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WO2001088019A1 - Materiau a base de polymeres biodegradables et son procede de preparation - Google Patents

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WO2001088019A1
WO2001088019A1 PCT/FR2001/001496 FR0101496W WO0188019A1 WO 2001088019 A1 WO2001088019 A1 WO 2001088019A1 FR 0101496 W FR0101496 W FR 0101496W WO 0188019 A1 WO0188019 A1 WO 0188019A1
Authority
WO
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molecule
polysaccharide
biodegradable polymer
particles
material according
Prior art date
Application number
PCT/FR2001/001496
Other languages
English (en)
Inventor
Ruxandra Gref
Gilles Ponchel
Dominique Duchene
Patrick Couvreur
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S) filed Critical Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S)
Priority to CA002408870A priority Critical patent/CA2408870A1/fr
Priority to AU62427/01A priority patent/AU6242701A/en
Priority to JP2001585235A priority patent/JP2004521152A/ja
Priority to EP01936544A priority patent/EP1285021A1/fr
Priority to US10/276,178 priority patent/US20040013626A1/en
Publication of WO2001088019A1 publication Critical patent/WO2001088019A1/fr

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/167—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction with an outer layer or coating comprising drug; with chemically bound drugs or non-active substances on their surface
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G81/00—Macromolecular compounds obtained by interreacting polymers in the absence of monomers, e.g. block polymers

Definitions

  • the present invention relates to new materials based on biodegradable polymers and polysaccharides, vectors derived from these materials preferably in the form of particles, and their uses as biological vectors for active materials.
  • Vectorization is an operation aimed at modulating and if possible completely controlling the distribution of a substance, by associating it with an appropriate system called a vector.
  • a vector In the vectorization field, three main functions are to be ensured:
  • the general principle of vectorization is also to make the distribution of the active substance as independent as possible from the properties of the active substance itself and to subject it to that of suitable vectors chosen according to the objective envisaged.
  • the in vivo fate of the vector is conditioned by its size, its physicochemical characteristics and, in particular, its surface properties which determine the interactions with the components of the living environment.
  • First generation vectors are systems designed to release an active ingredient within the target. It is necessary in this case to use a particular mode of administration. These vectors of relatively large size (greater than a few tens of microns) are either solid systems (microspheres) or hollow systems (microcapsules), containing an active substance, for example anticancer, in the dissolved or dispersed state in the constituent material of these systems.
  • the materials which can be used are of variable nature (wax, ethylcellulose, polylactic acid, copolymers of lactic and glycolic acids) biodegradable or not.
  • Second generation vectors are vectors capable, without any particular mode of administration, of transporting an active principle to the intended target. More precisely, these are vectors whose size is less than a micrometer and whose distribution in the organism is totally a function of their unique physico-chemical properties.
  • vesicular vectors of the liposome type which are vectors constituted by one or more internal cavities containing an aqueous phase
  • the nanocapsules which are vesicular vectors formed by an oily cavity surrounded by a wall of a polymeric nature.
  • nanospheres which consist of a polymer matrix which can encapsulate active ingredients.
  • nanoparticles includes nanospheres as well as nanocapsules.
  • the active ingredients are generally incorporated at the level of the nanoparticles either during the polymerization process of the monomers from which the nanoparticles are derived, or by adsorption on the surface of the already formed nanoparticles, or during the manufacture of the particles from the preformed polymers.
  • the present invention relates very particularly to the field of vectors of the nano- and micro-particle type and their applications.
  • Different types of nano- and micro-particles are already proposed in the literature. Conventionally, they derive from a material obtained by direct polymerization of monomers (for example cyanoacrylates), by crosslinking, or else they are produced from preformed polymers: poly (lactic acid) (PLA), poly (glycolic acid) (PGA), poly ( ⁇ -caprolactone) ( PCL), and their copolymers, such as for example poly (lactic acid-co-glycolic acid) (PLGA), etc.
  • a new type of particle has been obtained from a material derived from the catalytic polymerization of monomers (such as for example lactide or caprolactone), on the skeleton of a polysaccharide.
  • monomers such as for example lactide or caprolactone
  • this type of material has the main drawback of not being able to guarantee a reproducible composition.
  • all the hydroxyl functions present on the backbone of the polysaccharide considered are capable of initiating the polymerization of the monomers.
  • a very large number of chains of variable size derived from the monomer are thus formed on the skeleton, which "mask" this skeleton.
  • the present invention has for first object a new composite material with controlled structure deriving from the coupling of biodegradable polymer chains directly on the backbone of polysaccharides. Its second object relates to a vector based on this material, preferably in the form of particles, and more preferably in the form of nanoparticles.
  • the invention also aims in a third object, the use of this vector, preferably of particles, in particular as biological vehicles.
  • the first aspect of the invention relates to a material with a controlled chemical structure composed of at least one biodegradable polymer and of a polysaccharide with a linear, branched or crosslinked backbone, characterized in that it derives from the controlled functionalization d 'at least one molecule of said biodegradable polymer or one of its derivatives by covalent grafting directly at the level of its polymeric structure, of at least one molecule of said polysaccharide.
  • the material developed according to the present invention has the first advantage of having a controlled chemical structure and therefore of being therefore perfectly reproducible. Its chemical composition is clearly identified.
  • the claimed material preferably consists of at least 90% by weight and more preferably entirely of a copolymer derived from the controlled functionalization of at least one molecule of a biodegradable polymer or of one of its derivatives by covalent grafting directly at the level of its polymeric structure of at least one molecule of a polysaccharide with a linear, branched or crosslinked backbone.
  • the claimed material does not contain a starting molecule, that is to say of said biodegradable polymer or of said polysaccharide.
  • the material claimed is therefore different from a mixture of polymeric nature in which the expected copolymer would be present but where the starting polymers would also remain, in very variable quantities.
  • a mixture of polymeric nature 0 cannot be used as such to prepare nano- or microparticles.
  • the claimed material has a polydispersity less than or equal to 2 and preferably less than 1.5.
  • the claimed material is obtained by coupling directly, at the level of the polysaccharide molecule, with one or more identical or different molecules of biodegradable polymer.
  • This covalent bond between the two types of molecule can be of various natures.
  • the covalent bond o established between the two molecules is of the ester or amide type. More preferably, it derives from the reaction between a carboxylic function, if necessary activated, present on the biodegradable polymer and a hydroxyl or amine function present on the polysaccharide.
  • the preferred activated functions of the acid are the N-hydroxysuccinimide ester, the acid chloride and the imidazolide derived from carbonyl diimidazole.
  • This reactive function, preferably carboxylic can either be naturally present on the skeleton of the biodegradable polymer or have been introduced there before at the level of its skeleton, so as to allow its subsequent coupling with a polysaccharide molecule.
  • This activation of a function present on one of the molecules, preferably a carboxylic function on the biodegradable polymer, is particularly advantageous when it is desired to prevent the manifestation of a parasitic secondary reaction, such as for example an intramolecular reaction.
  • a parasitic secondary reaction such as for example an intramolecular reaction.
  • the carboxylic function present on the biodegradable polymer of so as to favor the kinetics of its coupling reaction with the hydroxyl function of the polysaccharide to the detriment of that of an intramolecular reaction at the level of the polysaccharide molecule.
  • the reproducibility and homogeneity of the corresponding material are thus ensured.
  • the material according to the invention also has the advantage of having satisfactory biodegradability due to the nature of the polymers which constitute it.
  • biodegradable is intended to denote any polymer which dissolves or degrades in a period acceptable for the application for which it is intended, usually in in vivo therapy. Generally, this period should be less than 5 years and more preferably one year when a corresponding physiological solution is exposed with a pH of 6 to 8 and at a temperature between 25 ° C and 37 ° C.
  • the chains of biodegradable polymers according to the invention are or are derived from synthetic or natural biodegradable polymers.
  • polyesters PLA, PGA, PCL, and their copolymers, such as for example PLGA. Indeed, their biodegradability and biocompatibility have been widely established.
  • Other synthetic polymers are also being investigated. These are polyanhydrides, poly (alkylcyanoacrylates), polyorthoesters, polyphosphazenes, polyamino acids, polyamidoamines, polymethylidenemalonate, polysiloxane, polyesters such as polyhydroxybutyrate or poly (malic acid), as well as their copolymers and derivatives.
  • Natural biodegradable polymers proteins such as albumin or gelatin, or polysaccharides such as alginate, dextran or chitosan may also be suitable.
  • biodegradable polymers are particularly interesting because their bioerosion is observed quickly.
  • these polymers are not always suitable for being coupled with one or more polysaccharides because they have almost no reactive groups, especially in the case of biodegradable polyesters (PLA, PCL, ...), and / or because these reactive groups only exist at the chain end. Consequently, the coupling of these polymers with a polysaccharide implies a prior functionalization of their chains with reactive groups while controlling the nature of the groups naturally present at the chain end.
  • - n and m represent independently of each other, either 0 or 1,
  • - R represents a C 1 -C 20 alkyl group, a polymer different from the biodegradable polymer [for example poly (ethylene glycol)
  • PEG poly(ethylene glycol)
  • Pluronic® polymer a copolymer containing PEG blocks or ethylene oxide units, such as for example a Pluronic® polymer]
  • a protected reactive function present on the polymer eg BOC-NH-
  • a function carboxyl activated or not or a hydroxyl function
  • - R 2 represents a hydroxyl function or a carboxylic function activated or not.
  • Polyesters are especially preferred as biodegradable polymers according to the invention: poly (lactic acid) (PLA), poly (glycolic acid) (PGA), poly ( ⁇ -caprolactone) (PCL), and their copolymers, such as for example poly (lactic acid-co-glycolic acid) (PLGA), synthetic polymers such as polyanhydrides, poly (alkylcyanoacrylates), polyorthoesters, polyphosphazenes, polyamides (eg polycaprolactam), polyamino acids, polyamidoamines, polymethylidene malonate, poly (alkylene d-tartrate ), polycarbonates, polysiloxane, polyesters such as polyhydroxybutyrate or polyhydroxyvalerate, or poly (malic acid), as well as the copolymers of these materials and their derivatives.
  • PLA poly (lactic acid)
  • PGA poly (glycolic acid)
  • PCL poly ( ⁇ -caprolactone)
  • PA poly (lactic acid-co-g
  • the material according to the invention is particularly advantageous in terms of bioadhesion and targeting properties for the particles which are derived therefrom at the level of organs and / or cells. It is in particular through the choice of the associated polysaccharide, and in particular its composition and its structural organization at the particle level, that this second aspect is more precisely achieved.
  • the polysaccharide (s) used according to the invention are polysaccharides with a linear, branched or crosslinked structure, modified or not.
  • Modified polysaccharide is understood to mean any polysaccharide which has undergone a change in its skeleton, such as for example the introduction of reactive functions, the grafting of chemical entities (molecules, aliphatic links, PEG chains, etc.). Of course, this modification must relate to few of the hydroxyl or amino groups present on the skeleton, so as to leave the vast majority of them free to then allow the coupling of biodegradable polymers. Thus, there are commercially available polysaccharides modified by grafting biotin, fluorescent compounds, etc. Other polysaccharides grafted with hydrophilic chains (eg PEG) have been described in the literature.
  • PEG polysaccharides grafted with hydrophilic chains
  • polysaccharides which are very particularly suitable for the invention are or are derived from D-glucose (cellulose, starch, dextran), D-galactose, D-mannose, D-fructose (galactosan, manane, fructosan). The majority of these polysaccharides contain the elements carbon, oxygen and hydrogen.
  • the polysaccharides according to the invention can also contain sulfur and / or nitrogen.
  • hyaluronic acid (composed of N-acetyl glucosamine and glucuronic acid units), chitosan, chitin, heparin or ovomucoid contain nitrogen, while agar, polysaccharide extracted from seaweed , contains sulfur in the form of acid sulfate (> CH-O-SOgH). Chondroitin-sulfuric acid contains sulfur and nitrogen simultaneously.
  • the polysaccharide has a molecular weight greater than or equal to 6000 g / mole.
  • n varies between 10 and 620 and preferably between 33 and 220.
  • the molar mass varies between 5 10 3 and 5 10 6 g / mole, preferably between 5 10 4 and 2 10 6 g / mole.
