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WO1998042377A1 - Preventives or remedies for sensitized t cell-related diseases containing il-6 antagonists as the active ingredient - Google Patents

Preventives or remedies for sensitized t cell-related diseases containing il-6 antagonists as the active ingredient Download PDF

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WO1998042377A1
WO1998042377A1 PCT/JP1998/001217 JP9801217W WO9842377A1 WO 1998042377 A1 WO1998042377 A1 WO 1998042377A1 JP 9801217 W JP9801217 W JP 9801217W WO 9842377 A1 WO9842377 A1 WO 9842377A1
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receptor
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hybridoma
mouse
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PCT/JP1998/001217
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Masahiko Mihara
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Definitions

  • the present invention relates to a preventive or therapeutic agent for a sensitized T cell-related disease, comprising an interleukin-6 (IL-6) antagonist as an active ingredient.
  • IL-6 interleukin-6
  • the present invention relates to a sensitized T cell inhibitor containing IL-6 antagonist as an active ingredient.
  • the present invention relates to a sensitized T cell inhibitor containing an antibody against 6 receptor as an active ingredient.
  • IL-6 is a site-powered insulin, also called B-cell stimulating factor 2 (BSF2) or Interperon / 32.
  • BSF2 B-cell stimulating factor 2
  • IL-6 was discovered as a differentiation factor involved in the activation of B lymphocyte cells (Hirano, T. et al., Nature (1986) 324, 73-76), and subsequently It has been revealed that it is a multifunctional site that influences the function of Adv (Akira, S. et al., Adv. In Immunology (1993) 54, 1-78). I-6 has been reported to induce maturation of T lymphocyte cells (Lotz et al., J. Exp. Immunol. 18: 1253-1258, 1988).
  • IL-6 transmits its biological activity on cells via two proteins.
  • One is the IL-6 receptor, a ligand-binding protein with a molecular weight of about 80 kD to which IL-6 binds.
  • the IL-6 receptor is present not only as a membrane-bound form that penetrates the cell membrane and is expressed on the cell membrane, but also as a soluble IL-6 receptor mainly composed of its extracellular region.
  • the other is the molecular weight of nonligand-binding signaling. It is gpl30, a 130 kD membrane protein. IL- 6 and IL-6 receptor form the 6Z I doctor 6 receptor complex have I, followed by binding to g P 130, the biological activity of IL- 6 is transmitted into cells ( Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967).
  • IL-6 antagonist is a substance that inhibits the transmission of IL-6 biological activity.
  • antibodies against IL-6 anti-IL-6 antibody
  • IL-6 receptor an antibody against gpl30 (anti-IL-6 receptor antibody)
  • an antibody against gpl30 anti-gpl30 antibody
  • international patent application publication number W0 95-00852 international patent application publication number W0 95-11303
  • international patent application publication number W0 96-34104 international patent application publication number W0 96-18648
  • the IL-6 antagonists disclosed in WO96-17869, JP-A-7-324097 and JP-A-8-311098 are known.
  • autoimmune diseases and allergic diseases have T cells that recognize specific antigens (sensitized T cells), and it is known that these sensitized T cells are involved in the pathology.
  • myelin basic protein Zhang, J. et al., J. Exp. Med (1994) 179, 973-984
  • S antigen Nussenblatt, RB et a 1., Am. J. Ophthalmol (1980) 89, 173-179
  • cycloglobulin for chronic thyroiditis food and mites for atopic dermatitis (Kubota , Y. et al., J. Dermatol (1993) 20, 85-87, Kondo, N.
  • sensitized T cells play an important role in the above diseases.
  • steroid and immunosuppressive drugs are used to treat these diseases, but they are symptomatic, require long-term administration, and have side effects.
  • An object of the present invention is to provide a therapeutic agent for a sensitized T cell-related disease that does not have the above-mentioned disadvantages.
  • the present invention relates to a preventive or therapeutic agent for a sensitized T cell-related disease, which comprises IL-6 antagonist as an active ingredient.
  • the present invention also relates to a preventive or therapeutic agent for a sensitized T cell-related disease, comprising an antibody against IL-6 receptor as an active ingredient.
  • the present invention also relates to a preventive or therapeutic agent for a sensitized T cell-related disease, which contains a monoclonal antibody to the 1L-6 receptor as an active ingredient.
  • the present invention also relates to a human IL-6 receptor.
  • the present invention also relates to a preventive or therapeutic agent for a sensitized T cell-related disease, comprising as an active ingredient a monoclonal antibody against mouse IL-6 receptor.
  • the present invention also relates to a preventive or therapeutic agent for a sensitized T cell-related disease, comprising a PM-1 antibody as an active ingredient.
  • the present invention also relates to a preventive or therapeutic agent for a sensitized T cell-related disease, comprising an MR16-1 antibody as an active ingredient.
  • the present invention also relates to a preventive or therapeutic agent for a sensitized T cell-related disease, which comprises, as an active ingredient, an antibody against an IL-6 receptor having a human antibody constant region (C region).
  • a preventive or therapeutic agent for a sensitized T cell-related disease which comprises, as an active ingredient, an antibody against an IL-6 receptor having a human antibody constant region (C region).
  • the present invention also relates to a preventive or therapeutic agent for a sensitized T cell-related disease, comprising a chimeric antibody against IL-6 receptor or a humanized antibody as an active ingredient.
  • the present invention also relates to a preventive or therapeutic agent for a sensitized T cell-related disease, comprising a humanized PM-1 antibody as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for treating multiple sclerosis, uveitis, chronic thyroiditis, delayed hypersensitivity, contact dermatitis or atby dermatitis containing the above-mentioned IL-6 antagonist as an active ingredient. It relates to a prophylactic or therapeutic agent. The present invention also relates to a sensitized T cell inhibitor comprising IL-6 antagonist as an active ingredient.
  • the present invention further relates to a sensitized T cell inhibitor comprising an antibody against IL-6 receptor as an active ingredient.
  • FIG. 1 shows the inhibitory effect of MR16-1 on the mouse delayed-type paw edema reaction when MR16-1 was administered simultaneously with the sensitization against M. tuberculosis.
  • the IL-6 antagonist used in the present invention may be of any origin, type, and shape if it has an inhibitory effect on sensitized T cells or a preventive or therapeutic effect on diseases involving sensitized T cells. It doesn't matter.
  • IL-6 antagonist is a substance that blocks signal transduction by IL-6 and inhibits the biological activity of IL-6.
  • the 6-antagonist includes anti-IL-6 antibody, anti-IL-6 receptor antibody, anti-gpl30 antibody, modified IL-6, or partial 1L-6 or IL-6 receptor Peptides.
  • the anti-1 antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using known means.
  • a mammal-derived monoclonal antibody is particularly preferred.
  • Monoclonal antibodies derived from mammals include those produced by hybridomas and those produced by a host transformed with an expression vector containing the antibody gene by genetic engineering techniques. This antibody is an antibody that binds to IL-6, thereby inhibiting the binding of I-6 to the IL-6 receptor and blocking the transmission of the biological activity of IL-6 into cells.
  • Such antibodies include MH166 (Matsuda et al., Eur. J. Immunol. (1988) 18, 951-956) and SK2 antibody (Sato, K. et al., The 21st Immunological Society of Japan) General Assembly, Academic Records (1991) 21, 166)
  • the anti-IL-6 antibody-producing hybridoma can be basically produced using a known technique as follows. That is, using IL-6 as a sensitizing antigen, immunizing it according to the usual immunization method, and obtaining Plasmid cells can be produced by fusing a known parent cell by a normal cell fusion method and screening monoclonal antibody-producing cells by a normal screening method.
  • an anti-IL-6 antibody may be prepared as follows.
  • human IL-6 used as a sensitizing antigen for obtaining antibodies can be obtained from Eur. J. Biochem (1987) 168, 543, J. Immunol. (1988) 140, 1534, or Argic. Biol. 1990) 54, 2685 by using the I6 gene / amino acid sequence.
  • the desired IL-6 protein After transforming an appropriate host cell by inserting the gene sequence of IL-6 into a known expression vector, the desired IL-6 protein is known from the host cell or culture supernatant.
  • the purified IL-6 protein may be used as a sensitizing antigen.
  • a fusion protein of I6 protein and another protein may be used as a sensitizing antigen.
  • the anti-IL-6 receptor antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using known means.
  • a mammalian monoclonal antibody is particularly preferable.
  • Monoclonal antibodies derived from mammals include those produced in hybridomas and those produced in hosts transformed with expression vectors containing antibody genes by genetic engineering techniques. is there. By binding to the I6 receptor, this antibody inhibits the binding of IL-6 to the IL-6 receptor and blocks the transmission of IL-6 biological activity into cells. Antibodies.
  • Such antibodies include the MR16-1 antibody (Saito, et al., J. Immunol. (1993) 147, 168-173) and the PM-1 antibody (Hirata, et al., J. Imm. unology (1989) 143, 2900-2906), AUK12-20 antibody, AUK64-7 antibody or AUK146-15 antibody (International Patent Application Publication No. WO 92-19759) And the like.
  • a particularly preferred antibody is the PM-1 antibody.
  • the PM-1 antibody-producing hybridoma cell line was designated as PM-1 by the National Institute of Bioscience and Human-Technology (Tsukuba-Higashi 1-3-1-3, Ibaraki Prefecture) as a PM-1 in July 1990. On 10th, it was deposited internationally under the Budapest Treaty as FERM BP-2998. In addition, the MR16-1 antibody-producing hybridoma cell line was deposited as Rat-mouse hybridoma MR161 on March 13, 1997, with FERM BP-5875 at the Research Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology, Japan. .
  • Monoclonal antibody-producing hybridomas can be prepared basically as described below using known techniques. That is, the I-6 receptor is used as a sensitizing antigen, immunized according to a usual immunization method, and the obtained immune cells are fused with a known parent cell by a normal cell fusion method. It can be produced by screening monoclonal antibody-producing cells by the above screening method.
  • an anti-IL-6 receptor antibody may be prepared as follows.
  • human 1L-6 receptor used as a sensitizing antigen for obtaining an antibody is described in European Patent Application Publication No. EP 325474, and mouse 1L-6 receptor is disclosed in Japanese Patent Application Publication No. 3-155579.
  • Soluble IL-6 receptor antibody consists essentially of the extracellular domain of Ile6 receptor bound to the cell membrane, and lacks the transmembrane domain or the transmembrane domain and the intracellular domain Is different from the membrane-bound IL-6 receptor.
  • the target IL-6 receptor protein is purified from the host cell or the culture supernatant by a known method, and the purified IL-6 receptor protein is used as a sensitizing antigen. It may be used. Alternatively, a cell expressing the 1L-6 receptor or a fusion protein of the IL-6 receptor protein and another protein may be used as the sensitizing antigen.
  • Escherichia coli (E. coli) containing the plasmid PIBIBSF2R, which contains the cDNA encoding the human IL-6 receptor, was released on January 9, 1989 by the National Institute of Bioscience and Biotechnology, Japan. It has been deposited internationally with the Institute as HB101-PIBIBSF2R under the Budapest Treaty under the accession number FERM BP-2232.
  • the anti-gpl30 antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using known means.
  • a monoclonal antibody derived from a mammal is particularly preferable.
  • Monoclonal antibodies derived from mammals include those produced by hybridomas and those produced by genetic engineering techniques in hosts transformed with expression vectors containing the antibody gene. This antibody binds to gpl30, blocking the binding of the I-6 / 1-6 receptor complex to gpl30 and blocking the transfer of the biological activity of the I-6 to the cell. is there.
  • Examples of such antibodies include the AM64 antibody (JP-A-3-219894), the 4B11 antibody and the 2H4 antibody (US5571513), the B-S12 antibody, and the B-P8 antibody (JP-A-8-291199).
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared basically using a known technique as follows. That is, gpl30 was used as a sensitizing antigen, and immunized according to the usual immunization method.
  • the obtained immune cells can be produced by fusing with known parent cells by a usual cell fusion method, and screening monoclonal antibody-producing cells by a usual screening method.
  • a monoclonal antibody may be prepared as follows.
  • gpl30 to be used as a sensitizing antigen for obtaining antibodies can be obtained by using the 1.6 receptor gene / amino acid sequence disclosed in European Patent Application Publication No. EP 411946.
  • the target gpl30 protein is purified from the host cell or culture supernatant by a known method, This purified IL-6 receptor protein may be used as a sensitizing antigen.
  • cells expressing gpl30 or a fusion protein of gpl30 protein with another protein may be used as the sensitizing antigen.
  • the mammal immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion. Rodents, such as mice, rats, and hamsters are used.
  • Immunization of an animal with a sensitizing antigen is performed according to a known method.
  • the sensitizing antigen is injected intraperitoneally or subcutaneously into a mammal.
  • the sensitizing antigen is diluted to an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline), physiological saline, or the like, and then suspended.
  • PBS Phosphate-Buffered Saline
  • physiological saline or the like
  • a normal adjuvant for example, Freund's complete adjuvant
  • an appropriate carrier can be used at the time of immunization with the sensitizing antigen.
  • immune cells are removed from the mammal and subjected to cell fusion.
  • Preferred immune cells to be subjected to cell fusion include spleen cells in particular.
  • Mammalian myeloma cells as the other parent cells fused with the immune cells are already known in various cell lines, for example, P3X63Ag8.653 (J. Immnol. (1979) 123: 1548). -1550), P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81: 1-7), NS-1 (Kohler.G. And Milstein, C. Eur.J. Immunol. (1976) 6 : 511-519), MFC-11 (Mar gulies. DH et al., Cell (1976) 8: 405-415), SP2 / 0 (Shulman, M.
