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WO2006121165A1 - タンパク質の製造法 - Google Patents

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WO2006121165A1
WO2006121165A1 PCT/JP2006/309598 JP2006309598W WO2006121165A1 WO 2006121165 A1 WO2006121165 A1 WO 2006121165A1 JP 2006309598 W JP2006309598 W JP 2006309598W WO 2006121165 A1 WO2006121165 A1 WO 2006121165A1
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WO
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bacterium
methanol
sequence
protein
promoter
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/309598
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hiroshi Itaya
Yoshimi Kikuchi
Masayo Date
Original Assignee
Ajinomoto Co., Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to JP2007528343A priority patent/JP5167813B2/ja
Priority to EP06732579A priority patent/EP1882743A4/en
Publication of WO2006121165A1 publication Critical patent/WO2006121165A1/ja
Priority to US11/938,844 priority patent/US8187835B2/en

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    • C12N9/86—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides, e.g. penicillinase (3.5.2)
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    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a method for secretory production of proteins containing industrially useful enzymes and physiologically active proteins using methanol-assimilating bacteria.
  • Methanol is a fermentation raw material that is inexpensive and available in large quantities, and is very useful as a carbon source. So far, a method of producing L-amino acids using methanol as a major carbon source using methanol-assimilating bacteria (see Patent Document 1), a method of producing polysaccharides using methanol-assimilating bacteria (Patent Document 2) Reference) was developed.
  • Non-Patent Document 1 examples in which lacZ was produced in bacterial cells by inducing with methanol using the alcohol oxidase (AOX) gene promoter in yeasts of the genus Pichia (see Non-Patent Document 1)
  • AOX alcohol oxidase
  • Non-Patent Document 2 An example is known in which aprochun (usi-derived spleen trypsin inhibitor) is secreted into the culture supernatant in an active form (see Non-Patent Document 2).
  • Examples of the accumulation of fluorescent protein (GFP) in the cells of Methylobac terium extorquens, a non-biased methanol-assimilating bacterium among methanol-assimilating bacteria (Patent Literature 3, Non-Patent Literature 3) are known.
  • GFP fluorescent protein
  • Patent Literature 3 Non-Patent Literature 3
  • secreting a protein outside the cell in an obligate methanol-assimilating bacterium secreting a protein outside the cell in an obligate methanol-assimilating bacterium.
  • Patent Document 1 European Patent Publication No. 1188822
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 11-56384
  • Patent Document 3 WO2003 / 046226 A1
  • Non-Patent Document 1 Nucleic Acids Res. 1987 May 11; 15 (9): 3859—76.
  • Non-Patent Document 2 J Ind Microbiol. 1991 Apr; 7 (3): 197-201.
  • Non-Patent Document 3 FEMS Microbiol Lett. 2000 Dec 15; 193 (2): 195-200
  • An object of the present invention is to provide a method for efficiently secreting and producing proteins and the like that have been difficult to produce with Escherichia bacteria.
  • the present inventors paid attention to a promoter and a signal sequence derived from a methanol-assimilating bacterium, and conducted intensive studies. As a result, a methanol-assimilating bacterium having a DNA sequence containing a promoter sequence that functions in methanol-assimilating bacteria and a nucleic acid sequence encoding a signal sequence and a target protein is cultured in a medium containing methanol as a main carbon source. As a result, it was found that proteins can be efficiently secreted and produced, and the present invention has been completed.
  • the present invention is as follows.
  • a protein characterized by culturing a methanol-assimilating bacterium in a liquid medium containing methanol as a carbon source, thereby allowing the bacterium to secrete the target protein and recovering the secreted target protein. Manufacturing method.
  • the methanol-assimilating bacterium is a Methylophilus bacterium, a Methylobacillus bacterium, a Methylophaga bacterium, an Achromopacter bacterium, a Pseudomonas bacterium, a Protaminobacterium bacterium, a Methanomonas bacterium, a Microcyclas bacterium, or a Methylobacterium.
  • the protein is a protein selected from phytase, interleukin, transglutaminase, interferon, insulin, acid phosphatase and peptide synthase.
  • the production method of the present invention includes a promoter sequence that functions in a methanol-assimilating bacterium, and a nucleic acid sequence that encodes a polypeptide including a signal sequence and a target protein sequence that is operably linked to the promoter sequence.
  • the methanol-assimilating bacterium first produces a polypeptide containing a signal sequence and a target protein, and then the signal sequence is cleaved to transfer the target protein to periplasm, and then to the outside of the cell. And secreted.
  • the target protein can be produced by recovering the secreted protein.
  • the production by secreting a protein into a bacterium and collecting the protein is sometimes referred to as “protein secretion production”.
  • secretory proteins are generally translated as prepeptides or prepropeptides, and then become mature proteins. That is, generally, after being translated as a prepeptide or prepeptide, the prepart is cleaved and converted to a mature peptide or propeptide, and the propeptide is further cleaved by a protease and further matured. It is known to become a type protein. Proteases responsible for cleavage of such signal peptides are generally called signal peptidases. [0009] In the present invention, when the target protein is secreted as a propeptide which may be secreted in the form of a mature protein or propeptide, an appropriate protease treatment is performed after the recovery. Thus, a mature protein can be obtained.
  • signal sequence refers to a sequence that is present at the N-terminus of a secretory protein precursor and is recognized upon protein secretion. Peptides with partial amino acid residues!
  • a protein having both a pre-sequence and a pro-part that is, a primary translation product is sometimes referred to as a “preb mouth protein”, and a protein having no pro-part but having a pro-part.
  • preb mouth protein a protein having no pro-part but having a pro-part.
  • proprotein The pro-pro part of a pro-protein is sometimes referred to as the “pro-structure part” or simply “pro-structure”.
  • the bacterium used in the production method of the present invention encodes a polypeptide comprising a promoter sequence that functions in a methanol-assimilating bacterium, a signal sequence operably linked to the promoter sequence, and a target protein sequence.
  • a DNA construct containing the nucleic acid sequence to be obtained is introduced into a methanol-assimilating bacterium.
  • the “methanol assimilating bacterium” is a bacterium that can grow using methanol as a main carbon source, and includes the genera Methylophilus, Methylobacillus, Methylophaga, Achromopacter, and Syudomonas. 45-25273), Protaminobacter genus (Japanese Patent Publication No. 49-125590), Methanomonas genus (Japanese Unexamined Patent Publication No. 50-25790), Micro Cyclas genus (Japanese Patent Publication No. 52-18886) And bacteria belonging to the genus Methylobacteria and the like.
  • bacteria that grow with methanol as the main carbon source and do not grow with glucose as a single carbon source or grow only weakly include Methylophilus bacteria, Methylobacillus bacteria, and Methylophaga bacteria.
  • Methylophilus bacteria include Methylophilus methylotrophus
  • Methylobacillus bacteria include Methylobacillus glycogenes, Methylobacillus flagellatus (Me thylobacillus flagellatus).
  • Mechirofaga bacteria examples include Mechirofa moth 'Sarashika (Methylophaga thalassica), Mechirofaga' marina (Methylophaga mari n a), and the like Mechirofaga bacteria such as methylcarbamoyl port Faga 'Arukarifuira (Methylophaga alcaliphila) (Biology of Methylotrophs; Edited by Israel Goldberg and J. Stef an Roken and published by Butterworth—Heinemann). It is also preferable that the bacterium is a bacterium having a function of secreting methano-to-norehydrogenase (MDH) outside the microbial cell.
  • MDH methano-to-norehydrogenase
  • Methylophilus' methylotrophus examples include AS1 strain (NCIMB10515), W3A1 (NCIMB 11348 strain), and ATCC53528 strain.
  • Methylophilus' Methylotrophus AS1 strain (NCI MB10515), W3A1 (NCIMB 11348 strain) is a national collection of industrial and marine Bacteria, address NCIMB Lts., Torry Research Station 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom).
  • Methylobacillus glycogenes includes T-11 strain (NCIMB 11375), ATCC 2127 6 strain, ATCC 21371 strain, ATCC 29475 strain, ATR80 strain (Appl. Microbiol. BiotechnoL, (1994), 42 ⁇ , p67-72), A513 strain (Appl. Microbiol. BiotechnoL, (1994), 42 ⁇ , p6 7-72) and the like.
  • Methylobacillus' Glycogenes NCIMB 11375 is a National Collections of Industrial Ana Marine Bacteria, address NCIMB Lts., Torry Research Station 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom).
  • VKM B-1610 strain and the like.
  • the Methylobacillus' Flageratus VKM B-1610 strain is also available in ALL-RUSSIAN COLLECTIO N OF MICROORGANISMS (Russia, 142290, Moscow Region, Pushchino, pr. Nauki, 5, IBPM).
  • Methylophaga 'Sarashica examples include ATTC 33145 strain, ATTC 33146 strain and the like. Examples of Methylofaga 'Marina include ATCC35842 strain. Examples of Methylofaga® alkali fillers include ATCCBAA-297 TM. Methylophaga 'Sarashika A TTC 33145 and ATTC 33146 can be purchased from the American' Type Kartyaichi 'collection (ATCC) (address ATCC, Address: PO Box 1549, Manassas, VA 20108, 1, United States of America;).
  • ATCC American' Type Kartyaichi 'collection
  • the "promoter that functions in a methanol-assimilating bacterium" contained in the DNA construct introduced into the methanol-assimilating bacterium is a force that means a promoter having promoter activity in the methanol-assimilating bacterium described above. It is not limited to a promoter derived from methanol-assimilating bacteria, and may be a promoter derived from another microorganism. In addition, a promoter inducible with methanol and a non-inducible promoter are included. Examples of the promoter that can be induced with methanol include a promoter of methanol dehydrogenase gene, a promoter of dihydroxyacetone synthase gene, and a promoter of formate dehydrogenase gene.
  • a promoter that functions in a methanol-assimilating bacterium a methanol dehydrogenase gene promoter (SEQ ID NO: 11) induced by methanol, a tac promoter (high expression promoter derived from Escherichia coli) ( SEQ ID NO: 12), ⁇ ⁇ promoter (SEQ ID NO: 21), ribosome protein promoter (SEQ ID NO: 22), etc., but are not limited to these! ,.
  • the promoter sequence is not limited to the wild type promoter, and may be a promoter obtained by modifying the wild type sequence in order to highly express the target gene. For example, as long as it has promoter activity in the bacterium, it may be a sequence obtained by substituting, deleting, adding, or inserting the wild type promoter sequence as described above. In order to increase the promoter activity, the promoter may be modified to the ⁇ 35 region and the ⁇ 10 region, or may be modified by adjusting the length of the spacer region between the ⁇ 35 and ⁇ 10 regions. Examples of methods for modifying these 35 and 110 regions include the method described in EP 1033407 and the method described in Nucleic Acids Res. 1999 Dec 15; 27 (24): 4768-74. Mentioned It is.
  • Promoter activity is defined by the frequency of RNA synthesis initiation.
  • strong promoters that can be used in methods for evaluating promoter activity and in the present invention include Goldstein et al. (Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128) and the like. It is described in.
  • International Publication No. 00/18935 pamphlet it is possible to introduce a base substitution of several bases into the promoter region of the target gene and modify it to be more powerful.
  • a nucleic acid sequence encoding a polypeptide containing a signal sequence and a target protein is linked downstream of the promoter so that it can be expressed.
  • a signal sequence that functions in a methanol-assimilating bacterium refers to a sequence capable of recognizing the above-described methanol-assimilating bacterial force and secreting the target protein when linked to the target protein. means.
  • the signal sequence may be a signal sequence derived from a protein different from the target protein, or may be a signal sequence contained in a precursor protein of the target protein. However, the signal sequence is preferably derived from the secreted protein of the host methanol-assimilating bacterium to be used.
  • the signal sequence that can be used for the purpose of the present invention may partially include the amino acid sequence on the N-terminal side of the target protein following the signal sequence in the precursor protein from which the signal sequence is derived.
  • the prep mouth protein is sometimes referred to as “heterologous fusion prep mouth protein”.
  • the protein when it is insulin, it may be referred to as “heterologous fusion preproinsulin” as opposed to “preb mouth insulin” or “proinsulin”.
  • the signal sequence is not particularly limited as long as it functions in methanol-assimilating bacteria. Signal sequences derived from secretory proteins of methanol-assimilating bacteria, other bacteria, yeasts, plants, animals, etc. Signal sequences derived from these secreted proteins can be used. More specifically, a signal sequence (amino acid sequence of SEQ ID NO: 18) of methanol dehydrogenase (MDH) derived from Methylotophas facillus methylophilus.
  • MDH methanol dehydrogenase
  • the signal sequence of phytase encoded by the Escherichia coli appA gene (amino acid sequence of SEQ ID NO: 20) and the signal sequence of acid phosphatase of Morganella morga nii (SEQ ID NO: 26 1-20) Etc.).
  • the nucleotide sequences encoding these amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 17, 19, and 25, respectively.
  • the base sequence encoding the signal sequence may be a base sequence encoding the wild-type signal sequence, but the sequence was substituted together with the codon used for the methanol-utilizing bacterium that secreted and produced the protein. It may be an array.
  • the "target protein” that can be secreted and recovered by the method of the present invention is secreted by using a methanol-assimilating bacterium by being linked to the signal sequence that functions in the aforementioned methanol-assimilating bacterium.
  • the protein is not particularly limited as long as it is a protein that can be processed, and includes all proteins including secreted proteins derived from animals and plants and microorganisms, and proteins in bacterial cells.
  • the method of the present invention can also be applied to powerful proteins that could not be secreted and produced by gram-negative bacteria such as Escherichia bacteria.
  • the “target protein” is preferably a heterologous protein having a different origin from that of the host methanol-utilizing bacterium.
  • the pre-sequence and the pro-sequence may be removed from the precursor, and those having the sequence and those containing the pro-sequence may be used without any deviation! ⁇ .
  • the “target protein” may be a protein from which at least one amino acid constituting the pre-part and pro-part has been removed by cleaving the peptide bond from the precursor protein, and its N-terminal region. That completely matches that of the natural mature protein, and one or more extra amino acids derived from the pre- or pro-part at the N-terminus compared to the natural mature protein, Also included are proteins that have a shorter amino acid sequence than the native mature protein.
  • the target protein to which the production method of the present invention can be applied is not particularly limited, and examples thereof include mature proteins or proproteins of the following proteins.
  • Phytase [EC: 3.1.3.2 3.1.3.26]
  • IL2 Human interleukin 2 (IL2: Genbank Accession No. AAK26665 etc., mature type is amino acid sequence 21-153) Plotting glutaminase
  • GCSF Granulocyte stimulating factor
  • Phytase also called phosphoanhydride phosphorylase
  • Phytases is an enzyme that hydrolyzes phytin (also called inositol hexakisphosphate or phytic acid), and is useful in the food, agricultural, and pharmaceutical fields.
