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WO1998012351A1 - Verfahren zur reinigung und gegebenenfalls analyse von nukleinsäuren aus biologischen proben - Google Patents

Verfahren zur reinigung und gegebenenfalls analyse von nukleinsäuren aus biologischen proben Download PDF

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WO1998012351A1
WO1998012351A1 PCT/EP1997/005129 EP9705129W WO9812351A1 WO 1998012351 A1 WO1998012351 A1 WO 1998012351A1 EP 9705129 W EP9705129 W EP 9705129W WO 9812351 A1 WO9812351 A1 WO 9812351A1
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WO
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nucleic acid
dna
synthetic resin
resin
subsequent
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PCT/EP1997/005129
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Inventor
W. Kurt Roth
Dorothee Waschk
Stefan Zeuzem
Original Assignee
Roth W Kurt
Dorothee Waschk
Stefan Zeuzem
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Definitions

  • the present invention relates to a method for the purification and optionally analysis of nucleic acids from biological samples.
  • DNA in particular serves as the starting material for genetic analyzes in laboratory diagnostic research and in routine use.
  • nucleic acids such as DNA and RNA
  • biological samples in particular from samples of the human body, such as blood, body secretions, tissue samples, urine, stool and the like. the like
  • samples of the human body such as blood, body secretions, tissue samples, urine, stool and the like. the like.
  • the subsequent use in genetic analyzes is of particular importance, especially with regard to screening in tumor diagnosis and for the diagnosis of infectious agents such as viruses or bacteria.
  • the analysis of DNA which comes from exfoliated intestinal epithelial cells from stool samples, is of particular interest for the diagnosis of colorectal tumors. Isolation of the nucleic acid from whole blood is also of great interest in order to make the isolated nucleic acid available for genetic analysis.
  • the resulting DNA should be in high purity and be able to be subjected directly to the required subsequent reactions.
  • Nucleic acid diagnostics using DNA-a-amplification approaches in particular the polymerase chain reaction (polymerase chain reaction, hereinafter abbreviated to PCR) (see elfaiki, R. r Gelfand, DH, Stoffel, S., Scharf, SJ, Higuchi, R., Hörn, GT, Mullis, KB, Erlich, HA (1988), Science 239: 487-491), opens up diverse approaches to specific and at the same time sensitive DNA diagnostics, for example of tumors in the early stages that are not stressful and for screening are well suited. Due to the often small amount of DNA that can be isolated from a defined biological sample, such as stool samples, DNA amplification approaches such as the PCR technique seem to be a suitable method for the duplication of the DNA of interest.
  • the main difficulties are inhibitors which are isolated together with the nucleic acid of the biological sample when using conventional extraction methods and which inhibit the enzymes to be used in the nucleic acid amplification batches. It has been found that the DNA polymerase required for the PCR is inhibited. Stool samples and whole blood, in particular, are critical biological starting samples since they contain relatively large amounts of inhibitors.
  • the nucleic acid (DNA, RNA) resulting from the purification and isolation should be present in high purity and should be able to be subjected directly to the necessary subsequent reactions. The inhibitors must therefore be separated efficiently and selectively.
  • the DNA is usually isolated from cells. Cells are disrupted, for example, under strongly denaturing and possibly reducing conditions. The disruption of the cells with denaturing substances, e.g.
  • the DNA obtained by such a method e.g. from exfoliated intestinal epithelial cells from stool samples is only suitable to a limited extent for use in the subsequent subsequent reactions, in particular enzymatic amplification reactions such as PCR.
  • PCR enzymatic amplification reactions
  • Recent data show that only 103 cases out of a total of 230 extracted stool samples (efficiency of 44.7%) can be amplified using PCR (Villa, E., Dugani, A., Rebecchi, AM, Vignoli, A., Grottola, A., Buttafoco, P., Losi, L., Perini, M., Trande, P., Merighi, A., Lerose, R. and Manenti, F. (1996), Gastroenterology: 110: 1346-1353 ).
  • Intestinal epithelial cells are lysed and extracted with a buffer containing adsorbent (potato flour or potato starch or bovine serum albumin).
  • adsorbent potato flour or potato starch or bovine serum albumin.
  • the DNA-containing solution is used to break down proteins, for example nucleic acid-cleaving enzymes the proteinase K incubated.
  • the shortening of this process is due to the fact that the phenol extraction and subsequent ethanol precipitation are replaced by the use of centrifugation columns (QIAa p spin columns, QIAGEN GmbH). While the DNA reversibly attached to one
  • Binds silica membrane in the column disruptive compounds are pressed through the use of a suitable washing buffer due to the action of centrifugal forces and thus cleaned.
  • a suitable buffer By adding a suitable buffer, the purified DNA is eluted from the column as a result of a centrifugation step.
  • the object underlying the invention is therefore to provide an improved method for purifying or isolating nucleic acids (DNA, RNA and the like) from unpurified biological samples such as whole blood or stool samples; the nucleic acid should be present in sufficient quantity and purity so that it can be subjected to the necessary subsequent reactions.
  • the efficiency for a subsequent nucleic acid analysis reaction, in particular for amplification approaches such as PCR, is to be increased.
  • This object is achieved by a method for purification, optionally also analysis of nucleic acids from biological samples, the method comprising the step of reacting the nucleic acid-containing sample with an anion exchanger synthetic resin which has a binding affinity for
  • a characteristic of the present invention is the use of a bile acid binding anion exchange resin.
  • the binding affinity of the anion exchanger synthetic resin for bile acids which is preferably high, is a measure of the fact that the inhibitors for the nucleic acid analysis reaction which may have to be subsequently carried out, for example in the PCR reaction, are efficiently bound and thus separated while nucleic acids are not or are bound less and can therefore be easily recovered.
  • Another surprising result of the present invention is the very good selectivity of the anion exchange resin, which has the affinity for bile acids, for binding the inhibitors compared to binding the nucleic acid, which are not bound or are bound less in the presence of the inhibitors.
  • the nucleic acid is made available in high purity by the method according to the invention, typically in an A 2 6o / A 2e o ratio obtained via the absorption values at 260 nm and 280 nm of more than 1.5, in particular of more than 1.7.
  • the method according to the invention ensures adequate cleaning of inhibitors for any subsequent nucleic acid detection reactions while at the same time maintaining a sufficiently high nucleic acid concentration.
  • the binding affinity for bile acids characteristic of the synthetic resin used according to the invention, where typical bile acids such as cholic acid are suitable, is suitably in the range of an average binding capacity, as determined, for example, of cholic acid, of at least 0.1 equivalents of cholic acid per kg of dry synthetic resin (eq / kg).
  • the average binding capacity is preferably at least 0.5, more preferably at least 1.0 and in particular at least 2.0 equivalents of cholic acid per kg of dry synthetic resin.
  • the binding capacity to bile acids can be determined by reacting a defined amount of dry synthetic resin (50 g) with an appropriately concentrated bile acid solution (1% by weight aqueous solution of cholic acid) under suitable conditions with regard to pH and ionic strength (e.g. pH 6 , 3 at 0.9% by weight NaCl concentration). Cholic acid can be easily quantified (see for example JLIrvin et al. In "J.Biol.Chem.”, 153, 439 (1944)).
  • the total chloride exchange capacity of the synthetic resin used according to the invention is preferably more than 4 eg / kg. However, it must be taken into account that the total number of active, available anion exchange sites is not the actually decisive criterion for the effective binding of the inhibitors.
  • the characteristic underlying the nature of the bile acid-binding synthetic resin plays a further specific role here.
  • the quality of the binding or separation of the inhibitors can be determined indirectly by determining the efficiency of a subsequent nucleic acid analysis reaction.
  • a binding or separation of the inhibitors is achieved when an increase in efficiency can be determined in the subsequent nucleic acid analysis reaction, the efficiency before the cleaning according to the invention, in particular in the case of inhibitors heavily contaminated samples, may be zero.
  • the efficiency due to the different quantity and heterogeneity of the inhibitors depending on the biological sample, it can be assumed that the same biological sample was examined.
  • the efficiency is defined as the percentage of the specific PCR products to be determined in a PCR analysis approach, a simple PCR reaction, but advantageously using carrier protein, is carried out, for example according to the examples below.
