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WO1999055309A1 - Nouvelles microspheres a base de poly(methylidene malonate), leur procede de preparation et compositions pharmaceutiques les contenant - Google Patents

Nouvelles microspheres a base de poly(methylidene malonate), leur procede de preparation et compositions pharmaceutiques les contenant Download PDF

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WO1999055309A1
WO1999055309A1 PCT/FR1999/001005 FR9901005W WO9955309A1 WO 1999055309 A1 WO1999055309 A1 WO 1999055309A1 FR 9901005 W FR9901005 W FR 9901005W WO 9955309 A1 WO9955309 A1 WO 9955309A1
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WO
WIPO (PCT)
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microspheres
preparation
poly
solution
support material
Prior art date
Application number
PCT/FR1999/001005
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English (en)
Inventor
Nicole Bru-Magniez
Catherine Le Visage
Elias Fattal
Patrick Couvreur
Pascal Breton
Original Assignee
Virsol
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Publication date
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Priority to SK1631-2000A priority patent/SK16312000A3/sk
Priority to PL99343687A priority patent/PL343687A1/xx
Priority to EP99915856A priority patent/EP1082104A1/fr
Priority to KR1020007011937A priority patent/KR20010043060A/ko
Priority to AU34288/99A priority patent/AU752644B2/en
Priority to HU0101649A priority patent/HUP0101649A3/hu
Priority to US09/673,255 priority patent/US6440461B1/en
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Definitions

  • New microspheres based on polyfmethylidene malonate their preparation process and pharmaceutical compositions containing them.
  • the present invention relates to new microspheres in particular useful in the pharmaceutical field as particulate vectors intended for the transport of biologically active substances, in particular hydrophilic substances (peptides or proteins), for oral administration.
  • biologically active substances in particular hydrophilic substances (peptides or proteins)
  • the invention also relates to a process for manufacturing these microspheres and to pharmaceutical compositions containing them.
  • microspheres is intended to denote substantially spherical particles, with an average diameter of between 1 ⁇ m and 100 ⁇ m, and preferably between 5 and 100 ⁇ m formed from a continuous network, more or less dense, of a support material.
  • microspheres are different from microcapsules which consist of a wall surrounding a cavity. It should however be noted that the microspheres prepared in multiple emulsion can comprise a set of globules dispersed in the continuous network constituting them.
  • the total volume of these globules will generally represent a fraction between 1:20 and 1: 2 of the total volume of the microspheres.
  • particulate polymer systems can be used to modify the release profile of a therapeutically active substance.
  • microspheres based on synthetic polymers such as, for example, poly (lactic acid), poly (lactic-co-glycolic acid), polystyrene, polyepsilonecaprolactone, polymethylmethacrylate, or even methylcellulose or ethylcellulose have been prepared, by various techniques.
  • synthetic polymers such as, for example, poly (lactic acid), poly (lactic-co-glycolic acid), polystyrene, polyepsilonecaprolactone, polymethylmethacrylate, or even methylcellulose or ethylcellulose have been prepared, by various techniques.
  • microspheres thus obtained are generally non-biodegradable, and when they are, they are characterized by a degradation very delayed in time.
  • the degradation is not progressive and occurs all at once after a significant time interval.
  • lactic polymers degrade, releasing strongly acidic products which not only cause the autocatalysis of the degradation of the polymer, but are at the origin of the induction of incompatibilities with the encapsulated substances.
  • the microspheres exhibit an extremely low degradation rate, or even zero.
  • the persistence time in the body of such particles can limit the repeated application in humans.
  • microspheres are characterized, for the most part, by a significant hydrophobicity which promotes strong and often denaturing interactions with the substance to be encapsulated, in particular when the latter is of protein or peptide nature.
  • the present application relates to microspheres consisting of a continuous network of a support material in which a substance is optionally dispersed, characterized in that said support material contains at least 70% by weight of a homopolymer consisting of repeating units corresponding to the following general formula (I):
  • R represents an alkyl group having from 1 to 6 carbon atoms or a group (CH 2 ) m - COOR 3 in which m is an integer between 1 and 5 and R 3 represents an alkyl group having from 1 to 6 carbon atoms;
  • R_ represents an alkyl group having from 1 to 6 carbon atoms
  • - n is an integer between 1 and 5.
  • microspheres can induce a stimulation of the immune response, when they are associated with an antigen
  • This polymeric material is essentially formed of a homopolymer consisting of recurring units of general formula (I).
  • Such polymers have the remarkable property of being biocompatible and bioerodible, that is to say that they are capable of degrading chemically or biochemically, by cutting the lateral substituents.
  • the erosion rate of the microspheres according to the invention being dependent on the molecular weight of the support material, it can therefore be modulated simply, by using a support material having a molecular weight adapted to the desired erosion rate.
  • microspheres according to the present invention therefore exhibit a modulated and progressive bioerosion allowing, for example, the transport of a biologically active substance, dispersed in the support material, to the place in the body where its action will be most effective. .
  • the bioerosion of microspheres also prevents their accumulation in the body; their use is therefore no longer limited.
  • the above-mentioned homopolymer consists of repeating units corresponding to the general formula (I) in which: R represents an alkyl group having from 1 to 6 carbon atoms; R 2 represents an alkyl group having from 1 to 6 carbon atoms; and n is a number equal to 1; and preferably in which R, and R_ represent a CH 2 -CH 3 group .
  • polymers from the poly (methylidene-malonate) family are particularly suitable for the encapsulation of substances hydrophilic, in particular of biological origin, and possibly biologically active.
  • biologically active molecule means without limitation any molecule having a prophylactic or curative biological activity, in vitro or in vivo, in particular an anti-infectious agent, in particular an antiseptic, antibiotic, antiviral, antiparasitic or antimitotic agent, especially anticancer.
  • Antibiotic or antiseptic agents which can be used can be, for example, rifampicin and colistin.
  • antiviral agents non-limiting mention may be made of didanosine, ribavirin, zidovudine, acyclovir, ganciclovir, foscarnet, vidarabine and zalcitabine.
  • the support material for the microspheres contains:
  • a copolymer comprising at least one block having a hydrophilic character and at least one block having a hydrophobic character, said block of hydrophobic character preferably comprising at least one repeating unit corresponding to the general formula (I).
  • the hydrophilic block of the abovementioned copolymer is chosen from a poly (oxyethylene), a poly (vinyl alcohol), a poly (vinylpyrrolidone), a poly (N-2-hydroxypropyl methacrylamide), a poly (hydroxyethylmethacrylate), a poly hydrophilic (amino acid) such as a polylysine, a polysaccharide, and will preferably be a poly (oxyethylene).
  • the copolymer may have a block structure, preferably diblock or triblock, or a grafted structure.
  • the addition of such copolymers in the support material makes it possible to obtain a homogeneous dispersion of the substance to be encapsulated inside each of the microspheres. It also makes it possible to modulate the hydrophilicity / hydrophobicity ratio of the surface of the microspheres, which makes it possible to avoid or limit the strong and often denaturing interactions with the substance to be encapsulated.
  • these copolymers are particularly advantageous for the implementation of the currently preferred process for preparing the microspheres as will be explained in more detail later.