  • phytases Information on the amino acid sequence of each phytase and the base sequence encoding it can be obtained by referring to the respective Genbank Accession Nos.
  • the acid phosphatase is an enzyme that catalyzes a reaction of hydrolyzing a phosphate ester under acidic conditions (EC 3.1.3.2).
  • a phosphate ester under acidic conditions
  • the following acid phosphatase derived from Morganella morgani oil and international publication WO96Z37603 The acid phosphatase described in the pamphlet and mutants thereof can be used.
  • the mature protein has amino acid sequences 21-259
  • genes encoding these proteins can be modified according to the host used and Z or to obtain the desired activity, including the addition of one or more amino acids to the encoded amino acid sequence. Modifications that result in deletions, substitutions, etc. are included.
  • Such general molecular biology techniques including modification techniques, gene cloning techniques, and production protein detection techniques, are well known to those skilled in the art, for example, Sambrook et al., 2001. , Molecular loning: A Laboratory Manual, Third Edition (1989) Cold bpnn g Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, DNA cloning: A Practic al Approach, Volumes I and II (DN Glover ed. 1985), FM Ausubel et al.
  • a gene encoding a protein can be obtained by PCR using primers designed based on a known sequence.
  • a gene that encodes a target protein based on homology etc. can be isolated from a chromosome of a microorganism, animal or plant, etc. by a hybridization method and the like, and its base sequence determined.
  • a gene chemically synthesized according to a known base sequence can be used. Sequence information can be obtained from database such as Genbank.
  • the target protein may be a protein including substitution, deletion, insertion, or addition of one or several amino acids at one or a plurality of positions as long as the target protein has the activity of the target protein. .
  • “one or several” means different forces depending on the position and type of the protein in the three-dimensional structure of amino acid residues. Specifically, 1 to 30, preferably 1 to 20, more preferably 1 To 10 pieces.
  • the protein substitution described above is a conservative substitution such that the activity of the protein is maintained.
  • a substitution is a change in which at least one residue in the amino acid sequence is removed and another residue is inserted therein.
  • the amino acids that replace the original amino acid of the enzyme protein and are considered conservative substitutions include Ala to Ser or Thr, Arg to Gln, His or Lys, Asn to Glu, Gln, Lys , His or Asp substitution, Asp to Asn, Glu or Gin substitution, Cys to Ser or Ala substitution, Gin to Asn, Glu, Lys, His, Asp or Arg substitution, Glu to Gly, Asn, Gln, Lys or Asp substitution, Gly to Pro substitution, His to Asn, Lys, Gln, Arg or Tyr substitution, lie to Leu, Met, Val or Phe substitution, Leu to lie, Met, Val or Phe substitution, Lys to Asn, Glu, Gln, His or Arg, Met to Ile, Leu, Val or Phe substitution
  • DNA encoding a protein that is substantially the same as the above-described protein may be substituted, deleted, inserted, added, or reversed, for example, by site-specific mutagenesis. It is obtained by modifying the base sequence encoding these enzymes so as to include the position. Further, the modified DNA as described above can be obtained by a conventionally known mutation treatment. Mutation treatment includes in vitro treatment of DNA before mutation treatment with hydroxylamine and the like, and microorganisms that retain the DNA before mutation treatment, such as bacteria belonging to the genus Escherichia, by ultraviolet irradiation or N-methyl N′-trole.
  • N-trosoguanidine N-trosoguanidine
  • a mutagen usually used for mutagenesis such as nitrous acid
  • An error-blown PC is a method for artificially generating random errors by making them irregular. R method etc. are mentioned.
  • DNA encoding substantially the same protein can be obtained.
  • a DNA encoding a protein having a mutation or a cell retaining the same is subjected to stringent conditions with, for example, a probe having a complementary sequence of a base sequence of a wild-type gene or a part thereof, and a stringent condition, and It is also possible to obtain DNA encoding a protein having the target protein activity.
  • stringent conditions refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. Although it is difficult to clearly express this condition, for example, highly homologous DNAs, for example, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, particularly preferred.
  • DNA with 95% or more homology is hybridized, and the homology is lower than that, and the DNA is not hybridized! /, Conditions, or washing of normal Southern hybridization
  • the condition is 60. C, 1 X SSC, 0. 1 0/0 SDS, or preferably ⁇ , 0. 1 X SSC, Haiburidizu conditions and the like at a salt concentration corresponding to 0. 1% SDS.
  • the target protein as described above may be directly linked to a signal sequence or indirectly linked via a linker sequence.
  • a linker sequence When a linker sequence is included, such a linker sequence can be used as long as it does not inhibit the productivity of the polypeptide or the activity of the target protein.For example, for purifying the target protein such as polyhistidine. Use arrays, etc.
  • the nucleic acid sequence encoding the polypeptide containing the signal sequence and the target protein can be appropriately prepared by linking the nucleic acid sequence encoding the signal sequence and the nucleic acid sequence encoding the target protein using a restriction enzyme or the like. it can.
  • a sequence encoding the precursor protein containing the signal sequence and the target protein can be amplified by PCR or the like.
  • the crossover PCR method is advantageously used for amplification, although various known variations can be used.
  • a DNA construct introduced into a methanol-assimilating bacterium comprises a signal sequence and a target protein.
  • Nucleic acid sequences encoding the polypeptide comprising can be prepared by linking to a promoter so that it can be expressed. “Linked so as to allow expression” means that when introduced into the bacterium, mRNA encoding the polypeptide is transcribed by the promoter, and the polypeptide is produced by the bacterium.
  • the nucleic acid sequence is linked to a promoter in a state including a 5 ′ untranslated region containing a transcription start site before the start codon of the polypeptide coding sequence.
  • the 5 ′ untranslated region may be a 5 ′ untranslated region of the sequence from which the promoter is derived, for example, in the case of the MDH gene promoter, the 5 ′ untranslated region of the MDH gene is used.
  • the 5 ′ untranslated region of the gene from which the sequence encoding the signal sequence is derived may be used, such as making the 5 ′ untranslated region of the phytase gene.
  • the operation for obtaining the DNA construct as described above may be carried out using microorganisms that directly secrete proteins, such as Escherichia, which uses gram-negative bacteria that can be easily genetically modified.
  • a vector carrying the above DNA construct may be introduced.
  • a gene fragment encoding the protein is ligated with a vector that functions in a methanol-assimilating bacterium, preferably a multicopy vector, to produce a recombinant DNA, which is then used as a methanol-assimilating bacterial host. Introduce into and transform.
  • the target promoter, signal sequence, and protein sequence can be obtained from, for example, the PCR method (PCR: polymerase chain reaction; White.TJ et al., Trends). Genet. 5, 185 (1989)).
  • Chromosomal DNA is derived from bacteria that are DNA donors, for example, by Saito and Miura's method. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963). For example, pp. 97-98, Baifukan, 1992).
  • Primers for PCR are based on gene sequences registered in known databases such as Genbank, or based on information on the region where sequences are conserved between known genes in other bacteria, etc. Can be prepared.
  • Examples of vectors capable of autonomous replication in methanol-assimilating bacteria include plasmids that can autonomously replicate in Methylophilus bacteria and Methylobacillus bacteria.
  • RSF1010 and its derivatives such as the Hirojuku main area vector, such as pAYC32 (Chistosrerdov, AY, Tsygankov, YD Plasmid, 1986, 16, 161-167), or pMFY42 (gene, 44, 53 (199 0)) ), PRP301, pTB70 (Nature, 287, 396, (1980)) and the like.
  • pAYCTER3 used in the examples in the present specification is also a suitable vector.
  • PAYCTER3 is a plasmid in which the upstream part of the streptomycin metagene (strA, B) of pAYC32 has been deleted and a pUC19 cloning site and a terminator of the E. coli rrnB gene have been inserted. That is, pAYCTER3 is a high-expression vector that does not express streptomycin resistance but becomes streptomycin-resistant through read-through when a DNA containing a promoter sequence in the forward direction is inserted into the multicloning site.
  • the vector is cleaved with a restriction enzyme that matches the end of the target gene. Ligation is usually performed using a ligase such as T4 DNA ligase.
  • the transformation methods reported so far may be used.
  • a method of preparing a competent cell from cells in the growth stage and introducing DNA Dubunau and Davidoff-Abelson, J. Mol. Biol, 56, 209 (1971); Duncan, CH, Wilson, GA and Young, FE , Gene, 1, 153 (1977)
  • a method in which a host cell is converted into a protoplast or spheroplast state that easily takes up a thread-replaceable DNA, and then the thread-recombinant DNA is introduced into a DNA recipient (Chang, S and d Choen, SN, Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979)).
  • one copy of the DNA construct is placed on the chromosomal DNA of the methanol-assimilating bacterium, or multiple copies. It can also be achieved by making it exist.
  • homologous recombination using a sequence that exists in multiple copies on the chromosomal DNA as a target, or a chromosome using a phage, etc. Perform random insertion on DNA.
  • a transposon As a sequence present in multiple copies on chromosomal DNA, a transposon, a repetitive sequence, or an inverted repeat present at the end of a transposable element can be used.
  • amplification of the vector and multicopy on the chromosome may be combined with the above-described modified expression regulatory sequence.
  • secreted of a protein or peptide means that the protein or peptide molecule is transferred outside the bacterial cell (extracellular), and finally the protein or peptide molecule.
  • extracellular extracellular
  • the target protein is secreted to such an extent that it can be recovered from the culture medium.
  • Methanol-assimilating bacteria are cultured using a medium containing methanol as a carbon source.
  • the medium using methanol as a carbon source include a medium to which 0.001 to 30% of methanol is added.
  • Carbon sources other than methanol for example, sugars such as glucose, sucrose, latatose, galactose, fructose starch hydrolysate, alcohols such as glycerin and sorbitol, fumaric acid, citrate, succinic acid, etc.
  • Organic acids may be included.
  • medium components other than methanol medium components such as nitrogen sources and inorganic ions used in normal culture can be added.
  • organic micronutrients such as vitamins and amino acids can be added as necessary.
  • nitrogen source ammonia gas, ammonia water, ammonium salt, and others can be used.
  • Inorganic ions include calcium ions, magnesium ions, phosphate ions, potassium ions, iron ions Etc. can be appropriately used as necessary.
  • the culture period may be about 1 to 7 days if the culture is performed under an aerobic condition in an appropriate range of pH 5.0 to 9.0 and 15 ° C to 45 ° C. By culturing methanol-assimilating bacteria under such conditions, the target protein is produced in large quantities in the cells and secreted efficiently.
  • the culture When using a promoter inducible with methanol, such as the MDH gene promoter, the culture may be performed under inducing conditions in order to increase the production amount of the polypeptide. Induction can be performed according to the conditions normally used for inducing the MDH gene promoter and the like. Normally, when cultivating methanol-utilizing bacteria in methanol, the MDH promoter functions without requiring special induction.
  • the protein secreted into the medium according to the present invention can be separated and purified after culturing, according to a method well known to those skilled in the art. For example, after removing cells by centrifugation, etc., salting out, ethanol precipitation, ultrafiltration, gel filtration chromatography, ion exchange column chromatography, affinity chromatography, medium to high pressure liquid chromatography, reverse phase chromatography Separation and purification can be performed by known appropriate methods such as chromatography and hydrophobic chromatography, or a combination thereof.
  • the polypeptide contains a sequence for purification, it can be purified using the sequence.
  • the protein secreted into the surface of the microbial cell according to the present invention is secreted into the medium after being soluble by a method well known to those skilled in the art, for example, by increasing the salt concentration, using a surfactant, etc. It can be separated and purified in the same manner as described above.
  • the protein secreted in the surface of the bacterial cell may be used as, for example, a fixed enzyme without dissolving it.
  • Example 1 Secretion expression of Methylophilus methyl otrophus ATCC 53528 of beta-lactamase derived from Escherichia coli K-12
  • the synthetic DNAs of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 designed to contain the sequence of the PUC19 multicloning site were annealed by methods well known to those skilled in the art.
  • a polylinker was created. This polylinker is designed to have the same end shape after cutting with restriction enzymes EcoRI and Bglll.
  • the primers described in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 were synthesized and Escherichia coli K-12 prepared according to a conventional method (Saito, Miura method [Biochim. Biophys. Acta, 72, 619 (196 3)]).
  • the region encoding the rrnB terminator sequence was amplified from the chromosomal DNA of the strain by PCR.
  • the primer of SEQ ID NO: 3 is designed with the recognition sequence of restriction enzyme Bglll
  • the primer of SEQ ID NO: 4 is designed with the recognition sequence of restriction enzyme Bell.
  • Pyrobest DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) was used for the PCR reaction, and the reaction conditions followed the protocol recommended by the supplier.
  • This PCR fragment was digested with restriction enzymes Bglll and Bell, and this PCR fragment was ligated with the previous polylinker to prepare a DNA fragment of about 400 bp.
  • DNA Ligation Kit Ver.2.1 manufactured by Takara Bio Inc. was used, and the reaction conditions followed the protocol recommended by the manufacturer.
  • M. methylotrophus ATCC 53 528 having the selected pAYCTER3 was cultured at 37 ° C. for 48 hours in SEIIA liquid medium containing 25 mg / l ampicillin and 2% methanol. After completion of the culture, the culture supernatant of M.
  • methylotrophus ATCC53528 cells having pAYCTER3 was subjected to SDS-PAGE, and a protein having the same molecular weight as that of beta-lactamase could be detected in the culture supernatant. N-terminal alignment of this protein When the column was determined using Protein Sequencer PPSQ-21A (Shimadzu Corporation), it was found to be a mature beta-lactamase sequence, and beta-lactamase was secreted into the culture supernatant. I was able to confirm.
  • Example 2 Secretion expression of phytase derived from Escherichia coli K-12 strain in Methylophilus methylotrophus ATCC 53528
  • the sequence of the methanol dehydrogenase gene from M. methylotrophus W3A1 strain has already been determined [Genbank Accession No. U41040] o
  • the primers shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 were synthesized.
  • the region encoding the methanol dehydrogenase sequence was amplified by PCR from the chromosomal DNA of M. methylotrophus ATCC53528 prepared according to Miura's method. Pyrobest DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) was used for the PCR reaction, and the reaction conditions followed the protocol recommended by the manufacturer.
  • an approximately 5.5 kb fragment obtained by digesting the chromosomal DNA of M. methylotrophus ATCC53528 with Pvull was recovered by agarose gel electrophoresis using EASYTRAP Ver.2 (Takara Bio Inc.), and this was pUC18 (Takara Bio Inc.). After being inserted into the Smal site, it was introduced into a competent cell of Escherichia coli JM109 (Takara Bio Inc.) to prepare a library.