  • the anion exchange resin used according to the invention binds the inhibitors from the biological starting material more selectively and more effective, so that the subsequent nucleic acid analysis reactions yield very high amplification rates even when using a simple PCR. According to the invention, significantly better results are obtained, even when using a smaller amount of anion exchange resin, and furthermore a smaller number of extraction steps are required; one incubation step is usually sufficient.
  • a comparison of conventional DNA purification and isolation methods was recently published by A. Kramvis et al. described in "Journal of Clinical Microbiology", 34, 2731-2733 (1996).
  • the selective separation of the inhibitors that can be achieved with the invention is also achieved with unpurified starting samples.
  • the method according to the invention has proven to be particularly effective in the case of starting samples which have been very problematic to date, e.g. in whole blood that has been treated with citrate and EDTA or the presumably PCR-inhibiting substance heparin, as well as in stool samples that come from the lysis of intestinal epithelial cells that have been exfoliated in stool and that have a high proportion of unknown inhibitors.
  • the advantages of the invention can also be achieved when applied to any other biological samples, for example other samples from the human body, such as body secretions, tissue samples, urine and the like. the like
  • the anion exchanger synthetic resin used according to the invention is a basic, in particular strongly basic polymer material of high molecular weight (for example in
  • 10 • 10 6 in particular 1 to 5 • 10 6 ), which is generally composed of an organic polymer or copolymer modified with tertiary and / or quaternary ammonium groups and whose characteristic feature is the affinity for bile acids described above.
  • the resin polymer is formed in a particularly suitable manner from a polystyrene which is crosslinked by divinylbenzene, preferably in a proportion of 0.5 to 5% by weight and in particular 1-3% by weight of divinylbenzene and in its network structure quaternary .Aitraionium groups, suitably in the form of benzyltrimethylammonium groups, are incorporated.
  • Colestyramine is the international free name for the copolymers of styrene (vinylbenzene) and about 2% divinylbenzene with the quaternary ammonium groups inserted into the network structure.
  • the colestyramine granules are known in the medical-therapeutic field as a highly hydrophilic, water-soluble, basic anion exchange resin for binding bile acids in bile acid loss syndromes and as a lipid-lowering agent for the treatment of hypercholesterolemia.
  • the lipid-lowering agent colestyramine is sold by STADApharm.
  • Crosslinked polyalkylamine anion exchange resins form further examples of a type of synthetic resin which is fundamentally suitable for use in the present invention.
  • the crosslinked polyalkylamine anion exchange resin is generally formed as a copolymer of a poly (lower) alkyl polyamine, for example diethylene triamine or tertaethylene pentamine, with epichlorohydrin (1-chloro-2, 3-epoxypropane).
  • An example of an anion-exchange synthetic resin of this type of polymer, which has a high affinity for bile acids and which has also achieved excellent results when used, is colestipol (average binding capacity of colestypol versus cholic acid 1.1 equivalents per kg resin dry weight) .
  • Colestipol is the international free name for the serum cholesterol-lowering copolymers of diethylene triamine and epichlorohydrin.
  • the Colestipol hydrochloride granules are also known per se as a water-insoluble, basic .anion exchange resin for binding bile acids in bile congestion and hypercholesterolemia (lipid-lowering agents). Colestipol hydrochloride was developed by Upjohn and was launched in 1977.
  • the cleaning efficiency compared to the inhibitors when using colestyramine is further increased compared to colestipol.
  • the polymers which form the synthetic resin also include other polymers and copolymers and the use of substituted representatives of the monomers which form the copolymers, provided that the inhibitors which may be present, in analogy with the ability to bind to bile acids, by increasing the efficiency of the subsequent nucleic acid analysis reaction can be determined and separated.
  • Anion exchange resins contain other additives known per se in conventional amounts, e.g. Superplasticizer.
  • the anion exchange resin also contains suitable salt partners for charge saturation; the tertiary ammonium groups are suitably in the hydrochloride form, while quaternary ammonium groups are suitably associated with chloride.
  • the resin to be used can first be in a suitable dry form, for example in the form of granules, or it can already be in an aqueous form
  • the resin suspension used for the reaction is usually buffered, suitably in the range from slightly acidic (approximately pH 5-6) to weakly basic (approximately pH 9-10).
  • nucleic acid types in particular DNA and RNA, are suitable as nucleic acid. Because of its greater importance, but above all because nucleic acid amplification reactions are usually based on DNA samples (cf. PCR), the invention is further described below, primarily for the purification or isolation of DNA.
  • the cells In the case of biological starting samples in which the nucleic acid to be isolated is present intracellularly, such as stool samples containing exfoliated intestinal epithelial cells, the cells must first be lysed in order to disrupt the intracellular material.
  • the lysis or disruption of the cells can be achieved by a simultaneous physical and chemical action on the sample containing the body cells.
  • the sample material can be frozen (-80 ° C) before lysis.
  • the lysis buffer suitably contains a denaturing agent, for example sodium dodecyl sulfate (SDS) or other detergents, which brings about chemical digestion of the cells, while stirring the suspension, for example with an automatic, mechanical stirring system, favors mechanical digestion.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • a centrifugation step can remove cell debris, undigested food residues or other macro residues.
  • the nucleic acid-containing cell lysate is treated with the special anion-exchange resin used according to the invention.
  • the resin in this case can be suitably pre-swelled in the lysis buffer.
  • the amount of the special synthetic resin used is preferably 10% by weight and less, based on the total weight of the treated sample. Above this amount there may be a tendency that not only the inhibitors but also the desired nucleic acid is increasingly bound to the resin.
  • aqueous, up to 10% by weight, in particular 5 to 10% by weight, suspension of the synthetic resin binds the inhibitors in sufficient quantity and at the same time does not, or only insignificantly, reduce the amount of DNA present in the aqueous solution.
  • the amount of synthetic resin used is inversely related to the frequency of the reaction. That is, with a relatively high salary, in particular with 7.5 to 10% by weight of resin suspension in an aqueous medium, a single reaction is preferable, while in the medium content range, approximately from 2.5 to 7.5% by weight and in particular around 5% by weight ( ⁇ 1 wt.), A two or more times implementation delivers better results.
  • the preferred ratio of resin content to frequency of implementation also depends on the sample material to be examined. For stool samples, a single reaction with 10% by weight or a double reaction with 5% by weight of copolymer resin is particularly suitable. In the case of whole blood, content ranges below 5% by weight are preferred, two reactions with 2.5% by weight of copolymer resin being particularly suitable.
  • the easiest way is to add the resin suspension to the nucleic acid-containing (possibly not pre-cleaned) sample, mix it very well, and then separate it again from the copolymer resin.
  • the latter can be conveniently carried out by centrifuging off the resin granules.
  • the reaction can also be carried out by means of a separation using a chromatography system using the special anion exchange resin.
  • the DNA can be further purified and isolated. It is advantageous to use non-specific proteinases such as Proteinase K to break down proteins and nucleic acid-cleaving enzymes. Then you get a viscous, gelatinous liquid. From this, the DNA is isolated from the aqueous phase, preferably by means of phenol extraction and subsequent ethanol precipitation. Alternatively, the DNA can be removed by using a detergent, for example a chaotropic guanidine-containing detergent (such as DNAzol TM from Gibco BRL), followed by ethanol precipitation from the aqueous phase isolate.
  • a detergent for example a chaotropic guanidine-containing detergent (such as DNAzol TM from Gibco BRL), followed by ethanol precipitation from the aqueous phase isolate.
  • the DNA-containing solution digested with Proteinase K is mixed with the detergent and ethanol and immediately pelleted by a centrifugation step. Since neither organic solvents (phenol, chloroform) are used, nor are several centrifugation steps required for extraction, this process is very user-friendly and time-saving.
  • organic solvents such as phenol or chaotropic detergents for isolating DNA
  • centrifugation columns known for this purpose, for example QIAamp-spin columns TM from Qiagen TM.
  • the quality of the nucleic acid sample required for this is provided by the method according to the invention.
  • the expected .amplicate could even be obtained in up to 100% of the samples tested.
  • the DNA purified or isolated according to the purification method according to the invention is preferably subjected to a PCR which is carried out in the presence of a carrier protein, such as bovine serum albumin (BSA).
