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WO2009014263A1 - インターロイキン６受容体阻害剤を有効成分とする眼炎症疾患治療剤 - Google Patents

インターロイキン６受容体阻害剤を有効成分とする眼炎症疾患治療剤 Download PDF

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WO2009014263A1
WO2009014263A1 PCT/JP2008/063809 JP2008063809W WO2009014263A1 WO 2009014263 A1 WO2009014263 A1 WO 2009014263A1 JP 2008063809 W JP2008063809 W JP 2008063809W WO 2009014263 A1 WO2009014263 A1 WO 2009014263A1
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WO
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antibody
receptor
agent
cells
receptor inhibitor
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PCT/JP2008/063809
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French (fr)
Inventor
Nobuyuki Ohguro
Yasuo Tano
Kohei Sonoda
Tatsuro Ishibashi
Original Assignee
Osaka University
Kyushu University, National University Corporation
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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Publication date
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Definitions

  • Therapeutic agent for ocular inflammatory diseases comprising an interleukin 6 receptor inhibitor as an active ingredient
  • the present invention relates to a therapeutic agent for ocular inflammatory diseases. More specifically, the present invention relates to a therapeutic agent for ocular inflammatory diseases comprising an interleukin 6 (IL-6) receptor inhibitor as an active ingredient.
  • IL-6 interleukin 6
  • Interleukin 6 is a cytodynamic force also called B cell stimulating factor 2 (BSF2) or interferon / 32.
  • BSF2 B cell stimulating factor 2
  • IL-6 was discovered as a differentiation factor involved in the activation of B lymphocyte cells (Non-patent Document 1), and it was later revealed that it is a multifunctional site force-in that affects the functions of various cells. (Non-Patent Document 2).
  • IL-6 has been reported to induce maturation of T lymphocyte cells (Non-patent Document 3).
  • IL-6 transmits its biological activity through two proteins on the cell.
  • One is IL-6 receptor, a ligand-binding protein having a molecular weight of about 80 kD to which IL-6 binds (Non-patent Documents 4 and 5).
  • IL-6 receptor exists as a soluble IL-6 receptor mainly composed of the extracellular region in addition to the membrane-bound type that penetrates the cell membrane and is expressed on the cell membrane.
  • the other is a membrane protein gpl 30 with a molecular weight of about 130 kD involved in non-ligand binding signaling.
  • IL-6 and IL-6 receptor form IL 6ZIL-6 receptor complex, and then bind to gpl 30 to transmit IL-6 biological activity into the cell (Non-patent Documents) 6).
  • IL-6 inhibitors are substances that inhibit the transmission of IL-6 biological activity. So far, antibody against IL-6 (anti-IL-6 antibody), antibody against IL-6 receptor (anti-IL-6 receptor antibody), antibody against gpl 30 (anti-gpl 30 antibody), IL-6 variant IL-6 or IL-6 receptor partial peptides are known.
  • Non-patent Documents 7 and 8 Patent Documents 1 to 3
  • Patent Document 9 the region of determining the phase of mouse antibody PM-1
  • a humanized PM-1 antibody obtained by transplanting (CDR; complementarity determining region) into a human antibody is known (Patent Document 4).
  • Antibodies against IL-6 receptor are used to treat inflammatory diseases such as rheumatism.
  • inflammatory cytokines such as IL-6 form a complex network.
  • IL-6 receptor inhibitors were effective for the treatment of other inflammatory diseases such as ocular inflammatory diseases.
  • Non-Patent Document 1 Hirano, T. et al., Nature (1986) 324, 73-76
  • Non-patent document 2 Akira, S. et al., Adv. In Immunology (1993) 54, 1-78
  • Non-patent document 3 Lotz, M. et al., J. Exp. Med. (1988) 167, 1253 -1258
  • Non-patent document 4 Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981
  • Non-patent document 5 Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241, 825- 828
  • Non-Patent Document 6 Taga, T. et al., Cell (1989) 58, 573-581
  • Non-patent document 7 Novick, D. et al., Hybridoma (1991) 10, 137-146
  • Non-patent document 8 Huang, YW et al., Hybridoma (1993) 12, 621-630
  • Non-patent document 9 Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906
  • Patent Document 1 International Patent Application Publication Number W0 95-09873
  • Patent Document 2 French Patent Application Publication Number FR 2694767
  • Patent Document 3 US Patent No. US 5216128
  • Patent Document 4 International Patent Application Publication Number W0 92-19759
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object thereof is to provide a novel therapeutic agent for ocular inflammatory diseases.
  • anti-IL-6 receptor antibody exhibits a remarkable therapeutic effect in autoimmune uveitis (EAU) -induced mice.
  • EAU autoimmune uveitis
  • the present invention provides the following [1] to [5] more specifically.
  • [1] Inyuichi A therapeutic agent for eye inflammatory diseases and a Z or prophylactic agent comprising a leukin 6 (IL-6) receptor inhibitor as an active ingredient.
  • IL-6 leukin 6
  • Ocular inflammatory diseases include panuveitis, anterior uveitis, middle uveitis, scleritis, keratitis, orbital inflammation, optic neuritis, dry eye, diabetic retinopathy, proliferative vitreoretinopathy Or the therapeutic agent for ocular inflammatory disease and Z or prophylactic agent according to any one of [1] to [4], which is any of postoperative inflammation.
  • a method for treating and / or preventing an ocular inflammatory disease in a subject comprising a step of administering an IL-6 receptor inhibitor to a subject who has developed or is likely to develop an ocular inflammatory disease.
  • IL-6 receptor inhibitor for the manufacture of a therapeutic agent for ocular inflammatory disease and a Z or prophylactic agent.
  • FIG. 1 is a graph showing changes in serum IL-6 concentration over time in EAU mice.
  • FIG. 2 shows changes in EAU clinical score 18 days after induction by administration of anti-mouse IL-6 receptor antibody.
  • FIG. 3 is a photograph showing the fundus findings of EAU mice 18 days after induction by administration of anti-mouse IL-6 receptor antibody.
  • FIG. 4 is a photograph showing histological changes in the retina of the EAU mouse 19 days after induction by administration of anti-mouse IL-6 receptor antibody.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of a restimulation test with an immunity-inducing peptide (IRBP).
  • IRBP immunity-inducing peptide
  • the “IL-6 receptor inhibitor” is a substance that blocks IL-6 receptor-mediated signal transduction and inhibits IL-6 receptor biological activity.
  • the IL-6 receptor inhibitor may be a substance that binds to IL-6 receptor and directly inhibits the biological activity of IL-6 receptor, or binds to other substances such as gpl 30 It may be a substance that indirectly inhibits the biological activity of the 6 receptor, but it preferably binds to the IL-6 receptor and has the activity of inhibiting the binding of IL-6 to the IL-6 receptor. It is.
  • Examples of the IL-6 receptor inhibitor of the present invention include, for example, an anti-IL-6 receptor antibody, a soluble IL-6 receptor variant, a partial peptide of IL-6 receptor, and a small molecule having the same activity as these Examples include substances, but are not particularly limited.
  • Preferred examples of the IL-6 receptor inhibitor of the present invention include an antibody that recognizes IL-6 receptor.
  • the origin of the anti-IL-6 receptor antibody used in the present invention is not particularly limited, but is preferably an antibody derived from a mammal.
  • the anti-IL-6 receptor antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using known means.
  • a monoclonal antibody derived from a mammal is particularly preferable.
  • Monoclonal antibodies derived from mammals include those produced in hybridomas and those produced in hosts transformed with an expression vector containing antibody genes by genetic engineering techniques. This antibody binds to the IL-6 receptor, thereby blocking the binding of IL-6 to the IL-6 receptor and blocking the intracellular transmission of IL-6 biological activity.
  • MR16-1 antibody Tropura, T. et al. Proc. Nat l. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11924-11928
  • PM-1 antibody Hirata, Y et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906)
  • AUK12-20 antibody AUK64-7 antibody or AUK 6-15 antibody
  • Tocilizmap Toc i 1 izumab
  • the preferred monoclonal antibody against human IL-6 receptor is exemplified by PM-1 antibody
  • the preferred monoclonal antibody against mouse IL-6 receptor is MR16-1 antibody. It is not limited to.
  • Anti-IL-6 receptor monoclonal antibody-producing hyperpridoma basically uses known techniques. And can be made as follows. That is, using IL-6 receptor as a sensitizing antigen, this is immunized according to a normal immunization method, and the resulting immune cells are fused with a known parent cell by a normal cell fusion method. Thus, it can be prepared by screening monoclonal antibody-producing cells.
  • an anti-IL-6 receptor antibody can be prepared as follows.
  • the human IL-6 receptor used as a sensitizing antigen for antibody acquisition was disclosed in European Patent Application Publication No. EP 32547, and the mouse IL-6 receptor was disclosed in Japanese Patent Application Publication No. JP-A-3-155795.
  • IL-6 receptor gene obtained by using the Z amino acid sequence.
  • IL-6 receptor protein is expressed on the cell membrane and separated from the cell membrane (soluble IL-6 receptor) (Yasukawa, K. et al., J. Biochem. (1990) 108, 673-676).
  • Soluble IL-6 receptor consists essentially of the extracellular region of IL-6 receptor bound to the cell membrane, and the membrane is transmembrane region or the membrane transmembrane region and the intracellular region are defective. Different from the bound IL-6 receptor.
  • any IL-6 receptor may be used as long as it can be used as a sensitizing antigen for producing the anti-IL-6 receptor antibody used in the present invention.