  • microspheres in accordance with the present invention can be obtained by implementing a process comprising:
  • This multiple emulsion can be obtained in a conventional manner by dispersing a primary emulsion of the water-in-oil type in a second aqueous phase containing a stabilizing agent. This multiple emulsion can also be obtained by a process
  • the present invention relates to a process for obtaining microspheres as previously described, comprising: a) the preparation of a first solution of the above-mentioned polymer (s) constituting the support material in a volatile organic solvent optionally containing a surfactant, b) the preparation of a second solution immiscible with the solution obtained in a), optionally containing said substance to be dispersed and optionally a surfactant, c) the preparation of a primary emulsion by dispersion of the second solution in the first solution, the continuous phase consisting of the solution of polymer (s), d) the preparation of a secondary emulsion: - either by dispersing, under stirring, the primary emulsion obtained in c) in a dispersing medium immiscible with said primary emulsion, said dispersing medium optionally containing a stabilizing agent;
  • the aforementioned method further comprises: f) isolation of the microspheres by centrifugation g) one or more successive washings of said microspheres h) lyophilization of said microspheres.
  • the first step of the process for preparing the microspheres according to the invention therefore comprises the production of an emulsion of the water-in-oil type preferably in the presence of an appropriate surfactant, the oily or organic phase containing the or polymers intended to constitute the support material of said microspheres.
  • a solution of the polymer (s) constituting the support material is prepared using an appropriate volatile organic solvent optionally in the presence of a surfactant.
  • preformed polymers will be used insofar as the homopolymers essentially constituting the support material for the microspheres can be obtained under conditions allowing good characterization in terms of molar mass and mass dispersity.
  • Homopolymers made up of repeating units corresponding to general formula (I) can be prepared from monomers, for example, by following the process described in patent EP 283 346 corresponding to patents US 4,931,584 and US 5,142,098 incorporated here. by reference, said monomers being generally degassed under a vane pump vacuum to constant weight to remove the polymerization inhibitor (SO 2 ).
  • These homopolymers will however advantageously be prepared anionically in an aprotic medium, for example by dispersion of the monomer in acetone, followed by the addition of sodium hydroxide with stirring, again followed by evaporation of the acetone and drying of the polymer thus got.
  • Other aprotic organic solvents such as acetonitrile, dioxane and tetrahydrofuran can be used in place of acetone.
  • the molecular mass of the homopolymer capable of being obtained by the implementation of this process can be perfectly controlled by a judicious choice of the conditions of implementation, and in particular of the concentration of monomer in the organic phase, of the pH and the molarity of the polymerization initiator (sodium hydroxide).
  • homopolymers having an average molar mass of 1,000 to 100,000, and preferably 5,000 to 80,000 will be used in the context of the present invention.
  • the volatile organic solvent capable of being used for the preparation of the first solution containing the polymer or polymers constituting the support material will generally be chosen so that its boiling point is lower than that of water. This solvent can therefore be easily removed during the final evaporation step, allowing precipitation of the polymer.
  • Ethyl acetate is a particularly suitable volatile organic solvent for this purpose.
  • the surfactants capable of being used for the stabilization of the primary emulsion can be of various nature and will be added to the organic phase containing the polymer (s) (first solution) and / or to the aqueous phase ( second solution) constituting the dispersed phase.
  • This can be for example a poloxamer such as the product sold under the name Pluronic ® F68, or even an alcohol
  • (R) poly vinyl such as the product sold under the name Mowiol 40-88, or else a polysorbate, or even a surfactant copolymer whose hydrophobic sequence has a chemical nature identical to that of homopolymer consisting of recurring units corresponding to the general formula (I). It has been shown that such surface-active copolymers and in particular the copolymers of poly (methylidene malonate) and of polyoxyethylene are particularly advantageous insofar as they allow, on the one hand, to obtain a very stable primary emulsion and on the other hand, to obtain a good anchoring of the surfactant in the matrix after evaporation of the solvent.
  • surfactant copolymers can be prepared by conventional polymerization techniques well known to those skilled in the art. Among these techniques, use will preferably be made of anionic polymerization, radical polymerization, or else the technique of coupling the precursor sequences of the copolymer, these sequences having previously been functionally functionalized at the end of the chain.
  • the anionic polymerization is more particularly suitable for the preparation of block copolymers.
  • a block copolymer can thus be obtained:
  • the initiating agents capable of being used in the context of these anionic polymerizations will generally be:
  • organometallic derivatives such as butyllithium and in particular diphenylhexyllithium;
  • alcoholates and in particular macromolecular alcoholates such as a POE alcoholate which can be generated by activation of a hydroxy function using cumylpotassium, diphenylmethylpotassium, naphthalene potassium.
  • the anionic polymerization will generally be carried out in a solvent compatible with the various blocks of the copolymer.
  • the block copolymers will preferably be prepared by successive anionic polymerization of the ethylene oxide followed by methylidene malonate or by activation of a polyoxyethylenated precursor commercial monohydroxylate and subsequent anionic polymerization of the poly (methylidene malonate) sequence.
  • tetrahydrofuran will preferably be used as the polymerization solvent, this product making it possible to work in a homogeneous medium and favorably influencing the polymerization kinetics.
  • the monomers used for the preparation of the hydrophilic blocks will generally be commercial products.
  • the coupling technique is also more particularly suitable for the preparation of block copolymers.
  • This reaction is generally carried out from presynthesized and functionalized homopolymers, in the presence of a coupling agent and optionally an activating agent, in an appropriate solvent.
  • the homopolymer of poly (oxyethylene) functionalized with an ⁇ -carboxy group can be obtained for example by transformation with succinic anhydride of a poly (oxyethylene) functionalized with a commercial ⁇ -hydroxy group.
  • the homopolymer of poly (methylidene malonate) functionalized with an ⁇ -hydroxy group can be obtained directly by anionic synthesis in an aqueous medium or by anionic synthesis in a solvent using an aqueous sodium hydroxide solution as initiator of the polymerization.
  • DCCI dicyclohexylcarbodiimide
  • Radical polymerization is more particularly suitable for the preparation of graft copolymers.
  • This polymerization is generally carried out from a macromonomer, that is to say from an oligomer carrying at one of its ends an ethylenic group which can be polymerized by radical means and capable of reacting with a monomer to form a copolymer with grafted structure .
  • This polymerization will generally be carried out in the presence of an initiator in an appropriate solvent.
  • Such a product may be commercial (Aldrich) and will consist, for example, of a poly (oxyethylene) chain with a molar mass of between 308 and 440 g / mol, or will be prepared from a commercial poly (ethylene glycol) monomethyl ether by coupling with methacrylic acid in dichloromethane to form a methoxy terminal function.
  • copolymers with grafted structures can also be prepared by transesterification of a poly (oxyethylene) monomethyl ether on side ester chains of a pre-synthesized poly (methylidene malonate). This transesterification will generally be carried out with alcohol in the presence of a catalyst at high temperature.
  • Copolymers whose total molecular weight of the hydrophobic blocks is between 1,000 and 80,000 g / mol, and preferably between 1,000 and 50,000 g / mol are particularly suitable in the context of the present invention.
  • the primary emulsion used for the preparation of the microspheres according to the invention can be obtained by means of a shearing homogenizer, for example of the Ultraturrax type (13,500 rpm - 5 min).
