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WO1998053099A1 - Procede de detection qualitative et quantitative d'alterations de l'adn et des ligands de ces alterations - Google Patents

Procede de detection qualitative et quantitative d'alterations de l'adn et des ligands de ces alterations Download PDF

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WO1998053099A1
WO1998053099A1 PCT/FR1998/001008 FR9801008W WO9853099A1 WO 1998053099 A1 WO1998053099 A1 WO 1998053099A1 FR 9801008 W FR9801008 W FR 9801008W WO 9853099 A1 WO9853099 A1 WO 9853099A1
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WO
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dna
recognition
ligand
alteration
protein
Prior art date
Application number
PCT/FR1998/001008
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Inventor
Franck Chaubron
Christian Provot
Original Assignee
Genolife
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Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids

Definitions

  • the subject of the present invention is a method for the qualitative and quantitative detection of alterations on deoxyribonucleic acid (DNA), these alterations possibly being due to the metabolism of the cell or to physical or chemical agents, endogenous or exogenous, as well as 'a method for the qualitative and quantitative detection of ligand (s) recognizing altered DNA.
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • genotoxicity is a general definition which contemplates the appearance of physical or chemical alterations in DNA due to a direct action of the genotoxic agent or a metabolite, as well as its biological consequences (Butterworth, 1990, Mutât. Res., 239. 117-132; Ashby, 1992, Mechanism of Carcinogenesis in risk identification, Vainio H., Magee PN, McGregor DB & McMichael AJ (eds) IARC, Lyon, 135-164).
  • genotoxics many molecules or physical agents are capable of inducing the appearance of mutations, which are detected by different bacterial or eukaryotic systems.
  • the most generally used mutagen detection system is that described by BN Ames (Ames et al., 1973, Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 70, 2281-2285), supplemented by the so-called micronucleus test (Mac Gregor et al., 1987, Mutat. Res., 189., 103-112). Since mutagenesis seems in many cases to be the consequence of the presence of lesions (due in particular to genotoxic agents), many systems capable of detecting and quantifying this damage to DNA have been developed. Detection of DNA damage requires physicochemical techniques such as post-labeling (Randerath et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci.
  • This DNA polymerization step can be quantified using radio-labeled nucleotides (Cleaver, 1984, Methods for studying excision-repair of eukariotic DNA damaged by physical and chemical mutagens (Kilbey BJ, Nichols W. & Ramel C, eds) 33-69, Elsevier, This trial was called UDS (Unscheduled DNA Synthesis) and used for the detection of genotoxics or for the evaluation of cell repair capacities.
  • This UDS test has been perfected in the sense of not using radioactive marker (Selden et al., 1994, Mutation Res., 3J_5, 147-167) but this improvement is put into perspective due to the use of flow cytometry which weighs down the method.
  • DNA repair is mainly due to the lesion excision system, which has recently been reproduced with cell extracts (Wood et al., 1988, Cell, 53, 97-106; Sibghat-UUah et al., 1989, Nucleic Acids Res., 17, 4471-4484).
  • This test uses treated and untreated (control) plasmids incubated in the presence of transcriptionally active extracts (Manley et al., 1983, Meth. Enzymol., 110, 568-582).
  • the repair reaction consists of the incision-excision of the lesions and then the resynthesis of a DNA fragment.
  • the method takes advantage of this step during which one or more radiolabelled nucleotides is (are) incorporated.
  • NER nucleotides
  • BER excision of bases
  • Patent application No. WO 96 24688 relates in particular to the use of modified anti-DNA antibodies and the article by Salles B. et al. (A Chemiluminescent microplate assay to detect DNA damage induced by genotoxic treatements, Analytical Biochemistry, vol. 232, 37-42, 1995) relates to the incorporation of DIG-11-dUTP and the use of anti-DIG-1 antibodies 1-dUTP for the detection of lesions.
  • the subject of the present invention is a method of demonstrating an alteration of a DNA sequence which can ensure detection of all of the DNA alterations using a method the implementation of which is relatively simple.
  • the present invention provides a method of demonstrating an alteration of a DNA sequence, characterized in that: a) said DNA sequence is placed in the presence of a composition comprising at least one compound recognizing the type of alteration in question, called a ligand, in a medium ensuring recognition, b) the recognition of the alteration by said ligand is revealed.
  • alteration By recognition of the alteration by said ligand, it is meant that the direct or indirect attachment of the ligand to the damaged DNA is detected. It can be an indirect fixation when the ligand is part of a complex for example.
  • alteration we first of all mean DNA damage. These can be of physical origin (for example ionizing or non-ionizing radiation, thermal) or chemical. These DNA damaging factors can be of exogenous or endogenous origin.
  • the types of lesions generated on DNA can roughly be classified into 5 types: • adducts (generally covalent complexation, but which can call on another type of chemical bond such as the coordination bond of a molecule on a base of l 'DNA), • base bridging (carried out by energy supply, the best known type being found in pyrimidine base dimers formed under the action of UVC or UNB radiation),
  • AD ⁇ replication the polymerase involved in this process must synthesize the new strand by correctly matching the new bases to the template strand according to the A-T, G-C model.
  • a bad mismatch constitutes an alteration of the AD ⁇ . This mismatch can be natural (due to a statistical error in the polymerase) or be the consequence of a drug that will disrupt the activity of the enzyme.
  • the method according to the present invention makes it possible to detect both “damage to AD ⁇ ” and “mismatches”. Faced with all these alterations, the cell inevitably has an enzymatic arsenal allowing it to restore AD ⁇ to its normal form. These mechanisms are grouped under the general name of "repair of AD ⁇ ". Depending on the type of alteration, 5 main mechanisms are involved: nucleotide excision, base excision, the mismatch repair system, repair of single-strand DNA breaks and repair of double-strand DNA breaks .
  • the revealed ligand will preferably be a protein for recognition of the DNA repair system.
  • repair system is meant both damaged DNA repair systems and mismatch repair systems.
  • recognition protein is meant both the protein ensuring the primary recognition of the alteration and a protein involved in this recognition, in particular when a complex is formed (for example XP-A, RPA or TFIIH in particular).
  • NER Nucleotide Excision Repair
  • NER neosynthesized strand (4).
  • the mechanism for recognizing lesions repaired by NER is not yet clearly defined but it is however clearly established that the XP-A protein is involved (in association or not with the RPA protein and possibly the TFIIH transcriptional complex) in the one of the first stages of recognition.
  • XP-A is the protein for which group A patients of Xeroderma pigmentosum are deficient.
  • the absence of an NER repair protein makes these patients very sensitive to UV radiation which, depending on the wavelength, generates damage repaired by NER on DNA, the XP-A form being the most severe form. .
  • the XP-A protein is a zinc finger protein (classic structure of proteins interacting with DNA) made up of 273 amino acids and translated from a 1.4 kb messenger RNA (Tanaka K. et al, 1990 , Nature, 348, 73-76).
  • XP-A recognizes (with a preference of a factor of 1000 compared to uninjured DNA) the damage generated by UVC (approximately 75% of pyrimidine dimers in cyclobutane form, 25% of pyrimidine dimers in the form of photoproducts ( 6-4)). Only these types of lesions were analyzed in this study (Robins P. et al., 1990, EMBO J., 10. 3913-3921). These authors also generated polyclonal antibodies against 2 synthetic peptides of the XP-A protein and determined that the XP-A protein does not require phosphorylation to be active.
  • HeLa has a stronger affinity for single strand DNA than for double DNA stranded, but not preferably for DNA damaged by UVC (Eker et al., 1992, Mutation Res., DNA 274. 211-224). These authors also generated polyclonal antibodies against the recombinant XP-A protein.
  • HMG proteins High Mobility Group. These proteins are involved in lesions caused by cisplatin, an agent used in chemotherapy (Hughes et al., 1992, J. Biol. Chem. 267; 13520-13527).
  • HMG proteins High Mobility Group
  • HMG proteins are involved in lesions caused by cisplatin, an agent used in chemotherapy (Hughes et al., 1992, J. Biol. Chem. 267; 13520-13527).
  • HeLaS3 proteins specific for adducts caused by cisplatin have been identified (Donahue et al., 1990, Biochemistry, 29, 587-5880; Andrews and Jones, 1991, Cancer Comn. 3, 1-10; Hughes and al., 1992, J. Biol. Chem., 267, 13520-13527).
  • the sequencing of the N-terminal part of two of these proteins revealed a strong homology with the proteins HMG2 and HMG1.
  • XP-A recognizes bulky adducts and corresponds to many genotoxic agents, but does not recognize non-bulky adducts and oxidative bonds.
  • Base excision repair takes place on the bases of DNA damaged by reactive endogenous oxygen species, ionizing radiation and alkylating agents.
  • the BER intervenes on damage that is not very large, unlike the NER, which recognizes voluminous damage.
  • the key BER enzymes are glycosylases which remove the modified bases by cleavage of the N-glycosidic bond between the base and deoxyribose.
  • glycosylases There are different glycosylases recognizing different types of damage. To date, a dozen of these enzymes have been identified in Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae and in humans (Seeberg et al., 1995, TIBS, 20, 391-397).
  • the AP site (apurinic or apyrimidic) is excised by an AP-endonuclease or an AP-lyase which cleave the DNA strand respectively on the 5 ′ or 3 ′ side of the AP site.
  • the deoxyribose phosphate remaining is excised by a phosphodiesterase and the resynthesis of the DNA strand is restored by a DNA polymerase. The strand continuity is then restored by DNA ligase.
  • cells of an XP-D line do not show any difference in behavior, compared to a wild line, in terms of survival curve following UVA irradiation (320-410 nm) whose damage is of the type oxidative, therefore repaired by BER, while they are hypersensitive to UVB (307-312 nm) and UVC (254 nm) (Stary et al., 1997, Mutation Res., 383, 1-8).
  • the poly (ADP-ribose) polymerase, or PARP, involved in repairing single-strand breaks is also involved in the final step of ligation of repair by BER (Kubota et al., 1996, EMBO J. 15, 6662- 6670).
  • Base mismatches can occur during replication, recombination or following DNA damage.
  • the mechanism of repair of mismatches is well known in the bacteria E. coli.
  • the MutHLS system has thus been reconstituted in vitro: it is composed of the proteins MutH, MutL, MutS and UvrD (or helicase II). The mechanism is completed by DNA polymerase III, DNA ligase and SSB (Single-Stranded DNA Binding protein) and a specific single-stranded exonuclease (Exo I, Exo VII or the RecJ protein (Friedberg et al., 1995, DNA repair and Mutagenesis, ASM Press).
  • the protein MutS recognizes the mismatch and MutH is an endonuclease. No activity has yet been assigned to MutL, although it interacts with MutS and is necessary for activation of MutH .
  • hMLH1 the homolog of the MutHLS system
  • hMSH2 the purification of homologs to MutL (called hMLH1) and MutS (called hMSH2).
  • hMSH2 recognizes both simple base mismatches (like MutS) but also more complex mismatches due to multiple deletions / insertions (Fishei et al., 1994, Science, 266, 1403-1405; Alani and al., 1995, Genes Dev., 9, 234-247).
  • hMSH2 can be copurified with a 160 kD protein, called GTBP (G / T Binding Protein) (Drummond et al., 1995, Science, 268, 1909-1912; Palombo et al., 1995 , Science, 268, 1912-1914), but the role of this GTBP is not clearly elucidated.
  • GTBP G / T Binding Protein
  • hMLHl appears to be associated with another protein, hPMS2, and to form a heterodimer called hmutL ⁇ (Li & Modrich, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 1950-1954).
  • HNPCC hereditary non-polypous colon cancer
  • Mut proteins in particular MutS or HMSH2, constitute the targets of choice for implementing the method according to the present invention.
  • This enzyme is present in very large quantities (of the order of a million molecules) in the nuclei of eukaryotic cells (with the exception of yeast).
  • the study of the nucleotide sequence has shown that this protein has 2 domains, an N-terminal domain containing 2 zinc fingers and binding to DNA, and a C-terminal domain with catalytic function (Cherney et al., 1987 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 8370-8374).
  • the recognition of the cut is made by covering 7-8 nucleotides on each side of the cut (Gradmple et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87. 2990-2994).
  • PARP When attached to a single stranded DNA cut, the catalytic activity of PARP is activated. PARP produces poly (ADP) ribose) using nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) as a substrate.
  • NAD nicotinamide adenine dinucleotide
  • the lifespan of the poly (ADP-ribose chain) is normally very short, of the order of a few minutes. It is possible to block the reaction at the DNA-PARP interaction stage by inhibiting the synthesis of poly ( ADP) ribose using a structural analog of NAD, 3-aminobenzamide (Prigent et al., 1994, Mol. Cell.
  • PARP does not participate in DNA repair but protects the endonuclease breakage. In particular, it has been shown that PARP does not intervene in the NER mechanism (Molinette et al., 1993, EMBO J., 12, 2109-2117; Aboussekhra et al.,
  • PARP If a role in the recognition of single strand breaks in DNA is well established for PARP, its physiological role is less clear. It has been proposed that it could for example have a role in triggering apoptosis, by different routes but in particular by depleting the cell stock of NAD. PARP could protect the genomic stability of the cell by avoiding too frequent recombination events at break sites. It could also intervene in the opening of chromatin zones by interfering with histones (reviewed by Lindahl et al., 1995,
  • Double strand breaks in DNA are created in particular by ionizing radiation, but can originate from endogenous origin, as in certain recombination reactions.