  • the molar mass varies between 6 10 3 and 6 10 5 g / mole, preferably between 6 10 3 and 15 10 4 g / mole g / mole.
  • polydextroses such as dextran, chitosan, pullulan, starch, amilose, hyaluronic acid, heparin, amilopectin, cellulose, pectin, alginate, curdlan, fucan, succinoglycan, chitin, xylan, xanthan, arab
  • the material according to the invention in the form of a copolymer, can include the biodegradable polymer and the polysaccharide in a mass ratio varying from 1: 20 to 20: 1 and preferably from 2: 9 to 2: 1.
  • the copolymers constituting the claimed material can be in the form of di-block copolymers, have a comb structure or a crosslinked structure.
  • the preferred nature of the backbone is a polysaccharide, and the preferred nature of the grafts is a biodegradable polymer.
  • Di-block or comb copolymers can be obtained by varying the polysaccharide: biodegradable polymer molar ratio during synthesis.
  • the crosslinked structure copolymers can be obtained from biodegradable polymers comprising at least two reactive functions.
  • the second aspect of the present invention relates to a process for preparing the claimed material.
  • this process comprises bringing together at least one molecule of a biodegradable polymer or one of its derivatives carrying at least one reactive function F1 with at least one molecule of a polysaccharide with a linear, branched or crosslinked backbone and carrying at least one reactive function F2 capable of reacting with the function F1, under conditions suitable for the reaction between the functions F1 and F2 to establish a covalent bond between the said molecules and in that the said material is recovered.
  • the claimed preparation process does not require the use of a catalyst like conventional methods.
  • This specificity of the claimed process is therefore particularly advantageous in terms of safety and biodegradability in the resulting material.
  • it is a quantitative reaction, that is to say at least one F1 function present on the polysaccharide molecules reacts with an F2 function present on a biodegradable polymer molecule.
  • the reaction is carried out under conditions such that the manifestation of any parasitic reaction is prevented, in particular the involvement of one of the functions F1 or F2 in another reaction than the expected coupling reaction. It is thus intended to avoid the intramolecular reactions mentioned above.
  • the reactive function present on the biodegradable polymer is an acid function or an activated acid function and the reactive function on the polysaccharide is a hydroxyl or amine function.
  • the polysaccharide and the biodegradable polymer or derivative are brought together in a mass ratio varying from 1: 20 to 20: 1.
  • the coupling reaction can be carried out by activation for example with dicyclohexylcarbodiimide (DCC) or carbonyldiimidazole (DCI).
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • DCI carbonyldiimidazole
  • biodegradable polysaccharides and polymers meet the definitions proposed above.
  • they can be derived from molecules of polysaccharides or biodegradable polymers, natural and which have been modified so as to be functionalized in accordance with the present invention.
  • a third aspect of the invention relates to vectors made of a material according to the invention. These vectors are preferably particles having a size between 50 nm and 500 ⁇ m and preferably between 80 nm and 100 ⁇ m.
  • the size of these can be fixed.
  • the particles have a size between 1 and 1000 nm and are then called nanoparticles.
  • Particles varying in size from 1 to several thousand microns refer to microparticles.
  • the claimed nanoparticles or microparticles can be prepared according to methods already described in the literature, such as for example the solvent emulsion / evaporation technique [R. Gurny et al. "Development of biodegradable and injectable latices for controlled release of potent drugs” Drug Dev. Ind. Pharm., Vol 7, p. 1-25 1981)]; the nanoprecipitation technique using a water-miscible solvent (FR 2 608 988 and EP 274 691). There are also variants of these methods.
  • the so-called “double-emulsion” technique which is advantageous for the encapsulation of hydrophilic active principles, consists in dissolving these in an aqueous phase, in forming an emulsion of the water / oil type with an organic phase containing the polymer. , then to form an emulsion of the water / oil / water type using a new aqueous phase containing a surfactant. After evaporation of the organic solvent, nano- or micro-spheres are recovered.
  • a particularly advantageous new method has also been developed by the inventors which comprises:
  • the polymers and copolymers constituting the claimed material comprise, as biodegradable polymer, a polycaprolactone derivative, and more preferably a polycaprolactone derivative with a molecular weight of less than 5000 g / mol.
  • the material according to the present invention has the major advantage of having surfactant properties, by its amphiphilic nature. These properties can therefore be exploited advantageously during the preparation of particles, for example, so as to avoid the use of surfactants, systematically used in the above-mentioned processes. Indeed, these are not always biocompatible and are difficult to remove at the end of the process.
  • Another advantage of the material according to the present invention is to offer the possibility of modulating the properties which intervene in the process of manufacturing particles through the choice: - of the mass ratio of biodegradable polymer polysaccharide and / or
  • copolymers hydrosoluble or insoluble in water having hydrophilic-lipophilic balances which can vary between 2 and 18 (thus making it possible to stabilize water / oil or oil / water emulsions).
  • a material derived from at least one polyester molecule linked by an ester or amide type bond to at least one polysaccharide molecule chosen from dextran , chitosan, hyaluronic acid and amilose are particles composed of a material derived from a block of polycaprolactone or of poly (lactic acid) linked by an ester or amide bond to at least one polysaccharide molecule chosen from dextran, chitosan, hyaluronic acid and amilose.
  • particle structures obtainable from the material according to the invention and the abovementioned methods can be variable.
  • the polysaccharide can be disposed either exclusively at the level of the aqueous inclusions, or at the level of these inclusions and of the surface of the particles. It can also protect the encapsulated active principles (proteins, peptides, etc.) from interactions, often denaturing, with the hydrophobic biodegradable polymer and the organic solvent;
  • hydrophilic core structure polysaccharide
  • hydrophobic ring biodegradable polymer
  • micellar structure obtained thanks to the self-association of a material in accordance with the invention in the aqueous phase, and - a so-called gel structure formed by crosslinking of the polysaccharides with biodegradable polymers comprising at least two reactive functions.
  • the particles preferably degrade over a period of between one hour and several weeks.
  • the particles according to the invention can contain an active substance which can be hydrophilic, hydrophobic or amphiphilic and biologically active.
  • biological active materials mention may more particularly be made of peptides, proteins, carbohydrates, nucleic acids, lipids, polysaccharides or their mixtures. They may also be synthetic organic or inorganic molecules which, administered in vivo to an animal or to a patient, are capable of inducing a biological effect and / or manifesting therapeutic activity. It can thus be antigens, enzymes, hormones, receptors, peptides, vitamins, minerals and / or steroids.
  • the particles can thus include magnetic particles, radio-opaque materials (such as air or barium) or fluorescent compounds.
  • fluorescent compounds such as rhodamine or Nile red can be included in particles with a hydrophobic core.
  • gamma emitters for example Indium or Technetium
  • Hydrophilic fluorescent compounds can also be encapsulated in the particles, but with a lower yield compared to hydrophobic compounds, due to the lower affinity with the matrix.
  • Commercial magnetic particles with controlled surface properties can also be incorporated into the particle matrix or covalently attached to one of their constituents.
  • the active material can be incorporated into these particles during their formation process or, on the contrary, be loaded at the level of the particles once they are obtained.
  • the particles in accordance with the invention can comprise up to 95% by weight of an active material.
  • the active ingredient can thus be present in an amount varying from 0.001 to 990 mg / g of particle and preferably from 0.1 to 500 mg / g. It should be noted that in the case of the encapsulation of certain macromolecular compounds (DNA, oligonucleotides, proteins, peptides, etc.) even lower charges may be sufficient.
  • the particles according to the invention can be administered in different ways, for example by the oral, parenteral, ocular, pulmonary, nasal, vaginal, cutaneous, buccal routes, etc.
  • the non-invasive oral route is a preferred route.
  • particles administered orally can undergo different processes: translocation (capture and then passage of the digestive epithelium by intact particles), bioadhesion (immobilization of particles on the surface of the mucosa by a membership mechanism) and transit.
  • translocation capture and then passage of the digestive epithelium by intact particles
  • bioadhesion immobilization of particles on the surface of the mucosa by a membership mechanism
  • transit transit.
  • the surface properties play a major role.
  • the particles according to the invention have numerous hydroxyl functions on the surface, proves to be particularly advantageous for binding a biologically active molecule to it, a molecule intended for targeting or which can be detected. It is thus possible to envisage functionalizing the surface of these particles so as to modify their surface properties and / or target them more specifically towards certain tissues or organs.
  • the particles thus functionalized can be maintained at the target level by the use of a magnetic field, during medical imaging or while an active compound is released.
  • targeting molecule type ligands such as receptors, lectins, antibodies or fragments thereof can be attached to the surface of the particles. This type of functionalization falls within the competence of a person skilled in the art.
  • the coupling of these ligands or molecules on the surface of the particles can be carried out in different ways. It can be carried out covalently by attaching the ligand to the polysaccharide covering the particles or non-covalently, that is to say by affinity. Thus, certain lectins could be attached by specific affinity to the polysaccharides located on the surface of particles according to the present invention, thereby enhancing the cell recognition properties of these particles. It may also be advantageous to graft the ligand via a spacer arm, to allow it to reach its target in an optimal conformation. Alternatively, the ligand can be carried by another polymer used in the composition of the particles.
  • the invention also relates to the use of the vectors and preferably of the particles obtained according to the invention for encapsulating one or more active materials as defined above.
  • Another aspect of the invention also relates to pharmaceutical or diagnostic compositions comprising vectors and preferably particles according to the invention, where appropriate associated with at least one pharmaceutically acceptable and compatible vehicle.
  • the particles can be administered in enteric capsules, or incorporated into gels, implants or tablets. They can also be prepared directly in an oil (such as Migliol®) and this suspension administered in a capsule or injected at a specific site (for example tumor). These particles are in particular useful as stealth vectors, that is to say capable of escaping the immune defense system of the organism and / or as bioadhesive vectors.
  • Figure 1 Representation using an optical microscope of R-PCL-COOH particles manufactured according to Example 13 (polymer synthesized according to Example 1).
  • Figure 2 Distribution of hydrodynamic diameters of R-PCL-COOH particles.
  • the acid and ⁇ -caprolactone were introduced into a flask surmounted by a condenser ascending. After purging the reagents, the flask was introduced into an oil bath thermostatically controlled at 225 ° C. The reaction continued for 3 h 30 min under an inert atmosphere (argon). It was stopped by immersion of the balloon in an ice bath. The solid obtained was dissolved hot in 15 ml THF, then was precipitated at room temperature with cold methanol.
  • Mn number-average molar masses
  • Mw number-average molar masses
  • CES steric exclusion chromatography
  • a number average molar mass equal to 3200 g / mole was determined by titration with a 10 "2 M KOH / EtOH solution of the polymer samples of approximately 100 mg dissolved in an acetone-water mixture.
  • the bifunctionalized polymer HOOC-PCL-COOH was synthesized according to the procedure of Example 1.
  • the succinic acid (99.9%, AIdrich) used as initiator was dried under vacuum at 110 ° C for 24 hours.
  • the monomer ( ⁇ -caprolactone) was purified by distillation on calcium hydride.
  • the polymerization from 0.2 g of succinic acid and 4 g of ⁇ -caprolactone made it possible to obtain after 3 hours of reaction 3.2 g of polymer (yield by weight 76% after four successive precipitations).
  • the assay of the terminal COOH groups with KOH / EtOH 10 "2 M made it possible to determine an acidity corresponding to a molar mass of 3500 g / mole.
  • Mn is equal to 4060 g / mole and Mw to 4810 g / mole, the polydispersity index is 1, 2.
  • the monomer (D, L-lactide) was purified by two recrystallizations from ethyl acetate followed by sublimation.
  • the catalyst (tin octanoate) was purified by distillation under very high vacuum.
  • the capric acid used as initiator was purified by recrystallization from ethyl acetate, then anhydrous by azeotropic distillation with benzene.
  • the capric acid (0.12 g) and the D, L-lactide (3.5 g) were introduced into a two-necked tube fitted with an ascending cooler connected to a vacuum / argon ramp.
  • the reaction flask was inert, then 7 ml of anhydrous toluene were added through the septum.
  • 0.284 g of catalyst was introduced and the reaction was immediately started by immersion of the flask in an oil bath at 120 ° C. After 4 hours, the reaction was stopped, the toluene was evaporated, and the polymer called R-PLA-COOH was dissolved in dichloromethane and precipitated with ethanol. After four successive precipitations, a constant acidity was obtained in the polymer, which was then dried.
