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WO1998035049A1 - Disulfure-isomerase de proteine de levure recombinee et son procede de preparation - Google Patents

Disulfure-isomerase de proteine de levure recombinee et son procede de preparation Download PDF

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Publication number
WO1998035049A1
WO1998035049A1 PCT/JP1998/000498 JP9800498W WO9835049A1 WO 1998035049 A1 WO1998035049 A1 WO 1998035049A1 JP 9800498 W JP9800498 W JP 9800498W WO 9835049 A1 WO9835049 A1 WO 9835049A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pdi
yeast
gene
expression vector
medium
Prior art date
Application number
PCT/JP1998/000498
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Nobuyoshi Ishii
Yasuo Suzuki
Kohji Uchida
Yushi Matuo
Hideo Tanaka
Original Assignee
Oriental Yeast Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oriental Yeast Co., Ltd. filed Critical Oriental Yeast Co., Ltd.
Priority to EP98901535A priority Critical patent/EP0974665A4/en
Publication of WO1998035049A1 publication Critical patent/WO1998035049A1/ja
Priority to US09/368,588 priority patent/US6387683B1/en

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi
    • Y10S435/94—Saccharomyces
    • Y10S435/942—Saccharomyces cerevisiae

Definitions

  • the present invention relates to a yeast-derived enzyme, a recombinant protein of protein disulfide isomerase (protein didisulfide, diisomersomese) (hereinafter referred to as “PDI”), and a method for producing the same.
  • PDI protein didisulfide, diisomersomese
  • the present invention provides a recombinant yeast PD I by modifying the coding region of the C-terminal endoplasmic reticulum localization signal in the yeast PDI gene and expressing the gene in an expression vector.
  • the enzyme is secreted outside the cells while maintaining sufficient enzyme activity, thereby enabling mass production.
  • the production method of the present invention further comprises obtaining a yeast PD I recombinant protein under a culture condition in which the pH is near neutral by using a host cell that can be cultured even under a condition in which the pH is near neutral. It is. Background art
  • PDI is an enzyme that catalyzes disulfide exchange in proteins (EC 5.3.3.4).
  • the PDI protein is localized in the lumen of the eukaryotic endoplasmic reticulum and has an activity of catalyzing the disulfide bond binding of a secreted protein translated by the membrane-bound ribosome and sent to the endoplasmic reticulum.
  • PDI a useful enzyme that can be applied to improve the properties of protein-containing foods such as dough, ham and sausage, seafood paste products, and tofu.
  • the PDI protein from L. cerevisiae has a molecular weight of about 70,000 and an isoelectric point of about 4.0—4.1, with an optimal pH of about 8.5-8.75. (J. Biochem., 108, 846 (1990), JP-A-4-197176).
  • yeast PDI is an enzyme protein present in the cells.To obtain the enzyme, after culturing the cells, the cells are disrupted, extracted from the cell disruption solution, crudely extracted, and collected. It had to go through a complicated process of obtaining. This cumbersome extraction process simply adds to the cost problem.
  • yeast PDI is an enzyme having an unstable property that is easily deactivated by heat or heavy metal ions, etc., and thus, accompanying the complexity of the extraction process, it is necessary to maintain the activity throughout the entire process. Careful and complicated operations are required.
  • a means for secreting and producing the enzyme which is a substance in the cell, out of the cell is effective. That is, if cells can be continuously produced in a culture solution outside the cells from the cells once cultivated, the number of times of culturing the cells is reduced, and the step of crushing the cells becomes unnecessary.
  • purification from a culture solution containing few impurities simplifies the purification process, reduces the effect on activity, and enables efficient mass production.
  • yeast PDI retains an extracellular secretory signal at the time of its precursor, and is produced in the endoplasmic reticulum, the origin of the secretory pathway. However, even if an attempt is made to express yeast PDI so that it is secreted extracellularly, it is not secreted into cells in the wild-type (M. Lamantiia et al, Cell, 74, 899, 1993). This is presumed to be due to the retention of the C-terminal ER localization signal (eg, in the case of the yeast Saccharomyces cerevisiae, the amino acid sequence is HDEL). In addition, yeast—there is only one PDI gene per cell—the amount of PDI produced per cell is extremely small and cannot be obtained at a sufficient concentration even if secreted into the culture solution.
  • yeast PDI activity is unstable in the acidic region, the optimal pH of normal yeast is in the weakly acidic region, and PDI is inactivated in this weakly acidic region (pH 6.0 or less).
  • yeast cells cannot normally maintain activity at pH in the region where PDI is not inactivated.
  • general yeast culture medium components also contain substances that reduce or inactivate PDI activity.If a medium containing such components is used, extracellularly produced PDI will be lost. Due to such various reasons, a method for mass-producing yeast PDI in an active state has not been developed before the present invention. Summary of the Invention
  • the present invention provides a method suitable for producing large quantities of biologically active recombinant yeast protein disulfide isomerase. Specifically, the production method of the present invention is characterized in that yeast PDI protein is produced and secreted extracellularly by a genetic engineering technique using the yeast PDI gene.
  • the present invention also provides a recombinant yeast protein disulfide isomerase produced by the production method of the present invention.
  • FIG. 1 is a diagram showing the progress of culture of Saccharomyces cerevisiae P1 and Y3 near neutral pH.
  • FIGS. 2 to 4 are a series of diagrams showing the base sequence of the PDI gene derived from Saccharomyces cerevisiae.
  • Figure 5 shows a restriction map of the yeast expression vector YEp1GII: Figures 6 to 10 show the complete nucleotide sequence of the yeast expression vector Yp1GII. is there.
  • FIG. 11 (A) is an image image of electrophoresis of a culture solution of various transformed yeasts using SDS-PAGE gel; (B) is an illustration of (A) It is. Detailed description of the invention
  • the present inventors have made intensive studies to solve the above problems, and as a result, by preparing yeast PDI by genetic engineering, extracellular cells with sufficient enzyme activity are maintained. At the same time, it has enabled mass production.
  • chromosome D from the yeast Saccharomyces cerevisiae
  • the yeast PDI gene obtained from NA H. Tachikiwawaeta, J.
  • Biochemical em., 110, 306-313, 199 1) (donated by Tachikawa) was transformed into a C-terminal 4-amino acid sequence H ( Histidine) D (aspartic acid) E (glutamic acid) L (leucine) Modified so that it does not encode, connect to a strong promoter, and use a multi-copy vector such as YE p-type.
  • the cells were introduced into host cells capable of growing in a medium and transformed.
  • the present invention was completed by expressing yeast PDI having enzymatic activity in a large amount in a culture solution outside the cells.
  • the present invention provides a method for producing a biologically active recombinant yeast protein disulphide isomerase
  • the secreted enzyme is further concentrated or purified.
  • the endoplasmic reticulum localization signal is a C-terminal 4-amino acid sequence (HDEL).
  • the expression vector is the yeast expression vector YEp1GII shown in FIG.
  • the host cells are cultured while maintaining the pH at 6.5-8.
  • the present invention also provides a recombinant yeast protein disulphide isomerase produced by the production method of the present invention.
  • the present invention also includes an expression vector and a transformed host cell used in the above production method.
  • the yeast PDI gene is not limited, and for example, a PDI gene derived from yeast Saccharomyces' Celepiche described in SEQ ID NO: 1 (Fig. 2-4) can be used.
  • the PDI gene derived from the yeast Saccharomyces cerevisiae is also disclosed in H. Tachikawaeta 1., J. Biochem., 110, 306—313, 1991, and JP-A-4-19771. And so on.
  • PDI is considered to be present in many yeasts besides Saccharomyces cerevisiae.Enzymes present in such other yeasts also have an endoplasmic reticulum localization signal in the natural state. Can be used for the method.
  • a PDI gene derived from yeast such as Picia or Kluyveromyces can also be used.
  • the PDI gene can be obtained by a technique commonly used based on the above-mentioned prior art documents and the like, for example, a hybridization method, a PCR method and the like.
  • secretion of proteins is usually accomplished by the following pathways.
  • the secreted protein is translated from mRNA in the ribosome, translocates into the endoplasmic reticulum after or during translation, is further transported to the Golgi apparatus, and is distributed to vacuoles, cell membranes, cell walls, or extracellular cells. Proteins that should remain in the endoplasmic reticulum follow the same transport pathway as secretory proteins, but are transported to the Golgi and then back to the endoplasmic reticulum.
  • these proteins located in the endoplasmic reticulum have a specific amino acid sequence consisting of a few residues in their structure to remain in the endoplasmic reticulum. Consensus sequence) or a consensus sequence called "motif" in which amino acid residues having similar properties may be conservatively substituted. In the present specification, to remain in the endoplasmic reticulum,
  • a part or all of the endoplasmic reticulum localization signal is encoded by deleting, substituting or adding one or more bases in the region encoding the endoplasmic reticulum localization signal of the PDI protein. Are modified so that they do not.
  • the endoplasmic reticulum localization signal is the C-terminal four amino acid residues (HDEL).
  • Other yeasts may have endoplasmic reticulum localization signals of different sequences.
  • the modified recombinant yeast yeast DI of the present invention has its gene modified so that it does not encode part or all of the ER localization signal, and the expressed recombinant PDI protein is converted into the ER. It is not localized but is secreted outside the cell.
  • Modification of the region encoding the ER localization signal can be achieved by any of a number of known techniques. Mutations can be introduced at specific positions by synthesizing mutant sequence-containing oligonucleotides flanking restriction sites that can be ligated to fragments of the native sequence. After ligation, the resulting reconstructed sequence encodes a variant having the desired amino acid insertion, substitution or deletion in the ER localization signal region.
  • oligonucleotide-directed site-directed mutagenesis producers can be used to provide altered genes with specific codons altered by the necessary deletion, substitution or addition.
  • Techniques for making such changes include Walder et al. (Gene 42: 133, 196 8); Bauer et al. (Gene 37: 73, 198 5); C raik ( Biotechniques, January 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1989); and U.S. Pat. Included are those described in US Pat. Nos. 4,518,584 and 4,737,462, which are incorporated herein by reference.
  • the modified recombinant yeast PDI of the present invention has a gene modified so as not to encode part or all of the ER localization signal, but is still biologically active. That is, it retains the enzymatic activity of catalyzing disulfide exchange in proteins. Furthermore, the region other than the ER localization signal region differs from the natural amino acid sequence. Even so, analogs having the biological activity of PDI are included in the recombinant yeast PDI of the present invention.
  • An analog can include, for example, a conservatively substituted sequence, wherein one or more amino acid residues of a native PDI protein is replaced with a different residue, but the conservatively substituted The PDI protein is shown to retain essentially the same desired biological activity as the native protein.