  • methylotrop hus ATCC53528 was 95% homologous to the methanol dehydrogenase gene of M. methylotrophus W3A 1 strain. (SEQ ID NO: 13). As a result of the determination of the nucleotide sequence, it was found that the approximately 5.5 kb fragment of PvuII contains the full-length methanol dehydrogenase gene and approximately 2.5 kb upstream thereof. The nucleotide sequence was determined using a dye terminator cycle sequencing kit (PE Applied Biosystems) and DNA sequencer 373A (PE Applied Biosystems).
  • the sequence of the phytase gene derived from Escherichia coli K-12 has already been determined (Genbank Accession No. AE000200: SEQ ID NO: 15). With reference to this sequence, the primers shown in SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 were synthesized, and the phytase sequence (mature type) was encoded from the chromosomal DNA of Escherichia coli K-12 prepared according to the method of Saito and Miura. The region was amplified by PCR. Pyrobest DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) was used for the PCR reaction, and the reaction conditions followed the protocol recommended by the manufacturer.
  • Pyrobest DNA polymerase manufactured by Takara Bio Inc.
  • SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 from the chromosomal DNA of M. methylotrophus ATCC 53528 prepared according to the method of Saito and Miura, the promoter region and signal sequence region of methanol dehydrogenase were subjected to PCR. Amplified. Pyrobest DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) was used for the PCR reaction, and the reaction conditions followed the protocol recommended by the manufacturer.
  • the primer shown in SEQ ID NO: 10 contains a sequence encoding an amino acid sequence on the N-terminal side of phytase in order to construct a fusion gene with phytase.
  • the fusion gene was amplified.
  • An amplified fragment of about 2.4 kb was detected by agarose gel electrophoresis.
  • This fragment was recovered from the agarose gel using EASYTRAP Ver.2 (Takara Bio Inc.) and inserted into the Smal site of pHSG 398 (Takara Bio Inc.) to obtain pHSGMappA. As a result of determining the nucleotide sequence of the inserted fragment, it was confirmed that the expected fusion gene was constructed. The nucleotide sequence was determined using a dye terminator one-cycle sequencing kit (PE Applied Biosystems) and DNA Sequencer 373A (PE Applied Biosystems).
  • a strain was selected which grew on 5 g of copper acid, 25 ⁇ g of manganese sulfate, 23 ⁇ g of zinc sulfate, 9.7 mg of iron trichloride, 15 g of agar, adjusted to 1 L with water and adjusted to pH 7.0).
  • M. methylotrophus ATCC53528 with the selected pA YCMappA or pAYCTER3 was cultured at 37 ° C for 48 hours in SEIIA liquid medium containing 25 mgZl ampicillin and 2% methanol, respectively. Nourished. After completion of the culture, the culture supernatant of each cell of M.
  • methylotrophus A TCC53528 having pAYCMappA or pAYCTER3 was subjected to SDS-PAGE. As a result, a protein having the target molecular weight in the culture supernatant only in the strain having pAYCMappA. could be detected.
  • phytase activity was measured using the culture supernatant of each cell as a crude enzyme solution. The enzyme activity was measured according to a report (JAOAC Int. 1994 May-Jun; 77 (3): 760-4.).
  • M. methylotrophus ATCC53528 with pAYCTER3 had a force pAYCMappA that could not detect enzyme activity in the culture supernatant.
  • M. methylotrophus ATCC 53528 had 60 FTU / mL (37 ° C, pH 5 .5) activity was detected, and it was confirmed that phytase was secreted into the culture supernatant.
  • Example 3 Secretory expression of acid phosphatase from Morganella morganii strain in Methylophilus methyl otrophus ATCC 53528
  • the sequence of the acid phosphatase gene from Morganella morganii has already been determined (Genbank Accession No. AB035805: SEQ ID NO: 25). Using this sequence as a reference, the primers shown in SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28 were synthesized, and the region encoding the acid phosphatase sequence (mature type) from the chromosomal DNA of Morganella morganii strain prepared according to the method of Saito and Miura. Was amplified by PCR. Pyrobest DNA polymerase (manufactured by Takano) was used for the PCR reaction, and the reaction conditions followed the protocol recommended by the manufacturer.
  • the primer shown in SEQ ID NO: 27 contains a sequence encoding the amino acid sequence on the C-terminal side of the signal sequence of methanol dehydrogenase in order to construct a fusion gene with M. methylotrophus methanol dehydrogenase. .
  • An amplified fragment of about 1.8 kb was detected by agarose gel electrophoresis.
  • the fragment was also collected for agarose gel force using EASYTRAP Ver.2 (Takara Bio Inc.) and inserted into the Smal site of pHSG398 (Takara Bio Inc.) to obtain pHSGMphoC.
  • EASYTRAP Ver.2 Tekara Bio Inc.
  • pHSG398 Tekara Bio Inc.
  • the nucleotide sequence was determined using a dye terminator cycle sequencing kit (PE Applied Biosystems) and DNA Sequencer 373A (PE Applied Biosystems).
  • PAYCMphoC methylella demethylase promoter derived from Methylophilus methylotrophus ATCC53528 and the acid phosphatase gene derived from Morganella morganii linked to pAYCTER3 and pT. Then, a strain grown on SEIIA agar medium containing 25 mg / l ampicillin and 1% methanol was selected. Next, M. methylotrophus ATCC53528 having the selected pAYCMphoC or pAYCTER3 was cultured in a SEIIA liquid medium containing 25 mgZl ampicillin and 2% methanol at 37 ° C. for 48 hours, respectively. After cultivation, M.
  • Example 4 Secretion expression of Methylophilus methylotrophus ATCC 53528 of a phytase derived from Escherichia coli K-12 with a substituted signal sequence
  • the promoter region of methanol dehydrogenase was amplified by PCR using the primers shown in SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 31 from M. methylotrophus ATCC 53528 chromosome DNA prepared according to the method of Saito and Miura. Pyrobest DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) was used for the PCR reaction, and the reaction conditions followed the protocol recommended by the manufacturer.
  • the primer shown in SEQ ID NO: 30 contains the recognition sequence for the restriction enzyme Hindlll.
  • the primers shown in SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 28 were used from the chromosomal DNA of M. morganii strain prepared according to the method of Saito and Miura.
  • the acid phosphatase gene containing the signal sequence was amplified by PCR. Pyrobest DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) was used for the PCR reaction, and the reaction conditions followed the protocol recommended by the manufacturer.
  • the primer shown in SEQ ID NO: 34 contains a sequence encoding an amino acid sequence on the C-terminal side of the promoter sequence of methanol dehydrogenase in order to construct a fusion gene with M. methylotrophus methanol dehydrogenase.
  • the primer shown in SEQ ID NO: 35 is used to construct a fusion gene with E. coli phytase. It contains a sequence encoding the amino acid sequence on the N-terminal side of the mature phytase sequence.
  • the fusion gene of the methanol dehydrogenase promoter region and acid phosphatase signal sequence amplified above and the PCR reaction solution 1 ⁇ 1 of the phytase gene amplified in Example 2 (2) were mixed to form a bowl-shaped sequence.
  • Crossover PCR was performed using the primers of SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 33, and the signal sequence of the M. morganii acid phosphatase connected to the M. methylotrophus ATCC 53528 methanol dehydrogenase gene promoter and E. coli.
  • the fusion gene of mature gene of phytase was amplified. An amplified fragment of about 2.4 kb was detected by agarose gel electrophoresis.
  • This amplified fragment was treated with restriction enzymes Hindi II and Kpnl, and the Hindm-Kpnl fragment was recovered from the agarose gel using EASYTRAP Ver.2 (manufactured by Takara Bio Inc.), and Hindlll-Kpnl of pAYCTER3 in Example 1 (1).
  • PAYCCappA was obtained by inserting into the site. As a result of determining the base sequence of the inserted fragment, it was confirmed that the expected fusion gene was constructed.
  • the nucleotide sequence was determined using a dye terminator 373A (manufactured by PE Applied Biosystems).
  • the pAYCAappA (methanol dehydrogenase promoter sequence derived from M. methylotrophus ATCC53528 and the phytase signal sequence derived from E. coli and the mature sequence gene) constructed in (1) above and pAYCCappA (derived from M. methylotrophus ATCC53528) M. methylotrophus ATCC53528 was transformed with PAYCTER3 as a control and methanol dehydrogenase promoter sequence and acid phosphatase signal sequence from M. morganii strain and E. coli phytase mature sequence gene). A strain grown on SEIIA agar medium containing 25 mg / l ampicillin and 1% methanol was selected. Next, M.
  • methylotrophus ATCC53528 having the selected pAYCAappA or pAYCCappA or pAYC TER3 was cultured in a SEIIA liquid medium containing 25 mg Zl ampicillin and 2% methanol at 37 ° C. for 48 hours, respectively.
  • M. methylotrophus ATC with pAYCAappA or pAYCCappA or pAYCTER3 When the culture supernatant of each cell of C53528 was subjected to SDS-PAGE, a protein having a target molecular weight could be detected in the culture supernatant only in strains having Koji & and CCappA.
  • M. methylotrophus ATCC53528 having pAYCTER3 has the power pAYCAappA and pAYCCappA in which no enzyme activity was detected during culture supernatant. It was confirmed that M. methylotrophus ATCC53528 had enzyme activity detected in the culture supernatant and secreted phytase in the culture supernatant. The enzyme activity was measured in the same manner as described in Example 2.
  • Example 5 Secretion and expression of Methylophilus methylotrophus ATCC 53528 of phytase derived from Escherichia coli K-12 strain with substituted promoter
  • pKK 223 - was amplified by 3 (pharmacia Inc.) PCR method tac promoter region using the primers shown in SEQ ID NO 36 and SEQ ID NO: 37 as ⁇ a.
  • the sequence of the tac promoter used is shown in SEQ ID NO: 12.
  • Pyrobest DNA polymerase manufactured by Takara Bio Inc. was used for the PCR reaction, and the reaction conditions followed the protocol recommended by the manufacturer.
  • the primer shown in SEQ ID NO: 36 contains a recognition sequence for the restriction enzyme EcoRI.
  • Example 2 Using the primer shown in SEQ ID NO: 38 and SEQ ID NO: 39 with pAYCMappA of (2) as a saddle type, the signal sequence of M. methylotrophus-derived methanol dehydrogenase and E. col oily phytase (mature type) The fusion gene was amplified by PCR. Pyrobest DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) was used for the PCR reaction, and the reaction conditions followed the protocol recommended by the manufacturer.
  • the primer shown in SEQ ID NO: 38 contains a partial sequence of the tac promoter in order to construct a fusion gene with the tac promoter, and the primer shown in SEQ ID NO: 39 is a recognition sequence for the restriction enzyme EcoRI. Is included.
  • An amplified fragment of about 1.6 kb was detected by agarose gel electrophoresis. After this amplified fragment was treated with EcoRI, it was recovered from the agarose gel using EASYTRAP Ver.2 (Takara Bio Inc.) and inserted into the EcoRI site of pAYCTER3 in Example 1 (1) to obtain pAYCPta cMappA. It was. As a result of determining the nucleotide sequence of the inserted fragment, it was confirmed that the expected fusion gene was constructed. The nucleotide sequence was determined using a dye terminator cycle sequencing kit (manufactured by PE Applied Biosystems) and DNA Sequencer 373A (manufactured by PE Applied Systems).
  • PAYCPtacMappA (tac promoter sequence and M. methylotrophus ATCC53528-derived methanol dehydrogenase signal sequence and E. coli-derived phytase mature sequence gene linked) constructed in (1) above and control pAYCTER3 with M. methylot
  • Each strain of rophus ATCC53528 was transformed and a strain grown on SEIIA agar medium containing 25 mg / l ampicillin and 1% methanol was selected.
  • M. methylotrophus ATCC53528 having the selected pAYCPtacMap pA or pAYCTER3 was cultured in a SEIIA liquid medium containing 25 mgZl ampicillin and 2% methanol at 37 ° C.
  • Example 6 Secreted expression of beta-lactamase derived from Escherichia coli K-12 in Methylobacillus glyco genes ATCC 29475
  • the M. glycogenes ATCC29475 strain is metaphysical to ampicillin and streptomycin and sensitive to tetracycline, it was decided to introduce the tetracycline resistance gene into the secretion expression plasmid ⁇ CTER3 prepared in Example 1 (1).
  • the tetracycline resistance gene was amplified by PCR using pRK310 (Plasmid. 1985 Mar; described in 13 (2): 149-53) as a cage and using the primers of SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24. An amplified fragment of about 1.5 kb was detected by agarose gel electrophoresis.
  • This amplified fragment was treated with the restriction enzyme BamHI, and the fragment was recovered from the agarose gel using EASYTRAP Ver.2 (Takara Bio Inc.) and inserted into the BamHI site of PAYCTER3 in Example 1 (1). got tet. As a result of determining the nucleotide sequence of the inserted fragment, it was confirmed that the expected fusion gene was constructed!
  • the primers shown in SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 contain the restriction enzyme BamHI recognition sequence, and the nucleotide sequence was determined by the dye terminator one cycle sequencing kit (manufactured by PE Applied Biosystems) and the DNA sequencer. 373A (manufactured by PE Applied Systems) was used.
  • M. glycogenes ATCC 2947 5 having the selected pAYCTER-tet was cultured at 30 ° C. for 48 hours in SEIIA liquid medium containing 5 mg / l tetracycline and 2% methanol. After completion of the culture, the culture supernatant of M.
  • glycogenes ATCC 29475 containing pAYCTER-tet was subjected to SDS-PAGE, and a protein having the same molecular weight as beta-lactamase could be detected in the culture supernatant. . N-terminal alignment of this protein When the sequence was determined using Protein Sequencer PPSQ-21A (Shimadzu), it was found to be a mature sequence of beta-lactamase and secreted beta-lactamase into the culture supernatant! /, I was able to confirm.
  • Example 7 Secretion expression of phytase derived from Escherichia coli K-12 in Methylobacillus glycogenes A TCC 29475
  • the tetracycline resistance gene prepared in Example 6 (1) was inserted into the BamHI site of the phytase secretion expression plasmid pAYCPtacMappA prepared in Example 5 (1) for the purpose of secreting and expressing E. coli phytase in M. glycogenes ATCC29475.
  • PAYCPtacMappA-tet was obtained by inserting the BamHI-treated fragment. As a result of determining the nucleotide sequence of the inserted fragment, it was confirmed that the expected fusion gene was constructed. The base sequence is determined by Dyter.
  • a sequencer 373A (manufactured by PE Applied Biosystems) was used.
  • Methylobacillus glycogenes ATCC 29475 was transformed with pAYCPtacMappA-tet constructed in (1) above or pAYCTER-tet prepared in Example 6 (2) as a control, respectively, and 5 mg / l tetracycline and 1% methanol were converted. Strains grown on the SEIIA agar medium were selected. Next, M. gly cogenes ATCC 29475 having the selected pAYCPtacMappA-tet or pAYCTER-tet was cultured at 37 ° C. for 48 hours in a SEIIA liquid medium containing 5 mg / l tetracycline and 2% methanol, respectively.