  • the molar mass Mw determined by CES is 22 Kg / mole.
  • the assay of the terminal groups with KOH / EtOH 10 "2 M made it possible to determine an acidity corresponding to a molar mass of 21 Kg / mole.
  • PCL or PLA polymers monofunctionalized at the chain end with an alcohol group were synthesized according to the protocol of Example 3, but by substituting for the acid initiator, an initiator alcohol, for example C 7 H 15 OH.
  • the acid initiator the poly (ethylene glycol) comprising at one end of a chain a methoxy group and at the other a carboxylic acid group (MeO-PEG-COOH) (Shearwater Polymers, 5000 g / mole) was dried before the reaction.
  • the lactide was purified by two recrystallizations (ethyl acetate) and by sublimation.
  • the mass ratio of MeO-PEG-COOH: lactide reagents was 1: 9 and the MeO-PEG-COOH: catalyst molar ratio was 1: 1.
  • the polymerization continued for 2 h under an inert atmosphere at reflux of toluene (solvent). After evaporation of the toluene, the copolymer is purified by two successive precipitations.
  • the mass Mw determined by CES is 42 kg / mole. EXAMPLE 6.
  • the acid function of the R-PCL-COOH polymers is transformed in the activated ester by reacting it with N-hydroxy succinimide (NHSI), in the presence of dicyclohexyl carbodiimide (DCC), in a DMF: CH 2 mixture.
  • the DCC was added in slight molar excess (1, 1) relative to the R-PCL-COOH chains and the NHSI in excess relative to the -COOH functions.
  • the reagents were dissolved in a minimum volume of solvent, with slight heating. The reaction takes place at 50 ° C for 24 hours under an inert atmosphere.
  • the coupling reaction takes place for 144 hours at 70 ° C under argon.
  • the transesterification reaction takes place with the release of NHSI.
  • the final product is washed with water to remove the NHSI and water-soluble copolymers, then with dichloromethane to extract traces of unreacted polyester.
  • a comb-type Dex-PCL copolymer is obtained with a yield of 40%, comprising a skeleton of dextran (Dex) (molar mass 40,000 g / mole) and side links of PCL linked by ester bridges.
  • the copolymer is purified at the end of the reaction. Its overall composition is determined by elementary microanalysis and by NMR. The copolymer contains 33% by weight of PCL.
  • R-PCL-COOH (Example 1) are anhydrated by azeotropic distillation, then dried under vacuum at 40-50 ° C, overnight, directly in the 50 ml reaction flask topped with an ascending cooler and connected to an empty ramp / argon. 5 ml of dry THF are then added to the flask. After dissolution of the acid, 0.243 g of carbonyl diimidazole (CDI) is added to the flask, which dissolves quickly. The inert mixture is brought to reflux of THF. CO 2 is observed. After 3 hours, the THF is evaporated.
  • CDI carbonyl diimidazole
  • the Dex-PCL copolymers were dissolved in dimethyl acetamide (DMAC) at concentrations of 5 mg / ml. The volumes injected were 100 ⁇ l. The eluent was DMAC containing 0.4% LiBr, at a flow rate of 0.5 ml / min. The molar masses were determined by the method of universal calibration. Some examples are shown in Table 1.
  • Dex-PCL7 is derived from the presence of 5% dextran and 95% PCL.
  • Dex-PCL5 is derived from the presence of 20% dextran and 80% PCL.
  • Dex-PCL3 is derived from the presence of dextran at 33% and PCL at 67%.
  • Mn number-average molar mass
  • Rgw average radius of gyration in weight dn / dc: variation of the specific refractive index with the concentration.
  • the three copolymers have a low polydispersity and weight-average molar masses of between 11,000 and 19,000 g / mole.
  • 0.2g amilose (Fluka, extracted from potatoes) are dissolved in 8ml DMSO.
  • the result is a cloudy solution, to which is added 0.2 g of R-PCL-ester of NHSI (Example 6) dissolved in 3 ml DMSO.
  • This mixture is incubated at 70 ° C for 144 h. After evaporation of the solvents, the solid is taken up with 200 ml of water and 200 ml of chloroform in a separating funnel.
  • the intermediate phase containing the amphiphilic polymer is recovered and extracted once again, then dried. This treatment is a variant of the purification method of Example 7.
  • the yield by weight after the second extraction is 38% (wt).
  • Chitosan-polycaprolactone copolymer is obtained according to the protocol of Example 9. The synthesis was carried out from crude chitosan (Fluka, 150 000 g / mol) and the yield for obtaining the copolymer was 22% by 'weight. According to elementary microanalysis, the copolymer contains 67% by weight of PCL. It is of the comb type, with a skeleton of chitosan and side links of PCL mainly linked by amide bonds.
  • Hyaluronic acid (Accros, molar mass greater than 10 6 g / mole) in the form of sodium carboxylate is dissolved in MilliQ water, and converted into the free acid form using a cation super-exchange resin , and freeze-dried.
  • the product thus obtained is fairly soluble in DMSO and allows the coupling with the NHSI ester of R-PCL-COOH, according to the protocol of Examples 7 and 9.
  • the hyaluronic acid-PCL comb type copolymer is recovered in the aqueous phase. There is no intermediate phase.
  • this copolymer contains 18% by weight of PCL.
  • R-PCL-COOH nanoparticles A well-defined mass of R-PCL-COOH synthesized according to Example 1 is dissolved in acetone to obtain a concentration of 20 mg / ml. A volume of water equal to twice the volume of acetone is poured dropwise. Spontaneously, the polymer forms nanospheres with an average diameter of 210 nm (measured after the evaporation of the solvent), in the absence of surfactant.
  • a well defined mass of Dex-PCL copolymer synthesized according to Example 7 is introduced into dichloromethane to obtain a concentration of 10 mg / ml.
  • the polymer is dispersed and swollen by the solvent, but it does not dissolve.
  • a volume of water two to twenty times greater than the volume of dichloromethane is added.
  • a coarse emulsion is first formed, then refined using ultrasound.
  • the amphiphilic copolymer stabilizes the emulsion, thus avoiding the need to add surfactants. After evaporation of the organic solvent, nanoparticles are obtained.
  • the average particle diameter is determined by light scattering (PCS).
  • PCS light scattering
  • Particles were formed according to the protocol of Example 14, except that instead of water, an acetate buffer solution pH4.8 saturated with chitosan was used. Spherical particles were thus obtained.
  • the tritiated PLA was encapsulated as a radioactive marker in Dex-PCL nanoparticles (Example 7) to allow precise determination of the localization of the particles (inside or on the surface of the cells or in the culture medium). This marking was found to be perfectly stable in the culture medium, thus authorizing these studies.
  • Caco2 cells were grown in 24-well plates, with medium change (1.5 ml / DMEM well 4.5 g / l glucose, 15% fetal vow serum) every 1 or 2 days until confluence.
  • the medium is removed, 1.5 ml of Hank's medium are added, the mixture is waited for 2 hours and then the nanosphere suspensions containing well-defined quantities of particles are added (in a total volume 100 ⁇ l).
  • the activity per well in the culture medium was fixed at 0.1 ⁇ Ci.
  • the supernatant was removed, the cells were washed twice with PBS, then lysed for 1 h with 1 ml of 0.1 M NaOH. radioactivity was counted in the supernatant, the washings and the cell lysate.
  • the quantity of Dex-PCL nanoparticles associated with Caco2 cells is double compared to those in polyester (PLA, Phusis, Mw 40,000 g / mole) manufactured by the nanoprecipitation technique (Example 10) in the presence of Pluronic®. Thus, 2.5% and 1.1% respectively of the nanoparticles are associated with the cells.
  • a suspension of radiolabelled nanoparticles made from Dex-PCL (Example 7) is brought into contact with a solution of pea lectin (Lens culinaris) in excess relative to the particles, so as to saturate the surface of the latter. in affinity adsorbed lectin.
  • the quantity of nanoparticles associated with Caco2 cells is significantly increased compared to those not covered with lectin. Thus, 3.5% of the nanoparticles introduced into each well are associated with the cells, compared to 2.5% in the absence of lectin.
  • the capacity of nanoparticles coated with dextran (made from Dex-PCL, example 7) to avoid capture by phagocyte cells (J774) was compared with those of the same size (approximately 200 nm) and coated with PEG 5000 g / mole (made from PEG-PLA synthesized according to Example 4, from Me-O-PEG-OH 5000 g / mole and lactide, with a molar mass of the PLA block of 50,000 g / mole).
  • the J774 cells were cultured in 24-well plates, in DMEM medium containing 4.5 g / 1 glucose and 10% fetal wish serum.

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Abstract

La présente invention a pour objet un matériau à structure chimique contrôlée composé d'au moins un polymère biodégradable et d'un polysaccharide à squelette linéaire, ramifié ou réticulé, caractérisé en ce qu'il dérive de la fonctionnalisation contrôlée d'au moins une molécule dudit polymère biodégradable ou d'un de ses dérivés par greffage covalent directement au niveau de sa structure polymérique, d'au moins une molécule dudit polysaccharide. Elle vise également un vecteur de préférence sous forme de particules obtenu à partir de ce matériau ainsi que son utilisation à titre de vecteur biologique.

Description

MATERIAU A BASE DE POLYMERES BIODEGRADABLES ET SON PROCEDE DE
PREPARATION.
La présente invention concerne de nouveaux matériaux à base de polymères biodégradables et de polysaccharides, des vecteurs dérivant de ces matériaux de préférence sous forme de particules, et leurs utilisations à titre de vecteurs biologiques pour des matières actives.
La vectorisation est une opération visant à moduler et si possible à totalement maîtriser la distribution d'une substance, en l'associant à un système approprié appelé vecteur. Dans le domaine de la vectorisation, trois fonctions principales sont à assurer :
- Transporter la ou les matières actives dans les liquides biologiques de l'organisme,
- Acheminer les matières actives vers les organes à traiter, et - Assurer la libération de ces matières actives.
Bien entendu, le principe général de la vectorisation est également de rendre la distribution de la matière active aussi indépendante que possible des propriétés de la substance active elle- même et de la soumettre à celle de vecteurs appropriés choisis en fonction de l'objectif envisagé.
En fait, le devenir in vivo du vecteur est conditionné par sa taille, ses caractéristiques physico-chimiques et, en particulier, ses propriétés de surface qui déterminent les interactions avec les composants du milieu vivant. Parmi les différents vecteurs déjà existants, on peut distinguer plusieurs catégories.
Les vecteurs de première génération sont des systèmes conçus pour libérer un principe actif au sein de la cible visée. Il est nécessaire dans ce cas de faire appel à un mode d'administration particulier. Ces vecteurs de taille relativement élevée (supérieure à quelques dizaines de microns) sont soit des systèmes pleins (microsphères), soit des systèmes creux (microcapsules), contenant une substance active, par exemple anticancéreuse, à l'état dissous ou dispersé dans le matériau constitutif de ces systèmes. Les matériaux utilisables sont de nature variable (cire, éthylcellulose, acide polylactique, copolymères des acides lactiques et glycolique) biodégradables ou non.
Les vecteurs de deuxième génération sont des vecteurs capables, sans mode d'administration particulier, de véhiculer un principe actif jusqu'à la cible visée. Plus précisément, il s'agit de vecteurs dont la taille est inférieure au micromètre et dont la distribution dans l'organisme est totalement fonction de leurs uniques propriétés physico-chimiques.
A cette seconde catégorie, appartiennent notamment les vecteurs vésiculaires de type liposomes qui sont des vecteurs constitués par une ou plusieurs cavités internes contenant une phase aqueuse, les nanocapsules qui sont des vecteurs vésiculaires formés d'une cavité huileuse entourée d'une paroi de nature polymérique, ainsi que les émulsions lipidiques. On distingue aussi les nanosphères qui sont constituées d'une matrice en polymère pouvant encapsuler des principes actifs. Couramment, on regroupe sous le terme « nanoparticules » les nanosphères ainsi que les nanocapsules. Les matières actives sont généralement incorporées au niveau des nanoparticules soit au cours du processus de polymérisation des monomères dont dérivent les nanoparticules, soit par adsorption à la surface des nanoparticules déjà formées, soit pendant la fabrication des particules à partir des polymères préformés.