  • conservative substitutions include amino acid substitutions that do not alter the secondary and / or tertiary structure of PDI.
  • Those skilled in the art can easily delete, substitute, or delete one or more nucleotide sequences in a portion other than the coding region of the endoplasmic reticulum localization signal of the yeast PDI gene using known genetic engineering techniques as described above. Addition can be performed to obtain an analog of yeast PDI.
  • naturally occurring analogs of yeast PDI such as allyls, are also included in yeast PDI of the present invention.
  • it can be modified to form yeast PDI derivatives by forming covalent or aggregate bonds with other chemical residues such as glycosyl groups, lipids, phosphates, acetyl groups, etc. it can.
  • the present invention provides a recombinant expression vector for expressing recombinant yeast PDI, and a host cell transformed with the expression vector.
  • Any suitable expression system can be used.
  • Yeast expression systems are preferred.
  • the expression vector contains a gene encoding a modified yeast PDI that is operably linked to an appropriate transcriptional or translational regulatory nucleotide sequence, such as one derived from a microorganism such as yeast, a mammal, a virus or an insect gene. Including. Examples of regulatory sequences include transcriptional promoters, operators or enhancers, mRNA ribosome binding sites, and appropriate sequences that control the initiation and termination of transcription and translation.
  • a strong transcription promoter sequence in the expression vector in order to enable large-scale expression of a modified yeast PDI.
  • an origin of replication that confers the ability to replicate in the desired host cell and a selection gene that identifies transformed cells are included in the expression vector.
  • the yeast PDI gene, promoter The DNA having the role of as described in J.o.1.Biol., 96, 171-184, 1974, for example, EcoR —
  • It can be prepared by digesting with a restriction enzyme such as I and BamHI and then ligating with a ligase such as T4DNA ligase.
  • Suitable host cells for expression of the yeast PDI variant include yeast, prokaryotic or higher eukaryotic cells.
  • Suitable cloning and expression vectors for use with yeast, bacterial, fungal and mammalian cell hosts are described, for example, in Pouwe 1 s et al., Cloning Vectors: AL aboratory Manual, El Sepia, NY (1980).
  • Yeast PDI can preferably be expressed in a yeast host, particularly preferably in the genus Saccharomyces (eg, Saccharomyces cerevisiae). Other genera of yeast, such as the genus Pichia or the genus Kluyveres (Kluyveromyces), may be used. Yeast vectors often have a 2 // origin of replication sequence from yeast plasmid, an autonomously replicating sequence (ARS), a promoter region, a sequence for polyadenylation, a sequence for transcription termination, and one gene for a selectable marker.
  • ARS autonomously replicating sequence
  • Promoter sequences suitable for yeast vectors include, in particular, meta-mouth thionein, 3-phosphodaricerate kinase (PGK) (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 207). 3,1980), or enolase, glyceraldehyde-1-phosphate dehydrogenase, hexokinase, pyruvate decarboxylase, phosphofructokinase, glucose-16-phosphate isomerase, 3-phosphoglycerate Other glycolytic enzymes such as mutase, pyruvate kinase, triosephosphate isomerase, phosphodulcose isomerase and dalcokinase (Hess et al., J.
  • PGK 3-phosphodaricerate kinase
  • enolase glyceraldehyde-1-phosphate dehydrogenase
  • hexokinase hexo
  • shuttle vectors capable of replicating in both yeast and E. coli were used to select DNA sequences from pBR322 (ATCC 370 17) (Amp resistance gene and replication) for selection and replication in E. coli. (Origin) can be inserted into the above yeast vector.
  • yeast-derived YEpGII Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-289267 shown in FIG. 5-10 is preferable.
  • a prokaryotic organism such as a Gram-negative or Gram-positive microorganism, for example, Escherichia coli or Bacillus (Bac11i) can be used as a host cell.
  • Suitable prokaryotic host cells for transformation include, for example, E. coli, Bacillus subtilis (B aci 1 1 ussubti 1 is ), Salmonella typhimurium (S a 1 mone 1 latyphi mu ri um) 3 ⁇ 4 sequence (this shoe - Pseudomonas genus ( Pseudomonas), Streptomyces and various other species within the genus Staphylococcus.
  • Expression vectors for use in prokaryotic host cells generally include one or more phenotypic selectable marker genes.
  • a phenotype selectable marker gene is, for example, a gene encoding a protein that confers antibiotic resistance or auxotrophy.
  • useful expression vectors for prokaryotic host cells include those derived from commercially available plasmids, such as the cloning vector pBR322 (ATCC 37017). Other commercially available vectors include, for example, pKK23-3-3 (Pharmacia Fine Chemi. Ca 1 s, Uppsala, Sweden) and pGEM1 (Promega Biotec). , Madison, WI, USA).
  • Promoter sequences commonly used in recombinant prokaryotic host cell expression vectors include:] 3-lactamase (penicillinase), a lactose promoter system (Chang et al., Nature 275: 615, 19). 78; and Goedde 1 et al., Nature 281: 544, 1979), a tryptophan (trp) motor series (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8: 405) -
  • C 1 oning: AL aboratory Ma nual , C old S pring H arbor L aboratory, 4 1 2 page, 1 9 8 2) is:
  • the phage lambda P L promoter and c I 8 5 7 ts heat labile repressor Arrays can also be used.
  • mammalian or insect host cell culture systems can also be used to express recombinant yeast PDI variants.
  • Expression vectors for use in mammalian host cells can be constructed, for example, as disclosed by Ocama and Berg (Mo 1. Cell Biol. 3: 280, 1983).
  • host cells selected from a wide range can be used in the present invention, but yeast PDI is inactivated under weakly acidic (pH 6.0) conditions.
  • Preferred host cells can also be obtained by known genetic engineering techniques, crossing techniques, and the like.
  • preferred host cells can be selected from naturally-occurring mutants.
  • yeast usually has an optimal pH for growth in a weakly acidic region, but the method described in Example 1 can screen yeast capable of growing in a medium having a pH near neutrality.
  • Saccharomyces cerevisiae P1 manufactured by Oriental Yeast
  • yeast cells prokaryotic cells, mammalian or insect cell culture systems or the like, which can be grown and cultured under conditions in which pH is near neutral, can be selected and used.
  • the intended host cell selected can be transformed using a known technique.
  • a yeast transformation protocol is described in Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US A75: 1929, 1997. 8
  • the transformed host cells are cultured under conditions suitable for the expression of the recombinant yeast PDI variant, depending on each host cell.
  • the cultivation is performed under conditions where the pH is near neutral, preferably under the condition of pH 6.5-8.0.
  • the recombinant PDI variant protein expressed by the method of the present invention is secreted out of the host cell.
  • the pH is maintained near neutrality, for example, by using a buffer such as HEPES in the culture medium of the transformant.
  • perilla-free minimal medium (6.7 g / L yeast nitrogenbasewith outaminoacid (D ifco), 20 g / L glucose, 20 mg ZL adenine, l O mg / LL-histidine, 60 m g / LL-leucine, 20 mg gZL L-tryptophan, 100 mM HE PES, 10 mM EDTA-2 Na, pH 7.5) can be used as the culture medium.
  • the modified yeast PDI protein produced by the method of the present invention can be purified by a known method.
  • the medium is first concentrated using a commercially available protein concentration filter, for example, an Am icon or Millipore Pel 1 icon ultrafiltration device. can do.
  • the concentrate can be applied to a purification matrix such as a gel filtration base.
  • a purification matrix such as a gel filtration base.
  • an anion exchange resin such as a matrix or support having pendant getylaminoethyl (DEAE) groups can be used.
  • the matrix can be acrylamide, agarose, dextran, cellulose or other types commonly used in protein purification.
  • a cation exchange step can be used.
  • Suitable cation exchangers include various insoluble matrices containing sulfopropyl or carboxymethyl groups.
  • RP-HPLC reversed-phase high-performance liquid chromatography
  • Secreted recombinant proteins from yeast host cell fermentations can be obtained, for example, by methods similar to those disclosed by Urda 1 et al. (J. Chromatog. 296: 171, 1984). Can be purified.
  • the modified yeast PDI protein is purified, for example, by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) so that protein bands corresponding to other proteins cannot be detected. Protein bands can be viewed by silver staining, Coomassie blue staining (if the protein is radiolabeled) by autoradiography.
  • SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
  • the recombinant yeast PDI variant protein of the present invention has a modified endoplasmic reticulum localization signal portion, but retains the PDI biological activity.
  • the enzymatic activity of the PDI protein can be performed by a known technique.
  • the activity of in vitro can be measured by, for example, restoring the activity using a denatured and reduced enzyme as a substrate. For example, but not limited to, using the method described in Example 4, which is a modification of the method of Mizunaga et al. (J. Biochem., 108, 846, 1990). Can be.
  • a host cell for producing PDI having an activity even at a pH near neutral was selected by the following method.
  • L-tryptophan 2.0% Next, main culture was performed near pH neutral.
  • l YPAD medium (10 gZL yeast extract, 20 g / L peptone, 140 mg / L adenine, 2 QgZL glucose) adjusted to pH 7.5 by adding O OmM HEP ES l
  • O OmL to Sakaguchi flask
  • 1 mL of the above precultured moromi was added thereto, and shaking culture was performed at 30 ° C. and 105 rpm.
  • Saccharomyces cerevisiae p1 (manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd .; MAT a1 eu2-3, 112. 289 ura 3-1 and 2 his 3- ⁇ 32 his 4-5 16 ade 2) were obtained.
  • Example 2 Modification of C-terminal ER localization signal of yeast PDI W yeast (Saccharomyces cerevisiae) Replaces the nucleotide sequence “CACGATGAATTG” encoding the C-terminal ER localization signal “HDEL” of PDI with “CACG ATTAATTG” and inserts a stop codon in the middle of the ER localization signal. was modified to be
  • the Sal I-Eco RV cleavage site containing the termination gene and the structural gene region of PD I was cut with the S a1 I-Sma I of the commercially available E. coli vector pUC19. Inserted between the sites to construct pUCPDIC1.
  • a stop codon (TAA) was introduced on the sequence encoding the endoplasmic reticulum localization signal by PCR site-directed mutagenesis.
  • the primers for PCR are shown in Table 2: Table 2 Primers used for PCR Primer Nucleotide sequence
  • the two amplified primary amplification products were mixed, annealed to form ⁇ , and then subjected to secondary PCR using a combination of RV and M4 as primers.
  • the resulting secondary amplification products containing the two DNA fragments were treated with SphI and EcoRI.
  • the SphI-EcoRI fragment was inserted between the Sphl-EcoRI cleavage sites of pUC19 to construct pUCPDIC2.
