACTGCCACGCTGGACGTGTACGACCATCGGACGCTGGCCTCGGAGGA

SR T A T T

S

880 N V I V V S L Q Y R V A S L G F L F L G T P E A P G N S-LAB GAACGTGATCGTAGTTTCGCTGCAGTACCGTGTCGCAAGTCTTGGGTTTCTCTTCCTGGGCACACCGGAGGCACCCGGTA _{SR G τ τ}

960 A G L F D Q N L A L R W V R D N I H R F G G D P S R S-LAB ACGCGGGGCTGTTTGATCAGAACCTGGCACTGAGATGGGTCCGCGACAACATCCACCGGTTCGGCGGTGACCCCTCGCGG

SR

Amorce Ex3rev

1040 V T L F G E S A G A V S V S L H L L S A L S R D L F Q S-LAB GTCACACTGTTCGGCGAGAGCGCCGGAGCGGTCTCGGTTTCGCTGCACCTGCTGTCGGCGCTCTCGCGGGACCTGTTCCA SR

Figure 6A 7/14

1120 R A I L Q S G S P T A P W A L V S R E E A T L R A L R S-LAB GCGGGCCATCCTCCAGAGTGGCTCCCCGACGGCCCCGTGGGCGCTGGTTTCGCGCGAAGAAGCTACGCTTAGAGCTCTTC

SR A

1200 L A E A V N C P H D A T K L S D A V E C L R T K D P S-LAB GTCTGGCCGAGGCCGTCAACTGTCCGCACGATGCGACCAAGCTGAGCGATGCCGTCGAATGCCTGCGAACCAAGGATCCG

SR T

1280

N E L V D N E W G T L G I C E F P F V P V V D G A F L

S-LAB AACGAGCTGGTCGACAACGAGTGGGGCACGCTGGGGATCTGCGAGTTTCCGTTCGTTCCGGTTGTGGACGGAGCCTTCCT

SR T T

1360

D E T P Q R S L A S G R F K T D I L T G S N T E E G

S-LAB CGATGAGACACCGCAGCGTTCGTTGGCCAGCGGGCGCTTCAAGAAAACGGACATCCTGACCGGCAGCAACACCGAGGAGG

SR T

1440 Y Y F I I Y Y L T E L L R K E E G V T V T R E E F L S-LAB GTTACTACTTTATCATTTACTATCTAACCGAACTGCTCAGGAAAGAGGAAGGGGTCACGGTAACACGCGAGGAGTTCCTA

SR

1520 Q A V R E L N P Y V N G A A R Q A I V F E Y T D W I E S-LAB CAGGCCGTCCGGGAGTTGAATCCGTACGTGAACGGTGCCGCCCGGCAGGCCATCGTGTTCGAGTACACGGACTGGATTGA

SR C —

1600

P D N P N S N R D A L D K M V G D Y H F T C N V N E F

S-LAB ACCGGACAACCCGAACAGCAACCGTGACGCGCTGGACAAGATGGTCGGGGATTATCACTTCACCTGCAACGTGAACGAAT

SR C G-

1680 A Q R Y A E E G N N V F M Y L Y T H R S K G N P W P S-LAB TCGCCCAGCGGTACGCCGAGGAGGGCAACAACGTGTTCATGTACCTGTACACGCACAGAAGCAAAGGAAATCCCTGGCCG

SR T

1760 R W T G V M H G D E I N Y V F G E P L N S A L G Y Q D S-LAB AGGTGGACCGGCGTGATGCACGGCGACGAGATCAACTACGTGTTTGGCGAACCGCTGAACTCGGCCCTCGGCTACCAGGA

SR T

1840 D E K D F S R K I M R Y W S N F A K T G N P N P S T P S-LAB CGACGAGAAGGACTTTAGCCGGAAAATTATGCGATACTGGTCCAACTTTGCCAAGACTGGCAATCCCAACCCGAGTACGC