  • the cell fusion of the immune cells and myeloma cells is basically performed by a known method, for example, the method of Minorestin et al. (Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46 ) Etc. can be performed.
  • the cell fusion is performed, for example, in a normal nutrient culture in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) and the like are used, and if necessary, an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide may be used to enhance the fusion efficiency. It can be used in addition.
  • the ratio of the use of the immune cells to the myeloma cells is, for example, preferably 1 to 10 times the number of the immune cells to the myeloma cells.
  • Examples of the culture medium used for the cell fusion include RPMI 1640 culture medium, MEM culture medium, and other cell cultures suitable for the growth of the myeloma cell line. The usual culture solution used for cultivation can be used.
  • Serum replacement fluid such as (FCS) can also be used in combination.
  • a predetermined amount of the immune cell and the myeloma cell are mixed well in the culture medium, and a PEG solution preliminarily heated to about 37 ° C., for example, a PEG solution having an average molecular weight of about 1000 to 6000 is used.
  • a PEG solution preliminarily heated to about 37 ° C.
  • the solution is added at a concentration of 30 to 60% (w / v), and the mixture is mixed to form a desired fused cell (hybridoma).
  • a cell fusion agent or the like that is not preferable for the growth of the hybridoma can be removed.
  • the hybridoma may be prepared using a conventional selective culture medium, for example, a HAT culture medium.
  • a culture solution containing hypoxanthine, aminobuterin and thymidine Culture in the HAT culture medium is continued for a period of time sufficient to kill cells other than the target hybridoma (non-fused cells), usually several days to several weeks. Then, a conventional limiting dilution method is performed, and screening and single-cloning of the hybridoma producing the desired antibody are performed.
  • a human lymphocyte is sensitized in vitro with a desired antigen protein or an antigen-expressing cell to obtain a sensitized B lymphocyte.
  • the sphere can be fused with a human myeloma cell, for example, U266, to obtain a desired human antibody having a binding activity to a desired antigen or an antigen-expressing cell (see Japanese Patent Publication No. 1-59878).
  • an antigen or an antigen-expressing cell may be administered to a transgenic animal having all of the human antibody gene revelries to obtain a desired human antibody according to the method described above (International Patent application publication numbers W093 / 12227, W092 / 03918, W094 / 02602, W094 / 25585, W096 / 34096, W096 / 33735).
  • the lidoma can be subcultured in a normal culture medium, and can be stored for a long time in liquid nitrogen.
  • a method of culturing the hybridoma according to an ordinary method and obtaining the culture supernatant, or transferring the hybridoma to a mammal compatible therewith A method of administering the substance, growing it, and obtaining it as ascites is employed.
  • the former method is suitable for obtaining high-purity antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
  • the production of a hybridoma producing an anti-IL-6 receptor antibody can be performed by the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 3-139293.
  • the newly deposited PM-1 antibody-producing hybridoma was intraperitoneally injected into BALB / c mice (manufactured by Nippon Clear Co., Ltd.) to obtain ascites, and the PM-1 antibody was purified from the ascites.
  • RPMI 1640 medium containing 10% fetal serum, 5% BM-Condimed HI (Boehringer Mannheim), Hypri-Doma SFM medium (GIBCO-BRL), PFHM-II medium (GIBC0-BRL) ) And purify the PM-1 antibody from the culture supernatant.
  • the antibody gene was cloned from a hybridoma as a monoclonal antibody, incorporated into an appropriate vector, introduced into a host, and produced using a genetic recombination technique.
  • Recombinant antibodies can be used (see, eg, Carl, AK Borrebaeck, James, W. Larrick, TERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).
  • anti-antibodies are produced from hybridomas that produce the desired antibody. Isolate the mRNA encoding the variable (V) region of the body.
  • mRNA can be isolated by known methods, for example, guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, J. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), and AGPC method (Chmczynski, P. et al., (1987) 162). , 156-159)), and prepare mRNA using mRNA Purification Kit (Pharmacia). Also, mRNA can be directly prepared by using the QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • cDNA for the antibody V region is synthesized using reverse transcriptase.
  • cDNA can be synthesized using AMV Reverse Transcriptase First-st rand cDNA DNA Synthesis Kit or the like.
  • the 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) and the 5'-RACE method using PCR (Frohman, MA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) can be used.
  • a recombinant vector is prepared from this, introduced into E. coli, etc., and a colony is selected to prepare a desired recombinant vector.
  • the base sequence of the target DNA is confirmed by a known method, for example, the Doxy method.
  • DNA encoding the V region of the desired antibody is obtained, it is ligated to the DNA encoding the desired antibody constant region (C region) and incorporated into an expression vector.
  • DNA encoding the V region of the antibody may be incorporated into an expression vector containing the DNA of the C region of the antibody.
  • an antibody gene is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region, for example, an enhancer or a promoter, as described later.
  • host cells can be transformed with this expression vector to express the antibody. 1-6. Modified antibody
  • a recombinant antibody artificially modified for the purpose of reducing heterologous antigenicity to humans for example, a chimeric antibody or a humanized antibody is used.
  • These modified antibodies can be produced using known methods.
  • Chimeric antibodies are obtained by ligating the DNA encoding the antibody V region obtained as described above to DNA encoding the human antibody C region, incorporating the DNA into an expression vector, and introducing it into a host. (See European Patent Application Publication No. EP 125023, International Patent Application Publication No. WO 96/02576). Using this known method, chimeric antibodies useful in the present invention can be obtained.
  • plasmids containing DNA encoding the V regions of the L chain and H chain of the Chimera PM-1 antibody are named pPM-k3 and pPM-hi, respectively, and have this plasmid.
  • Escherichia coli has been deposited with the National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited on February 11, 1991 as NC 1MB 40366 and NCIMB 40362, respectively, based on the Budapest Treaty (International Patent Application Publication No. W0 92-19759).
  • the humanized antibody is also referred to as a reshaped human antibody, and the complementarity determining region (CDR) of a mammal other than human, for example, a mouse antibody, is replaced with the human antibody. It has been transplanted into the complementarity determining region, and its general genetic recombination technique is also known (see European Patent Application Publication No. EP 125023 and International Patent Application Publication No. WO 96/02576).
  • a DNA sequence designed to link the CDR of a mouse antibody and the framework region (FR) of a human antibody was constructed to have an overlapping portion at the end.
  • a few It is synthesized from the oligonucleotide by the PCR method.
  • the obtained DNA is ligated to DNA encoding the human antibody C region, then incorporated into an expression vector, and introduced into a host to produce it (European Patent Application Publication No. EP 239400, See International Patent Application Publication No. WO 92-19759).
  • the FRs of the human antibody linked via the CDR are selected so that the complementarity determining region forms a favorable antigen-binding site. If necessary, amino acids in the framework region of the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).
  • the human antibody C region is used for chimeric antibodies and humanized antibodies.
  • Examples of the human antibody C region include Ca, and for example, Ca1, Ca2, C ⁇ 3, and Ca4 can be used.
  • the human antibody C region may be modified to improve the stability of the antibody or its production.
  • Chimeric antibodies consist of the variable regions of antibodies derived from mammals other than human and C regions derived from human antibodies, and humanized antibodies comprise the complementarity-determining regions of antibodies derived from mammals other than human and human antibodies. It is composed of a framework region (FR) and a C region of origin, and has a reduced antigenicity in a human body, and thus is useful as an active ingredient of the therapeutic agent of the present invention.
  • FR framework region
  • Preferred specific examples of the humanized antibody include humanized PM-1 antibody (see International Patent Application Publication No. WO92-19759).
  • the antibody gene constructed as described above can be expressed and obtained by a known method.
  • mammalian cells useful and commonly used It can be expressed by an oral motor, an antibody gene to be expressed, a DNA having a polyA signal operably linked to its 3 "downstream, or a vector containing the DNA.
  • promoter Z Enhansa Examples include human cytomegalovirus immediate early promoter / enhancer.
  • retroviruses poliovirus, adenovirus, and simian virus 40 ( SV40) or other promoters / enhancers derived from mammalian cells, such as Z promoters / Herogenic factor 1a (HEF1a) may be used. .
  • expression can be performed by operably linking a useful promoter commonly used, a signal sequence for antibody secretion, and an antibody gene to be expressed.
  • the promoters include the lacz promoter and the araB promoter.
  • the lacz promoter the method of Ward et al. (Nature (1098) 341, 544-546; FA SEB J. (1992) 6, 2422-2427), and when the araB promoter is used, the method of Better et al. (Science (1988) 240, 1041-1043).
  • the pelB signal sequence (Lei, SP et al J. Bact. eriol. (1987) 169, 4379) may be used. After isolating the antibody produced in the periplasm, the antibody structure is appropriately refolded and used (see, for example, W096 / 30394).
  • the expression vector should be selected as an important factor, such as the aminoglycoside trans- ferase (APH) gene and thymidine kinase (TK).
  • APH aminoglycoside trans- ferase
  • TK thymidine kinase
  • Ecogpt Escherichia coli xanthinguanine phosphorolibosyltransferase
  • dhfr dihydrofolate reductase
  • any production system can be used. Production systems for producing antibodies include in vitro and in vivo production systems. Examples of in vitro production systems include production systems using eukaryotic cells and production systems using prokaryotic cells.
  • animal cells When eukaryotic cells are used, there are production systems using animal cells, plant cells, and fungal cells.
  • animal cells include (1) mammalian cells, for example, CH0, COS, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero, (2) amphibian cells, for example, African toad frog oocytes Or (3) insect cells such as sf9, sf21, and Tn5 are known.
  • Known plant cells include cells derived from Nicotiana tabacum, which may be callus cultured.
  • Fungal cells include yeast, for example, the genus Saccharomyces, for example, Saccharomyces cerev isiae, filamentous fungi, for example, the genus Aspergillus, For example, Aspergillus nier is known strongly.
  • E. coli Escherichia coli
  • Bacillus subtilis Bacillus subtilis
  • the desired antibody gene is introduced into these cells by transformation.
  • An antibody can be obtained by culturing the transformed cells in vitro. Culture is performed according to a known method. For example, DMEM, MEM, RPMI 1640, 1MDM can be used as a culture solution, and a serum supplement such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination. Alternatively, antibodies may be produced in vivo by transferring the cells into which the antibody gene has been introduced into the peritoneal cavity or the like of the animal.
  • FCS fetal calf serum
  • examples of in vivo production systems include production systems using animals and production systems using plants. When using animals, there are production systems using mammals and insects.
  • Goats, pigs, sheep, mice, and mice can be used as mammals (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993).
  • silkworms can be used as insects.
  • tobacco When using plants, for example, tobacco can be used.
  • an antibody gene is introduced into these animals or plants, and antibodies are produced and recovered in the animals or plants.
  • an antibody gene is inserted into a gene encoding a protein that is uniquely produced in milk, such as goat casein, to prepare a fusion gene.
  • a DNA fragment containing the fusion gene into which the antibody gene has been introduced is injected into a goat embryo, and this embryo is introduced into a female goat.
  • the desired antibody is obtained from the milk produced by the transgenic Nigga or the progeny of the goat that has received the embryo.
  • hormones may be used in the transgenic Nigki to increase the amount of milk containing the desired antibody produced from the transgenic Nigki. (Ebert, K. M. et al., Bio / Technology (1994) 12, 699-702).
  • vaccum into which the desired antibody gene is inserted is used.
  • Silkworms are infected with the virus, and the desired antibody is obtained from the body fluid of the silkworm (Susumu,. Et al., Nature (1985) 315, 592-594).
  • the desired antibody gene is introduced into a plant expression vector, for example, pMON530, and this vector is introduced into a bacterium such as Agrobacterium tume faciens.
  • the bacterium is infected with tobacco, for example, Nicotiana tabacum, and the desired antibody is obtained from the leaves of this tobacco (Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138). ) o
  • the DNA encoding the antibody heavy chain (H chain) or light chain (L chain) is separately incorporated into an expression vector to prepare the host.
  • the host may be transformed by co-transformation or by incorporating DNA encoding the H and L chains into a single expression vector (International Patent Application Publication No. WO 94- 11523).
  • the antibody used in the present invention may be an antibody fragment or a modified product thereof as long as it can be suitably used in the present invention.
  • the antibody fragment include Fab, F (ab ') 2, Fv, or a single chain Fv (scFv) obtained by linking an H chain and an L chain Fv with an appropriate linker.
  • an antibody is treated with an enzyme such as papine or pepsin to generate an antibody fragment, or a gene encoding these antibody fragments is constructed and introduced into an expression vector.
  • Expression in a suitable host cell for example, Co, MS et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-29776, Better, M.
  • scFv can be obtained by linking the H chain V region and L chain V region of the antibody.
  • the H chain V region and the L chain V region are linked via a linker, preferably a peptide linker (Huston, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883).
  • the H chain V region and L chain V region in the scFv may be derived from any of those described as the above antibodies.
  • the peptide linker for connecting the V regions for example, any single-chain peptide consisting of 12 to 19 residues of amino acid is used.
  • the DNA encoding the scFv is a DNA encoding the H chain or H chain V region of the antibody, and a DNA encoding the V chain region of the scaffold or L chain, and the sequences of these sequences
  • the DNA portion encoding the desired amino acid sequence is amplified by the PCR method using a pair of primers defining both ends, and then the DNA encoding a portion of the peptide linker is further amplified. And by amplifying them by combining a pair of primers that define both ends thereof to be linked to an H chain and an L chain, respectively.
  • DNAs encoding scFv are prepared, expression vectors containing them and host cells transformed with the expression vectors can be obtained according to a conventional method.
  • An scFv can be obtained by a conventional method using a host.
  • antibody fragments can be obtained and expressed in the same manner as described above, and can be produced by a host.