  • YEp1GII As a multicopy type vector for expression in yeast, YEp1GII (JP-A-7-289926) having the nucleotide sequence shown in FIG. 5-10 was used. YEp1GII contains a GAP (daricelaldehyde triphosphate dehydrogenase) promoter with high promoter activity.
  • GAP daricelaldehyde triphosphate dehydrogenase
  • yeast PDI expression vector obtained in Example 3 host cells for production of PDI, Saccharomyces cerevisiae P1, were transformed by a conventional cell method using lithium phosphate according to a conventional method.
  • E0 the strain into which YEpGIPI has been introduced
  • E1 the yeast strain into which YEpGIPIDI has been introduced
  • E2 the yeast strain into which YEpGIPIDIC has been introduced
  • the obtained transformant, E2 was sent to FERM P-1 595 by the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Institute of Advanced Industrial Science and Technology (1-3-1, Higashi 305, Tsukuba, Ibaraki, Japan) on January 15, 1996. Deposited as one.
  • FERM P-159951 was transferred from the original deposit to a deposit based on the Budapest Treaty on January 28, 1998, and became a deposit number F ERM BP-6240.
  • the PDI activity measurement method was performed by modifying the method of Mizunaga et al. (J. Biochem., 108, 846, 1990). In other words, the activity of RNase A whose activity was replicated by PDI was measured using the method of Uchida (Biochemistry Laboratory Course 2, pp 68, Tokyo Kagaku Dojin, 1977).
  • PD I activity measurement sample (or ultrapure water) 40 / L, 2. 5-fold concentration PE buffer (1 2 5 mM N a H 2 P_ ⁇ 4, 6. 2 5 mM EDTA- 2 Na, p H 7 5) 40 ⁇ L, 0. Mix 10 ⁇ L of ImM dithiothreitol (within 2 hours after preparation) in a 1.5 mL eppendorf tube, and pre-incubate at 30 ° C for 5 minutes. I did it.
  • PDI 1 unit (1U) is pH 7.5, 30. C, defined as the enzyme activity that restores RNase A 1 U in 1 minute.
  • the “RNaseA 1 unit (1 U)” is defined as the above method (by stopping and diluting the RNase A reaction solution (by diluting 200/150 ⁇ 1040/40 times))
  • the absorbance at 260 was measured and defined as an enzyme activity that increases by 1 per minute.Example 6 Selection of culture medium that does not inhibit PDI activity
  • Yeast culture medium for producing yeast PDI was selected by mixing the medium with a crude enzyme solution extracted from yeast cells and measuring PDI activity.
  • a minimal medium without ⁇ rasil (6.7 g / L yeast nitrogenbase with out am inoacid (D ifco), 20 g / L glucose, 20 mg ZL adenine, l OmgZL L-histidine, 60 mg ZL L—mouth isine, 20 mg / LL —Tributophan, 100 mM HEPE S, 10 mM EDTA—2 Na, pH 7.5) Inoculate one platinum loop of yeast (Saccharomyces' Celepiche) into a 16 mm diameter test tube containing 5 mL.
  • a crude enzyme solution was prepared from the cells by shaking culture at 30 ° C for 3 days.
  • the above-mentioned minimal medium containing no peracil, YAD medium (10 g / L yeast extract, 20 gZL glucose, 20 mg L adenine, lOOmM HEPES, 10 mM EDTA—2Na, pH7
  • Table 4 shows the results of comparing 5).
  • Table 4 Selection of culture medium that does not inhibit PDI activity
  • Minimal medium 100 not containing From Table 4 a minimal medium containing no peracil was selected as a medium not inhibiting PDI activity.
  • Example 7 Culture of transformed host cells
  • the transformed yeast host cells obtained in Example 4 were inoculated with one platinum loop into a 16 mto diameter test tube containing 5 mL of YPAD medium, and cultured at 30 ° C for 3 days with shaking.
  • the culture was centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes, and washed twice with ice-cold 4-fold concentration PE buffer (200 mM NaH2P04, 10 mM EDTA-2 Na, pH 7.5). .
  • PE buffer 200 mM NaH2P04, 10 mM EDTA-2 Na, pH 7.5
  • 2 mL of a PDI production medium having the above composition prepared by adding a buffer and a chelating agent to a minimal medium containing no peracil, was added, and cultured with shaking at 30 ° C for 15 hours.
  • Example 8 PD I activity of recombinant yeast PD I protein Yeast serum albumin (BSA) (manufactured by Wako) was added to the culture solution obtained from the yeast PDI production culture to a final concentration of 0.1 lg / L. ipore, Ultrafree C 3 LGC, molecular weight cut off 10,000), and concentrated at 600 rpm at 5 ° C until the total volume became about 100 ⁇ L to obtain a yeast-containing PDI solution.
  • BSA yeast Yeast serum albumin
  • the PDI protein was secreted and expressed in the medium, and the PDI activity was measured and compared by the method of Example 4, and the results are shown in Table 5.
  • Table 5 PDI activity of ⁇ 0, — ⁇ 1, _ ⁇ 2 strains Sample PDI activity ml L) —
  • yeast PDI in the culture was also performed by SDS-PAGE: the culture was concentrated approximately 60-fold in the same way as described above, without adding BSA.
  • the equipment used was a double minislab electrophoresis apparatus (AE 6450) manufactured by ATTO.
  • the method was the Laemmii method according to the attached manual. Separation gel concentration was 7.5%.
  • Staining was performed using BLU PRINT Fast-PAGE Stain (GI BCOB RL).
  • Figure 11 shows an image of the stained SDS-PAGE gel.
  • a band specific to the PDI-introduced strains (El, E2) is observed around 70,000 daltons.
  • the yeast PD I molecule 1 is about 70,000 daltons, which is considered yeast PDI.
  • the band concentration was E 2> E 1, and the effectiveness of the present invention was also confirmed by SDS-PAGE. The invention's effect
  • a large amount of yeast PDI protein is secreted into the culture solution in an active state, and can be recovered by a simple purification method.
  • ATC AAG CAA AGC CAA CCG GCT GTC GCC GTT GTT GCT GAT CTA CCA 450 lie Lys Gin Ser Gin Pro Ala Val Ala Val Val Ala Asp Leu Pro
  • GGT CTA ATG AAC TTT GTT AGC ATC GAT GCC AGA AAA TTC GGC AGA 900 Gly Leu Met Asn Phe Val Ser lie Asp Ala Arg Lys Phe Gly Arg
  • ATC CAC GAC ATG ACT GAA GAC TTG AAG TAC GGT TTG CCT CAA CTC 990 lie His Asp Met Thr Glu Asp Leu Lys Tyr Gly Leu Pro Gin Leu

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Description

明細書 組換え酵母 PD Iおよびその製造方法 発明の分野
本発明は、 酵母由来の酵素、 プロテインジスルフィ ドイソメラーゼ （p r o t e i n d i s u l f i d e i s ome r a s e) (以 「PD I」 とい う） の組換えタンパク質、 およびその製造方法に関する。
本発明は、 特に、 酵母 PD I遺伝子中の C末端小胞体局在シグナルのコード領 域を改変し、 当該遺伝子を発現ベクターに組み込んだものを発現させることによ り、 組換え酵母 PD Iを、 十分に酵素活性を保持する状態で菌体外に分泌させ、 大量製造することを可能としたものである。 本発明の製造方法は、 さらに、 p H が中性近傍の条件下においても培養可能な宿主細胞を用いることにより、 P Hが 中性近傍の培養条件下で、 酵母 PD I組換えタンパク質を得るものである。 背景技術
PD Iはタンパク質中のジスルフイ ド交換を触媒する酵素 （E C. 5. 3. 4.
1. ；) で、 適切な酸化還元剤の存在下でタンパク質のジスルフイ ド結合の組換え を促進する酵素である。 PD Iタンパク質は、 真核生物の小胞体の内腔に局在し、 膜結合型のリボソームにより翻訳され小胞体に送られた分泌タンパク質のジスル フイ ド結合の結合を触媒する活性を有する。 PD Iを、 遺伝子組換えによって製 造される各種タンパク質に作用させることにより、 当該タンパク質が活性を有す る立体構造を持たせる用途に利用できると考えられている。 また工業的には、 例 えばパン生地、 ハム · ソーセージ、 水産ねり製品、 豆腐等のタンパク質含有食品 の物質向上に応用可能であり、 有用な酵素である。
また、 近年の遺伝子工学技術により、 PD Iをコードする遺伝子も開示されて いる。 例えば、 特開平 4— 1 97 1 76号には、 酵母サッカロマイセス 'セレビ シェ (.S a c c h a r omy c e s c e r e v i s i a e) 由来 PD Iの坦化 学的性質及び、 該タンパク質をコードする遺伝子配列が記載されている： サッカ
I ロマイセス 'セレピシェ由来の P D Iタンパク質は、 約 70， 000の分子量お よび約 4. 0— 4， 1の等電点を有し、 また、 至適 p Hは、 約 8. 5 - 8. 75 である （J . B i o c h em. ， 1 08， 846 (1 990) 、 特開平 4 - 1 9 71 76号） 。
通常、 酵母 PD Iは菌体内に存在する酵素タンパク質であり、 該酵素を取得す るには、 菌体の培養後、 菌体を破砕し、 該菌体破砕溶液中から抽出 ·粗製し、 取 得するという煩雑な工程を経る必要があった。 この煩雑な抽出工程は、 単にコス ト的な問題を大きくするばかりである。 また、 酵母 PD Iは熱や重金属イオンな どにより容易に失活する不安定な性質を有する酵素であるが故に、 抽出工程の複 雑さに付随して、 全工程にわたって活性を維持するために慎重でかつ、 煩雑な操 作が要求される。
有用物質の PD Iタンパク質を、 充分に酵素活性を保持した状態で安定に大量 に製造し、 市場に供給することは重要課題の一つである。 その為に抽出工程の簡 素化には、 菌体内物質である該酵素を、 菌体外に分泌製造させる手段が有効であ る。 すなわち、 一度培養した菌体から、 菌体外の培養液中に連続製造出来るなら ば、 菌体の培養回数は減少し、 菌体破砕工程は不要となる。 また、 不純物の少な い培養液中から精製すれば精製過程も簡素化され、 活性に与える影響も減少し、 効率的な大量製造が可能となる。
酵母 PD Iは前駆体の時点で細胞外分泌シグナルを保持し、 しかも分泌経路の 起点である小胞体内に製造される。 しかしながら、 酵母 PD Iが細胞外に分泌さ れるように発現を試みても、 野性型では細胞 に分泌されない （M. L a ma n t i a e t a l， C e l l , 74， 89 9， 1 9 93) 。 これは、 C末端側 の小胞体局在シグナル （例えば、 酵母サッカロマイセス .セレピシェの場合、 ァ ミノ酸配列で HDE L) を保持するためではないか、 と推測される。 また、 酵母 —菌体あたりの P D I遺伝子数は 1つしかなく、 ー菌体あたりの P D I製造量は 極めて微量で、 仮に培養液中に分泌されても、 十分な濃度として得ることができ ない。
さらに、 酵母 PD I活性は酸性領域で不安定であるのに対して、 通常の酵母の 至適 p Hは弱酸性領域であり、 この弱酸性 （ p H 6. 0以下） では P D Iは失活 _ する。 逆に、 PD Iが失活しない領域の p Hでは、 通常酵母菌体は活性を保つこ とができない。 また、 一般的な酵母培養用の培地成分には PD I活性を減少また は失活させる物質も含まれており、 このような成分を含む培地を用いれば菌体外 に製造された PD Iは失活してしまう このような種々の理由から、 本発明前、 酵母 PD I を活性を有する状態で大量製造する方法は開発されていなかった。 発明の概要
本発明は、 生物学的に活性な組換え酵母プロテインジスルフィ ドイソメラ一ゼ を大量に製造するために適する方法を提供する。 具体的には、 本発明の製造方法 は、 酵母 P D I遺伝子を用いた遺伝子工学技術により、 酵母 PD Iタンパク質を 製造し細胞外に分泌させることを特徴とする。
本発明は、 また、 上記本発明の製造方法により製造された、 組換え酵母プロテ インジスルフィ ドイソメラーゼを提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 サッカロマイセス ·セレピシェ P 1及び Y 3の p H中性近傍での培養 経過を示した図である。
図 2ないし 4は、 サッカロマイセス ·セレピシェ由来の PD I遺伝子の塩基配 列を示した一連の図である。
図 5は、 酵母内発現ベクター Y E p 1 G I Iの制限酵素地図を示した図である: 図 6ないし 1 0は、 酵母内発現ベクター Y p 1 G I Iの全塩基配列を示した —連の図である。
図 1 1は、 （A) は各種形質転換酵母の培養液濃縮液を S D S— PAGEゲル を用いて電気泳動したものをイメージ映像化したものである： (B) は (A) を 図示したものである。 発明の詳細な説明
本発明者らは、 上記問題を解決するために鋭意研究に努めた結果、 遺伝子工学 的に酵母 P D Iを調製することよって、 十分に酵素活性を保持する状態で菌体外 一 に大量製造することを可能にした。
具体的には本発明者らは、 酵母サッカロマイセス ·セレビシェ由来の染色体 D
N Aから得た酵母 P D I遺伝子 （H. T a c h i k a wa e t a し ， J .