La présente invention concerne tout particulièrement le domaine des vecteurs du type nano- et micro-particules et leurs applications. Différents types de nano- et micro-particules sont déjà proposés dans la littérature. Conventionnellement, ils dérivent d'un matériau obtenu par polymérisation directe de monomères (par exemple cyanoacrylates), par réticulation, ou encore ils sont élaborés à partir de polymères préformés : poly(acide lactique) (PLA), poly(acide glycolique) (PGA), poly(ε-caprolactone) (PCL), et leurs copolymères, comme par exemple le poly(acide lactique-co-acide glycolique) (PLGA), etc...
Plus récemment, un nouveau type de particules a été obtenu à partir d'un matériau dérivant de la polymérisation catalytique de monomères (comme par exemple lactide ou caprolactone), sur le squelette d'un polysaccharide. Ce type de matériau présente toutefois l'inconvénient principal de ne pouvoir garantir une composition reproductible. En effet, toutes les fonctions hydroxyles présentes sur le squelette du polysaccharide considéré sont susceptibles d'amorcer la polymérisation des monomères. Il se forme ainsi sur le squelette un très grand nombre de chaînes de taille variable dérivant du monomère, qui « masquent » ce squelette. Ceci est un inconvénient majeur dans l'élaboration de vecteurs adaptés pour certaines applications (bioadhésion, « furtivité », ciblage,...) ou l'on recherche précisément à contrôler la nature du recouvrement des particules. En conséquence, par ce type de polymérisation, il est impossible d'obtenir une bonne reproductibilité de la synthèse, des échantillons homogènes, et de contrôler les degrés de polymérisation et de substitution, d'autant plus que la polymérisation se fait généralement en masse (en absence de solvant). En effet, lors de la synthèse du matériau, le polysaccharide est souvent utilisé sous la forme de particules dispersées dans le monomère fondu et la polymérisation est généralement conduite en présence d'un catalyseur. En absence de catalyseur, les degrés de polymérisation sont très faibles.
Ont également été décrites dans le brevet US 6 007 845 des particules dérivant d'un matériau obtenu par couplage covalent sur un matériau multifonctionnel de type acide citrique ou tartarique, d'une ou plusieurs molécules d'un polymère hydrophile comme le polyéthylène glycol et d'une ou plusieurs molécules d'un polymère hydrophobe comme l'acide polylactique. Toutefois, la synthèse de ce matériau a pour inconvénient majeur de nécessiter l'utilisation d'un composé annexe jouant le rôle d'intercalaire entre les molécules des deux types de polymères.
La présente invention a pour premier objet un nouveau matériau composite à structure contrôlée dérivant du couplage de chaînes de polymère biodégradable directement sur le squelette de polysaccharides. Son second objet concerne un vecteur à base de ce matériau, de préférence sous forme de particules, et plus préférentiellement sous la forme de nanoparticules.
L'invention vise également dans un troisième objet, l'utilisation de ce vecteur, de préférence de particules, notamment à titre de véhicules biologiques. Plus précisément, le premier aspect de l'invention concerne un matériau à structure chimique contrôlée composé d'au moins un polymère biodégradable et d'un polysaccharide à squelette linéaire, ramifié ou réticulé, caractérisé en ce qu'il dérive de la fonctionnalisation contrôlée d'au moins une molécule dudit polymère biodégradable ou d'un de ses dérivés par greffage covalent directement au niveau de sa structure polymérique, d'au moins une molécule dudit polysaccharide.
Par opposition aux matériaux précédemment évoqués, le matériau mis au point selon la présente invention a pour premier avantage d'avoir une structure chimique contrôlée et donc d'être à ce titre parfaitement reproductible. Sa composition chimique est clairement identifiée.
Ainsi, le matériau revendiqué est de préférence constitué d'au moins 90% en poids et plus préférentiellement en totalité d'un copolymère dérivant de la fonctionnalisation contrôlée d'au moins une molécule d'un polymère biodégradable ou d'un de ses dérivés par greffage covalent directement au niveau de sa structure polymérique d'au moins une molécule d'un polysaccharide à squelette linéaire, ramifié ou réticulé.
Selon un mode préféré de l'invention, le matériau revendiqué ne contient pas de molécule de départ, c'est-à-dire dudit polymère 5 biodégradable ou dudit polysaccharide.
En l'espèce, le matériau revendiqué est donc différent d'un mélange de nature polymérique dans lequel serait présent le copolymère attendu mais où demeureraient également, en des quantités très variables, les polymères de départ. Un tel mélange de nature polymérique 0 ne peut être utilisé tel quel pour préparer des nano- ou micro- particules.
En l'occurrence, le matériau revendiqué possède une polydispersité inférieure ou égale à 2 et de préférence inférieure à 1 ,5.
Plus précisément, le matériau revendiqué est obtenu par couplage directement au niveau de la molécule du polysaccharide, d'une ou 5 plusieurs molécules de polymère biodégradable, identiques ou différentes.
Cette liaison covalente entre les deux types de molécule peut être de natures diverses.
Elle peut ainsi dériver de la réaction entre un groupement acide carboxylique avec soit une fonction aminé pour former une liaison amide, o soit une fonction hydroxyle pour former une liaison ester.
Elle peut aussi résulter de la réaction entre un groupement isocyanate avec un groupement alcool pour former une liaison de type uréthane.
Elle peut également dériver de la réaction d'une fonction thiol 5 avec un groupement carboxylique pour conduire à une liaison de type thioester.
L'ensemble de ces réactions est bien connu de l'homme de l'art et leurs réalisations relèvent de ses compétences.
Selon une variante préférée de l'invention, la liaison covalente o établie entre les deux molécules est de type ester ou amide. Plus préférentiellement, elle dérive de la réaction entre une fonction carboxylique, le cas échéant activée, présente sur le polymère biodégradable et une fonction hydroxyle ou aminé présente sur le polysaccharide. Les fonctions activées préférées de l'acide sont l'ester de N-hydroxysuccinimide, le chlorure d'acide et Pimidazolide dérivé du carbonyl diimidazole. Cette fonction réactive, de préférence carboxylique, peut être soit naturellement présente sur le squelette du polymère biodégradable ou y avoir été introduite au préalable au niveau de son squelette, de manière à permettre son couplage ultérieur avec une molécule de polysaccharide.
Cette activation d'une fonction présente sur l'une des molécules, de préférence une fonction carboxylique sur le polymère biodégradable, est notamment avantageuse lorsque l'on veut empêcher la manifestation d'une réaction secondaire parasite, comme par exemple une réaction intramoléculaire. Ainsi, dans le cas particulier où le polysaccharide possède au niveau de sa molécule deux fonctions susceptibles de réagir l'une avec l'autre, par exemple une fonction hydroxyle et une fonction carboxylique, on active préalablement la fonction carboxylique présente sur le polymère biodégradable de manière à privilégier la cinétique de sa réaction de couplage avec la fonction hydroxyle du polysaccharide au détriment de celle d'une réaction intramoléculaire au niveau de la molécule du polysaccharide.
La reproductibilité et l'homogénéité du matériau correspondant sont ainsi assurées. Le matériau selon l'invention a également pour avantage de posséder une biodégradabilité satisfaisante en raison de la nature des polymères qui le constituent.
Au sens de l'invention, on entend désigner sous l'appellation « biodégradable » tout polymère qui se dissous ou se dégrade en une période acceptable pour l'application à laquelle il est destiné, habituellement en thérapie in vivo. Généralement, cette période doit être inférieure à 5 ans et plus préférentiellement à une année lorsque l'on expose une solution physiologique correspondante avec un pH de 6 à 8 et à une température comprise entre 25°C et 37°C.
Les chaînes de polymères biodégradables selon l'invention sont ou dérivent de polymères biodégradables synthétiques ou naturels.
Classiquement, les polymères biodégradables synthétiques les plus employés sont les polyesters : PLA, PGA, PCL, et leurs copolymères, comme par exemple PLGA. En effet, leur biodégradabilité et biocompatibilité ont été largement établies. D'autres polymères synthétiques font également l'objet d'investigations. Il s'agit des polyanhydrides, poly(alkylcyanoacrylates), polyorthoesters, polyphosphazènes, polyaminoacides, polyamidoamines, polyméthylidènemalonate, polysiloxane, polyesters comme le polyhydroxybutyrate ou le poly(acide malique), ainsi que leurs copolymères et dérivés. Des polymères biodégradables naturels (protéines comme l'albumine ou la gélatine, ou des polysaccharides comme l'alginate, le dextrane ou le chitosane) peuvent également convenir.
En l'espèce, les polymères synthétiques sont tout particulièrement intéressants car leur bioérosion est observée rapidement. Toutefois, ces polymères ne sont pas toujours adaptés à être couplés avec un ou plusieurs polysaccharides car ils ne possèdent quasiment pas de groupements réactifs, surtout dans le cas des polyesters biodégradables (PLA, PCL, ...), et/ou parce que ces groupements réactifs n'existent qu'en extrémité de chaîne. En conséquence, le couplage de ces polymères avec un polysaccharide implique une fonctionnalisation préalable de leurs chaînes avec des groupements réactifs tout en contrôlant la nature des groupements naturellement présents en extrémité de chaîne. Ce sont notamment les composés ainsi obtenus que l'on entend désigner dans le cadre de la présente invention par le terme de dérivés de polymères biodégradables. C'est ainsi que le polymère biodégradable répond de préférence à la formule générale I :
(R.,) — [-polymère biodégradable A — ( 2)
dans laquelle :
- n et m représentent indépendamment l'un de l'autre, soit 0, soit 1 ,
- R, représente un groupement alkyle en C1-C20, un polymère différent du polymère biodégradable [par exemple poly(éthylène glycol)
(PEG), ou un copolymère contenant des blocs de PEG ou des unités d'oxyde d'éthylène, comme par exemple un polymère Pluronic®], une fonction réactive protégée présente sur le polymère (ex. BOC-NH-), une fonction carboxylique activée ou non, ou une fonction hydroxyle, et - R2 représente une fonction hydroxyle ou une fonction carboxylique activée ou non.
Sont notamment préférés comme polymères biodégradables selon l'invention, les polyesters : poly(acide lactique) (PLA), poly(acide glycolique) (PGA), poly(ε-caprolactone) (PCL), et leurs copolymères, comme par exemple le poly(acide lactique-co-acide glycolique) (PLGA), les polymères synthétiques tels les polyanhydrides, poly(alkylcyanoacrylates), polyorthoesters, polyphosphazènes, polyamides (ex. polycaprolactame), polyaminoacides, polyamidoamines, polyméthylidène malonate, poly(alkylène d-tartrate), polycarbonates, polysiloxane, polyesters comme le polyhydroxybutyrate ou polyhydroxyvalérate, ou le poly(acide malique), ainsi que les copolymères de ces matériaux et leurs dérivés.
Il s'agit plus préférentiellement d'un polyester de poids moléculaire inférieur à 50 000 g/mole et notamment d'un polycaprolactone. Outre un aspect avantageux en terme de biodégradabilité, le matériau selon l'invention est particulièrement intéressant en terme de propriétés de bioadhésion et de ciblage pour les particules qui en dérivent au niveau d'organes et/ou de cellules. C'est en particulier à travers le choix du polysaccharide associé, et notamment sa composition et son organisation structurelle au niveau des particules, que ce second aspect est plus précisément atteint.
Le ou les polysaccharides mis en œuvre selon l'invention sont des polysaccharides de structure linéaire, ramifiée ou réticulée, modifiée ou non.
Sous cette définition, on entend exclure du domaine de l'invention, les polysaccharides possédant une structure cyclique à l'image des cyclodextrines.