  • the “antibody” in the claims of the present application also includes fragments of these antibodies.
  • an antibody conjugated to various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can also be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • the "antibody” mentioned above also includes these modified antibodies.
  • Such a modified antibody can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. These methods are already established in this field.
  • the antibody expressed and produced as described above can be separated from inside and outside the host cell and purified to homogeneity. Separation and purification of the antibody used in the present invention can be performed by affinity chromatography.
  • Columns used for affinity chromatography include, for example, a protein A column and a protein G column.
  • the carrier used for the protein A column include Hyper D, P0R0S, Sepharose F.F., and the like.
  • the separation and purification methods used for ordinary proteins may be used, and there is no limitation.
  • the present invention can be used by appropriately selecting and combining a chromatogram, a filter, an ultrafiltration, a salting-out, and a dialysis other than the above-mentioned affinity chromatograph.
  • Antibodies can be separated and purified. Examples of the chromatography include ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, and gel filtration. These chromatographs are applicable to HPLC. Alternatively, reverse phase HPLC can be used.
  • the concentration of the antibody obtained in 2-1 can be measured by measuring absorbance or ELISA. That is, in the case of measuring the absorbance, after appropriately diluting with PBS (-), measure the absorbance at 280 nm, and calculate 1 mg / ml as 1.350D.
  • ELISA it can be measured as follows. That is, 0.1M bicarbonate buffer (pH Goat anti-human IgG (manufactured by TAG0) 1001 diluted to 1 g / ml with 9.6) was added to a 96-well plate (manufactured by Nunc), incubated at 4 ° C, and the antibody was solidified. Become
  • the modified IL-6 used in the present invention is a substance that has an activity of binding to an IL-6 receptor and does not transmit a biological activity of IL-6. That is, the modified IL-6 competitively binds to IL-6 receptor with IL-6, but does not transmit the biological activity of IL-6, and thus blocks signal transduction by IL-6.
  • the IL-6 variant is produced by introducing a mutation by substituting an amino acid residue in the amino acid sequence of IL-6.
  • IL-6 which is the basis of the IL-6 variant, may be of any origin, but is preferably human IL-6 in consideration of antigenicity and the like.
  • the amino acid sequence of IL-6 can be determined using a known molecular modeling program, for example, WHAT IF (Vriend et al., J. Mol. Graphics (1990) 8, 52-56). This is done by predicting its secondary structure and evaluating its effect on the overall amino acid residue to be replaced.
  • the vector containing the nucleotide sequence coding for the human IL-6 gene is used as a template to perform the routine PCR (Polymerization).
  • Recombinant IL-6 method to introduce a mutation to replace the amino acid The gene is obtained. This can be inserted into an appropriate expression vector if necessary, and a modified IL-6 can be obtained according to the above-described methods for expressing, producing and purifying a recombinant antibody.
  • 1-6 variants include Brakenhoff et al., J. Biol. Chem. (1994) 269, 86-93, and Savino et al., EMBO J. (1994) 13, 1357- 1367, W096- 18648, W096-17869.
  • the IL-6 partial peptide or IL-6 receptor partial peptide used in the present invention has an activity of binding to IL-6 receptor or IL-6, respectively, and has a biological activity of IL-6.
  • a substance that does not transmit active activity That is, the IL-6 partial peptide or the IL-6 receptor partial peptide binds to the IL-6 receptor or IL-6, and captures these to bind to the IL-6 1L-6 receptor. Specifically inhibits binding. As a result, it does not transmit the biological activity of IL-6 and thus blocks signal transduction by I-6.
  • IL-6 partial peptide or IL-6 receptor partial peptide is a region involved in the binding between 1L-6 and IL-6 receptor in the amino acid sequence of IL-6 or IL-6 receptor. Is a peptide consisting of a part or all of the amino acid sequence. Such peptides usually consist of 10 to 80, preferably 20 to 50, more preferably 20 to 40 amino acid residues.
  • the 6 partial peptide or IL-6 receptor partial peptide is involved in the binding between IL-6 and IL-6 receptor in the amino acid sequence of IL-6 or IL-6 receptor.
  • a region can be specified, and a part or all of the amino acid sequence can be prepared by a generally known method, for example, a genetic engineering method or a peptide synthesis method.
  • an IL-6 partial peptide or an IL-6 receptor partial peptide by a genetic engineering method a DNA sequence encoding a desired peptide is incorporated into an expression vector, and It can be obtained according to the expression, production and purification methods of the recombinant antibody.
  • a method generally used in peptide synthesis for example, a solid phase synthesis method or a liquid phase method Synthetic methods can be used.
  • the peptide is deprotected and cleaved from the support of the peptide chain.
  • hydrogen fluoride or trifluormethanesulfonic acid can be usually used in the Boc method
  • TFA can be usually used in the Fmoc method.
  • the Boc method for example, the above-mentioned protective peptide resin is treated in the presence of anisol in hydrogen fluoride.
  • the protecting group is removed and the peptide is cleaved from the support to recover the peptide.
  • the crude peptide is obtained by freeze-drying.
  • a deprotection reaction and a cleavage reaction from a peptide chain support can be carried out in TFA by the same operation as described above.
  • the obtained crude peptide can be separated and purified by applying to HPLC.
  • the elution may be performed under optimal conditions using a water-acetonitrile solvent commonly used for protein purification.
  • the fraction corresponding to the peak of the obtained chromatographic profile is collected and freeze-dried. Petit purified in this way
  • the dope fraction is identified by mass spectrometry molecular weight analysis, amino acid composition analysis, amino acid sequence analysis, or the like.
  • IL-6 partial peptide and the IL-6 receptor partial peptide are disclosed in JP-A-2-188600, JP-A-7-324097, JP-A-8-311098, and US Pat. I have.
  • the activity of the IL-6 antagonist used in the present invention can be evaluated by a generally known method.
  • BSF2 was added IL-6, the 3 H- Ji Mi Jin uptake by Ri IL- 6 dependent cells and this coexist IL- 6 antagonists preparative an indicator You just have to evaluate it.
  • the addition of unlabeled IL- 6 of IL-6 is a receptor-expressing cells U266 to 125 1-labeled IL- 6 over Amaryou, I physician 6 A Ntagonisu preparative added simultaneously, IL - 6 receptor-expressing by the child measuring 125 1-labeled IL- 6 bound to the cell, it may be evaluated.
  • the IL-6 antagonist used in the present invention in an animal in which T cells have been sensitized by antigen administration or the like. And assessing the suppressive effect of sensitized T cells.
  • Mycobacterium tuberculosis As a sensitizing antigen to be administered to an animal, for example, Mycobacterium tuberculosis can be used.
  • the animal to be immunized may be an animal usually used in an experiment, for example, a mouse, a rat, a rabbit, and the like.
  • the effect of the present invention to be evaluated can be confirmed by observing a delayed inflammatory response induced by challenge of the same antigen to an animal immunized with the antigen.
  • IL-6 pancreatic antibodies such as anti-IL-6 receptor antibody are sensitized T cells. It was shown to have an inhibitory effect on cells.
  • the agent for preventing or treating a sensitized T cell-related disease of the present invention can be parenterally administered systemically or locally.
  • intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, or subcutaneous injection such as infusion can be selected, and the administration method can be appropriately selected according to the age and symptoms of the patient.
  • the effective dose is selected in the range of 0.01 mg / kg to 100 mg / kg body weight at a time.
  • a dose of 1 to 1000 mg, preferably 5 to 50 mg per patient can be chosen.
  • the preventive or therapeutic agent for a sensitized T cell-related disease of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier or additive depending on the administration route.
  • a pharmaceutically acceptable carrier or additive include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinyl vinylidone, carboxyvinyl polymer, and carboxymethyl cellulose.
  • the additives to be used are appropriately selected from the above or in combination according to the dosage form, but are not limited thereto.
  • the disease to be prevented or treated in the present invention is a disease involving sensitized ⁇ cells. Specific examples include delayed hypersensitivity, chronic thyroiditis, uveitis, atopic dermatitis, contact dermatitis, and multiple sclerosis.
  • the prophylactic or therapeutic agent of the present invention is useful as a prophylactic or therapeutic agent for these diseases involving sensitized ⁇ cells.
  • Example 1 Inhibitory effect of delayed type paw reaction
  • the MR16-1 antibody was intraperitoneally administered 0.125 mg, 0.5 mg or 2 only once at the same time as the antigen sensitization.
  • Rat G (KH-5) having the same isotype was administered to the control group, and physiological saline was similarly administered to the unsensitized mouse group. The result is shown in Figure 1.
  • a soluble IL-6 receptor was prepared by the PCR method. Plasmid pBSF2R.236 was digested with restriction enzyme SphI to obtain IL-6 receptor cDNA, which was inserted into mpl8 (Amersham). Using a synthetic oligo primer designed to introduce a stop codon into the IL-6 receptor cDNA, the PCR method was performed using an invitro miu uta geneesis system (manufactured by Amersham). Mutations were introduced into the 1L-6 receptor cDNA. By this operation, a stop codon was introduced at the position of amino acid 345, and a cDNA encoding a soluble IL-6 receptor was obtained.
  • soluble IL-6 receptor cDNA In order to express the soluble IL-6 receptor cDNA in CH0 cells, it was ligated with plasmid pSV (manufactured by Pharmacia) to obtain plasmid pSVL344.
  • plasmid pSV manufactured by Pharmacia
  • the soluble IL-6 receptor cDNA cut with HindIII-SalI was inserted into a plasmid pECEdhfr containing the cDNA of dhfr to obtain a CH0 cell expression plasmid pECEdhfr344.
  • CH0 cells were screened by limiting dilution to obtain a single CH0 cell clone.
  • This CH0 cell clone was amplified with methotrexate (MTX) at a concentration of 20 nM to 200 nM to obtain a human soluble IL-6 receptor-producing CH0 cell line 5E27.
  • CH0 cell line 5E27 was cultured in Iscope modified Dulbecco's medium (IMDM, Gibco) containing 5BS. The culture supernatant was collected, and the concentration of soluble receptor 6 in the culture supernatant was measured by ELISA.