B i o c h em. ， 1 1 0, 306 - 3 1 3, 1 99 1 ) (立川氏より寄贈） を、 遺伝子組換え技術によって、 小胞体局在シグナルである、 C末端の 4アミノ酸配 列 H (ヒスチジン） D (ァスパラギン酸） E (グルタミン酸） L (ロイシン） を コードしないように改変し、 活性の強いプロモーターに接続し、 YE p型などの 多コピー型ベクターを用いて、 p H中性近傍の培地で増殖可能な宿主細胞に導入 し、 形質転換した。 当該形質転換された微生物を HE P E S緩衝液を用いて p H を中性近傍に維持しながら、 ゥラシルを含まない最少培地等の酵母 PD I活性阻 害物質を含まない培地で培養することにより、 酵素活性を有する酵母 PD I を菌 体外の培養液中に大量発現させ、 本発明を完成した。
よって、 本発明は、 生物学的に活性な組換え酵母プロテインジスルフイ ドイソ メラーゼの製造方法であって、
a ) 酵母のプロテインジスルフイ ドイソメラーゼをコードする遺伝子の小胞 体局在シグナルをコードする領域の 1または複数の塩基を欠失、 置換若しくは付 加することによって、 当該小胞体局在シグナルの一部又は全部をコードしないよ うに改変し ；
b) 前記改変遺伝子を発現ベクターに組み込み；
c) 前記発現ベクターで宿主細胞を形質転換し；そして
d) 前記発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培地の p Hを中性近傍に保 ちながら培養する
ことにより宿主細胞外へプロティンジスルフィ ドイソメラーゼを活性な状態で分 泌させることを含む、 前記製造方法に関する。
好ましくは、 分泌された酵素はさらに濃縮または精製される。
本発明は、 その一態様において、 前記小胞体局在シグナルが、 C末端の 4アミ ノ酸配列 （HDEL) である。
本発明は、 その一態様において、 発現ベクターが、 図 5に示す酵母発現べクタ 一 Y E p 1 G I Iである。 本発明は、 その一態様において宿主細胞を P H 6. 5— 8に保ちながら培養す る。
本発明は、 また、 上記本発明の製造方法により製造された、 組換え酵母プロテ インジスルフイ ドイソメラーゼを提供する。
本発明は、 また、 上記製造方法に使用される、 発現べクタ一、 形質転換宿主細 胞を含む。
酵母 P D I遺伝子
本発明において、 酵母 PD I遺伝子は、 限定されるわけではないが、 例えば配 列番号 1 (図 2— 4) に記載された酵母サッカロマイセス 'セレピシェ由来の P D I遺伝子を用いることができる。 酵母サッカロマイセス ·セレピシェ由来の P D I遺伝子は、 また、 H. T a c h i k a w a e t a 1. , J . B i o c h em. ， 1 1 0, 306— 3 1 3， 1 99 1、 特開平 4— 1 9 7 1 76号等にも 開示されている。 PD Iは、 サッカロマイセス 'セレピシェ以外にも多くの酵母 に存在していると考えられ、 そのような他の酵母に存在する酵素も、 天然状態で 小胞体局在シグナルを有するものは、 本発明の方法に使用できる。 例えば、 P i c h i aまたは K l u y v e r omy c e s等の酵母に由来する P D I遺伝子も 用いることができる。 PD I遺伝子は、 前記先行技術文献等に基づいて慣用され た技術、 例えば、 ハイブリダィゼーシヨン法、 PCR法等によって得ることがで さる。
真核生物細胞において、 タンパク質の分泌は通常、 以下の経路によってなされ る。 分泌タンパク質はリボソームで mRN Aから翻訳され、 翻訳後あるいは翻訳 中に小胞体に移入し、 さらにはゴルジ体へと輸送され、 液胞、 細胞膜、 細胞壁あ るいは細胞外等へと振り分けられる。 小胞体に残留すべきタンパク質も分泌タン パク質と同一の輸送経路をとるが、 いったんゴルジ体に輸送された後に小胞体へ と逆送される。 これらの小胞体に局在するタンパク質は、 分泌経路に入るために 必要なシグナルの他に、 小胞体に残留するために、 その構造中に、 数個の残基か らなる特定のアミノ酸配列 （コンセンサス配列） 、 あるいは、 性状の似たアミノ 酸残基同士が保存的に置換されていてもよい 「モチーフ」 と称されるコンセンサ ス配列、 等特殊な構造を有する。 本明細書中において、 小胞体に残留するために
0 - 必要なこのような特殊な構造を、 「小胞体局在シグナル」 という。
本発明では、 PD Iタンパク質の小胞体局在シグナルをコードする領域の 1ま たは複数の塩基を欠失、 置換若しくは付加することによって、 当該小胞体局在シ グナルの一部又は全部をコードしないように改変させる。
例えば、 サッカロマイセス ·セレビシェでは、 小胞体局在シグナルは、 C末端 の 4アミノ酸残基 （HDE L) である。 他の酵母では異なる配列の小胞体局在シ グナルを有する可能性もある。 いずれの場合においても、 本発明の組換え酵母 Ρ D I改変体は、 小胞体局在シグナルの一部又は全部をコードしないように遺伝子 が改変され、 発現された組換え P D Iタンパク質が、 小胞体に局在せず、 細胞外 に分泌されるようになったものである。
小胞体局在シグナルをコードする領域の改変は、 多数の既知の技法のいずれに よっても達成できる。 突然変異は、 天然の配列の断片に対して連結できる制限部 位に隣接した突然変異体配列含有オリゴヌク レオチドを合成することによって特 定の位置に導入することができる。 連結後、 得られた再構成配列は、 小胞体局在 シグナル領域に所望のアミノ酸揷入、 置換または欠失を有する改変体をコードす る。
或いは、 オリゴヌクレオチドに支配された部位特異的突然変異誘発プロデュー サーを用いて、 必要な欠失、 置換または付加によって変更された特定のコドンを 有する変更された遺伝子を提供することができる。 このような変更を行う技術に は、 Wa l d e rら （G e n e 4 2 : 1 3 3， 1 9 8 6) ； B a u e r ら （G e n e 3 7 ： 7 3 , 1 9 8 5) ； C r a i k (B i o T e c h n i q u e s , 1 9 8 5年 1月， 1 2— 1 9) ； Sm i t hら （G e n e t i c E n g i n e e r i n g : P r i n c i p l e s a n d M e t h o d s , P l e n um P r e s s, 1 9 8 1 ) ；および米国特許第 4， 5 1 8， 5 84号および同第 4， 7 3 7， 4 6 2号で記載されたものが含まれ、 これらは本明細書中に援用される。 本発明の組換え酵母 PD I改変体は、 小胞体局在シグナルの一部又は全部をコ ードしないように遺伝子が改変されているが、 なお、 生物学的に活性である。 即 ち、 タンパク質中のジスルフィ ド交換を触媒するという酵素活性を保持している。 さらに、 小胞体局在シグナル領域以外の領域において天然のァミノ酸配列と異 なっていても、 上記 PD Iの生物活性を有する類似体は、 本発明の組換え酵母 P D Iに含まれる。 類似体は、 例えば、 保存的に置換された配列を含むことができ、 天然の PD Iタンパク質の 1個またはそれ以上のアミノ酸残基は、 異なった残基 で置き換えられるが、 その保存置換された PD Iタンパク質は、 天然のタンパク 質の場合と本質的に同等の望まれる生物学的活性を保持していることが示される。 保存置換の例としては、 PD Iの二次および または三次構造を変化させないァ ミノ酸の置換がある。 当業者は、 上述したような公知の遺伝子工学技術を用いて、 酵母 PD I遺伝子の小胞体局在シグナルのコード領域以外の部分において、 容易 に 1またはそれ以上の塩基配列の欠失、 置換または付加を行い、 酵母 PD Iの類 似体を得ることができる。 また、 天然に存在する酵母 PD Iの類似体、 例えばァ リルも、 本発明の酵母 PD Iに含まれる。 さらにまた、 グリコシル基、 脂質、 リ ン酸塩、 ァセチル基等のような他の化学残基との共有結合または凝集結合を形成 することによって、 酵母 PD I誘導体を生成するように修飾することもできる。 発現ベクターおよび宿主細胞
本発明は、 組換え酵母 PD I発現のための組換え発現ベクター、 および該発現 ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。 いずれかの適当な発現系を用い ることもできる。 酵母の発現系が好ましい。 発現ベクターは、 酵母等の微生物、 哺乳動物、 ウィルスまたは昆虫遺伝子に由来するものなどの適当な転写または翻 訳調節ヌクレオチド配列に対して機能的に結合した、 酵母 PD I改変体をコード する遺伝子を含む。 調節配列の例としては、 転写プロモータ一、 オペレータ一ま たはェンハンサー、 mRNAのリボソーム結合部位、 並びに転写および翻訳の開 始および終結を制御する適当な配列が含まれる。 酵母 PD Iの改変体の大量発現 を可能にするために、 強力な転写プロモーター配列を発現べクタ一に含ませるこ とが好ましい。 また、 一般に、 所望の宿主細胞中で複製する能力を与える複製起 点、 および形質転換細胞を識別する選択遺伝子を、 発現ベクター中に包含させる。 本発明の発現ベクターを得るには、 例えば B i o c h em. B i o p h y s. Ac t a, 72， 6 1 9 - 62 9, 1 96 3に記載の方法に従い、 酵母 P D I遺 伝子とプロモータ一及びベクターとしての役割を有する DNAとを J . o 1. B i o l . ， 96， 1 7 1 - 1 84, 1 9 74に記載の方法で、 例えば E c o R —
I , B a mH I等の制限酵素で消化し、 次いで、 例えば T 4 D N Aリガーゼ等の リガーゼを用いて結合することにより調製できる。
酵母 PD I改変体の発現に適当な宿主細胞としては、 酵母、 原核細胞または高 等真核生物細胞がある。 酵母、 細菌、 真菌および哺乳動物細胞宿主と一緒に用い るのに適当なクローニングおよび発現べクタ一は、 例えば、 P o uw e 1 s ら、 C l o n i n g V e c t o r s ： A L a b o r a t o r y Ma n u a l , エルセピア、 ニューヨーク （ 1 9 8 5) に記載されている。
酵母 PD Iは、 好ましくは、 酵母宿主中で、 特に好ましくは、 サッカロマイセ ス属 （例えば、 サッカロマイセス .セレピシェ） 中で発現させることができる。 ピキア属 （P i c h i a) 属またはクルイべ口ミセス属 （K l u y v e r o my c e s) などの酵母の他の属を用いてもよい。 酵母ベクターは、 しばしば、 2 // 酵母プラスミ ドからの複製起点配列、 自己複製配列 （ARS) 、 プロモーター領 域、 ポリアデニル化のための配列、 転写終結のための配列および選択可能マーカ 一遺伝子を有するであろう。