SR A

1920 S V D L P E W P K H T A H G R H Y L E L G L N T T F S-LAB CGAGCGTGGACCTGCCCGAATGGCCCAAGCACACCGCCCACGGACGACACTATCTGGAGCTGGGACTGAACACGACCTTC

SR

2000

V G R G P R L R Q C A F W K K Y L P Q L V A A T S N L

S-LAB GTGGGACGGGGCCCACGATTGCGGCAGTGCGCTTTCTGGAAGAAATATTTGCCGCAACTAGTAGCAGCTACCTCTAACCT

SR

2080

Q V T P A P S V P C E S S S T S Y R S T L L L I V T L

S-LAB CCAAGTAACTCCCGCGCCTAGCGTACCTTGCGAAAGCAGCTCAACATCTTATCGATCCACTCTACTTCTAATAGTCACAC

SR

2109 L L V T R F K I * S-LAB TACTTTTAGTAACGCGGTTCAAGATTTAA SR

Figure 6B 8/14

Figure 7 9/14

Figure 8 10/14

1 80

KISUMU GAATGCGCATTGTTGCGATAGATTGAATTTCCTTGGTTGTTGTTGTTGTTGGTTTTCTTTTGACATGTTTGTGTGTTGTT

YAO

160

A F F T P Y I G H G E S

KISUMU TTTTCTTTCTCTCTCTCTCTCT — CTGTGGTTCCAACATTTCAGACGCATTTTTTACACCATATATAGGTCACGGTGAGT

YAO TT

240 V R I I D A E L G T L E H V H S G A T P R R R G L T KISUMU CC|G'iajCGAATTATAGATGCCGAGT^,rGGGCACGCTCGAGCATGTCCACAGTGGAGCAACGCCGCGGCGACGCGGTCTGACG

YAO C A

A

320 R R E S N S D KISUMU AGGCGCGAGTCCAACTCGGGTAAGTACGCGATTGGAAGTGGGGGGACGTTTACCCTGCCGTGTACTACAATGCACTTTAC

YAO A A C

400 A N D N D P L V V N T D K G R I R G I KISUMU CCCCACGCACACGCACCGGCAGACGCGAACGACAACGATCCGCTGGTGGTCAACACGGATAAGGGGCGCATCCGCGGCAT

YAO

480 T V D A P S G K K V D V W L G I P Y A Q P P V G P L R KISUMU TACGGTCGATGCGCCCAGCGGCAAGAAGGTGGACGTGTGGCTCGGCATTCCCTACGCCCAGCCGCCGGTCGGGCCGTTAC

YAO C C

560 F R H P R P A E K W T G V L N T T T P P N S C V Q I KISUMU GGTTCCGTCATCCGCGGCCGGCCGAAAAGTGGACCGGCGTGCTGAACACGACCACACCGCCCAACAGCTGCGTGCAGATC γ_A0

Amorce Ex3AGdir

640 V D T V F G D F P G A T M N P N T P L S E D C L Y I KISUMU GTGGACACCGTGTTCGGCGACTTCCCGGGCGCGACCATGTGGAACCCGAACACGCCCCTGTCCGAGGACTGTCTGTACAT

YAO Amorce Ex3AGdir

720

N V V A P R P R P K N A A V M L W I F G G G F Y S G T

KISUMU TAACGτGGTGGCA.CCGCGACCCCGGCCCAAGAAτGCGGCCGTCATGCTGTGGATCTTCGGCGGC|GGç|τTCTACTCCGGCA

YAO G A

S

800 A T L D V Y D H R A L A S E E N V I V V S L Q Y R V KISUMU CCGCCACCCTGGACGTGTACGACCACCGGGCGCTTGCGTCGGAGGAGAACGTGATCGTGGTGTCGCTGCAGTACCGCGTG