  • the target IL-6 receptor protein After inserting the IL-6 receptor gene sequence into a known expression vector system to transform an appropriate host cell, the target IL-6 receptor protein is transferred from the host cell or culture supernatant.
  • the purified IL-6 receptor protein may be used as a sensitizing antigen after purification by a known method.
  • cells expressing IL-6 receptor or a fusion protein of IL-6 receptor protein and other proteins may be used as the sensitizing antigen.
  • the mammal immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion, and is generally a rodent. Animals such as mouse, rat, hams, etc. are used.
  • a known method is performed.
  • a sensitizing antigen is injected intraperitoneally or subcutaneously into a mammal.
  • the sensitizing antigen is diluted with PBS (Phosphate-Buf fered Saline) or physiological saline to an appropriate amount and suspended, and then mixed with an appropriate amount of usual adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, if desired.
  • an appropriate carrier can be used during immunization with the sensitizing antigen.
  • immune cells are removed from the mammal and subjected to cell fusion.
  • Preferred immune cells that are subjected to cell fusion include spleen cells.
  • Mammalian myeloma cells as the other parental cells to be fused with the immune cells have already been known to various known cell lines such as P3X63Ag8.653 (Kearney, J.F. et al. J. Immnol.
  • the cell fusion between the immunocytes and myeloma cells is basically performed by a known method, for example, the method of Millusteine et al. (Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73,
  • the cell fusion is performed, for example, in a normal nutrient culture medium in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ), or the like is used as a fusion accelerator.
  • An auxiliary agent such as methyl sulfoxide can also be added and used.
  • the usage ratio of immune cells and myeloma cells is preferably 1 to 10 times the number of immune cells relative to myeloma cells.
  • the culture medium used for the cell fusion for example, RPMI 1640 culture medium suitable for growth of the myeloma cell line, MEM culture medium, and other normal culture liquids used for this type of cell culture can be used.
  • fetal calf serum (FCS) FCS
  • Serum replacement fluid such as 25 can be used in combination.
  • a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are mixed well in the culture solution, and a PEG solution that has been pre-warmed to about 37, for example, a PEG solution having an average molecular weight of about 1000 to 6000 is usually used. Add it at a concentration of 30-60% (w / v) and mix to achieve the desired flux. A combined cell (hypridoma) is formed. Subsequently, cell fusion agents and the like unfavorable for the growth of high-pridoma can be removed by sequentially adding an appropriate culture solution and centrifuging to remove the supernatant.
  • the hyperidoma is selected by culturing in a normal selective culture solution, for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing with the HAT culture solution is continued for a period of time, usually several days to several weeks, sufficient for the cells (non-fusion cells) other than the target eight-hybridoma to die. Next, the usual limiting dilution method is performed to screen and clone the hyperidoma that produces the target antibody.
  • a normal selective culture solution for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing with the HAT culture solution is continued for a period of time, usually several days to several weeks, sufficient for the cells (non-fusion cells) other than the target eight-hybridoma to die.
  • the usual limiting dilution method is performed to screen and clone the hyperidoma that produces the target
  • human lymphocytes are sensitized in vitro with the desired antigen protein or antigen-expressing cells, and sensitized B lymphocytes are human myeloma cells.
  • a desired human antibody having a binding activity to a desired antigen or an antigen-expressing cell can be obtained (see Japanese Patent Publication No. 1-59878).
  • antigens or antigen-expressing cells may be administered to a transgenic animal having a repertoire of baboon antibody genes, and a desired human antibody may be obtained according to the method described above (International Patent Application Publication No. W0 93/12227, W0 92/03918, W0 94/02602, W0 94/25585, W0 96/34096, W0 96/33735).
  • the thus-prepared hybridoma producing monoclonal antibodies can be subcultured in a normal culture solution and can be stored for a long time in liquid nitrogen.
  • the hyperidoma is cultured according to a normal method and obtained as a culture supernatant, or the hybridoma is administered to a mammal that is compatible therewith to proliferate.
  • the method of obtaining it as ascites is adopted.
  • the former method is suitable for obtaining high-purity antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
  • anti-IL-6 receptor antibody-producing hyperpridoma can be prepared by the method disclosed in Japanese Patent Laid-Open No. 3-139293.
  • PM-1 antibody-producing hyperpridoma was injected into the peritoneal cavity of BALB / c mice to obtain ascites, and PM-1 antibody was purified from this ascites.
  • a suitable medium such as 10% urine fetal serum, RPMI1640 medium containing 5% BM-CondimedHl (Boehringer Mannheim), hybridoma SFM medium (GIBC0-BRL), PFHM-II medium (GIBC0-BRL), etc. And then purify PM-1 antibody from the culture supernatant.
  • an antibody gene is cloned from a hyperprime, incorporated into an appropriate vector, introduced into a host, and a recombinant antibody produced using a gene recombination technique is used.
  • a recombinant antibody produced using a gene recombination technique See, for example, Borrebaeck C. AK and Larrick JW THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).
  • mRNA encoding the variable (V) region of the antibody is isolated from cells producing the target antibody, for example, eight hybridomas. Isolation of mRNA can be performed by a known method such as guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC method (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) etc. to prepare total RNA, and mRNA is prepared using mRNA Purification Kit (Pharmacia) etc. Alternatively, mRNA can be directly prepared by using QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • the cDNA of the antibody V region is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase. Synthesis of cDNA can be performed using a layer such as Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit. For synthesis and amplification of cDNA, 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) and 5'-RACE method using PCR (Frohman, MA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ( 1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932). The target DNA fragment is purified from the obtained PCR product and ligated with vector DNA.
  • a recombinant vector is prepared from this, introduced into Escherichia coli, etc., and colonies are selected to prepare a desired recombinant vector.
  • the base sequence of the target DNA is confirmed by a known method such as the deoxy method.
  • DNA encoding the V region of the desired antibody is obtained, it is ligated with DNA encoding the desired antibody constant region (C region) and incorporated into the expression vector.
  • the DNA encoding the antibody V region is incorporated into an expression vector containing the antibody C region DNA. Also good.
  • an antibody gene is incorporated into an expression vector so that the antibody gene is expressed under the control of an expression control region, for example, an enhancer or a promoter, as described later.
  • an expression control region for example, an enhancer or a promoter, as described later.
  • host cells can be transformed with this expression vector to express antibodies.
  • a recombinant antibody that has been artificially modified for the purpose of, for example, reducing the heterologous antigenicity to humans such as a chimeric antibody or a humanized antibody
  • modified antibodies can be produced using known methods.
  • a chimeric antibody can be obtained by ligating the DNA encoding the antibody V region obtained as described above with the DNA encoding the human antibody C region, incorporating it into an expression vector, and introducing it into a host for production. (See European Patent Application Publication No. EP 125023, International Patent Application Publication No. W0 92-19759). Using this known method, a chimeric antibody useful in the present invention can be obtained.
  • Humanized antibodies also called reshaped human antibodies or humanized antibodies, are mammals other than humans, for example, the complementarity determining region (CDR) of a mouse antibody transplanted to the complementarity determining region of a human antibody.
  • CDR complementarity determining region
  • the general genetic recombination technique is also known (see European Patent Application Publication No. EP 125023, International Patent Application Publication No. W0 92-19759).
  • the FRs of rabbit antibodies linked via CDRs are selected such that the complementarity determining region forms a good antigen binding site. If necessary, amino acid in the framework region of the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen binding site (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).
  • the human antibody C region is used for the chimeric antibody and the humanized antibody.
  • human antibody heavy chain C region include Ca, Ca, ⁇ , CS, Cs, for example, C rl, C r 2, C r 3 or C T 4 can be used.
  • Examples of human antibody light chain C region include ⁇ or ⁇ .
  • the human antibody c region may be modified in order to improve the stability of the antibody or its production.
  • a chimeric antibody consists of a variable region of an antibody derived from a non-human mammal and a C region derived from a human antibody
  • a humanized antibody consists of a complementarity determining region of a non-human mammal-derived antibody and a framework region derived from a human antibody. It consists of C region, and these are useful as the antibodies used in the present invention because of their reduced antigenicity in the human body.
  • a preferred specific example of a humanized antibody used in the present invention is a humanized PM-1 antibody (see International Patent Application Publication No. TO 92-19759).
  • a technique for obtaining human antibodies by panning using a human antibody library is also known.
  • a variable region of a human antibody can be expressed as a single chain antibody (scFv) on the surface of a phage by the phage display method, and a phage that binds to the antigen can be selected.
  • the DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen can be determined. If the DNA sequence of scFv that binds to the antigen is clarified, an appropriate expression vector containing the sequence can be prepared, and a human antibody can be obtained.
  • the antibody gene constructed as described above can be expressed by a known method.
  • mammalian cells When mammalian cells are used, they can be expressed by a commonly used useful promoter, an antibody gene to be expressed, a DNA having a poly A signal operably linked to the 3 ′ downstream thereof, or a vector containing the same.
  • a promoter / enhancer is the human cytomegalovirus rus immediate early promoter / enhancer.
  • Viral promoters such as Rus 40 (SV40) / enhancer or human fermentation factor 1 (HEF1) may be used.
  • the promo night can include the lacZ promoter and the araB promo night.
  • the lacZ promoter the method of Ward et al. (Ward, ES et al., Nature (1989) 341, 544-546; Ward, ES et al. FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), araB promoter Can be used according to the method of Better et al. (Better, M. et al. Science (1988) 240, 1041-1043).