酵母ベクターに適当なプロモーター配列には、 特に、 メタ口チォネイン、 3— ホスホダリセリン酸キナ一ゼ （P GK) (H i t z e m a nら、 J . B i o l . C h e m. 2 5 5 : 2 0 7 3, 1 9 8 0) 、 またはエノラーゼ、 グリセルアルデ ヒ ド一 3—リン酸デヒ ドロゲナーゼ、 へキソキナーゼ、 ピルビン酸デカルボキシ ラーゼ、 ホスホフルク トキナ一ゼ、 グルコース一 6—リン酸イソメラーゼ、 3— ホスホグリセリン酸ムターゼ、 ピルビン酸キナーゼ、 トリオースリン酸イソメラ ーゼ、 ホスホダルコースイソメラーゼおよびダルコキナーゼなどの他の解糖酵素 (H e s sら、 J . A d v. E n z yme R e g . 7 : 1 4 9 , 1 9 6 8 ;お よび H o 1 l a n dら、 B i o c h e m. 1 7 : 4 9 0 0、 1 9 78) のプロモ 一ターが含まれる。 酵母発現で用いるための他の適当なベクターおよびプロモー ターは、 H i t z e ma n, E PA— 7 3， 6 5 7号で更に記載されている。 ま た、 グルコース抑制'性の ADH 1 (B e n n e t z e nら、 J . B i o l . C h e m. 2 5 7 : 3 0 1 8、 1 9 8 2) 又は AD H 2 (Ru s s e l l ら、 J . B i o 1. C h e m. 2 5 8 ： 2 6 74, 1 9 8 2 ;および B e i e r ら、 N a t u r e 30 0 : 72 4, 1 9 8 2) を用いることもできる。 あるいは、 GA L 1. G A L 1 0 (S t . J o h nら、 C e l l 1 6 : 4 4 3, 1 9 7 9 ;および S t . J o h nら、 J . Mo l . B i o l . 1 5 2 : 2 8 5 , 1 9 8 1 ) 等を用い ることもできる。 さらに、 酵母および大腸菌の両方で複製可能なシャ トルベクタ 一を、 大腸菌中での選択および複製のための p B R 3 2 2 (ATCC 3 7 0 1 7) からの DN A配列 （Amp耐性遺伝子および複製起点） を上記酵母ベクター 中に挿入することによって構築することもできる。
酵母宿主細胞での発現ベクターとしては、 例えば、 図 5— 1 0に示す、 酵母由 来の Y E p G I I (特開平 7— 2 8 9 2 6 7号公報） が好ましい。
酵母宿主細胞の代わりに、 グラム陰性またはグラム陽性の微生物等の原核生物、 例えば、 大腸菌またはバチルス属 （B a c i 1 1 i ) を宿主細胞として用いるこ とができる。 形質転換に適当な原核生物宿主細胞には、 例えば、 大腸菌、 枯草菌 (B a c i 1 1 u s s u b t i 1 i s ) 、 ネズミチフス菌 ( S a 1 m o n e 1 l a t y p h i mu r i um) ¾ 並び (こシュ―ドモナス属 (P s e u d o mo n a s ) 、 ストレプトミセス属 （S t r e p t o my c e s ) 及びブドウ球菌属 (S t a p h y l o c o c c u s ) 内の様々な他の種が含まれる。
原核生物宿主細胞中で用いるための発現ベクターは、 概して、 1種類またはそ れ以上の表現型選択可能マーカー遺伝子を含む。 表現型選択可能マーカー遺伝子 は、 例えば、 抗生物質耐性を与えるかまたは独立栄養要求を与えるタンパク質を コードしている遺伝子である。 原核生物宿主細胞に有用な発現ベクターの例とし ては、 クローニングベクター p B R 3 2 2 (ATCC 3 7 0 1 7) などの商業的 に入手可能なプラスミ ドに由来するものがある。 他の商業的に入手可能なベクタ 一としては、 例えば、 p KK 2 3 3 - 3 (P h a r ma c i a F i n e C h e m i. c a 1 s、 ウプサラ、 スウェーデン） および p GEM 1 (P r o m e g a B i o t e c、 マディソン、 W I、 米国） がある。
組換え原核生物宿主細胞発現ベクターに一般的に用いられるプロモーター配列 としては、 ]3—ラクタマーゼ （ぺニシリナーゼ） 、 ラク トースプロモータ一系 (C h a n gら、 N a t u r e 2 7 5 : 6 1 5、 1 9 78 ;および G o e d d e 1 ら、 N a t u r e 2 8 1 : 544、 1 9 7 9) 、 トリプトファン （ t r p) プ 口モータ一系 （G o e d d e l ら、 N u c l . A c i d s R e s . 8 : 4 0 5 -
7， 1 9 8 0 ;および E PA— 3 6 7 7 6号） 、 T 7プロモータ一系 （D a v a n l o oら、 P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U SA 8 1 : 2 0 3 5， 1 9 8 4) および t a cプロモータ一 （Ma n i a t i s , Mo l e c u l a r
C 1 o n i n g : A L a b o r a t o r y Ma n u a l , C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y、 4 1 2頁、 1 9 8 2) がある： また、 ファージ λ PLプロモーターおよび c I 8 5 7 t s熱不安定性リプレッサー 配列を用いることもできる。
あるいは、 哺乳動物または昆虫宿主細胞培養系もまた、 組換え酵母 PD I改変 体を発現させるのに用いることができる。 哺乳動物宿主細胞中で用いるための発 現ベクターは、 例えば、 ォカャマおよびバーグ （Mo 1 . C e l l B i o l . 3 : 2 8 0， 1 9 8 3) によって開示されたように構築することができる： 上述したように、 本発明においては広範な範囲から選択された宿主細胞を用い ることができるが、 酵母 PD Iは弱酸性 （p H 6. 0) 条件下で失活するので、 p Hが中性近傍の条件下で増殖、 培養の可能な宿主細胞を選択して使用すること が望ましい。 当業者は本明細書の記載に基づいて、 適当な宿主細胞を選択するこ とが可能である。 好ましい宿主細胞は、 公知の遺伝子工学技術、 交配技術等によ つて得ることもできる。 あるいは、 天然に得られた突然変異体から、 好ましい宿 主細胞を選択することもできる。
例えば、 酵母は通常増殖の至適 p Hが弱酸性領域であるが、 実施例 1に記載し た方法等によって、 p Hが中性近傍の培地でも生育可能な酵母をスク リーニング することができる。 好ましくは、 サッカロマイセス ·セレビシェ P 1 (オリエン タル酵母社製） ） を本発明の製造方法における宿主細胞として用いることができ る。 あるいは、 酵母細胞の代わりに、 p Hが中性近傍の条件下で増殖、 培養の可 能である、 原核細胞、 哺乳動物または昆虫細胞培養系等を選択使用することがで さる。
酵母 PD I改変体の発現
上記発現ベクターを用いて、 選択された所期の宿主細胞を公知技術を用いて形 質転換することができる。 例えば、 酵母の形質転換プロ トコ一ルは、 H i n n e nら、 P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 7 5 ： 1 9 2 9, 1 9 7 8に記載されている。
形質転換された宿主細胞は、 各宿主細胞に応じ、 組換え酵母 PD I改変体の発 現に適した条件下で培養される。 培養は、 p Hが中性近傍の条件下、 好ましくは p H 6. 5 - 8. 0の条件下で行う。 本発明の方法によって発現された組換え酵 母 PD I改変体タンパク質は、 宿主細胞の細胞外に分泌される。 分泌された PD Iタンパク質が安定に保持されるために、 例えば形質転換体の培養培地に HE P E Sなどの緩衝液を用いることにより p Hを中性近傍に維持する。 さらに、 酵母 PD Iタンパク質活性を阻害する物質を含まないように、 例えば培地として最少 培地を用いたり、 キレート剤を添加することが好ましい。 限定されるわけではな いが、 例えば、 ゥラシルを含まない最小培地 （6. 7 g/L y e a s t n i t r o g e n b a s e w i t h o u t a m i n o a c i d (D i f c o) 、 20 g/L グルコース、 20mgZL アデニン、 l O mg/L L - ヒスチジン、 6 0m g/L L—ロイシン、 2 0 m gZL L—トリプトファン、 1 0 0 mM HE P E S、 1 0 mM EDTA— 2 N a、 p H 7. 5) を培養培 地として用いることができる。
本発明の方法によって製造された酵母 PD I改変体タンパク質は、 公知の方法 によって精製することができる。 本発明において、 組換えタンパク質は細胞外に 分泌されるため、 先ず、 商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、 例えば、 Am i c o nまたは M i l l i p o r e P e l 1 i c o n限外濾過装置を用い てその培地を濃縮することができる。 濃縮工程後、 その濃縮物をゲル濾過基剤な どの精製マトリ ックスに対して適用することができる。 或いは、 陰イオン交換樹 脂、 例えば、 ジェチルアミノエチル （DEAE) 側基を有するマ トリ ックスまた は支持体を用いることができる。 マトリックスは、 アクリルアミ ド、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースまたはタンパク質精製において一般的に用いられる他 の種類であり得る。 或いは、 陽イオン交換工程を用いることができる。 適当な陽 イオン交換体としては、 スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含む種々 の不溶性マトリ ッタスがある。 最後に PD Iタンパク質を更に精製するために、 1回またはそれ以上の逆相高速液体クロマトグラフィー （R P— HP L C) 工程 を、 疎水性 RP— H P LC基剤 （例えば、 遊離のメチルまたは他の脂肪族側基を 一 有するシリカゲル） を用いて、 使用することができる。 前述の精製工程のいくつ かまたは全てを様々な組み合わせで用いて、 精製酵母 PD I改変体タンパク質を 提供することができる。
酵母宿主細胞発酵からの分泌組換えタンパク質は、 例えば、 U r d a 1 ら （J. Ch r oma t o g. 2 96 : 1 7 1、 1 9 84) によって開示されたものと同 様の方法によつて精製することができる。
酵母 P D I改変体タンパク質は、 例えば、 S D S—ポリアクリルアミ ドゲル電 気泳動 （SDS— PAGE) によって他のタンパク質に相当するタンパク質バン ドが検出できないように精製される。 タンパク質バンドは、 銀染色、 クマシーブ ルー染色 （タンパク質が放射標識されている場合） オートラジオグラフィ一によ つて目視することができる。