  • BSA bovine serum albumin
  • the carrier protein concentration is chosen to be high, preferably more than 50 ⁇ g / ml. Very good amplification rates have been found for carrier protein concentrations in the range of 120-200 ⁇ g / ml.
  • relatively high concentrations of nucleotides required for the PCR deoxyribonucleoside
  • Triphosphate Triphosphate
  • primers and DNA polymerases such as Tag DNA polymerase advantageous.
  • the nucleotide concentrations are preferably in the range of 150-225 ⁇ M.
  • primer concentration is in the range from 0.75 to 1.25 ⁇ M.
  • the content of DNA polymerase is suitably in the range of 2 to 3 units per 50 ul batch.
  • the amplification is preferably carried out by a simple PCR in which 30-35 temperature cycles are carried out.
  • 200 mg of stool material is deep-frozen for at least one hour at -80 ° C, then mixed with 600 ⁇ l lysis buffer (500 M Tris, 75 mM EDTA, 10 M NaCl, 1% SDS, pH 9.0) and homogenized.
  • the lysed sample is 10 min. Centrifuged at 4 ° C and 6000 xg in an Eppendorf table centrifuge to remove coarse stool particles, cell debris, bacteria and food residues.
  • the supernatant is a second time at 4 ° C, 20,000 xg 10 min. centrifuged.
  • the DNA-containing supernatant is mixed with the same volume of a colestyramine solution (5% colestyramine in lysis buffer), mixed well, 2 min.
  • the DNA can be pelleted from the aqueous, upper phase by ethanol precipitation, by adding 1/10 volume of 3 M sodium acetate, pH 5.2 and 2.5 times the volume of 100% ethanol.
  • the DNA pellet washed in 75% ethanol and dried at room temperature, is dissolved in 100 ⁇ l of distilled water.
  • the DNA yield is 10-15 ⁇ g per 200 mg stool sample with an A 260/2 eo ratio of 1.7. 5 ⁇ l of this DNA solution are used to amplify defined genes / gene segments in a 50 ⁇ l PCR approach used.
  • the amplification mixture is composed as follows:
  • BSA bovine serum albumin
  • 200 mg of stool material is frozen for at least one hour at - 80 ° C, then mixed with 600 ⁇ l lysis buffer (500 mM Tris, 75 mM EDTA, 10 mM NaCl, 1% SDS, pH 9.0) and homogenized.
  • the lysed sample is 10 min. Centrifuged at 4 ° C and 5000 xg in an Eppendorf table centrifuge to remove coarse stool particles, cell debris, bacteria and food residues.
  • the supernatant is a second time at 4 ° C, 13000 xg 10 min. centrifuged.
  • the DNA-containing supernatant is mixed with the same volume of a colestipol hydrochloride solution (10% colestipol hydrochloride in lysis buffer), mixed well, 2 min.
  • the clear supernatant is incubated with proteinase K (final concentration 100 ⁇ g / ml) for 2 hours at 56 ° C.
  • the digested sample is mixed with the same volume of a phenol-chloroform-isoamyl alcohol solution (25: 24: 1), mixed well and 5 min. centrifuged at room temperature and 13000 xg.
  • the aqueous, upper phase becomes a again with the same volume of a chloroform-isoamyl alcohol solution (24: 1) and centrifuged as described above.
  • the DNA can be removed from the aqueous, upper phase by ethanol precipitation, by adding 1/10 volume of 3 M sodium acetate, pH 5.2 and 2.5 times the volume
  • the DNA pellet washed in 75% ethanol and dried at room temperature, is dissolved in 100 ⁇ l of distilled water.
  • the DNA yield is 15-20 ⁇ g per 200 mg stool sample with an A 260 / A 280 ratio of 1.9. 5 ⁇ l of this DNA solution are used for the amplification of defined genes / gene segments in a 50 ⁇ l PCR approach.
  • the amplification mixture is identical to that of Example 1.
  • 500 ⁇ l citrate, heparin or EDTA blood or frozen and thawed blood are mixed with 500 ⁇ l lysis buffer (500 mM Tris, 75 mM EDTA, 10 mM NaCl, 1% SDS, pH 9.0) and mixed well.
  • 500 mM Tris, 75 mM EDTA, 10 mM NaCl, 1% SDS, pH 9.0 500 mM Tris, 75 mM EDTA, 10 mM NaCl, 1% SDS, pH 9.0
  • the DNA-containing solution is mixed with the same volume of a colestyramine solution (2.5% colestyramine in lysis buffer), mixed well, 2 min. at
  • Phenol added, mixed well and 5 min. centrifuged at room temperature and 20,000 xg.
  • the aqueous, upper phase is again mixed with the same volume of a chloroform-isoamyl alcohol solution (24: 1) and as described above centrifuged.
  • the DNA can be removed from the aqueous, upper phase by ethanol precipitation , by adding 1/10 volume of 3 M sodium acetate, pH 5.2 and 2.5 times the volume of 100% ethanol.
  • the DNA pellet washed in 75% ethanol and dried at room temperature, is dissolved in 30 ⁇ l of distilled water.
  • the DNA yield is 5-10 ⁇ g per 500 ⁇ l whole blood with an ⁇ 2 6o / 2 8o ratio of 1.7. 5 ⁇ l of this DNA solution are used for the amplification of defined genes / gene segments in a 50 ⁇ l PCR approach.
  • the amplification mixture is identical to that of Example 1.

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Abstract

Es wird ein Verfahren zur Reinigung und gegebenenfalls Analyse von Nukleinsäuren aus biologischen Proben beschrieben, wobei das Verfahren den Schritt umfaßt, daß die Nukleinsäure-haltige Probe mit einem Anionenaustauscher-Kunstharz umgesetzt wird, welches eine, vorzugsweise hohe, Bindungsaffinität zu Gallensäuren besitzt, wobei die möglicherweise vorhandenen Inhibitoren für die gegebenenfalls anschließende Nukleinsäure-Analysereaktion an das Anionenaustauscherharz gebunden und abgetrennt werden.

Description

Verfahren zur Reinigung und gegebenenfalls .Analyse von Nukleinsäuren aus biologischen Proben
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung und gegebenenfalls Analyse von Nukleinsäuren aus biologischen Proben.
Die Reinigung von Nukleinsäuren spielt eine zentrale Rolle in der Molekularbiologie. Vor allem die DNA dient als Ausgangsmaterial für genetische Analysen in der labordiagnostischen Forschung und im routinemäßigen Einsatz.
Die Isolierung von Nukleinsäuren wie DNA und RNA aus biologischen Proben, insbesondere aus Proben des menschlichen Körpers, wie zum Beispiel Blut, Körpersekreten, Gewebeproben, Urin, Stuhl u. dergl . , zum nachfolgenden Einsatz in genetischen Analysen kommt eine besondere Bedeutung zu, insbesondere im Hinblick auf ein Screening in der Tumordiagnostik sowie zur Diagnose infektiöser Agentien wie Viren oder Bakterien.
So ist zum Beispiel die Analyse der DNA, die aus abgeschilferten Darmepithelzellen von Stuhlproben stammt, von besonderem Interesse zur Diagnostik kolorektaler Tumoren. Von großem Interesse ist auch eine Isolierung der Nukleinsäure aus dem Vollblut, um die isolierte Nukleinsäure einer genetischen .Analyse zugänglich zu machen.
Insbesondere soll die dabei anfallende DNA in hoher Reinheit vorliegen und direkt den erforderlichen Folgereaktionen unterworfen werden können. Eine Nukleinsäure-Diagnostik unter Einsatz von DNA- aAinplifikationsansätzen, insbesondere der Polymerase- Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, im Folgenden mit PCR abgekürzt) (s. Ξaiki, R.r Gelfand, D. H., Stoffel, S., Scharf, S.J., Higuchi, R., Hörn, G.T., Mullis, K.B., Erlich, H.A. (1988), Science 239: 487-491), eröffnet vielfältige Ansätze zu einer spezifischen und zugleich sensitiven DNA-Diagnostik, z.B. von Tumoren im Frühstadium, die nicht belastend und für ein Screening gut geeignet sind. Aufgrund der häufig geringen DNA- Menge, die aus einer definierten biologischen Probe, wie beispielsweise bei Stuhlproben, isoliert werden kann, scheinen DNA-Amplifikationsansätze wie die PCR-Technik eine geeignete Methode zur Vervielfältigung der interessierenden DNA zu sein.