  • IR4-7 IR for Ionizing Radiation
  • XRCC5 and XRCC7 X-ray Repair Cross-Complementing
  • DNA-PK DNA-dependent protein Kinase
  • DNA-PK DNA-dependent protein Kinase
  • DNA-PK consists of a catalytic subunit (DNA-PK C s) and a subunit interacting with DNA called Ku.
  • Ku originally identified as an autoantigen, is a heterodimer made up of 2 polypeptides of 70 and 80 kDa (Ku70 and Ku80) and corresponds to XRCC5. It attaches to the ends of DNA but not to cellular DNA (Gottling & Jackson, 1993, Cell 72,
  • DNA-PK C s subunit Apart from the phosphorylation inactivation of RNA polymerase I in the vicinity of DNA breaks (Kuhn et al., 1995, Genes Dev., 9, 193-203), the substrates of DNA-PKcs. (coded by XRCC7) are not yet well defined and its role in DNA repair remains to be proven.
  • the ligand Ku used for the implementation of double-strand breaks is more particularly usable for the detection of ionizing radiation (nuclear power plants or hospitals for example).
  • DNA repair mechanisms are not always known in detail, it is known that DNA alterations are first recognized by very specific ligands or recognition proteins, this recognition preceding the repair step aimed at reconstituting the DNA in its own form. It is interesting to note, for example, that if in the case of NER repair, only 7% of lesions are repaired in vitro, the majority of lesions, if not all, are recognized since they all induce deformation of the 'DNA and that it is the repair step itself which is limiting.
  • the method according to the invention implements the observation that in an in vitro system, most of the alterations, even if they are not repaired, are nevertheless recognized and that it is this recognition step which must be used for highlighting alterations.
  • the method according to the invention therefore relies on the detection of the interaction of one or more molecule (s) in repair systems recognizing alterations in DNA, in particular proteins.
  • the method according to the present invention is first of all a qualitative method, that is to say it makes it possible to detect the existence of a DNA alteration and its nature as a function precisely of the type of ligand.
  • the demonstration of an interaction of XP-A with DNA shows an alteration involving NER
  • the interaction of MutS or HMSH2 demonstrates a problem of mismatching.
  • This type of test notably makes it possible to define the genotoxicity of an environment and the nature of the action on DNA.
  • the product tested is DNA altered by a genotoxic whose activity we want to assess. You can also use the process according to the invention for, as it were, from a “determined alteration of known DNA”, to measure the activity of a repair system.
  • a cell extract which may or may not provide the ligand (in this case the ligand will be added).
  • we wish to test a possible deficiency in a repair system for certain cells biological samples for example
  • the present invention also relates to a method allowing the detection in a sample of an alteration of the DNA repair system, characterized in that: a) the sample is placed in the presence of a Altered DNA, b) the recognition of the alteration is revealed by a ligand of the repair system, c) the result obtained in step b) is evaluated with respect to a standard.
  • the standard could be, for example, a normal sample treated under equivalent conditions or any other method, in particular calibration curves.
  • alteration of the repair system is meant any modification of the response in the previous test of a repair system compared to a control system serving as a standard. This alteration will generally be characterized by a deficiency in the recognition of the altered DNA, but the opposite is also possible.
  • the method according to the invention may make it possible to demonstrate the presence or absence of proteins in relation for example with a determined pathology.
  • Such an application can be used to evaluate the resistance acquired to certain alkylating agents used in anti-tumor treatment in patients and this by measuring a defect in repairing mismatches (Eshlemen & Markowitz, 1995, Curr. Opin. Oncol. 7 , 83-89) or sensitivity or resistance to radiotherapy.
  • this same method according to the invention makes it possible to highlight alterations in the modulators of recognition of DNA ligands (such as antitumor agents interacting with repair factors).
  • the method according to the present invention can be implemented according to different variants.
  • the DNA tested can be a total cell extract, a semi-purified cell extract or a purified DNA, this will depend on the type of research carried out.
  • the recognition medium may be entirely synthetic or else be constituted by a cell extract, which may in particular also include the ligand, in this case the revelation will be carried out with a ligand binding marker, labeled antibody for example.
  • the recognition medium must include all the cofactors necessary for the recognition of the alteration.
  • the recognition medium consists of a cell extract which is more or less purified as regards the presence of endogenous ligand and DNA endogenous to said recognition medium.
  • the interaction of the ligand and the DNA may be demonstrated by any suitable method, in particular as has been specified, using a labeled ligand or using an antibody recognizing the ligand.
  • the labeling may or may not be radioactive.
  • non-radioactive labels that is to say fluorescent for example, or enzymatic labels.
  • step a) comprises compounds recognizing different types of alteration and in that in step b) the different types of recognition can be identified separately.
  • fluorescent markers it will thus be possible to use different chromophores. This allows you to immediately see the type of alteration or even the various alterations.
  • the method comprises the following steps: • the action, in the case of the use of a target DNA, of the agent (physical or chemical) to be tested on this DNA; in the case of a chemical agent, the action of the compound may require the concomitant action of an activating mixture of compounds (such as, for example, the biotransforming action of an “S9” type liver extract in the presence of all the necessary cofactors);
  • DNA purification from cells or tissues for which the degree of DNA damage is to be known for example monitoring of patients or people in contact with risky environments, incubation of cells in culture with agents including genotoxicity is to be determined; search for correlation between the state of alteration of cellular DNA and the presence or predisposition to certain diseases for example);
  • All of these steps can be carried out in the liquid phase or in the semi-solid phase by fixing one of the reagents to a support (microtiter plate, membrane or microbead, gel or agarose column or affinity column for example ); in the first case, a system which does not require washing between the different stages or a single-stage system will preferably be chosen; in the second case, the different stages are separated by washes.
  • a support microtiter plate, membrane or microbead, gel or agarose column or affinity column for example
  • the nature of the fixed reagent, ligand or DNA in particular may depend on the type of assay performed, assay of the extent of the lesion or assay of recognition.
  • TRACE-type systems can also be used in which one of the markers can only be revealed by the proximity of the second.
  • the test consists in incubating DNA (injured or not) both in the presence of an anti-DNA antibody and of a specific DNA alteration protein. Said protein can be directly coupled to a fluorophore or be revealed by an antibody.
  • each of the two ligands can be coupled to a fluorophore whose emission wavelengths differ sufficiently to be read simultaneously with good discrimination .
  • TRACE Time-Resolved Amplified Cryptate Emission
  • CIS bio international Bognols-sur-Sèze, France.
  • CIS Bio International XL665 or vice versa
  • label 2 proteins which only form a complex in the vicinity of the altered DNA.
  • This quantity of DNA can be obtained using the same system using for example two anti-DNA antibodies, one coupled to cryptate, the other to the energy acceptor fluorophore.
  • TRACE TRACE
  • speed since it is not necessary to carry out washing steps, but especially on the quantity of DNA (and therefore of lesions) analyzable by condition.
  • this system is fully automated, and is already suitable for HTS screening.
  • the purified alteration ligand is not available, or if this requires cofactors, protein or not, for the interaction step, it is then possible to use a purified cell extract so that these cofactors are present.
  • the interaction of the ligand with the alteration will be demonstrated using an antibody directed against this ligand.
  • This antibody can be coupled to a system making it possible to detect it, or a method known to those skilled in the art is used, which consists in using a second antibody directed against the first, this second antibody being coupled to a detection system. .
  • biochips type dosing systems, in particular the techniques developed by Affymetrix or CIS Bio International (Bagnols-sur-Séze, France). We can consider fixing the DNA on the chips:
  • An oligonucleotide or DNA containing a mismatch can make it possible to detect the presence of hMSH2 in a biopsy or in vivo and therefore the risk of developing cancer.
  • This method must be quantitative to discriminate healthy individuals homozygous from heterozygotes for the hMSH2 gene, predisposed to the development of cancers, in particular of the colon.
  • An oligonucleotide or DNA containing an adduct of a genotoxic agent used in chemotherapy could be used to monitor the level of XPA proteins and to monitor a certain type of resistance.
  • a genotoxic agent used in chemotherapy alkylating, cis-platinum, etc.
  • the method according to the present invention is more particularly usable for evaluating the genotoxicity of an environment on a sample by measuring the alteration of the DNA of said sample.
  • environment is meant to designate chemical, biological as well as physical factors (radiation for example).
  • the invention is particularly applicable to qualitative evaluation. and quantitative of lesions on the DNA of cells cultured in vitro, isolated ex vivo or derived from animal or plant tissues, for example application to the detection of genotoxic xenobiotics, to the therapeutic monitoring of patients with tumors subjected to chemotherapeutic treatment, application to follow up on. risks of people in contact with potentially genotoxic agents.
  • nucleophilic molecules DNA, lipid compounds, etc.
  • free radicals in particular in the field of cosmetics for example, similarly than in the qualitative and quantitative evaluation of compounds inhibiting the action of oxidizing agents.
  • the method allows the determination of the capacities of a cellular extract to recognize lesions as well as the determination of the type of lesions induced on the DNA through the use, ie of deficient cellular extracts in a part of the repair system. of these lesions, either specific proteins, or antibodies directed against specific proteins.
  • the present method based on the demonstration of a specific interaction of proteins involved in the repair of damaged DNA, has a large number of advantages:
  • the fixing of the target DNA can, for example, be done by one end (example: biotinylated DNA, support coupled to a biotin ligand, such than streptavidin);
  • the XP-A protein will preferably be used since it is the first to recognize a DNA damage.
  • this protein whose complementary DNA is cloned, can be expressed in a vector propagated in a microorganism and thus be produced in large quantities in a fermenter for example.
  • the XP-A protein and the RPA complex can also be co-incubated.
  • FIG. 1 Principle of the GeneTEX test (Gene Toxicology Environment Xenobiotics)
  • the GeneTEX test comprises 6 steps: 1- Adsorption of target DNA on a support, 2- generation of lesions by incubation with a genotoxic agent,
  • DNA is represented by a double helix, lesions by black circles, proteins for recognition of lesions by white ovals, and antibodies coupled to an enzyme carries a white rectangle.
  • Figure 2 Recognition of damage due to UVC by the XPA protein in a cell extract and detection by an anti-XPA monoclonal antibody
  • This graph represents the signal obtained (signal / background noise ratio) as a function of the increasing UVC doses.
  • Figure 3 Recognition of double-strand breaks induced by bleomycin by the Ku protein in a cell extract and detection by an anti-Ku monoclonal antibody
  • This graph represents the signal obtained (signal / background noise ratio) as a function of increasing concentrations of bleomycin.
  • Figure 4 Measurement of the persistence of double-strand breaks induced by the Ku protein in a cell extract and detection by an anti-Ku monoclonal antibody
  • + / + designates cells not mutated for the ATM gene +/- represents the mutated cells heterozygous for the ATM gene - / - designates the mutated cells homozygous for the ATM gene 12h and 24h represent the post-incubation times with IGy and 3Gy irradiation (Gray) define the irradiation doses
  • the whole of this test preferably takes place at 30 ° C. Each stage is separated by washes.
  • the target DNA is adsorbed on wells previously covered with the polylysine.
  • This DNA is subjected for the desired duration, preferably 30 minutes, to the action of a genotoxic agent or of a composition containing at least one such agent.
  • This step has the effect of generating lesions on the DNA, if the solution tested contains one (or more) genotoxic agent (s).
  • a cell extract preferably of human origin, preferably derived from HeLa cells, is incubated on DNA.
  • the DNA alteration recognition proteins will bind to the alteration sites.
  • An antibody, polyclonal or preferably monoclonal, directed against the alteration recognition protein is added and will recognize the proteins attached to the alteration sites.
  • a second antibody directed against the first antibody (preferably recognizing the species from which the first antibody is derived), coupled to an enzyme, preferably of the peroxidase type, is added and will recognize the first antibody.
  • an enzyme preferably of the peroxidase type
  • a luminescent substrate of the enzyme is added and the light signal emitted is quantified by a luminometer.
  • the antibody directed against the recognition protein can be directly coupled to a detection system, therefore requiring no secondary antibody.
  • This detection system can be an enzyme, a fluorescent marker or a time-resolved fluorescence marker (of the Europium chelate type), or an electrochemiluminescence marker.
  • the antibody directed against the alteration recognition protein is for example coupled to cryptate, and an anti-DNA antibody is coupled to XL665 (or the reverse), or 2 antibodies directed against 2 proteins forming a complex in the vicinity of the altered DNA are used.
  • the 2 antibodies being sufficiently close, the energy transfer between the excited Europium cryptate and the acceptor XL665 will be possible and the fluorescent signal emitted is proportional to the level of antibodies fixed on the protein for recognition of alterations.
  • Example 1 Detection of lesions on DNA recognized by the NER system
  • the DNA (plasmid pUC18), at a concentration of 50 ⁇ g / ml, was injured by UVC by irradiation under a 254nm light lamp at 50 ⁇ W / cm 2 for the time necessary to obtain doses varying from 5 to 200J / m 2 .
  • the DNA taken from the UVC was adsorbed on wells covered with poly-lysine, at a rate of 50 ng per well.
  • DNA carrying oxidative lesions (lesions generated by illumination in the presence of methylene blue), repaired by the BER system were used.
  • Manley-type cell extract [Manley et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 3855-3859], modified by Wood [Wood et al. (1988) Cell, 53, 97-106] for 90 minutes at 30 ° C in a buffer containing 40mM Hepes; 5mM MgCl 2 ; 50mM KCl; 0.5mM DTT; 10MM phosphocreatine; 0.1 mg / ml BSA; 50 ⁇ g / ml creatine phosphokinase; 2mM EGTA; pH 7.6. The wells were then washed twice with a PBS solution added with 0.1% Tween-20.