  • the culture supernatant of each bacterial cell of M. glycogenes ATCC 29475 having pAYCPtacMappA-tet or pAYCTER-tet was subjected to SDS-PAGE, and cultured only in strains having pAYCPtacMappA-tet! A protein having the desired molecular weight could be detected in the supernatant.
  • M as a result of measuring phytase activity using the culture supernatant of each bacterial cell as a crude enzyme solution, M.
  • gly cogenes ATCC 29475 having pAYCTER-tet was able to detect the enzyme activity in the culture supernatant pAYCPtac MappA It was confirmed that M. glycogenes ATCC 29475 having -tet could detect enzyme activity in the culture supernatant and secreted phytase in the culture supernatant. Measurement of enzyme activity The determination method was the same as the method described in Example 2.
  • protein can be secreted and produced efficiently at low cost.
  • industrially useful proteins such as phytase can be efficiently secreted and produced.

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Abstract

　メタノール資化性細菌で機能するプロモーター配列、及び該プロモーター配列に発現可能に連結された、シグナル配列および目的タンパク質配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含むDNA構築物を保持するメタノール資化性細菌を、メタノールを主要炭素源とする液体培地中で培養することにより、該細菌に目的タンパク質を分泌させ、分泌された目的タンパク質を回収する。

Description

タンパク質の製造法
技術分野
[0001] 本発明は、産業上有用な酵素や生理活性タンパク質を含むタンパク質を、メタノー ル資化性細菌を用いて分泌生産する方法に関する。
背景技術
[0002] メタノールは、安価で大量に入手可能な発酵原料であり、炭素源として非常に有用 である。これまでにメタノールを主要炭素源として、メタノール資化性細菌を用いて L- アミノ酸を製造する方法 (特許文献 1参照）、メタノール資化性細菌を用いて多糖を製 造する方法 (特許文献 2参照）が開発されていた。
[0003] また、これまでに Pichia属酵母においてアルコールォキシダーゼ (AOX)遺伝子のプ 口モーターを使って、メタノールで誘導することによって lacZを菌体内に生産させた例 (非特許文献 1参照)や、ァプロチュン (ゥシ由来脾臓トリプシンインヒビター)を活性型 にて培養上清に分泌させた例 (非特許文献 2参照）が知られて ヽる。
また、メタノール資化性細菌のうち、非偏性メタノール資化性細菌である Methylobac terium extorquensの細胞内に蛍光蛋白質（GFP)を蓄積せしめた例（特許文献 3、非 特許文献 3)は知られているが、偏性メタノール資化性細菌において菌体外へ蛋白 質を分泌させた例は知られて 、な 、。
特許文献 1 :欧州特許公開第 1188822号明細書
特許文献 2：特開平 11― 56384号公報
特許文献 3 :WO2003/046226 A1
非特許文献 1 : Nucleic Acids Res. 1987 May 11;15(9):3859— 76.
非特許文献 2 : J Ind Microbiol. 1991 Apr;7(3): 197-201.
非特許文献 3 : FEMS Microbiol Lett. 2000 Dec 15;193(2):195- 200
発明の開示
[0004] 本発明は、これまでェシエリヒア属細菌等では分泌生産が困難であったようなタン パク質などを効率的に分泌生産する方法を提供することを課題とする。 [0005] 本発明者らはメタノール資化性細菌由来のプロモーター、シグナル配列に注目し、 鋭意検討を行った。その結果、メタノール資化性細菌で機能するプロモーター配列、 ならびにシグナル配列および目的タンパク質をコードする核酸配列を含む DNA構築 物を保持するメタノール資化性細菌を、メタノールを主要炭素源とする培地で培養す ることによって、効率よくタンパク質を分泌生産できることを見出し、本発明を完成す るに至った。
[0006] すなわち本発明は以下のとおりである。
(1)メタノール資化性細菌で機能するプロモーター配列、及び該プロモーター配列 に発現可能に連結された、シグナル配列および目的タンパク質配列を含むポリぺプ チドをコードする核酸配列を含む DNA構築物を保持するメタノール資化性細菌を、メ タノールを炭素源とする液体培地中で培養することにより、該細菌に前記目的タンパ ク質を分泌させ、分泌された目的タンパク質を回収することを特徴とする、タンパク質 の製造方法。
(2)前記メタノール資化性細菌で機能するプロモーター配列力 メタノールデヒドロ ゲナーゼのプロモーター、 tacプロモーター、 σ Εプロモーター、及びリボゾームタンパ ク質プロモーターから選択される (1)の方法。
(3)前記プロモーター配列が、配列番号 11、 12、 21又は 22の塩基配列を有する プロモーター配列である、（1)の方法。
(4)前記シグナル配列力 メタノールデヒドロゲナーゼ、フイターゼおよび酸性フォス ファタ一ゼカも選択されるタンパク質のシグナル配列である（1)〜（3)のいずれかの 方法。
(5)前記シグナル配列が、配列番号 18、 20から選択されるアミノ酸配列を有するこ とを特徴とする（1)〜（3)の 、ずれかの方法。
(6)前記メタノール資化性細菌が、メチロフイラス属細菌、メチロバチラス属細菌、メ チロファーガ属細菌、ァクロモパクター属細菌、シユードモナス属細菌、プロタミノバク ター属細菌、メタノモナス属細菌、ミクロサイクラス属細菌、及びメチロバクテリゥム属 細菌からなる群より選択される細菌であることを特徴とする、 (1)〜（5)の 、ずれかの 方法。 (7)前記タンパク質がフイターゼ、インターロイキン、トランスグルタミナーゼ、インタ 一フエロン、インシュリン、酸性フォスファターゼ及びペプチド合成酵素から選択され るタンパク質である（1)〜（6)の!、ずれかの方法。
(8)前記メタノール資化性細菌が、偏性メタノール資化性細菌である（1)〜（7)の 、 ずれかの方法。
(9)前記偏性メタノール資化性細菌が、メチロフイラス属細菌、メチロバチラス属細 菌、メチロファーガ属細菌力もなる群より選択される細菌であることを特徴とする、 (8) の方法。
発明を実施するための最良の形態
[0007] 本発明の製造方法は、メタノール資化性細菌で機能するプロモーター配列、及び 該プロモーター配列に発現可能に連結された、シグナル配列および目的タンパク質 配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む DNA構築物を保持するメタノー ル資化性細菌を、メタノールを炭素源とする液体培地中で培養することにより、該細 菌に前記目的タンパク質を分泌させ、分泌された目的タンパク質を回収することを特 徴とする。ここに、分泌とは、細胞内から菌体外に目的タンパク質を排出ないしは放 出することをいい、細胞内への蓄積は含まない。
すなわち、該メタノール資化性細菌によって、まずシグナル配列および目的タンパ ク質を含むポリペプチドが産生され、次いで、シグナル配列が切断されることによって 目的タンパク質がペリブラズムに移行し、その後に菌体外へと分泌される。この分泌 されたタンパク質を回収することにより目的タンパク質を製造することができる。なお、 タンパク質を細菌に分泌させ、該タンパク質を回収することによって製造することを、「 タンパク質の分泌生産」と呼ぶことがある。
[0008] 分泌型タンパク質は一般にはプレペプチドまたはプレプロペプチドとして翻訳され、 その後、成熟型タンパク質になることが知られている。すなわち、一般に、プレぺプチ ドまたはプレブ口ペプチドとして翻訳された後、プレ部分が切断されて成熟型ぺプチ ドまたはプロペプチドに変換され、プロペプチドはプロテアーゼによってさらにプロ部 分が切断されて成熟型タンパク質になることが知られて 、る。このようなシグナルぺプ チドの切断を担うプロテアーゼは、一般にシグナルぺプチダーゼと呼ばれる。 [0009] なお、本発明では、 目的タンパク質は成熟型タンパク質、プロペプチドの 、ずれの 形態で分泌されるものでもよぐプロペプチドとして分泌される場合には、回収後に適 当なプロテアーゼ処理を施すことにより、成熟型タンパク質を得ることができる。
[0010] 本明細書にぉ 、て、「シグナル配列」とは、分泌性タンパク質前駆体の N末端に存 在し、タンパク質の分泌に際して、認識される配列をいい、「シグナルペプチド」とは 当該アミノ酸残基部分力もなるペプチドを!、う。
なお、本明細書において、プレ配列およびプロ部分の両方を有するタンパク質、す なわち、一次翻訳産物を「プレブ口タンパク質」と称することがあり、また、プレ部分を 有しないがプロ部分を有するタンパク質を「プロタンパク質」と称することがある。プロ タンパク質のプロ部分は「プロ構造部」または単に「プロ構造」と称することもあり、本 明細書にお 、てタンパク質の「プロ構造部 zプロ構造」とタンパク質の「プロ部分」と は互換的に使用される。
[0011] 本発明の製造方法において用いる細菌は、メタノール資化性細菌で機能するプロ モーター配列、及び該プロモーター配列に発現可能に連結されたシグナル配列およ び目的タンパク質配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む DNA構築物 を、メタノール資化性細菌に導入することによって得られる。
[0012] ここで、「メタノール資化性細菌」とは、メタノールを主たる炭素源として生育すること ができる細菌であり、メチロフイラス属、メチロバチラス属、メチロファーガ属、ァクロモ パクター属、シユードモナス属（特開昭 45- 25273号公報）、プロタミノバクター属（特公 昭 49-125590号公報）、メタノモナス属（特開昭 50-25790号公報）、ミクロサイクラス属（ 特開昭 52-18886号公報）、及びメチロバクテリゥム属などに属する細菌が含まれる。 中でも、グルコースを単一炭素源とした状態では生育しないか、微弱にしか生育しな い、偏性メタノール資化性細菌が好ましい。具体的には、メタノールを主たる炭素源と して成育し、グルコースを単一炭素源とした状態では生育しないか、微弱にしか生育 しない細菌としては、メチロフイラス属細菌、メチロバチラス属細菌、メチロファーガ属 細菌が挙げられる。メチロフイラス属細菌としては、メチロフィラス'メチロトロファス（Me thylophilus methylotrophus)等が挙げられ、メチロバチラス属細菌としては、メチロバ チラス ·グリコゲネス (Methylobacillus glycogenes)、メチロバチラス ·フラジェラタス (Me thylobacillus flagellatus)等が挙げられ、メチロファーガ属細菌としては、メチロファー ガ 'サラシカ (Methylophaga thalassica)、メチロファーガ 'マリーナ (Methylophaga mari na)、メチ口ファーガ 'アルカリフイラ（Methylophaga alcaliphila)等のメチロファーガ属 細菌などが含まれる（Biology of Methylotrophs； Edited by Israel Goldberg and J. Stef an Roken and published by Butterworth— Heinemann)。また、メタノ ~~ノレァヒドロゲナ ーゼ (MDH)を菌体外に分泌する機能を有する細菌類であることも好ま 、。
[0013] メチロフィラス'メチロトロファスとしては、 AS1株（NCIMB10515)、 W3A1 (NCIMB 113 48株）、 ATCC53528株などが挙げられる。メチロフィラス'メチロトロファス AS1株（NCI MB10515)、 W3A1 (NCIMB 11348株）は、ナショナル 'コレクション'ォブ 'インダストゥリ ァノレ'アンド 'マリン'ノ クテリア (National Collections of Industrial and Marine Bacteri a、住所 NCIMB Lts., Torry Research Station 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG , United Kingdom)から入手可能である。
[0014] また、メチロバチラス'グリコゲネスとしては、 T- 11株（NCIMB 11375)、 ATCC 2127 6株、 ATCC 21371株、 ATCC 29475株、 ATR80株（Appl. Microbiol. BiotechnoL, (19 94)、 42卷， p67- 72に記載）、 A513株（Appl. Microbiol. BiotechnoL, (1994)、 42卷， p6 7-72に記載)等が挙げられる。メチロバチラス'グリコゲネス NCIMB 11375株は、ナシ ョナル .コレクシヨン ·ォブ ·インダストウリアル ·アンド'マリン ·バクテリア（National Colle ctions of Industrial ana Marine Bacteria、住所 NCIMB Lts., Torry Research Station 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom)から入手可能である。
[0015] メチロバチラス 'フラジェラタスとしては、 ATTC 51484株、 ΚΤ株（Ν丄 Govorukhinaら.