  • the pelB signal sequence (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383) may be used when it is produced in the periplasm of E. coli. After isolating the antibody produced in the periplasm, the antibody structure is appropriately refolded and used (see eg W096 / 30394).
  • the origin of replication can be derived from SV40, poliovirus, adenovirus, ushipapilloma virus (BPV), etc.
  • the expression vector is Selectable markers include aminoglycoside phosphotransferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, E. coli xanthine guanine phospholiposyltransferase (EC0gpt) gene, dihydrofolate reductase (dhfr) gene, etc. it can.
  • Production systems for antibody production include in vitro and in vivo production systems.
  • in vitro Examples of production systems include production systems that use eukaryotic cells and production systems that use prokaryotic cells.
  • Animal cells include: (1) mammalian cells such as CH0, COS, Mieguchi, BHK (baby hams ter kidney), HeLa, Vero, etc. (2) amphibian cells such as Xenopus laevis oocytes, or (3) Insect cells such as sf9, sf21, and Tn5 are known.
  • plant cells cells derived from Nicotiana tapacum are known, and these may be cultured in callus.
  • Fungal cells include yeasts such as Saccharomyces, eg Saccharomyces cerevis iae, filamentous fungi such as Aspergillus, such as Aspergillus niger) etc. are known.
  • An antibody can be obtained by introducing a desired antibody gene into these cells by transformation, and culturing the transformed cells in vitro. Culture is performed according to a known method. For example, DMEM, MEM, RPMI 1640, and IMDM can be used as the culture medium, and serum supplements such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • FCS fetal calf serum
  • antibodies may be produced in vivo by transferring cells into which the antibody gene has been introduced to the abdominal cavity of animals.
  • in vivo production systems include production systems that use animals and production systems that use plants. When animals are used, there are production systems using mammals and insects.
  • mammals examples include goats, pigs, hidges, mice, and bushes (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applicat ions, 1993).
  • silkworms can be used as insects.
  • tobacco can be used when using plants.
  • an antibody gene is introduced into these animals or plants, and the antibodies are produced and collected in the animals or plants.
  • an antibody gene is inserted in the middle of a gene encoding a protein inherently produced in milk such as goat / 3 casein to prepare a fusion gene.
  • a DNA fragment containing a fusion gene into which an antibody gene is inserted is injected into a goat embryo, and the embryo is introduced into a female goat.
  • the desired antibody is obtained from the milk produced by the transgene goat born from the goat that received the embryo or its progeny. Desired produced from transgenic goat
  • hormones may be used as appropriate in the transgenic dog (Ebert, KM et al., Bio / Technology (1994) 12, 699-702).
  • a silkworm is infected with a baculovirus into which the target antibody gene is inserted, and a desired antibody is obtained from the body fluid of this silkworm (Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592- 594).
  • the desired antibody gene is inserted into a plant expression vector such as pM0N530, and this vector is introduced into a pacteria such as Agrobacterium tumefaciens.
  • This bacterium is infected with tobacco, for example Nicotiana tabacum, and the desired antibody is obtained from the leaves of this tobacco (Julian, K. -C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138) .
  • DNAs encoding the antibody heavy chain (H chain) or light chain (L chain) are separately incorporated into an expression vector and simultaneously transformed into the host.
  • the DNA may be transformed into a single expression vector by transforming the host (see International Patent Application Publication No. W0 94-11523).
  • the antibody used in the present invention may be an antibody fragment or a modified product thereof as long as it can be suitably used in the present invention.
  • antibody fragments include Fab, F (ab ′) 2, Fv, or single thiein Fv (scFv) in which Fv of H chain and L chain are linked by an appropriate linker.
  • the antibody is treated with an enzyme such as papain or pepsin to generate antibody fragments, or genes encoding these antibody fragments are constructed and introduced into the expression vector, and then appropriately (Eg, Co, MS et al., J. I thigh unol. (1994) 152, 2968-2976, Better, M.
  • scFv can be obtained by linking antibody H chain V region and L chain V region.
  • the H chain V region and the L chain V region are linked via a linker, preferably a peptide linker (Huston, JS et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988). 85, 5879-5883).
  • the H chain V region and L chain V region in scFv may be derived from any of the antibodies described above.
  • the peptide linker for linking the V regions for example, any single chain peptide consisting of amino acid 12-19 residues is used.
  • the scFv-encoding DNA consists of a DNA encoding the H chain or H chain V region of the antibody, and a DNA encoding the L chain or L chain V region, and a desired DNA sequence of those sequences.
  • the DNA portion that codes the amino acid sequence is amplified by PCR using a pair of primers that define both ends of the DNA, and then the DNA that encodes the peptide linker portion and both ends are ligated to the H and L chains, respectively. It is obtained by combining and amplifying primer pairs specified as follows.
  • DNA encoding scFv is prepared, an expression vector containing them and a host transformed with the expression vector can be obtained according to a conventional method. In accordance with conventional methods, scFv can be obtained.
  • antibody fragments can be produced by the host by obtaining and expressing the gene in the same manner as described above.
  • antibody as used in the present invention includes fragments of these antibodies.
  • an antibody conjugated with various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can be used.
  • the “antibody” referred to in the present invention includes these modified antibodies. In order to obtain such a modified antibody, it can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. These methods are already established in this field.
  • the antibody produced and expressed as described above can be separated from the host inside and outside the cell and purified to homogeneity. Separation and purification of the antibody used in the present invention can be performed by affinity mouth chromatography. Examples of the power ram used for affinity chromatography include a protein A column and a protein G column. Examples of the carrier used for the protein A column include HyperD, POROS, Sepharose F. F. and the like. In addition, separation and purification methods used for ordinary proteins may be used, and the method is not limited at all.
  • chromatography filter, ultrafiltration, salting out, dialysis, etc. other than the above affinity chromatography are appropriately selected and combined, they are used in the present invention.
  • Antibodies can be separated and purified.
  • chromatography include ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, and the like. These chromatographies can be applied to high performance liquid chromatography (HPLC). Further, reverse phase HPLC may be used.
  • the antibody concentration obtained above can be measured by measuring absorbance or ELISA. That is, when measuring the absorbance, after appropriately diluting with PBS (-), measure the absorbance at 280 nm and calculate lmg / ml as 1.350D.
  • EL ISA it can be measured as follows. That is, goat anti-human IgG (TAG) 100 i 1 diluted to 0.1 lg / ml with 0.1 M bicarbonate buffer (PH9.6) was added to a 96-well plate (Nunc) at 4 ° C overnight. Incubate to immobilize antibody. After blocking, appropriately diluted antibody or antibody-containing sample used in the present invention, or human IgG (manufactured by CAPPEL) 100 1 as a sample is added and incubated at room temperature for 1 hour.
  • alkaline phosphatase-labeled anti-human IgG (BIO SOURCE) 100 ⁇ 1 diluted 5000 times and incubate at room temperature for 1 hour. After washing, add the substrate solution, and after incubation, measure the absorbance at 05 nm using MICR0PLATE READER Model 3550 (manufactured by Bio-Rad) to calculate the concentration of the desired antibody.
  • the IL-6 receptor partial peptide is a peptide consisting of part or all of the amino acid sequence of the region related to the binding between IL-6 and IL-6 receptor in the amino acid sequence of IL-6 receptor.
  • Such a peptide usually consists of 10 to 80, preferably 20 to 50, more preferably 20 to 40 amino acid residues.
  • the IL-6 receptor partial peptide specifies a region related to the binding between IL-6 and IL-6 receptor in the amino acid sequence of IL-6 receptor, and a part or all of the amino acid sequence of the specified region. It can be prepared by a generally known method based on the sequence, for example, a genetic engineering method or a peptide synthesis method.
  • a DM sequence encoding a desired peptide is incorporated into an expression vector, and the recombinant antibody is expressed, produced and purified according to the method described above. Obtainable.
  • a partial peptide of IL-6 receptor by peptide synthesis method, for example, solid-phase synthesis methods or liquid-phase synthesis methods can be used.
  • Solid phase synthesis method for example, an amino acid corresponding to the C-terminus of the peptide to be synthesized is bound to a support that is insoluble in an organic solvent, and the ⁇ -amino group and the side chain functional group are protected with appropriate protecting groups.
  • the reaction of condensing amino acids one by one in the order from the C-terminal to the N-terminal and the reaction of removing the protecting group of the amino acid or peptide amino group bonded to the resin, A method of extending the peptide chain is used.
  • Solid phase peptide synthesis methods are broadly divided into Boc and Fmoc methods, depending on the type of protecting group used.
  • the deprotection reaction and the cleavage reaction from the peptide chain support are performed.
  • hydrogen fluoride or trifluoromethanesulfonic acid can usually be used for the Boc method
  • TFA can be used for the Fmoc method.
  • Boc method for example, the above-described protected peptide resin is treated in hydrogen fluoride in the presence of an anisol. Then, the peptide is recovered by removing the protecting group and cleaving from the support. By freezing and drying this, a crude peptide can be obtained.
  • the deprotection reaction and the cleavage reaction from the support of the peptide chain can be carried out in the same manner as described above in TFA.
  • the obtained crude peptide can be separated and purified by application to HPLC.
  • a water-acetonitrile solvent usually used for protein purification may be used under optimum conditions.
  • the fraction corresponding to the peak of the obtained chromatographic profile is collected and lyophilized.
  • the peptide fraction thus purified is identified by molecular weight analysis by mass spectrum analysis, amino acid composition analysis, amino acid sequence analysis, or the like.
  • the therapeutic agent for ocular inflammatory diseases of the present invention can be used in the treatment and / or prevention of ocular inflammatory diseases.