Hauptschwierigkeiten stellen jedoch Inhibitoren dar, die bei der Anwendung gängiger Extraktionsmethoden gemeinsam mit der Nukleinsäure der biologischen Probe isoliert werden, und die die in den Nukleinsäure-Amplifikationsansätzen einzusetzenden Enzyme inhibieren. So hat sich herausgestellt, daß die für die PCR erforderliche DNA-Polymerase inhibiert wird. Insbesondere Stuhlproben und Vollblut sind kritische biologische Ausgangsproben, da sie mit relativ großen Mengen an Inhibitoren behaftet sind. Die durch die Reinigung und Isolierung anfallende Nukleinsäure (DNA, RNA) soll in hoher Reinheit vorliegen und direkt den erforderlichen Folgereaktionen unterworfen werden können. Die Inhibitoren müssen daher effizient und selektiv abgetrennt werden. Üblicherweise wird die DNA aus Zellen isoliert. Dabei werden Zellen beispielsweise unter stark denaturierenden und gegebenenfalls reduzierenden Bedingungen aufgeschlossen. Weit verbreitet ist der Aufschluß der Zellen mit denaturierenden Substanzen, z. B. Detergenzien, und die Verwendung von bestimmten Enzymen zum .Abbau von Proteinen und Nukleinsäuren. So wird beispielsweise Natriumdodecylsulfat (SDS) als denaturierendes Agens verwendet, Proteinase K zum Abbau von Proteinen und RNase A zur Degradation von Ribonukleinsäuren (RNA) . Zur vollständigen Denaturierung von Proteinen wird die DNA-haltige Lösung mit dem organischen Lösungsmittel Phenol extrahiert. Durch die anschließende Ethanolpräzipitation erfolgt die Konzentrierung der DNA und gleichzeitig die Entfernung verbleibender Phenolreste aus der deproteinierten, wässrigen Lösung. (Maniatis, T., Fritsch, E. F. and Sa brook, S. (1982), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor University Press, Cold Spring Harbor) .
Die mit einem solchen Verfahren gewonnene DNA, z.B. aus abgeschilferten Darmepithelzellen von Stuhlproben, eignet sich nur begrenzt für den Einsatz in die sich anschließenden Folgereaktionen, insbesondere enzymatische Amplifikationsreaktionen, wie die PCR. So belegen jüngere Daten, daß sich nur in 103 Fällen von insgesamt 230 extrahierten Stuhlproben (Effizienz von 44,7%) die DNA mittels PCR amplifizieren läßt (Villa, E., Dugani, A., Rebecchi, A.M., Vignoli, A., Grottola, A. , Buttafoco, P., Losi, L., Perini, M., Trande, P., Merighi, A. , Lerose, R. and Manenti, F. (1996), Gastroenterology: 110:1346-1353) .
Deuter et al . veröffentlichten 1995 eine Methode zur Isolierung von DNA aus Stuhlproben, die das beschriebene Verfahren zeitlich verkürzt und vereinfacht (Deuter, R., Pietsch, R., Hertel, S. and Müller, 0. (1995), Nucl. Acids Res . , 23:3800- 3801) . Die sich im Stuhl befindlichen abgeschilferten
Darmepithelzellen werden lysiert und mit einem Adsorbens (Kartoffelmehl oder Kartoffelstärke oder Rinderserumalbumin) enthaltenden Puffer extrahiert. Zum Abbau von Proteinen, z.B. nukleinsäurespaltenden Enzymen, wird die DNA-haltige Lösung mit der Proteinase K inkubiert. Die zeitliche Verkürzung dieses Verfahrens beruht darauf, daß die Phenolextraktion und anschließende Ethanolfällung durch die Verwendung von Zentrifugationssäulchen (QIAa p spin columns, QIAGEN GmbH) ersetzt werden. Während die DNA reversibel an eine
Silikamembran in der Säule bindet, werden störende Verbindungen durch die Verwendung eines geeigneten Waschpuffers infolge der Wirkung von Zentrifugalkräften durch die Membran gepresst und somit abgereinigt. Durch Zugabe eines geeigneten Puffers wird die gereinigte DNA infolge eines Zentrifugationsschrittes von der Säule eluiert. Da sich jedoch Flüssigkeiten nicht vollständig aus solchen Membranen entfernen lassen, hat man immer mit einem Verlust der DNA-Ausbeute zu rechnen. Die nach diesem Verfahren gewonnene DNA liegt nicht in ausreichend guter Qualität (A26o/A28o = 1, ) und Menge (2 μg
DNA/200 mg Stuhlprobe) vor. Folgereaktionen, insbesondere die PCR, erfordern eine hohe und reproduzierbare Ausbeute der DNA- Rohpräparate unter gleichzeitiger intensiver Abreinigung störender Inhibitoren. Die Amplifikation eines definierten Gens/Genabschnitts der nach der von Deuter et al. beschriebenen Methode präparierten DNA mittels einer einfachen PCR zeigt eine Effizienz von 16 %. Auch durch eine nachfolgende Phenolextraktion dieser DNA läßt sich die Amplifikationseffizienz nur von 16 auf 40 % erhöhen. Lediglich die Anwendung einer verschachtelten ("nested") PCR, die sich durch eine erhöhte Empfindlichkeit und Sensitivität, bei gleichzeitiger Ausdünnung potentieller Inhibitoren, auszeichnet (Newton, C.R. and Graham, A. (1994), PCR, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, Bundesrepublik Deutschland) , erzielt eine erhöhte Amplifikationsausbeute von 66 %.
Es ist wünschenswert, die DNA in ausreichender Menge und in reproduzierbar guter Qualität zu isolieren, so daß definierte Gene/Genabschnitte in einer einfachen, d.h. nicht verschachtelten, PCR vervielfältigt werden können. Die Durchführung einer verschachtelten PCR zeigt sich für bestimmte Anwendungen (z. B. routinemäße Untersuchungen im diagnostischen Labor) nachteilig, da hier die Rate der falsch Positiven durch Produktkontaminationen erhöht ist.
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe besteht somit in der Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens zur Reinigung bzw. Isolierung von Nukleinsäuren (DNA, RNA und dergl.) aus ungereinigten biologischen Proben wie Vollblut oder Stuhlproben; dabei soll die Nukleinsäure in ausreichender Menge und Reinheit vorliegen, so daß sie den erforderlichen Folgereaktionen unterworfen werden kann. Die Effizienz für .eine nachfolgende Nukleinsäure-Analysereaktion, insbesondere für Amplifikationsansätze wie die PCR, soll gesteigert werden.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Reinigung, gegebenenfalls auch Analyse von Nukleinsäuren aus biologischen Proben, wobei das Verfahren den Schritt umfaßt, daß die Nukleinsäure-haltige Probe mit einem Anionenaustauscher- Kunstharz umgesetzt wird, welches eine Bindungsaffinität zu
Gallensäuren besitzt, wobei Inhibitoren für die gegebenenfalls anschließende Nukleinsäure-.Analysereaktion an das •Anionenaustauscherharz gebunden und abgetrennt werden.
Ein charakertistisches Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung eines Gallensäure-bindenden Anionenaustauscher-Kunstharzes .
Die Bindungsaffinität des Anionenaustauscher-Kunstharzes gegenüber Gallensäuren, die vorzugsweise hoch ist, ist ein Maßfaktor dafür, daß die Inhibitoren für die gegebenenfalls anschließend durchzuführende Nukleinsäure-Analysenereaktion, beispielsweise in der PCR-Reaktion, effizient gebunden und somit abgetrennt werden, während Nukleinsäuren nicht oder schwächer gebunden werden und somit leicht wiedergewonnen werden können.