On entend par polysaccharide modifié tout polysaccharide ayant subi un changement au niveau de son squelette, comme par exemple l'introduction de fonctions réactives, le greffage d'entités chimiques (molécules, chaînons aliphatiques, chaînes de PEG, etc.). Bien sur, cette modification doit concerner peu des groupements hydroxyle ou aminé présents sur le squelette, de manière à laisser la grande majorité d'entre eux libres pour permettre ensuite le couplage des polymères biodégradables. Ainsi, il existe dans le commerce des polysaccharides modifiés par greffage de la biotine, de composés fluorescents, etc.. D'autres polysaccharides greffés avec des chaînes hydrophiles (ex. PEG) ont été décrites dans la littérature. Sous le terme réticulé, il est fait référence à des polymères formant un réseau tridimensionnel par opposition à des polymères linéaires simplifiés. Dans le réseau tridimensionnel, les chaînes sont connectées entre elles par des liaisons covalentes ou ioniques et les matériaux deviennent ainsi insolubles. Les polysaccharides convenant tout particulièrement à l'invention sont ou dérivent de la D-glucose (cellulose, amidon, dextrane), D-galactose, D-mannose, D-fructose (galactosane, manane, fructosane). La majorité de ces polysaccharides contiennent les éléments carbone, oxygène et hydrogène. Les polysaccharides conformes à l'invention peuvent contenir aussi du soufre et/ou de l'azote. Ainsi, l'acide hyaluronique (composé d'unités N-acétyle glucosamine et acide glucuronique), le chitosane, la chitine, l'héparine ou l'ovomucoïde contiennent de l'azote, tandis que la gélose, polysaccharide extrait d'algues marines, contient du soufre sous la forme de sulfate acide (>CH- O-SOgH). L'acide chondroitin-sulfurique contient simultanément du soufre et de l'azote.
L'ensemble de ces polysaccharides peut être fonctionnalisé avec des polymères biodégradables selon l'invention, dans la mesure où ils possèdent naturellement des fonctions aminé et/ou alcool libres.
Selon une variante préférée de l'invention, le polysaccharide possède un poids moléculaire supérieur ou égal à 6000 g/mole.
Dans le cas particulier du dextrane et de l'amilose (C6H10O5)n, n varie entre 10 et 620 et de préférence entre 33 et 220. Dans le cas de l'acide hyaluronique, la masse molaire varie entre 5 103 et 5 106 g/mole, de préférence entre 5 104 et 2 106 g/mole. Dans le cas du chitosane, la masse molaire varie entre 6 103 et 6 105 g/mole, de préférence entre 6 103 et 15 104 g/mole g/mole.
A titre illustratif des polysaccharides convenant plus particulièrement à l'invention, on peut citer les polydextroses comme le dextrane, le chitosane, le pullulane, l'amidon, l'amilose, l'acide hyaluronique, l'héparine, l'amilopectine, la cellulose, la pectine, l'alginate, le curdlan, le fucane, le succinoglycane, la chitine, le xylane, la xanthane, l'arabinane, la carragheenane, l'acide polyguluronique, l'acide polymannuronique, et leurs dérivés (comme par exemple le sulfate de dextrane, les esters de l'amilose, l'acétate de cellulose, etc). Sont plus particulièrement préférés le dextrane, l'amilose, le chitosane et l'acide hyaluronique, et leurs dérivés. Le matériau selon l'invention, sous forme de copolymère, peut inclure le polymère biodégradable et le polysaccharide dans un rapport massique variant de 1 :20 à 20 :1 et de préférence de 2 :9 à 2 :1.
A titre illustratif des matériaux revendiqués, on peut plus particulièrement citer ceux composés d'un copolymère dextrane- polycaprolactone, amilose-polycaprolactone, acide hyaluronique- polycaprolactone ou chitosane-polycaprolactone.
Les copolymères constituant le matériau revendiqué peuvent se présenter sous la forme de copolymères di-blocs, posséder une structure peigne ou encore une structure réticulée.
La nature préférée du squelette est un polysaccharide, et la nature préférée des greffons est un polymère biodégradable.
Des copolymères di-blocs ou peigne peuvent être obtenus en jouant sur le rapport molaire polysaccharide : polymère biodégradable lors de la synthèse. Les copolymères à structure réticulée peuvent être obtenus à partir de polymères biodégradables comportant au moins deux fonctions réactives.
Le second aspect de la présente invention concerne un procédé de préparation du matériau revendiqué.
Plus précisément, ce procédé comprend la mise en présence d'au moins une molécule d'un polymère biodégradable ou un de ses dérivés portant au moins une fonction réactive F1 avec au moins une molécule d'un polysaccharide à squelette linéaire, ramifié ou réticulé et portant au moins une fonction réactive F2 capable de réagir avec la fonction F1, dans des conditions propices à la réaction entre les fonctions F1 et F2 pour établir une liaison covalente entre lesdites molécules et en ce que l'on récupère ledit matériau.
Dans le cas où le polymère biodégradable est le polycaprolactone, le procédé de préparation revendiqué ne requiert pas l'utilisation d'un catalyseur comme les procédés conventionnels. Cette spécificité du procédé revendiqué est donc particulièrement avantageuse en terme d'innocuité et biodégradabilité au niveau du matériau résultant. Avantageusement, il s'agit d'une réaction quantitative, c'est-à-dire au moins une fonction F1 présente sur les molécules de polysaccharides réagit avec une fonction F2 présente sur une molécule de polymère biodégradable.
A ces fins, la réaction est réalisée dans des conditions telles qu'est prévenue la manifestation d'une quelconque réaction parasitaire, notamment l'implication de l'une des fonctions F1 ou F2 dans une autre réaction que la réaction de couplage attendue. On entend ainsi éviter les réactions intramoléculaires évoquées précédemment.
Selon une variante préférée de l'invention, la fonction réactive présente sur le polymère biodégradable est une fonction acide ou une fonction acide activée et la fonction réactive sur le polysaccharide est une fonction hydroxyle ou aminé. De préférence, le polysaccharide et le polymère biodégradable ou dérivé sont mis en présence dans un rapport massique variant de 1 :20 à 20 :1.
Dans le cas particulier ou la fonction réactive présente sur le polymère biodégradable est une fonction acide, la réaction de couplage peut être réalisée par activation par exemple avec la dicyclohexylcarbodiimide (DCC) ou le carbonyldiimidazole (DCI). Cette réaction d'estérification relève des compétences de l'homme de l'art.
Plus préférentiellement, les polysaccharides et polymères biodégradables répondent aux définitions proposées précédemment. En particulier, ils peuvent dériver de molécules de polysaccharides ou polymères biodégradables, naturelles et qui ont été modifiées de manière à être fonctionnalisées conformément à la présente invention.
Un troisième aspect de l'invention concerne des vecteurs constitués d'un matériau conforme à l'invention. Ces vecteurs sont de préférence des particules possédant une taille comprise entre 50 nm et 500 μm et de préférence entre 80 nm et 100 μm.
En fait, selon le protocole de préparation retenu pour préparer les particules à partir du matériau revendiqué, on peut fixer la taille de celles- ci.
Selon un mode préféré de l'invention, les particules ont une taille comprise entre 1 et 1000 nm et sont alors dénommées nanoparticules. Les particules de taille variant de 1 à plusieurs milliers de microns font référence à des microparticules.
Les nanoparticules ou microparticules revendiquées peuvent être préparées selon des méthodes déjà décrites dans la littérature, comme par exemple la technique d'émulsion/évaporation du solvant [R. Gurny et al. « Development of biodégradable and injectable latices for controlled release of potent drugs » Drug Dev. Ind. Pharm., vol 7, p. 1-25 1981)] ; la technique de nanoprécipitation à l'aide d'un solvant miscible à l'eau (FR 2 608 988 et EP 274 691 ). Il existe également des variantes de ces procédés. Par exemple, la technique dite de « double-émulsion », intéressante pour l'encapsulation de principes actifs hydrophiles, consiste à dissoudre ceux-ci dans une phase aqueuse, à former une emulsion de type eau/huile avec une phase organique contenant le polymère, puis à former une emulsion de type eau/huile/eau à l'aide d'une nouvelle phase aqueuse contenant un agent tensioactif. Après évaporation du solvant organique, on récupère des nano-ou des micro-sphères. Dans le cadre de la présente invention, il a également été mis au point par les inventeurs une nouvelle méthode particulièrement avantageuse qui comprend :
- l'introduction d'un matériau conforme à l'invention, en mélange le cas échéant avec un autre composé et/ou une matière active, dans un liquide, de préférence l'eau, à une concentration inférieure ou égale à 50 mg/ml,
- le chauffage de l'ensemble sous agitation jusqu'à une température propice à la fonte ou au ramollissement dudit matériau de manière à obtenir sa mise en dispersion sous forme de gouttelettes,
- le refroidissement de l'ensemble de manière à figer la structure ainsi obtenue, et
- la récupération des particules. II est à noter que ce procédé est plus particulièrement avantageux lorsque les polymères et copolymères constituant le matériau revendiqué comprennent à titre de polymère biodégradable un dérivé de polycaprolactone, et plus préférentiellement un dérivé de polycaprolactone de poids moléculaire inférieur à 5000 g/mole. Le matériau selon la présente invention a l'avantage majeur de posséder des propriétés tensioactives, de par sa nature amphiphile. Ces propriétés peuvent donc être exploitées avantageusement lors de la préparation de particules, par exemple, de manière à éviter l'utilisation d'agents tensioactifs, systématiquement utilisés dans les procédés susmentionnés. En effet, ces derniers ne sont pas toujours biocompatibles et sont difficiles à éliminer en fin de procédé.
Un autre avantage du matériau selon la présente invention est d'offrir la possibilité de moduler les propriétés qui interviennent dans le procédé de fabrication de particules à travers le choix : - du rapport massique polymère biodégradable polysaccharide et/ou
- des masses molaires des polymères biodégradables et des polysaccharides considérés.
Il est ainsi possible d'obtenir des copolymères hydrosolubles ou insolubles dans l'eau, ayant des balances hydrophile-lipophile pouvant varier entre 2 et 18 (permettant donc de stabiliser des émulsions eau/huile ou huile/eau).
Par ailleurs, il est possible de tirer avantage, lors de la fabrication de particules, des propriétés particulières de certains polysaccharides composant ledit matériau. Par exemple, il est connu que les alginates, les pectines ayant un degré d'estérification faible, et la gomme xanthane peuvent former des gels en présence d'ions Ca2+. On peut donc envisager de former des gels ou des particules à l'aide des matériaux polysaccharide-polymère biodégradable dans des conditions analogues. Ces particules posséderont l'avantage, par rapport à celles élaborées uniquement à partir de polysaccharides, de comporter des chaînes hydrophobes dans leur matrice, permettant un contrôle de la dégradation et une meilleure encapsulation en principes actifs de nature hydrophobe ou comportant des domaines hydrophobes comme certaines protéines. De même, on peut envisager la formation de particules à partir de deux types de matériaux selon la présente invention, comme par exemple à partir de copolymères alginate-polymère biodégradable et chitosane- polymère biodégradable.
A titre représentatif des particules selon l'invention, on peut plus particulièrement citer celles constituées d'un matériau dérivant d'au moins une molécule de polyester liée par une liaison de type ester ou amide à au moins une molécule de polysaccharide choisie parmi le dextrane, le chitosane, l'acide hyaluronique et l'amilose. De préférence, il s'agit de particules composées d'un matériau dérivant d'un bloc de polycaprolactone ou de poly(acide lactique) lié par une liaison de type ester ou amide à au moins une molécule de polysaccharide choisie parmi le dextrane, le chitosane, l'acide hyaluronique et l'amilose.
En ce qui concerne les structures de particules pouvant être obtenues à partir du matériau selon l'invention et les procédés susmentionnés, elles peuvent être variables. On distingue ainsi : une structure de type cœur hydrophobe en polymère biodégradable (pouvant encapsuler des principes actifs)- couronne hydrophile en polysaccharide, obtenues soit à l'aide de l'un des procédés sus-mentionnés, soit par adsorption du matériau selon l'invention sur des particules préformées ;
- une structure des particules selon laquelle la matrice en polymère biodégradable contient des inclusions aqueuses qui peuvent être obtenues par un procédé de « double emulsion » et adaptées à l'encapsulation des principes actifs hydrophiles. Selon le mode opératoire choisi et la balance hydrophile- lipophile du matériau, le polysaccharide peut se disposer soit exclusivement au niveau des inclusions aqueuses, soit au niveau de ces inclusions et de la surface des particules. Il peut également protéger les principes actifs encapsulés (protéines, peptides, ...) vis-à-vis des interactions, souvent dénaturantes, avec le polymère biodégradable hydrophobe et le solvant organique ;
- une structure de type cœur hydrophile (polysaccharide) - couronne hydrophobe (polymère biodégradable), lorsque les particules sont élaborées à partir d'une emulsion huile dans huile (par exemple, huile silicone-acétone) ou eau dans huile dans huile ;
- une structure micellaire, obtenue grâce à l' autoassociation d'un matériau conforme à l'invention en phase aqueuse, et - une structure dite gel formée par réticulation des polysaccharides avec des polymères biodégradables comportant au moins deux fonctions réactives.