  • treatment of ocular inflammatory disease means suppression of ocular inflammatory disease, reduction of incidence of ocular inflammatory disease, treatment of ocular inflammatory disease, improvement of symptoms of ocular inflammatory disease, and the like.
  • the ocular inflammatory diseases that can be treated with the therapeutic agent of the present invention include panuveitis, anterior uveitis, intermediate uveitis, scleritis, keratitis, orbital inflammation, optic neuritis, dry Includes eye, glycouric retinopathy, proliferative vitreoretinopathy and postoperative inflammation.
  • the effect of the IL-6 receptor inhibitor used in the present invention as a therapeutic agent for ocular inflammatory diseases can be evaluated using, for example, signal transduction inhibitory activity as an index, but is not limited thereto.
  • the signal transduction inhibitory activity of an IL-6 receptor inhibitor can be evaluated by a commonly used method. Specifically, IL-6-dependent human myeloma line (S6B45, KP awakening 2), human Rennelt T lymphoma cell line KT3, or IL-6-dependent cell MH60. BSF2 is cultured, and IL-6 is added to it. At the same time, IL-6-dependent cell uptake may be measured by coexisting an IL-6 receptor inhibitor. Further, by culturing U266 is IL-6 receptor-expressing cells, was added 125 1-labeled IL- 6, by adding simultaneously IL- 6 receptor inhibitors, bound to IL- 6 receptor-expressing cells 125 1 Measure IL-6. In the above-mentioned Atsy system, in addition to the group in which an IL-6 receptor inhibitor is present, there is a negative control group that does not contain an IL-6 receptor inhibitor. The IL-6 receptor inhibitory activity of the agent can be evaluated.
  • the subject to which the therapeutic agent for ocular inflammatory disease of the present invention is administered is a mammal.
  • the mammal is preferably a human.
  • the therapeutic agent for ocular inflammatory disease of the present invention can be administered in the form of a pharmaceutical, and can be administered systemically or locally orally or parenterally.
  • intravenous injection such as infusion, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, suppository, enema, oral enteric solvent, etc.
  • the administration method can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient. Effective doses are selected in the range of O. Olmg to lOOmg per kg body weight. Alternatively, a dose of 1 to 1000 mg, preferably 5 to 50 mg per patient can be selected.
  • preferable dose and administration method include, for example, in the case of anti-IL-6 receptor antibody, 0.5 mg to 40 mg, preferably 1 mg to 20 mg once a month (4 weeks) per kg of body weight.
  • Intravenous injection such as intravenous infusion, subcutaneous injection, intramuscular injection, etc. with a dosage schedule of 2 times Z week, 1 time / week, 1 time / 2 weeks, 1 time Z 4 weeks, etc. And how to administer it.
  • Dosing schedule is 2 weekly or 1 time weekly once / weekly, once / two weeks, once / '3 weeks, once every 4 weeks while observing patient condition and observing blood test trends It is also possible to make adjustments such as extending the length.
  • the therapeutic agent for ocular inflammatory disease of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier such as a preservative and a stabilizer.
  • a pharmaceutically acceptable carrier means a material that can be administered together with the above-mentioned drug. Examples of materials that are acceptable for formulation include sterilized water, physiological saline, stabilizers, excipients, buffers, preservatives, surfactants, chelating agents (EDTA, etc.), binders, etc. Can do.
  • examples of the surfactant include nonionic surfactants, such as sorbitan fatty acid esters such as sorbitan monoforce prelate, sorbitan monolaurate, sorbitan monopalmitate; glycerin monocaprylate, glycerin monomilli. Glycerin fatty acid esters such as state and glyceryl monostearate; polyglycerin fatty acid esters such as decaglyceryl monostearate, decaglyceryl distearate, decaglyceryl monolinoleate; polyoxyethylene sorbitan monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monoo Late, polyoxyethylene
  • Polyoxyethylene sorbate fatty acid esters such as tearates; Polyoxyethylene sorbite fatty acid esters such as polyoxyethylene sorpit tetrastearate and polyoxyethylene sorbite tetraoleate; Polyoxyethylene glyceryl monostearate and other poly Oxyethylene glycerin fatty acid ester; polyethylene Polyethylene glycol fatty acid ester such as recall distearate; Polyoxyethylene alkyl ether such as polyoxyethylene lauryl ether; Polyoxyethylene alkyl such as polyphenyl ether such as polyoxyethylene pill ether and polyoxyethylene polyoxypropylene cetyl ether Polyoxyethylene hydrogenated castor oil such as polyoxyethylene castor oil and polyoxyethylene hydrogenated castor oil (polyoxyethylene hydrogen castor oil); polyoxyethylene beeswax derivatives such as polyoxyethylene sorbite beeswax; polyoxyethylene lanolin Polyoxyethylene lanolin derivatives such as polyoxyethylene stearic acid amide, etc.
  • the surfactant examples include an anionic surfactant, for example, an alkyl sulfate having an alkyl group having 10 to 18 carbon atoms such as sodium cetyl sulfate, sodium lauryl sulfate, sodium oleyl sulfate; Oxyethylene lauryl sulfate Polyoxyethylene alkyl ether sulfates having an average addition mole number of ethylene oxide of 2 to 4 and an alkyl group carbon atom number of 10 to 18 such as sodium lauryl sulfate; lauryl sulfosuccinate Alkyl sulfosuccinic acid ester salts having 8 to 18 carbon atoms in the alkyl group, such as sodium; natural surfactants such as lecithin, glycine phospholipids; fingophospholipids such as sphingomyelin; carbon atoms 1 2 Typical examples include sucrose fatty acid esters of ⁇ 18 fatty acids.
  • a preferred surfactant for use in the formulations of the present invention is polysorbate
  • Polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters such as 20, 40, 60 or 80, with polysorbates 20 and 80 being particularly preferred.
  • Polyoxyethylene polyoxypropylene glycol represented by poloxamer such as Pluronic 68 (registered trademark) is also preferred.
  • the amount of surfactant added varies depending on the type of surfactant used. In the case of 20 or polysorbate 80, it is generally 0.001 to: L 0 O mg / mL, preferably 0.03 to 5 O mg ZmL, more preferably 0. 0 0 5 ⁇ 2 mg / / m;
  • the buffering agent phosphoric acid, citrate buffer, acetic acid, malic acid, tartaric acid, succinic acid, lactic acid, potassium phosphate, dalconic acid, strong prillic acid, deoxycholic acid, salicylic acid, triethanolamine
  • organic acids such as fumaric acid, carbonic acid buffer solution, tris buffer solution, histidine buffer solution, imidazole buffer solution and the like can be mentioned.
  • a solution formulation may be prepared by dissolving in an aqueous buffer known in the field of solution formulation.
  • the concentration of the buffer is generally 1 to 50 O mM, preferably 5 to 100 mM, and more preferably 10 to 20 mM.
  • the therapeutic agent of the present invention may contain other low molecular weight polypeptides, serum albumin, proteins such as gelatin and immunoglobulin, saccharides such as amino acids, polysaccharides and monosaccharides, carbohydrates, and sugar alcohols.
  • amino acids include basic amino acids such as arginine, lysine, histidine, ornithine and the like, or inorganic salts of these amino acids (preferably hydrochlorides, phosphate forms, ie, phosphate amino acids). I can do it.
  • free amino acids are used, the preferred pH value is adjusted by the addition of appropriate physiologically acceptable buffer substances such as inorganic acids, especially hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, acetic acid, formic acid or their salts. .
  • phosphate is particularly advantageous in that a particularly stable lyophilizate is obtained.
  • the preparation is substantially free of organic acids such as malic acid, tartaric acid, citrate, succinic acid, fumaric acid, etc. or the corresponding anions (malate ion, tartrate ion, citrate ion, succinate ion) And fumarate ions) are particularly advantageous.
  • Preferred amino acids are arginine, lysine, histidine, or ornithine.
  • acidic amino acids such as glutamic acid and aspartic acid, and salts thereof (preferably sodium salts) or neutral amino acids such as isoleucine, leucine, glycine, serine, threonine, valine, methionine, cysteine, or alanine, or Aromatic amino acids such as phenylalanine, tyrosine, tryptoph Or the derivative N-acetiltliptophan can also be used.
  • saccharides and carbohydrates such as polysaccharides and monosaccharides include, for example, dextran, glucose, flak 1 ⁇ ose, lactose, xylose, mannose, maltose, sucrose, trehalose, rafinoose, etc. Can be mentioned.
  • examples of the sugar alcohol include mannitol, sorbitol, inositol and the like.
  • the drug of the present invention when used as an aqueous solution for injection, it contains, for example, physiological saline, glucose and other adjuvants (for example, D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride), etc. Can be mixed with a tonic solution, and the aqueous solution can be a suitable solubilizing agent.
  • alcohol ethanol etc.
  • polyalcohol propylene glycol, PEG etc.
  • nonionic surfactant polysorbate 80, HC0-50 etc.
  • it may further contain a diluent, a solubilizing agent, a pH adjusting agent, a soothing agent, a sulfur-containing reducing agent, an antioxidant and the like.
  • examples of the sulfur-containing reducing agent include N-acetyl cysteine, N-acetyl cysteine, thioctic acid, thiodiglycol, thioethanolamine, thiodalyserol, thiosorbitol, thioglycolic acid and salts thereof.
  • sodium thiosulfate, daryuthione, and those having a sulfhydryl group such as a thioalkanoic acid having 1 to 7 carbon atoms.