P D I酵素活性
本発明の組換え酵母 PD I改変体タンパク質は、 小胞体局在シグナル部分が改 変されているが、 なお、 PD I生物活性を保持するものである。 PD Iタンパク 質の酵素活性は、 公知の技術によって行うことができる。 i n V i t r oの活 性は、 変性還元された酵素を基質として、 活性の回復等で測定することができる。 例えば、 限定されるわけではないが、 M i z u n a g aらの方法 （J. B i o c h em. ， 1 08、 846， 1 9 90) の方法を改変した、 実施例 4に記載した 方法を用いて行うことができる。 当該方法は、 PD Iによって活性の回復した R N a s e Aの活性測定を内田の方法 （生化学実験講座 2 , p p 68、 東京化学同 人、 1 976) を改変したものである。 . 以下、 本発明を実施例により具体的に説明するが、 これらは、 本発明の技術的 範囲を限定するためのものではない。 当業者は本明細書の記載に基づいて容易に 本発明に修飾、 変更を加えることができ、 それらは本発明の技術的範囲に含まれ る。 実施例 実施例 1 酵母 PD I製造用の宿主細胞の選択
pHが中性近傍でも活性を有する PD I製造用の宿主細胞を、 以下の方法で選 択した。
前培養として、 1 6 mm径試験管に下記表 1に示すゥラシルを含まない最少培 地を 5mL入れ、 酵母 P l， Y 3および X 3 (全てオリエンタル社製） を各々 1 白金耳ずつ、 別個に接種し、 30°Cで 1 日振盪培養を行った。 表 1 ゥラシルを含まない最少培地組成 （ p H = 7. 5 ) 酵母用アミノ酸不含窒素源
(Yeast Nitrogen Base without Amino acid)
(ディフコ （D i f c o) 社製） 0. 6 7% グノレコース 2. 0 % アデニン 2. 0 %
L一ヒスチジン 1. 0 %
L—ロイシン 6. 0 %
L—トリプトファン 2. 0 % ついで、 p H中性近傍での本培養を行った。 l O OmM HEP E Sの添加に より pH 7. 5とした Y P AD培地 （ 1 0 gZL イース トエキス、 20 g/L ペプトン、 140mg/L アデニン、 2 Q gZL グルコース） l O OmL を、 坂口フラスコに入れ、 これに上記の前培養もろみを 1 mL添加し、 30°C、 1 05 r p mで振盪培養を行った。
その結果、 増殖が良好であり、 7日間の培養中に p H 7. 0以上を維持したサ ッカロマイセス .セレピシェ p 1 (オリエンタル酵母社製； MAT a 1 e u 2 - 3 , 1 1 2 .t r p l— 289 u r a 3 - 1 , 2 h i s 3 - δ 32 h i s 4 - 5 1 6 a d e 2) を取得した。 実施例 2 酵母 P D Iの C末端小胞体局在シグナルの改】 W 酵母 （サッカロマイセス .セレピシェ） P D Iの C末端小胞体局在シグナル 「HDEL」 をコードする塩基配列 「CACGATGAATTG」 を 「CACG ATTAATTG」 と置換し、 小胞体局在シグナルの中途に終止コ ドンが揷入さ れるよう改変した。
酵母実験室株サッカロマイセス ·セレピシェ TM 5の 3番染色体上の PD I構 造遺伝子 （T a c h i k a waら、 J . B i o c h em. 1 1 0 : 306， 1 9 9 1 ) (立川氏より寄贈） を含む 6386 b p . の E c o R I—Xh o I切断部 位間の両末端を B a mH I切断部位に改変した。 次いで、 当該改変遺伝子を大腸 菌ベクタ一 pUC 1 8の B amH I切断部位に揷入して、 pUC PD Iを構築し た。 得られたプラスミ ド pUCPD I より、 PD Iの構造遺伝子領域と終止コド ンを含む S a l I— E c o R V切断部位間を、 市販の大腸菌ベクター p U C 1 9 の S a 1 I 一 Sma I切断部位間に挿入し p U C P D I C 1を構築した。
次いで、 PCR部位特異的突然変異導入により小胞体局在シグナルをコードす る配列上に終止コドン （TAA) を導入した。 PCR用プライマーを表 2に示す: 表 2 P C Rに使用したプライマ一 プライマー 塩基配列 由来
1 RV 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3' 宝酒造社製
2 GP1 5' AACGTTAGCATTTTGTTTATTTATGTGTG 3' 合成
3 PDIN 5' AACAAAATGAAGTTTTCTGCTGG 3' 合成
4 M4 5' GTTTCCCAGTCACGAC 3' 宝酒造社製
5 PDIC 5' TAACAATTAATCGTGAATGGC 3' 合成
6 UT3 5' TGATTACGCCTAGCTTACAT 3' 宝酒造社製 具体的には、 上記の得られたプラスミ ド p UC PD I C 1を铸型として、 1本 鎖合成オリゴヌクレオチド RV (宝酒造社製） と PD I C (本発明者が合成） の 組み合わせ、 あるいは MUT 3と M4 (宝酒造社製） との組み合わせを用いて、 「遺伝子工学製品ガイ ド」 （宝酒造株式会社、 1 995— 1 99 6) の記載に従 つて、 D N A断片を PC R法により増幅した。 さらに、 増幅した 2種の第 1次増 幅産物を混合し、 アニーリングして铸型とし、 次いでプライマーとして RVと M 4の組み合わせを用いて 2次の P C Rを行った。 その結果得られた、 2種の DN A断片を含む第 2次増幅産物を S p h I及び E c o R Iで処理した。 該 S p h I 一 E c o R I断片を pUC 1 9の S p h l— E c o R I切断部位間に挿入して p UC PD I C 2を構築した。
さらに、 p UC PD Iの PD Iのプロモーター領域と構造遺伝子を含む S p h I - S a 1 Ϊ切断部位の間に、 p UC P D I C 2由来の S p h I — S a 1 I切断 部位間に挿入し、 P UC PD I Cを構築した。 実施例 3 組換え酵母 PD I発現のための発現ベクターの作製
酵母内発現用の多コピー型べクタ一として、 図 5— 1 0に示す塩基配列を有す る Y E p 1 G I I (特開平 7— 2 8 92 6 7号） を利用した。 Y E p 1 G Γ Iは、 高いプロモーター活性を有する GAP (ダリセルアルデヒ ド 3リン酸デヒ ドロゲ ナーゼ） プロモーターを含む。
YE p l G I Iを E c o R Iで切断後、 末端を DNAポリメラ一ゼにより平滑 化し、 これに p UC P D I Cの P D I構造遺伝子を含む D r a I一 D r a I切断 部位問を揷入し、 YE pG I I PD I Cを構築した。 対照として、 同様に、 YE P 1 G I I を E c o R Iで切断後、 末端を DN Aポリメラーゼにより平滑化し、 これに p UC PD Iの PD I構造遺伝子を含む D r a I— D r a I切断部位間を 揷入し、 YE p G I I PD Iを構築した。 構築した酵母内 PD I発現ベクターを 表 3に示す。 表 3 酵母形質転換用べクタ一 名称 ベクター プロモーター 小胞体局在 導入菌
シグナル 株名称
YEplGII YEplGII 一 一 E 0
YEpGIIPDI YEplGII 変異型 野生型 E 1 YEpGIIPDIC YEplGII 変異型 変異型 E 2 実施例 4 発現ベクターによる宿主細胞の形質転換
実施例 3で得られた酵母 PD I発現ベクターを用いて、 PD I製造用の宿主細 胞サッカロマイセス ·セレピシェ P 1を、 常法に従い齚酸リチウムによるコンビ テント細胞法により形質転換した。 以下、 YE p l G I Iを導入した菌株を E 0、 YE p G I I PD Iを導入した酵母菌株を E 1、 YE p G I I PD I Cを導入し た酵母菌株を E 2と呼称する。 得られた形質転換体の E 2は、 平成 8年 1 1月 1 5日に工業技術院生命工学工業技術研究所 （干 305 茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号） に FERM P— 1 595 1として寄託された。 F E RM P - 1 5 9 5 1は、 平成 1 0年 1月 28日に原寄託よりブダペスト条約に基づく寄託へ移 管され、 受託番号 F ERM B P— 6240となった。
実施例 5 PD I活性測定
P D I活性測定法は、 M i z u n a g aらの方法 （J. B i o c h e m. ， 1 08， 846， 1 9 90) を改変して行った。 すなわち、 PD Iによって活性の 回複した RN a s e Aの活性測定を、 内田の方法 （生化学実験講座 2， p p 68, 東京化学同人， 1 9 76) に改変して行った。
PD I活性測定用試料 （または超純水） 40 / L、 2. 5倍濃度 P E緩衝液 (1 2 5 mM N a H2P〇4、 6. 2 5 mM EDTA— 2 Na、 p H 7. 5 ) 4 0 μ L, 0. I mMジチオスレィ トール 1 0 μ L (調製後、 2時間以内） を 1. 5 mL容エツペンドルフチューブに混合した後、 30°C、 5分間プレインキュべ ートした。 これに 1 OmM酢酸で調製した 5mgZmL RNa s e A、 及ぴs c r a mb l e d d i s u l f i d e b o n d s (S I GMA社製） 、 （ま たは 1 0 mM酢酸） を 1 0 /i L添加し、 30°C、 1 0— 30分間 P D I反応を行 つた。 一方、 オートクレーブ殺菌した T KM緩 i街液 （50mM トリス、 5 mM 塩化マグネシウム、 25mM 塩化カリウム、 pH 7. 5) を用いて調製 した 2mg/mLRNA (S I GMA社製、 T y p e X I ) l mLを 1. 5 mL 容エツペンドルフチューブに入れ、 37°C， 8分間プレインキュペートした。 こ れに前記の PD I反応液 1 0 μ Lを添加し、 3 7°C、 3分間 R N a s e A反応後、 RN a s e A反応液 1 50 μ ίをとり、 予め別のェッペンドルフチューブに入れ てあつた改変ゥラニル試薬 （1 0%過塩素酸に 0. 75%酢酸ゥラニルを溶解し た試薬） 50 しと混合した。 混合液を 1 2, 000 r p m, 5分間遠心分離し た後、 上清 40 μ Lをキュベットに取り出し、 3 7°Cに加温した超純水 1 mLで 希釈し、 3 7°Cで 2 60 nmにおける吸光度を測定した。
「P D I 1単位 （ 1 U) 」 は、 p H 7. 5、 30。C、 1分間に RN a s e A 1 Uを回復させる酵素活性と定義した。 また、 「RNa s eA 1単位 （ 1 U) 」 とは、 上記の方法 （RN a s e A反応溶液を反応停止と希釈によって （2 00/1 50 X 1 040/40倍希釈する） 分光光度計の 260における吸光度 を測定し、 1分間に 1増加させる酵素活性と定義した。 実施例 6 PD I活性を阻害しない培養培地の選定