YAO

880 A S L G F L F L G T P E A P G N A G L F D Q N L A L R KISUMU GCCAGTCTGGGCTTCCTGTTTCTCGGCACCCCGGAAGCGCCGGGCAATGCGGGACTGTTCGATCAGAACCTTGCGCTACG

YAO

960 KISUMU GTAGGTGTCTTTGCATGGGTGAATGAGGGTATAGTATTCTAACGAGGTGCTCTTCTTCCCATCACTTCTTGGGAGTCAGC

1040 W V R D N I H R F G G D P S R V T L F G E S A G A V S KlSUMU GGGTGCGGGACAACATTCACCGGTTCGGTGGTGATCCGTCGCGTGTGACACTGTTCGGCGAGAGTGCCGGTGCCGTCTC

YAO

1120

V S L H L L S A L S R D L F Q R A I L Q S G S P T A P

KISUMU GGTGTCGCTGCATCTGCTGTCCGCCCTGTCCCGCGATCTGTTCCAGCGGGCCATCCTGCAGAGCGGCTCGCCGACGGCAC

YAO T

Amorce Ex3AGrev

1200 W A L V S R E E A T L R KISUMU CGTGGGCATTGGTATCGCGCGAGGAAGCCACGCTAAGGTACGTGCCAGCTGCTGCTTTCCCCAAACCACCAACCCGCGAC YAO A —

Figure 9A 11/14

1280 A L R L A E A V G C P H

KISUMU AGCTCACACAACCCTCTTTTCCTTCGCTCTTTTCTCGCTCCAGAGCACTGCGGTTGGCCGAGGCGGTCGGCTGCCCGCAC YAO _G

1360 E P S K L S D A V E C L R G K D P H V L V N N E W G T

KISUMU GAACCGAGCAAGCTGAGCGATGCGGTCGAGTGTCTGCGCGGCAAGGATCCGCACGTGCTGGTCAACAACGAGTGGGGCAC YAO

1440

L G I C E F P F V P V V D G A F L D E T P Q R S L A S

KISUMU GCTCGGCATTTGCGAGTTCCCGTTCGTGCCGGTGGTCGACGGTGCGTTCCTGGACGAGACGCCGCAGCGTTCGCTCGCCA YAO

1520 G R F K K T E I L T G S N T E E G Y Y F I I Y Y L T

KISUMU GCGGGCGCTTCAAGAAGACGGAGATCCTCACCGGCAGCAACACGGAGGAGGGCTACTACTTCATCATCTACTACCTGACC YAO

1600 E L L R K E E G V T V T R E E F L Q A V R E L N P Y V

KISUMU GAGCTGCTGCGCAAGGAGGAGGGCGTGACCGTGACGCGCGAGGAGTTCCTGCAGGCGGTGCGCGAGCTCAACCCGTACGT YAO

1680

N G A A R Q A I V F E Y T D W T E P D N P N S N R D A

KISUMU GAACGGGGCGGCCCGGCAGGCGATCGTGTTCGAGTACACCGACTGGACCGAGCCGGACAACCCGAACAGCAACCGGGACG YAO

1760 L D K M V G D Y H F T C N V N E F A Q R Y A E E G N

KISUMU CGCTGGACAAGATGGTGGGCGACTATCACTTCACCTGCAACGTGAACGAGTTCGCGCAGCGGTACGCCGAGGAGGGCAAC YAO

1840 N V Y M Y L Y T H R S K G N P W P R W T G V M H G D E

KISUMU AACGTCTACATGTATCTGTACACGCACCGCAGCAAAGGCAACCCGTGGCCGCGCTGGACGGGCGTGATGCACGGCGACGA YAO

1920

I N Y V F G E P L N P T L G Y T E D E K D F S R K I M

KISUMU GATCAACTACGTGTTCGGCGAACCGCTCAACCCCACCCTCGGCTACACCGAGGACGAGAAAGACTTTAGCCGGAAGATCA YAO

2000 R Y S N F A K T G

KISUMU TGCGATACTGGTCTAACTTTGCCAAAACCGGGTAAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCAAACAGCAGAGTGTCGATCGCTCT YAO _{A C}__A—_A