Microbiology (Russia) 56 (1987), pp. 849- 854.に記載）、 VKM B- 1610株等が挙げら れる。メチロバチラス 'フラジェラタス VKM B-1610株は、 ALL-RUSSIAN COLLECTIO N OF MICROORGANISMS (Russia, 142290, Moscow Region, Pushchino, pr. Nauki, 5, IBPM)力も入手可能である。
メチロフィラス.メチロトロファス ATCC53528株、メチロバチラス'グリコゲネス ATCC 2 1276株、 ATCC 21371株、 ATCC 29475株、メチロバチラス'フラジェラタス ATTC 514 84株は、アメリカン'タイプ'カルチヤ一'コレクション (ATCC)より分譲を受けることがで きる （住所 ATCC, Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1, United States of America ) 0
[0016] メチロファーガ'サラシカとしては、 ATTC 33145株、 ATTC 33146株等が挙げられる 。メチロファーガ 'マリーナとしては、 ATCC35842株等が挙げられる。メチロファーガ' アルカリフイラとしては、 ATCCBAA-297™等が挙げられる。メチロファーガ'サラシカ A TTC 33145株、 ATTC 33146株は、アメリカン'タイプ'カルチヤ一'コレクション (ATCC )より分譲を受けることができる （住所 ATCC, Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1, United States of America；)。
[0017] 上記メタノール資化性細菌に導入される DNA構築物に含まれる「メタノール資化性 細菌で機能するプロモーター」とは、上述のメタノール資化性細菌においてプロモー ター活性を有するプロモーターを意味する力 メタノール資化性細菌由来のプロモー ターに限定されず、他の微生物由来のプロモーターであってもよい。また、メタノール で誘導可能なプロモーターも、非誘導型のプロモーターも含む。メタノールで誘導可 能なプロモーターとしては、メタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター、ジヒド ロキシアセトンシンターゼ遺伝子のプロモーター、ギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプ 口モーターなどが挙げられる。
[0018] メタノール資化性細菌で機能するプロモーターとして、具体的には、メタノールで誘 導されるメタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（配列番号 11)、ェシエリヒ ァ 'コリ由来の高発現プロモーターである tacプロモーター（配列番号 12)、 σ Εプロモ 一ター（配列番号 21)、リボゾームタンパク質プロモーター（配列番号 22)等が挙げら れるがこれに限定されな！、。
[0019] またプロモーター配列は野生型のプロモーターに限定されず、 目的遺伝子を高発 現化するために野生型の配列を改変したプロモーターであっても構わな 、。たとえば 、上記細菌内でプロモーター活性を有する限り、上記のような野生型プロモーター配 列を数塩基置換、欠失、付加、挿入した配列であっても構わない。また、プロモータ 一活性を上昇させるために、—35領域、—10領域に改変したものや、—35、 - 10 領域間のスぺーサー領域の長さを調節して改変したものでも構わない。これらの 3 5、 一 10領域を改変する方法としては、欧州特許公開第 1033407号明細書に記載の 方法、 Nucleic Acids Res. 1999 Dec 15;27(24):4768-74.に記載の方法などが挙げら れる。
なお、プロモーター活性は、 RNA合成開始の頻度により定義される。プロモーター 活性の評価法および本発明にお 、て用いることのできる強力なプロモーターの例は 、 Goldsteinらの論文 (Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Re v., 1995, 1, 105-128)等に記載されている。また、国際公開 00/18935号パンフレット に開示されているように、 目的遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導 入し、より強力なものに改変することも可能である。
[0020] メタノール資化性細菌に導入される DNA構築物においては、前記プロモーターの 下流に、シグナル配列および目的タンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸配 列が発現可能に連結されて 、る。
「メタノール資化性細菌で機能するシグナル配列」とは、 目的タンパク質に連結した ときに、上述のメタノール資化性細菌力 該シグナル配列を認識し、該目的タンパク 質を分泌させることのできる配列を意味する。
シグナル配列は目的タンパク質とは異なるタンパク質に由来するシグナル配列であ つても、 目的タンパク質の前駆体タンパク質に含まれるシグナル配列であってもよい。 ただし、シグナル配列は、使用する宿主メタノール資化性細菌の分泌性タンパク質に 由来することが好ましい。なお、本発明の目的に使用し得るシグナル配列は、それが 由来する前駆体タンパク質において該シグナル配列に続く目的タンパク質の N末端 側アミノ酸配列を一部含んで 、てもよ 、。
なお、シグナル配列と目的タンパク質の起源が異なる場合はプレブ口タンパク質を 特に「異種融合プレブ口タンパク質」と称することもある。例えば、タンパク質がインスリ ンの場合は、「プレブ口インスリン」、「プロインスリン」に対し、「異種融合プレプロイン スリン」と称することがある。
[0021] シグナル配列はメタノール資化性細菌で機能するものであれば特に制限されず、メ タノール資化性細菌の分泌タンパク質に由来するシグナル配列や、その他の細菌、 酵母、植物、または動物などの分泌タンパク質に由来するシグナル配列を用いること ができる。より具体的には、メチロト口ファス 'メチロフィラス由来のメタノールデヒドロゲ ナーゼ（MDH)のシグナル配列（配列番号 18のアミノ酸配列）が挙げられる。また、他 の細菌由来のシグナル配列としては、ェシエリヒア'コリの appA遺伝子によってコード されるフイターゼのシグナル配列（配列番号 20のアミノ酸配列）や、 Morganella morga niiの酸性フォスファターゼのシグナル配列（配列番号 26の 1〜20位）などが挙げられ る。これらのアミノ酸配列をコードする塩基配列は、配列番号 17、 19、 25にそれぞれ 示される。
なお、シグナル配列をコードする塩基配列は、野生型のシグナル配列をコードする 塩基配列であってもよいが、該配列を、タンパク質を分泌生産するメタノール資化性 細菌の使用コドンに併せて置換した配列であってもよい。
[0022] 本発明の方法によって分泌させ、回収し得る「目的タンパク質」は、前述のメタノー ル資化性細菌で機能するシグナル配列と連結されることによりメタノール資化性細菌 を用いて分泌されることのできるタンパク質であれば特に限定されず、動植物ゃ微生 物由来の分泌タンパク質および菌体内タンパク質を含むタンパク質全般が含まれる。 本発明の方法は、これまでェシエリヒア属細菌などのグラム陰性細菌で分泌生産でき な力つたタンパク質についても適用することができる。なお、「目的タンパク質」は、宿 主のメタノール資化性細菌とは起源の異なる異種タンパク質が好ましい。
「目的タンパク質」として分泌タンパク質を用いる場合、前駆体からプレ配列および プロ配列を除 、た配列を有するものと、プロ配列を含むものの 、ずれを用いてもよ！ヽ 。ただし、「目的タンパク質」は、前駆体タンパク質からペプチド結合を切断すること〖こ よってプレ部分およびプロ部分を構成する少なくとも 1以上のアミノ酸が除去されたタ ンパク質であればよく、その N末端領域が天然の成熟型タンパク質のものと完全に一 致するタンパク質、および、天然の成熟型タンパク質に比較して N末端にプレ部分ま たはプロ部分に由来する 1以上の余分のアミノ酸を有するもの、および天然の成熟型 タンパク質よりもアミノ酸配列が短いタンパク質も含まれる。
[0023] 本発明の製造法を適用できる目的タンパク質は特に限定されるものではないが、例 えば、以下のようなタンパク質の成熟型タンパク質又はプロタンパク質が挙げられる。 フイターゼ [EC:3.1.3.2 3.1.3.26]
ヒトインタ一ロイキン 2 (IL2 : Genbank Accession No. AAK26665等、成熟型は 21〜1 53位のアミノ酸配列） プロティングルタミナーゼ
トランスグルタミナーゼ（Genbank Accession No. AF531437等）
インターフェロン
インシュリン（特開平 07-284394等）
酸性フォスファターゼ
ペプチド合成酵素（WO 2004/011653号、 WO2004/065610号）
顆粒球刺激因子 (GCSF)
中でも好ましくは、後述する実施例にて製造した、フイターゼ及び酸性フォスファタ ーゼが挙げられる。
フイターゼ (phosphoanhydride phosphorylaseとも呼ばれる)は、フィチン (イノシトー ルへキサキスリン酸、フィチン酸ともいう）を加水分解する酵素であり、食品分野、農 業分野及び医薬品分野等で有用な酵素である。フイターゼとして、以下のものが利 用出来る。各フイターゼのアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列の情報はそ れぞれの Genbank Accession No.を参照することにより入手できる。
ェシエリヒア'コリ由来フィターゼ Genbank Accession No. AAC74065 (配列番号 16) 成熟型タンパク質は 23〜432位のアミノ酸配列 カビ由来フィターゼ Genbank Accession No. AAU93518、 AAU93517
Genbank Accession No.AAC38573、 AAG17903 酵母由来フィターゼ Genbank Accession No.CAB70441
エノレシ-ァ由来フイターゼ Genbank Accession No.YP— 070934
クレブシエラ由来フィターゼ Genbank Accession No.AAM23271、
キサントモナス由来フィターゼ Genbank Accession AAM38967,
シユードモナス由来フイターゼ Genbank Accession AAN77879、
キノコ由来フイターゼ Genbank Accession No.CAC48195、 CAC48164 トウモロコシ由来フィターゼ Genbank Accession No.AAB52233 大豆由来フィターゼ Genbank Accession No.AAK49438
サッマイモ由来フイタ一ゼ Genbank Accession No.AAF60315
ラット由来フイターゼ Genbank Accession No.AAA42305
[0025] 酸性フォスファターゼとは、燐酸エステルを酸性条件下で加水分解する反応を触媒 する酵素であり（EC 3.1.3.2)、例えば、以下の Morganella morgani油来の酸性フォス ファターゼや、国際公開 WO96Z37603号パンフレットに記載の酸性フォスファターゼ や、これらの変異体を用いることが出来る。
Morganella morganii由来酸'性フォスファターゼ Genbank Accession No. AB035805 ( 配列番号 25)
成熟型タンパク質は 21〜259位のアミノ酸配列
[0026] これらのタンパク質をコードする遺伝子は、使用する宿主に応じて、および Zまたは 、望みの活性を得るために改変することができ、それらにはコードするアミノ酸配列に 1以上のアミノ酸の付加、欠失、置換などが生じるような改変が含まれる。改変技術、 遺伝子のクローユング技術、生産されたタンパク質の検出技術を含む、このような一 般的な分子生物学的手法は当業者によく知られたものであり、例えば、 Sambrook et al., 2001, Molecularし loning: A Laboratory Manual, Third Edition (1989) Cold bpnn g Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York、 DNA cloning: A Practic al Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985)、 F.M. Ausubel et al. (eds), Cu rrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)、 PCR Technolo gy: Principles and Application for DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press 等を参照することができる。異種タンパクである場合は、分泌発現を行う微生物で使 用頻度の高 、コドンに置換した遺伝子を用いてもょ 、。
[0027] タンパク質をコードする遺伝子は既知の配列に基づいて設計されたプライマーを用 いた PCRなどによって得ることができる。また、ホモロジ一等に基いて目的タンパク質 をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体からハイブリダィゼーシヨン法など によって単離し、塩基配列を決定したものなども使用することができる。また、既知の 塩基配列にしたがって化学合成した遺伝子を使用することもできる。なお、配列情報 は Genbank等のデータベース力 入手出来る。 [0028] また、 目的タンパク質は、 目的とするタンパクの活性を有する限り、 1若しくは複数の 位置での 1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むタンパクで あってもよい。ここで、「1若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造に おける位置や種類によっても異なる力 具体的には 1から 30個、好ましくは、 1から 20 個、より好ましくは 1から 10個である。
[0029] 上記のタンパク質の置換は、タンパク質の活性が維持されるような保存的置換であ る。置換は、アミノ酸配列中の少なくとも 1残基が除去され、そこに他の残基が挿入さ れる変化である。酵素タンパクの元々のアミノ酸を置換し、かつ、保存的置換とみなさ れるアミノ酸としては、 Alaから Ser又は Thrへの置換、 Argから Gln、 His又は Lysへの置 換、 Asnから Glu、 Gln、 Lys, His又は Aspへの置換、 Aspから Asn、 Glu又は Ginへの置 換、 Cysから Ser又は Alaへの置換、 Ginから Asn、 Glu、 Lys、 His, Asp又は Argへの置換 、 Gluから Gly、 Asn、 Gln、 Lys又は Aspへの置換、 Glyから Proへの置換、 Hisから Asn、 Lys, Gln、 Arg又は Tyrへの置換、 lieから Leu、 Met, Val又は Pheへの置換、 Leuから lie 、 Met, Val又は Pheへの置換、 Lysから Asn、 Glu、 Gln、 His又は Argへの置換、 Metから Ile、 Leu、 Val又は Pheへの置換、 Pheから Trp、 Tyr、 Met, lie又は Leuへの置換、 Serか ら Thr又は Alaへの置換、 Thrから Ser又は Alaへの置換、 Trpから Phe又は Tyrへの置換 、 Tyrから His、 Phe又は Trpへの置換、及び、 Valから Met、 lie又は Leuへの置換が挙げ られる。
[0030] 上記のようなタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードする DNAは、例えば部 位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又 は逆位を含むように、これら酵素をコードするの塩基配列を改変することによって得ら れる。また、上記のような改変された DNAは、従来知られている変異処理によっても 取得され得る。変異処理としては、変異処理前の DNAをヒドロキシルァミン等でインビ トロ処理する方法、及び変異処理前の DNAを保持する微生物、例えばエシ リヒア属 細菌を、紫外線照射または N—メチル N' -トロ一 N -トロソグァ二ジン (NTG) もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法、 P CR反応液の中のデォキシヌクレオチドの構成比を、例えば通常の等量力 不揃いに することにより人為的にランダムなエラーを発生させる方法として、エラーブローン PC R法等が挙げられる。
このような変異を有する DNAを、適当な細胞で発現させ、発現産物の活性を調べる ことにより、実質的に同一のタンパク質をコードする DNAが得られる。
また、変異を有するタンパクをコードする DNAまたはこれを保持する細胞から、例え ば野生型遺伝子の塩基配列の相補配列又はその一部を有するプローブとストリンジ ェントな条件下でノ、イブリダィズし、かつ、 目的タンパクの活性を有するタンパク質を コードする DNAを得ることもできる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる 特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されな 、条件を 、う 。この条件を明確に数値ィ匕することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い D NA同士、例えば 70%以上、好ましくは 80%以上、より好ましくは 90%以上、特に好 ましくは 95%以上の相同性を有する DNA同士がノ、イブリダィズし、それより相同性が 低!、DNA同士がハイブリダィズしな!/、条件、あるいは通常のサザンハイブリダィゼー シヨンの洗 ヽの条件である 60。C、 1 X SSC, 0. 10/0SDS、好ましく ίま、 0. 1 X SSC、 0. 1 %SDSに相当する塩濃度でハイブリダィズする条件が挙げられる。