Der Grund, weshalb ein .Anionenaustauscher-Kunstharz mit starker Affinität gegenüber Gallensäuren sehr effizient die Inhibitoren bindet und abtrennt, ist nicht klar. Es kann jedoch vermutet werden, daß - obgleich Gallensäuren selbst offenbar nicht die Inhibitoren von Nukleinsäure-Analysereaktionen darstellen - die Gallensäurestruktur mit der einerseits permanent negativen Carboxyl-Ladungsgruppe und dem andererseits relativ hydrophoben, in ß-Stellung methylierten Steroid-Struktur- bereich, welcher aber seinerseits üblicherweise durch hydrophile Hydroxylgruppen in α-Stellung derivatisiert ist, offensichtlich relativ gut die in den Inhibitoren vorliegende grobe Strukturverteilung widerspiegelt, so daß eine analog starke Affinität zu den Inhibitoren besteht.
Ein weiteres überraschendes Ergebnis der vorliegenden Erfindung ist die sehr gute Selektivität des Anionenaustauscher-Harzes, das die Affinität zu Gallensäuren besitzt, zur Bindung der Inhibitoren im Vergleich zur Bindung der Nukleinsäure, die in Gegenwart der Inhibitoren nicht oder schwächer gebunden werden. Gleichzeitig wird durch das erfindungsgemäße Verfahren die Nukleinsäure in hoher Reinheit zur Verfügung gestellt, typischerweise in einem über die Absorptionswerte bei 260 nm und 280 nm erhaltenen Verhältnis A26o/A2eo von über 1,5, insbesondere von über 1,7.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird eine ausreichende .Abreinigung von Inhibitoren für gegebenenfalls anschließende Nukleinsäure-Nachweisreaktionen unter gleichzeitigem Erhalt einer genügend hohen Nukleinsäure-Konzentration sichergestellt.
Die für das erfindungsgemäß eingesetzte Kunstharz charakteristische Bindungsaffinität gegenüber Gallensäuren, wobei typische Gallensäuren wie Cholsäure in Betracht kommen, liegt geeigneterweise im Bereich einer gegenüber z.B. Cholsäure ermittelten durchschnittlichen Bindungskapazität von mindestens 0, 1 Äquivalente Cholsäure pro kg trockenem Kunstharz (eq/kg) . Vorzugsweise beträgt die durchschnittliche Bindungskapazität mindestens 0,5, weiter bevorzugt mindestens 1,0 und insbesondere mindestens 2,0 Äquivalente Cholsäure pro kg trockenem Kunstharz. Die Bindungskapazität gegenüber Gallensäuren kann ermittelt werden durch Umsetzen einer definierten Menge an trockenem Kunstharz (50 g) mit einer angemessen konzentrierten Gallensäurelösung (1 gew.-%tige wässrige Lösung von Cholsäure) bei geeigneten Bedingungen bzgl. pH-Wert und Ionenstärke (z.B. pH 6,3 bei 0,9 gew.%-iger NaCl-Konzentration) . Cholsäure läßt sich leicht quantifizieren (s. z.B. J.L.Irvin et al . in „J.Biol.Chem.", 153, 439 (1944)).
Die Gesamt-Chloridaustauschkapazität des erfindungsgemäß eingesetzten Kunstharzes, bestimmt mittels üblicher Titrationsmethode, beträgt vorzugsweise mehr als 4 eg/kg. Es ist aber zu berücksichtigen, daß die Gesamtzahl der aktiven, verfügbaren Anionenaustauschstellen nicht das eigentlich maßgebliche Kriterium zur wirksamen Bindung der Inhibitoren darstellt. Die in der Natur des Gallensäure-bindenden Kunstharzes zugrundeliegende Charakteristik spielt hier eine weitere spezifische Rolle.
Die Qualität der Bindung bzw. Abtrennung der Inhibitoren kann indirekt ermittelt werden durch die Bestimmung der Effizienz einer anschließenden Nukleinsäure-Analysereaktion. Eine Bindung bzw. Abtrennung der Inhibitoren ist dann erreicht, wenn in der anschließenden Nukleinsäure-Analysereaktion eine Steigerung der Effizienz feststellbar ist, wobei die Effizienz vor der erfindungsgemäßen Reinigung, insbesondere bei durch Inhibitoren stark verunreinigten Proben, bei null liegen kann. Für einen Vergleich ist allerdings aufgrund der unterschiedlichen Menge und Heterogenität der Inhibitoren je nach biologischer Probe von der Untersuchung derselben biologischen Probe auszugehen. Zum Beispiel bei Stuhlproben, die einen besonders hohen Gehalt an stofflich bisher nicht charakterisierten, heterogenen Inhibitor-Substanzen aufweisen, sollte wünschenswerterweise in einem Qualitätstest eine Effizienz von mindestens 40%, vorzugsweise mindestens 60% und insbesondere mindestens 70% erreichbar sein. Die Effizienz ist dabei definiert als der prozentuale Anteil der spezifisch festzustellenden PCR-Produkte in einem PCR-Analyseansatz, wobei eine einfache PCR-Reaktion, vorteilhafterweise aber unter Einsatz von Trägerprotein, durchgeführt wird, beispielsweise gemäß der untenstehenden Beispiele.
Ein weiteres, überrachendes Ergebnis ergab sich aus einem Vergleich zu anderen, in Betracht kommenden, herkömmlichen basischen Anionenaustauscher-Materialien, wie einem FPLC- MonoQ™-System, dem sogenannten GeneReleaser™-System, einem
Diethylaminoethyl-Celluloseionenaustauscher (DE.AE-Sephacell™; DE-52) oder dem Qiagen™-Silika-Material : Obwohl es sich um das gleiche Prinzip eines Anionenaustausches handelt, bindet das erfindungsgemäß eingesetzte Anionenaustauscher-Harz die Inhibitoren aus dem biologischen Ausgangsmaterial selektiver und effektiver, so daß die nachfolgenden Nukleinsäure- Analysereaktionen bereits bei .Anwendung einer einfachen PCR sehr hohe Amplifikationsraten erbringen. Gemäß der Erfindung ergeben sich wesentlich bessere Resultate, und zwar bereits beim Einsatz einer geringeren Menge an Anionenaustauscher-Harz, und ferner sind eine geringere Anzahl an Extraktionsschritten erforderlich; in der Regel reicht ein Inkubationsschritt aus. Ein Vergleich herkömmlicher DNA-Reinigungs- und Isolierverfahren wurde vor kurzem von A.Kramvis et al . beschrieben in „Journal of Clinical Microbiology", 34, 2731-2733 (1996) .
Die mit der Erfindung erzielbare, selektive .Abtrennung der Inhibitoren wird auch bei ungereinigten Ausgangsproben erreicht.
So hat sich das erfindungsgemäße Verfahren als besonders wirksam erwiesen bei bisher sehr problematischen Ausgangsproben, z.B. bei Vollblut, das mit Citrat und EDTA oder der vermutlich PCR-inhibierenden Substanz Heparin behandelt wurde, sowie bei Stuhlproben, die aus der Lyse von im Stuhl abgeschilferten Darmepithelzellen stammen und einen hohen .Anteil an nicht bekannten Inhibitoren aufweisen. Selbstverständlich sind die Vorteile der Erfindung aber auch bei Anwendung auf beliebig andere biologische Proben erzielbar, beispielsweise anderen Proben aus dem menschlichen Körper, wie Körpersekreten, Gewebeproben, Urin u. dergl .
Das erfindungsgemäß eingesetzte Anionenaustauscher-Kunstharz ist ein basisches, insbesondere stark basisches Polymermaterial hohen Molekulargewichts (beispielsweise im
Molekulargewichtsbereich von über 0,5 • 106, wie von 0,5 bis
10 • 106, insbesondere 1 bis 5 • 106) , welches im allgemeinen aus einem mit tertiären und/oder quartären Ammoniumgruppen modifizierten organischen Polymer oder Copolymer aufgebaut ist und dessen charakteristisches Merkmal die vorstehend beschriebene Affinität zu Gallensäuren ist.
Das Harz-Polymer ist dabei auf besonders geeignete Weise gebildet aus einem Polystyrol, welches durch Divinylbenzol, vorzugsweise mit einem Anteil von 0,5 bis 5 Gew.-% und insbesondere von 1 - 3 Gew.-% Divinylbenzol quervernetzt ist und in dessen Netzstruktur quartäre .Aitraioniumgruppen, geeigneterweise in Form von Benzyltrimethylammoniumgruppen, eingebaut sind.