  • the binding of the XPA protein was revealed by incubation of an anti-XPA monoclonal antibody diluted to 900 ng / ml in PBS supplemented with 0.1% BSA and Igepal CA-630 (sold by Sigma) for 2 hours at 30 °. C, with stirring.
  • the primary anti-XPA antibody was then recognized by a secondary goat anti-mouse antibody, coupled to peroxidase, diluted 1 / 10,000 in the same buffer as the primary antibody in a 30-minute incubation.
  • a luminescent substrate of the peroxidase (Specichrom, sold by Speci, Ste Foy-les-Lyon, France) is then added and the whole was incubated for 15 minutes at 30 ° C. with shaking.
  • the light signal emitted was measured by a Victor (Wallac oy, Turku, Finland).
  • the result is expressed as the specific signal ratio to the signal of the untreated plasmid and an example result is given in FIG. 2. It is thus shown, at this stage of development of the test, a detection threshold of 30 J / m 2 for UVC lesions.
  • Example 2 detection of double-strand breaks on DNA This type of breaks, generating an increase in the number of DNA fragments and therefore of ends, is detected by the Ku-DNA PK complex. The fixing on the ends is ensured by the Ku sub-unit (Ku70-Ku80).
  • double-strand breaks have been generated by a radiomimetic molecule, bleomycin, in the presence of ferrous ions: in this case there is production of double-strand breaks as in the case of treatment with ionizing radiation.
  • the DNA (plasmid pUC18) was adsorbed on wells covered with poly-lysine, at a rate of 50 ng per well.
  • the wells were washed twice with a PBS solution supplemented with 0.1% Tween-20.
  • bleomycin from 0 to 200 ⁇ M were incubated for 30 minutes with the adsorbed DNA, in the presence of 0.5 ⁇ M of FeCl 2 , with shaking at 30 ° C.
  • the wells were then washed twice with a PBS solution added with 0.1% Tween-20.
  • the wells were then saturated with a 3% BSA solution in PBS for 1 hour at 30 ° C, with stirring.
  • the wells were then washed once with a PBS solution added with 0.1% Tween-20.
  • Manley-type cell extract [Manley et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 3855-3859], modified by Wood [Wood et al. (1988) Cell, 53, 97-106] for 90 minutes at 30 ° C in a buffer containing 40mM Hepes; 5mM MgCl 2 ; 50mM KCl; 0.5mM DTT; 10MM phosphocreatine; 0.1 mg / ml BSA; 50 ⁇ g / ml creatine phosphokinase; 2mM EGTA; pH 7.6.
  • the wells were then washed twice with a PBS solution added with 0.1% Tween-20.
  • the binding of the Ku complex was revealed by incubation of an anti-Ku monoclonal antibody diluted to 400 ng / ml in PBS supplemented with 0.1% BSA and Igepal CA-630 (sold by Sigma) for 2 hours at 30 ° C. , with stirring.
  • the wells were then washed 3 times with a PBS solution added with 0.1% Tween-20.
  • the primary anti-Ku antibody was then recognized by a secondary goat anti-mouse antibody, coupled to peroxidase, diluted 1 / 10,000 in the same buffer as the primary antibody in a 30-minute incubation.
  • the light signal emitted was measured by a Victor (Wallac oy, Turku, Finland).
  • the result is expressed as the specific signal ratio to the signal of the untreated plasmid and an example result is given in Figure 3.
  • MIS-C 5 1 ATGTGAATCAGTATGGTTCCTATCTGCTGAAGGAAAT 3 '
  • the oligonucleotides are solubilized at 1 mg: ml in TE1X.
  • the pairing is carried out in 200 ⁇ l, at 400 ⁇ g / ml of each oligo, in the presence of 1M NaCl
  • the tubes are brought to 100 ° C. for 10 minutes in a thermocycler and left to cool for 3 hours.
  • the DNA is then precipitated by adding 2.5 volumes of absolute ethanol, kept overnight at -20 ° C, then centrifuged at 14,000 rpm at 4 ° C for 40 minutes. After washing the pellets in 70% ethanol and drying, the pellets are taken up in 1.5 ml of TE IX (at a final concentration of 100 ⁇ g / ml).
  • MIS-C + MIS-Grev hybridization leads to normally paired double-stranded DNA (C: G) while MIS-C + MIS-T hybridization leads to double-stranded DNA with mismatch (C: T) .
  • the DNA was adsorbed on wells covered with poly-lysine, at the rate of 200 ng per well. After a 30-minute incubation, the wells were washed twice with a PBS solution supplemented with 0.1% Tween-20.
  • Manley-type cell extract [Manley et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 3855-3859], modified by Wood [Wood et al. (1988) Cell, 53, 97-106] for 90 minutes at 30 ° C in a buffer containing 40mM Hepes; 5mM MgCl 2 ; 50mM KCl; 0.5mM DTT; 10MM phosphocreatine; 0.1 mg ml BSA; 50 ⁇ g / ml creatine phosphokinase; 2mM EGTA; pH
  • hMSH2 The binding of hMSH2 was revealed by incubation of an anti-hMSH2 monoclonal antibody diluted to 2 ⁇ g / ml in PBS supplemented with 0.1% BSA and Igepal CA-630 (sold by Sigma) for 2 hours at 30 ° C., under agitation. The wells were then washed 3 times with a PBS solution added with 0.1% Tween-20.
  • the primary anti-hMSH2 antibody was then recognized by a secondary goat antibody, anti-mouse, coupled to peroxidase, diluted 1 / 10,000 in the same buffer as the primary antibody in a 30-minute incubation.
  • the wells were then washed 5 times with a PBS solution supplemented with 0.1% Tween-20.
  • a luminescent substrate of peroxidase (Specichrom, sold by Speci,
  • the specific signal ratio (oligonucleotide carrying a mismatch; T: G) on the signal of the oligonucleotide carrying no mismatch (C: G) was 5.
  • Lymphoblastoid cells obtained from healthy patients, heterozygous or homozygous for the ATM gene (Ataxia telangectasia; leading to hypersensitivity to ionizing radiation), in culture were irradiated at doses of 0;
  • the doses of 1 and 3 Gy have the effect of generating double-strand breaks in the DNA which will be detected by means of the recognition of the Ku-DNA PK complex as described in Example 2.
  • the cells are then cultured in a suitable medium for 12 and 24 hours, at which time they are washed and frozen at -80 ° C. They are then lysed and the genomic DNA adsorbed on the wells as in the previous examples.
  • Manley-type cell extract [Manley et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 3855-3859], modified by Wood [Wood et al. (1988) Cell, 53, 97-106] for 90 minutes at 30 ° C in a buffer containing 40mM Hepes; 5mM MgCl; 50mM KCl; 0.5mM DTT; 10MM phosphocreatine; 0.1 mg / ml BSA; 50 ⁇ g / ml creatine phosphokinase; 2mM EGTA; pH 7.6. The wells were then washed twice with a PBS solution added with 0.1% Tween-20.
  • the binding of the Ku complex was revealed by incubation of an anti-Ku monoclonal antibody diluted to 100 ng / ml in PBS supplemented with 0.1% BSA and Igepal CA-630 (sold by Sigma) for 2 hours at 30 ° C. , with stirring. The wells were then washed 3 times with a PBS solution added with 0.1% Tween-20.
  • the primary anti-Ku antibody was then recognized by a secondary goat anti-mouse antibody, coupled to peroxidase, diluted 1 / 10,000 in the same buffer as the primary antibody in a 30-minute incubation. The wells were then washed 5 times with a PBS solution supplemented with 0.1% Tween-20.
  • a luminescent substrate of the peroxidase (Specichrom, sold by Speci, Ste Foy-les-Lyon, France) is then added and the whole was incubated for 15 minutes at 30 ° C. with shaking.
  • the light signal emitted was measured by a Victor (Wallac oy, Turku,
  • test is in particular applicable to the measurement of the radiosensitivity of cells originating from patients.
  • we can discriminate patients homozygotes ATM, heterozygotes ATM and patients not carrying a mutation in this gene.
  • the DNA (plasmid pUC18) was sampled using UVC or cis-platinum as described in Example 1.
  • the DNA pretreated with UVC or cis-platinum was adsorbed on wells covered with poly-lysine, at the rate of 50 ng per well.
  • DNA carrying oxidative lesions (lesions generated by illumination in the presence of methylene blue), repaired by the BER system were used.
  • TBS solution Tris buffer saline
  • the wells were then washed once with a TBS solution supplemented with 0.1% Tween-20.
  • the treated DNA was then incubated with a Manley-type cell extract.
  • the binding of the XPA protein was revealed by incubation of an anti-XPA monoclonal antibody diluted to 500 ng / ml in TBS supplemented with 0.1% BSA and Igepal CA-630 (sold by Sigma) for 2 hours at 30 °. C, with stirring.
  • This antibody was previously labeled with an average of 10 Europium chelates (Eu J + ) according to the Wallac protocol.
  • the wells were then washed 8 times with a TBS solution supplemented with 0.1% Tween-20.
  • the result is expressed as the specific signal ratio to the signal of the untreated plasmid and is similar to the result shown in FIG. 1. It is thus shown, at this stage of test development, a detection threshold also of 30 J / m 2 for UVC lesions.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de mise en évidence d'une altération d'une séquence d'ADN, caractérisé en ce que: a) on met ladite séquence d'ADN en présence d'une composition comportant au moins un composé reconnaissant le type d'altération en cause, dénommé ligand, dans un milieu assurant la reconnaissance, b) on révèle la reconnaissance de l'altération par ledit ligand. Application à la mise en évidence des propriétés génotoxiques d'un environnement par mesure de l'altération que l'environnement produit sur l'ADN de l'échantillon, ainsi que la mise en évidence d'une altération du système de réparation de l'ADN.

Description

PROCEDE DE DETECTION QUALITATIVE ET QUANTITATIVE D'ALTERATIONS DE L'ADN ET DES LIGANDS DE CES ALTERATIONS
La présente invention a pour objet un procédé de détection qualitative et quantitative d'altérations sur de l'Acide DésoxyriboNucléique (ADN), ces altérations pouvant être dues au métabolisme de la cellule ou à des agents physiques ou chimiques, endogènes ou exogènes, ainsi qu'un procédé de détection qualitative et quantitative de de ligand(s) reconnaissant de l'ADN altéré.
La définition la plus satisfaisante (parmi les nombreuses controversées) de la génotoxicité est une définition générale qui envisage l'apparition d'altérations physiques ou chimiques de l'ADN dues à une action directe de l'agent génotoxique ou d'un métabolite, ainsi que ses conséquences biologiques (Butterworth, 1990, Mutât. Res., 239. 117-132 ; Ashby, 1992, Mechanism of Carcinogenesis in risk identification, Vainio H., Magee P.N., McGregor D.B. & McMichael A.J. (eds) IARC, Lyon, 135- 164). Parmi les génotoxiques, de nombreuses molécules ou agents physiques sont susceptibles d'induire l'apparition de mutations, lesquelles sont détectées par différents systèmes bactériens ou eucaryotes. Le système de détection des mutagènes le plus généralement utilisé est celui décrit par B.N. Ames (Ames et al., 1973, Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 70, 2281-2285), complété par le test dit du micronoyau (Mac Grégor et al., 1987, Mutât. Res., 189., 103-112). Puisque la mutagénèse semble être dans de nombreux cas la conséquence de la présence de lésions (dues en particulier à des agents génotoxiques), de nombreux systèmes capables de détecter et quantifier ces dommages à l'ADN ont été développés. La détection de lésions de l'ADN fait appel à des techniques physico-chimiques comme le post-marquage (Randerath et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 6126-6129), l'élution alcaline ou neutre (Kohn et al., 1976, Biochemistry, 15, 4629-4637), des techniques immunologiques (Philips D.H., Chemical-carcinogenesis and mutagenesis, vol. I, 503-546, Springer Verlag, Heidelberg, 1990, Cooper and Grover (eds), ou fait appel aux conséquences d'événements de réparation de ces lésions comme l'essai des Comètes (Singh et al.,1988, Exp. Cell Res., 175. 184-191). Certains essais utilisent la capacité de réparation des lésions de la cellule dont le mécanisme fait intervenir une étape de synthèse d'ADN de novo. Cette étape de polymérisation d'ADN peut être quantifiée en utilisant des nucléotides radio-marqués (Cleaver, 1984, Methods for studying excision-repair of eukariotic DNA damaged by physical and chemical mutagens (Kilbey B.J., Nichols W. & Ramel C, eds) 33-69, Elsevier, Amsterdam). Cet essai a été dénommé UDS (Unscheduled DNA Synthesis) et utilisé pour la détection de génotoxique ou pour l'évaluation des capacités de réparation de cellules. Ce test UDS a été perfectionné dans le sens d'une non utilisation de marqueur radioactif (Selden et al., 1994, Mutation Res., 3J_5, 147-167) mais ce perfectionnement est relativisé du fait de l'utilisation de la cytométrie de flux qui alourdit la méthode.
La réparation de l'ADN est majoritairement due au système d'excision des lésions, système qui a été récemment reproduit avec des extraits cellulaires (Wood et al., 1988, Cell, 53, 97-106 ; Sibghat-UUah et al., 1989, Nucleic Acids Res., 17, 4471- 4484). Cet essai utilise des plasmides traité et non traité (contrôle) incubés en présence d'extraits actifs transcriptionnellement (Manley et al., 1983, Meth. Enzymol., 1O1, 568- 582). La réaction de réparation consiste dans l'incision-excision des lésions puis la resynthèse d'un fragment d'ADN. La méthode tire profit de cette étape au cours de laquelle un ou des nucléotides radio-marqués est (sont) incorporé(s). Deux grands mécanismes sont impliqués dans la restauration des dommages de l'ADN : l'excision de nucléotides (NER) et l'excision de bases (BER). Ces 2 mécanismes seront décrits plus loin. Dans le cas de ce test in vitro, la réparation des lésions par NER ne concerne qu'un faible pourcentage des lésions, de l'ordre de 7%.