[0031] 上述したような目的タンパク質はシグナル配列に直接連結されていてもよいし、リン カー配列を介して間接的に連結されていてもよい。リンカ一配列を含む場合、そのよ うなリンカ一配列はポリペプチドの生産性や目的タンパク質の活性を阻害しない限り 任意の配列を用いることができる力 例えば、ポリヒスチジンなど目的タンパク質を精 製するための配列などを用いてもょ 、。
シグナル配列と目的タンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸配列は、シグ ナル配列をコードする核酸配列と目的タンパク質をコードする核酸配列を、制限酵素 などを用いて連結させるなどして適宜調製することができる。
また、シグナル配列と目的タンパク質として互いに同種の前駆体タンパク質由来の ものを用いるときは、シグナル配列と目的タンパク質を含む前駆体タンパク質をコード する配列を PCRなどにより増幅して用いることもできる。 PCR法としては、種々の公知 の変法を用いることが出来る力 中でもクロスオーバー PCR法が増幅に有利に用いら れる。
[0032] メタノール資化性細菌に導入する DNA構築物は、シグナル配列と目的タンパク質を 含むポリペプチドをコードする核酸配列を、発現可能にプロモーターに連結すること によって調製することができる。「発現可能に連結する」とは、該細菌に導入した場合 に、プロモーターによってポリペプチドをコードする mRNAが転写され、該ポリべプチ ドが該細菌によって産生されることを意味する。
前記核酸配列はポリペプチドをコードする配列の開始コドンの前に、転写開始点を 含む 5 '非翻訳領域を含む状態でプロモーターに連結させることが好ま U、。 5 '非翻 訳領域としては、例えば、 MDH遺伝子プロモーターの場合に MDH遺伝子の 5'非翻 訳領域を用いるなど、プロモーターが由来する配列の 5 '非翻訳領域であってもよ 、 。また、フイターゼのシグナル配列を用いる場合に 5'非翻訳領域をフイターゼ遺伝子 のものにするなど、シグナル配列をコードする配列が由来する遺伝子の 5'非翻訳領 域であってもよい。
なお、 5'非翻訳領域を用いる場合、リボソーム結合部位 (RBS)と開始コドンとの間 のスぺーサ一、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換 が mRNAの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られているため、そのように改変 した 5，非翻訳領域を用いてもょ 、。
なお、上記のような DNA構築物を得るための操作は、ェシエリヒア等、遺伝子組換え が容易なグラム陰性細菌を用いてもょ ヽし、直接タンパク質を分泌させる微生物で行 つてもよい。
メタノール資化性を上記のような DNA構築物を保持するように改変するためには、 例えば、上記 DNA構築物を搭載したベクターを導入すればよい。例えば、前記タン パク質をコードする遺伝子断片を、メタノール資化性細菌で機能するベクター、好ま しくはマルチコピー型のベクターと連結して組換え DNAを作製し、これをメタノール資 化性細菌宿主に導入して形質転換すればょ ヽ。
目的とするプロモーター、シグナル配列、タンパク質配列は、例えば、 目的の配列 を有する動物 ·植物 ·微生物の染色体 DNAを铸型とする PCR法 (PCR： polymerase ch ain reaction; White.T.J. et al.， Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）によって、取得す ることができる。染色体 DNAは、 DNA供与体である細菌から、例えば、斎藤、三浦の 方法 . Saito and K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工学実 験書、 日本生物工学会編、 97〜98頁、培風館、 1992年参照)等により調製すること ができる。 PCR用プライマーは、 Genbank等公知のデータベースに登録されている遺 伝子配列に基づ 、て、又は他の細菌等で配列が公知の遺伝子間で保存されて 、る 領域の情報に基づいて、調製することができる。
[0034] メタノール資化性細菌で自律複製可能なベクターとしては、例えばメチロフイラス属 細菌、メチロバチルス属細菌で自律複製出来るプラスミドである。具体的には、広宿 主域ベクターである RSF1010及びその誘導体、例えば pAYC32 (Chistosrerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D. Plasmid, 1986, 16, 161- 167)、あるいは pMFY42 (gene, 44, 53(199 0))、 pRP301、 pTB70 (Nature, 287, 396, (1980))等が挙げられる。
[0035] また、本明細書中の実施例で用いられて 、る pAYCTER3も好適なベクターである。
PAYCTER3は、 pAYC32のストレプトマイシン而性遺伝子（strA,B)の上流部分を欠失 し、 pUC19のマルチクロー-ングサイトと、 E.coli rrnB遺伝子のターミネータ一を挿入 したプラスミドである。すなわち、 pAYCTER3はストレプトマイシン耐性を発現しないが 、マルチクロー-ングサイトに strAと順向きにプロモーター配列を含む DNAが挿入さ れると、リードスルーでストレプトマイシン耐性になる高発現ベクターである。
[0036] 上記 DNA構築物とメタノール資化性細菌で機能するマーカーを搭載したベクター を連結して組換え DNAを調製するには、 目的遺伝子の末端に合うような制限酵素で ベクターを切断する。連結は T4 DNAリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通で ある。
上記のように調製した組換え DNAをメタノール資化性細菌に導入するには、これま でに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、増殖段階の細胞から コンビテントセルを調製して DNAを導入する方法（Dubunau and Davidoff-Abelson, J. Mol. Biol, 56, 209 (1971); Duncan, C.H., Wilson, G.A. and Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977))、又は、宿主細胞を、糸且換え DNAを容易に取り込むプロトプラストまたは スフエロプラストの状態にして糸且換え DNAを DNA受容菌に導入する方法（Chang,S.an d Choen,S.N.,Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979))が挙げられる。
[0037] また、本発明の DNA構築物を有するメタノール資化性細菌を構築するためには、同 DNA構築物をメタノール資化性細菌の染色体 DNA上に 1コピー、あるいは多コピー 存在させることによつても達成できる。メタノール資化性細菌の染色体 DNA上に本発 明を 1コピーあるいは多コピーで導入するには、染色体 DNA上に多コピー存在する 配列を標的として利用する相同組換え、もしくはファージなどを用いた染色体 DNA上 へのランダムな挿入により行う。染色体 DNA上に多コピー存在する配列としては、トラ ンスポゾン、繰返し配列、転移因子の端部に存在するインバーテッド'リピート等が利 用できる。また、ベクターの増幅、染色体上での多コピー化は、上述の発現調節配列 の改変したものと組合わせてもよ 、。
[0038] 上記のようにして得られたメタノール資化性細菌を、メタノールを炭素源とする液体 培地中で培養することにより、該細菌に前記目的タンパク質を分泌させ、分泌された 目的タンパク質を回収することによってタンパク質を製造することができる。
なお、本明細書において、タンパク質またはペプチドが「分泌」されるとは、タンパク 質またはペプチドの分子が細菌菌体外 (細胞外）に移送されることをいい、最終的に そのタンパク質またはペプチド分子が培地中に完全に遊離状態におかれる場合はも ちろん、一部のみが菌体外に存在している場合、菌体表層に存在している場合も含 む。
本発明においては目的タンパク質が培地ゃ菌体から回収できる程度に分泌される ことが好ましい。
[0039] メタノール資化性細菌はメタノールを炭素源とする培地を用いて培養する。メタノー ルを炭素源とする培地とは、例えば、メタノールを 0. 001〜30%添加する培地を挙 げることができる。なお、メタノール以外の炭素源、例えば、グルコース、シュクロース 、ラタトース、ガラクトース、フラクトースゃでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセ口 一ルゃソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クェン酸、コハク酸等の有機 酸類が含まれていても良い。
メタノール以外の培地成分としては、通常の培養に用いられる、窒素源、無機ィォ ンなどの培地成分を添加することができる。さらに高い増殖を得るため、ビタミン、アミ ノ酸等の有機微量栄養素を必要に応じて添加することもできる。窒素源としては、ァ ンモユアガス、アンモニア水、アンモニゥム塩、その他が使用できる。無機イオンとし ては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、リン酸イオン、カリウムイオン、鉄イオン 等を必要に応じて適宜使用することができる。培養は例えば、 pH5. 0〜9. 0、 15°C 〜45°Cの適切な範囲にて好気的条件下で行えばよぐ培養期間は 1〜7日間程度 でよい。このような条件下でメタノール資化性細菌を培養することにより、目的タンパク 質は菌体内で多量に生産され、効率よく分泌される。
[0040] MDH遺伝子プロモーターなどメタノールで誘導可能なプロモーターを用いる場合 、ポリペプチドの生産量を増加させるために誘導条件で培養を行ってもよい。誘導は 通常 MDH遺伝子プロモーターなどを誘導するために用いられている条件にしたがつ て行うことができる。通常、メタノール資化性菌をメタノール中で培養する場合、特段 の誘導を要することなぐ MDHプロモーターは機能する。
[0041] 本発明によって培地中に分泌されたタンパク質は、当業者によく知られた方法に従 つて培養後の培地力も分離精製することができる。例えば、菌体を遠心分離等により 除去した後、塩析、エタノール沈殿、限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン 交換カラムクロマトグラフィー、ァフィニーティークロマトグラフィー、中高圧液体クロマ トグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等の既知の適切な方法、 またはこれらを組み合わせることにより分離精製することができる。なお、ポリペプチド が精製用の配列を含む場合はその配列を利用して精製することもできる。
本発明によって菌体表層に分泌されたタンパク質も当業者によく知られた方法、例 えば塩濃度の上昇、界面活性剤の使用等によって可溶ィ匕した後に、培地中に分泌さ れた場合と同様にして分離精製することができる。また、ある場合には、菌体表層に 分泌されたタンパク質を可溶ィ匕せずに、例えば固定ィ匕酵素として使用しても良い。
[0042] 本発明は以下の実施例によって、更に具体的に説明されるが、これらはいかなる意 味でも本発明を限定するものではな 、。
実施例
[0043] 実施例 1： Escherichia coli K- 12株由来のベータラクタマーゼの Methylophilus methyl otrophus ATCC 53528での分泌発現
(1)メタノール資化性細菌中で機能する発現用プラスミド PAYCTER3の構築
PUC19のマルチクローユングサイトの配列を含有するようにデザインした配列番号 3 と配列番号 4に記載の合成 DNAを、当該者に良く知られた方法でアニーリングさせて ポリリンカ一を作成した。このポリリンカ一は制限酵素 EcoRIと Bglllで切断後と同じ末 端形状となる様にデザインしてある。更に、配列番号 5と配列番号 6に記載のプライマ 一を合成し、常法に従って（斉藤、三浦の方法 [Biochim. Biophys. Acta, 72, 619(196 3)])調製した Escherichia coli K- 12株の染色体 DNAから rrnBのターミネータ一配列を コードする領域を PCR法にて増幅した。配列番号 3のプライマーには制限酵素 Bglll の認識配列を、配列番号 4のプライマーには制限酵素 Bellの認識配列をそれぞれデ ザインしてある。 PCR反応には Pyrobest DNA polymerase (宝バイオ社製）を用い、反 応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。この PCR断片を制限酵素 Bglllと Bellで 消化させた後、この PCR断片と先程のポリリンカ一とをライゲーシヨンさせて約 400bpの DNA断片を作成した。ライゲーシヨン反応には DNA Ligation Kit Ver.2.1 (宝バイオ社 製)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。次に、公知のプラスミド である pAYC32 (J. Gen. Microbiol, 137, 169-178 (1991))の制限酵素 EcoRIと BamHI で切り出される約 9.2kbpの断片を回収し、先程の DNA断片を挿入する事により、 M.m ethylotrophus ATCC 53528中で機能する発現用プラスミド pAYCTER3を構築した。 なお、この pAYCTER3は、 pAYC32中にコードされている strA遺伝子の 5'側上流配列 を欠損し、代わりに pUC19のマルチクロー-ングサイトと rrnBターミネータ一を持ち、 E .coli由来のベータラクタマーゼ遺伝子を含む構造になっている。
(2)ベータラクタマーゼの Methylophilus methylotrophus ATCC53528での分泌発現 上記（1)で構築した pAYCTER3で Methylophilus methylotrophus ATCC53528を形 質転換し、 25mg/lのアンピシリンと 1%のメタノールを含む SEIIA寒天培地（硫酸ァ ンモニゥム 5g、 K HPO 1. 9g、 NaH PO · 2H O 1. 56g、硫酸マグネシウム
2 4 2 4 2
200mg、塩ィ匕カルシウム 72mg、硫酸銅 5 /z g、硫酸マンガン 25 /z g、硫酸亜鉛 23 /z g、三塩ィ匕鉄 9. 7mg、寒天 15g、水で 1Lにして pH7. 0に調整）で生育し た菌株を選択した。次に、選択した pAYCTER3を有する M. methylotrophus ATCC53 528を、 25mg/lのアンピシリンと 2%のメタノールを含む SEIIA液体培地で 37°C、 48 時間培養した。培養終了後、 pAYCTER3を有する M. methylotrophus ATCC53528の 菌体の培養上清を SDS— PAGEに供したところ、培養上清中にベータラクタマーゼ と同じ分子量を有するタンパク質を検出することができた。このタンパク質の N末端配 列をプロテインシークェンサ一 PPSQ-21A (島津製作所製)を用いて決定したところ、 ベータラクタマーゼの成熟型配列である事が判明し、培養上清中にベータラクタマー ゼを分泌して 、る事が確認できた。
[0045] 実施例 2： Escherichia coli K- 12株由来のフイターゼの Methylophilus methylotrophus ATCC 53528での分泌発現
(l) Methylophilus methylotrophus ATCC 53528由来メタノールデヒドロゲナーゼ遺 伝子の取得
M. methylotrophus W3A1株由来メタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子の配列は既に 決定されている [Genbank Accession No. U41040]oこの配列を参考にして、配列番 号 1と配列番号 2に示したプライマーを合成し、前記斉藤、三浦の方法に従って調製 した M. methylotrophus ATCC53528の染色体 DNAからメタノールデヒドロゲナーゼ配 列をコードする領域を PCR法にて増幅した。 PCR反応には Pyrobest DNA polymerase (宝バイオ社製)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。
[0046] 次に増幅した約 l.Okbの DNA断片を、 Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2 (宝 バイオ社製）と [ a—32P] dCTPを用いて、添付のプロトコールに従って反応させ、 D NAプローブを作製した。作製したプローブと M. methylotrophus ATCC53528の染色 体 DNAを用 ヽて、 Molecular Cloning 2nd edition[J. bambrook, E. F. Fntsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p9.31(1989)]に記載されているよう な一般的な方法に従って、サザンプロットハイブリダィゼーシヨンを行ったところ、制限 酵素 PvuIIで切り出される約 5.5kbの断片にメタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子が存在 していることが確認できた。そこで M. methylotrophus ATCC53528の染色体 DNAを Pv ullで消化した約 5.5kbの断片を EASYTRAP Ver.2 (宝バイオ社製）を用いてァガロー スゲル電気泳動により回収し、これを pUC18 (宝バイオ社製)の Smal部位に挿入した 後、 Escherichia coli JM109 (宝バイオ社製）のコンビテントセルに導入し、ライブラリー を作製した。