  • the substance to be encapsulated is generally added to the dispersed aqueous phase of the primary emulsion. 11 5309 PCT / FR99 / 01005
  • the second step of the process for preparing the microspheres in accordance with the invention comprises the preparation of a secondary emulsion:
  • the dispersing medium which is immiscible with the primary emulsion is an aqueous phase into which the primary emulsion is preferably introduced drop by drop and the emulsion is also produced for example using a homogenizer of the Ultraturrax type ( 8,000 rpm; 5 mins).
  • Polyvinyl alcohol constitutes a stabilizing agent which is particularly suitable for the preparation of the secondary emulsion.
  • this second step can be followed by an additional step of displacement of the organic solvent.
  • the third essential step of the process for preparing the microspheres in accordance with the invention consists in evaporating the volatile organic solvent which was used for the preparation of the solution of the polymer (s). In the particular case where this solvent is ethyl acetate, this evaporation takes place for a period of approximately 12 hours at room temperature, with mechanical stirring (1,400 rpm).
  • these microspheres will have an average diameter of between 1 ⁇ m and 100 ⁇ m, preferably between 5 ⁇ m and 50 ⁇ m for their application as vectors in the pharmaceutical field.
  • the microspheres obtained at the end of the third step will be isolated by centrifugation, washed and possibly lyophilized.
  • the present invention also relates to pharmaceutical compositions containing the microspheres which have just been described. These compositions will generally be suitable for a 12 5309 PCT / FR99 / 01005
  • oral administration and will be presented, for example, in the form of tablets, capsules, powders or granules.
  • PMM 2.1.2 polymer consisting of recurring monomer units corresponding to the formula
  • microspheres thus obtained have an average diameter of 6 microns and 14.2% of the ovalbumin used in the preparation are encapsulated in the microspheres of PMM 2.1.2, which corresponds to an encapsulation of 2.5% (w / w).
  • This preparation is administered orally to C3H mice at a dose of 100 micrograms of encapsulated ovalbumin (per mouse and per day) for 5 consecutive days. The last force-feeding takes place 7 days before the 14 55309 PCT / FR99 / 01005
  • a POE-PMM 2.1.2 block copolymer was used. This copolymer was obtained by successive polymerization of the two monomers, starting with the preparation of the POE block, by the implementation of the following experimental protocol.
  • the reactor in which the polymerization is carried out 250 ml is connected to a vacuum ramp allowing to work under high vacuum and to get rid of protic impurities.
  • the solvent (THF, 150 ml) purified of any trace of moisture is cryodistilled in the reactor at -70 ° C.
  • the initiator (potassium Terbutanolate (0.1N / THF); 10 ml) is then added using a syringe through a septum.
  • the ethylene oxide (5 g) is then introduced by cryodistillation.
  • the polymerization is carried out at room temperature for 48 hours. After this period, a sample makes it possible to control, by gel permeation chromatography, the molar mass (4,000 g / mol) and the polymolecularity index (1.13) of the first sequence.
  • the MM 2.1.2 (0.5 ml) freshly degassed under vacuum to remove the SO 2 used as a polymerization inhibitor, is then added quickly and all at once at room temperature. 15 5309 PCT / FR99 / 01005
  • the copolymer is deactivated by adding methanol and precipitated in diethyl ether.
  • the procedure described in example 1 is followed, but the ovalbumin (60 mg) is replaced by 2 mg of the peptide V3 28 of the V3 BRU loop of HIV gp 120 (sequence NNTRKSIHI GPGRAFYATGDIIGDIRQA).
  • the microspheres obtained have an average size of 5.8 microns and 70% of the V3 28 peptide used is encapsulated in the microspheres, which corresponds to an encapsulation of 0.48% w / w.
  • the study carried out in scanning electron microscopy reveals smooth and spherical particles.
  • the procedure is as in Example 4, but Pluronic F 68 is added to the aqueous phase containing the peptide at a concentration of 2%.
  • the microspheres obtained have a size of 7.0 microns and 70% of the V3 28 peptide used is encapsulated in the microspheres.
  • Example 2 The procedure is as in Example 1, but the internal aqueous phase consists of 1 ml of 0.5M acetic acid containing 3 mg of type IL collagen.
  • the microspheres thus obtained have an average diameter of 6 microns and 66.6% of the collagen put in in the preparation are encapsulated in the microspheres of PMM2.1.2, which corresponds to an encapsulation of 0.7% (w / w).
  • Example 2 The procedure is as in Example 1, but the internal aqueous phase consists of 1 ml of distilled water.
  • the microspheres thus obtained do not contain a biologically active substance. Their average diameter is 7.0 microns.
  • Example 2 The procedure described in Example 1 is followed, but the ovalbumin (60 mg) is replaced by the plasmid pCDNA3 (5 mg).
  • the microspheres obtained have an average size of 7 ⁇ m and 9.8% of plasmid used are encapsulated in the microspheres which corresponds to an encapsulation of 0.17% (w / w).
  • microspheres thus obtained have an average diameter of 7 ⁇ m and 12% of the plasmid used are encapsulated in the microspheres which corresponds to an encapsulation of 0.22% (w / w).
  • Example 2 The procedure described in Example 1 is followed, but the ovalbumin (60 mg) is replaced by the oligonucleotide (pdT16) (2 mg).
  • the microspheres obtained have an average size of 4.8 ⁇ m and 20.6% of oligonucleotide used are encapsulated in the microspheres which corresponds to an encapsulation of 0.19% (w / w).
  • microspheres obtained have an average diameter of 5.7 ⁇ m and 23% of oligonucleotide used are encapsulated in the microspheres which corresponds to an encapsulation of 0.21% (w / w).

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Abstract

La présente invention a pour objet de nouvelles microsphères notamment utiles dans le domaine pharmaceutique comme vecteurs particulaires destinés au transport de substances biologiquement actives, en particulier de substances hydrophiles, en vue d'une administration orale. Selon l'invention, ces microsphères sont constituées d'un réseau continu d'un matériau support dans lequel est éventuellement dispersée une substance, ledit matériau support contenant au moins 70 % en poids d'un homopolymère constitué d'unités récurrentes répondant à la formule générale (I), dans laquelle; R1 représente un groupe alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ou un groupe (CH2)m - COOR3 dans lequel m est un nombre entier compris entre 1 et 5 et R3 représente un groupe alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone; R2 représente un groupe alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone; et n est un nombre entier compris entre 1 et 5. Application: domaine pharmaceutique.

Description

Nouvelles microsphères à base de polyfméthylidène malonate). leur procédé de préparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
La présente invention a pour objet de nouvelles microspheres notamment utiles dans le domaine pharmaceutique comme vecteurs particulaires destinés au transport de substances biologiquement actives, en particulier de substances hydrophiles (peptides ou protéines), en vue d'une administration orale.
L'invention a également pour objet un procédé de fabrication de ces microsphères et des compositions pharmaceutiques les contenant.
Dans le cadre de la présente description, on entend désigner par le terme "microsphères" des particules sensiblement sphériques, d'un diamètre moyen compris entre 1 μm et 100 μm, et de préférence entre 5 et 100 μm formées d'un réseau continu, plus ou moins dense, d'un matériau support.