  • IMDM Iscope modified Dulbecco's medium

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Description

明 細 書
I L一 6 アンタゴニス トを有効成分と して含有する感作 T細胞関与 疾患の予防 · 治療剤 技術分野
本発明はィ ンタ一ロイキン- 6 ( IL-6) アンタゴニス トを有効成分 と して含有する感作 T 細胞関与疾患の予防または治療剤に関する。 また、 本発明は、 IL-6ア ンタゴニス トを有効成分とする感作 T 細胞 抑制剤に関する。 さ らに、 本発明は 1レ6受容体に対する抗体を有効 成分とする感作 T 細胞抑制剤に関する。 背景技術
IL- 6は B 細胞刺激因子 2 (BSF2) あるいはイ ンタ一フ ヱロ ン /32 とも呼称されたサイ ト力イ ンである。 IL- 6は、 B リ ンパ球系細胞の 活性化に関与する分化因子と して発見され （Hirano, T. et al.， N ature (1986) 324, 73-76 ) 、 その後、 種々の細胞の機能に影響を 及ぼす多機能サイ ト力イ ンであることが明らかになった （ Ak i ra， S . et al. , Adv. in Immunology (1993) 54, 1 -78) 。 Iい 6は、 T リ ンパ球系細胞の成熟化を誘導するこ とが報告されている （Lotz et al. , J. Exp. Immunol.18: 1253-1258, 1988) 。
IL- 6は、 細胞上で二種の蛋白質を介してその生物学的活性を伝達 する。 一つは、 IL- 6が結合する分子量約 80kDのリ ガン ド結合性蛋白 質の IL- 6受容体である。 IL- 6受容体は、 細胞膜を貫通して細胞膜上 に発現する膜結合型の他に、 主にその細胞外領域からなる可溶性 IL -6受容体と しても存在する。
もう一つは、 非リ ガン ド結合性のシグナル伝達に係わる分子量約 130kD の膜蛋白質 gpl30 である。 IL- 6と IL-6受容体は Iい 6Z Iい 6受 容体複合体を形成し、 次いで gP130 と結合することにより、 IL- 6の 生物学的活性が細胞内に伝達される （Taga, T. et al.， J. Exp. M ed. (1987) 166, 967 ) 。
IL-6ア ンタ ゴニス トは、 I L- 6の生物学的活性の伝達を阻害する物 質であり、 これまでに、 IL- 6に対する抗体 （抗 IL- 6抗体） 、 IL- 6受 容体に対する抗体 （抗 1L- 6受容体抗体） 、 gpl30 に対する抗体 （抗 gpl30 抗体） が知られている。 また、 その他に、 国際特許出願公開 番号 W0 95-00852 、 国際特許出願公開番号 W0 95-11303 、 国際特許 出願公開番号 W0 96-34104 、 国際特許出願公開番号 W0 96-18648 、 国際特許出願公開番号 W0 96-17869 、 特開平 7- 324097、 特開平 8-31 1098に開示された IL- 6ァンタゴニス 卜が知られている。
抗 IL-6受容体抗体に関しては、 いく つかの報告がある （Novick, D. et al. , Hybridoma (1991) 10， 137-146 、 Huang, Y. W, et al .， Hybridoma (1993) 12， 621-630 、 国際特許出願公開番号 WO 95- 09873 、 フ ラ ンス特許出願公開番号 FR 2694767、 米国特許番号 US 5 21628 ) 。 その一つであるマウス抗体 PM-1 (Hirata, et al. , J. I mmunology (1989) 143， 2900-2906 ) の相捕性決定領域 （CDR ) を ヒ ト抗体へ移植することにより得られたヒ ト型化 PM- 1抗体が知られ ている （国際特許出願公開番号 W0 92-19759 ) 。
一方、 多く の自己免疫疾患やアレルギー疾患において、 特定の抗 原を認識する T細胞 （感作 T細胞） が存在し、 この感作 T 細胞が病 態に関与していることが知られている。 例えば、 多発性硬化症では ミ エ リ ン塩基性タ ンパク （Zhang, J. et al. , J. Exp. Med (1994) 1 79， 973-984 ) 、 ぶどう膜炎では S抗原 （ Nussenblat t， R. B. et a 1. , Am. J. Ophthalmol ( 1980) 89, 173- 179 ) 、 慢性甲状腺炎では サイ ログロブリ ン、 ア ト ピー性皮膚炎では食物、 ダニなど （Kubota ， Y. et al. , J. Dermatol (1993) 20, 85-87, Kondo, N. et al.， J. Allergy Clin. Immunol (1993) 91, 658-668) 、 遅延型過敏症で は細菌、 ウィルス、 カ ビなど、 接触性皮膚炎では金属、 漆などを抗 原とする感作 T細胞の存在が知られている。
さ らに、 これらの抗原を動物に免疫したり、 抗原特異的感作 T細 胞を非免疫動物に移入することにより ヒ 卜と類似の病態を誘導する こと も可能である。 このことから、 感作 T細胞が上記疾患において 重要な役割を果たしていると考えられている。 現在、 これら疾患の 治療にはステロイ ド剤ゃ免疫抑制剤が使用されているが、 対症療法 であり、 しかも長期間の投与が必要とされ、 副作用が問題となって いる。
これまでに、 上記のような Iい 6アンタゴニス トが感作 T細胞抑制 効果を示し、 感作 T 細胞が関与する疾患に対して治療効果を有する ことは知られていなかった。 発明の開示
本発明は、 前記の欠点を有さない感作 T 細胞関与疾患の治療剤を 提供しょう とするものである。
すなわち、 本発明は、 IL- 6アンタゴニス トを有効成分と して含有 する感作 T 細胞関与疾患の予防または治療剤に関する。
本発明はまた、 IL-6受容体に対する抗体を有効成分と して含有す る感作 T 細胞関与疾患の予防または治療剤に関する。
本発明はまた、 1L-6受容体に対するモノ クロ一ナル抗体を有効成 分と して含有する感作 T 細胞関与疾患の予防または治療剤に関する 本発明はまた、 ヒ ト IL- 6受容体に対するモノ ク ローナル抗体を有 効成分と して含有する感作 T 細胞関与疾患の予防または治療剤に関 する。
本発明はまた、 マウス IL-6受容体に対するモノ ク ローナル抗体を 有効成分と して含有する感作 T 細胞関与疾患の予防または治療剤に 関する。
本発明はまた、 PM-1抗体を有効成分と して含有する感作 T 細胞関 与疾患の予防または治療剤に関する。
本発明はまた、 MR16- 1抗体を有効成分と して含有する感作 T 細胞 関与疾患の予防または治療剤に関する。
本発明はまた、 ヒ ト抗体定常領域 （C 領域） を有する IL- 6受容体 に対する抗体を有効成分と して含有する感作 T 細胞関与疾患の予防 または治療剤に関する。
本発明はまた、 IL- 6受容体に対するキメ ラ抗体またはヒ ト型化抗 体を有効成分と して含有する感作 T 細胞関与疾患の予防または治療 剤に関する。
本発明はまた、 ヒ ト型化 PM-1抗体を有効成分と して含有する感作 T 細胞関与疾患の予防または治療剤に関する。
本発明はまた、 上記 IL- 6アンタゴニス トを有効成分と して含有す る多発性硬化症、 ぶどう膜炎、 慢性甲状腺炎、 遅延性過敏症、 接触 性皮膚炎またはァ ト ビー性皮膚炎の予防または治療剤に関する。 本発明はまた、 IL-6アンタゴニス トを有効成分とする感作 T 細胞 抑制剤に関する。
本発明はさ らに、 IL- 6受容体に対する抗体を有効成分とする感作 T 細胞抑制剤に関する。 図面の簡単な説明
図 1 は、 結核菌感作と同時に MR16-1を投与した際の、 MR 16-1のマ ウス遅延型足せき浮腫反応抑制作用を示す。 発明の実施の形態
1. IL-6 ァ ンタ ゴニス上
本発明で使用される IL- 6ァンタゴニス トは、 感作 T 細胞の抑制効 果または、 感作 T 細胞が関与する疾患の予防または治療効果を示す ものであれば、 その由来、 種類および形状を問わない。
IL- 6ア ンタ ゴニス ト は、 IL- 6によ る情報伝達を遮断し、 IL- 6の生 物学的活性を阻害する物質である。 1レ6ア ンタゴニス 卜 と しては、 抗 IL- 6抗体、 抗 IL- 6受容体抗体、 抗 gpl30 抗体、 IL- 6改変体、 ある いは 1L- 6または IL-6受容体の部分べプチ ドが挙げられる。
1-1. 抗 IL- 6抗体
本発明で使用される抗 1レ 6抗体は、 公知の手段を用いてポ リ ク ロ ーナルまたはモノ ク ロ一ナル抗体と して得ることができる。 本発明 で使用される抗 IL-6抗体と して、 特に哺乳動物由来のモノ ク ロ一ナ ル抗体が好ま しい。 哺乳動物由来のモノ ク ロ一ナル抗体と しては、 ハイプリ ドーマに産生されるもの、 および遺伝子工学的手法により 抗体遺伝子を含む発現ベク ターで形質転換した宿主に産生される も のがある。 この抗体は IL- 6と結合するこ とにより、 Iい 6の IL- 6受容 体への結合を阻害して IL-6の生物学的活性の細胞内への伝達を遮断 する抗体である。
このような抗体と しては、 MH166 (Matsuda et al. , Eur. J. Im munol. (1988) 18， 951 -956) や SK2 抗体 （Sato, K. et al. , 第 21回 日本免疫学会総会、 学術記録（1991) 21, 166) 等が挙げられ
^> o
1-1-1. IL-6 の調製
抗 IL- 6抗体産生ハイプリ ドーマは、 基本的には公知技術を使用 し 、 以下のよう にして作製できる。 すなわち、 IL-6を感作抗原と して 使用 して、 これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、 得られる免 疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、 通常 のスク リ 一二ング法により、 モノ ク ローナルな抗体産生細胞をスク リ ーニングするこ とによって作製できる。
具体的には、 抗 IL-6抗体を作製するには次のようにすればよい。 例えば、 抗体取得の感作抗原と して使用される ヒ ト IL-6は、 Eur. J . Biochem (1987) 168， 543 、 J. Immunol. ( 1988) 140， 1534 、 あるいは Argic. Biol. (1990) 54， 2685に開示された Iい 6遺伝子/ ァ ミ ノ酸配列を用いることによって得られる。
IL-6の遺伝子配列を公知の発現べク 夕一系に挿入して適当な宿主 細胞を形質転換させた後、 その宿主細胞中または、 培養上清中から 目的の IL- 6蛋白質を公知の方法で精製し、 この精製 IL- 6蛋白質を感 作抗原と して用いればよい。 また、 Iい 6蛋白質と他の蛋白質との融 合蛋白質を感作抗原と して用いてもよい。
1-2. 抗 IL-6受容体抗体
本発明で使用される抗 IL- 6受容体抗体は、 公知の手段を用いてポ リ ク 口一ナルまたはモノ ク ロ一ナル抗体と して得ることができる。 本発明で使用される抗 IL-6受容体抗体と して、 特に哺乳動物由来の モノ ク ローナル抗体が好ま しい。 哺乳動物由来のモノ ク ロ一ナル抗 体と しては、 ハイプリ ドーマに産生される もの、 および遺伝子工学 的手法により抗体遺伝子を含む発現べク タ—で形質転換した宿主に 産生される ものがある。 この抗体は Iい 6受容体と結合することによ り、 IL-6の IL-6受容体への結合を阻害して IL- 6の生物学的活性の細 胞内への伝達を遮断する抗体である。
このような抗体と しては、 MR16- 1抗体 （Saito, et al.， J. Immu nol. (1993) 147, 168-173) 、 PM- 1抗体 （Hirata, et al. , J. I mm unology (1989) 143， 2900-2906 ) 、 AUK12-2 0 抗体、 AUK64-7 抗 体あるいは AUK146- 15 抗体 （国際特許出願公開番号 WO 92-19759 ) などが挙げられる。 これらのうちで、 特に好ま しい抗体と して PM - 1 抗体が挙げられる。
なお、 PM- 1抗体産生ハイプリ ドーマ細胞株は、 PM- 1と して、 工業 技術院生命工学工業技術研究所 （茨城県つく ば巿東 1 丁目 1 番 3 号 ) に、 平成 2 年 7 月 10日に、 FERM BP- 2998と してブダぺス ト条約に 基づき国際寄託された。 また、 MR16- 1抗体産生ハイプリ ドーマ細胞 株は Rat- mouse hybridoma MR16 1と して、 平成 9 年 3 月 13日に工業 技術院生命工学工業技術研究所に FERM BP- 5875と して寄託された。
1-2-1. IL-6 受容体の調製
モノ ク ロ一ナル抗体産生ハイブリ ドーマは、 基本的には公知技術 を使用 し、 以下のようにして作製できる。 すなわち、 Iし- 6受容体を 感作抗原と して使用 して、 これを通常の免疫方法にしたがって免疫 し、 得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と 融合させ、 通常のスク リ ーニング法により、 モノ ク ローナルな抗体 産生細胞をスク リ 一二ングするこ とによつて作製できる。
具体的には、 抗 IL- 6受容体抗体を作製するには次のようにすれば よい。 例えば、 抗体取得の感作抗原と して使用される ヒ ト 1L-6受容 体は、 欧州特許出願公開番号 EP 325474 に、 マウス 1L-6受容体は日 本特許出願公開番号特開平 3- 155795に開示された IL- 6受容体遺伝子 Zァ ミ ノ酸配列を用いることによって得られる。
IL- 6受容体蛋白質は、 細胞膜上に発現している ものと細胞膜より 離脱している もの （可溶性 IL- 6受容体） （Yasukawa, et al.， J. B iochem. (1990) 108, 673-676 ) との二種類がある。 可溶性 IL- 6受 容体抗体は細胞膜に結合している Iレ 6受容体の実質的に細胞外領域 から構成されており、 細胞膜貫通領域あるいは細胞膜貫通領域と細 胞内領域が欠損している点で膜結合型 IL- 6受容体と異なつている。
IL- 6受容体の遺伝子配列を公知の発現べクタ一系に挿入して適当 な宿主細胞を形質転換させた後、 その宿主細胞中または、 培養上清 中から目的の IL-6受容体蛋白質を公知の方法で精製し、 この精製 IL -6受容体蛋白質を感作抗原と して用いればよい。 また、 1L- 6受容体 を発現している細胞や IL- 6受容体蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白 質を感作抗原と して用いてもよい。
ヒ ト IL- 6受容体をコ一 ドする cDNAを含むブラス ミ ド PIBIBSF2R を 含有する大腸菌 （E. coli) は、 平成元年 （ 1989年） 1 月 9 日付でェ 業技術院生命工学工業技術研究所に、 HB101- PIBIBSF2R と して、 受 託番号 FERM BP- 2232と してブダぺス ト条約に基づき国際寄託されて いる。
1-3. 抗 gpl30 抗体