Dans le cas de la présente invention, les particules se dégradent de préférence en une période s'étendant entre une heure et plusieurs semaines. Les particules selon l'invention peuvent contenir une substance active qui peut être de nature hydrophile, hydrophobe ou amphiphile et biologiquement active.
Comme matières actives biologiques, on peut plus particulièrement citer les peptides, les protéines, les carbohydrates, les acides nucléiques, les lipides, les polysaccharides ou leurs mélanges. Il peut également s'agir de molécules organiques ou inorganiques synthétiques qui, administrées in vivo à un animal ou à un patient, sont susceptibles d'induire un effet biologique et/ou manifester une activité thérapeutique. Il peut ainsi s'agir d'antigènes, d'enzymes, d'hormones, de récepteurs, de peptides, de vitamines, de minéraux et/ou de stéroïdes.
A titre représentatif des médicaments susceptibles d'être incorporés dans ces particules, on peut citer les composés antiinflammatoires, les anesthésiants, les agents chimiothérapeutiques, les immunotoxines, les agents immunosuppresseurs, les stéroïdes, les antibiotiques, les antiviraux, les antifongiques, les antiparasitaires, les substances vaccinantes, les immunomodulateurs et les analgésiques.
De même, on peut envisager d'associer à ces matières actives des composés destinés à intervenir au niveau de leur profil de libération. Par exemple, on peut ajouter dans la composition des particules, des chaînes de PEG, ou de polyester (modifiés ou non), et obtenir ainsi des particules dites composites. Comme déjà évoqué précédemment, on peut également mélanger plusieurs types de matériaux selon la présente invention, pour obtenir des particules mixtes, dans le but d'intervenir au niveau du profil de libération des matières encapsulées et d'obtenir des propriétés de surface des particules adaptées aux applications envisagées.
Enfin, on peut également incorporer dans les particules, des composés à finalité de diagnostic. Il peut ainsi s'agir de substances détectables par rayons X, fluorescence, ultrasons, résonance magnétique nucléaire ou radioactivité. Les particules peuvent ainsi inclure des particules magnétiques, des matériaux radio-opaques (comme par exemple l'air ou le barium) ou des composés fluorescents. Par exemple, les composés fluorescents comme la rhodamine ou le rouge de Nile peuvent être englobés dans des particules à cœur hydrophobe. Alternativement, des émetteurs gamma (par exemple Indium ou Technetium) peuvent y être incorporés. Des composés fluorescents hydrophiles peuvent également être encapsulés dans les particules, mais avec un rendement moindre comparativement aux composés hydrophobes, du fait de la moindre affinité avec la matrice. Des particules magnétiques commercialisées ayant des propriétés de surface contrôlées peuvent être également incorporées dans la matrice des particules ou attachées de manière covalente à l'un de leurs constituants.
La matière active peut être incorporée dans ces particules lors de leur processus de formation ou au contraire être chargée au niveau des particules une fois que celles-ci sont obtenues.
Les particules conformes à l'invention peuvent comprendre jusqu'à 95% en poids d'une matière active.
La matière active peut ainsi être présente en une quantité variant de 0,001 à 990 mg/g de particule et préférentiellement de 0,1 à 500 mg/g. Il est à noter que dans le cas de l'encapsulation de certains composés macromoléculaires (ADN, oligonucléotides, protéines, peptides, etc) des charges encore plus faibles peuvent être suffisantes.
Les particules selon l'invention peuvent être administrées de différentes façons, par exemple par voies orale, parentérale, oculaire, pulmonaire, nasale, vaginale, cutanée, buccale, etc... La voie orale, non invasive, est une voie de choix.
De manière générale, les particules administrées par voie orale peuvent subir différents processus : translocation (capture puis passage de l'épithélium digestif par les particules intactes), bioadhésion (immobilisation des particules à la surface de la muqueuse par un mécanisme d'adhésion) et transit. Pour ces deux premiers phénomènes, les propriétés de surface jouent un rôle majeur.
Le fait que les particules selon l'invention possèdent en surface de nombreuses fonctions hydroxyles, s'avère particulièrement avantageux pour y lier une molécule biologiquement active, une molécule à vocation de ciblage ou pouvant être détectée. On peut ainsi envisager de fonctionnaliser la surface de ces particules de manière à en modifier les propriétés de surface et/ou les cibler plus spécifiquement vers certains tissus ou organes. Eventuellement, les particules ainsi fonctionnalisées peuvent être maintenues au niveau de la cible par l'utilisation d'un champ magnétique, pendant l'imagerie médicale ou pendant qu'un composé actif est libéré. De même, des ligands de type molécules de ciblage comme des récepteurs, lectines, anticorps ou fragments de ceux-ci peuvent être fixés à la surface des particules. Ce type de fonctionnalisation relève des compétences de l'homme de l'art.
Le couplage de ces ligands ou molécules à la surface des particules peut être exécuté de différentes manières. Il peut être réalisé de manière covalente en attachant le ligand au polysaccharide recouvrant les particules ou de façon non covalente c'est à dire par affinité. Ainsi, certaines lectines ont pu être attachées par affinité spécifique aux polysaccharides situés à la surface de particules selon la présente invention, en exaltant ainsi les propriétés de reconnaissance cellulaire de ces particules. Il peut également être avantageux de greffer le ligand par l'intermédiaire d'un bras espaceur, pour lui permettre d'atteindre sa cible dans une conformation optimale. Alternativement, le ligand peut être porté par un autre polymère entrant dans la composition des particules.
L'invention concerne également l'utilisation des vecteurs et de préférence des particules obtenues selon l'invention pour encapsuler une ou plusieurs matières actives telles que définies précédemment. Un autre aspect de l'invention concerne également les compositions pharmaceutiques ou de diagnostic comprenant des vecteurs et de préférence des particules selon l'invention, le cas échéant associées à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable et compatible. Par exemple, les particules peuvent être administrées dans des capsules gastro-résistantes, ou incorporées dans des gels, implants ou tablettes. Elles peuvent aussi être préparées directement dans une huile (comme le Migliol®) et cette suspension administrée dans une capsule ou injectée au niveau d'un site précis (par exemple tumeur). Ces particules sont en particulier utiles à titre de vecteurs furtifs, c'est-à-dire capables d'échapper au système de défense immunitaire de l'organisme et/ou comme vecteurs bioadhésifs.
Les exemples et figures figurant ci-après sont présentés à titre iliustratif et non limitatif de la présente invention.
Figures :
Figure 1 : Représentation à l'aide d'un microscope optique de particules R-PCL-COOH fabriquées selon l'exemple 13 (polymère synthétisé selon l'exemple 1 ).
Figure 2 : Distribution de diamètres hydrodynamiques de particules R-PCL-COOH.
EXEMPLE 1
R-PCL-COOH
Des polymères PCL monofonctionnalisés de faible masse molaire
(2 à 4000 g/mole) du type R-PCL-CO2H (R= C9H19) sont obtenus à partir de 5,2 g de monomère (ε-caprolactone fraîchement distillé) et 0,3 g d'acide caprique (C9H19CO2H) de haute pureté. L'acide et le ε-caprolactone ont été introduits dans un ballon surmonté d'un réfrigérant ascendant. Après une purge des réactifs, le ballon a été introduit dans un bain d'huile thermostaté à 225°C. La réaction s'est poursuivie pendant 3h30 sous atmosphère inerte (argon). Elle a été stoppée par immersion du ballon dans un bain de glace. Le solide obtenu à été dissout à chaud dans 15 ml THF, puis a été précipité à température ambiante avec du méthanol froid.
Après trois reprécipitations, le rendement en poids de la réaction est 60-70%. Les masses molaires moyennes en nombre (Mn) et en poids (Mw) ont été déterminées par chromatographie d'exclusion stérique (CES) (éluant THF 1 ml/min, calibration universelle réalisée avec des standards de polystyrène). Mn est égale à 3420 g/mole et Mw à 4890 g/mole ; l'indice de polydispersité est donc égal à 1 ,4.
Une masse molaire moyenne en nombre égale à 3200 g/mole a été déterminée par titration avec une solution KOH/EtOH 10"2 M des échantillons de polymères d'environ 100 mg dissous dans un mélange acétone-eau.
D'autres polymères avec des R différents ont été obtenus par la même méthode, par exemple à partir de l'acide caproïque (R=C6H13).
EXEMPLE 2.
HOOC-PCL-COOH
Le polymère bifonctionnalisé HOOC-PCL-COOH a été synthétisé d'après le mode opératoire de l'exemple 1.
L'acide succinique (99,9%, AIdrich) utilisé comme amorceur a été séché sous vide à 110°C pendant 24h. Le monomère (ε-caprolactone) a été purifié par distillation sur hydrure de calcium.
La polymérisation à partir de 0,2 g d'acide succinique et de 4 g de ε-caprolactone a permis d'obtenir après 3h de réaction 3,2 g de polymère (rendement en poids 76% après quatre précipitations successives). Le dosage des groupements COOH terminaux par KOH/EtOH 10"2 M a permis de déterminer une acidité correspondant à une masse molaire de 3500 g/mole.
Par CES, Mn est égale à 4060 g/mole et Mw à 4810 g/mole, l'indice de polydispersité est de 1 ,2.
D'autres polymères de masse variable sont obtenus en changeant le rapport molaire acide : monomère.
EXEMPLE 3.
Figure imgf000023_0001
Le monomère (D,L-lactide) a été purifié par deux recristallisations dans l'acétate d'éthyle suivies de sublimation. Le catalyseur (octanoate d'étain) a été purifié par distillation sous vide très poussé. L'acide caprique utilisé comme amorceur a été purifié par recristallisation dans l'acétate d'éthyle, puis anhydrisé par distillation azeotropique avec du benzène.
L'acide caprique (0,12 g) et le D,L-lactide (3,5 g) ont été introduits dans un bicol muni d'un réfrigérant ascendant connecté à une rampe à vide/argon. Le ballon de réaction a été inerte, puis 7 ml de toluène anhydre ont été rajoutés à travers le septum. Après dissolution, 0,284 g de catalyseur ont été introduits et la réaction a été immédiatement démarrée par immersion du ballon dans un bain d'huile à 120°C. Après 4 heures, la réaction a été stoppée, le toluène a été évaporé, et le polymère appelé R-PLA-COOH a été dissout dans du dichlorométhane et précipité avec de l'ethanol. Après quatre précipitations successives, il a été obtenu une acidité constante dans le polymère, qui a été ensuite séché.
La masse molaire Mw déterminée par CES est 22 Kg/mole. Le dosage des groupements terminaux par KOH/EtOH 10"2 M a permis de déterminer une acidité correspondant à une masse molaire de 21 Kg/mole. En variant le rapport molaire monomère/amorceur et le temps de réaction, il a été possible d'obtenir des polymères ayant des masses molaires comprises entre 10 et 50 Kg/mole.
EXEMPLE 4.
R-PCL-OH et R-PLA-OH (R= alkyle
Des polymères PCL ou PLA monofonctionnalisés en bout de chaîne par un groupement alcool (R-PCL-OH ou R-PLA-OH) ont été synthétisés selon le protocole de l'exemple 3, mais en substituant à l' amorceur acide, un amorceur alcool, par exemple C7H15OH.
5g de caprolactone et 0,29 g d'alcool heptilique ont été chauffés dans du toluène au reflux pendant 2h sous atmosphère inerte et en présence d'octanoate d'étain en quantité équimolaire avec l'amorceur.
Après deux précipitations, le rendement massique de la réaction est 54%. La masse molaire Mw est de 2100 g/mole.
Le test avec KOH/EtOH n'a pas permis de détecter des traces d'acidité libre.