Ces microsphères se différencient des microcapsules qui sont constituées d'une paroi entourant une cavité. Il est cependant à noter que les microsphères préparées en émulsion multiple peuvent comporter un ensemble de globules dispersés dans le réseau continu les constituant.
Dans ce dernier cas, le volume total de ces globules représentera généralement une fraction comprise entre 1 : 20 et 1 : 2 du volume total des microsphères. Au cours des dernières années, de nombreuses études ont permis de montrer que des systèmes particulaires à base de polymères peuvent être utilisés pour modifier le profil de libération d'une substance thérapeutiquement active.
C'est ainsi que des microsphères à base de polymères synthétiques, comme par exemple, de poly(acide lactique), de poly(acide lactique-co- glycolique), de polystyrène, de polyepsilonecaprolactone, de polyméthylméthacrylate, ou encore à base de méthylcellulose ou d'éthylcellulose ont été préparées, par des techniques variées.
Cependant, les microspheres ainsi obtenues sont généralement non biodégradables, et lorsqu'elles le sont, elles se caractérisent par une dégradation très retardée dans le temps.
Ainsi, dans le cas des microsphères à base d'acide poly(lactique), par exemple, la dégradation n'est pas progressive et se produit en une seule fois après un intervalle de temps important.
En outre, les polymères lactiques se dégradent en libérant des produits fortement acides qui, non seulement entraînent l'autocatalyse de la dégradation du polymère, mais sont à l'origine de l'induction d'incompatibilités avec les substances encapsulées.
Dans le cas des autres polymères utilisés, les microsphères présentent une vitesse de dégradation extrêmement faible, voire nulle. Le temps de rémanence dans l'organisme de telles particules peut en limiter l'application répétée chez l'homme.
Enfin, les microsphères connues se caractérisent, pour la plupart, par une hydrophobicité importante qui favorise des interactions fortes et souvent dénaturantes avec la substance à encapsuler, en particulier lorsque cette dernière est de nature protéinique ou peptidique.
Il a été découvert, et ceci constitue le fondement de la présente invention, qu'il était possible de réaliser de nouvelles microsphères qui permettent de remédier aux inconvénients des microsphères de l'état de la technique.
Ainsi, selon un premier aspect, la présente demande a pour objet des microsphères constituées d'un réseau continu d'un matériau support dans lequel est éventuellement dispersée une substance, caractérisées en ce que ledit matériau support contient au moins 70 % en poids d'un homopolymère constitué d'unités récurrentes répondant à la formule générale (I) suivante :
COOR1
— CH.
COO — (CH2)n— COOR2
dans laquelle :
- R, représente un groupe alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ou un groupe (CH2)m - COOR3 dans lequel m est un nombre entier compris entre 1 et 5 et R3 représente un groupe alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ;
- R_ représente un groupe alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ; et
- n est un nombre entier compris entre 1 et 5.
Il a été montré qu'en raison de la nature chimique des polymères formant leur matrice, ces nouvelles microsphères :
- présentent une cinétique de dégradation progressive et modulée ; - permettent d'encapsuler avec une grande efficacité des substances hydrophiles, notamment d'origine biologique ;
Il a en outre été observé, d'une façon tout à fait surprenante et inattendue, que ces microsphères : - peuvent induire une stimulation de la réponse immunitaire, lorsqu'elles sont associées à un antigène ;
- permettent, dans certains cas, la suppression de réactions pathologiques d'hypersensibilité (induction d'une tolérance), lorsqu'elles sont administrées par voie orale. C'est donc la nature du matériau polymérique formant la matrice des microsphères qui constitue l'originalité de la présente invention.
Ce matériau polymérique est essentiellement formé d'un homopolymère constitué d'unités récurrentes de formule générale (I).
De tels polymères présentent la propriété remarquable d'être biocompatibles et bioérodables, c'est à dire qu'ils sont susceptibles de se dégrader par voie chimique ou biochimique, par coupure des substituants latéraux.
La vitesse d'érosion des microsphères conformes à l'invention étant dépendante du poids moléculaire du matériau support, elle peut donc être modulée simplement, en utilisant un matériau support ayant un poids moléculaire adapté à la vitesse d'érosion désirée.
Les microsphères selon la présente invention présentent donc une bioérosion modulée et progressive permettant, par exemple, le transport d'une substance biologiquement active, dispersée dans le matériau support, jusqu'à l'endroit de l'organisme où son action sera la plus efficace. La bioérosion des microspheres évite également leur accumulation dans l'organisme ; leur utilisation n'est donc plus limitée.
Selon une caractéristique particulière, l'homopolymère précité est constitué d'unités récurrentes répondant à la formule générale (I) dans laquelle : R, représente un groupe alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ; R2 représente un groupe alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ; et n est un nombre égal à 1 ; et de préférence dans laquelle R, et R_ représentent un groupement CH2-CH3.
Ces différents types de polymères de la famille des poly(méthylidène- malonate) conviennent particulièrement à l'encapsulation de substances hydrophiles, notamment d'origine biologique, et éventuellement biologiquement actives.
Par "molécule biologiquement active", on entend de manière non limitative toute molécule ayant une activité biologique prophylactique ou curative, in vitro ou in vivo, notamment un agent anti-infectieux, en particulier un agent antiseptique, antibiotique, antiviral, antiparasitaire ou antimitotique, notamment anticancéreux.
Des agents antibiotiques ou antiseptiques utilisables peuvent être par exemple la rifampicine et la colistine. A titre d'exemples d'agents antiviraux, on peut citer de manière non limitative la didanosine, la ribavirine, la zidovudine, l'acyclovir, le ganciclovir, le foscarnet, la vidarabine et la zalcitabine.
Le cis-plastine et le taxol peuvent par exemple être utilisés en tant qu'agents anticancéreux. Selon un mode de réalisation actuellement préféré de l'invention, le matériau support des microsphères contient :
- de 90 % à 99,5 % en poids d'un homopolymère tel que défini précédemment ; et
- de 0,5 % à 10 % en poids d'un copolymère comportant au moins une séquence présentant un caractère hydrophile et au moins une séquence présentant un caractère hydrophobe, ladite séquence à caractère hydrophobe comprenant de préférence au moins une unité récurrente répondant à la formule générale (I).
Avantageusement, la séquence à caractère hydrophile du copolymère précité est choisie parmi un poly(oxyéthylène), un poly(alcoolvinylique), une poly(vinylpyrrolidone), un poly(N-2-hydroxypropyl méthacrylamide), un poly(hydroxyéthylméthacrylate), un poly(amino acide) hydrophile tel qu'une polylysine, un polysaccharide, et sera de préférence un poly(oxyéthylène).
Le copolymère peut avoir une structure à blocs, de préférence di-blocs ou tri-blocs, ou une structure greffée. L'addition de tels copolymères dans le matériau support permet d'obtenir une dispersion homogène de la substance à encapsuler à l'intérieur de chacune des microsphères. Elle permet également de moduler le rapport hydrophilie/hydrophobie de la surface des microsphères, ce qui permet d'éviter ou de limiter les interactions fortes et souvent dénaturantes avec la substance à encapsuler.