Ces essais ne sont pas applicables à une large application de criblage ou dans un sens plus large de recherche industrielle pour différentes raisons : (i) le nombre d'échantillons traitables simultanément (de l'ordre de quelques dizaines) est trop faible, (ii) le temps requis pour l'analyse (environ 2 jours) est relativement long, (iii) l'utilisation de molécules radio-marquées restreint ce test à des laboratoires agréés, (iv) le test est restreint à l'utilisation d'ADN plasmidique hautement purifié (forme surenroulée).
Tenant compte de ces contraintes, un nouvel essai de synthèse réparatrice in vitro susceptible de pallier les inconvénients des autres systèmes avait été développé, en autorisant l'analyse simultanée de plus de 100 échantillons en 5 heures, avec un système de détection non radioactif. Cette méthode, autorisant également l'utilisation d'ADN de différentes natures, a fait l'objet d'une demande de brevet français n° 95 03230 du 15 mars 1995 et d'une demande PCT n° PCT FR 96/00391 du 13 mars 1996, publiée sous le n° WO 96 28571 le 19 septembre 1996.
D'autres techniques assez similaires ont pour objet la détection directe de l'ADN endommagé, mais aucune ne porte sur la détection des systèmes de réparation liés à l'ADN lésé. Par exemple, la détection quantitative des altérations de l'ADN par incorporation de nucléotides marqués radioactivement est décrite dans les demandes de brevet n° WO 96 24688 et WO 96 23895 et dans les articles suivants : Salles B. et al. In vitro eukaryotic DNA excision repair assays; an overview; Biochimie, vol. 77, n° 10, 1995 ; Calsou P. et Salles B. Measurement of Damage-specific DNA incision by nucleotide excision repair in vitro; Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 202, n° 2, 29 juillet 1994 ; Calsou P. et Salles B. Properties of damage-dependent DNA incision by nucleotide excision repair in hu an cell-free extracts, Nucleic Acis Research, vol. 22, n° 23, 1994 ; Salles B. et Calsou P. Rapid quantification of DNA repair synthesis in cell extracts, Analytical Biochemistry, vol. 215, 304-306, 1993.
La demande de brevet n° WO 96 24688 concerne notamment l'utilisation d'anticorps anti-ADN modifié et l'article de Salles B. et al. (A Chemiluminescent microplate assay to detect DNA damage induced by genotoxic treatements, Analytical Biochemistry, vol. 232, 37-42, 1995) porte sur l'incorporation de DIG-11-dUTP et l'utilisation d'anticorps anti-DIG-1 1-dUTP pour la détection des lésions.
Parmi les documents de l'art antérieur, aucun ne décrit, ni ne suggère, la présente invention telle que définie ci-dessous.
Description de l'invention
Ainsi, la présente invention a pour objet un procédé de mise en évidence d'une altération d'une séquence d'ADN qui puisse assurer une détection de l'ensemble des altérations de l'ADN grâce à une méthode dont la mise en oeuvre soit relativement simple.
Pour ce faire, la présente invention propose un procédé de mise en évidence d'une altération d'une séquence d'ADN, caractérisé en ce que : a) on met ladite séquence d'ADN en présence d'une composition comportant au moins un composé reconnaissant le type d'altération en cause, dénommé ligand, dans un milieu assurant la reconnaissance, b) on révèle la reconnaissance de l'altération par ledit ligand.
Par reconnaissance de l'altération par ledit ligand, on entend que l'on détecte la fixation directe ou indirecte du ligand sur l'ADN endommagé. Il peut s'agir d'une fixation indirecte lorsque le ligand fait partie d'un complexe par exemple. Par altération, on entend tout d'abord les dommages de l'ADN. Ceux-ci peuvent être d'origine physique (par exemple radiation ionisante ou non, thermique) ou chimique. Ces facteurs endommageant l'ADN peuvent être d'origine exogène ou endogène. Les types de lésions générés sur l'ADN peuvent grossièrement être classés en 5 types : • les adduits (complexation généralement covalente, mais pouvant faire appel à un autre type de liaison chimique comme la liaison de coordination d'une molécule sur une base de l'ADN), • les pontages de bases (réalisés par apport d'énergie, le type le plus connu étant retrouvé dans les dimères de bases pyrimidiques formés sous l'action de rayonnement UVC ou UNB),
• la complexation de bases de l'ADΝ à des protéines (ce type de complexation, le plus souvent covalent, étant également la conséquence d'un apport d'énergie),
• les dommages oxydatifs engendrant des modifications de la structure de l'ADΝ sous forme de cassures ou délétions de bases, cassures du désoxyribose, cassures de la liaison phosphodiester, etc.),
• les cassures causées par les rayonnements ionisants (comme certains rayonnements radioactifs).
En plus de ces dommages, d'autres altérations de l'ADΝ peuvent survenir. Lors de la réplication de l'ADΝ, la polymérase impliquée dans ce processus se doit de synthétiser le nouveau brin en appariant correctement les nouvelles bases au brin matrice selon le modèle A-T, G-C. Un mauvais appariement (« mismatch ») constitue une altération de l'ADΝ. Ce mésappariement peut être naturel (dû à une erreur statistique de la polymérase) ou être la conséquence d'une drogue qui va perturber l'activité de l'enzyme.
Le procédé selon la présente invention permet de détecter aussi bien les « dommages de l'ADΝ » que les « mésappariements ». Face à toutes ces altérations, la cellule possède heureusement un arsenal enzymatique lui permettant de rétablir l'ADΝ dans sa forme normale. Ces mécanismes sont regroupés sous l'appellation générale de « réparation de l'ADΝ ». Selon le type d'altération, 5 mécanismes principaux interviennent : l'excision de nucléotides, l'excision de bases, le système de réparation des mésappariements, la réparation des cassures simple brin d'ADN et la réparation des cassures double brin d'ADN.
Ces mécanismes ont en commun de faire appel dans une première étape à une reconnaissance de l'altération. C'est précisément grâce à l'existence de composés, notamment des protéines, intervenant au niveau de la reconnaissance de l'altération, appelées ci-après « ligand », que le procédé selon la présente invention a pu être développé.
C'est pourquoi, dans un mode de mise en oeuvre préféré du procédé selon la présente invention, le ligand révélé sera, de préférence, une protéine de reconnaissance du système de réparation de l'ADN.
Par « système de réparation », on entend désigner aussi bien les systèmes de réparation de PADN endommagé que les systèmes de réparation des mésappariements. Enfin, par « protéine de reconnaissance », on entend aussi bien la protéine assurant la reconnaissance primaire de l'altération qu'une protéine impliquée dans cette reconnaissance, notamment lorsqu'il y a formation d'un complexe (par exemple XP-A, RPA ou TFIIH notamment).
Parmi les protéines en cause, il faut citer :
• les protéines du système NER, • les protéines du système BER,
• les protéines de réparation des mésappariements,
• les protéines des systèmes détectant les cassures de l'ADN, qu'il soit double ou simple brin.
Le système de réparation par excision de nucléotides (Nucleotide Excision Repair : NER) est le mécanisme reconnaissant le plus large spectre de lésions sur l'ADN, ces lésions étant principalement constituées d'adduits encombrants.
La réparation par NER est classiquement décomposée en 4 étapes : reconnaissance de la lésion (1) ; excision de la lésion (2) ; resynthèse du fragment excisé (3) ; ligation du brin néosynthétisé (4). Le mécanisme de reconnaissance des lésions réparées par NER n'est pas encore clairement défini mais il est par contre clairement établi que la protéine XP-A est impliquée (en association ou non avec la protéine RPA et éventuellement le complexe transcriptionnel TFIIH) dans l'un des premiers stades de reconnaissance.
XP-A est la protéine pour laquelle les patients du groupe A de Xeroderma pigmentosum sont déficients. L'absence d'une protéine de réparation de NER rend ces malades très sensibles aux rayonnements UV qui, selon la longueur d'onde, génèrent sur l'ADN des dommages réparés par NER, la forme XP-A étant la forme la plus sévère.
La protéine XP-A est une protéine en doigt de zinc (structure classique de protéines interagissant avec l'ADN) constituée de 273 acides aminés et traduite à partir d'un ARN messager de 1,4 kb (Tanaka K. et al, 1990, Nature, 348, 73-76).
XP-A reconnaît (avec une préférence d'un facteur 1000 par rapport à un ADN non lésé) les dommages générés par les UVC (environ 75% de dimères de pyrimidine sous forme cyclobutane, 25% de dimères de pyrimidine sous forme de photoproduits (6-4)). Seuls ces types de lésions ont été analysés dans cette étude (Robins P. et al., 1990, EMBO J., 10. 3913-3921). Ces auteurs ont également générés des anticorps polyclonaux contre 2 peptides synthétiques de la protéine XP-A et déterminé que la protéine XP-A ne nécessite pas de phosphorylation pour être active.
En utilisant des colonnes de chromatographie constituées soit d'agarose couplé à de l'ADN simple brin ou de la cellulose couplée à de l'ADN irradié aux UVC, ou en incubant différents types d'ADN (simple ou double brin, lésé aux UVC ou non)
Eker et al. concluent que la protéine XP-A extraite de thymus de veau ou de cellule
HeLa présente une affinité plus forte pour l'ADN simple brin que pour l'ADN double brin, mais pas de préférence pour l'ADN lésé aux UVC (Eker et al., 1992, Mutation Res., DNA 274. 211-224). Ces auteurs ont également générés des anticorps polyclonaux contre la protéines XP-A recombinante.
Les résultats obtenus par Tanaka et al. ont été complétés en 1993 à l'aide d'une protéine XP-A recombinante. Il a été confirmé que XP-A reconnaît bien les lésions UVC et principalement les photoproduits (6-4), ainsi que les lésions dues à l'agent antitumoral cis-platine (c/'_.-diamine-dichloroplatinum (II)). Un fragment d'ADN simple brin est 4 fois plus efficace dans une compétition envers un ADN lésé aux UVC vis-à-vis de XP-A qu'un ADN double brin. Par contre, ces auteurs n'ont pas pu mettre en évidence d'affinité de XPA vis-à-vis d'un ADN contenant des adduits issus de psoralène photoactivé (Jones C.J. & Wood R.D., 1993, Biochemistry, 32, 12096- 12104).
A la reconnaissance des lésions dues aux UVC ainsi qu'à celles dues au cis- platine, Asahina et al. ont ajouté en 1994 les lésions dues au tétroxyde d'osmium (Asahina H. et al., 1994, Mutation Res., DNA Repair, 315, 229-237).
Le clonage des gènes codant pour XP-A chez le poulet, le xénope et la drosophile (chez laquelle il a été appelé Dxpa) montre une forte conservation de ce gène de l'évolution chez les eucaryotes (T. Shi amoto et al., 1995, J. Biol. Chem., 270. 22452-22459). L'excision de bases apparaît normale dans les cellules XP (Cleaver J.E. &
Kraemer K.H.,1989, The metabolic basis of inherited disease, ed.Scriver C.R., Beaudet AL., Sly W.S. & Valle D. (McGrall-Hill, New York), 6"' Ed., 2949-2971), ce qui confère à XP-A la spécificité de reconnaissance des lésions réparées par NER. Toutefois, en utilisant des ADN lésés par un rayonnement γ ou par les radicaux hydroxyles générés par décomposition de l'eau oxygénée, traités de façon à ce qu'ils ne soient plus reconnus par le système de réparation par excision de bases, Satoh et al. montrent l'implication de XP-A (ainsi que XP-B et XP-C, deux autres sous-groupes de Xeroderma pigmentosum qui en compte sept nommés XP-A à XP-G), dans la réparation de certaines classes de lésions induites par des radicaux libres oxygénés (Satoh M.S. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 6335-6339). Le type de substrat utilisé pour mettre en évidence l'implication de protéines du groupe XP dans ce processus de réparation étant totalement artificiel, ces résultats doivent être pris avec précaution.
Enfin, il a été montré par la technique du double hybride ou par des techniques immunologiques plus classiques que la protéine XP-A (recombinante) se liait à la protéine RPA (Replication Protein A, également appelée Human Single-Stranded DNA Binding protein, HSSB). Il n'a toutefois pas été montré dans ces expériences que cette association était impliquée dans la réparation par excision de nucléotides (Matsuda T., 1995, J. Biol. Chem., 270, 21800-21805).
Il faut ajouter le rôle potentiel des protéines HMG (High Mobility Group). Ces protéines interviennent lors de lésions provoquées par le cis-platine, agent utilisé en chimiothérapie (Hughes et al., 1992, J. Biol. Chem. 267 ; 13520-13527). Quatre protéines HeLaS3 spécifiques des adduits provoqués par le cis-platine ont été mises en évidence (Donahue et al., 1990, Biochemistry, 29, 587-5880 ; Andrews et Jones, 1991, Cancer Comn. 3, 1-10 ; Hughes et al., 1992, J. Biol. Chem., 267, 13520-13527). Le séquençage de la partie N terminale de deux de ces protéines a révélé une forte homologie avec les protéines HMG2 et HMG1. De même, la liaison covalente de sel de chrome sur l'ADN induit des adduits reconnues par HMG1 et HMG2 in vivo. L'affinité des HMG est dose/dépendante vis-à-vis du sel de chrome (Wang et al., 1997, Carcinogenesis, 18, 371-375).