  • examples of the antioxidant include erythorbic acid, dibutylhydroxytoluene, butylhydroxyanisole, ⁇ -tocopherol, tocopherol acetate, L-ascorbic acid and salts thereof, L-ascorbyl palmitate, L — Chelating agents such as ascorbic acid stearate, sodium bisulfite, sodium sulfite, triamyl gallate, propyl gallate or disodium ethylenediammine tetraacetate (ED ⁇ ⁇ ), sodium pyrophosphate, sodium metaphosphate.
  • Chelating agents such as ascorbic acid stearate, sodium bisulfite, sodium sulfite, triamyl gallate, propyl gallate or disodium ethylenediammine tetraacetate (ED ⁇ ⁇ ), sodium pyrophosphate, sodium metaphosphate.
  • microcapsules such as hydroxymethylcellulose, gelatin, poly [methylmethacrylic acid]
  • colloid drug delivery systems ribosomes, albumin microspheres, microemulsions. Emissions, may be a nano-particles, and nano-capsules) ( "Remington s Pharmaceutical Science 16 th edition", Oslo Ed., See 1980 etc.).
  • a method of making a drug a sustained-release drug is also known and can be applied to the present invention (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 1981, 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. 1982, 12: 98-105; U.S. Pat. No. 3,773,919; European Patent Application (EP) 58,481; Sidmanet al., Biopolyraers 1983, 22: 547-556; EP 133, 988 issue).
  • EP European Patent Application
  • the pharmaceutically acceptable carrier to be used is appropriately or in combination selected from the above depending on the dosage form, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to a method for treating and / or preventing an ocular inflammatory disease in a subject, comprising the step of administering an IL-6 receptor inhibitor to a subject who has developed or is likely to develop an ocular inflammatory disease. .
  • the “subject” refers to an organism to which the therapeutic agent for ocular inflammatory disease of the present invention is administered, and a part of the organism.
  • Organisms include, but are not limited to, animals (eg, humans, domestic animal species, wild animals).
  • the “part of the body of the living organism” is not particularly limited, but preferred examples include the eye or the peripheral region of the eye.
  • administering includes administering orally or parenterally.
  • Oral administration can include administration in the form of oral preparations, and oral dosage forms such as granules, powders, tablets, capsules, solvents, emulsions, or suspensions are selected. can do.
  • parenteral administration examples include administration in the form of injections, and examples of injections include subcutaneous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections, and the like.
  • the effect of the method of the present invention can be achieved by introducing a gene containing an oligonucleotide to be administered into a living body using a gene therapy technique.
  • the agent of the present invention can be locally administered to a region where treatment is desired.
  • administration can be by local injection during surgery, use of a catheter, or targeted gene delivery of DNA encoding the peptides of the invention.
  • the agent of the present invention comprises at least one known therapeutic agent and Both may be administered as part of a pharmaceutical composition.
  • the agent of the present invention may be administered simultaneously with at least one known inflammatory disease therapeutic agent.
  • the agent of the present invention and the known inflammatory disease therapeutic agent may be administered substantially simultaneously.
  • Example 1 Induction of autoimmune uveitis (EAU) in mice
  • mice WTC57BL / 6 female, 8-10 weeks was used for all experiments. Handling of mice is Statement for the Use of Animals in Association for Research in Vision and Ophthalmology
  • the peptide synthesized from position 20 was immunized with the antigen as an antigen, and mouse experimental autoimmune uveitis (EAU) was induced.
  • EAU mouse experimental autoimmune uveitis
  • IRBP peptidel-20 (GPTHLFQPSLVLDMAKVLLD) (Gene Net Co. Ltd. (Fukuoka,
  • mice 2 mg / 0.7m 1 DMSO / m 1 and CFA supplemented with 10 mg / ml of tuberculosis killed H37RA (Sigma-Aldrich (St. Louis, M0) and DIFCO (Detroit, MO)) 1: 1 Emulsified.
  • 0.2m 1 / mouse of this adjuvant in mice (0.1 on the back of the head, 0.05 on the sole, 0.05 on the diameter,
  • IRBP 200 g was injected subcutaneously.
  • PTX pertussus toxin pertussis toxin
  • 0.5 ⁇ g / mouse was administered intraperitoneally.
  • mice Peripheral blood of mice was collected before EAU induction and 1, 3, 7, 14, 21 and 28 days after induction, and serum IL-6 was measured by ELISA.
  • Figure 1 shows the results obtained. Serum IL-6 concentration showed a peak shape on the 14th day after induction of EAU.
  • Example 3 Suppression of EAU development by anti-mouse IL-6 receptor antibody
  • MR16-1 manufactured by Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. was used as an anti-mouse IL-6 receptor antibody.
  • Grade 2 Multiple (> 5) chorioretinal lesions and / or infiltrations; severe vasculitis (large size, thick wall, infiltrations);
  • Grade 3 Pattern of linear lesions; large confluent lesions; subret inal naovascul ization; ret inal hemorrhage; papilledema
  • the eyeballs were removed, encapsulated in an OCT compound, frozen and stored at _80 ° C, ⁇ thick sections were prepared, and HE (hematoxylin eosin) staining was performed for evaluation.
  • Anti-mouse IL-6 receptor antibody suppresses EAU development (1) Effect of administration of anti-mouse IL-6 receptor antibody on the suppression of EAU development immediately before sputum induction
  • each antibody was administered to the above two groups, and on the 18th day, fundus examination and histological evaluation were performed.
  • Fig. 2 Cl inical score
  • Fig. 3 fundus findings
  • the mice administered with anti-mouse IL-6 receptor antibody were more prominent than the mice administered with control antibody. Inhibition of inflammation was observed.
  • the optic disc edema is marked in the control antibody-treated mice and the surrounding blood vessels are white, whereas the anti-mouse IL-6 receptor antibody-treated mice show the optic disc. The outline was clear and almost no abnormalities were found in the blood vessels.
  • mice treated with anti-mouse IL-6 receptor antibody infiltration of inflammatory cells into the retina was hardly observed, and retinal tissue destruction was also suppressed.
  • CD4 positive T cells were purified from lymphocytes collected from mouse neck, armpit and inguinal lymph nodes using MiniMACS TM Separator (Miltenyi Biotec Gladbach, Germany). This