En outre, ces copolymères, dont la nature chimique de la séquence hydrophobe est identique à celle de l'homopolymère constituant pour l'essentiel les microsphères, sont particulièrement avantageux pour la mise en oeuvre du procédé actuellement préféré de préparation des microsphères comme cela sera expliqué plus en détail par la suite.
D'une façon générale, les microsphères conformes à la présente invention peuvent être obtenues par la mise en oeuvre d'un procédé comportant :
- la préparation d'une émulsion multiple à trois phases, dont la phase intermédiaire est constituée d'une solution du ou des polymères constituant le matériau support dans un solvant organique volatil, et
- l'évaporation dudit solvant organique, dans des conditions permettant de provoquer la précipitation du polymère autour des gouttelettes constituant la phase interne.
Cette émulsion multiple peut être obtenue de façon classique en dispersant une émulsion primaire du type eau-dans-huile dans une seconde phase aqueuse contenant un agent stabilisant. Cette émulsion multiple peut également être obtenue par un procédé
"inverse" consistant à verser une solution aqueuse dans une émulsion primaire de type eau-dans-huile. D'une façon tout à fait inattendue, ce procédé "inverse" a permis d'obtenir des résultats tout à fait remarquables parfois même meilleurs que ceux obtenus par la technique classique précitée. Ainsi, selon un deuxième aspect, la présente invention concerne un procédé d'obtention de microsphères telles que précédemment décrites, comprenant : a) la préparation d'une première solution du ou des polymère(s) précité(s) constituant le matériau support dans un solvant organique volatil contenant éventuellement un agent tensio-actif, b) la préparation d'une seconde solution non miscible avec la solution obtenue en a), contenant éventuellement ladite substance à disperser et éventuellement un agent tensio-actif, c) la préparation d'une émulsion primaire par dispersion de la seconde solution dans la première solution, la phase continue étant constituée par la solution de polymère(s), d) la préparation d'une émulsion secondaire : - soit en dispersant, sous agitation, l'émulsion primaire obtenue en c) dans un milieu dispersant non miscible avec ladite émulsion primaire, ledit milieu dispersant contenant éventuellement un agent stabilisant ;
- soit en versant sous agitation, dans ladite émulsion primaire, une solution constituée d'un milieu non miscible avec ladite émulsion primaire, ledit milieu contenant éventuellement un agent stabilisant, e) l'évaporation dudit solvant organique sous agitation.
Selon une caractéristique particulière de l'invention, le procédé précité comprend en outre : f) l'isolation des microsphères par centrifugation g) un ou plusieurs lavages successifs desdites microsphères h) la lyophilisation desdites microsphères.
La première étape du procédé de préparation des microsphères conforme à l'invention comporte donc la réalisation d'une émulsion de type eau-dans-huile de préférence en présence d'un agent tensio-actif approprié, la phase huileuse ou organique contenant le ou les polymères destinés à constituer le matériau support desdites microsphères.
Dans un premier temps, une solution du ou des polymère(s) constituant le matériau support est préparée à l'aide d'un solvant organique volatil approprié éventuellement en présence d'un agent tensio-actif. Avantageusement, on utilisera dans cette étape, des polymères préformés dans la mesure où les homopolymères constituant pour l'essentiel le matériau support des microsphères peuvent être obtenus dans des conditions permettant une bonne caractérisation en terme de masse molaire et de dispersité en masse.
Les homopolymères constitués d'unités récurrentes répondant à la formule générale (I) peuvent être préparés à partir de monomères, par exemple, en suivant le procédé décrit dans le brevet EP 283346 correspondant aux brevets US 4 931 584 et US 5 142 098 incorporés ici par référence, lesdits monomères étant généralement dégazés sous vide de pompe à palettes jusqu'à poids constant pour éliminer l'inhibiteur de polymérisation (SO2). Ces homopolymères seront cependant avantageusement préparés par voie anionique en milieu aprotique, par exemple par dispersion du monomère dans l'acétone, suivie de l'ajout de soude sous agitation, encore suivie de l'évaporation de l'acétone et du séchage du polymère ainsi obtenu. D'autres solvants organiques aprotiques tels que l'acétonitrile, le dioxane et le tétrahydrofurane peuvent être utilisés en lieu et place de l'acétone.
La masse moléculaire de l'homopolymère susceptible d'être obtenu par la mise en oeuvre de ce procédé peut être parfaitement maîtrisée par un choix judicieux des conditions de mise en oeuvre, et en particulier de la concentration en monomère dans la phase organique, du pH et de la molarité de l'amorceur de polymérisation (soude).
D'une façon générale, on utilisera dans le cadre de la présente invention des homopolymères présentant une masse molaire moyenne de 1.000 à 100.000, et de préférence de 5.000 à 80.000. Le solvant organique volatil susceptible d'être utilisé pour la préparation de la première solution contenant le ou les polymères constituant le matériau support sera généralement choisi de telle sorte que son point d'ébullition soit inférieur à celui de l'eau. Ce solvant pourra donc être éliminé facilement lors de l'étape finale d'évaporation en permettant la précipitation du polymère. L'acétate d'éthyle constitue un solvant organique volatil particulièrement approprié à cet effet.
Les tensio-actifs susceptibles d'être utilisés pour la stabilisation de l'émulsion primaire peuvent être de nature variée et seront ajoutés à la phase organique contenant le(s) polymère(s) (première solution) et/ou à la phase aqueuse (seconde solution) constituant la phase dispersée.
Il peut s'agir par exemple d'un poloxamer tel que le produit commercialisé sous la dénomination Pluronic® F68, ou bien encore d'un alcool
(R) poly vinylique tel que le produit commercialisé sous la dénomination Mowiol 40- 88, ou bien encore d'un polysorbate, ou bien encore d'un copolymère tensio-actif dont la séquence hydrophobe présente une nature chimique identique à celle de l'homopolymère constitué d'unités récurrentes répondant à la formule générale (I). Il a été montré que de tels copolymères tensio-actifs et en particulier les copolymères de poly(méthylidène malonate) et de polyoxyéthylène sont particulièrement avantageux dans la mesure où ils permettent d'une part, d'obtenir une émulsion primaire très stable et d'autre part, d'obtenir un bon ancrage du tensio-actif dans la matrice après évaporation du solvant.
Les copolymères tensio-actifs précités peuvent être préparés par des techniques de polymérisation classiques bien connues de l'homme de métier. Parmi ces techniques, on utilisera de préférence la polymérisation par voie anionique, la polymérisation par voie radicalaire, ou encore la technique de couplage des séquences précurseurs du copolymère, ces séquences ayant été au préalable fonctionnalisées en bout de chaîne de façon adéquate.
La polymérisation par voie anionique convient plus particulièrement à la préparation de copolymères à blocs.
Elle comporte l'addition séquentielle des monomères et permet d'obtenir des copolymères de structure parfaitement définie, les quantités d'amorceurs et de monomères engagés permettant de contrôler le degré de polymérisation de chacune des séquences. Un copolymère à blocs peut être ainsi obtenu :
- soit par polymérisation anionique d'un premier monomère et réaction sur la chaîne en croissance d'un second monomère ;
- soit par activation d'un polymère précurseur qui servira d'amorceur à la polymérisation d'un second monomère. Les agents d'amorçage susceptibles d'être utilisés dans le cadre de ces polymérisations par voie anionique seront généralement :
- d'une part, les dérivés organométalliques comme le butyllithium et en particulier le diphénylhexyllithium ;
- d'autre part, des alcoolates et en particulier les alcoolates macromoléculaires tels qu'un alcoolate de POE qui peuvent être générés par activation d'une fonction hydroxy à l'aide de cumylpotassium, de diphénylméthylpotassium, de naphtalène potassium.