本発明で使用される抗 gpl30 抗体は、 公知の手段を用いてポ リ ク 口一ナルまたはモノ ク 口一ナル抗体と して得ることができる。 本発 明で使用される抗 gpl 30 抗体と して、 特に哺乳動物由来のモノ クロ —ナル抗体が好ま しい。 哺乳動物由来のモノ ク ローナル抗体と して は、 ハイプリ ドーマに産生される もの、 および遺伝子工学的手法に より抗体遺伝子を含む発現ベク ターで形質転換した宿主に産生され る ものがある。 この抗体は gpl30 と結合することにより、 Iい 6/1し - 6受容体複合体の gpl30 への結合を阻害して Iい 6の生物学的活性の 細胞内への伝達を遮断する抗体である。
このような抗体と しては、 AM64抗体 （特開平 3- 219894) 、 4B11抗 体および 2H4 抗体 （US5571513 ) B-S12 抗体および B- P8抗体 （特開 平 8- 291199) などが挙げられる。
1-3-1. gpl30の調製
モノ ク ローナル抗体産生ハイ プリ ドーマは、 基本的には公知技術 を使用 し、 以下のようにして作製できる。 すなわち、 gpl30 を感作 抗原と して使用 して、 これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、 得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合 させ、 通常のスク リ ーニング法により、 モノ ク ローナルな抗体産生 細胞をスク リ ーニングすることによつて作製できる。
具体的には、 モノ ク ローナル抗体を作製するには次のようにすれ ばよい。 例えば、 抗体取得の感作抗原と して使用される gpl30 は、 欧州特許出願公開番号 EP 411946 に開示された 1い 6受容体遺伝子/ ァ ミ ノ酸配列を用いるこ とによって得られる。
2P130 の遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿 主細胞を形質転換させた後、 その宿主細胞中または、 培養上清中か ら目的の gpl30 蛋白質を公知の方法で精製し、 この精製 IL-6受容体 蛋白質を感作抗原と して用いればよい。 また、 gpl30 を発現してい る細胞や gpl30 蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原と し て用いてもよい。
1-4. 抗体産生ハイプリ ドーマの作製
感作抗原で免疫される哺乳動物と しては、 特に限定される もので はないが、 細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択す るのが好ま しく 、 一般的にはげつ歯類の動物、 例えば、 マウ ス、 ラ ッ ト、 ハムスター等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、 公知の方法にしたがって行われ る。 例えば、 一般的方法と して、 感作抗原を哺乳動物の腹腔内また は、 皮下に注射することにより行われる。 具体的には、 感作抗原を PBS (Phosphate-Buffered Saline ) や生理食塩水等で適当量に希 釈、 懸濁したものを所望により通常のアジュバン ト、 例えば、 フロ ィ ン ト完全アジュバン トを適量混合し、 乳化後、 哺乳動物に 4-21日 毎に数回投与するのが好ま しい。 また、 感作抗原免疫時に適当な担 体を使用することができる。
このように免疫し、 血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確 認した後に、 哺乳動物から免疫細胞が取り出され、 細胞融合に付さ れる。 細胞融合に付される好ま しい免疫細胞と しては、 特に脾細胞 が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞と しての哺乳動物の ミ エ ローマ細胞は、 すでに、 公知の種々の細胞株、 例えば、 P3X63Ag8.6 53 (J. Immnol. (1979) 123: 1548-1550) 、 P3X63Ag8U.1 (Curren t Topics in Microbiol ogy and Immunology (1978) 81: 1-7) 、 NS - 1 (Kohler. G. and Mi lstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6： 511-519) 、 MFC- 11 (Mar gul ies. D. H. et al. , Cell (1976) 8: 405-415) 、 SP2/0 (Shulman, M. et al. , Nature (1978) 276: 2 69-270) 、 F0 (de St. Groth, S. F. et al. , J. Immunol. Method s (1980) 35: 卜 21)、 S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (19 78) 148: 313-323) 、 R210 (Galf re, G. et al. , Nature (1979) 2 77: 131-133 ) 等が適宜使用される。
前記免疫細胞と ミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方 法、 たとえば、 ミ ノレスティ ンらの方法 （Kohler. G. and Mi lstein, C. 、 Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46) 等に準じて行う ことが できる。
より具体的には、 前記細胞融合は例えば、 細胞融合促進剤の存在 下に通常の栄養培養液中で実施される。 融合促進剤と しては例えば 、 ポ リ エチ レ ングリ コール （PEG ) 、 セ ンダイ ウ ィ ルス （HVJ ) 等 が使用され、 更に所望により融合効率を高めるためにジメ チルスル ホキシ ド等の補助剤を添加使用するこ と もできる。
免疫細胞と ミ エローマ細胞との使用割合は、 例えば、 ミ エ口一マ 細胞に対して免疫細胞を 1 〜10倍とするのが好ま しい。 前記細胞融 合に用いる培養液と しては、 例えば、 前記ミ エローマ細胞株の増殖 に好適な RPMI 1640培養液、 MEM 培養液、 その他、 この種の細胞培養 に用いられる通常の培養液が使用可能であり、 さ らに、 牛胎児血清
( FCS ) 等の血清補液を併用することもできる。
細胞融合は、 前記免疫細胞と ミ エローマ細胞との所定量を前記培 養液中でよ く混合し、 予め、 37°C程度に加温した PEG 溶液、 例えば 、 平均分子量 1000〜6000程度の PEG 溶液を通常、 30〜60 % ( w/v ) の濃度で添加し、 混合することによって目的とする融合細胞 （ハイ プリ ドーマ） が形成される。 続いて、 適当な培養液を逐次添加し、 遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイプリ ドーマ の生育に好ま し く ない細胞融合剤等を除去できる。
当該ハイプリ ドーマは、 通常の選択培養液、 例えば、 HAT 培養液
(ヒポキサンチン、 ア ミ ノ ブテリ ンおよびチ ミ ジンを含む培養液） で培養するこ とにより選択される。 当該 HAT 培養液での培養は、 目 的とするハイプリ ドーマ以外の細胞 （非融合細胞） が死滅するのに 十分な時間、 通常数日〜数週間継続する。 ついで、 通常の限界希釈 法を実施し、 目的とする抗体を産生するハイプリ ドーマのスク リ ー 二 ングぉよび単一ク 口一ニングが行われる。
また、 ヒ ト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリ ドーマを得 る他に、 ヒ ト リ ンパ球を i n v i t roで所望の抗原蛋白質または抗原発 現細胞で感作し、 感作 B リ ンパ球をヒ ト ミエローマ細胞、 例えば U2 66と融合させ、 所望の抗原または抗原発現細胞への結合活性を有す る所望のヒ ト抗体を得ること もできる （特公平 1 -59878 参照） 。 さ らに、 ヒ ト抗体遺伝子の全てのレバ一 ト リ ーを有する トラ ンスジェ ニッ ク動物に抗原または抗原発現細胞を投与し、 前述の方法に従い 所望のヒ ト抗体を取得してもよい （国際特許出願公開番号 W0 93/12 227 、 W0 92/03918 、 W0 94/02602 、 W0 94/25585 、 W0 96/34096 、 W0 96/33735 参照） 。
このよ う にして作製されるモノ ク ローナル抗体を産生するハイブ リ ドーマは、 通常の培養液中で継代培養するこ とが可能であり、 ま た、 液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイプリ ドーマからモノ ク ローナル抗体を取得するには、 当 該ハイプリ ドーマを通常の方法にしたがい培養し、 その培養上清と して得る方法、 あるいはハイプリ ドーマをこれと適合性がある哺乳 動物に投与して増殖させ、 その腹水と して得る方法などが採用され る。 前者の方法は、 高純度の抗体を得るのに適しており、 一方、 後 者の方法は、 抗体の大量生産に適している。
例えば、 抗 IL- 6受容体抗体産生ハイプリ ドーマの作製は、 特開平 3 - 139293に開示された方法により行う ことができる。 工業技術院生 命工学工業技術研究所 （茨城県つく ば巿東 1 丁目 1 番 3 号） に、 平 成 2 年 7 月 10日に、 FERM BP- 2998と してブタぺス ト条約に基づき国 際寄託された PM-1抗体産生ハイプリ ドーマを BALB/cマウス （日本ク レア製） の腹腔内に注入して腹水を得、 この腹水から PM-1抗体を精 製する方法や、 本ハイプリ ドーマを適当な培地、 例えば、 10%ゥ シ 胎児血清、 5 % BM-Condimed HI (Boehringer Mannheim 製） 含有 RP MI 1640培地、 ハイプリ ドーマ SFM 培地 （GIBCO- BRL 製） 、 PFHM- II 培地 （GIBC0-BRL 製） 等で培養し、 その培養上清から PM-1抗体を精 製する方法で行う こ とができる。
1-5. 組換え型抗体
本発明には、 モノ ク ローナル抗体と して、 抗体遺伝子をハイプリ ドーマからク ローニ ングし、 適当なベク タ一に組み込んで、 これを 宿主に導入し、 遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体 を用いることができる （例えば、 Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, TERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照） 。 具体的には、 目的とする抗体を産生するハイプリ ドーマから、 抗 体の可変 （V ) 領域をコー ドする mRNAを単離する。 mRNAの単離は、 公知の方法、 例えば、 グァニジ ン超遠心法 （Chirgwin, J. . ら、 Biochemistry (1979) 18, 5294-5299 ) 、 AGPC法 （ Chmczynsk i， P. ら、 （1987) 162， 156-159 ) 等により全 RNA を調製し、 mRNA Purif ication Kit ( Pharmac i a 製） 等を使用 して mRNAを調製する。 また 、 QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia 製） を用いるこ とにより mRNAを直接調製することができる。
得られた mRNAから逆転写酵素を用いて抗体 V 領域の cDNAを合成す る。 cDNAの合成は、 AMV Reverse Transcriptase F i r s t -s t rand cD NA Synthesis K i t等を用いて行う こ とができる。 また、 cDNAの合成 および増幅を行うには 5' - Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製） および PCR を用いた 5' -RACE 法 （Frohman, M. A. ら、 Proc. Natl . Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998 - 9002 ； Belyavsky, A. ら、 Nu cleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932 ) を使用することができ る。 得られた PCR 産物から目的とする DNA 断片を精製し、 ベク ター DNA と連結する。 さ らに、 これより組換えベク ターを作成し、 大腸 菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えべクタ一を調製す る。 目的とする DNA の塩基配列を公知の方法、 例えば、 デォキシ法 により確認する。
目的とする抗体の V 領域をコ一 ドする DNA が得られれば、 これを 所望の抗体定常領域 （C 領域） をコー ドする DNA と連結し、 これを 発現べク タ一へ組み込む。 または、 抗体の V 領域をコー ドする DNA を、 抗体 C 領域の DNA を含む発現ベクターへ組み込んでもよい。 本発明で使用される抗体を製造するには、 後述のように抗体遺伝 子を発現制御領域、 例えば、 ェンハンサ一、 プロモーターの制御の もとで発現するよう発現ベク ターに組み込む。 次に、 この発現べク ターにより宿主細胞を形質転換し、 抗体を発現させることができる 1-6. 改変抗体
本発明では、 ヒ トに対する異種抗原性を低下させること等を目的 と して人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、 例えば、 キメ ラ （Ch imeric) 抗体、 ヒ ト型化 （Humanized ) 抗体を使用できる。 これら の改変抗体は、 既知の方法を用いて製造することができる。
キメ ラ抗体は、 前記のようにして得た抗体 V 領域をコー ドする DN A をヒ ト抗体 C 領域をコ一 ドする DNA と連結し、 これを発現べク タ 一に組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる （欧州 特許出願公開番号 EP 125023 、 国際特許出願公開番号 W0 96/02576 参照） 。 この既知の方法を用いて、 本発明に有用なキメ ラ抗体を得 るこ とができる。
例えば、 キメ ラ PM-1抗体の L 鎖および H 鎖の V 領域をコ一 ドする DNA を含むプラス ミ ドは、 各々 pPM- k3および pPM- hiと命名され、 こ のプラ ス ミ ドを有する大腸菌は、 National Collections of Indust rial and Marine Bacteria Limitedに、 1991年 2 月 11日に、 各々 NC 1MB 40366 、 NCIMB40362と してブダぺス ト条約に基づき国際寄託さ れている （国際特許出願公開番号 W0 92-19759 参照） 。