2080 N P N P N T A S S E F P E W P K H T

KISUMU AACGCC TTCTCTCTTCAACAGCAATCCAAATCCCAACACGGCCAGCAGCGAATTCCCCGAGTGGCCCAAGCACA YAO A — AGCGTC T A

2160 A H G R H Y L E L G L N T S F V G R G P R L R Q C A

KISUMU CCGCCCACGGACGGCACTATCTGGAGCTGGGCCTCAACACGTCCTTCGTCGGTCGGGGCCCACGGTTGAGGCAGTGTGCC YAO

2240 F K K Y L P Q L V A A T S

KISUMU TTCTGGAAGAAGTACCTTCCCCAGCTAGTTGCAGCTACCTGTAAGTCTCGT-GCAGCGCTTGAAATCCTCTCCCGCATCC YAO A — T — T — A-GA C — C T G

2320 N L P G

KISUMU TCAACAGGGTCCAGGTTGCAATAACAAATGTATCTCTCTCTCTCTCACGTCTCTTTTCCCCAAAACAGCGAACCTACCAG YAO C—T A-A A

2400 P A P P S E P C E S S A F F Y R P D L I V L L V S L

KISUMU GGCCAGCACCGCCCAGTGAACCGTGCGAAAGCAGCGCATTTTTTTACCGACCTGATCTGATCGTGCTGCTGGTGTCGCTG YAO

2480 L T A T V R F I Q *

KISUMU CTTACGGCGACCGTCAGATTCATACAATAATTACTACCCCATCCATGGCCTAGTTCTTTTAAGCTTTAAGATAGTGAGGA YAO G •

KISUMU ACAAATTTTTCCTAACCAATTTCCCAACCCCCTTTAGAGCAGAACCGAGGGAGAGATAGGACT

YAO

Figure 9B 12/14

ιo- 1(T 10⁴ 10^"2

Figure 10

13 / 14

An Gambiae C. pipiens An. albimanus

FIGURE 11

Test d'inhibition par le propoxur

moustiques

FIGURE 12 14/14

An gam S CÇGGGCGCGACCATGTGGAACCCGAACACGCCCCTGTCCGAGGACTGTCTGTACATTAACGTGGTGGCACCGCGACCCCG

An gam R •--- ' G

C pip S G—C A—G—C—G C C-TG—A—G A-

C pip R , ' A C—G C C-TG—AA-G—G&-

An alb S • G—« T A—T A—C—G C C G A-G—A—

An alb R G TT A—T A—C—G C C G A-G— ~

An gam S ACCGGGCGCTTGCGTCGGAGGAGA&CGTGATCGT

An gam R 1

C pip S -T A G—C- ~ ^,_—.--.

C pip R -T A G—C " —-—•

An alb S C—C-- & Ts

An alb R C—C ^*-&• T

FIGURE 13

>An. albi. "S"

CCGGGGGCGACTATGTGGAACCCAAATACGCCACTCTCGGAGGACTGCCTGTACATCAACGTGGTGGCGCCGAGGCCACGGCCCA AGAATGCTGCCGTCATGCTGTGGATCTTCGGCGGTGGCTTCTACTCCGGTACGGCCACACTGGACGTGTACGATCACCGGGCGCT CGCCTCGGAAGAGAACGTTATCGT

>An. albi. "R"

CCGGGGGCGACTATGTGGAACCCAAATACGCCACTCTCGGAGGACTGCCTGTACATCAACGTGGTGGCGCCGAGGCCACGGCCCA AGAATGCTGCCGTCATGCTGTGGATCTTCGGCGGTAGCTTCTACTCCGGTACGGCCACACTGGACGTGTACGATCACCGGGCGCT CGCCTCGGAAGAGAACGTTATCGT

FIGURE 14

Priority Applications (4)

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