La polymérisation par voie anionique sera généralement réalisée dans un solvant compatible avec les diverses séquences du copolymère. Dans le cas où la séquence à caractère hydrophile est constituée d'un poly(oxyéthylène) et la séquence à caractère hydrophobe est constituée d'un poly(méthylidène malonate), les copolymères à blocs seront préparés de préférence par polymérisation anionique successive de l'oxyde d'éthylène puis du méthylidène malonate ou par activation d'un précurseur polyoxyéthyléné monohydroxylé commercial et polymérisation anionique subséquente de la séquence poly(méthylidène malonate).
D'une façon générale, on utilisera de préférence le tétrahydrofurane comme solvant de polymérisation, ce produit permettant de travailler en milieu homogène et influençant favorablement la cinétique de polymérisation.
Les monomères utilisés pour la préparation des séquences hydrophiles seront généralement des produits commerciaux.
La technique de couplage convient également plus particulièrement à la préparation de copolymères à blocs. Cette réaction est généralement réalisée à partir d'homopolymères présynthétisés et fonctionnalisés, en présence d'un agent de couplage et éventuellement d'un agent d'activation, dans un solvant approprié.
Dans le cas de la préparation des copolymères préférés selon l'invention, dont la séquence hydrophile est constituée d'un poly(oxyéthylène) et la séquence hydrophobe est constituée d'un poly(méthylidène malonate), on utilisera avantageusement un homopolymère du poly(oxyéthylène) fonctionnalisé par un groupement α-carboxy et un homopolymère du poly(méthylidène malonate) fonctionnalisé par un groupement α-hydroxy.
L'homopolymère du poly(oxyéthylène) fonctionnalisé par un groupement α-carboxy peut être obtenu par exemple par transformation par l'anhydride succinique d'un poly(oxyéthylène) fonctionnalisé par un groupement α-hydroxy commercial.
L'homopolymère du poly(méthylidène malonate) fonctionnalisé par un groupement α-hydroxy peut être obtenu directement par synthèse anionique en milieu aqueux ou par synthèse anionique dans un solvant en utilisant une solution aqueuse de soude comme amorceur de la polymérisation.
En tant qu'agent de couplage particulièrement adapté à cette polymérisation, on utilisera avantageusement le dicyclohexylcarbodiimide (DCCI). La réaction de couplage peut être éventuellement activée par catalyse basique et se déroulera généralement dans un solvant compatible avec les homopolymères, comme en particulier le dichlorométhane dans le cas particulier des copolymères préférés de l'invention. 10 5309 PCT/FR99/01005
La polymérisation par voie radicalaire convient plus particulièrement à la préparation de copolymères greffés.
Cette polymérisation est généralement réalisée à partir d'un macromonomère, c'est à dire d'un oligomère portant à l'une de ses extrémités un groupement éthylénique polymérisable par voie radicalaire et susceptible de réagir avec un monomère pour former un copolymère à structure greffée.
Cette polymérisation sera généralement réalisée en présence d'un amorceur dans un solvant approprié.
Dans le cas de la préparation des copolymères dont la séquence hydrophile est constituée d'un poly(oxyéthylène) divers macromomeres fonctionnalisés pourront être utilisés.
On préférera plus particulièrement utiliser un macromonomère de poly(oxyéthylène) fonctionnalisé par un groupement méthacryloyle.
Un tel produit peut être commercial (Aldrich) et sera constitué par exemple d'une chaîne de poly(oxyéthylène) de masse molaire comprise entre 308 et 440 g/mol, ou sera préparé à partir d'un poly(éthylèneglycol)monométhyléther commercial par couplage avec l'acide méthacrylique dans le dichlorométhane pour former une fonction terminale méthoxy.
On peut encore préparer un tel macromonomère par activation d'un poly(oxyéthylène) et réaction subséquente sur le chlorure de méthacryloyle.
Les copolymères à structures greffées peuvent également être préparés par transestérification d'un poly(oxyéthylène) monométhyléther sur des chaînes latérales esters d'un poly(méthylidène malonate) pré-synthétisé. Cette transestérification sera généralement réalisée avec de l'alcool en présence d'un catalyseur à température élevée.
Des copolymères dont la masse molaire totale des séquences à caractère hydrophobe est comprise entre 1.000 et 80.000 g/mol, et de préférence entre 1.000 et 50.000 g/mol conviennent particulièrement dans le cadre de la présente invention. D'une façon générale, l'émulsion primaire servant à la préparation des microsphères selon l'invention pourra être obtenue au moyen d'un homogénéisateur cisaillant par exemple de type Ultraturrax (13.500 tr/mn - 5 mn).
La substance à encapsuler est généralement additionnée à la phase aqueuse dispersée de l'émulsion primaire. 11 5309 PCT/FR99/01005
La deuxième étape du procédé de préparation des microsphères conformes à l'invention comprend la préparation d'une émulsion secondaire :
- soit en dispersant, sous agitation, l'émulsion primaire obtenue à la première étape dans un milieu dispersant non miscible avec ladite émulsion primaire, ledit milieu dispersant contenant éventuellement un agent stabilisant ;
- soit en versant sous agitation dans ladite émulsion primaire, une solution constituée d'un milieu non miscible avec ladite émulsion primaire, ledit milieu contenant éventuellement un agent stabilisant.
Généralement, le milieu dispersant non miscible avec l'émulsion primaire est une phase aqueuse dans laquelle l'émulsion primaire est introduite de préférence goutte à goutte et l'émulsion est également réalisée par exemple à l'aide d'un homogénéisateur du type Ultraturrax (8.000 tr/mn ; 5mn).
L'alcool polyvinylique constitue un agent stabilisant particulièrement approprié pour la préparation de l'émulsion secondaire. Eventuellement, cette deuxième étape peut être suivie d'une étape supplémentaire de déplacement du solvant organique.
La troisième étape essentielle du procédé de préparation des microsphères conformes à l'invention, consiste à évaporer le solvant organique volatil ayant servi à la préparation de la solution du ou des polymères. Dans le cas particulier où ce solvant est l'acétate d'éthyle, cette évaporation s'effectue pendant une durée d'environ 12 heures à température ambiante, sous agitation mécanique (1.400 tr/mn).
L'homme de métier choisira de façon appropriée les différentes conditions de mise en oeuvre de ces trois premières étapes essentielles du procédé conforme à la présente invention en fonction des caractéristiques physicochimiques et morphologiques des microsphères recherchées.
D'une façon générale, ces microsphères présenteront un diamètre moyen compris entre 1 μm et 100 μm, de préférence entre 5 μm et 50 μm pour leur application en tant que vecteurs dans le domaine pharmaceutique. D'une façon générale, les microsphères obtenues à l'issue de la troisième étape seront isolées par centrifugation , lavées et éventuellement lyophilisées.