Cependant, leur rôle exact dans la réparation de l'ADN n'a pas encore été établi (pas de reconnaissance en particulier de lésions provoquées par les UV).
Dans la mise en oeuvre du procédé selon la présente invention, on utilisera de préférence la révélation de la protéine XP-A ou des protéines apparentées ainsi qu'éventuellement les protéines RPA, TFIIH et HMG ou d'autres protéines du complexe. Selon la nature du ligand détecté, on pourra, en outre, envisager de mieux définir le type de génotoxique en cause. En effet, XP-A reconnaît des adduits volumineux et correspond à de nombreux génotoxiques mais ne reconnaît pas des adduits non volumineux et des liaisons oxydatives.
La réparation par excision de bases (BER) est moins bien connue que la réparation par excision de nucléotides (NER). La raison principale réside dans l'absence de mutants pouvant servir à la recherche de gènes impliqués dans ce mécanisme puisqu'il n'existe pas de maladie identifiée comme résultant d'un déficit en BER.
La réparation par excision de bases intervient sur les bases de l'ADN lésées par des espèces réactives oxygénées endogènes, des radiations ionisantes et des agents alkylants. Pour simplifier, le BER intervient sur des dommages peu volumineux au contraire du NER qui reconnaît les dommages volumineux.
Les enzymes clés du BER sont les glycosylases qui enlèvent les bases modifiées par clivage de la liaison N-glycosidique entre la base et le désoxyribose. Il existe différentes glycosylases reconnaissant différents types de dommages. A ce jour, on a identifié une dizaine de ces enzymes chez Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae et chez l'homme (Seeberg et al., 1995, TIBS, 20, 391-397). Une fois la base enlevée, le site AP (apurinique ou apyrimidique) est excisé par une AP-endonucléase ou une AP-lyase qui clivent le brin d'ADN respectivement du côté 5' ou 3' du site AP. Le désoxyribose-phosphate restant est excisé par une phosphodiestérase et la resynthèse du brin d'ADN est restaurée par une DNA polymérase. La continuité du brin est ensuite restaurée par une DNA ligase.
Il a été longtemps admis que c'était la polymérase β qui était impliquée dans la resynthèse du brin d'ADN dans le BER. Or, il a été récemment montré sur des extraits cellulaires d'hamster (CHO) que 2 mécanismes différents pouvaient réparer des petits adduits dus à des alkylants. L'un implique la polymérase β, l'autre présente certaines similitudes avec le NER puisque faisant intervenir le PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen ; facteur intervenant dans le NER) (Frosina et al., 1996, J. Biol. Chem., 271, 9573-9578). Les dommages à l'ADN dus aux UVA sont vraisemblablement réparés par BER. En effet, des cellules d'une lignée XP-D ne montrent pas de différence de comportement, par rapport à une lignée sauvage, en terme de courbe de survie suite à une irradiation UVA (320-410 nm) dont les dommages sont de type oxydatif, donc réparés par BER, alors qu'elles sont hypersensibles aux UVB (307-312 nm) et UVC (254 nm) (Stary et al., 1997, Mutation Res., 383, 1-8).
La poly(ADP-ribose) polymérase, ou PARP, impliquée dans la réparation des cassures simple brin est également impliquée dans l'étape finale de ligation de la réparation par BER (Kubota et al., 1996, EMBO J. 15, 6662-6670).
Les mésappariements de bases peuvent survenir au cours de la réplication, la recombinaison ou suite à des dommages sur l'ADN.
Le mécanisme de réparation des mésappariements est bien connu chez la bactérie E. coli. Le système MutHLS a ainsi été reconstitué in vitro : il est composé des protéines MutH, MutL, MutS et UvrD (ou hélicase II). Le mécanisme est complété par la DNA polyméase III, la DNA ligase et la SSB (Single-Stranded DNA Binding protein) et une exonucléase spécifique de simple brin (Exo I, Exo VII ou la protéine RecJ (Friedberg et al., 1995, DNA repair and Mutagenesis, ASM Press). La protéine MutS reconnaît le mésappariement et MutH est une endonucléase. Aucune activité n'a pour l'instant été attribuée à MutL, bien qu'elle interagisse avec MutS et soit nécessaire à l'activation de MutH.
Plusieurs données semblent montrer qu'il existe chez l'homme l'homologue du système MutHLS, en particulier la purification d'homologues à MutL (appelé hMLHl) et MutS (appelé hMSH2). hMSH2 reconnaît à la fois les mésappariements de simple base (comme MutS) mais également des mésappariements plus complexes dus à de multiples délétions/insertions (Fishei et al., 1994, Science, 266, 1403-1405 ; Alani et al., 1995, Gènes Dev., 9, 234-247). Il a de plus été montré récemment que hMSH2 peut être copurifié avec une protéine de 160 kD, appelée GTBP (G/T Binding Protein) (Drummond et al., 1995, Science, 268, 1909-1912 ; Palombo et al., 1995, Science, 268, 1912-1914), mais le rôle de cette GTBP n'est pas clairement élucidé. De la même façon, hMLHl semble être associée à une autre protéine, hPMS2, et former un hétérodimère appelé hmutLα (Li & Modrich, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 1950-1954).
Une déficience dans ce mécanisme de réparation des mésappariements est clairement corrélée à une prédisposition à des cancers, en particulier au cancer du colon non polypeux héréditaire (HNPCC). C'est le cas lors de mutations de hMSH2 (Fishel et al., 1993, Cell, 75, 1027-1038 ; Leach et al., 1993, Cell, 75, 1215-1225) ou de hMLHl (Bronner et al., 1994, Nature, 368, 258-261 ; Papadopoulos et al., 1994, Science, 263. 1625-1629.
Les protéines Mut, notamment MutS ou HMSH2, constituent les cibles de choix pour la mise en oeuvre du procédé selon la présente invention.
L'intérêt de la recherche de ce type de ligand réside dans la caractérisation d'extraits cellulaires (biopsie ou directement in vivo). En effet, une déficience du système HMSH2 est, en général, associée à un risque accru de développements de cancers. Les dommages à l'ADN de type cassures simple brin peuvent être induites par des agents alkylants ou des radiations ionisantes. Ces cassures sont immédiatement reconnues dans la cellule par la poly(ADP-ribose) polymérase, ou PARP.
Cette enzyme est présente en très forte quantité (de l'ordre du million de molécules) dans les noyaux des cellules eucaryotes (à l'exception de la levure). L'étude de la séquence nucléotidique a montré que cette protéine possède 2 domaines, un domaine N-terminal contenant 2 doigts de zinc et se fixant à l'ADN, et un domaine C-terminal à fonction catalytique (Cherney et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 8370-8374).
La reconnaissance de la coupure se fait en recouvrant 7-8 nucléotides de chaque côté de la coupure (Gradwohl et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87. 2990-2994).
Lorsqu'elle est fixée sur une coupure simple brin d'ADN, l'activité catalytique de la PARP est activée. La PARP produit du poly(ADP)ribose) en employant comme substrat la nicotinamide adénine dinucléotide (NAD). La durée de vie de la chaîne de poly(ADP-ribose est normalement très courte, de l'ordre de quelques minutes. Il est possible de bloquer la réaction à l'étape d'interaction ADN-PARP en inhibant la synthèse de poly(ADP)ribose à l'aide d'un analogue structural du NAD, le 3-aminobenzamide (Prigent et al., 1994, Mol. Cell.
Biol., H, 310-317).
PARP ne participe pas à la réparation de l'ADN mais protège la cassure d'endonucléases. Il a en particulier été montré que la PARP n'intervient pas dans le mécanisme NER (Molinette et al., 1993, EMBO J., 12, 2109-2117 ; Aboussekhra et al.,
1995, Cell, 80, 859-868).
Si un rôle dans la reconnaissance des cassures simple brin de l'ADN est bien établie pour la PARP, son rôle physiologique est moins clair. Il a été proposé qu'elle pourrait par exemple avoir un rôle dans le déclenchement de l'apoptose, par différentes voies mais εn particulier en épuisant le stock cellulaire de NAD. La PARP pourrait protéger la stabilité génomique de la cellule en évitant de trop fréquents événements de recombinaison aux sites de cassures. Elle pourrait également intervenir dans l'ouverture de zones de chromatine en interférant avec les histones (revu par Lindahl et al., 1995,
TBS, 20. 405-411). Les cassures double brin de l'ADN sont créées en particulier par les radiations ionisantes, mais peuvent provenir d'origine endogène comme dans certaines réactions de recombinaison.
Une mauvaise réparation ou une absence de réparation de ces lésions peut être très délétère car pouvant engendrer des délétions ou des translocations ayant pour conséquences possibles l'inactivation d'un gène.
Chez les mammifères, 4 groupes de complémentation ont été identifiés pour la réparation des cassures double brin, définissant 4 gènes impliqués dans ce processus
(revu par Jackson & Jeggo, 1995, TBS, 20. 412-415). Parmi ces 4 groupes (IR4-7 ; IR pour Ionizing Radiation), les groupes IR5 et IR7, dont les produits sont XRCC5 et XRCC7 (X-ray Repair Cross-Complementing), nous intéressent plus particulièrement. Les groupes ER5 et ER.7 sont déficients dans des constituants de la DNA-
PK. La DNA-PK (DNA-dependent protein Kinase) est une kinase sérine/thréonine qui n'est active que lorsqu'elle est liée à l'ADN (on peut au passage noter la similitude avec la PARP) (Getts & Stamato, 1994, J. Biol. Chem., 269, 15981-15984 ; Rathmell & Chu, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9_ 7623-7627 ; Taccioli et al., 1994, Science,
265. 1442-1445). La DNA-PK est constituée d'une sous-unité catalytique (DNA-PKCs) et d'une sous-unité interagissant avec l'ADN appelé Ku.
Ku, à l'origine identifié comme autoantigène est un hétérodimère constitué de 2 polypeptides de 70 et 80 kDa (Ku70 et Ku80) et correspond à XRCC5. Il se fixe aux extrémités d'ADN mais pas à l'ADN cellulaire (Gottlieb & Jackson, 1993, Cell 72,
131-142) et active ainsi la sous-unité DNA-PKCs. Mis à part l'inactivation par phosphorylation de la RNA polymérase I au voisinage de cassures d'ADN (Kuhn et al., 1995, Gènes Dev., 9, 193-203), les substrats de la DNA- PKcs. (codée par XRCC7) ne sont pas encore bien définis et son rôle dans la réparation de l'ADN reste à prouver. Le ligand Ku utilisé pour la mise en oeuvre des cassures double brin est plus particulièrement utilisable pour la mise en évidence des rayonnements ionisants (centrales nucléaires ou hôpitaux par exemple).
Comme il vient d'être décrit, si les mécanismes de réparation de l'ADN ne sont pas toujours connus en détail, on sait que les altérations de l'ADN sont tout d'abord reconnues par des ligands bien précis ou protéines de reconnaissance, cette reconnaissance précédant l'étape de réparation ayant pour but de reconstituer l'ADN dans sa forme propre. Il est intéressant de noter, par exemple, que si dans le cas de la réparation par NER, seulement 7% des lésions sont réparées in vitro, la majorité des lésions, sinon la totalité, sont reconnues puisqu'elles induisent toutes une déformation de l'ADN et que c'est l'étape de réparation proprement dite qui est limitante.
C'est pourquoi le procédé selon l'invention met en oeuvre la constatation que dans un système in vitro l'essentiel des altérations, même si elles ne sont pas réparées, sont néanmoins reconnues et que c'est cette étape de reconnaissance qui doit être utilisée pour la mise en évidence des altérations. Le procédé selon l'invention repose donc sur la détection de l'interaction d'une ou des molécule(s) des systèmes de réparation reconnaissant les altérations de l'ADN, en particulier les protéines.
Le procédé selon la présente invention est d'abord un procédé qualitatif, c'est-à-dire qu'il permet de détecter l'existence d'une altération de l'ADN et sa nature en fonction précisément du type de ligand. Ainsi, la mise en évidence d'une interaction de XP-A avec l'ADN montre une altération faisant intervenir NER, au contraire l'interaction de MutS ou HMSH2 démontre un problème de mésappariement. Ce type de test permet notamment de définir la génotoxicité d'un environnement et la nature de l'action sur l'ADN. Mais, il peut être quantitatif si la quantité de ligand fixé peut être quantifiée, par exemple par rapport à des standards. Dans ce dernier cas on pourra ainsi évaluer l'importance de l'altération ou suivre les évolutions de celle-ci. Dans ce cas notamment, on pourra classer par exemple les génotoxiques en fonction de leur génotoxicité, mais également suivre l'évolution d'une altération dans le temps par exemple pour « monitorer » un traitement.
Dans les tests décrits précédemment, le produit testé est un ADN altéré par un génotoxique dont on veut évaluer l'activité. On peut également utiliser le procédé selon l'invention pour, à partir en quelque sorte d'une « altération déterminée d'ADN connue », mesurer l'activité d'un système de réparation.
En particulier, on peut prévoir la mise en évidence d'une déficience de certains systèmes de réparation. En effet, dans le procédé selon la présente invention, afin d'assurer les conditions de la reconnaissance, il est nécessaire de prévoir, outre le ligand, la présence dans le milieu d'autres éléments assurant la reconnaissance, co-facteurs notamment ; pour ce faire, on utilisera en général un extrait cellulaire qui pourra apporter le ligand ou non (dans ce cas le ligand sera ajouté). Lorsque l'on souhaitera tester une éventuelle déficience d'un système de réparation de certaines cellules (prélèvements biologiques par exemple) on pourra utiliser un extrait de ces cellules pour le tester directement sur un ADN altéré, l'activité de reconnaissance des altérations pouvant être évaluée par un standard réalisé, par exemple, avec un extrait cellulaire normal. C'est pourquoi, la présente invention concerne également un procédé permettant la mise en évidence dans un échantillon d'une altération du système de réparation de l'ADN, caractérisé en ce que : a) on met l'échantillon en présence d'un ADN altéré, b) on révèle la reconnaissance de l'altération par un ligand du système de réparation, c) on évalue le résultat obtenu à l'étape b) par rapport à un standard.