ヒ ト型化抗体は、 再構成 （reshaped) ヒ ト抗体と も称され、 ヒ ト 以外の哺乳動物、 たとえばマウス抗体の相補性決定領域 （CDR; com plementar i ty determining region ) をヒ ト抗体の相補性決定領域 へ移植したものであり、 その一般的な遺伝子組換え手法も知られて いる （欧州特許出願公開番号 EP 125023 、 国際特許出願公開番号 W0 96/02576 参照） 。
具体的には、 マウス抗体の CDR と ヒ ト抗体のフ レームワーク領域 (FR; framework region) を連結するように設計した DNA 配列を、 末端部にオーバーラ ップする部分を有するように作製した数個のォ リ ゴヌ ク レオチ ドから PCR 法により合成する。 得られた DNA をヒ ト 抗体 C 領域をコー ドする DNA と連結し、 次いで発現ベク ターに組み 込んで、 これを宿主に導入し産生させるこ とにより得られる （欧州 特許出願公開番号 EP 239400 、 国際特許出願公開番号 W0 92-19759 参照） 。
CDR を介して連結される ヒ 卜抗体の FRは、 相補性決定領域が良好 な抗原結合部位を形成するものが選択される。 必要に応じ、 再構成 ヒ ト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように 抗体の可変領域のフ レームワーク領域のア ミ ノ酸を置換してもよい (Sato, K. et al. , Cancer Res. (1993) 53, 851-856) 。
キメ ラ抗体、 ヒ ト型化抗体には、 ヒ ト抗体 C 領域が使用される。 ヒ ト抗体 C 領域と しては、 C ァが挙げられ、 例えば、 C ァ 1 、 C ァ 2 、 C γ 3 、 C ァ 4 を使用することができる。 また、 抗体またはそ の産生の安定性を改善するために、 ヒ ト抗体 C 領域を修飾してもよ い。
キメ ラ抗体はヒ ト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域と ヒ ト抗体 由来の C 領域からなり、 ヒ ト型化抗体はヒ ト以外の哺乳動物由来抗 体の相補性決定領域と ヒ ト抗体由来のフ レームワーク領域 （framew ork region; FR) および C 領域からなり、 ヒ ト体内における抗原性 が低下しているため、 本発明の治療剤の有効成分と して有用である 本発明に使用される ヒ ト型化抗体の好ま しい具体例と しては、 ヒ ト型化 PM-1抗体が挙げられる （国際特許出願公開番号 W0 92-19759 参照） 。
1-7. 発現および産生
前記のように構築した抗体遺伝子は、 公知の方法により発現させ 、 取得するこ とができる。 哺乳類細胞の場合、 常用される有用なプ 口モータ一、 発現される抗体遺伝子、 その 3"側下流にポ リ A シグナ ルを機能的に結合させた DNA あるいはそれを含むベク タ一により発 現させるこ とができる。 例えばプロモーター Zェンハンサ一と して は、 ヒ トサイ トメガロウ ィ ルス前期プロモータ一/ェンハンサー （ human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer ソ を 挙げることができる。
また、 その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモ —ター Zェンハンサ一と して、 レ トロゥ イ ノレス、 ポ リオ一マウィ ル ス、 アデノ ウ イ ルス、 シ ミ ア ンウ ィ ルス 40 ( SV 40 ) 等のウ ィ ルス プロモーター Zェ ンノヽ ンサ一ゃヒ ト ェロ ンゲ一 シ ョ ンフ ァ ク タ一 1 a (HEF1 a ) などの哺乳類細胞由来のプロモーター/ェ ンハ ンサー を用いればよい。
例えば、 SV 40 プロモータ一/ェ ンハ ンサ一を使用する場合、 Mu lliganらの方法 （Nature (1979) 277, 108) 、 また、 HEF1 αプロモ 一夕一 Ζェ ンハ ンサーを使用する場合、 Mizushima らの方法 （Nucl eic Acids Res. (1990) 18， 5322) に従えば容易に実施することが できる。
大腸菌の場合、 常用される有用なプロモーター、 抗体分泌のため のシグナル配列、 発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現 させることができる。 例えばプロモータ一と しては、 laczプロモー 夕一、 araBプロモータ一を挙げることができる。 laczプロモーター を使用する場合、 Wardらの方法 （Nature (1098) 341, 544- 546； FA SEB J. (1992) 6, 2422-2427) 、 araBプロモータ一を使用する場合 、 Betterらの方法 （Science (1988) 240， 1041-1043 ) に従えばよ い。
抗体分泌のためのシグナル配列と しては、 大腸菌のペリ ブラズ厶 に産生させる場合、 pelBシグナル配列 （Lei， S. P. et al J. Bact eriol. (1987) 169, 4379 ) を使用すればよい。 ペリブラズムに産 生された抗体を分離した後、 抗体の構造を適切にリ フ ォール ド （re fold) して使用する （例えば、 W096/30394を参照） 。
複製起源と しては、 SV 40 、 ポリオ一マウ ィ ルス、 アデノ ウ ィ ル ス、 ゥ シノ、°ピロ一マウ イ ノレス （BPV ) 等の由来のものを用いるこ と ができ、 さ らに、 宿主細胞系で遺伝子コ ピー数増幅のため、 発現べ ク タ一は選択マ一力一と して、 ア ミ ノ グリ コ シ ド トラ ンスフ ェラー ゼ （APH ) 遺伝子、 チ ミ ジ ンキナーゼ （TK) 遺伝子、 大腸菌キサン チ ングァニ ンホスホ リ ボシル ト ラ ンスフ ヱ ラ ーゼ （ Ecogp t) 遺伝子 、 ジヒ ドロ葉酸還元酵素 （dhfr) 遺伝子等を含むことができる。 本発明で使用される抗体の製造のために、 任意の産生系を使用す るこ とができる。 抗体製造のための産生系は、 in vitroおよび in v ivo の産生系がある。 in vi troの産生系と しては、 真核細胞を使用 する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、 動物細胞、 植物細胞、 真菌細胞を用い る産生系がある。 動物細胞と しては、 （1) 哺乳類細胞、 例えば、 CH 0 、 COS 、 ミ エローマ、 BHK (baby hamster kidney ) 、 HeLa, Ve ro、 (2) 両生類細胞、 例えば、 アフ リ カッメ ガエル卵母細胞、 ある いは（3) 昆虫細胞、 例えば、 sf9 、 sf21、 Tn5 が知られている。 植 物細胞と しては、 Nicotiana tabacum 由来の細胞が知られており 、 これをカルス培養すればよい。 真菌細胞と しては、 酵母、 例えば 、 サッ カロ ミ セス （Saccharomyces ) 属、 例えばサッカロ ミ セス · セ レ ヒ シェ ( Saccharomyces cerev i s i ae) 、 糸状菌、 例えばァスぺ ルギウス属 （Aspergillus ) 属、 例えばァスペルギウス · ニガ一 （ Aspergillus ni er ) など力く知られている。
原核細胞を使用する場合、 細菌細胞を用いる産生系がある。 細菌 細胞と しては、 大腸菌 （E. coli ) 、 枯草菌が知られている。 これらの細胞に、 目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し
、 形質転換された細胞を in vitroで培養することにより抗体が得ら れる。 培養は、 公知の方法に従い行う。 例えば、 培養液と して、 DM EM、 MEM 、 RPMI 1640, 1MDMを使用するこ とができ、 牛胎児血清 （FC S ) 等の血清補液を併用すること もできる。 また、 抗体遺伝子を導 入した細胞を動物の腹腔等へ移すこ とにより、 in vivo にて抗体を 産生してもよい。
一方、 in vivo の産生系と しては、 動物を使用する産生系や植物 を使用する産生系が挙げられる。 動物を使用する場合、 哺乳類動物 、 昆虫を用いる産生系がある。
哺乳類動物と しては、 ャギ、 ブタ、 ヒッジ、 マウス、 ゥ シを用い る こ とができる （Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applica tions, 1993 ) 。 また、 昆虫と しては、 カイ コを用いることができ る。
植物を使用する場合、 例えばタバコを用いるこ とができる。
これらの動物または植物に抗体遺伝子を導入し、 動物または植物 の体内で抗体を産生させ、 回収する。 例えば、 抗体遺伝子をャギ カゼィ ンのよ うな乳汁中に固有に産生される蛋白質をコー ドする遺 伝子の途中に挿入して融合遺伝子と して調製する。 抗体遺伝子が揷 入された融合遺伝子を含む DNA 断片をャギの胚へ注入し、 この胚を 雌のャギへ導入する。 胚を受容したャギから生まれる ト ラ ンスジェ ニッ クャギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。 ト ラ ンスジニニ ッ クャギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を 増加させるために、 適宜ホルモンを トラ ンスジヱニッ クャギに使用 してもよい。 (Ebert, K. M. et al. , Bio/Technology (1994) 12， 699-702 ) 。
また、 カイ コを用いる場合、 目的の抗体遺伝子を挿入したバキュ ロウ ィ ルスをカイ コに感染させ、 このカイ コの体液より所望の抗体 を得る （Susumu, . et al. , Nature (1985) 315, 592-594 ) 。 さ らに、 タバコを用いる場合、 目的の抗体遺伝子を植物発現用べクタ 一、 例えば pMON 530に揷入し、 このべク タ一を Agrobacterium tume faciens のようなバクテリ アに導入する。 このバクテリ アをタバコ 、 例えば Nicotiana tabacum に感染させ、 本タバコの葉より所望の 抗体を得る （Julian, K. -C. Ma et al. , Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138) o
上述のよう に in vitroまたは in vivo の産生系にて抗体を産生す る場合、 抗体重鎖 （H 鎖） または軽鎖 （L 鎖） をコー ドする DNA を 別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよい し、 あるいは H 鎖および L 鎖をコー ドする DNA を単一の発現べク タ 一に組み込んで、 宿主を形質転換させてもよい （国際特許出願公開 番号 W0 94-11523 参照） 。
1-8. 抗体修飾物
本発明で使用される抗体は、 本発明に好適に使用され得るかぎり 、 抗体の断片やその修飾物であってよい。 例えば、 抗体の断片と し ては、 Fab 、 F(ab' )2 、 Fvまたは H 鎖と L 鎖の Fvを適当な リ ンカー で連結させたシングルチヱイ ン Fv (scFv) が挙げられる。 具体的に は、 抗体を酵素、 例えば、 パパイ ン、 ペプシ ンで処理し抗体断片を 生成させるか、 または、 これら抗体断片をコー ドする遺伝子を構築 し、 これを発現ベク ターに導入した後、 適当な宿主細胞で発現させ る （例えば、 Co, M. S. et al. , J. Immunol. (1994) 152, 2968-29 76、 Better, M. & Horwi tz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc. 、 Plueckthun, A. & Skerr a, A. Methods in Enzymology (1989) 178， 476 - 496， Academic Pr ess, Inc. 、 Lamoy i , E. , Methods in Enzymology (1989) 121, 65 2-663 、 Rousseaux, J. e t al. , Methods in Enzymology (1989) 121, 663-669、 Bird, R. E. et al. , TIBTECH (1991) 9, 132-137 参照） 。
scFvは、 抗体の H 鎖 V 領域と L 鎖 V 領域を連結することにより得 られる。 この scFvにおいて、 H 鎖 V 領域と L 鎖 V 領域はリ ンカー、 好ま し く は、 ペプチ ドリ ンカ一を介して連結される （Huston, J. S . et al.、 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. (1988) 85， 5879-5883 ) 。 scFvにおける H 鎖 V 領域および L 鎖 V 領域は、 上記抗体と して 記載されたもののいずれの由来であってもよい。 V 領域を連結する ぺプチ ドリ ンカーと しては、 例えばァ ミ ノ酸 12〜 19残基からなる任 意の一本鎖ぺプチ ドが用いられる。
scFvをコー ドする DNA は、 前記抗体の H 鎖または、 H 鎖 V 領域を コ一 ドする DNA 、 およびし 鎖または、 L 鎖 V 領域をコー ドする DNA を铸型と し、 それらの配列のうちの所望のァ ミ ノ酸配列をコー ドす る DNA 部分を、 その両端を規定するプライマ一対を用いて PCR 法に より増幅し、 次いで、 さ らにペプチ ドリ ンカ一部分をコー ドする DN A およびその両端を各々 H 鎖、 L 鎖と連結されるよう に規定するプ ライマー対を組み合せて増幅するこ とにより得られる。
また、 一旦 scFvをコー ドする DNA が作製されれば、 それらを含有 する発現ベク ター、 および該発現べク タ一により形質転換された宿 主を常法に従って得る こ とができ、 また、 その宿主を用いて常法に 従って、 scFvを得るこ とができる。
これら抗体の断片は、 前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現 させ、 宿主により産生させることができる。 本願特許請求の範囲で いう 「抗体」 にはこれらの抗体の断片も包含される。
抗体の修飾物と して、 ポ リエチレングリ コール （PEG ) 等の各種 分子と結合した抗体を使用すること もできる。 本願特許請求の範囲 でいう 「抗体」 にはこれらの抗体修飾物も包含される。 このような 抗体修飾物を得るには、 得られた抗体に化学的な修飾を施すこ とに よって得るこ とができる。 これらの方法はこの分野においてすでに 確立されている。
1 - 9.抗体の分離 · 精製
1-9-1. 抗体の分離 ' 精製