酵母 PD I製造するための酵母培養培地は、 酵母菌体より抽出した粗酵素液と 培地を混合し、 PD I活性を測定することにより選抜した。
先ず、 ゥラシルを含まない最少培地 （6. 7 g/L y e a s t n i t r o g e n b a s e w i t h o u t am i n o a c i d (D i f c o) , 2 0 g/L グルコース、 20mgZL アデニン、 l OmgZL L—ヒスチジ ン、 60mgZL L—口イシン、 20mg/L L—トリブトファン、 1 00 mM HE PE S、 1 0 mM EDTA— 2 N a、 p H 7. 5 ) 5mLを入れた 1 6 mm径試験管に酵母 （サッカロマイセス 'セレピシェ） を 1白金耳植菌し、 30°C、 3日間振盪培養することにより、 菌体からの粗酵素液を調製した。 培養 終了後、 3000 r pm、 5分間遠心分離し、 これを氷冷した 4倍濃度の P E緩 衝液 (200 mM N a H2P 04、 1 0 mM EDTA- 2 N a , p H 7. 5) で 2回洗浄し、 菌体を取得した。 得られた菌体に 300 μ Lの 4倍濃度 PE緩衝液 を添加し、 菌体懸濁液 （全 1約 6 00 / L) とした。 約 0. 4 gのグラスビーズ (平均直径 0. 40— 0. 45 mm) を入った 1. 5 m L容エツペンドルフチュ ーブに、 該菌体懸濁液 300 μ Lを加え、 μチューブミキサー (トミー精ェ ΜΤ 一 360) を用いて、 冷蔵庫中にて 1 0分間最大速度で振盪することにより該菌 体を破砕した。 破砕終了後、 該エツペンチューブを 1 3 , 000 r pm、 1 5分 間遠心分離し、 上清を別のチューブに回収し、 粗酵素液として取得した： 次に、 得られた粗酵素液 20 μ Lと所期の培地 20 μ Lを混合して、 PD I活 性測定用試料とし、 上記の方法で PD I活性を測定した ώ なお、 培地は緩衝剤-と キレート剤を入れ調製した。 培地として、 前記ゥラシルを含まない最少培地、 YAD培地 （1 0 g/L イース トエキス、 2 0 gZL グルコース、 20mg L アデニン、 l O OmM HE PE S、 1 0 mM EDTA— 2 N a、 p H 7. 5) を比較した結果を表 4に示す。 表 4 PD I活性を阻害しない培地の選定 培地 PD I相対活性 （％) 水 1 00
Y AD 68
含まない最少培地 1 00 表 4より、 PD I活性を阻害しない培地としてゥラシルを含まない最少培地を 選抜した。 実施例 7 形質転換宿主細胞の培養
実施例 4で得られた形質転換酵母宿主細胞を、 Y P A D培地 5 m Lの入った 1 6 mto径試験管に 1 白金耳植菌し、 30°C、 3日間振盪量培養した。 該培養液を 3000 r pm, 5分間遠心分離後、 氷冷した 4倍濃度 P E緩衝液 （ 200 mM N a H2P04, 1 0 mM EDTA— 2 N a、 p H 7. 5) で 2回洗浄した。 再度遠心分離した菌体に、 ゥラシルを含まない最少培地に緩衝剤とキレート剤を 添加し調製した上記組成の PD I製造用培地 2 mLを加え、 30°C、 1 5時間振 盪培養した。 培養終了後の培養液を氷冷後、 3000 r pm、 5分間遠心分離し、 菌体と培養液とを分離した。 実施例 8 組換え酵母 PD Iタンパク質の PD I活性 酵母 PD I製造培養で得られた培養液に、 終濃度で 0. l g/Lになるようゥ シ血清アルブミン （B SA) (和光社製） を添加した後、 遠心濾過チューブ （M i 1 1 i p o r e、 ウルトラフリー C 3 LGC, 分画分子量 1万） に入れ、 60 00 r pm、 5°Cで全量が約 1 00 μ Lになるまで濃縮し、 含酵母 PD I溶液を 取得した。 前記表 3に示された各種形質転換酵母を用いて PD Iタンパク質を培 地へ分泌発現させ、 実施例 4の方法により PD I活性を測定比較した結果を表 5 に示す。 Ε 2株 （分泌型に変換した酵母 PD I遺伝子を導入） において、 最も Ρ D I活性が高く、 本発明の有効性が確認された。 表 5 Ε 0， — Ε 1， _ Ε 2株の P D I活性 菌株 サンプル P D I活性 m L )—
E 0 培養液 0
E 1 培養液 0 95 X 1 0
E 2 培養液 1 43 X 1 0
2 E 0 培養液 0
E 1 培養液 1 1 5 X 1 0
E 2 培養液 2 2 7 X 1 0
E 0 培養液 0
E 1 培養液 0 36 X 10
E 2 0 90 X 1 0
*) 培養液の P D I活性は濃縮液 1 m Lあたりで示した。 実施例 9 培表液の SDS— PAGE
さらに、 培養液中の酵母 PD Iの検出を、 S D S— P AG Eによっても行った: 培養液に B S Aを添加せずに、 上記と同様の方法で約 60倍に濃縮した。 装置 は AT TO製 2連ミニスラブ電気泳動装置 （AE 6450) を使用し、 方法は付 属マニュアルに従い L a e mm i i法にて行ったつ 分離ゲル濃慶は 7. 5%とし た。 染色は B LU P R I NT F a s t— PAGE S t a i n (G I BCOB RL社製） を用いた。
図 1 1に染色した SDS— PAGEゲルをイメージ映像化したものを示す。 分 子量 7万ダルトン付近に PD I導入菌株 （E l , E 2) に特異的なパンドが見ら れる。 酵母 PD I分子 1は約 7万ダルトンであり、 これが酵母 P D I と考えられ る。 バンド濃度は E 2 >E 1で、 SDS— PAGEによっても本発明の有効性が 確認された。 発明の効果
本発明の方法により、 酵母 PD Iタンパク質が、 活性を有する状態で多量に培 養液に分泌され、 簡便な精製法で回収することが可能となった。
配列表
( 1 ) 配列番号： 1
( i ) 配列の特性
(A) 長さ ： 1 5 6 9塩基対
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
( i i ) 配列の種類： c DN A
( i i i ) ハイポセティカル ： NO
( i V) アンチセンス ： NO
(v i ) 起源 ：
(A) 生物名 ：サッカロマイセス ·セレビシェ
(X i ) 配列：配列番号：'1
ATG AAG TTT TCT GCT GGT GCC GTC CTG TCA TGG TCC TCC CTG CTG 45 Met Lys Phe Ser A丄 a ij丄 y Ala Val Leu Ser Trp i>er Ser Leu Leu
5 10 15
CTC GCC TCC TCT GTT TTC GCC CAA CAA GAG GCT GTG GCC CCT GAA 90 Leu Ala Ser Ser Val Phe Ala Gin Gin Glu Ala Val Ala Pro Glu
20 25 30
GAC TCC CTG TCG TTA AGT TGG CCA CCG ACT CTT TCA ATG AAT ACA 135 Asp Ser Leu Ser Leu Ser Trp Pro Pro Thr Leu Ser Met Asn Thr
35 40 45
TTC AGT CGC ACG ACT TGG TGG CTT GCG GAG TTT TTT GCT CCA TGG 180 Phe Ser Arg Thr Thr Trp Trp Leu Ala Glu Phe Phe Ala Pro Trp 50 55 60
TGT GGC CAC TGT AAG AAC ATG GCT CCT GAA TAC GTT AAA GCC GCC 225 Cys Gly Hi s Cys Lys Asn Met Ala Pro Glu Tyr Val Lys Ala Ala
65 70 75
GAG ACT TTA GTT GAG AAA AAC ATT ACC TTG GCC CAG ATC GAC TGT 270 Glu Thr Leu Val Glu Lys Asn l ie Thr Leu Ala Gin lie Asp Cys
80 85 90
ACT GAA AAC CAG GAT CTG TGT ATG GAA CAC AAC ATT CCA GGG TTC 315 Thr Glu Asn Gin Asp Leu Cys Met Glu His Asn He Pro Gly Phe
95 100 105
CCA AGC TTG AAG ATT TTC AAA AAC AGC GAT GTT AAC AAC TCG ATC 360 Pro Ser Leu Lys lie Phe Lys Asn Ser Asp Val Asn Asn Ser lie
110 115 120
GAT TAC GAG GGA CCT AGA ACT GCC GAG GCC ATT GTC CAA TTC ATG 405 Asp Tyr Glu Gly Pro Arg Thr Ala Glu Ala lie Val Gin Phe Met
125 130 135
ATC AAG CAA AGC CAA CCG GCT GTC GCC GTT GTT GCT GAT CTA CCA 450 lie Lys Gin Ser Gin Pro Ala Val Ala Val Val Ala Asp Leu Pro
140 145 150
GCT TAC CTT GCT AAC GAG ACT TTT GTC ACT CCA GTT ATC GTC CAA 495 Ala Tyr Leu Ala Asn Glu Thr Phe Val Thr Pro Val l ie Val Gin
155 160 165 TCC GGT AAG ATT GAC GCC GAC TTC AAC GCC ACC TTT TAC TCC ATG 540
Ser Gly し ys l ie Asp Ala Asp Phe Asn Ala Thr Phe Tyr Ser Met
170 175 180
GCC AAC AAA CAC TTC AAC GAC TAC GAC TTT GTC TCC GCT GAA AAC 585
Ala Asn Lys His Phe Asn Asp Tyr Asp Phe Val Ser Ala Glu Asn
185 190 195
GCA GAG GAT GAT TTC AAG CTT TCT ATT TAC TTG CCC TCC GCC ATG 630
Ala Glu Asp Asp Phe Lys Leu Ser lie Tyr Leu Pro Ser Ala Met
200 205 210
GAC GAG CCT GTA GTA TAC AAC GGT AAG AAA GCC GAT ATC GCT GAC 675 Asp Glu Pro Val Val Tyr Asn Gly Lys Lys Ala Asp lie Ala Asp
215 220 225