Selon un troisième aspect, la présente invention concerne également des compositions pharmaceutiques contenant les microsphères qui viennent d'être décrites. Ces compositions seront généralement appropriées pour une 12 5309 PCT/FR99/01005
administration par voie orale et se présenteront par exemple sous la forme de comprimés, de gélules, de poudres ou de granules.
La présente invention va maintenant être illustrée par les exemples non limitatifs suivants : Dans ces exemples, les abréviations suivantes ont été utilisées :
OE : oxyde d'éthylène
POE : poly(oxyéthylène)
MM 2.1.2 : méthylidène malonate répondant à la formule :
O
.C— OCH2CH3
H2C=C O
C— O— CH,- ^
I I
O OCH2CH3
encore dénommé : 1-éthoxycarbonyl-l-éthoxycarbonylméthylène- oxycarbonyléthène
PMM 2.1.2 : polymère constitué d'unités monomères récurrentes répondant à la formule
COOCH2CH3
-CH2 Ç
CO— O— CH2 COOCH2CH3
Par ailleurs, dans ces exemples : - la taille des microsphères a été mesurée par la technique du compteur Coulter et l'examen morphologique réalisé en microscopie électronique à balayage, soit sur les microsphères brutes de fabrication, soit après cryofracture ; 13 5309 PCT/FR99/01005
- la masse moléculaire des polymères a été déterminée par chromatographie de perméation de gel (CPG).
EXEMPLE 1
100 mg de méthylidène malonate 2.1.2 sont dissous dans 10 ml d'acétone sous agitation magnétique. 100 micro litres de soude 0,1 N sont ajoutés progressivement sous agitation magnétique. La polymérisation est maintenue pendant 5 minutes puis 100 microlitres d'HCl 0,1 N sont ajoutés toujours sous agitation magnétique. L'acétone est entièrement évaporé sous vide. Le polymère obtenu est ensuite lavé à l'aide d'environ 100 ml d'eau distillée puis séché sous vide. La masse moléculaire de ce polymère est de 30.000.
280 mg de polyméthylidène malonate sont dissous dans 10 ml d'acétate d'éthyle. 1 ml de phase aqueuse contenant 60 mg d'ovalbumine est émulsionné dans la phase organique sous agitation à l'aide d'un Ultraturrax à une vitesse de
13.500 rpm pendant 5 minutes. Cette émulsion est ensuite ajoutée à 100 ml d'une solution aqueuse d'alcool polyvinylique à 2 %, l'agitation étant réalisée à l'aide d'un Ultraturrax à une vitesse de 8.000 rpm pendant 5 minutes. L'évaporation de l'acétate d'éthyle est réalisée à température ambiante pendant la nuit, sous agitation mécanique (pale tournante) à une vitesse de 1.400 rpm. Les microsphères sont recueillies après centrifugation à 4.000 rpm pendant 10 minutes puis lavées 6 fois avec de l'eau distillée et chaque fois soumises à une nouvelle centrifugation. Après la dernière centrifugation, les microsphères sont remises en suspension dans un volume de 3 ml d'eau distillée puis lyophilisées.
Les microsphères ainsi obtenues ont un diamètre moyen de 6 microns et 14,2 % de l'ovalbumine mise en oeuvre dans la préparation sont encapsulés dans les microsphères de PMM 2.1.2, ce qui correspond à une encapsulation de 2,5 % (w/w).
Cette préparation est administrée par voie orale à des souris C3H à la dose de 100 microgrammes d'ovalbumine encapsulée (par souris et par jour) pendant 5 jours consécutifs. Le dernier gavage a lieu 7 jours avant la 14 55309 PCT/FR99/01005
sensibilisation des animaux à l'ovalbumine qui est effectuée par injection sous- cutanée d'ovalbumine libre (100 microgrammes par souris) aux jours JO et J14. 90 % des souris survivent à la deuxième injection d'ovalbumine alors que moins de 30 % des souris gavées par les microsphères sans ovalbumine ou par la même dose d'ovalbumine non encapsulée survivent.
EXEMPLE 2
On procède suivant l'exemple 1 mais du Pluronic F 68 est ajouté dans la phase aqueuse contenant l'ovalbumine à la concentration de 2 %.
EXEMPLE 3
On procède suivant l'exemple 1 mais 20 mg de copolymère de POE- PMM sont ajoutés dans la phase organique contenant le polymère.
Dans cet exemple, un copolymère à blocs POE-PMM 2.1.2 a été utilisé. Ce copolymère a été obtenu par polymérisation successive des deux monomères en commençant par la préparation du bloc POE, par la mise en oeuvre du protocole expérimental suivant. Le réacteur dans lequel est effectué la polymérisation (250 ml) est raccordé à une rampe à vide permettant de travailler sous vide poussé et de s'affranchir des impuretés protiques.
Le solvant (THF, 150 ml) purifié de toute trace d'humidité est cryodistillé dans le réacteur à - 70°C. L'amorceur (Terbutanolate de potassium (0.1N/THF) ; 10 ml) est ensuite ajouté à l'aide d'une seringue au travers d'un septum.
L'oxyde d'éthylène (5 g) est alors introduit par cryodistillation. La polymérisation s'effectue à température ambiante pendant 48 heures. Après cette durée, un prélèvement permet de contrôler, par chromatographie par perméation de gel, la masse molaire (4.000 g/mol) et l'indice de polymolécularité (1.13) de la première séquence.
Le MM 2.1.2 (0,5 ml) fraîchement dégazé sous vide pour enlever le SO2 utilisé comme inhibiteur de polymérisation, est alors rajouté rapidement et en une seule fois à température ambiante. 15 5309 PCT/FR99/01005
Après 5 heures, le copolymère est désactivé par ajout de méthanol et précipité dans l'éther diéthylique.
5 motifs dérivés de MM 2.1.2 sont fixés au POE, ce qui correspond à une masse molaire pour le PMM 2.1.2 de 1.150 g/mol. L'analyse thermique du copolymère révèle une température de transition vitreuse de - 16°C ainsi qu'un pic de fusion de 45°C (ΔH = 117 J/g).
EXEMPLE 4
On procède suivant la technique décrite dans l'exemple 1, mais l'ovalbumine (60 mg) est remplacée par 2 mg du peptide V3 28 de la boucle V3 BRU de la gp 120 du VIH (séquence NNTRKSIHI GPGRAFYATGDIIGDIRQA). Les microsphères obtenues ont une taille moyenne de 5.8 microns et 70 % du peptide V3 28 mis en oeuvre sont encapsulés dans les microsphères ce qui correspond à une encapsulation de 0.48 % w/w. L'étude réalisée en microscopie électronique à balayage révèle des particules lisses et de forme sphérique.
EXEMPLE 5
On procède suivant l'exemple 4 mais du Pluronic F 68 est ajouté dans la phase aqueuse contenant le peptide à la concentration de 2 %. Les microsphères obtenues ont une taille de 7.0 microns et 70 % du peptide V3 28 mis en oeuvre sont encapsulés dans les microsphères.
EXEMPLE 6
On procède suivant l'exemple 4 mais 20 mg de copolymère de POE- PMM sont ajoutés dans la phase aqueuse contenant le peptide. 16 5309 PCT/FR99/01005
EXEMPLE 7
On procède suivant l'exemple 4 mais 20 mg de copolymère de POE- PMM sont ajoutés dans la phase organique contenant le polymère.