  • CD4 positive T cells (2 X 10 cel ls / 200 1 / wel l) and irradiated APC (wild type C57B6 mouse spleen, 20 gray irradiation) 1: 5, then add IRBPlO ⁇ g / ml And cultured for 48 hours. Supernatants were collected and cytoforce-in ELISA was measured using Bio-Plex TM (Bio-Rad Laboratories). The measured site force values are IFN-A, IL-17, MIP-1 and GM-CSF, TNF-O ;.

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Abstract

　本発明は、インターロイキン６（IL-6）受容体阻害剤を有効成分とする眼炎症疾患治療剤および／または予防剤に関する。

Description

明細書
インターロイキン 6受容体阻害剤を有効成分とする眼炎症疾患治療剤 技術分野
本発明は、 眼炎症疾患治療剤に関する。 さらに詳しくは、 本発明は、 インタ一ロイ キン 6 (IL-6) 受容体阻害剤を有効成分とする眼炎症疾患治療剤に関する。
背景技術
インタ一ロイキン 6 (IL-6) は B細胞刺激因子 2 (BSF2)あるいはインターフェロン /3 2とも呼称されたサイト力インである。 IL-6は、 Bリンパ球系細胞の活性化に関与 する分化因子として発見され （非特許文献 1 )、 その後、 種々の細胞の機能に影響を 及ぼす多機能サイト力インであることが明らかになった（非特許文献 2 )。 IL-6は、 T リンパ球系細胞の成熟化を誘導することが報告されている （非特許文献 3 )。
IL-6は、細胞上で二種の蛋白質を介してその生物学的活性を伝達する。一つは、 IL-6 が結合する分子量約 80kDのリガンド結合性蛋白質の IL- 6受容体である（非特許文献 4、 5 )。 IL- 6受容体は、 細胞膜を貫通して細胞膜上に発現する膜結合型の他に、 主 にその細胞外領域からなる可溶性 IL- 6受容体としても存在する。
もう一つは、非リガンド結合性のシグナル伝達に係わる分子量約 130kDの膜蛋白質 gpl 30である。 IL- 6と IL- 6受容体は IL 6ZIL-6受容体複合体を形成し、次いで gpl 30 と結合することにより、 IL- 6の生物学的活性が細胞内に伝達される（非特許文献 6 )。
IL-6阻害剤は、 IL- 6の生物学的活性の伝達を阻害する物質である。 これまでに、 IL - 6に対する抗体（抗 IL-6抗体)、 IL-6受容体に対する抗体（抗 IL-6受容体抗体)、 gpl 30に対する抗体（抗 gpl 30抗体）、 IL- 6改変体、 IL- 6又は IL-6受容体部分べプチ ド等が知られている。
抗 IL- 6受容体抗体に関しては、 いくつかの報告がある （非特許文献 7、 8、 特許 文献 1〜3 )。 その一つであるマウス抗体 PM-1 (非特許文献 9 ) の相捕性決定領域
(CDR; complementari ty determining region ) をヒト抗体へ移植することにより得 られたヒト化 PM - 1抗体が知られている （特許文献 4 )。
IL-6受容体に対する抗体がリゥマチなどの炎症性疾患の治療に用いられている。し かしながら、 IL-6などの炎症性サイトカインは複雑なネットワークを形成しているこ とから、 眼炎症性疾患などの他の炎症性疾患の治療に対して IL- 6受容体阻害剤が有 効であるか否かは不明であった。
なお、 本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
非特許文献 1 ： Hirano, T. et al., Nature (1986) 324, 73-76
非特許文献 2 ： Akira, S. et al., Adv. in Immunology (1993) 54, 1-78 非特許文献 3 ： Lotz, M. et al., J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1258 非特許文献 4： Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981 非特許文献 5 ： Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241, 825-828 非特許文献 6 ： Taga, T. et al., Cell (1989) 58, 573-581
非特許文献 7 ： Novick, D. et al., Hybridoma (1991) 10, 137-146 非特許文献 8 ： Huang, Y. W. et al., Hybridoma (1993) 12, 621-630 非特許文献 9 ： Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906 特許文献 1 ： 国際特許出願公開番号 W0 95-09873
特許文献 2 ： フランス特許出願公開番号 FR 2694767
特許文献 3 ： 米国特許番号 US 5216128
特許文献 4 ： 国際特許出願公開番号 W0 92-19759
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
眼炎症性疾患における IL- 6および IL- 6受容体の詳細な役割については明らかにさ れていなかった。 また、 IL-6受容体阻害剤の投与が、 眼炎症疾患においてどのような 効果を示すかは明らかにされていなかった。
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、 その目的は、 新規な眼炎症 疾患治療剤を提供することにある。
課題を解決するための手段
本発明者らは、 上記目的を解決するために鋭意研究した結果、 自己免疫性ブドウ膜 炎 （EAU) 誘導マウスにおいて、 抗 IL- 6受容体抗体が顕著な治療効果を示すことを発 見して本発明を完成した。
すなわち、本発明は、 より具体的には以下の〔1〕〜〔5〕を提供するものである。 [1] イン夕一ロイキン 6 (IL-6) 受容体阻害剤を有効成分とする眼炎症疾患治療剤 および Zまたは予防剤。
[2] IL- 6受容体阻害剤がヒト IL- 6受容体阻害剤である [1] に記載の眼炎症疾患 治療剤および/または予防剤。
[3] IL-6受容体阻害剤が抗 IL- 6受容体抗体である [1] に記載の眼炎症疾患治療 剤および/または予防剤。
[4] 抗 IL-6受容体抗体がキメラ抗体、 ヒト化抗体またはヒト抗体である [3] に 記載の眼炎症疾患治療剤および Zまたは予防剤。
[5] 眼炎症疾患が、 汎ぶどう膜炎、 前部ぶどう膜炎、 中間部ぶどう膜炎、 強膜炎、 角膜炎、 眼窩炎症、 視神経炎、 ドライアイ、 糖尿病網膜症、 増殖硝子体網膜症または 術後炎症のいずれかである [1] から [4] のいずれかに記載の眼炎症疾患治療剤お よび Zまたは予防剤。
[6] IL- 6受容体阻害剤を、眼炎症疾患を発症した対象または発症する可能性がある 対象に投与する工程を含む、対象において眼炎症疾患を治療および/または予防する 方法。
[7] 眼炎症疾患治療剤および Zまたは予防剤の製造のためのインターロイキン 6 (IL-6) 受容体阻害剤の使用。
図面の簡単な説明
図 1は、 EAUマウスにおける血清 IL- 6濃度の経時的変化を示すグラフである。 図 2は、 抗マウス IL- 6受容体抗体投与による誘導後 18日目の EAUクリニカルス コアの変化を示す図である。
図 3は、 抗マウス IL-6受容体抗体投与による誘導後 18日目の EAUマウスの眼底 所見を示す写真である。
図 4は、 抗マウス IL-6受容体抗体投与による誘導後 19日目の EAUマウス網膜の 組織学的変化を示す写真である。
図 5は、 免疫誘導ペプチド （IRBP) による再刺激試験の結果を示すグラフである。 ELISAによって測定したサイト力インは IFN—ァ、 IL - 17、 MIP - 1ひ、 G -CSF, TNF-a である。 発明を実施するための形態
本発明において、 「IL- 6受容体阻害剤」 とは、 IL- 6受容体を介したシグナル伝達を 遮断し、 IL- 6受容体の生物学的活性を阻害する物質である。 IL- 6受容体阻害剤は、 IL-6受容体に結合して IL- 6受容体の生物学的活性を直接阻害する物質でもよいし、 gpl 30などの他の物質に結合して IL-6受容体の生物学的活性を間接的に阻害する物 質でもよいが、好ましくは IL-6受容体に結合し、 IL- 6と IL-6受容体との結合を阻害 する活性を有する物質である。
本発明の IL- 6受容体阻害剤としては、 例えば、 抗 IL-6受容体抗体、 可溶性 IL- 6 受容体改変体、 IL- 6受容体の部分ペプチド、 これらと同様の活性を示す低分子物質な どが挙げられるが、 特に限定されるものではない。 本発明の IL- 6受容体阻害剤の好 ましい例として、 IL- 6受容体を認識する抗体を挙げることが出来る。
本発明で用いられる抗 IL- 6受容体抗体の由来は特に限定されるものではないが、 好ましくは哺乳動物由来の抗体である。
本発明で使用される抗 IL- 6受容体抗体は、 公知の手段を用いてポリクロ一ナル又 はモノクローナル抗体として得ることができる。 本発明で使用される抗 IL-6受容体 抗体として、 特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。 哺乳動物由来のモ ノクロ一ナル抗体としては、 ハイブリド一マに産生されるもの、 および遺伝子工学的 手法により抗体遺伝子を含む発現べク夕一で形質転換した宿主に産生されるもの等 がある。 この抗体は IL-6受容体と結合することにより、 IL- 6の IL-6受容体への結合 を阻害して IL-6の生物学的活性の細胞内への伝達を遮断する。
このような抗体の例としては、 MR16-1抗体 (Tamura, T. et al . Proc. Nat l . Acad. Sc i . USA (1993) 90, 11924-11928)、 PM - 1抗体 (Hirata, Y. et al . , J. Immunol . (1989) 143, 2900 - 2906)、 AUK12- 20抗体、 AUK64-7抗体あるいは AUK 6- 15抗体 （国際特許 出願公開番号 W0 92- 19759)、 トシリズマプ （toc i 1 izumab) などが挙げられる。 これ らのうちで、 ヒト IL- 6受容体に対する好ましいモノクローナル抗体としては PM-1抗 体が例示され、 またマウス IL- 6受容体に対する好ましいモノクローナル抗体として は MR16- 1抗体が挙げられるが、 これに限定されない。
抗 IL-6受容体モノクローナル抗体産生ハイプリドーマは、 基本的には公知技術を 使用し、 以下のようにして作製できる。すなわち、 IL- 6受容体を感作抗原として使用 して、 これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、 得られる免疫細胞を通常の細胞融 合法によって公知の親細胞と融合させ、 通常のスクリーニング法により、 モノクロ一 ナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによつて作製できる。
具体的には、 抗 IL-6受容体抗体を作製するには次のようにすればよい。 例えば、 抗体取得の感作抗原として使用されるヒト IL- 6受容体は、 欧州特許出願公開番号 EP 32547 に、マウス IL- 6受容体は日本特許出願公開番号特開平 3- 155795に開示された IL-6受容体遺伝子 Zアミノ酸配列を用いることによって得られる。
IL-6受容体蛋白質は、細胞膜上に発現しているものと細胞膜より離脱しているもの (可溶性 IL- 6受容体） (Yasukawa, K. et al . , J. Biochem. (1990) 108, 673-676) との二種類がある。可溶性 IL-6受容体は細胞膜に結合している IL- 6受容体の実質的 に細胞外領域から構成されており、細胞膜貫通領域あるいは細胞膜貫通領域と細胞内 領域が欠損している点で膜結合型 IL- 6受容体と異なっている。 IL-6受容体蛋白質は、 本発明で用いられる抗 IL-6受容体抗体の作製の感作抗原として使用されうる限り、 いずれの IL- 6受容体を使用してもよい。
IL-6 受容体の遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形 質転換させた後、 その宿主細胞中又は、 培養上清中から目的の IL- 6受容体蛋白質を 公知の方法で精製し、 この精製 IL- 6受容体蛋白質を感作抗原として用いればよい。 また、 IL-6受容体を発現している細胞や IL-6受容体蛋白質と他の蛋白質との融合蛋 白質を感作抗原として用いてもよい。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、 特に限定されるものではないが、 細胞融 合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげつ歯 類の動物、 例えば、 マウス、 ラッ卜、 ハムス夕一等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、 公知の方法にしたがって行われる。 例えば、 一般 的方法として、 感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は、 皮下に注射することにより行われ る。 具体的には、 感作抗原を PBS (Phosphate-Buf fered Sal ine ) や生理食塩水等で 適当量に希釈、 懸濁したものを所望により通常のアジュバント、 例えば、 フロイント 完全アジュバントを適量混合し、 乳化後、 哺乳動物に -21 日毎に数回投与するのが 好ましい。 また、 感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。 このように免疫し、 血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、 哺乳 動物から免疫細胞が取り出され、 細胞融合に付される。細胞融合に付される好ましい 免疫細胞としては、 特に脾細胞が挙げられる。
5 前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、す でに、公知の種々の細胞株、例えば、 P3X63Ag8.653 (Kearney, J. F. et al. J. Immnol.
(1979) 123, 1548-1550) , P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and
I腿 unology (1978) 81, 1-7) 、 NS-1 (Rohler. G. and Milstein, C. Eur. J.