[0047] 先に作製したメタノールデヒドロゲナーゼの DNAプローブを用いて、 Molecular Clon ing 2nd edition[J. Sambrook, E. F. Frits cn and T. Maniatis, Cola Spring Harbor Lao oratory Press, pi.90(1989)]記載のコロニーハイブリダィゼーシヨンにより、ライブラリ 一のスクリーニングを行い、メタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子断片がクローン化され たプラスミドを保持する菌株を取得し、これよりプラスミドを回収し、 pUMDHと名付けた 。 pUMDHにクローン化されている断片の塩基配列を決定したところ、 M. methylotrop hus ATCC53528のメタノールデヒドロゲナーゼの遺伝子は、 M. methylotrophus W3A 1株のメタノールデヒドロゲナーゼの遺伝子と 95%以上の相同性を示す塩基配列を有 することが確認された（配列番号 13)。塩基配列の決定の結果、この PvuIIの約 5.5kb の断片は完全長のメタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びその 5 '側上流約 2.5kbを 含んでいる事が判明した。尚、塩基配列の決定はダイターミネータ一サイクルシーク ェンシングキット（PEアプライドバイオシステムズ社製）と DNAシークェンサ一 373A (P Eアプライドバイオシステムズ社製)を用いて行った。
[0048] (2) Escherichia coli K- 12株由来のフィターゼ遺伝子の取得と分泌発現用プラスミド の構築
Escherichia coli K- 12株由来のフィターゼ遺伝子の配列は既に決定されている（Ge nbank Accession No. AE000200 :配列番号 15)。この配列を参考にして、配列番号 7 と配列番号 8に示したプライマーを合成し、前記斉藤、三浦の方法に従って調製した Escherichia coli K- 12株の染色体 DNAからフィターゼ配列（成熟型）をコードする領 域を PCR法にて増幅した。 PCR反応には Pyrobest DNA polymerase (宝バイオ社製） を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。
[0049] 次に前記斉藤、三浦の方法に従って調製した M. methylotrophus ATCC 53528の 染色体 DNAから配列番号 9と配列番号 10に示したプライマーを用いてメタノールデヒ ドロゲナーゼのプロモーター領域とシグナル配列領域を PCR法にて増幅した。 PCR 反応には Pyrobest DNA polymerase (宝バイオ社製）を用い、反応条件は業者の推奨 するプロトコルに従った。なお、配列番号 10に示したプライマーはフイターゼとの融 合遺伝子を構築するために、フイターゼの N末端側のアミノ酸配列をコードする配列 を含んでいる。
[0050] 次に、上記で増幅した Escherichia coli K- 12株のフィターゼ配列（成熟型）をコード する領域と、やはり上記で増幅した Methylophilus methylotrophus ATCC 53528のメ タノールデヒドロゲナーゼのプロモーター領域及びシグナル配列領域の PCR反応液 1 μ 1を混ぜて铸型とし、配列番号 9と配列番号 8のプライマーを用いてクロスオーバ 一 PCRを行い、 Methylophilus methylotrophus ATCC 53528のメタノールデヒドロゲナ ーゼ遺伝子のプロモーター及びシグナル配列に接続されたフイターゼの融合遺伝子 を増幅させた。ァガロースゲル電気泳動により約 2.4kbの増幅断片を検出した。この 断片を EASYTRAP Ver.2 (宝バイオ社製）を用いてァガロースゲルから回収し、 pHSG 398 (宝バイオ社製）の Smal部位に挿入することによって、 pHSGMappAを得た。挿入 断片の塩基配列決定の結果、予想通りの融合遺伝子が構築されて ヽることを確認し た。尚、塩基配列の決定はダイターミネータ一サイクルシークェンシングキット（PEァ プライドバイオシステムズ社製）と DNAシークェンサ一 373A (PEアプライドバイオシス テムズ社製）を用いて行った。次に、 pHSGMappAの BamHト Kpnl断片を EASYTRAP Ver.2 (宝バイオ社製）を用いてァガロースゲルから回収し、 DNA blunting Kit (宝バイ ォ社製)を用いて断片の末端平滑ィ匕を行った。次に、実施例 1 (1)で構築した pAYC TER3を EcoRI断片を EASYTRAP Ver.2 (宝バイオ社製）を用いてァガロースゲルから 回収し、 DNA blunting Kit (宝バイオ社製)を用いて断片の末端平滑ィ匕を行った後、 先程の平滑末端化させた BamHI-Kpnl断片を挿入することによって、 pAYCMappAを 得た。前述の方法に従って、挿入断片の塩基配列の決定を行った結果、予想通りの 異種融合遺伝子が構築されて ヽることを確認した。
(3)フイターゼ遺伝子の Methylophilus methylotrophus ATCC53528での発現 上記（2)で構築した pAYCMappA (Methylophilus methylotrophus ATCC53528由来 のメタノールデヒドロゲナーゼのプロモーター配列及びシグナル配列と Escherichia co li K-12株由来のフィターゼ遺伝子を連結）及び対照とする pAYCTER3で Methylophil us methylotrophus ATCC53528をそれぞれ形質転換し、 25mg/lのアンピシリンと 1 %のメタノールを含む SEIIA寒天培地（硫酸アンモ -ゥム 5g、K HPO 1. 9g、 N
2 4
aH ΡΟ · 2Η O 1. 56g、硫酸マグネシウム 200mg、塩ィ匕カルシウム 72mg、硫
2 4 2
酸銅 5 g、硫酸マンガン 25 μ g、硫酸亜鉛 23 μ g、三塩化鉄 9. 7mg、寒天 15g、水で 1Lにして pH7. 0に調整)で生育した菌株を選択した。次に、選択した pA YCMappAもしくは pAYCTER3を有する M. methylotrophus ATCC53528を、 25mgZl のアンピシリンと 2%のメタノールを含む SEIIA液体培地でそれぞれ 37°C、 48時間培 養した。培養終了後、 pAYCMappAもしくは pAYCTER3を有する M. methylotrophus A TCC53528の各菌体の培養上清を SDS— PAGEに供したところ、 pAYCMappAを有 する株においてのみ培養上清中に目的とする分子量を有するタンパク質を検出する ことができた。次に、各菌体の培養上清を粗酵素液としてフィターゼ活性を測定した。 尚、酵素活性測定は既報に従って（J AOAC Int. 1994 May-Jun;77(3):760-4.)行つ た。その結果、 pAYCTER3を有する M. methylotrophus ATCC53528は、培養上清中 に酵素活性を検出できなかった力 pAYCMappAを有する M. methylotrophus ATCC 53528は、培養上清中に 60 FTU/mL (37°C、 pH5.5)の活性を検出でき、培養上清中 にフイターゼを分泌して 、る事が確認できた。
[0052] 実施例 3： Morganella morganii株由来の酸性フォスファターゼの Methylophilus methyl otrophus ATCC 53528での分泌発現
(1) Morganella morganii株由来の酸性フォスファターゼ遺伝子の取得と分泌発現用 プラスミドの構築
Morganella morganii株由来の酸性フォスファターゼ遺伝子の配列は既に決定され ている（Genbank Accession No.AB035805 :配列番号 25)。この配列を参考にして、 配列番号 27と配列番号 28に示したプライマーを合成し、前記斉藤、三浦の方法に 従って調製した Morganella morganii株の染色体 DNAから酸性フォスファターゼ配列（ 成熟型）をコードする領域を PCR法にて増幅した。 PCR反応には Pyrobest DNA poly merase (宝ノィォ社製)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。な お、配列番号 27に示したプライマーは M. methylotrophusのメタノールデヒドロゲナー ゼとの融合遺伝子を構築するために、メタノールデヒドロゲナーゼのシグナル配列の C末端側のアミノ酸配列をコードする配列を含んでいる。
[0053] 次に前記斉藤、三浦の方法に従って調製した M. methylotrophus ATCC 53528の 染色体 DNAから配列番号 9と配列番号 29に示したプライマーを用いてメタノールデヒ ドロゲナーゼのプロモーター領域とシグナル配列領域を PCR法にて増幅した。 PCR 反応には Pyrobest DNA polymerase (宝バイオ社製）を用い、反応条件は業者の推奨 するプロトコルに従った。
[0054] 次に、上記で増幅した Morganella morganii株の酸性フォスファターゼ配列（成熟型） をコードする領域と、同じく上記で増幅した Methylophilus methylotrophus ATCC 535 28のメタノールデヒドロゲナーゼのプロモーター領域及びシグナル配列領域の PCR 反応液 1 μ 1を混ぜて铸型とし、配列番号 9と配列番号 28のプライマーを用いてクロス オーバー PCRを行い、 Methylophilus methylotrophus ATCC 53528のメタノールデヒド ロゲナーゼ遺伝子のプロモーター及びシグナル配列に接続された酸性フォスファタ ーゼの融合遺伝子を増幅させた。ァガロースゲル電気泳動により約 1.8kbの増幅断 片を検出した。この断片を EASYTRAP Ver.2 (宝バイオ社製）を用いてァガロースゲル 力も回収し、 pHSG398 (宝バイオ社製）の Smal部位に挿入することによって、 pHSGMp hoCを得た。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの融合遺伝子が構築されて いることを確認した。尚、塩基配列の決定はダイターミネータ一サイクルシークェンシ ングキット（PEアプライドバイオシステムズ社製）と DNAシークェンサ一 373A(PEァプ ライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。次に、 pHSGMphoCの BamHト Kpnl断 片を EASYTRAP Ver.2 (宝バイオ社製）を用いてァガロースゲルから回収し、 DNA blu nting Kit (宝バイオ社製)を用いて断片の末端平滑ィ匕を行った。次に、実施例 1 (1) で構築した pAYCTER3の Smal断片を EASYTRAP Ver.2 (宝バイオ社製）を用いてァガ ロースゲルから回収し、平滑末端化させた BamHト Kpnl断片を挿入することによって、 pAYCMphoCを得た。前述の方法に従って、挿入断片の塩基配列の決定を行った結 果、予想通りの異種融合遺伝子が構築されていることを確認した。
(2)酸性フォスファターゼ遺伝子の Methylophilus methylotrophus ATCC53528での 発現
上記（1)で構築した pAYCMphoC (Methylophilus methylotrophus ATCC53528由来 のメタノールデヒドロゲナーゼのプロモーター配列及びシグナル配列と Morganella mo rganii株由来の酸性フォスファターゼ遺伝子を連結）及び対照とする pAYCTER3で Me thylophilus methylotrophus ATCC53528をそれぞれ开質転換し、 25mg/lのアンピ シリンと 1%のメタノールを含む SEIIA寒天培地で生育した菌株を選択した。次に、選 択した pAYCMphoCもしくは pAYCTER3を有する M. methylotrophus ATCC53528を、 25mgZlのアンピシリンと 2%のメタノールを含む SEIIA液体培地でそれぞれ 37°C、 48時間培養した。培養終了後、 pAYCMphoCもしくは pAYCTER3を有する M. methyl otrophus ATCC53528の各菌体の培養上清を SDS— PAGEに供したところ、 pAYC MphoCを有する株においてのみ培養上清中に目的とする分子量約 25kDaを有する タンパク質を検出することができた。次に、各菌体の培養上清を粗酵素液として基質 pNPPを用いてフォスファターゼ活性を測定した結果、 pAYCTER3を有する M. methyl otrophus ATCC53528は、培養上清中に酵素活性を検出できなかった力 pAYCMap pAを有する M. methylotrophus ATCC53528は、培養上清中に活性を検出でき、培養 上清中に酸性フォスファターゼを分泌して 、る事が確認できた。
[0056] 実施例 4：シグナル配列を置換した Escherichia coli K- 12株由来のフイターゼの Meth ylophilus methylotrophus ATCC 53528での分泌発現
(1)シグナル配列を置換した Escherichia coli K-12株由来のフイターゼの分泌発現 用プラスミドの構築
前記斉藤、三浦の方法に従って調製した M. methylotrophus ATCC 53528の染色 体 DNAから配列番号 30と配列番号 31に示したプライマーを用いてメタノールデヒド ロゲナーゼのプロモーター領域を PCR法にて増幅した。 PCR反応には Pyrobest DNA polymerase (宝バイオ社製)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った 。なお、配列番号 30に示したプライマーは制限酵素 Hindlllの認識配列を含んでいる
[0057] E. coli K-12株由来フイターゼのシグナル配列を利用する目的で、前記斉藤、三浦 の方法に従って調製した E. coli K-12株の染色体 DNAから、配列番号 32と配列番号 33に示したプライマーを用いてシグナル配列を含むフイターゼ遺伝子を PCR法にて 増幅した。 PCR反応には Pyrobest DNA polymerase (宝バイオ社製）を用い、反応条 件は業者の推奨するプロトコルに従った。なお、配列番号 32に示したプライマーは M . methylotrophusのメタノールデヒドロゲナーゼとの融合遺伝子を構築するために、メ タノールデヒドロゲナーゼのプロモーター配列の C末端側のアミノ酸配列をコードする 配列を含んでおり、配列番号 33に示したプライマーは制限酵素 Kpnlの認識配列を 含んでいる。
[0058] 次に、上記で増幅した Escherichia coli K- 12株のフィターゼ配列をコードする領域と 、同じく上記で増幅した Methylophilus methylotrophus ATCC 53528のメタノールデヒ ドロゲナーゼのプロモーター領域の PCR反応液 1 μ 1を混ぜて铸型とし、配列番号 30 と配列番号 33のプライマーを用いてクロスオーバー PCRを行い、 Methylophilus meth ylotrophus ATCC 53528のメタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターに接続 された E. coliフイターゼのシグナル配列と成熟遺伝子の融合遺伝子を増幅させた。 ァガロースゲル電気泳動により約 2.4kbの増幅断片を検出した。この断片 HindIII-Kp nl断片を EASYTRAP Ver.2 (宝バイオ社製）を用いてァガロースゲルから回収し、実 施例 1 (1)の pAYCTER3の Hindlll- Kpnl部位に挿入することによって、 pAYCAappAを 得た。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの融合遺伝子が構築されているこ とを確認した。尚、塩基配列の決定はダイターミネータ一サイクルシークェンシングキ ット（PEアプライドバイオシステムズ社製）と DNAシークェンサ一 373A(PEアプライド バイオシステムズ社製)を用いて行った。
一方、 Morganella morganii株の酸性フォスファターゼのシグナル配列を利用する目 的で、前記斉藤、三浦の方法に従って調製した M. morganii株の染色体 DNAから配 列番号 34と配列番号 28に示したプライマーを用いてシグナル配列を含む酸性フォ スファターゼ遺伝子を PCR法にて増幅した。 PCR反応には Pyrobest DNA polymerase (宝バイオ社製)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。なお、配列 番号 34に示したプライマーは M. methylotrophusのメタノールデヒドロゲナーゼとの融 合遺伝子を構築するために、メタノールデヒドロゲナーゼのプロモーター配列の C末 端側のアミノ酸配列をコードする配列を含んでいる。