Ein Beispiel für ein Anionenaustauscher-Kunstharz diesen Polymer-Typs, das eine hohe Affinität zu Gallensäuren besitzt und bei dessen Einsatz ausgezeichnete Resultate erzielt wurden, ist Colestyramin (mittlere Bindungskapazität von Colestyramin gegenüber Cholsäure = 2,2 Äquivalente pro kg Harz- Trockengewicht) . Colestyramin ist der internationale Freiname für das Plasma-Cholesterinspiegel senkende Copolymere von Styrol (Vinylbenzol) und etwa 2 % Divinylbenzol mit in die Netzstruktur eingefügten quartären .Ammoniumgruppen. Das Colestyramin-Granulat ist auf dem medizinisch-therapeutischen Gebiet bekannt als ein stark hydrophiles, wasserlösliches, basisches .Anionenaustauscherharz zur Bindung von Gallensäuren bei Gallensäurenverlustsyndromen und als Lipidsenker zur Behandlung von Hypercholesterinämie. Der Lipidsenker Colestyramin wird von der Firma STADApharm vertrieben.
Weitere Beispiele für einen, zum Einsatz für die vorliegende Erfindung grundsätzlich gut geeigneten Kunstharz-Typ bilden vernetzte Polyalkylamin-Anionenaustauscherharze . Das vernetzte Polyalkylamin-.Anionenaustauscherharz ist dabei in der Regel als Copolymer aus einem Poly (niedrig) alkyl-Polyamin, beispielsweise Diethylentriamin oder Tertaethylenpentamin, mit Epichlorhydrin (l-Chlor-2, 3-epoxypropan) gebildet.
Ein Beispiel für ein .Anionenaustauscher-Kunstharz diesen Polymer-Typs, das eine hohe Affinität zu Gallensäuren besitzt und bei dessen Einsatz ebenfalls ausgezeichnete Resultate erzielt wurden, ist Colestipol (mittlere Bindungskapazität von Colestypol gegenüber Cholsäure = 1,1 Äquivalente pro kg Harz- Trockengewicht) . Colestipol ist der internationale Freiname für das Serum-Cholesterinspiegel senkende Copolymere von Diethylentriamin und Epichlorhydrin. Das Colestipolhydrochlorid-Granulat ist ebenfalls an sich bekannt als ein wasserunlösliches, basisches .Anionenaustauscherharz zur Bindung von Gallensäuren bei Gallenstauung und Hypercholesterinämie (Lipidsenker) . Colestipolhydrochlorid wurde von der Firma Upjohn entwickelt und kam 1977 auf den Markt .
Korrelierend mit der erhöhten Gallensäure-Bindungsaffinität ist die Reinigungseffizienz gegenüber den Inhibitoren beim Einsatz von Colestyramin im Vergleich zu Colestipol weiter erhöht.
Die das Kunstharz aufbauenden Polymere schließen neben den zuvor genannten Copolymeren auch andere Polymere und Copolymere sowie den Einsatz von substituierten Vertretern der die Copolymere aufbauenden, beispielhaft genannten Monomere ein, sofern in .Analogie mit der Bindungsfähigkeit zu Gallensäuren die möglicherweise vorhandenen Inhibitoren in durch die Effizienzsteigerung der anschließenden Nukleinsäure-Analysereaktion feststellbarem Maße gebunden und abgetrennt werden.
Desweiteren können die erfindungsgemäß eingesetzten
Anionenaustauscher-Harze weitere, an sich bekannte Additive in üblichen Mengen enthalten, wie z.B. Fließmittel. Zur Ladungsabsättigung enthält das Anionenaustauscher-Harz zudem geeignete Salzpartner; die tertiären Ammoniumgruppen liegen geeigneterweise in der Hydrochlorid-Form vor, während quartäre Ammoniumgruppen geeigneterweise mit Chlorid assoziiert sind.
Vor der Umsetzung der Probe kann das einzusetzende Harz zunächst in geeigneter Trockenform vorliegen, beispielsweise als Granulat, oder es kann bereits in einer wässrigen
Suspension vorliegen. Wird vom trockenen Harz ausgegangen, empfielt es sich, das Harz in einem geeigneten Puffer vorzuquellen, um wegen der hygroskopischen Eigenschaften des Harzes Verluste des Flüssigkeitsvolumens der verwendeten biologischen Probe zu vermeiden. Die zur Umsetzung eingesetzte Harzsuspension ist üblicherweise gepuffert, geeigneterweise im Bereich von schwach sauer (etwa pH 5-6) bis schwach basisch (etwa pH 9-10) .
Als Nukleinsäure kommen alle Nukleinsäurearten, insbesondere DNA und RNA, in Frage. Aufgrund der größeren Bedeutung, vor allem aber weil Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionen in der Regel auf DNA-Proben aufgebaut sind (vgl. die PCR), wird die Erfindung im Folgenden stellvertretend vor allem zur Reinigung bzw. Isolierung von DNA weiter beschrieben.
Bei biologischen Ausgangsproben, bei denen die zu isolierende Nukleinsäure intrazellulär vorliegt, wie beispielsweise abgeschilferte Darmepithelzellen enthaltende Stuhlproben, sind die Zellen zunächst zu lysieren, um das intrazelluläre Material aufzuschließen.
Die Lyse bzw. der Aufschluß der Zellen kann durch eine gleichzeitige physikalische und chemische Einwirkung auf die körperzellenhaltige Probe erzielt werden. Das Probenmaterial kann vor der Lyse in tiefgefrorenem Zustand (-80 °C) vorliegen. Im Lysepuffer ist geeigneterweise ein denaturierendes Agens, z.B. Natriumdodecylsulfat (SDS) oder andere Detergentien enthalten, welches den chemischen Aufschluß der Zellen bewirkt, während das Verrühren der Suspension, beispielsweise mit einem automatischen, mechanischen Rührsystem, den mechanischen Aufschluß begünstigt. Bei Stuhlproben hat sich gezeigt, daß bei sehr fester Konsistenz ein kräftiges Durchmischen der Probe mit einem Reagenzglasschüttler die Folgeanwendungen erleichtert. Durch einen Zentrifugationsschritt können Zelltrümmer, unverdaute Nahrungsmittelreste oder andere Makroreste entfernt werden. .Anschließend an die Lyse erfolgt die Behandlung des Nukleinsäure-haltigen Zellysats mit dem erfindungsgemäß eingesetzten, speziellen Anionenaustauscher-Harz. Das Harz kann in diesem Fall geeigneterweise in dem Lysepuffer vorgequellt werden.
Es hat sich gezeigt, daß bereits ein einmaliges Umsetzen des erfindungsgemäß eingesetzten Anionenaustauscher-Harzes eine ausreichende selektive Abreinigung der Inhibitoren ermöglichte. Die eingesetzte Menge des speziellen Kunstharzes beträgt vorzugsweise 10 Gew.-% und weniger, bezogen auf das Gesamtgewicht der behandelten Probe. Oberhalb dieser Menge kann die Tendenz bestehen, daß nicht nur die Inhibitoren, sondern auch die gewünschte Nukleinsäure in zunehmendem Maße an das Harz gebunden wird.
Es hat sich herausgestellt, daß eine zu häufige Wiederholung der batch-weisen Extraktion, insbesondere bei hohem Mengeneinsatz von über 10 Gew.-% sehr stark Gallensäure- bindender Kunstharze, zu einer nachteiligen Reduzierung der Nukleinsäure-Menge führen kann. Die Ursache hierfür ist unklar. Es wird vermutet, daß das spezielle Harz zunächst die Inhibitoren bindet und dadurch abgesättigt wird. Fehlen jedoch die Inhibitoren in der wässrigen Lösung, kann das spezielle Harz aufgrund seiner Ladungseigenschaften verstärkt die Nukleinsäure binden.
Eine wässrige, bis 10 gewichts-%ige, insbesondere 5 bis 10 gewichts-%ige Suspension des Kunstharzes bindet die Inhibitoren in ausreichender Menge und setzt gleichzeitig die Menge der in der wässrigen Lösung vorliegenden DNA nicht oder nur unwesentlich herab.