On conçoit que l'ensemble des développements effectués sur le procédé principal sont également utilisables dans le procédé décrit précédemment.
Le standard pourra être, par exemple, un échantillon normal traité dans des conditions équivalentes ou toute autre méthode, notamment des courbes d'étalonnage. Par « altération du système de réparation » on entend désigner toute modification de la réponse dans le test précédent d'un système de réparation par rapport à un système témoin servant de standard. Cette altération sera caractérisée en général par une déficience de la reconnaissance de l'ADN altéré, mais le contraire est également possible. Ainsi, le procédé selon l'invention pourra permettre de mettre en évidence la présence ou l'absence de protéines en relation par exemple avec une pathologie déterminée. Une telle application peut être mise à profit pour évaluer la résistance acquise à certains agents alkylants utilisés en traitement antitumoral chez des patients et ceci par mesure d'un défaut de réparation des mésappariements (Eshlemen & Markowitz, 1995, Curr. Opin. Oncol. 7, 83-89) ou la sensibilité ou résistance à la radiothérapie. De plus, ce même procédé selon l'invention permet de mettre en évidence des altérations dans les modulateurs de reconnaissance de ligands d'ADN (comme des agents antitumoraux interagissant avec des facteurs de réparation).
En effet, dans ce cas, on notera des modifications dans la réponse des ligands de reconnaissance.
La mise en oeuvre spécifique du procédé selon la présente invention peut être réalisée selon différentes variantes.
Le procédé selon la présente invention peut être mis en oeuvre selon différentes variantes. L'ADN testé peut être un extrait cellulaire total, un extrait cellulaire semi- purifié ou bien un ADN purifié, ceci dépendra du type de recherche effectuée.
Le milieu de reconnaissance pourra être entièrement synthétique ou bien être constitué par un extrait cellulaire, lequel pourra notamment comporter également le ligand, dans ce cas la révélation sera effectuée avec un marqueur de la fixation du ligand, anticorps marqué par exemple. En tout état de cause, le milieu de reconnaissance devra comporter tous les cofacteurs nécessaires à la reconnaissance de l'altération.
De façon préférentielle, le milieu de reconnaissance est constitué d'un extrait cellulaire plus ou moins purifié quant à la présence de ligand endogène et d'ADN endogène audit milieu de reconnaissance.
L'interaction du ligand et de l'ADN pourra être mise en évidence par toute méthode appropriée, en particulier comme cela a été précisé, à l'aide d'un ligand marqué ou à l'aide d'un anticorps reconnaissant le ligand.
Dans tous les cas, le marquage pourra être radioactif ou non. On préférera l'utilisation de marquages non radioactifs, c'est-à-dire fluorescents par exemple, ou de marquages enzymatiques.
En particulier, il est possible de prévoir que l'étape a) comporte des composés reconnaissant différents types d'altération et en ce que dans l'étape b) on puisse identifier séparément les différents types de reconnaissance. Dans le cas de marqueurs fluorescents, on pourra ainsi utiliser des chromophores différents. Ceci permet de visualiser immédiatement le type d'altération ou même les diverses altérations.
De façon plus spécifique, le procédé comprend les étapes suivantes : • l'action, dans le cas de l'utilisation d'un ADN cible, de l'agent (physique ou chimique) à tester sur cet ADN ; dans le cas d'un agent chimique, l'action du composé peut nécessiter l'action concommitante d'un mélange activateur des composés (comme par exemple l'action biotransformante d'un extrait hépatique de type « S9 » en présence de tous les cofacteurs nécessaires) ;
• la purification d'ADN de cellules ou tissus dont on veut connaître le degré d'altération de l'ADN (par exemple suivi de malades ou personnes en contact avec des environnements à risque, incubation de cellules en culture avec des agents dont la génotoxicité est à déterminer ; recherche de corrélation entre l'état d'altération de l' ADN cellulaire et la présence ou prédisposition à certaines maladies par exemple) ;
• l'action d'un extrait cellulaire possédant une activité réparatrice, ou au minimum de reconnaissance des altérations, sur cet ADN, ou plus simplement d'une protéine, ou complexe protéique, reconnaissant ces altérations ou un extrait déficient en une protéine que l'on ajoutera ;
• la révélation de l'interaction d'une protéine ou complexe protéique à l'aide d'un anticorps ; plus simplement, dans le cas d'une protéine purifiée reconnaissant les lésions, il est possible de greffer directement sur cette protéine un marqueur de révélation direct (de type fluorescence par exemple) ou indirect (de type enzymatique), ces exemples n'étant pas limitatifs ;
• dans le cas de l'utilisation d'un anticorps, sa révélation directe ou indirecte (anticorps directement marqué) ou révélation par un anticorps (ou ligand) secondaire ; • détection choisie de préférence parmi les techniques sensibles telles que la luminescence (substrat luminescent) ou la fluorescence, éventuellement la radioactivité.
L'ensemble de ces étapes peut se faire en phase liquide ou en phase semi- solide en fixant l'un des réactifs sur un support (plaque de microtitration, membrane ou microbille, gel ou colonne d'agarose ou colonne d'affinité par exemple) ; dans le premier cas, on choisira préférentiellement un système ne nécessitant pas de lavages entre les différentes étapes ou un système en une seule étape ; dans le second cas, les différentes étapes sont séparées par des lavages.
Dans le cas d'un dosage avec une phase solide ou semi-solide, la nature du réactif fixé, ligand ou ADN notamment, pourra dépendre du type de dosage effectué, dosage de l'importance de la lésion ou bien dosage de la reconnaissance.
Dans le cas d'un dosage en phase liquide, il est nécessaire de pouvoir mettre en évidence la fixation du ligand sur l'ADN, on peut notamment prévoir deux marquages différents pour l'ADN et le ligand et évaluer visuellement la proximité des marqueurs, on peut également utiliser des systèmes type TRACE dans lesquels l'un des marqueurs ne peut être révélé que par la proximité du second. De façon générale, le test consiste à incuber l'ADN (lésé ou non) à la fois en présence d'un anticorps anti-ADN et d'une protéine spécifique d'altérations de l'ADN. Ladite protéine peut être couplée directement à un fluorophore ou être révélée par un anticorps. Dans le cas de l'utilisation d'un anticorps anti-ADN et d'une protéine spécifique, chacun des deux ligands peut être couplé à un fluorophore dont les longueurs d'onde d'émission diffèrent suffisamment pour être lues simultanément avec une bonne discrimination. On peut également, dans les deux cas de figure envisagés ci-dessus, utiliser un système de détection TRACE (Time-Resolved Amplified Cryptate Emission) décrit par CIS bio international (Bagnols-sur-Sèze, France). On pourrait, dans ce cas, conjuguer l'anticorps anti-ADN au « cryptate » (trisbipyridine diamine Europium) et lier une potéine de reconnaissance des lésions ou l'anticorps la reconnaissant, à un fluorophore accepteur d'énergie tel que la phycobiliprotéine modifiée, appelée par CIS Bio International XL665 (ou l'inverse), ou marquer 2 protéines qui ne forment un complexe qu'au voisinage de l'ADN altéré. On peut envisager de standardiser la lecture en rapportant le signal à la quantité d'ADN. Cette quantité d'ADN (relative) peut être obtenue à l'aide du même système en utilisant par exemple deux anticorps anti-ADN, l'un couplé au cryptate, l'autre au fluorophore accepteur d'énergie.
L'avantage du système TRACE porte sur sa rapidité (puisqu'il n'est pas nécessaire de procéder à des étapes de lavage), mais surtout sur la quantité d'ADN (et donc de lésions) analysable par condition. De plus, ce système est tout à fait automatisable, et est d'ailleurs déjà adapté au criblage HTS.
Si l'on ne dispose pas du ligand d'altération purifié, ou si celui-ci nécessite des cofacteurs, protéiques ou non, pour l'étape d'interaction, on peut dans ce cas utiliser un extrait cellulaire purifié de manière à ce que ces cofacteurs soient présents. Dans ce cas, l'interaction du ligand avec l'altération sera mise en évidence à l'aide d'un anticorps dirigé contre ce ligand. Cet anticorps peut être couplé à un système permettant de le détecter, ou on fait appel à une méthode connue de l'homme de l'art consistant à utiliser un second anticorps dirigé contre le premier, ce second anticorps étant couplé à un système de détection.
Dans le dosage en phase solide, on pourra fixer l'ADN endommagé sur un support et révéler la fixation d'un ligand sur l'ADN fixé par exemple, d'autres méthodes sont envisageables qui dérivent des méthodes décrites précédemment pour la phase liquide.
Il est possible également d'utiliser des systèmes de dosage de type « biochips », notamment les techniques développées par Affymetrix ou CIS Bio International (Bagnols-sur-Sèze, France). On peut envisager de fixer l'ADN sur les chips :
• Un oligonucléotide ou ADN contenant un mésappariement peut permettre de détecter la présence de hMSH2 dans une biopsie ou in vivo et donc le risque de développement d'un cancer. Cette méthode doit être quantitative pour discriminer les individus sains homozygotes des hétérozygotes pour le gène hMSH2, prédisposés au développement de cancers, en particulier du côlon.
• Un oligonucléotide ou ADN contenant un adduit d'un génotoxique utilisé en chimiothérapie (alkylant, cis-platine, etc.) pourrait servir à un suivi du taux de protéines XPA et au suivi d'un certain type de résistance. On peut également prévoir la fixation de la protéine sur les chips :
• Il n'est plus question d'utiliser des anticorps anti-protéines mais les protéines elles- mêmes. On peut en théorie, à partir de ce système, détecter tous les types de lésion et la quantification de l'ADN se ferait en utilisant un anticorps anti-ADN qui permettrait de rapporter le signal obtenu pour chaque type de lésion à un signal « ADN ». Ce système semble assez intéressant pour le suivi thérapeutique.
Comme cela a été décrit dans le préambule, le procédé selon la présente invention est plus particulièrement utilisable pour évaluer la génotoxicité d'un environnement sur un échantillon par mesure de l'altération de l'ADN dudit échantillon. Par « environnement », on entend désigner aussi bien des facteurs chimiques, biologiques que physiques (rayonnement par exemple).
L'invention est notamment applicable à l'évaluation qualitative . et quantitative de lésions sur l'ADN de cellules cultivées in vitro, isolées ex vivo ou issues de tissus animaux ou végétaux, par exemple application à la détection de xénobiotiques génotoxiques, au suivi thérapeutique de patients atteins de tumeurs soumis à un traitement chimiothérapeutique, application au suivi des. risques de personnes en contact avec des agents potentiellement génotoxiques.
On peut également l'utiliser, en général, à l'évaluation qualitative et quantitative de composés réagissant avec des molécules nucléophiles (ADN, composés lipidiques, etc.) tels que les radicaux libres, notamment dans le domaine des cosmétiques par exemple, de même que dans l'évaluation qualitative et quantitative de composés inhibant l'action d'agents oxydants.
Enfin, le procédé permet la détermination des capacités d'un extrait cellulaire à reconnaître des lésions ainsi que la détermination du type de lésions induites sur l'ADN grâce à l'utilisation, soit d'extraits cellulaires déficients dans une partie du système de réparation de ces lésions, soit de protéines spécifiques, soit d'anticorps dirigés contre des protéines spécifiques. Le présent procédé, basé sur la mise en évidence d'une interaction spécifique de protéines impliquées dans la réparation de l'ADN lésé, présente un grand nombre d'avantages :
• ce test est, dans le cas d'un support solide, un simple ELISA, et comme tel automatisable et adapté au « high throughput screening » ou HTS,
• ce test est d'autant plus automatisable dans son option totalement phase liquide,
• par rapport notamment au test décrit dans le brevet français n° 95 03230 du 15 mars 1995, publié le 20 septembre 1996 sous le n° 2 731 71 1 ; demande PCT/FR 96/00391 du 13 mars 1996, en référence le 19 septembre 1996 sous le n° WO 96 28571, celui-ci est avantageux car
• il nécessite moins d'extraits cellulaires ou
• il ne nécessite pas d'extraits cellulaires, une (ou une combinaison de) protéine(s) purifiée(s) ou même produite(s) par génie génétique étant suffisante, • il ne nécessite pas de nucleotide modifié, ou marqué, radioactivement par exemple,
• il ne nécessite pas d'adsorption de l'ADN sur un support sensibilisé, mais la fixation de l'ADN cible peut, par exemple, se faire par une extrémité (exemple : ADN biotinylé, support couplé à un ligand de biotine, tel que la streptavidine) ;
• il est plus rapide (puisqu'il ne s'intéresse qu'à l'étape de reconnaissance de la lésion et non pas à l'ensemble reconnaissance-réparation), ce qui peut réduire le test à un temps de l'ordre de 2 à 3 heures ;
• si on utilise une protéine du NER il est possible d'incuber l'ADN cible en présence d'un système activateur : différentes sources de fractions activatrices pouvant être utilisées :
• fraction S9 ou microsomale, de foie de rat ou de cobaye, induit ou non,
• extrait de cellules humaines HepG2 stimulées, ou non, à l' hydrocortisone 21 hémisuccinate et au benzanthracène, • extrait de cellules de la lignée humaine MCL 5 (société Gentest),
• extrait de cellules eucaryotes recombinantes exprimant des P450,
• catalyse par les porphyrines.