前記のよう に発現 · 産生された抗体は、 宿主細胞内外から分離し 均一にまで精製することができる。 本発明で使用される抗体の分離 、 精製はァフ ィ 二ティ 一ク ロマ トグラフィ ーにより行う ことができ る。 ァフ ィ 二ティ ーク ロマ トグラフィ 一に用いるカラムと しては、 例えば、 プロテイ ン A カラム、 プロテイ ン G カラムが挙げられる。 プロテイ ン A カラムに用いる担体と して、 例えば、 Hyper D 、 P0R0 S 、 Sepharose F. F.等が挙げられる。 その他、 通常のタ ンパク質で 使用されている分離、 精製方法を使用すればよ く 、 何ら限定される ものではない。 例えば、 上記ァフ ィ二ティ 一ク ロマ トグラフ ィ ー以 外のク ロマ ト グラフ ィ ー、 フィ ルター、 限外濾過、 塩析、 透析等を 適宜選択、 組み合わせれば、 本発明で使用される抗体を分離、 精製 するこ とができる。 ク ロマ トグラフ ィ ーと しては、 例えば、 イオン 交換ク ロマ ト グラフ ィ ー、 疎水ク ロマ トグラフィ ー、 ゲルろ過等が 挙げられる。 これらのク ロマ トグラフィ 一は HPLCに適用可能である 。 または逆相 HPLCを使用すること もできる。
1-9-2.抗体の濃度測定
上記 2-1 で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定または ELISA 等により行う ことができる。 すなわち、 吸光度の測定による場合に は、 を PBS (-)で適当に希釈した後、 280 nmの吸光度を測定し、 1 mg /ml を 1.35 0D と して算出する。 また、 ELISA による場合は以下の ように測定するこ とができる。 すなわち、 0. 1M 重炭酸緩衝液 （pH 9.6 ) で 1 g/ml に希釈したャギ抗ヒ ト IgG (TAG0製） 100 1 を 96穴プレー ト （Nunc製） に加え、 4 °Cでー晚イ ンキュベーシ ョ ン し、 抗体を固層化する。
ブロ ッ キングの後、 適宜希釈した本発明で使用される抗体または 抗体を含むサンプル、 あるいは標品と してヒ ト IgG (CAPPEL製） 10 0 1 を添加し、 室温にて 1 時間ィ ンキュベ一シ ョ ンする。 洗浄後 、 5000倍希釈したアルカ リ フ ォ スフ ァタ一ゼ標識抗ヒ ト IgG (BIO SOURCE製） 100 μ.1 を加え、 室温にて 1 時間イ ンキュベー トする。 洗浄後、 基質溶液を加えィ ンキュベーシ ョ ンの後、 MICROPLATE REA DER Model 3550 (Bio-Rad 製） を用いて 405nm での吸光度を測定し 、 目的の抗体の濃度を算出する。
1-10. 抗体以外の Iい 6ア ンタ ゴニス ト
本発明で使用される IL- 6改変体は、 IL-6受容体との結合活性を有 し、 且つ IL-6の生物学的活性を伝達しない物質である。 即ち、 IL-6 改変体は IL-6受容体に対し Iい 6と競合的に結合するが、 IL- 6の生物 学的活性を伝達しないため、 IL-6によるシグナル伝達を遮断する。
IL- 6改変体は、 IL- 6のァ ミ ノ酸配列のア ミ ノ酸残基を置換するこ とにより変異を導入して作製される。 IL-6改変体のも と となる IL - 6 はその由来を問わないが、 抗原性等を考慮すれば、 好ま し く はヒ ト IL-6である。 具体的には、 IL- 6のア ミ ノ酸配列を公知の分子モデリ ングプログラム、 たとえば、 WHAT IF (Vriend et al. , J. Mol. Gra hics (1990) 8， 52- 56)を用いてその二次構造を予測し、 さ らに置 換されるア ミ ノ酸残基の全体に及ぼす影響を評価することにより行 われる。 適切な置換ア ミ ノ酸残基を決定した後、 ヒ ト IL- 6遺伝子を コー ドする塩基配列を含むべクタ一を铸型と して、 通常行われる PC R (ポ リ メ レ一スチヱイ ンリ アク ショ ン） 法によりア ミ ノ酸が置換 されるよう に変異を導入することにより、 IL-6改変体をコ一 ドする 遺伝子が得られる。 これを必要に応じて適当な発現ベクターに組み 込み、 前記組換え型抗体の発現、 産生及び精製方法に準じて IL- 6改 変体を得ることができる。
1い 6改変体の具体例と しては、 Brakenhoff et al.， J. Biol. Ch em. (1994) 269， 86-93 、 及び Savino et al. , EMBO J. (1994) 13 , 1357-1367， W096- 18648， W096-17869 に開示されている。
本発明で使用される IL- 6部分べプチ ド又は IL- 6受容体部分べプチ ドは、 各々 IL- 6受容体あるいは IL-6との結合活性を有し、 且つ IL - 6 の生物学的活性を伝達しない物質である。 即ち、 IL-6部分ペプチ ド 又は IL- 6受容体部分べプチ ドは IL-6受容体又は IL-6に結合し、 これ らを捕捉するこ とにより IL-6の 1L-6受容体への結合を特異的に阻害 する。 その結果、 IL-6の生物学的活性を伝達しないため、 Iい 6によ るシグナル伝達を遮断する。
IL-6部分べプチ ド又は IL- 6受容体部分べプチ ドは、 IL- 6又は IL-6 受容体のア ミ ノ酸配列において 1L-6と IL- 6受容体との結合に係わる 領域の一部又は全部のァ ミ ノ酸配列からなるペプチ ドである。 この ようなぺプチ ドは、 通常 10〜80、 好ま し く は 20〜50、 より好ま しく は 20〜40個のァ ミ ノ酸残基からなる。
1レ6部分べプチ ド又は IL- 6受容体部分べプチ ドは、 IL-6又は IL - 6 受容体のア ミ ノ酸配列において、 IL-6と IL-6受容体との結合に係わ る領域を特定し、 その一部又は全部のァ ミ ノ酸配列を通常知られる 方法、 例えば遺伝子工学的手法又はべプチ ド合成法により作製する ことができる。
IL- 6部分べプチ ド又は IL- 6受容体部分べプチ ドを遺伝子工学的手 法により作製するには、 所望のぺプチ ドをコ一ドする DNA 配列を発 現ベクターに組み込み、 前記組換え型抗体の発現、 産生及び精製方 法に準じて得ることができる。 I L -6部分べプチ ド又は I L - 6受容体部分べプチ ドをぺプチ ド合成法 により作製するには、 ぺプチ ド合成において通常用いられている方 法、 例えば固相合成法又は液相合成法を用いるこ とができる。 具体 的には、 続医薬品の開発第 14巻ペプチ ド合成 監修矢島治明廣川書 店 1991年に記載の方法に準じて行えばよい。 固相合成法と しては、 例えば有機溶媒に不溶性である支持体に合成しょう とするペプチ ド の C末端に対応するア ミ ノ酸を結合させ、 α—ァ ミ ノ基及び側鎖官 能基を適切な保護基で保護したア ミ ノ酸を C末端から Ν末端方向の 順番に 1 ア ミ ノ酸ずつ縮合させる反応と樹脂上に結合したァ ミ ノ酸 又はべプチ ドの α —ァ ミ ノ基の該保護基を脱離させる反応を交互に 繰り返すこ とにより、 ペプチ ド鎖を伸長させる方法が用いられる。 固相ペプチ ド合成法は、 用いられる保護基の種類により B o c 法と Fm o c法に大別される。
このようにして目的とするペプチ ドを合成した後、 脱保護反応及 びべプチ ド鎖の支持体から切断する。 ぺプチ ド鎖との切断反応には 、 B o c 法ではフ ッ化水素又は ト リ フルォロメ タ ンスルホン酸を、 又 Fmo c法では TFA を通常用いることができる。 B o c 法では、 例えばフ ッ化水素中で上記保護べプチ ド樹脂をァニソール存在下で処理する 。 次いで、 保護基の脱離と支持体から切断しペプチ ドを回収する。 これを凍結乾燥するこ とにより、 粗ペプチ ドが得られる。 一方、 Fm o c法では、 例えば TFA 中で上記と同様の操作で脱保護反応及びぺプ チ ド鎖の支持体から切断反応を行う ことができる。
得られた粗べプチ ドは、 HPLCに適用することにより分離、 精製す ることができる。 その溶出にあたり、 蛋白質の精製に通常用いられ る水ーァセ トニ ト リ ル系溶媒を使用 して最適条件下で行えばよい。 得られたク ロマ トグラフ ィ 一のプロフ ァイルのピークに該当する画 分を分取し、 これを凍結乾燥する。 このようにして精製したぺプチ ド画分について、 マススぺク トル分析による分子量解析、 ア ミ ノ酸 組成分析、 又はア ミ ノ酸配列解析等により同定する。
IL- 6部分べプチ ド及び IL- 6受容体部分べプチ ドの具体例は、 特開 平 2 — 188600、 特開平 7 — 324097、 特開平 8 — 311098及び米国特許 公報 US 5210075に開示されている。
2.〖レ 6ァンタゴニス トの活性の確認
本発明で使用される IL- 6ァンタゴニス トの活性の評価は、 通常知 られた方法を使用することができる。 例えば、 IL- 6依存性細胞 MH60 . BSF2 に IL-6を添加し、 IL- 6アンタゴニス トを共存させるこ とによ り IL- 6依存性細胞の 3 H—チ ミ ジン取込みを指標と して評価すればよ い。 また、 IL-6受容体発現細胞である U266に対し 1251標識 IL- 6と過 剰量の非標識 IL- 6を添加し、 同時に Iい 6ア ンタゴニス トを加え、 IL - 6受容体発現細胞に結合した 1251標識 IL- 6を測定するこ とにより、 評価すればよい。
3.治療効果の確認
本発明により達成される効果を確認するには、 本発明で使用され る IL-6ア ンタゴニス トを、 抗原投与などで T 細胞が感作された状態 の動物ゃ感作 T 細胞を移入した動物に投与し、 感作 T 細胞の抑制効 果を評価することにより行う ことができる。
動物に投与される感作抗原と しては、 例えば、 結核菌を用いるこ とができる。
また、 免疫される動物と しては、 通常実験に用いられる動物でよ く 、 例えば、 マウス、 ラ ッ ト、 ゥサギなどを用いることができる。 評価する本発明の効果の確認は、 抗原免疫した動物に同一の抗原を チ ャ レ ンジすることにより誘導される遅延型の炎症反応を観察する こ とにより行う ことができる。
後述の実施例に示されるように、 抗 IL-6受容体抗体の投与により 、 マウス遅延型足せき浮腫反応において、 遅延型炎症反応の抑制が 認められた。 遅延型足せき浮腫反応には感作 τ 細胞が関与している こ とが知られているこ とから、 抗 I L - 6受容体抗体等の I L - 6ァン夕ゴ ニス トは感作 T 細胞に対して抑制効果を有することが示された。
4.投与経路および製剤
本発明の感作 T 細胞関与疾患の予防または治療剤は、 非経口的に 全身あるいは局所的に投与することができる。 例えば、 点滴などの 静脈内注射、 筋肉内注射、 腹腔内注射、 皮下注射を選択することが でき、 患者の年齢、 症状により適宜投与方法を選択することができ る。 有効投与量は、 一回につき体重 1 kgあたり 0. 0 1 mg から 100 mg の範囲で選ばれる。 あるいは、 患者あたり 1 〜 1 000 mg 、 好ま し く は 5 〜50 mg の投与量を選ぶことができる。
本発明の感作 T 細胞関与疾患の予防または治療剤は、 投与経路次 第で医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよ い。 このよ う な担体および添加物の例と して、 水、 医薬的に許容さ れる有機溶媒、 コラーゲン、 ポ リ ビニルアルコール、 ポ リ ビニルビ ロ リ ドン、 カルボキシ ビ二ルポ リ マー、 カルボキシメ チルセルロー スナ ト リ ウム、 ポ リ ア ク リ ル酸ナ ト リ ウ ム、 アルギン酸ナ ト リ ウム 、 水溶性デキス ト ラ ン、 カルボキシメ チルスターチナ ト リ ウム、 ぺ ク チ ン、 メ チルセルロース、 ェチルセルロース、 キサンタ ンガム、 アラ ビア ゴム、 カゼイ ン、 ゼラチ ン、 寒天、 ジグリ セ リ ン、 プロ ピ レ ング リ コール、 ポ リ エチ レ ングリ コール、 ワセ リ ン、 ノ、。ラ フ ィ ン 、 ステア リ ノレアルコール、 ステア リ ン酸、 ヒ ト血清アルブ ミ ン （ HS A ) 、 マンニ トール、 ソルビ トール、 ラ ク ト一ス、 医薬添加物と し て許容される界面活性剤などが挙げられる。
使用される添加物は、 剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組 合せて選択されるが、 これらに限定される ものではない。 本発明の予防または治療対象疾患は、 感作 τ 細胞が関与する疾患 である。 具体的には、 遅延性過敏症、 慢性甲状腺炎、 ぶどう膜炎、 ア ト ピー性皮膚炎、 接触性皮膚炎または多発性硬化症等が挙げられ る。 本発明の予防または治療剤は、 これら感作 τ 細胞が関与する疾 患の予防または治療剤と して有用である。 実施例
以下、 実施例、 参考例および実験例により本発明を具体的に説明 するが、 本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例 1 . 遅延型足せき反応抑制作用
フロイ ン トの不完全アジュバン トにミ コバクテリ ゥム · ブチリ 力 ム (Mycobactero i um butyr i cum) の乾燥死菌を 2.5 mg/ml となるよ う に加えて乳剤と した後、 C57BL/6 系雌性マウスにその 0.2 mlを皮 下注射して抗原感作を行った。 14日後に生理的食塩水に懸濁した 10 mg の ミ コノく クテリ ゥム · ブチリ カム （Mycobactero ium butyricum ) の乾燥死菌を、 右側フ ッ トパッ ド （foot pad) に皮下注射して反 応を惹起した。 24時間後に左右のフ ッ トパッ ド （foot pad) 重量を 測定し、 重量の差を反応の強さ と した。
MR16-1抗体は抗原感作と同時に 1 回のみ 0.125 mg、 0.5 mgあるい は 2 を腹腔内投与した。 コ ン トロール群にはイ ソタイプが同じで あるラ ッ ト G (KH-5) を、 また、 感作しなかったマウス群には生 理的食塩水を同様に投与した。 その結果は図 1 に示す通りである。
抗原感作日に 1 回 MR16-1を投与するこ とにより、 遅延型足せき浮 腫反応は用量依存的に抑制された。
参考例 1. ヒ ト可溶性 1L- 6受容体の調製
Yamasakiらの方法 （Science (1988) 241， 825-828 ) に従い得ら れた IL- 6受容体をコ一 ドする cDNAを含むブラス ミ ド PBSF2R.236を用 いて、 PCR 法により可溶性 IL- 6受容体を作成した。 プラス ミ ド pBSF 2R.236を制限酵素 Sph I で消化して、 I L-6受容体 cDNAを得、 これを mpl8 (Amersham製） に挿入した。 I L- 6受容体 cDNAにス ト ッ プコ ドン を導入するようにデザイ ンした合成オリ ゴプライマ一を用いて、 ィ ン ビ ト ロ ミ ユータ ジエネ シスシステム （Amersham製） によ り、 PCR 法で 1L- 6受容体 cDNAに変異を導入した。 この操作により ス ト ップコ ドンがア ミ ノ酸 345 の位置に導入され、 可溶性 IL- 6受容体をコ一 ド する cDNAが得られた。
可溶性 IL-6受容体 cDNAを CH0 細胞で発現するために、 プラス ミ ド pSV (Pharmacia 製） と連結させ、 プラス ミ ド pSVL344 を得た。 dh frの cDNAを含むプラ ス ミ ド pECEdhfrに Hind III- Sal Iで切断した可 溶性 IL- 6受容体 cDNAを挿入し， CH0 細胞発現プラ ス ミ ド pECEdhfr34 4 を得た。