EXEMPLE 5. R-PEG-PLA-COOH (R=OMe)
L'amorceur acide, le poly(éthylène glycol) comportant à un bout de chaîne un groupement méthoxy et à l'autre un groupement acide carboxylique (MeO-PEG-COOH) (Shearwater Polymers, 5000g/mole) a été séché préalablement à la réaction. Le lactide a été purifié par deux recristallisations (acétate d'éthyle) et par sublimation. Le rapport massique des réactifs MeO-PEG-COOH :lactide a été 1 :9 et le rapport molaire MeO-PEG-COOH :catalyseur a été 1 :1. La polymérisation s'est poursuivie pendant 2h sous atmosphère inerte au reflux du toluène (solvant). Après évaporation du toluène, le copolymère est purifié par deux précipitations successives. La masse Mw déterminée par CES est de 42Kg/mole. EXEMPLE 6.
R-PCL-ester de NHSI (R≈alkyle)
La fonction acide des polymères R-PCL-COOH (exemplel ) est transformée dans l'ester activé en la faisant réagir avec la N-hydroxy succinimide (NHSI), en présence de dicyclohéxyl carbodiimide (DCC), dans un mélange DMF :CH2CI2 1 :2 (v :v). La DCC a été rajouté en léger excès molaire (1 ,1 ) par rapport aux chaînes de R-PCL-COOH et la NHSI en excès par rapport aux fonctions -COOH. Les réactifs ont été solubilisés dans un volume minimal de solvant, avec un léger chauffage. La réaction a lieu à 50°C pendant 24h sous atmosphère inerte. Après filtration de l'urée formée (DCU), les solvants sont évaporés et le DMF est entraîné avec de l'éther. Le polymère est lavé à l'eau et séché. D'après la masse de DCU pesée à chaque synthèse de ce type, le rendement de la réaction est quantitatif. L'ester ainsi obtenu est soluble dans THF, acétone, solvants chlorés, etc..
EXEMPLE 7 PCL-DEX
Le polymère R-PCL-ester NHSI (R=C9H19) possédant la fonction ester activée (exemple 6) est dissout dans du DMSO, puis une quantité égale de dextran (Pharmacia, masse molaire 40 000 g/mole) est introduite. La réaction de couplage a lieu pendant 144 heures à 70°C sous argon. La réaction de transestérification a lieu avec libération de NHSI. Après évaporation des solvants, le produit final est lavé à l'eau pour enlever le NHSI et des copolymères hydrosolubles, puis avec du dichlorométhane pour extraire des traces de polyester non réagi.
On obtient avec un rendement de 40% un copolymère Dex-PCL, de type peigne, comportant un squelette de dextrane (Dex) (masse molaire 40000 g/mole) et des chaînons latéraux de PCL liés par des ponts ester. Le copolymère est purifié en fin de réaction. Sa composition globale est déterminée par microanalyse élémentaire et par RMN. Le copolymère contient 33% en poids de PCL.
Le même protocole a été utilisé pour un dextrane de masse molaire plus faible, 6000g/mole (Fluka).
EXEMPLE 8 Dex-PCL
3g de R-PCL-COOH (exemple 1) sont anhydrisés par distillation azeotropique, puis séchés sous vide à 40-50°C, pendant une nuit, directement dans le ballon de réaction de 50 ml surmonté d'un réfrigérant ascendant et connecté à une rampe vide/argon. On rajoute ensuite dans le ballon 5 ml de THF sec. Après dissolution de l'acide, on rajoute dans le ballon 0,243 g de carbonyle diimidazole (CDI) qui se dissout rapidement. Le mélange inerte est porté au reflux du THF. On observe un dégagement de CO2. Après 3 heures, le THF est évaporé.
1 ,29 g de dextrane (Fluka, masse molaire 6000 g/mole) préalablement anhydrisé sont dissous à chaud dans 7 ml de DMSO anhydre, puis rajoutés dans le ballon de réaction contenant l'intermédiaire imidazolide de l'acide R-PCL-COOH. On chauffe le mélange de réaction à 130°C pendant 3 heures. La solution devient brunâtre. On évapore le DMSO puis on dissout le produit de réaction dans du chloroforme et on l'introduit dans une ampoule à décanter. On l'extrait avec de l'eau distillée. La phase aqueuse se présente comme une emulsion abondante stable. Après évaporation du solvant, on ne retrouve pratiquement pas de résidu dans la phase organique. On évapore la phase aqueuse et on obtient ainsi un précipité qu'on sépare. On lave le polymère ainsi obtenu avec de l'éther puis on le sèche. La masse molaire déterminée par CES (tableau 1) est de 11000 g/mole. Cette méthode avec rendement élevé (> 80 %), rapide et sélective, est préférée par la suite. En variant le rapport massique dextrane : R-PCL-COOH dans la synthèse du Dex-PCL, il est possible d'obtenir par cette méthode une série de copolymères Dex-PCL contenant des taux massiques de Dex variables. Ces copolymères ont été caractérisés par chromatographie de perméation sur gel (détecteurs réfractomètre et viscosimètre, à 70°C), à l'aide d'une colonne ViscoGel (GMHHR-H, Viscotek, GB), étalonnée avec des standards de Pullulane. Les copolymères Dex-PCL ont été dissous dans du diméthyle acétamide (DMAC) à des concentrations de 5 mg/ml. Les volumes injectés ont été 100 μl. L' éluant a été DMAC contenant 0,4% LiBr, à un débit de 0,5 ml/min. Les masses molaires ont été déterminées par la méthode de la calibration universelle. Quelques exemples figurent dans le tableau 1.
Figure imgf000027_0001
Le Dex-PCL7 dérive de la mise en présence de dextrane à raison de 5% et de PCL à raison de 95%. Le Dex-PCL5 dérive de la mise en présence de dextrane à raison de 20% et de PCL à raison de 80%.
Le Dex-PCL3 dérive de la mise en présence de dextrane à raison de 33% et de PCL à raison de 67%.
Tableau 1. Caractéristiques du dextrane de départ et de trois copolymères Dex-PCL comportant respectivement 7, 5 ou 3 chaînons de PCL greffés au niveau du squelette de dextrane, synthétisés en utilisant dans le mélange réactionnel 5, 20 ou 33 % en poids de dextrane (par rapport au poids total de RPCL-COOH et de dextrane) :
Mw : masse molaire moyenne en poids
Mn : masse molaire moyenne en nombre Pd : polydispersité (=Mw/Mn)
Ivw : viscosité intrinsèque moyenne en poids
Rgw : rayon de giration moyen en poids dn/dc : variation de l'indice de réfraction spécifique avec la concentration. Les trois copolymères présentent une faible polydispersité et des masses molaires moyennes en poids comprises entre 11000 et 19000 g/mole.
EXEMPLE 9 amilose-PCL
0,2g amilose (Fluka, extraite de pommes de terre) sont dissous dans 8ml DMSO. Il résulte une solution trouble, à laquelle on rajoute 0,2 g de R-PCL-ester de NHSI (exemple 6) dissout dans 3 ml DMSO. Ce mélange est incubé à 70°C pendant 144h. Après évaporation des solvants, le solide est repris avec 200 ml eau et 200 ml chloroforme dans une ampoule à décanter. La phase intermédiaire contenant le polymère amphiphile est récupérée et extraite encore une fois, puis séchée. Ce traitement est une variante de la méthode de purification de l'exemple 7.
Le rendement en poids après la deuxième extraction est de 38% (pds).
Les résultats de la microanalyse permettent de déterminer la composition globale du copolymère amphiphile obtenu, qui contient 32% en poids de PCL. EXEMPLE 10.
Chitosane-PCL
Le copolymère chitosane-polycaprolactone est obtenu selon le protocole de l'exemple 9. La synthèse a été effectuée à partir du chitosane brut (Fluka, 150000 g/mole) et le rendement d'obtention du copolymère a été 22% en' poids. D'après la microanalyse élémentaire, le copolymère contient 67% en poids de PCL. Il est de type peigne, avec un squelette de chitosane et des chaînons latéraux de PCL liés majoritairement par des liaisons amides.
EXEMPLE 11
HA-PCL
L'acide hyaluronique (Accros, masse molaire supérieure à 106 g/mole) sous la forme de carboxylate de sodium est dissous dans l'eau MilliQ, et converti sous la forme acide libre à l'aide d'une résine superéchangeuse de cation, et lyophilisé. Le produit ainsi obtenu est assez soluble dans le DMSO et permet de réaliser le couplage avec l'ester NHSI du R-PCL-COOH, d'après le protocole des exemples 7 et 9.
Le copolymère de type peigne acide hyaluronique-PCL est récupéré dans la phase aqueuse. II n'y a pas de phase intermédiaire.
D'après la microanalyse, ce copolymère contient 18% en poids de PCL.
EXEMPLE 12
Nanoparticules R-PCL-COOH Une masse bien définie de R-PCL-COOH synthétisé selon l'exemple 1 est dissoute dans l'acétone pour obtenir une concentration de 20mg/ml. Un volume d'eau égal au double du volume d'acétone est versé goutte-à-goutte. Spontanément, le polymère forme des nanosphères d'un diamètre moyen de 210 nm (mesuré après l' évaporation du solvant), en absence d' agent tensioactif . EXEMPLE 13
Nanoparticules Dex-PCL
Une masse bien définie de copolymère Dex-PCL synthétisé selon l'exemple 7 est introduite dans le dichlorométhane pour obtenir une concentration de 10 mg/ml. Le polymère est dispersé et gonflé par le solvant, mais il ne se dissout pas. Un volume d'eau deux à vingt fois supérieur au volume de dichlorométhane est rajouté. Une emulsion grossière est d'abord formée, puis affinée grâce aux ultrasons. Le copolymère amphiphile stabilise l'émulsion, en évitant ainsi la nécessité de rajouter des agents tensioactifs. Après évaporation du solvant organique, on obtient des nanoparticules.
Le diamètre moyen des particules est déterminé par diffusion de la lumière (PCS). La taille des particules, généralement inférieure à 300 nm par ce procédé, dépend de la concentration, du rapport des volumes des deux phases aqueuse et organique, du temps et de la puissance de sonication.
EXEMPLE 14.
22 mg R-PCL-COOH (exemple 1) sont introduits dans 10 mi eau MilHQ et chauffés à 80°C sous agitation magnétique. Suite à la fusion du polymère à cette température, des particules sphériques ont été formées (Fig. 1). Le refroidissement du récipient a permis ensuite de figer les structures ainsi formées. Les particules ont pu être récupérées ensuite par sédimentation. II a été observé que le rajout de l'ethanol en faible quantité permettait d'améliorer la fabrication en évitant la formation de films à la surface de l'eau. EXEMPLE 15.
Des particules ont été formées selon le protocole de l'exemple 14, sauf qu'à la place de l'eau, une solution tampon acétate pH4,8 saturée en chitosane a été utilisé. Des particules sphériques ont été ainsi obtenues.
EXEMPLE 16.
22 mg R-PCL-COOH (exemple 1) sont introduits dans 10 ml eau
MilliQ et chauffés à 80°C. Une sonde à ultrasons a été plongée ensuite dans le récipient et des ultrasons ont été appliqués (20W, 20sec). Ceci a 0 permis d'obtenir des microsphères d'un diamètre hydrodynamique moyen de 1 ,1 μ (déterminé par PCS) et ayant une faible polydispersité (fig. 2).
Il a été noté que l'utilisation d'un ultraturax pouvait remplacer la sonication pour la formation des nanoparticules.
Il a été observé que le copolymère Dex-PCL (exemple 7) et le 5 copolymère chitosane-PCL (exemple 9) formaient également des particules par ce procédé.
Il a été noté qu'il était également possible de former des particules par ce procédé en remplaçant l'eau par une huile (par exemple Migliol®) ou par un polymère (comme le PEG de masse molaire 200 g/mole). Ces o essais ont été réalisés avec 25 mg de polymère dans 5 ml de liquide.