Dans le cas de l'utilisation d'une seule protéine de reconnaissance (porteuse ou non d'un marqueur), la protéine XP-A sera préférentiellement utilisée car elle est la première à reconnaître une lésion de l'ADN. De plus, cette protéine, dont l'ADN complémentaire est clone, peut être exprimée dans un vecteur propagé dans un microorganisme et ainsi être produite en grande quantité dans un fermenteur par exemple.
On peut également co-incuber la protéine XP-A et le complexe RPA.
On peut également envisager d'utiliser de la même façon uniquement XPA ou le complexe RPA.
On peut également envisager d'utiliser de la même façon les protéines HMG.
De façon générale, les systèmes les plus intéressants selon la présente invention sont les systèmes NER et BER. Pour la suite de la description, on se référera aux légendes des figures.
Légendes
Figure 1 : Principe du test GeneTEX (Gène Toxicology Environment Xenobiotics) Le test GeneTEX comporte 6 étapes : 1- Adsorption de l'ADN cible sur un support, 2- génération de lésions par incubation avec un agent génotoxique,
3- reconnaissance de lésions par une protéine issue d'un extrait cellulaire,
4- révélation de la fixation de cette protéine par un anticorps,
5- révélation de la fixation du premier anticorps par un anti-anticorps couplé à un enzyme, 6- génération d'un signal lumineux par addition d'un substrat chimiluminescent de l'enzyme.
L'ADN est représenté par une double hélice, les lésions par des cercles noirs, les protéines de reconnaissance des lésions par des ovales blancs, et les anticorps couplés à un enzyme porte un rectangle blanc. Figure 2 : Reconnaissance de dommages dus aux UVC par la protéine XPA dans un extrait cellulaire et détection par un anticorps monoclonal anti-XPA
Ce graphe représente le signal obtenu (rapport signal/bruit de fond) en fonction des doses UVC croissantes.
Figure 3 : Reconnaissance de cassures double-brin induites par la bléomycine par la protéine Ku dans un extrait cellulaire et détection par un anticorps monoclonal anti-Ku
Ce graphe représente le signal obtenu (rapport signal/bruit de fond) en fonction de concentrations croissantes de bléomycine.
Figure 4 : Mesure de la persistance de cassures double-brin radio-induites par la protéine Ku dans un extrait cellulaire et détection par un anticorps monoclonal anti-Ku
+/+ désigne les cellules non mutées pour le gène ATM +/- représente les cellules mutés hétérozygotes pour le gène ATM -/- désigne les cellules mutées homozygotes pour le gène ATM 12h et 24h représentent les temps de post-incubation avec irradiation IGy et 3Gy (Gray) définissent les doses d'irradiation
Un mode avantageux de la présente invention est basé sur le principe du test appelé GeneTEX :
L'ensemble de ce test se déroule préférentiellement à 30°C. Chaque étape est séparée par des lavages.
L'ADN cible est adsorbé sur des puits préalablement recouverts par la poly- lysine. Cet ADN est soumis pendant la durée désirée, préférentiellement 30 minutes, à l'action d'un agent génotoxique ou d'une composition contenant au moins un tel agent. Cette étape a pour effet de générer des lésions sur l'ADN, si la solution testée contient un (ou des) agent(s) génotoxique(s).
Un extrait cellulaire, préférentiellement d'origine humaine, préférentiellement issu de cellules HeLa, est incubé sur l'ADN. Les protéines de reconnaissance des altérations de l'ADN vont se fixer aux sites d'altération.
Un anticorps, polyclonal ou préférentiellement monoclonal, dirigé contre la protéine de reconnaissance des altérations est ajouté et va reconnaître les protéines fixées aux sites d'altération.
Un second anticorps, dirigé contre le premier anticorps (reconnaissant préférentiellement l'espèce dont est issu le premier anticorps), couplé à une enzyme, préférentiellement de type péroxydase, est ajouté et va reconnaître le premier anticorps. Un substrat luminescent de l'enzyme est ajouté et le signal lumineux émis est quantifié par un luminomètre.
Un des aspects du test geneTEX est illustré à la figure 1. Toutefois, ce test ne se limite pas à cet aspect et peut comporter les variantes suivantes :
1) L'anticorps dirigé contre la protéine de reconnaissance peut être directement couplé à un système de détection, ne nécessitant donc pas d'anticorps secondaire. Ce système de détection peut être une enzyme, un marqueur fluorescent ou un marqueur de fluorescence en temps résolu (de type chélate d'Europium), ou un marqueur d'électrochimiluminescence.
2) Des cellules sont incubées en présence de l'agent génotoxique pendant le temps désiré, puis lysées et l'ADN cellulaire adsorbé sur les puits sensibilisés. L'ensemble du test se déroule ensuite normalement. 3) L'ensemble du test peut être réalisé en phase liquide, sans utilisation d'un support solide en utilisant la technologie TRACE développée par Cis Bio International (Bagnols-sur-Sèze, France) qui utilise un transfert d'énergie entre un cryptate d'Europium et un accepteur d'énergie (en particulier la molécule XL665). Il n'y a émission de signal uniquement dans le cas où les 2 molécules, portées par exemple par 2 anticorps, sont suffisamment proches. Dans le cas du test, l'anticorps dirigé contre la protéine de reconnaissance de l'altération est par exemple couplé au cryptate, et un anticorps anti-ADN est couplé au XL665 (ou l'inverse), ou 2 anticorps dirigés contre 2 protéines formant un complexe au voisinage de l'ADN altéré sont utilisés. Les 2 anticorps se trouvant suffisamment proches, le transfert d'énergie entre le cryptate d'Europium excité et l'accepteur XL665 va être possible et le signal fluorescent émis est proportionnel au taux d'anticorps fixé sur la protéine de reconnaissance des altérations.
Exemple 1 : détection de lésions sur l'ADN reconnues par le système NER
L'ADN (plasmide pUC18), à la concentration de 50μg/ml, a été lésé aux UVC par irradiation sous une lampe éclairant à 254nm à 50μW/cm2 pendant les temps nécessaires à l'obtention de doses variant de 5 à 200J/m2.
L'ADN prélésé aux UVC a été adsorbé sur des puits recouverts par de la poly-lysine, à raison de 50ng par puits. En contrôle, des ADN portant des lésions oxydatives (lésions générées par éclairement en présence de bleu de méthylène), réparés par le système BER ont été utilisés.
Après une incubation de 30 minutes, les puits ont été lavés 2 fois par une solution de PBS additionnée de Tween-20 à 0.1%. Les puits ont ensuite été lavés 2 fois par une solution de PBS additionnée de Tween-20 à 0.1%.
Les puits ont ensuite été saturés à l'aide d'une solution de BSA à 3% dans du PBS pendant 1 heure à 30°C, sous agitation.
Les puits ont ensuite été lavés 1 fois par une solution de PBS additionnée de Tween-20 à 0.1%.
L'ADN traité a ensuite été incubé avec un extrait cellulaire de type Manley [Manley et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 3855-3859], modifié par Wood [Wood et al. (1988) Cell, 53, 97-106] pendant 90 minutes à 30°C dans un tampon contenant 40mM Hepes; 5mM MgCl2; 50mM KCl; 0,5mM DTT; lOmM phosphocréatine; 0,lmg/ml BSA; 50μg/ml créatine phosphokinase; 2mM EGTA; pH 7,6. Les puits ont ensuite été lavés 2 fois par une solution de PBS additionnée de Tween-20 à 0.1%.
La fixation de la protéine XPA a été révélé par incubation d'un anticorps monoclonal anti-XPA dilué à 900ng/ml dans du PBS additionné de BSA 0.1% et d'Igepal CA-630 (vendu par Sigma) pendant 2 heures à 30°C, sous agitation.
Les puits ont ensuite été lavés 3 fois par une solution de PBS additionnée de Tween-20 à 0.1%.
L'anticorps primaire anti-XPA a ensuite été reconnu par un anticorps secondaire de chèvre, anti-souris, couplé à la péroxydase, dilué au 1/10,000 dans le même tampon que l'anticorps primaire dans une incubation de 30 minutes.
Les puits ont ensuite été lavés 5 fois par une solution de PBS additionnée de Tween-20 à 0.1%.
Un substrat luminescent de la péroxydase (Specichrom, vendu par Speci, Ste Foy-les-Lyon, France) est ensuite ajouté et l'ensemble a été incubé pendant 15 minutes à 30°C sous agitation.
Le signal lumineux émis a été mesuré par un Victor (Wallac oy, Turku, Finlande).
Le résultat est exprimé comme le rapport de signal spécifique sur le signal du plasmide non traité et un exemple de résultat est donné sur la figure 2. II est ainsi montré, à ce stade de développement du test, un seuil de détection de 30J/m2 pour les lésions UVC.
Les lésions générées par le bleu de méthylène éclairé n'ont pas été détectées.
Exemple 2 : détection de cassures double-brin sur l'ADN Ce type de cassures, générant une augmentation du nombre de fragments d'ADN et donc d'extrémités, est détecté par le complexe Ku-DNAPK. La fixation sur les extrémités est assurée par la sous unité Ku (Ku70-Ku80).
En pratique, des cassures double-brin ont été générées par une molécule radiomimétique, la bléomycine, en présence d'ions ferreux: il y a dans ce cas production de cassures double-brins comme dans le cas de traitement par des radiations ionisantes. L'ADN (plasmide pUC18) a été adsorbé sur des puits recouverts par de la poly-lysine, à raison de 50ng par puits.
Après une incubation de 30 minutes, les puits ont été lavés 2 fois par une solution de PBS additionnée de Tween-20 à 0.1%. Des doses croissantes de bléomycine (de 0 à 200μM) ont été incubées pendant 30 minutes avec l'ADN adsorbé, en présence de 0.5μM de FeCl2, sous agitation à 30°C. Les puits ont ensuite été lavés 2 fois par une solution de PBS additionnée de Tween-20 à 0.1%.
Les puits ont ensuite été saturés à l'aide d'une solution de BSA à 3% dans du PBS pendant 1 heure à 30°C, sous agitation. Les puits ont ensuite été lavés 1 fois par une solution de PBS additionnée de Tween-20 à 0.1%.
L'ADN traité a ensuite été incubé avec un extrait cellulaire de type Manley [Manley et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 3855-3859], modifié par Wood [Wood et al. (1988) Cell, 53, 97-106] pendant 90 minutes à 30°C dans un tampon contenant 40mM Hepes; 5mM MgCl2; 50mM KCl; 0,5mM DTT; lOmM phosphocréatine; 0,lmg/ml BSA; 50μg/ml créatine phosphokinase; 2mM EGTA; pH 7,6.
Les puits ont ensuite été lavés 2 fois par une solution de PBS additionnée de Tween-20 à 0.1%. La fixation du complexe Ku a été révélée par incubation d'un anticorps monoclonal anti-Ku dilué à 400ng/ml dans du PBS additionné de BSA 0.1% et d'Igepal CA-630 (vendu par Sigma) pendant 2 heures à 30°C, sous agitation.
Les puits ont ensuite été lavés 3 fois par une solution de PBS additionnée de Tween-20 à 0.1%. L'anticorps primaire anti-Ku a ensuite été reconnu par un anticorps secondaire de chèvre, anti-souris, couplé à la péroxydase, dilué au 1/10,000 dans le même tampon que l'anticorps primaire dans une incubation de 30 minutes.
Les puits ont ensuite été lavés 5 fois par une solution de PBS additionnée de Tween-20 à 0.1%. Un substrat luminescent de la péroxydase (Specichrom, vendu par Speci,
Ste Foy-les-Lyon, France) est ensuite ajouté et l'ensemble a été incubé pendant 15 minutes à 30°C sous agitation.
Le signal lumineux émis a été mesuré par un Victor (Wallac oy, Turku, Finlande). Le résultat est exprimé comme le rapport de signal spécifique sur le signal du plasmide non traité et un exemple de résultat est donné sur la figure 3.
Il est ainsi montré, à ce stade de développement du test, un seuil de détection de 0,032μM (32nM) pour les cassures double-brin générées par la bléomycine en présence de 0,5μM de FeCl2. Exemple 3 : détection de mésappariements de bases de l'ADN
Ce type d'altération de l'ADN, est détecté par un complexe protéique. La reconnaissance du mésappariement est assurée par la protéine hMSH2.
En pratique, des oligonucléotides 37-mer ont été synthétisés de façon à générer un appariement parfait ou un site de mésappariement (la base introduisant le mésappariement est soulignée).
Les séquences suivantes ( Fishel et al., 1994, Science, 266? 1403-1405) ont été synthétisées :
MIS-C 51 ATGTGAATCAGTATGGTTCCTATCTGCTGAAGGAAAT 3'
MIS-T 5' ATGTGAATCAGTATGGTTTCTATCTGCTGAAGGAAAT 3'
MIS -Grev 5 ' AATTCCTTCAGCAGATAGGAACCATACTGATTCACAT
Les oligonucléotides sont solubilisés à lmg:ml dans du TE1X.
L'appariement (hybridation) est réalisé dans 200μl, à 400μg/ml de chaque oligo, en présence de NaCl 1M
Les tubes sont portés à 100°C pendant 10 minutes dans un thermocycleur et laissés à refroidir pendant 3 heures.