GCT GAT GTT TTT GAA AAA TGG TTG CAA GTG GAA GCC TTG CCC TAC 720 Ala Asp Val Phe Glu Lys Trp Leu Gin Val Glu Ala Leu Pro Tyr
230 235 240
TTT GGT GAA ATC GAC GGT TCC GTT TTC GCC CAA TAC GTC GAA AGC 765 Phe Gly Glu lie Asp Gly Ser Val Phe Ala Gin Tyr Val Glu Ser
245 250 255
GGT TTG CCT TTG GGT TAC TTG TTC TAC AAT GAC GAG GAA GAA TTG 810 Gly Leu Pro Leu Gly Tyr Leu Phe Tyr Asn Asp Glu Glu Glu Leu
260 265 270 GAA GAA TAC AAG CCT CTC TTT ACC GAG TTG GCC AAA AAG AAC AGA 855 Glu Glu Tyr Lys Pro Leu Phe Thr Glu Leu Ala Lys Lys Asn Arg
275 280 285
GGT CTA ATG AAC TTT GTT AGC ATC GAT GCC AGA AAA TTC GGC AGA 900 Gly Leu Met Asn Phe Val Ser lie Asp Ala Arg Lys Phe Gly Arg
290 305 300
CAC GCC GGC AAC TTG AAC ATG AAG GAA CAA TTC CCT CTA TTT GCC 945 His Ala Gly Asn Leu Asn Met Lys Glu Gin Phe Pro Leu Phe Ala
305 310 315
ATC CAC GAC ATG ACT GAA GAC TTG AAG TAC GGT TTG CCT CAA CTC 990 lie His Asp Met Thr Glu Asp Leu Lys Tyr Gly Leu Pro Gin Leu
320 325 330
TCT GAA GAG GCG TTT GAC GAA TTG AGC GAC AAG ATC GTG TTG GAG 1035 Ser Glu Glu Ala Phe Asp Glu Leu Ser Asp Lys lie Val Leu Glu
335 340 345
TCC AAG GCT ATT GAA CCT TTG GTT AAG GAC TTC TTG AAA GGT GAT 1080 Ser Lys Ala lie Glu Pro し eu Val Lys Asp Phe Leu Lys Gly Asp
350 355 360
GCC TCC CCA ATC GTG AAG TCC CAA GAG ATC TTC GAG AAC CAA GAT 1125 Ala Ser Pro He Val Lys Ser Gin Glu lie Phe Glu Asn Gin Asp
365 370 375
TCC TCT GTC TTC CAA TTG GTC GGT AAG AAC CAT GAC GAA ATC GTC 1170 2
ηΐΟ 丄
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usy ηχο sXq 81^1 VVO OVl Oil 330 OVV 100 OVO 010 OVO Dll DVO 100 OVV VVO OVV
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9Ι2Ϊ DOL 330 丄 VI 3V丄 iXU 丄丄 丄丄 丄丄 ί) OVO OVV OVV VOD OVO OVV
06S S82 08S
ΤΒΛ 9Π ηχο dsy s sAq η9Ί "TO Ji5S f00/86dT/X3d 6f0SC/86OAV 485 490 495
GAA GCC CAG GAA AAG GCT GCT GAG GAA GCC GAT GCT GAC GCT GAA 1530 Glu Ala Gin Glu し ys Ala Ala Glu Glu Ala Asp Ala Asp Ala Glu
500 505 510
TTG GCT GAC GAA GAA GAT GCC ATT CAC GAT GAA TTG TAA 1569 Leu Ala Asp blu Glu Asp Aia lie His Asp Glu Leu
515 520 522
( 2 ) 配列番号： 2
( i ) 配列の特性
(A) 長さ ： 5 84 8塩基対
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：二本鎖
(D) トポロジー：両形態
( i i ) 配列の種類： c DN A
( i i i ) ハイポセティカル ： NO
( i V) アンチセンス ： NO
(v i i ) 直接の起源：
(C) クローン名 ： YE p l G I I
( X i ) 配列：配列番号： 2
1 AGATCTGGGC CTCGTGATAC GCCTATTTTT ATAGGTTAAT GTCATGATAA TAATGGTTTC 61 TTAGACGTCA GGTGGCACTT TTCGGGGAAA TGTGCGCGGA ACCCCTATTT GTTTATTTTT 121 CTAAATACAT TCAAATATGT ATCCGCTCAT GAGACAATAA CCCTGATAAA TGCTTCAATA 181 ATATTGAAAA AGGAAGAGTA TGAGTATTCA ACATTTCCGT GTCGCCCTTA TTCCCTTTTT 241 TGCGGCATTT TGCCTTCCTG TTTTTGCTCA CCCAGAAACG CTGGTGAAAG TAAAAGATGC 301 TGAAGATCAG TTGGGTGCAC GAGTGGGTTA CATCGAACTG GATCTCAACA GCGGTAAGAT 00 σ¾ o
Figure imgf000029_0001
VきV 80V0 i VV83 διιιινΰき V νν 1§V。V01 v§ VV30300 さ/1υ¾ OAV
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vvν§vννΰ vvV1Vοΰο ο vll 0011 )13 ΰνοννο 6Z
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86f00/86df/X3d 6fOS£/86 OAV 5581 GAAATCGATA GATCAATTTT TTTCTTTTCT CTTTCCCCAT CCTTTACGCT AAAATAATAG
5641 TTTATTTTAT TTTTTGAATA TTTTTTATTT ATATACGTAT ATATAGACTA TTATTTACTT
5701 TTAATAGATT ATTAAGATTT TTATTAAAAA AAAATTCGTC CCTCTTTTTA ATGCCTTTTA
5761 TGCAGTTTTT TTTTCCCATT CGATATTTCT ATGTTCGGGT TTCAGCGTAT TTTAAGTTTA
5821 ATAACTCGAA AATTCTGCGT TTCGAAAA
( 3 ) 配列番号： 3
( i ) 配列の特性
(A) 長さ ： 1 7塩基対
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
( i i ) 配列の種類：合成 DN A
( X i ) 配列：配列番号： 3
CAGGA AACAG CTATG AC 17
(4) 配列番号： 4
( i ) 配列の特性
(A) 長さ ： 2 9塩基対
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
( i i ) 配列の種類：合成 DNA
(x i ) 配列：配列番号： 4
AACGT TAGCA TTTTG TTTAT TTATG TGTG 29
( 5 ) 配列番号： 5 ( i ) 配列の特性
(A) 長さ ： 2 3塩基対
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー ：直鎖状
( i i ) 配列の種類：合成 DN A
( X i ) 配列：配列番号： 5
AACAA AATGA AGTTT TCTGC TGG 23
(6) 配列番号： 6
( i ) 配列の特性
(A) 長さ ： 1 6塩基対
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー ：直鎖状
( i i ) 配列の種類：合成 DN A
( X i ) 配列：配列番号： 6
GTTTC CCAGT CACGA C 16
( 7 ) 配列番号： 7
( i ) 配列の特性
(A) 長さ ： 2 1塩基対
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー ：直鎖状
( i i ) 配列の種類：合成 DN A
(x i ) 配列：配列番号： 7 TAACA ATTAA TCGTG AATGG C 21
( 8 ) 配列番号： 8
( i ) 配列の特性
(A) 長さ ： 20塩基対
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
( i i ) 配列の種類：合成 DN A
( X i ) 配列：配列番号： 8
TGATT ACGCC TAGCT TACAT 20

Claims

請求の範囲
1. 生物学的に活性な組換え酵母プロテインジスルフィ ドイソメラーゼの製造 方法であって、
a) 酵母のプロテインジスルフィ ドイソメラーゼをコードする遺伝子の小胞 体局在シグナルをコードする領域の 1または複数の塩基を欠失、 置換若しくは付 加することによって、 当該小胞体局在シグナルの一部又は全部をコードしないよ うに改変し ；
b) 前記改変遺伝子を発現ベクターに組み込み；
c) 前記発現ベクターで宿主細胞を形質転換し；そして
d) 前記発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培地の p Hを中性近傍に保 ちながら培養する
ことにより宿主細胞外へプロティンジスルフィ ドイソメラーゼを活性な状態で分 泌させることを含む、 前記製造方法。
2. 前記小胞体局在シグナルが、 C末端の 4アミノ酸残基 HDE Lである、 請 求項 1に記載の方法。
3. 発現ベクターが、 酵母発現ベクター YE p 1 G I Iである、 請求項 1また は 2に記載の方法。
4. 宿主細胞を p H 6. 5— 8に保ちながら培養する、 請求項 1ないし 3のい ずれか 1項に記載の方法。
5. 工程 dの次に、 培養液中に分泌されたプロテインジスルフイ ドイソメラー ゼを濃縮または精製することをさらに含む、 請求項 1ないし 4のいずれか 1項に 記載の方法。
6. 請求項 1ないし 5のいずれか 1項に記載の方法により製造された、 組換え 酵母プロテインジスルフィ ドイソメラーゼ
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