EXEMPLE 8
On procède suivant l'exemple 1 mais la phase aqueuse interne est constituée de 1 ml d'acide acétique 0,5M contenant 3 mg de collagène de type IL Les microsphères ainsi obtenues ont un diamètre moyen de 6 microns et 66.6 % du collagène mis en oeuvre dans la préparation sont encapsulés dans les microsphères de PMM2.1.2, ce qui correspond à une encapsulation de 0.7 % (w/w).
EXEMPLE 9
On procède suivant l'exemple 1 mais la phase aqueuse interne est constituée de 1 ml d'eau distillée. Les microsphères ainsi obtenues ne contiennent pas de substance biologiquement active. Leur diamètre moyen est de 7.0 microns.
EXEMPLE 10
On procède suivant la technique décrite dans l'exemple 1 mais l'ovalbumine (60 mg) est remplacée par le plasmide pCDNA3 (5 mg). Les microsphères obtenues ont une taille moyenne de 7 μm et 9,8 % de plasmide mis en oeuvre sont encapsulés dans les microsphères ce qui correspond à une encapsulation de 0,17 % (w/w).
L'étude réalisée en microscopie électronique à balayage révèle des particules lisses et de forme sphérique.
EXEMPLE 11
On procède suivant l'exemple 10 mais du Pluronic® est ajouté dans la phase aqueuse contenant le plasmide, à la concentration de 2 %. 17 5309 PCT/FR99/01005
Les microsphères ainsi obtenues ont un diamètre moyen de 7 μm et 12 % du plasmide mis en oeuvre sont encapsulés dans les microsphères ce qui correspond à une encapsulation de 0,22 % (w/w).
EXEMPLE 12
On procède suivant la technique décrite dans l'exemple 1 mais l'ovalbumine (60 mg) est remplacée par l'oligonucléotide (pdT16) (2 mg). Les microsphères obtenues ont une taille moyenne de 4,8 μm et 20,6 % d'oligonucléotide mis en oeuvre sont encapsulés dans les microsphères ce qui correspond à une encapsulation de 0,19 % (w/w).
EXEMPLE 13
On procède suivant l'exemple 12 mais du Pluronic® à la concentration de 2 % est ajouté dans la phase aqueuse contenant l'oligonucléotide.
Les microsphères obtenues ont un diamètre moyen de 5,7 μm et 23 % d'oligonucléotide mis en oeuvre sont encapsulés dans les microsphères ce qui correspond à une encapsulation de 0.21 % (w/w).

Claims

18 5309 PCT/FR99/01005REVENDICATIONS
1. Microsphères constituées d'un réseau continu d'un matériau support dans lequel est éventuellement dispersée une substance, caractérisées en ce que ledit matériau support contient au moins 70 % en poids d'un homopolymère constitué d'unités récurrentes répondant à la formule générale (I) suivante :
COOR1
— CH2
COO — (CH2)n— COOR2
dans laquelle :
- R, représente un groupe alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ou un groupe (CH2)m - COOR3 dans lequel m est un nombre entier compris entre 1 et 5 et R3 représente un groupe alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ;
- R_ représente un groupe alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ; et - n est un nombre entier compris entre 1 et 5.
2. Microsphères selon la revendication 1, caractérisées en ce que l'homopolymère précité est constitué d'unités récurrentes répondant à la formule générale (I) dans laquelle :
R, représente un groupe alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ; R2 représente un groupe alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ; et n est un nombre égal à 1.
3. Microsphères selon la revendication 1, caractérisées en ce que l'homopolymère précité est constitué d'unités récurrentes répondant à la formule générale (I) dans laquelle R, et R_ représentent un groupement CH2-CH3.
4. Microsphères selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisées en ce que ledit matériau support contient :
- de 90 % à 99,5 % en poids d'un homopolymère tel que défini à la revendication 1 , 2 ou 3 ; et
- de 0,5 % à 10 % en poids d'un copolymère comportant au moins une séquence présentant un caractère hydrophile et au moins une séquence présentant un 19 55309 PCT/FR99/01005
caractère hydrophobe, ladite séquence à caractère hydrophobe comprenant au moins une unité récurrente répondant à la formule générale (I).
5. Microsphères selon la revendication 4, caractérisées en ce que la séquence à caractère hydrophile dudit copolymère précité est choisie parmi un poly(oxyéthylène), un poly(alcoolvinylique), une poly(vinylpyrrolidone), un poly(N-2 hydroxypropyl méthacrylamide), un poly(hydroxyéthylméthacrylate), un poly(amino acide) hydrophile tel qu'une polylysine, un polysaccharide.
6. Microsphères selon la revendication 4 ou 5, caractérisées en ce que ledit copolymère a une structure à blocs, de préférence di-blocs ou tri-blocs, ou une structure greffée.
7. Microsphères selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisées en ce qu'une substance est effectivement dispersée dans ledit matériau support, ladite substance étant éventuellement biologiquement active.
8. Microsphères selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisées en ce que ladite substance dispersée est un peptide.
9. Microsphères selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisées en ce que ladite substance dispersée est une protéine.
10. Procédé de préparation de microsphères selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend : a) la préparation d'une première solution du ou des polymère(s) précité(s) constituant le matériau support dans un solvant organique volatil contenant éventuellement un agent tensio-actif, b) la préparation d'une seconde solution non miscible avec la solution obtenue en a), contenant éventuellement ladite substance à disperser et éventuellement un agent tensio-actif, c) la préparation d'une émulsion primaire par dispersion de la seconde solution dans la première solution, la phase continue étant constituée par la solution de polymère(s), d) la préparation d'une émulsion secondaire : - soit en dispersant, sous agitation, l'émulsion primaire obtenue en c) dans un milieu dispersant non miscible avec ladite émulsion primaire, ledit milieu dispersant contenant éventuellement un agent stabilisant ; 20 5309 PCT/FR99/01005
- soit en versant sous agitation, dans ladite émulsion primaire, une solution constituée d'un milieu non miscible avec ladite émulsion primaire, ledit milieu contenant éventuellement un agent stabilisant, e) l'évaporation dudit solvant organique sous agitation.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comporte en outre une étape e') de déplacement dudit solvant organique, ladite étape e') étant mise en oeuvre entre l'étape d) et l'étape e).
12. Procédé selon la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce qu'il comprend en outre : f) l'isolation des microsphères par centrifugation g) un ou plusieurs lavages successifs desdites microsphères h) la lyophilisation desdites microsphères.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisé en ce que l'agent tensio-actif utilisé pour la préparation de l'émulsion primaire est choisi parmi les poloxamers, les polysorbates, les alcools polyvinyliques et les copolymères tels que définis dans l'une quelconque des revendications 4 à 6.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, caractérisé en ce que ledit agent stabilisant utilisé pour la préparation de l'émulsion secondaire est un alcool poly vinylique 15. Compositions pharmaceutiques destinées à une administration par voie orale, caractérisées en ce qu'elles contiennent des microsphères telles que définies à l'une quelconque des revendications 1 à 9 ou obtenues par la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 14.
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