Geeigneterweise steht dabei die eingesetzten Menge an Kunstharz zu der Häufigkeit der Umsetzung in einem umgekehrten Verhältnis. Das heißt, bei einem relativ hohen Gehalt, insbesondere bei 7,5 bis 10 Gew.-% Harzsuspension in wässrigem Medium, ist eine einmalige Umsetzung vorzuziehen, während im mittleren Gehaltsbereich, etwa von 2,5 bis 7,5 Gew.-% und insbesondere um 5 Gew.-% (± 1 Gew.- ), eine zwei- oder mehr- malige Umsetzung bessere Resultate liefert. Das vorzugsweise zu wählende Verhältnis von Harzgehalt zu Häufigkeit der Umsetzung hängt aber auch von dem jeweils zu untersuchenden Probenmaterial ab. So ist bei Stuhlproben ein einmaliges Umsetzen mit 10 Gew.-% oder ein zweimaliges Umsetzen mit jeweils 5 Gew.-% Copolymer-Harz gut geeignet. Bei Vollblut sind Gehaltsbereiche unter 5 Ge .-% vorzuziehen, wobei ein zweimaliges Umsetzen mit jeweils 2,5 Gew.-% Copolymer-Harz besonders gut geeignet ist.
Beim Umsetzen wird am einfachsten die Nukleinsäure-haltige (ggf. nicht vorgereinigte) Probe mit der Harz-Suspension versetzt, sehr gut gemischt, und dann wieder vom Copolymeren- Harz abgetrennt. Letzteres kann bequem durch ein .Abzentrifugieren des Harzgranulats erfolgen. Das Umsetzen kann aber auch mittels einer Trennung über ein das spezielle Anionenaustauscher-Harz einsetzende Chromatographie- System erfolgen.
Anschließend an die Inhibitorabreinigung kann die DNA weiter gereinigt und isoliert werden. Vorteilhaft ist es, hierfür zunächst unspezifisch wirkende Proteinasen wie die Proteinase K einzusetzen, um Proteine und Nukleinsäure-spaltende Enzyme abzubauen. Danach erhält man eine viskose, gallertartige Flüssigkeit. Daraus wird die DNA vorzugsweise mittels Phenolextraktion und anschließender Ethanolpräzipitation aus der wässrigen Phase isoliert. Alternativ läßt sich die DNA durch die Verwendung eines Detergens, beispielsweise eines chaotropen, Guanidin-haltigen Detergens (wie DNAzol™ von Gibco BRL) , mit anschließender Ethanolfällung aus der wässrigen Phase isolieren. Dazu wird die DNA-haltige, mit Proteinase K verdaute Lösung mit dem Detergens und Ethanol versetzt und sofort durch einen Zentrifugationsschritt pelletiert. Da weder organische Lösungsmittel (Phenol, Chloroform) eingesetzt werden, noch mehrere Zentrifugationssschritte zur Extraktion nötig sind, ist dieses Verfahren sehr anwenderfreundlich und zeitersparend. Die Verwendung von organischen Lösungsmitteln wie Phenol oder chaotropen Detergentien zur Isolierung von DNA kann alternativ durch den Gebrauch von für diesen Zweck bekannten Zentrifugationssäulchen ersetzt werden, beispielsweise durch QIAamp-spin columns™ von Qiagen™. Hierbei eignet sich zur Zellyse sowohl ein Proteinase K-Verdau, sowie die Verwendung von kommerziell erhältlichen Lysepuffern (z. B. AVL-Puffer des QIAamp Viral RNA Kits™ von Qiagen, Hepatitis C Virus- Lysereagenz des Amplicor HCV Kits™ der Hoffmann-La Röche AG) . Bei der Verwendung der käuflichen Lysepuffer erfolgt die Behandlung der Proben analog dem jeweiligen Protokoll der Hersteller .
An die Reinigung bzw. Isolierung der DNA bzw. RNA können sich dann - je nach Wunsch - Folgereaktionen anschließen. Die hierfür erforderliche Qualität der Nukleinsäureprobe wird durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Verfügung gestellt. Die erfindungsgemäße Verfahrensweise gewährleistet eine Präparation der Nukleinsäure mit hoher Ausbeute (beispielsweise 10-20 μg DNA pro 200 mg Stuhlprobe) und Reinheit (A26o/28o = 1/7 - 1,9) unter .Abreinigung von Inhibitoren enzymatischer Reaktionen und erlaubt es, eine qualitativ reproduzierbare .Analytik durchzuführen, insbesondere in Kombination mit enzymatischen Verfahren zur Amplifikation von DNA.
Es hat sich herausgestellt, daß das erfindungsgemäße Verfahren in besonders günstiger Weise mit einer PCR-Amplifikation kombiniert werden kann, wobei bereits eine einfache PCR in über 60 %, teilweise in über 80 % aller untersuchten Stuhlproben zum Erfolg führte.
Bei einer .Amplifikation der isolierten Stuhl-DNA mittels einer verschachtelten PCR konnte sogar in bis zu 100 % der getesteten Proben das erwartete .Amplifikat erhalten werden.
Die gemäß dem erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren gereinigte bzw. isolierte DNA wird vorzugsweise einer PCR unterworfen, die in Gegenwart eines Trägerproteins, wie Rinderserumalbumin (BSA) , ausgeführt wird. Die Trägerproteinkonzentration wird dabei hoch gewählt, vorzugsweise mehr als 50 μg/ml. Sehr gute Amplifikationsraten haben sich bei Trägerprotein- Konzentrationen im Bereich von 120 - 200 μg/ml ergeben. Weiterhin wirken sich relativ hohe Konzentrationen an für die PCR erforderlichen Nukleotiden (Desoxyribonukleosid-
Triphosphate) , Primer und DNA-Polymeräsen wie der Tag-DNA- Polymerase vorteilhaft aus. Die Nukleotidkonzentrationen liegen vorzugsweise im Bereich von 150-225 μM. Gleichzeitig liegt die Primerkonzentration im Bereich von 0,75 bis 1,25 μM. Der Gehalt an DNA-Polymerase liegt geeigneterweise im Bereich von 2 bis 3 Units pro 50 μl-Ansatz.