10〃 g のプラ ス ミ ド pECEdhfr344 を dhf r- CHO細胞株 DXB- 11 (Urla nd et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77， 4216-4220) へカルシウ ムフ ォ スフ ヱイ ト沈降法 （Chen et al. , Mol. Cell. Bi ol. (1987) 7， 2745-2751 ) によ り、 ト ラ ンスフ ヱ ク ト した。 ト ラ ンスフ ヱ ク 卜 した CH0 細胞を ImM グルタ ミ ン、 10% 透析 FCS 、 100U /ml のペニシ リ ンおよび 100 /ml のス ト レプ トマイ シ ンを含むヌ ク レオシ ド不含 α MEM 選択培養液で 3 週間培養した。
選択された CH0 細胞を限界希釈法でスク リーニングし、 単一の CH 0 細胞ク ロ一ンを得た。 この CH0 細胞ク ロ一ンを 20nM-200nMの濃度 のメ ト ト レキセ一 ト （MTX ) で増幅し、 ヒ ト可溶性 IL- 6受容体産生 CH0 細胞株 5E27を得た。 CH0 細胞株 5E27を 5 BS を含むイ スコープ 改変ダルべコ培養液 （IMDM、 Gibco 製） で培養した。 培養上清を回 収し、 培養上清中の可溶性 1レ 6受容体の濃度を ELISA にて測定した

Claims

参考例 2. ヒ ト抗 IL- 6抗体の調製
10〃 g の組換型 Iい 6 (Hiranoら、 Immunol. Lett. , 17:41, 1988 ) をフロイ ン ト完全アジュバン ト とと もに BALB/cマウス免疫し、 血 清中に抗 IL- 6抗体が検出できるまで一週間毎にこれを続けた。 局部 のリ ンパ節から免疫細胞を摘出し、 ポ リエチレングリ コール 1500を 用いてミ エローマ細胞株 P3U1と融合させた。 ハイプリ ドーマを HAT 培養液を用いる 0iらの方法 （Selective Methods in Cellular Immu nology, W. H. Freeman and Co. , San Francisco, 351, 1980 ) に従 つて選択し、 ヒ ト 1レ6抗体を産生するハイプリ ドーマを樹立した。
ヒ ト抗 IL-6抗体を産生するハイプリ ドーマは下記のよう にして IL - 6結合ア ツセィをおこなった。 すなわち、 柔軟なポリ ビニル製の 96 穴マイ ク 口プレー 卜 (Dynatech Laboratories, Inc. 製， Al exandr ia, VA) を 0.1Mの carbonate - hydrogen carbonate緩衝液 ( H 9.6) 中で 100 1 のャギ抗マウス Ig ( 10 // 1/ml, Cooper Biomedical, I nc製 Malvern, PA) により 4 °Cでー晚コー ト した。 次いで、 プレー トを 100 u 1 の 1 %ゥシ血清アルブミ ン （BSA ) を含む PBS により 室温で 2 時間処理した。
これを PBS で洗浄した後、 100 a 1 のハイプリ ドーマ培養上清を 各穴へ加え、 4 °Cにて一晩イ ンキュベー ト した。 プレー トを洗浄し て、 2000cpm/0.5ng/wellとなるように 1 251標識組換型 Iい 6を各穴へ 添加し、 洗浄した後各穴の放射活性をガンマカウ ンタ一 （Beckman Gamma 9000， Beckman Instruments, Ful lerton, CA) で測定した。 216 個のハイブリ ドーマク ロー ンのうち 32個のハイブリ ドーマク口 ― ンが I L- 6結合ア ツセィにより陽性であった。 これらのク ローンの なかで最終的に安定な匪 166. BSF2が得られた。 該ハイプリ ドーマが 産生する抗 IL- 6抗体 MH166 は I gGl Λ型のサブタイプを有する。
ついで、 Iい 6依存性マウスハイプリ ドーマク ロー ン MH166. BSF2を 用いて MH166 によるハイプリ ドーマの増殖に関する中和活性を調べ た。 MH166. BSF2細胞を 1 x 104/200 〃 1/穴となるように分注し、 こ れに MH166 抗体を含むサンプルを加え、 48時間培養し、 15.1Ci/mM の 3 Hチ ミ ジン （New England Nuclear, Boston, MA ) を加えた後、 更に 6 時間培養を続けた。 細胞をグラスフ ィ ルタ一ペーパー上にお き、 自動ハ一ベスター ( Labo Mash Science Co. , Tokyo, Japan ) で処理した。 コ ン トロールと してゥサギ抗 1L-6抗体を用いた。
その結果、 MH166 抗体は IL-6により誘導される MH166. BSF2細胞の 3Hチ ミ ジ ンの取込みを容量依存的に阻害した。 このことより、 MH16 6 抗体は IL-6の活性を中和することが明らかとなつた。
参考例 3. ヒ ト抗 IL- 6受容体抗体の調製
Hirataらの方法 （J. Immunol. , 143:2900-2906, 1989) により作 成した抗 IL-6抗体 MT18を CNBrにより活性化させたセフ ァ ロース 4B ( Pharmacia Fine Chemi cal s製， Pi scataway, NJ) と添付の処力にし たがって結合させ、 Iい 6レセプタ一 （Science (1988) 241， 825-82 8 ) を精製した。 ヒ ト ミ エロ一マ細胞株 U266を 1¾；ジギ トニン （Wako Chemicals製） ， lOmMト リエタノールァ ミ ン （pH 7.8) および 0.15 M NaClを含む lmM p-パラア ミ ノ フ エニルメ タ ンスルフ ォニルフルォ ライ ドハイ ドロク ロ リ ド （Wako Chemicals製） （ジギ トニン緩衝液 ) で可溶化し、 セフ ァ ロース 4Bビーズと結合させた MT18抗体と混合 した。 その後、 ビーズをジギ トニン緩衝液で 6 回洗浄し、 免疫する ための部分精製 IL- 6受容体と した。
BALB/cマウスを 3 X 109 個の U266細胞から得た上記部分精製 Iい 6 受容体で 10日おきに 4 回免疫し、 その後常法によりハイプリ ドーマ を作成した。 成長陽性穴からのハイプリ ドーマ培養上清を下記の方 法にて IL-6受容体への結合活性を調べた。 5 X 107 個の U266細胞を 35S —メ チォニン （2.5mCi) で標識し、 上記ジギ トニン緩衝液で可 溶化した。 可溶化した U266細胞を 0.04ml容量のセフ ァロース 4Bビー ズと結合させた MT18抗体と混合し、 その後、 ジギ トニン緩衝液で 6 回洗浄し、 0.25mlのジギ トニン緩衝液 （PH3.4 ) により 35 S —メチ ォニン標識 IL- 6受容体を流出させ、 0.025ml の 1M Tris ( H 7.4) で中和した。
0.05mlのハイブリ ドーマ培養上清を 0.01mlの Protein G セフ ァ ロ ース （Phramacia 製） と混合した。 洗浄した後、 セフ ァ ロ一スを上 記で調製した 0.005ml の 35 S 標識 IL- 6受容体溶液とともにイ ンキュ ペー ト した。 免疫沈降物質を SDS-PAGEで分析し、 IL-6受容体と反応 するハイプリ ドーマ培養上清を調べた。 その結果、 反応陽性ハイブ リ ドーマク ロー ン PM-1を樹立した。 ハイプリ ドーマ PM- 1から産生さ れる抗体は、 IgGl/c型のサブタイプを有する。
ハイプリ ドーマ PM-1が産生する抗体のヒ ト IL-6受容体に対する IL -6の結合阻害活性をヒ ト ミ エローマ細胞株 U266を用いて調べた。 ヒ ト組換型 IL- 6を大腸菌より調製し （Hiranoら， Immunol. Lett. , 17 :41, 1988 ) 、 ボル ト ン—ハンター試薬 （New England Nuclear, B os ton, MA ) により ' 25 I標識した （Taga, T et al.， J. Exp. Me d. (1987) 166, 967) 。 4 x 105 個の U266細胞を 100 倍量の過剰な 非標識 IL- 6の存在下で室温にて、 1 時間、 70% (v/v ) のハイプリ ドーマ PM- 1の培養上清を 14000cpmの 125 I標識 Iい 6とともに培養し た。 70〃 1 のサンプルを 400 1 のマイ ク ロ フユ一ジポ リ エチ レ ン チューブに 300 IX 1 の FCS 上に重層し、 遠心の後、 細胞上の放射活 性を測定した。
その結果、 ハイプリ ドーマ PM-1が産生する抗体は、 IL-6の IL- 6受 容体に対する結合を阻害することが明らかとなつた。
参考例 4. マウス抗 IL-6受容体抗体の調製
Saito, et al. , J. Immunol. (1993) 147, 168- 173に記載の方法 により、 マウス IL-6受容体に対するモノ ク ロ一ナル抗体を調製した マウス可溶性 IL- 6受容体を産生する CH0 細胞を 10 CSを含む IMDM 培養液で培養し、 その培養上清からマウス可溶性 IL- 6受容体 RS12 ( 上記 Saito, et al参照） と Affigel 10ゲル （Biorad) に固定したァ フ ィ ニティ ーカラムを用いてマウス可溶性 IL-6受容体を精製した。 得られたマウス可溶性 IL- 6受容体 50 / g をフロイ ン ト完全アジュ ノくン ドと混合し、 ウ ィ スターラ ッ ト （日本チャルズリバー） の腹部 に注射した。 2 週間後からはフ口イ ン 卜不完全ァジュバン ドで追加 免疫した。 45日目にラ ッ トを屠殺し、 その脾細胞約 2 X 108 個を 1 X 107 個のマウス ミ エローマ細胞 P3U1と 50% の PEG1500 (ベーリ ン ガーマ ンハイ ム） をもちいて常法により細胞融合させた後、 HAT 培 地にてハイプリ ドーマをスク リーニングした。
ゥサギ抗ラ ッ ト IgG 抗体 （カ ッペル） をコー ト したプレー トにハ イブリ ドーマ培養上清を加えた後、 マウス可溶性 IL-6受容体を反応 させた。 次いで、 ゥサギ抗マウス IL-6受容体抗体およびアルカ リ フ ォ スフ ァタ一ゼ標識ヒッジ抗ゥサギ G による ELISA 方によりマウ ス可溶性 IL- 6受容体に対する抗体を産生するハイブリ ドーマをスク リ 一ニングした。 抗体の産生が確認されたハイプリ ドーマク ロー ン は 2 回のサブスク リ ーニングを行い、 単一のハイブリ ドーマク ロー ンを得た。 このクローンを MR16-1と名付けた。
このハイプリ ドーマが産生する抗体のマウス IL- 6の情報伝達にお ける中和活性を MH60. BSF2 細胞 （Matsuda et al. , J. immunol. (1 988) 18, 951-956) を用いた 3 Hチミ ジンの取込みで調べた。 96ゥェ ルプレー トに MH60. BSF 細胞を 1 x 104 個/ 200〃 1/ゥエルとなるよ うに調製した。 このプレー トに 10pg/ml のマウス IL-6と MR16- 1抗体 または RS12抗体を 12.3〜 1000ng/ml を加えて 37°C、 5% C02で 44時間 培養した後、 1 Ci/ ゥヱルの3 Hチ ミ ジ ンを加えた。 4 時間後に3 H チ ミ ジンの取込みを測定した。 その結果 MR16-1抗体は MH60. BSF2 細 胞の 3 Hチ ミ ジン取込みを抑制した。
したがって、 ハイプリ ドーマ MR16- 1が産生する抗体は、 IL-6の IL - 6受容体に対する結合を阻害することが明らかとなった。 産業上の利用可能性
本発明により、 抗 IL- 6受容体抗体等の IL- 6ァンタ ゴニス トが感作 T細胞の抑制効果を有することが示された。 したがって、 IL- 6アン タ ゴニス トは多発性硬化症、 ぶどう膜炎、 慢性甲状腺炎、 遅延性過 敏症、 接触性皮膚炎またはァ ト ビー性皮膚炎の治療剤と して有用で あるこ とが明らかにされた。
特許協力条約第 13規則の 2 の寄託された微生物への言及及び寄託 機関
寄託機関 名 称 工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名 日本国茨城県つく ば市東 1 丁目 1 一 3 微生物（1) 表 示 Rat-mouse hybr i doma MR16-1
寄託番号 ： FERM BP- 5875
寄託日 ： 1997年 3 月 13日
(2) 表 示 ： HB 101-pIBIBSF2R
寄託番号 ： FERM BP- 2232
寄託日 ： 1989年 1 月 9 日
(3) 表 示 ： PM1
寄託番号 ： FERM BP- 2998
寄託日 ： 1989年 7月 12日
寄 ft機関 名 称 ： National Collection of Industrial and
Marine Bacteria Limited あて名 ： 23 st Machar Drive Aberdeen AB2 1RY 微生物（4) 表 示 ： Escherichia coli DH5a -pPM-k3
寄託番号 ： NCIMB 40366
寄託日 ： 1991年 2月 12日
(5) 表 示 ： Escherichia col i DH5 a -pPM-hl
寄託番号 ： NCIMB 40362
寄託日 ： 1991年 2月 12日
請 求 の 範 囲
I . イ ンターロイ キン- 6 ( IL-6) ア ン夕 ゴニス トを有効成分と し て含有する感作 T 細胞関与疾患の予防または治療剤。
2. IL- 6ァンタゴニス 卜が IL- 6受容体に対する抗体であることを 特徴とする請求項 1 記載の予防または治療剤。
3. IL- 6ア ンタゴニス トが IL-6受容体に対するモノ ク ローナル抗 体であるこ とを特徴とする請求項 2 に記載の予防または治療剤。
4. IL - 6アンタゴニス トがヒ ト IL-6受容体に対するモノ ク ロ一ナ ル抗体であることを特徴とする請求項 3 に記載の予防または治療剤
5. IL-6アンタゴニス トがマウス IL- 6受容体に対するモノ クロ一 ナル抗体であるこ とを特徴とする請求項 3 に記載の予防または治療 剤。
6. IL- 6アンタゴニス トが PM-1抗体であることを特徴とする請求 項 4 に記載の予防または治療剤。
7. IL- 6アンタゴニス 卜が MR16- 1抗体であることを特徴とする請 求項 5 に記載の予防または治療剤。
8. IL- 6ア ンタ ゴニス 卜がヒ ト抗体定常領域を有する IL-6受容体 に対する抗体であるこ とを特徴とする請求項 4 に記載の予防または 治療剤。
9. IL- 6アンタゴニス トが IL- 6受容体に対するキメ ラ抗体または ヒ ト型化抗体であるこ とを特徴とする請求項 4 に記載の予防または 治療剤。
10. Iい 6ア ンタゴニス 卜がヒ ト型化 PM-1抗体であることを特徴と する請求項 9 に記載の予防または治療剤。
II. 感作 T 細胞関与疾患が、 多発性硬化症、 ぶどう膜炎、 慢性甲 状腺炎、 遅延性過敏症、 接触性皮膚炎またはア ト ピー性皮膚炎であ る、 請求項 1 ないし 10に記載の予防または治療剤。
12. I L-6アンタゴニス トを有効成分と して含有する感作 T 細胞抑 制剤。
13. I L-6受容体に対する抗体を有効成分と して含有する感作 T 細 胞抑制剤。
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