EXEMPLE 17. bioadhésion
L'interaction des particules selon l'invention avec des cellules 5 Caco2 en culture, utilisées comme modèle d'interaction pour les particules destinées pour la voie orale a été étudiée. Le PLA tritié a été encapsulé comme marqueur radioactif dans des nanoparticules Dex-PCL (exemple 7) pour permettre de déterminer avec précision la localisation des particules (à l'intérieur ou à la surface des cellules ou dans le milieu de 0 culture). Ce marquage s'est révélé parfaitement stable dans le milieu de culture, autorisant donc ces études. Des cellules Caco2 ont été cultivées dans des plaques à 24 puits, avec changement du milieu (1 ,5 ml/puits DMEM 4,5 g/l glucose, 15% sérum de vœu fœtal) tous les 1 ou 2 jours jusqu'à confluence. Après environ 4 jours, lorsque les cellules sont arrivées à confluence, le milieu est retiré, on rajoute 1 ,5 ml de milieu Hank's, on attend 2h puis on rajoute les suspensions de nanosphères contenant des quantités bien définies de particules (dans un volume total de 100 μl). L'activité par puits dans le milieu de culture a été fixée à 0,1 μCi. Après trois heures d'incubation à 37°C dans un incubateur à CO2, le surnageant a été retiré, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS, puis lysées pendant 1 h avec 1 ml de NaOH 0,1 M. La radioactivité a été comptée dans le surnageant, les eaux de lavage et le lysat cellulaire. Ainsi, il a été possible de déterminer avec précision la quantité de nanoparticules effectivement associée aux cellules.
La quantité des nanoparticules Dex-PCL associée aux cellules Caco2 est double par rapport à celles en polyester (PLA, Phusis, Mw 40000 g/mole) fabriquées par la technique de la nanoprécipitation (exemple 10) en présence de Pluronic®. Ainsi, 2,5% et 1 ,1 % respectivement des nanoparticules sont associées aux cellules.
EXEMPLE 18 couplage de lectines par affinité, ciblage
Une suspension de nanoparticules radiomarquées, fabriquées à partir de Dex-PCL (exemple 7), est mise en contact avec une solution de lectine de pois (Lens culinaris) en excès par rapport aux particules, de manière à saturer la surface de celles-ci en lectine adsorbée par affinité.
L'interaction des nanoparticules ainsi recouvertes de lectine avec des cellules Caco2 en culture est étudiée selon le protocole précédent (exemple 16).
La quantité des nanoparticules associée aux cellules Caco2 est significativement augmentée par rapport à celles non recouvertes de lectine. Ainsi, 3,5% des nanoparticules introduites en chaque puits sont associées aux cellules, par rapport à 2,5% en absence de lectine.
EXEMPLE 19 Furtivité
La capacité de nanoparticules recouvertes de dextrane (fabriquées à partir de Dex-PCL, exemple 7) à éviter la capture par des cellules phagocytes (J774) a été comparée à celles de même taille (environ 200 nm) et recouvertes de PEG 5000 g/mole (fabriquées à partir de PEG-PLA synthétisé selon l'exemple 4, à partir de Me-O-PEG-OH 5000 g/mole et de lactide, avec une masse molaire du bloc de PLA de 50000 g/mole). Les cellules J774 ont été cultivées dans des plaques à 24 puits, dans un milieu DMEM contenant 4,5 g/1 glucose et 10% sérum de vœu fœtal. Préalablement aux expériences, le surnageant des cellules a été renouvelé et on a attendu 4h avant de rajouter les suspensions de nanoparticules radiomarquées dans les puits. La capture des nanoparticules Dex-PCL et des nanoparticules de référence de même taille recouvertes par du PEG a été pratiquement la même (1 à 2%), malgré la capacité bien connue de ce type de cellules à phagocyter des nanoparticules. Ceci est une indication concernant le caractère « furtif » des nanoparticules recouvertes de dextrane, similaire à celui des particules recouvertes de PEG, bien connues dans la littérature.

Claims

REVENDICATIONS
1. Matériau à structure chimique contrôlée composé d'au moins un polymère biodégradable et d'un polysaccharide à squelette linéaire, ramifié ou réticulé, caractérisé en ce qu'il dérive de la fonctionnalisation contrôlée d'au moins une molécule dudit polymère biodégradable ou d'un de ses dérivés par greffage covalent directement au niveau de sa structure polymérique, d'au moins une molécule dudit polysaccharide.
2. Matériau selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il est constitué d'au moins 90% en poids d'un copolymère dérivant de la fonctionnalisation contrôlée d'au moins une molécule d'un polymère biodégradable ou d'un de ses dérivés par greffage covalent directement au niveau de sa structure polymérique d'au moins une molécule d'un polysaccharide à squelette linéaire, ramifié ou réticulé.
3. Matériau selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est dépourvu en produit de départ.
4. Matériau selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il possède une polydispersité inférieure ou égale à 2.
5. Matériau selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la liaison covalente établie entre la molécule de polymère biodégradable et la molécule de polysaccharide est de nature ester ou amide.
6. Matériau selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la liaison covalente dérive de la réaction entre une fonction hydroxyle ou une fonction aminé présente sur la molécule du polysaccharide et une fonction carboxylique, activée ou non, présente sur la molécule du polymère biodégradable.
7. Matériau selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polymère biodégradable répond à la formule : biodégradable
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Figure imgf000035_0001
dans laquelle
- n et m représentent indépendamment l'un de l'autre, soit 0, soit 1 ,
- R, représente un groupement alkyle en C,-C20, un polymère différent du polymère biodégradable, une fonction réactive protégée présente sur le polymère, une fonction carboxylique, activée ou non, ou une fonction hydroxyle, et 0 - R2 représente une fonction hydroxyle ou une fonction carboxylique activée ou non.
8. Matériau selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polymère biodégradable est ou dérive d'un poly(acide lactique) (PLA), poly(acide glycolique) (PGA), poly(ε- 5 caprolactone) (PCL), les polymères synthétiques tels les polyanhydrides, poly(alkylcyanoacrylates), polyorthoesters, polyphosphazènes, polyamides, polyaminoacides, polyamidoamines, polyméthylidène malonate, poly(alkylène d-tartrate), polycarbonates, polysiloxane, polyesters comme le polyhydroxybutyrate ou polyhydroxyvalérate, ou le o poly(acide malique), ainsi que leurs copolymères et dérivés.
9. Matériau selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polymère biodégradable est un polyester de poids moléculaire inférieur à 50.000 g/mole.
10. Matériau selon l'une des revendications précédentes, 5 caractérisé en ce que le polymère biodégradable est un polycaprolactone.
11. Matériau selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polysaccharide possède un poids moléculaire supérieur ou égal à 6000 g/mole.
12. Matériau selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polysaccharide est choisi parmi le dextrane, le chitosane, le pullulane, l'amidon, l'amilose, l'acide hyaluronique, l'héparine, l'amilopectine, la cellulose, la pectine, l'alginate, le curdlan, le fucane, le succinoglycane, la chitine, le xylane, la xanthane, l'arabinane, la carragheenane, l'acide polyguluronique, l'acide polymannuronique, et leurs dérivés.
13. Matériau selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il associe ou non un polymère biodégradable et un polysaccharide dans un rapport massique variant de 1 :20 à 20 :1 et de préférence de 2 :9 à 2 :1.
14. Matériau selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'un copolymère di-bloc.
15. Matériau selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il possède une structure peigne ou une structure réticulée.
16. Matériau selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un copolymère possédant un squelette polysaccharide et des greffons polymères biodégradables.
17. Matériau selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il dérive d'un copolymère choisi parmi dextrane- polycaprolactone, amilose-polycaprolactone, acide hyaluronique- polycaprolactone, et chitosane-polycaprolactone.
18. Procédé de préparation d'un matériau selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on met en présence au moins une molécule d'un polymère biodégradable ou un de ses dérivés portant au moins une fonction réactive F1 avec au moins une molécule d'un polysaccharide à squelette linéaire, ramifié ou réticulé et portant au moins une fonction réactive F2 capable de réagir avec la fonction F1 , dans des conditions propices à la réaction entre les fonctions F1 et F2 pour établir une liaison covalente entre lesdites molécules et en ce que l'on récupère ledit matériau.
19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que le polymère biodégradable est tel que défini en revendications 7 à 10 et le polysaccharide selon la revendication 11 ou 12.
20. Procédé selon la revendication 18 ou 19, caractérisé en ce que la fonction réactive du polymère biodégradable est une fonction acide activée et celle du polysaccharide une fonction hydroxyle ou aminé.
21. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polysaccharide et le polymère biodégradable ou dérivé sont mis en présence dans un rapport massique variant de 1 :20 à 20 :1.
22. Vecteur obtenu à partir d'un matériau selon l'une des revendications 1 à 17.
23. Vecteur selon la revendication 22, caractérisée en ce qu'il s'agit de particules.
24. Vecteur selon la revendication 22 ou 23, caractérisée en ce qu'il s'agit de microparticules ou nanoparticules.
25. Vecteur selon l'une des revendications 22 à 24, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une substance active.
26. Vecteur selon la revendication 25, caractérisé en ce que la substance active est choisie parmi les peptides, protéines, carbohydrates, acides nucléiques, lipides ou des molécules organiques ou inorganiques susceptibles d'induire un effet biologique et/ou à activité thérapeutique.
27. Vecteur selon l'une des revendications 22 à 26, caractérisé en ce qu'il comprend jusqu'à 95% en poids d'une matière active.
28. Vecteur selon l'une des revendications 22 à 27, caractérisée en ce qu'il s'agit de particules comprenant en outre au moins une molécule liée de manière covalente à sa surface.
29. Vecteur selon l'une des revendications 22 à 27, caractérisée en ce qu'il s'agit de particules comprenant en outre au moins une molécule liée de manière non covalente à sa surface.
30. Vecteur selon la revendication 28 ou 29, caractérisée en ce que cette molécule est une molécule biologiquement active, une molécule à vocation de ciblage ou pouvant être détectée.
31. Vecteur selon la revendication 30, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une molécule de ciblage choisie parmi les anticorps et fragments d'anticorps et lectines.
32. Vecteur selon l'une des revendications 22 à 31 , caractérisé en ce qu'il s'agit de particules constituées d'un matériau dérivant d'au moins une molécule de polyester liée par une liaison de type ester ou amide à au moins une molécule de polysaccharide choisie parmi le dextrane, le chitosane, l'acide hyaluronique et l'amilose.
33. Vecteur selon l'une des revendications 22 à 31 , caractérisé en ce qu'il s'agit de particules constituées d'un matériau dérivant d'un bloc de polycaprolactone ou de poly(acide lactique) lié par une liaison de type ester ou amide à au moins une molécule de polysaccharide choisie parmi le dextrane, le chitosane, l'acide hyaluronique et l'amilose.
34. Procédé de préparation d'un vecteur sous forme de particules selon l'une des revendications 22 à 33, caractérisé en ce qu'il comprend au moins : - l'introduction d'un matériau selon l'une des revendications 1 à 17, le cas échéant avec un autre composé et/ou une matière active, dans un liquide, de préférence l'eau, à une concentration inférieure ou égale à 50 mg/ml, - le chauffage de l'ensemble sous agitation jusqu'à une température propice à la fonte ou au ramollissement dudit matériau de manière à obtenir sa mise en dispersion sous forme de gouttelettes,
- le refroidissement de l'ensemble de manière à figer la structure ainsi obtenue, et - la récupération desdites particules.
35. Procédé selon la revendication 34, caractérisé en ce que le matériau est un copolymère de poly(ε-caprolactone) de poids moléculaire inférieur à 5000 g/mole.
36. Procédé selon la revendication 34 ou 35, caractérisé en ce qu'il est réalisé en présence également de la matière active à encapsuler.
37. Utilisation d'un vecteur selon l'une des revendications 17 à 33 pour encapsuler au moins une matière active.
38. Utilisation selon la revendication 37, caractérisée en ce que les matières actives sont choisies parmi les peptides, protéines, carbohydrates, acides nucléiques, lipides, ou des molécules organiques ou inorganiques susceptibles d'induire un effet biologique et/ou à activité thérapeutique.
39. Composition pharmaceutique ou de diagnostic caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de matière active un vecteur selon l'une des revendications 17 à 33.
40. Composition de diagnostic caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de matière active un vecteur selon l'une des revendications 17 à 33.
41. Utilisation d'un vecteur selon l'une des revendications 17 à 33, à titre de vecteurs « furtifs ».
42. Utilisation d'un vecteur selon l'une des revendications 17 à 33 à titre de vecteurs bioadhésifs.
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