•Die Amplifikation erfolgt hinsichtlich der beabsichtigten routinemäßigen Anwendung im diagnostischen Labor vorzugsweise durch eine einfache PCR, in der 30-35 Temperaturzyklen durchlaufen werden.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert. Beispiel 1
Isolierung von DNA aus einer Stuhlprobe:
200 mg Stuhlmaterial wird für die Dauer von mindestens einer Stunde bei -80 °C tiefgefroren, anschließend mit 600 μl Lysepuffer (500 M Tris, 75 mM EDTA, 10 M NaCl, 1 % SDS, pH 9,0) versetzt und homogenisiert. Die lysierte Probe wird 10 min. bei 4 °C und 6000 x g in einer Eppendorf-Tischzentrifuge zentrifugiert, um grobe Stuhlpartikel, Zelltrümmer, Bakterien und Nahrungsmittelreste abzutrennen. Der Überstand wird ein zweites Mal bei 4 °C, 20000 x g 10 min. zentrifugiert. Der DNA- haltige Überstand wird mit dem gleichen Volumen einer Colestyramin-Lösung (5 % Colestyramin in Lysepuffer) versetzt, gut durchmischt, 2 min. bei Raumtemperatur inkubiert und wie oben beschrieben bei 20000 x g zentrifugiert. Nach einer Wiederholung dieses Extraktionsschrittes wird der klare Überstand mit der Proteinase K (Endkonzentration 100 μg/ml) 2 Stunden bei 56 °C inkubiert. Die verdaute Probe wird mit dem gleichen Volumen einer Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Lösung (25:24:1) versetzt, gut durchmischt und 5 min. bei Raumtemperatur und 20000 x g abzentrifugiert . Die wässrige, obere Phase wird ein weiteres Mal mit dem gleichen Volumen einer Chloroform-Isoa ylalkohol-Lösung (24:1) versetzt und wie oben beschrieben zentrifugiert. Aus der wässrigen, oberen Phase kann die DNA durch eine Ethanolpräzipitation, durch Zugabe von 1/10-Volumen 3 M Natriumacetat, pH 5,2 und 2,5-fachem Volumen 100 %igem Ethanol, pelletiert werden. Das in 75 %igem Ethanol gewaschene und bei Raumtemperatur getrocknete DNA-Pellet wird in 100 μl destilliertem Wasser gelöst. Die DNA-Ausbeute beträgt 10-15 μg pro 200 mg Stuhlprobe mit einem A260/2eo-Verhältnis von 1,7. 5 μl dieser DNA-Lösung werden zur Amplifikation definierter Gene/Genabschnitte in einem 50 μl-PCR-Ansatz eingesetzt. Das Amplifikationsgemisch setzt sich wie folgt zusammen:
10 M Tris-HCl, pH 8, 3
50 mM KC1
2, 0 mM MgCl2
200 μM jedes dNTP
160 μg/ml Rinderserumalbumin (BSA)
1 μM jeder Primer
2,5 U Tag-DNA-Polymerase pro 50 μl-Ansatz
Beispiel 2
Alternative Isolierung von DNA aus einer Stuhlprobe
200 mg Stuhlmaterial wird für die Dauer von mindestens einer Stunde bei - 80 °C tiefgefroren, anschließend mit 600 μl Lysepuffer (500 mM Tris, 75 mM EDTA, 10 mM NaCl, 1 % SDS, pH 9,0) versetzt und homogenisiert. Die lysierte Probe wird 10 min. bei 4 °C und 5000 x g in einer Eppendorf-Tischzentrifuge zentrifugiert, um grobe Stuhlpartikel, Zelltrümmer, Bakterien und Nahrungsmittelreste abzutrennen. Der Überstand wird ein zweites Mal bei 4 °C, 13000 x g 10 min. zentrifugiert. Der DNA- haltige Überstand wird mit dem gleichen Volumen einer Colestipolhydrochlorid-Lösung (10 % Colestipolhydrochlorid in Lysepuffer) versetzt, gut durchmischt, 2 min. bei Raumtemperatur inkubiert und wie oben beschrieben bei 13000 x g zentrifugiert. Nach einer Wiederholung dieses Extraktionsschrittes wird der klare Überstand mit der Proteinase K (Endkonzentration 100 μg/ml) 2 Stunden bei 56 °C inkubiert. Die verdaute Probe wird mit dem gleichen Volumen einer Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Lösung (25:24:1) versetzt, gut durchmischt und 5 min. bei Raumtemperatur und 13000 x g abzentrifugiert . Die wässrige, obere Phase wird ein weiteres Mal mit dem gleichen Volumen einer Chloroform- Isoamylalkohol-Lösung (24:1) versetzt und wie oben beschrieben zentrifugiert. Aus der wässrigen, oberen Phase kann die DNA durch eine Ethanolpräzipitation, durch Zugabe von 1/10-Volumen 3 M Natriumacetat, pH 5,2 und 2,5-fachem Volumen
100 %igem Ethanol, entfernt werden. Das in 75 %igem Ethanol gewaschene und bei Raumtemperatur getrocknete DNA-Pellet wird in 100 μl destilliertem Wasser gelöst. Die DNA-Ausbeute beträgt 15-20 μg pro 200 mg Stuhlprobe mit einem A260/A280-Verhältnis von 1,9. 5 μl dieser DNA-Lösung werden zur Amplifikation definierter Gene/Genabschnitte in einen 50 μl-PCR-Ansatz eingesetzt. Das Amplifikationsgemisch ist identisch mit demjenigen des Beispiels 1.
Beispiel 3
Isolierung von DNA aus Vollblut:
500 μl Citrat-, Heparin- oder EDTA-Blut oder tiefgefrorenes und wieder aufgetautes Blut werden mit 500 μl Lysepuffer (500 mM Tris, 75 mM EDTA, 10 mM NaCl, 1 % SDS, pH 9,0) versetzt und gut durchmischt. Die DNA-haltige Lösung wird mit dem gleichen Volumen einer Colestyramin-Lösung (2,5 % Colestyramin in Lysepuffer) versetzt, gut durchmischt, 2 min. bei
Raumtemperatur inkubiert und wie oben beschrieben bei 20000 x g zentrifugiert. Nach einer Wiederholung dieses Extraktionsschrittes wird der klare Überstand mit der Proteinase K (Endkonzentration 100 μg/ml) 2 Stunden bei 56 °C inkubiert. Die verdaute Probe wird mit dem gleichen Volumen
Phenol versetzt, gut durchmischt und 5 min. bei Raumtemperatur und 20000 x g abzentrifugiert . Die wässrige, obere Phase wird ein weiteres Mal mit dem gleichen Volumen einer Chloroform- Isoamylalkohol-Lösung (24:1) versetzt und wie oben beschrieben zentrifugiert. Nach effizienter Lyse aller eukaryontischen und/oder prokaryontischen Zellen und/oder Viren (gleichzeitige Inaktivierung infektiöser Pathogene) und durch Denaturierung und enzymatischen Abbau von Proteinen (gleichzeitige Entfernung der an die Nukleinsäure gebundenen Proteine) kann die DNA aus der wässrigen, oberen Phase durch eine Ethanolpräzipitation, durch Zugabe von 1/10-Volumen 3 M Natriumacetat, pH 5,2 und 2,5-fachem Volumen 100 %igem Ethanol, pelletiert werden. Das in 75 %igem Ethanol gewaschene und bei Raumtemperatur getrocknete DNA-Pellet wird in 30 μl destilliertem Wasser gelöst. Die DNA- Ausbeute beträgt 5 - 10 μg pro 500 μl Vollblut mit einem Ä26o/28o-Verhältnis von 1,7. 5 μl dieser DNA-Lösung werden zur Amplifikation definierter Gene/Genabschnitte in einem 50 μl- PCR-Ansatz eingesetzt. Das Amplifikationsgemisch ist identisch mit demjenigen des Beispiels 1.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Reinigung, gegebenenfalls auch Analyse, von Nukleinsäuren aus biologischen Proben, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren den Schritt umfaßt, daß die Nukleinsäure- haltige Probe mit einem Anionenaustauscher-Kunstharz umgesetzt wird, welches eine Bindungsaffinität zu Gallensäuren besitzt, wobei die möglicherweise vorhandenen Inhibitoren für die gegebenenfalls anschließende Nukleinsäure-Analysereaktion an das Anionenaustauscherharz gebunden und abgetrennt werden.
2. Verfahren nach .Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Anionenaustauscher-Kunstharz ein Polystyrol-Copolymer, welches mit Divinylbenzol vernetzt und durch den Einbau von tertiären und/oder quartären Ammoniumgruppen stark basisch gemacht wurde, umfaßt .
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Copolymer Colestyramin verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Anionenaustauscher-Kunstharz ein Polyalkylamin-Harz umfaßt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Copolymer aus Polyethylenpolyamin- und Epichlorhydrin-Monomeren gebildet wurde.
6. Verfahren nach .Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Copolymer Colestipol verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Umsetzung der Gehalt des Anionenaustauscher-Kunstharzes in einer Harzsuspension 10 Gew.- % nicht übersteigt.
8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure nach der Umsetzung mit dem .Anionenaustauscher-Kunstharz durch einen Isolierschritt isoliert wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Isolierschritt durch Phenolextraktion mit anschließender
Alkoholpräzipitation erfolgt.
10. Verfahren nach einem der vorangehenden .Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die gereinigte Nukleinsäure zur nachfolgenden .Analyse einer Polymerase-Kettenreaktion unterworfen wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerase-Kettenreaktion in Gegenwart von Trägerprotein erfolgt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerprotein-Konzentration mehr als 50 μg/ml beträgt.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Polymerase-Kettenreaktionsansatz 120-200 μg/ml Trägerprotein, 150-225 μM von jedem eingesetzten Desoxyribonukleosid-Triphosphat und 0,75-1,25 μM von jedem eingesetzten Primer enthält.
14. Verwendung von Colestyramin zum Reinigen und/oder Isolieren und gegebenenfalls anschließenden .Analysieren von Nukleinsäuren aus biologischen Proben.
15. Verwendung von Colestipol zum Reinigen und/oder Isolieren und gegebenenfalls anschließenden .Analysieren von Nukleinsäuren aus biologischen Proben.
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