L'ADN est ensuite précipité par addition de 2,5 volume d'éthanol absolu, gardé la nuit à -20°C, puis centrifugé à 14000 rpm à 4°C pendant 40 minutes. Après lavage des culots dans de l'éthanol à 70% et séchage, les culots sont repris par 1,5ml de TE IX (à une concentration finale de lOOμg/ml). L'hybridation MIS-C + MIS-Grev conduit à un ADN double-brin normalement apparié (C:G) alors que l'hybridation MIS-C + MIS-T conduit à un ADN double brin comportant un mésappariement (C:T).
L'ADN a été adsorbé sur des puits recouverts par de la poly-lysine, à raison de 200ng par puits. Après une incubation de 30 minutes, les puits ont été lavés 2 fois par une solution de PBS additionnée de Tween-20 à 0.1%.
Les puits ont ensuite été saturés à l'aide d'une solution de BSA à 3% dans du PBS pendant 1 heure à 30°C, sous agitation.
Les puits ont ensuite été lavés 1 fois par une solution de PBS additionnée de Tween-20 à 0.1%.
L'ADN traité a ensuite été incubé avec un extrait cellulaire de type Manley [Manley et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 3855-3859], modifié par Wood [Wood et al. (1988) Cell, 53, 97-106] pendant 90 minutes à 30°C dans un tampon contenant 40mM Hepes; 5mM MgCl2; 50mM KCl; 0,5mM DTT; lOmM phosphocréatine; 0,lmg ml BSA; 50μg/ml créatine phosphokinase; 2mM EGTA; pH
7,6. Les puits ont ensuite été lavés 2 fois par une solution de PBS additionnée de Tween-20 à 0.1%.
La fixation de hMSH2 a été révélée par incubation d'un anticorps monoclonal ànti-hMSH2 dilué à 2μg/ml dans du PBS additionné de BSA 0.1% et d'Igepal CA-630 (vendu par Sigma) pendant 2 heures à 30°C, sous agitation. Les puits ont ensuite été lavés 3 fois par une solution de PBS additionnée de Tween-20 à 0.1%.
L'anticorps primaire anti-hMSH2 a ensuite été reconnu par un anticorps secondaire de chèvre, anti-souris, couplé à la péroxydase, dilué au 1/10,000 dans le même tampon que l'anticorps primaire dans une incubation de 30 minutes. Les puits ont ensuite été lavés 5 fois par une solution de PBS additionnée de Tween-20 à 0.1%.
Un substrat luminescent de la péroxydase (Specichrom, vendu par Speci,
Ste Foy-les-Lyon, France) est ensuite ajouté et l'ensemble a été incubé pendant 15 minutes à 30°C sous agitation. Le signal lumineux émis a été mesuré par un Victor (Wallac oy, Turku,
Finlande).
Le rapport de signal spécifique (oligonucléotide portant un mésappariement; T:G) sur le signal de l'oligonucléotide ne portant pas de mésappariement (C:G) a été de 5.
Exemple 4 : application à la mise en évidence de différences de capacité de réparation des cassures double-brin chez des cellules de patients portant ou non un gène muté ATM
Les cellules lymphoblastoïdes, issues de patients sains, hétérozygotes ou homozygotes pour le gène ATM (Ataxia telangectasia; conduisant à une hypersensibilité aux radiations ionisantes), en culture ont été irradiées à des doses de 0;
1 et 3 Gy. Les doses de 1 et 3 Gy ont pour effet de générer des cassures double-brin de l'ADN qui vont être détectées par le biais de la reconnaissance du complexe Ku-DNAPK comme décrit dans l'exemple 2. Les cellules sont ensuite cultivées dans un milieu adapté pendant 12 et 24 heures, temps auxquels elles sont lavées et congelées à -80°C. Elles sont ensuite lysées et l'ADN génomique adsorbé sur les puits comme dans les exemples précédents.
Après une incubation de 30 minutes, les puits ont été lavés 2 fois par une solution de PBS additionnée de Tween-20 à 0.1%. Les puits ont ensuite été saturés à l'aide d'une solution de BSA à 3% dans du PBS pendant 1 heure à 30°C, sous agitation.
Les puits ont ensuite été lavés 1 fois par une solution de PBS additionnée de Tween-20 à 0.1%.
L'ADN traité a ensuite été incubé avec un extrait cellulaire de type Manley [Manley et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 3855-3859], modifié par Wood [Wood et al. (1988) Cell, 53, 97-106] pendant 90 minutes à 30°C dans un tampon contenant 40mM Hepes; 5mM MgCl ; 50mM KCl; 0,5mM DTT; lOmM phosphocréatine; 0,lmg/ml BSA; 50μg/ml créatine phosphokinase; 2mM EGTA; pH 7,6. Les puits ont ensuite été lavés 2 fois par une solution de PBS additionnée de Tween-20 à 0.1%.
La fixation du complexe Ku a été révélée par incubation d'un anticorps monoclonal anti-Ku dilué à lOOng/ml dans du PBS additionné de BSA 0.1% et d'Igepal CA-630 (vendu par Sigma) pendant 2 heures à 30°C, sous agitation. Les puits ont ensuite été lavés 3 fois par une solution de PBS additionnée de Tween-20 à 0.1%.
L'anticorps primaire anti-Ku a ensuite été reconnu par un anticorps secondaire de chèvre, anti-souris, couplé à la péroxydase, dilué au 1/10,000 dans le même tampon que l'anticorps primaire dans une incubation de 30 minutes. Les puits ont ensuite été lavés 5 fois par une solution de PBS additionnée de Tween-20 à 0.1%.
Un substrat luminescent de la péroxydase (Specichrom, vendu par Speci, Ste Foy-les-Lyon, France) est ensuite ajouté et l'ensemble a été incubé pendant 15 minutes à 30°C sous agitation. Le signal lumineux émis a été mesuré par un Victor (Wallac oy, Turku,
Finlande).
Le résultat est exprimé comme le rapport de signal spécifique sur le signal du plasmide non traité et un exemple de résultat est donné sur la figure 4.
Il est ainsi montré que le test est en particulier applicable à la mesure de la radiosensibilité de cellules issus de patients. Selon la cinétique de réparation des cassures induites par les radiations ionisantes, on peut discriminer les patients homozygotes ATM, les hétérozygotes ATM et les patients ne portant pas de mutation dans ce gène.
A la dose de 3Gy, les cassures de l'ADN sont moins bien réparées chez les hétérozygotes pour le gène ATM comme en témoigne le pourcentage de cassures persistantes.
Selon le même principe, il est possible de détecter toute sensibilité aux radiations ionisantes, quelle soit due à un déficit en ATM ou dans un autre gène.
Exemple 5 : détection de lésions sur l'ADN reconnues par le système NER par un anticorps anti-XPA et la technique DELFIA®
L'ADN (plasmide pUC18) a été prélésé aux UVC ou au cis-platine comme décrit dans l'exemple 1.
L'ADN prélésé aux UVC ou au cis-platine a été adsorbé sur des puits recouverts par de la poly-lysine, à raison de 50ng par puits. En contrôle, des ADN portant des lésions oxydatives (lésions générées par éclairement en présence de bleu de méthylène), réparés par le système BER ont été utilisés.
Après une incubation de 30 minutes, les puits ont été lavés 2 fois par une solution de PBS additionnée de Tween-20 à 0.1%.
Les puits ont ensuite été lavés 2 fois par une solution de TBS (Tris buffer saline) additionnée de Tween-20 à 0.1%.
Les puits ont ensuite été saturés à l'aide d'une solution de BSA à 3% dans du TBS pendant 1 heure à 30°C, sous agitation.
Les puits ont ensuite été lavés 1 fois par une solution de TBS additionnée de Tween-20 à 0.1%. L'ADN traité a ensuite été incubé avec un extrait cellulaire de type Manley
[Manley et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 3855-3859], modifié par Wood [Wood et al. (1988) Cell, 53, 97-106] pendant 90 minutes à 30°C dans un tampon contenant 40mM Hepes; 5mM MgCl2; 50mM KCl; 0,5mM DTT; lOmM phosphocréatine; 0, lmg/ml BSA; 50μg/ml créatine phosphokinase; 2mM EGTA; pH 7,6.
Les puits ont ensuite été lavés 2 fois par une solution de TBS additionnée de Tween-20 à 0.1%.
La fixation de la protéine XPA a été révélée par incubation d'un anticorps monoclonal anti-XPA dilué à 500ng/ml dans du TBS additionné de BSA 0.1% et d'Igepal CA-630 (vendu par Sigma) pendant 2 heures à 30°C, sous agitation. Cet anticorps a été au préalable marqué à une moyenne de 10 chélates d'Europium (EuJ+) selon le protocole Wallac. Les puits ont ensuite été lavés 8 fois par une solution de TBS additionnée de Tween-20 à 0.1%.
La solution de révélation ("Enhancement Solution", Wallac) est ensuite ajoutée (50μl/puits) et la plaque mise à agiter vigoureusement pendant 5 minutes. La fluorescence ("Time Resolved Fluorescence") émise a été mesurée par un Victor (Wallac oy, Turku, Finlande) selon le protocole DELFIA adapté aux chélates d'Europium
Le résultat est exprimé comme le rapport de signal spécifique sur le signal du plasmide non traité et est similaire au résultat montré sur la figure 1. II est ainsi montré, à ce stade de développement du test, un seuil de détection également de 30 J/m2 pour les lésions UVC.
La technologie DELFIA a ainsi été adaptée avec succès au procédé selon l'invention.
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(1) DEPOSANT
(A) NOM GENOLIFE
(B) RUE BIOPOLE CLERMONT-LIMAGNE (C) VILLE: SAINT BEAUZIRE
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 63390
(n) TITRE DE L' INVENTION: PROCEDE DE DETECTION QUALITATIVE ET
QUANTITATIVE D'ALTERATIONS DE L'ADN ET DES LIGANDS DE CES ALTERATIONS
(m) NOMBRE DE SEQUENCES: 3
(îv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(vi) DONNEES DE LA DEMANDE ANTERIEURE:
(A) NUMERO DE LA DEMANDE: FR 9706102
(B) DATE DE DEPOT: 20-MAY-1997
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(î) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 37 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(n) TYPE DE MOLECULE: ADN
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: MIS-C
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
ATGTGAATCA GTATGGTTCC TATCTGCTGA AGGAAAT 37
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(1) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 37 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
!ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: MIS-T
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: ATGTGAATCA GTATGGTTTC TATCTGCTGA AGGAAAT 37
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 37 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: MIS-Grev
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: AATTCCTTCA GCAGATAGGA ACCATACTGA TTCACAT 37

Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé de mise en évidence d'une altération d'une séquence d'ADN, caractérisé en ce que : a) on met ladite séquence d'ADN en présence d'une composition comportant au moins un composé reconnaissant le type d'altération en cause, dénommé ligand, dans un milieu assurant la reconnaissance, b) on révèle la reconnaissance de l'altération par ledit ligand.
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le ligand est une protéine de reconnaissance du système de réparation de l'ADN.
3) Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le milieu assurant la reconnaissance est constitué par un extrait cellulaire.
4) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le ligand est une protéine de reconnaissance du système NER. 5) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le ligand est une protéine de reconnaissance du système BER.
6) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le ligand est une protéine de reconnaissance du système de réparation des mésappariements. 7) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le ligand est une protéine de reconnaissance du système détectant les cassures de l'ADN.
8) Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le ligand est marqué.
9) Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'on utilise dans l'étape b) un élément de révélation de la reconnaissance du ligand.
10) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'élément de révélation de la reconnaissance du ligand comporte un anticorps.
11) Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'ADN utilisé dans l'étape a) est au moins partiellement purifié. 12) Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'ADN utilisé dans l'étape a) est un extrait cellulaire total.
13) Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'ADN de l'étape a) est fixé sur un support solide.
14) Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le procédé est mis en oeuvre en milieu liquide. 15) Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le système de révélation utilisé est le système TRACE.
16) Procédé selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que l'étape a) comporte des composés reconnaissant différents types d'altération et en ce que dans l'étape b) on peut identifier séparément les différents types de reconnaissance.
17) Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que les composés reconnaissant les différents types d'altération sont révélés par des marqueurs différents.
18) Procédé permettant la mise en évidence dans un échantillon d'une altération du système de réparation de l'ADN, caractérisé en ce que : a) on met l'échantillon en présence d'un ADN altéré, b) on révèle la reconnaissance de l'altération par un ligand du système de réparation, on évalue le résultat obtenu à l'étape b) par rapport à un standard constitué par un échantillon normal traité dans les mêmes conditions.
19) Application du procédé selon l'une des revendications 1 à 18, à la mise en évidence des propriétés génotoxiques d'un environnement par mesure de l'altération que l'environnement produit sur l'ADN de l'échantillon.
PCT/FR1998/001008 1997-05-20 1998-05-20 Procede de detection qualitative et quantitative d'alterations de l'adn et des ligands de ces alterations WO1998053099A1 (fr)

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CA002290679A CA2290679A1 (fr) 1997-05-20 1998-05-20 Procede de detection qualitative et quantitative d'alterations de l'adn et des ligands de ces alterations
JP55005498A JP2002500511A (ja) 1997-05-20 1998-05-20 Ｄｎａの損傷ならびにこれら損傷のリガンドの定性的および定量的検出法
EP98925754A EP0983388A1 (fr) 1997-05-20 1998-05-20 Procede de detection qualitative et quantitative d'alterations de l'adn et des ligands de ces alterations
AU77751/98A AU7775198A (en) 1997-05-20 1998-05-20 Method for detecting qualitative and quantitative alterations in dna and ligandsof said alteration ligands
US09/424,120 US6309838B1 (en) 1997-05-20 1998-05-20 Method for detecting qualitative and quantitative alterations in DNA and ligands of said alteration ligands

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