上記で増幅した酸性フォスファターゼ遺伝子と上述したメタノールデヒドロゲナーゼ のプロモーター領域の PCR反応液 1 μ 1を混ぜて铸型とし、配列番号 30と配列番号 2 8のプライマーを用いてクロスオーバー PCRを行い、 M. methylotrophus ATCC 53528 のメタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターに接続された M. morganiiの酸性 フォスファターゼのシグナル配列と成熟遺伝子の融合遺伝子を増幅させた。更にこ の融合遺伝子を铸型として、配列番号 30と配列番号 35に示したプライマーを用いて 、 M. methylotrophus ATCC 53528のメタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモータ 一と M. morganiiの酸性フォスファターゼのシグナル配列部分を増幅させた。なお、配 列番号 35に示したプライマーは E. coliフィターゼとの融合遺伝子を構築するために、 フイターゼ成熟型配列の N末端側のアミノ酸配列をコードする配列を含んでいる。
[0060] 上記で増幅したメタノールデヒドロゲナーゼのプロモーター領域及び酸性フォスファ ターゼのシグナル配列の融合遺伝子と、実施例 2 (2)で増幅したフィターゼ遺伝子の PCR反応液 1 μ 1を混ぜて铸型とし、配列番号 30と配列番号 33のプライマーを用いて クロスオーバー PCRを行い、 M. methylotrophus ATCC 53528のメタノールデヒドロゲ ナーゼ遺伝子のプロモーターに接続された M. morganiiの酸性フォスファタ一ゼのシ グナル配列と E. coliフイターゼの成熟遺伝子の融合遺伝子を増幅させた。ァガロース ゲル電気泳動により約 2.4kbの増幅断片を検出した。この増幅断片を制限酵素 Hindi IIと Kpnlで処理し、 Hindm- Kpnl断片を EASYTRAP Ver.2 (宝バイオ社製）を用いてァ ガロースゲルから回収し、実施例 1 (1)の pAYCTER3の Hindlll-Kpnl部位に挿入する ことによって、 pAYCCappAを得た。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの融 合遺伝子が構築されていることを確認した。尚、塩基配列の決定はダイターミネータ ェンサ一 373A (PEアプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。
[0061] (2) E.coliのフイターゼのシグナル配列及び M. morganiiの酸性フォスファタ一ゼのシ グナル配列に接続された E.coliの成熟型フイターゼの Methylophilus methylotrophus ATCC53528での発現
上記（1)で構築した pAYCAappA(M. methylotrophus ATCC53528由来のメタノー ルデヒドロゲナーゼのプロモーター配列及び E. coli由来のフイターゼのシグナル配列 と成熟型配列の遺伝子を連結;)及び pAYCCappA (M. methylotrophus ATCC53528 由来のメタノールデヒドロゲナーゼのプロモーター配列及び M. morganii株由来の酸 性フォスファターゼのシグナル配列と E. coli由来のフイターゼの成熟型配列の遺伝子 を連結）及び対照とする PAYCTER3で M. methylotrophus ATCC53528をそれぞれ形 質転換し、 25mg/lのアンピシリンと 1%のメタノールを含む SEIIA寒天培地で生育 した菌株を選択した。次に、選択した pAYCAappAもしくは pAYCCappAもしくは pAYC TER3を有する M. methylotrophus ATCC53528を、 25mgZlのアンピシリンと 2%のメ タノールを含む SEIIA液体培地でそれぞれ 37°C、 48時間培養した。培養終了後、 p AYCAappAもしくは pAYCCappAもしくは pAYCTER3を有する M. methylotrophus ATC C53528の各菌体の培養上清を SDS— PAGEに供したところ、 丫じ & 及び 丫 CCappAを有する株においてのみ培養上清中に目的とする分子量を有するタンパク 質を検出することができた。次に、各菌体の培養上清を粗酵素液としてフイターゼ活 性を測定した結果、 pAYCTER3を有する M. methylotrophus ATCC53528は、培養上 清中に酵素活性は検出されなかった力 pAYCAappA及び pAYCCappAを有する M. methylotrophus ATCC53528は、培養上清中にそれぞれ酵素活性が検出され、培養 上清中にフイターゼを分泌している事が確認できた。なお、酵素活性の測定方法は、 前記実施例 2に記載の方法と同様にして行った。
[0062] 実施例 5：プロモーターを置換した Escherichia coli K-12株由来のフイターゼの Methy lophilus methylotrophus ATCC 53528での分泌、発現
(1)プロモーターを置換した Escherichia coli K-12株由来のフイターゼの分泌発現用 プラスミドの構築
tacプロモーターを利用する目的で、 pKK223-3 (pharmacia社）を铸型として配列番 号 36と配列番号 37に示したプライマーを用いて tacプロモーター領域を PCR法にて 増幅した。用いた tacプロモーターの配列は配列番号 12に示す。 PCR反応には Pyrob est DNA polymerase (宝バイオ社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコル に従った。なお、配列番号 36に示したプライマーは制限酵素 EcoRIの認識配列を含 んでいる。
実施例 2 (2)の pAYCMappAを铸型にして配列番号 38と配列番号 39に示したプラ イマ一を用いて M. methylotrophus由来メタノールデヒドロゲナーゼのシグナル配列と E. col油来フイターゼ (成熟型）の融合遺伝子を PCR法にて増幅した。 PCR反応には Pyrobest DNA polymerase (宝バイオ社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロ トコルに従った。なお、配列番号 38に示したプライマーは tacプロモーターとの融合遺 伝子を構築するために、 tacプロモーターの一部の配列を含んでおり、配列番号 39 に示したプライマーは制限酵素 EcoRIの認識配列を含んでいる。
[0063] 次に、上記で増幅した tacプロモーター配列をコードする領域と、同じく上記で増幅 した M. methylotrophus由来のメタノールデヒドロゲナーゼのシグナル配列と E.coli由 来のフイターゼ (成熟型）の融合遺伝子をコードする領域の PCR反応液 1 μ 1を混ぜて 铸型とし、配列番号 36と配列番号 39のプライマーを用いてクロスオーバー PCRを行 い、 tacプロモーターに接続された M. methylotrophus由来のメタノールデヒドロゲナー ゼのシグナル配列と E. coli由来フイターゼの成熟遺伝子を融合させた遺伝子を増幅 させた。ァガロースゲル電気泳動により約 1.6kbの増幅断片を検出した。この増幅断 片を EcoRI処理した後、 EASYTRAP Ver.2 (宝バイオ社製）を用いてァガロースゲルか ら回収し、実施例 1 (1)の pAYCTER3の EcoRI部位に挿入することによって、 pAYCPta cMappAを得た。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの融合遺伝子が構築さ れていることを確認した。尚、塩基配列の決定はダイターミネータ一サイクルシークェ ンシングキット（PEアプライドバイオシステムズ社製）と DNAシークェンサ一 373A(PE アプライドバイォシステムズ社製)を用いて行った。
(2)tacプロモーターに接続された E.coli由来フイターゼの Methylophilus methylotrop hus ATCC53528での発現
上記（1)で構築した pAYCPtacMappA (tacプロモーター配列及び M. methylotrophu s ATCC53528由来のメタノールデヒドロゲナーゼのシグナル配列及び E. coli由来の フイターゼの成熟型配列の遺伝子を連結）及び対照とする pAYCTER3で M. methylot rophus ATCC53528をそれぞれ形質転換し、 25mg/lのアンピシリンと 1%のメタノー ルを含む SEIIA寒天培地で生育した菌株を選択した。次に、選択した pAYCPtacMap pAもしくは pAYCTER3を有する M. methylotrophus ATCC53528を、 25mgZlのアン ピシリンと 2%のメタノールを含む SEIIA液体培地でそれぞれ 37°C、 48時間培養した 。培養終了後、 pAYCPtacMappAもしくは pAYCTER3を有する M. methylotrophus AT CC53528の各菌体の培養上清を SDS— PAGEに供したところ、 pAYCPtacMappAを 有する株においてのみ培養上清中に目的とする分子量を有するタンパク質を検出す ることができた。次に、各菌体の培養上清を粗酵素液としてフィターゼ活性を測定し た結果、 pAYCTER3を有する M. methylotrophus ATCC53528は、培養上清中に酵素 活性を検出できなかったが、 pAYCPtacMappAを有する M. methylotrophus ATCC53 528は、培養上清中に酵素活性を検出でき、培養上清中にフイターゼを分泌している 事が確認できた。なお、酵素活性の測定方法は、前記実施例 2に記載の方法と同様 にして行った。 [0065] 実施例 6： Escherichia coli K- 12株由来のベータラクタマーゼの Methylobacillus glyco genes ATCC 29475での分泌発現
(l) Methylobacillus glycogenes ATCC 29475中で機能する発現用プラスミド pAYCTE R-tetの構築
M.glycogenes ATCC29475株は、アンピシリン及びストレプトマイシンに而性で、テト ラサイクリンに感受性を示す事から、実施例 1 (1)で作成した分泌発現プラスミド ρΑΥ CTER3にテトラサイクリン耐性遺伝子を導入する事とした。 pRK310 (Plasmid. 1985 Ma r； 13(2) :149-53に記載）を铸型にして配列番号 23と配列番号 24のプライマーを用 ヽ てテトラサイクリン耐性遺伝子を PCR法により増幅させた。ァガロースゲル電気泳動に より約 1.5kbの増幅断片を検出した。この増幅断片を制限酵素 BamHIで処理し、断片 を EASYTRAP Ver.2 (宝バイオ社製）を用いてァガロースゲルから回収し、実施例 1 (1 )の PAYCTER3の BamHI部位に挿入することによって、 pAYCTER- tetを得た。挿入断 片の塩基配列決定の結果、予想通りの融合遺伝子が構築されて!ヽることを確認した 。尚、配列番号 23と配列番号 24に示したプライマーは制限酵素 BamHIの認識配列 を含んでおり、塩基配列の決定はダイターミネータ一サイクルシークェンシングキット (PEアプライドバイオシステムズ社製）と DNAシークェンサ一 373A (PEアプライドバイ ォシステムズ社製)を用いて行った。
[0066] (2)ベータラクタマーゼの Methylobacillus glycogenes ATCC 29475での分泌、発現 上記（1)で構築した pAYCTER- tetで Methylobacillus glycogenes ATCC 29475を开 質転換し、 5mg/lのテトラサイクリンと 1%のメタノールを含む SEIIA寒天培地 (硫酸ァ ンモニゥム 5g、 K HPO 1. 9g
2 4 、 NaH PO · 2H O 1. 56g、硫酸マグネシウム
2 4 2
200mg、塩ィ匕カルシウム 72mg、硫酸銅 5 /z g、硫酸マンガン 25 /z g、硫酸亜鉛 23 /z g、三塩ィ匕鉄 9. 7mg、寒天 15g、水で 1Lにして pH7. 0に調整）で生育し た菌株を選択した。次に、選択した pAYCTER-tetを有する M.glycogenes ATCC 2947 5を、 5mg/lのテトラサイクリンと 2%のメタノールを含む SEIIA液体培地で 30°C、 48 時間培養した。培養終了後、 pAYCTER- tetを有する M. glycogenes ATCC 29475の 菌体の培養上清を SDS— PAGEに供したところ、培養上清中にベータラクタマーゼ と同じ分子量を有するタンパク質を検出することができた。このタンパク質の N末端配 列をプロテインシークェンサ一 PPSQ-21A (島津社製)を用いて決定したところ、ベー タラクタマーゼの成熟型配列である事が判明し、培養上清中にベータラクタマーゼを 分泌して!/、る事が確認できた。
[0067] 実施例 7： Escherichia coli K- 12株由来のフイターゼの Methylobacillus glycogenes A TCC 29475での分泌発現
(1) Methylobacillus glycogenes ATCC 29475における Escherichia coli K- 12株由来 のフイターゼの分泌発現用プラスミドの構築
M.glycogenes ATCC29475株で E.coli由来フイターゼを分泌発現させる目的で、実 施例 5 (1)で作成したフィターゼ分泌発現プラスミド pAYCPtacMappAの BamHI部位に 、実施例 6 (1)で作成したテトラサイクリン耐性遺伝子の BamHI処理断片を挿入する 事によって、 pAYCPtacMappA-tetを得た。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想 通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。尚、塩基配列の決定はダイター
Aシークェンサ一 373A (PEアプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。
[0068] (2) E.coli由来フイターゼの Methylobacillus glycogenes ATCC 29475での発現
上記（1)で構築した pAYCPtacMappA-tetもしくは対照とする実施例 6 (2)で作成し た pAYCTER- tetで Methylobacillus glycogenes ATCC 29475をそれぞれ开質転換し、 5mg/lのテトラサイクリンと 1%のメタノールを含む SEIIA寒天培地で生育した菌株を 選択した。次に、選択した pAYCPtacMappA- tetもしくは pAYCTER- tetを有する M.gly cogenes ATCC 29475を、 5mg/lのテトラサイクリンと 2%のメタノールを含む SEIIA液 体培地でそれぞれ 37°C、 48時間培養した。培養終了後、 pAYCPtacMappA- tetもしく は pAYCTER- tetを有する M.glycogenes ATCC 29475の各菌体の培養上清を SDS— PAGEに供したところ、 pAYCPtacMappA-tetを有する株にお!、てのみ培養上清中に 目的とする分子量を有するタンパク質を検出することができた。次に、各菌体の培養 上清を粗酵素液としてフィターゼ活性を測定した結果、 pAYCTER-tetを有する M.gly cogenes ATCC 29475は、培養上清中に酵素活性を検出できなかった力 pAYCPtac MappA-tetを有する M.glycogenes ATCC 29475は、培養上清中に酵素活性を検出 でき、培養上清中にフイターゼを分泌している事が確認できた。なお、酵素活性の測 定方法は、前記実施例 2に記載の方法と同様にして行った。
産業上の利用の可能性
本発明により、タンパク質を安価に効率的に分泌生産することができる。特に、産業 上有用なタンパク質、例えば、フイターゼなどを効率的に分泌生産することができる。

Claims

請求の範囲
[1] メタノール資化性細菌で機能するプロモーター配列、及び該プロモーター配列に発 現可能に連結された、シグナル配列および目的タンパク質配列を含むポリペプチド をコードする核酸配列を含む DNA構築物を保持するメタノール資化性細菌を、メタノ ールを炭素源とする液体培地中で培養することにより、該細菌に前記目的タンパク質 を分泌させ、分泌された目的タンパク質を回収することを特徴とする、タンパク質の製 造方法。
[2] 前記メタノール資化性細菌で機能するプロモーター配列力 メタノールデヒドロゲナ ーゼのプロモーター、 tacプロモーター、 σ Εプロモーター、及びリボゾームタンパク質 プロモーターから選択される請求項 1に記載の方法。
[3] 前記プロモーター配列が、配列番号 11、 12、 21又は 22の塩基配列を有するプロモ 一ター配列である、請求項 1に記載の方法。
[4] 前記シグナル配列力 メタノールデヒドロゲナーゼ、フイターゼおよび酸性フォスファ ターゼ力 選択されるタンパク質のシグナル配列である請求項 1〜3のいずれか一項 に記載の方法。
[5] 前記シグナル配列力 配列番号 18、及び 20から選択されるアミノ酸配列を有するこ とを特徴とする請求項 1〜3のいずれか一項に記載の方法。
[6] 前記メタノール資化性細菌が、メチロフイラス属細菌、メチロバチラス属細菌、メチロフ ァーガ属細菌、ァクロモパクター属細菌、シユードモナス属細菌、プロタミノバクタ一 属細菌、メタノモナス属細菌、ミクロサイクラス属細菌、及びメチロバクテリゥム属細菌 力もなる群より選択される細菌であることを特徴とする、請求項 1〜5のいずれか一項 に記載の方法。
[7] 前記タンパク質がフイターゼ、インターロイキン、トランスグルタミナーゼ、インターフエ ロン、インシュリン、酸性フォスファターゼ及びペプチド合成酵素力も選択されるタン パク質である請求項 1〜6のいずれか一項に記載の方法。
[8] 前記メタノール資化性細菌力 偏性メタノール資化性細菌である、請求項 1〜7の 、 ずれか一項に記載の方法。
[9] 前記偏性メタノール資化性細菌が、メチロフイラス属細菌、メチロバチラス属細菌、メ チロファーガ属細菌力もなる群より選択される細菌であることを特徴とする、請求項 8 記載の方法。
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