Immunol. (1976) 6， 511-519 )、 MPC-11 (Margulies. D. H. et al., Cell (1976) 8， 10 405-415 )、 SP /0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270 )、 F0 (de
St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21 )、 S194 (Trowbridge,
I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323)、 R210 (Gal f re, G. et al., Nature (1979)
277, 131-133 ) 等が適宜使用される。
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、 たとえば、 ミ 15 ルシユタインらの方法 (Kohler. G. and Milstein, C. , Methods Enzymol. (1981) 73,
3-46) 等に準じて行うことができる。
より具体的には、 前記細胞融合は例えば、 細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培 養液中で実施される。 融合促進剤としては例えば、 ポリエチレングリコール （PEG)、 センダイウィルス （HVJ) 等が使用され、 更に所望により融合効率を高めるためにジ
20 メチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、 例えば、 ミエローマ細胞に対して免疫 細胞を 1〜10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、 前記ミエローマ細胞株の増殖に好適な RPMI 1640培養液、 MEM培養液、その他、 この種 の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、 さらに、 牛胎児血清 （FCS)
25 等の血清補液を併用することもできる。
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合 し、 予め、 37で程度に加温した PEG溶液、 例えば、 平均分子量 1000〜6000程度の PEG 溶液を通常、 30〜60% (w/v) の濃度で添加し、 混合することによって目的とする融 合細胞 （ハイプリドーマ） が形成される。 続いて、 適当な培養液を逐次添加し、 遠心 して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイプリドーマの生育に好ましくな い細胞融合剤等を除去できる。
当該ハイプリドーマは、通常の選択培養液、例えば、 HAT培養液（ヒポキサンチン、 アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液） で培養することにより選択される。 当 該 HAT培養液での培養は、 目的とする八イブリドーマ以外の細胞 （非融合細胞） が死 減するのに十分な時間、 通常数日〜数週間継続する。 ついで、 通常の限界希釈法を実 施し、 目的とする抗体を産生するハイプリドーマのスクリーニングおよびクローニン グが行われる。
また、 ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリドーマを得る他に、 ヒトリン パ球を in vi troで所望の抗原蛋白質又は抗原発現細胞で感作し、 感作 Bリンパ球を ヒトミエローマ細胞、 例えば U266 と融合させ、 所望の抗原又は抗原発現細胞への結 合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平 1-59878参照）。さらに、 ヒ卜抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジエニック動物に抗原又は抗原発 現細胞を投与し、 前述の方法に従い所望のヒト抗体を取得してもよい （国際特許出願 公開番号 W0 93/12227、 W0 92/03918、 W0 94/02602、 W0 94/25585、 W0 96/34096、 W0 96/33735参照）。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマは、通常 の培養液中で継代培養することが可能であり、 また、 液体窒素中で長期保存すること が可能である。
当該ハイプリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、 当該ハイプリドーマ を通常の方法にしたがい培養し、 その培養上清として得る方法、 あるいはハイブリド 一マをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法な どが採用される。 前者の方法は、 高純度の抗体を得るのに適しており、 一方、 後者の 方法は、 抗体の大量生産に適している。
例えば、 抗 IL- 6受容体抗体産生ハイプリドーマの作製は、 特開平 3- 139293に開示 された方法により行うことができる。 PM- 1抗体産生ハイプリドーマを BALB/cマウス の腹腔内に注入して腹水を得、 この腹水から PM-1抗体を精製する方法や、 本八イブ リドーマを適当な培地、 例えば、 10%ゥシ胎児血清、 5%BM- CondimedHl (Boehringer Mannheim製)含有 RPMI1640培地、ハイブリドーマ SFM培地 (GIBC0- BRL製）、 PFHM-II 培地（GIBC0-BRL製）等で培養し、 その培養上清から PM-1抗体を精製する方法で行う ことができる。
本発明では、 モノクローナル抗体として、 抗体遺伝子をハイプリド一マからクロー ニングし、 適当なベクターに組み込んで、 これを宿主に導入し、 遺伝子組換え技術を 用いて産生させた組換え型抗体を用いることができる （例えば、 BorrebaeckC. A. K. and Larrick J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。
具体的には、 目的とする抗体を産生する細胞、 例えば八イブリドーマから、 抗体の 可変 （V) 領域をコードする mRNAを単離する。 mRNAの単離は、 公知の方法、 例えば、 グァニジン超遠心法 (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299 )、 AGPC法 (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159)等により全 RNAを調製し、 mRNA Purification Kit (Pharmacia製） 等を使用して mRNAを調製す る。 また、 QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia製） を用いることにより mRNAを直接調製することができる。
得られた mRNAから逆転写酵素を用いて抗体 V領域の cDNAを合成する。 cDNAの合成 は、 層 Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit等を用いて行う ことができる。 また、 cDNAの合成および増幅を行うには 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製) および PCRを用いた 5' -RACE法 (Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1988) 85, 8998-9002 ； Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) を使用することができる。 得られた PCR産物から目的と する DNA断片を精製し、 ベクター DNAと連結する。 さらに、 これより組換えべクタ一 を作成し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。 目的とする DNAの塩基配列を公知の方法、 例えば、 デォキシ法により確認する。
目的とする抗体の V領域をコードする DNAが得られれば、 これを所望の抗体定常領 域 （C領域） をコードする DNAと連結し、 これを発現べクタ一へ組み込む。 又は、 抗 体の V領域をコードする DNAを、抗体 C領域の DNAを含む発現べクタ一へ組み込んで もよい。
本発明で使用される抗体を製造するには、後述のように抗体遺伝子を発現制御領域、 例えば、 ェンハンサー、 プロモーターの制御のもとで発現するよう発現べクタ一に組 み込む。 次に、 この発現べクタ一により宿主細胞を形質転換し、 抗体を発現させるこ とができる。
本発明では、 ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改 変した遺伝子組換え型抗体、 例えば、 キメラ （Chimeri c) 抗体、 ヒト化 （Humanized) 抗体などを使用できる。 これらの改変抗体は、 既知の方法を用いて製造することがで さる。
キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体 V領域をコードする DNAをヒト抗体 C領 域をコードする DNAと連結し、 これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生さ せることにより得られる （欧州特許出願公開番号 EP 125023、 国際特許出願公開番号 W0 92-19759参照)。 この既知の方法を用いて、 本発明に有用なキメラ抗体を得ること ができる。
ヒト化抗体は、 再構成 （reshaped) ヒト抗体またはヒト型化抗体とも称され、 ヒト 以外の哺乳動物、 例えばマウス抗体の相補性決定領域 （CDR)をヒト抗体の相補性決定 領域へ移植したものであり、 その一般的な遺伝子組換え手法も知られている （欧州特 許出願公開番号 EP 125023, 国際特許出願公開番号 W0 92-19759参照）。
具体的には、 マウス抗体の CDRとヒト抗体のフレームワーク領域 （FR; framework region) を連結するように設計した DNA配列を、 末端部にオーバ一ラップする部分を 有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドから PCR法により合成する。得られ た DMをヒト抗体 C領域をコ一ドする DNAと連結し、次いで発現べクタ一に組み込ん で、 これを宿主に導入し産生させることにより得られる （欧州特許出願公開番号 EP 239400、 国際特許出願公開番号 W0 92- 19759参照）。
CDRを介して連結されるヒ卜抗体の FRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を 形成するものが選択される。 必要に応じ、 再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な 抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を 置換してもよい （Sato, K. et al . , Cancer Res. (1993) 53, 851-856)。 キメラ抗体、 ヒト化抗体には、 通常、 ヒト抗体 C領域が使用される。 ヒト抗体重鎖 C領域の例としては、 Cァ、 C a、 ίΐ、 C S、 C sが、挙げられ、例えば、 C r l、 C r 2, C r 3 又は C T 4を使用することができる。 ヒト抗体軽鎖 C領域の例としては、 κまたは λ を挙げることができる。 また、 抗体又はその産生の安定性を改善するために、 ヒト抗 体 c領域を修飾してもよい。
キメラ抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の C領域から なり、 またヒト化抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域とヒト抗体由 来のフレームワーク領域および C領域からなり、 これらはヒト体内における抗原性が 低下しているため、 本発明に使用される抗体として有用である。
本発明に使用されるヒト化抗体の好ましい具体例としては、 ヒト化 PM-1抗体が挙 げられる （国際特許出願公開番号 TO 92-19759参照）。
また、 ヒ卜抗体の取得方法としては先に述べた方法のほか、 ヒト抗体ライブラリ一 を用いて、 パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。 例えば、 ヒト 抗体の可変領域を一本鎖抗体（scFv) としてファ一ジディスプレイ法によりファージ の表面に発現させ、 抗原に結合するファージを選択することもできる。選択されたフ ァージの遺伝子を解析すれば、 抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードする DNA 配列を決定することができる。 抗原に結合する scFvの DNA配列が明らかになれば、 当該配列を含む適当な発現べクタ一を作製し、 ヒト抗体を取得することができる。 こ れらの方法は既に周知であり、 W0 92/01047, W0 92/20791, W0 93/06213, W0 93/11236, W0 93/19172, W0 95/01438, W0 95/15388を参考にすることができる。
前記のように構築した抗体遺伝子は、 公知の方法により発現させることができる。 哺乳類細胞を用いた場合、 常用される有用なプロモーター、 発現される抗体遺伝子、 その 3'側下流にポリ Aシグナルを機能的に結合させた DNAあるいはそれを含むベクタ 一により発現させることができる。 例えばプロモ一夕一/ェンハンサーとしては、 ヒ トサイトメガロウィルス前期プロモーター Zェンハンサ— （human cytomegalovi rus immedi ate ear ly promoter/enhancer) を挙げること力できる。
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター/ェンハン サ一として、 レトロウイルス、 ポリオ一マウィルス、 アデノウイルス、 シミアンウイ ルス 40 (SV40)等のウィルスプロモーター /ェンハンサ一ゃヒトェロンゲ一ションフ ァク夕一 1 (HEF1 ) などの哺乳類細胞由来のプロモーター Zェンハンサーを用い ればよい。
例えば、 SV40 プロモー夕一 ェンハンサ一を使用する場合、 Mulligan らの方法 (Mulligan, R. C. et al., Nature (1979) 277, 108-114) 、 また、 HEF1 αプロモ一 夕一/ェンハンサ一を使用する場合、 Mizushimaらの方法（Mizushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322 ) に従えば容易に実施することができる。 宿主として原核細胞を使用する場合、 細菌細胞を用いる産生系がある。 細菌細胞と しては、 大腸菌 （E.coli)、 枯草菌が知られている。
大腸菌の場合、 常用される有用なプロモーター、 抗体分泌のためのシグナル配列、 発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモ 一夕一としては、 lacZプロモーター、 araBプロモ一夕一を挙げることができる。 lacZ プロモーターを使用する場合、 Wardらの方法（Ward, E. S. et al., Nature (1989) 341, 544-546 ; Ward, E. S. et al. FASEB J. (1992) 6, 2422-2427 ), araBプロモーター を使用する場合、 Better らの方法 （Better, M. et al. Science (1988) 240, 1041-1043 ) に従えばよい。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリブラズムに産生させる場合、 pelBシグナル配列 (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383)を使 用すればよい。 ペリブラズムに産生された抗体を分離した後、 抗体の構造を適切にリ フォールド （refold) して使用する （例えば、 W096/30394を参照）。
複製起源としては、 SV40、 ポリオ一マウィルス、 アデノウイルス、 ゥシパピローマ ウィルス （BPV)等の由来のものを用いることができ、 さらに、 宿主細胞系で遺伝子コ ピ一数増幅のため、 発現べクタ一は選択マーカーとして、 アミノグリコシドホスホト ランスフェラーゼ （APH) 遺伝子、 チミジンキナーゼ （TK) 遺伝子、 大腸菌キサンチ ングァニンホスホリポシルトランスフェラ一ゼ （EC0gpt) 遺伝子、 ジヒドロ葉酸還元 酵素 （dhfr) 遺伝子等を含むことができる。
本発明で使用される抗体の製造のために、 任意の産生系を使用することができる。 抗体製造のための産生系は、 in vitroおよび in vivoの産生系がある。 in vitroの 産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられ る。
宿主として真核細胞を使用する場合、 動物細胞、 植物細胞、 又は真菌細胞を用いる 産生系がある。 動物細胞としては、 （1)哺乳類細胞、 例えば、 CH0、 COS, ミエ口一マ、 BHK(baby hams ter kidney) , HeLa、 Veroなど、 (2)両生類細胞、 例えば、 アフリカッ メガエル卵母細胞、 あるいは（3)昆虫細胞、 例えば、 s f9、 sf21、 Tn5などが知られて いる。 植物細胞としては、 ニコチアナ ·タパクム（Nicot iana tabacum)由来の細胞が 知られており、 これをカルス培養すればよい。 真菌細胞としては、 酵母、 例えば、 サ ッカロミセス (Saccharomyces)属、例えぱサッカロミセス ·セレピシェ (Saccharomyces cerevis iae) , 糸状菌、 例えばァスペルギルス属 （Aspergi l lus)属、 例えばァスペル ギルス ·二ガー （Aspergi l lus niger) などが知られている。
これらの細胞に、 目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、 形質転換された 細胞を in vi troで培養することにより抗体が得られる。 培養は、 公知の方法に従い 行う。 例えば、 培養液として、 DMEM、 MEM, RPMI 1640、 IMDMを使用することができ、 牛胎児血清 （FCS) 等の血清補液を併用することもできる。 また、 抗体遺伝子を導入 した細胞を動物の腹腔等へ移すことにより、 in vivoにて抗体を産生してもよい。 一方、 in vivoの産生系としては、 動物を使用する産生系や植物を使用する産生系 が挙げられる。 動物を使用する場合、 哺乳類動物、 昆虫を用いる産生系などがある。 哺乳類動物としては、 ャギ、 ブタ、 ヒッジ、 マウス、 ゥシなどを用いることができ る (Vicki Gl aser, SPECTRUM Biotechnology Appl icat ions, 1993)。 また、 昆虫とし ては、 カイコを用いることができる。 植物を使用する場合、 例えばタバコを用いるこ とができる。
これらの動物又は植物に抗体遺伝子を導入し、動物又は植物の体内で抗体を産生さ せ、 回収する。 例えば、 抗体遺伝子をャギ /3カゼインのような乳汁中に固有に産生さ れる蛋白質をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺 伝子が挿入された融合遺伝子を含む DNA断片をャギの胚へ注入し、 この胚を雌のャギ へ導入する。胚を受容したャギから生まれるトランスジエニックャギ又はその子孫が 産生する乳汁から所望の抗体を得る。 トランスジェニックャギから産生される所望の 抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジエニックャギに使 用してもよい (Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702 )。
また、 カイコを用いる場合、 目的の抗体遺伝子を挿入したバキュロウィルスをカイ コに感染させ、 このカイコの体液より所望の抗体を得る （Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592-594)。 さらに、 タバコを用いる場合、 目的の抗体遺伝子を植物発現 用ベクター、 例えば pM0N530に挿入し、 このべクタ一を Agrobacterium tumefaciens のようなパクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば Nicotiana tabacum に感染させ、 本タバコの葉より所望の抗体を得る （Julian, K. -C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994)24, 131-138)。
上述のように in vitro又は in vivoの産生系にて抗体を産生する場合、 抗体重鎖 (H鎖） 又は軽鎖 （L鎖） をコードする DNAを別々に発現ベクターに組み込んで宿主 を同時形質転換させてもよいし、 あるいは Η鎖および L鎖をコードする DNAを単一の 発現ベクターに組み込んで、宿主を形質転換させてもよい（国際特許出願公開番号 W0 94- 11523参照）。
本発明で使用される抗体は、 本発明に好適に使用され得るかぎり、 抗体の断片やそ の修飾物であってよい。 例えば、 抗体の断片としては、 Fab、 F(ab')2、 Fv又は H鎖と L鎖の Fvを適当なリンカーで連結させたシングルチエイン Fv (scFv)が挙げられる。 具体的には、 抗体を酵素、 例えば、 パパイン、 ペプシンで処理し抗体断片を生成さ せるか、 又は、 これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、 これを発現べクタ一に 導入した後、 適当な宿主細胞で発現させる （例えば、 Co, M.S. et al., J. I腿 unol. (1994) 152, 2968 - 2976、 Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496、 Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 497-515、 Lamoyi, E. , Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663、 Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663—66、 Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132- 137参照）。
scFvは、抗体の H鎖 V領域と L鎖 V領域を連結することにより得られる。この scFv において、 H鎖 V領域と L鎖 V領域はリンカ一、 好ましくは、 ペプチドリンカ一を介 して連結される (Huston, J. S. et al.、 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883)。 scFvにおける H鎖 V領域および L鎖 V領域は、上記抗体として記載され たもののいずれの由来であってもよい。 V領域を連結するペプチドリンカーとしては、 例えばァミノ酸 12 - 19残基からなる任意の一本鎖べプチドが用いられる。
scFvをコードする DNAは、 前記抗体の H鎖又は、 H鎖 V領域をコードする DNA、 お よび L鎖又は、 L鎖 V領域をコードする DNAを銬型とし、 それらの配列のうちの所望 のアミノ酸配列をコ一ドする DNA部分を、その両端を規定するプライマ一対を用いて PCR法により増幅し、 次いで、 さらにペプチドリンカ一部分をコードする DNAおよび その両端を各々 H鎖、 L鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増 幅することにより得られる。
また、 一旦 scFvをコードする DNAが作製されれば、 それらを含有する発現べクタ 一、および該発現べクタ一により形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、 また、 その宿主を用いて常法に従って、 scFvを得ることができる。
これら抗体の断片は、 前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、 宿主により 産生させることができる。 本発明でいう 「抗体」 にはこれらの抗体の断片も包含され る。
抗体の修飾物として、 ポリエチレングリコール （PEG)等の各種分子と結合した抗体 を使用することもできる。 本発明でいう 「抗体」 にはこれらの抗体修飾物も包含され る。 このような抗体修飾物を得るには、 得られた抗体に化学的な修飾を施すことによ つて得ることができる。 これらの方法はこの分野においてすでに確立されている。 前記のように産生、 発現された抗体は、 細胞内外、 宿主から分離し均一にまで精製 することができる。 本発明で使用される抗体の分離、 精製はァフィ二ティーク口マト グラフィ一により行うことができる。ァフィ二ティ一クロマトグラフィーに用いる力 ラムとしては、 例えば、 プロテイン Aカラム、 プロテイン Gカラムが挙げられる。 プ ロティン Aカラムに用いる担体として、 例えば、 HyperD、 POROS, SepharoseF. F.等が 挙げられる。 その他、 通常のタンパク質で使用されている分離、 精製方法を使用すれ ばよく、 何ら限定されるものではない。
例えば、 上記ァフィ二ティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィー、 フィ ルター、 限外濾過、 塩析、 透析等を適宜選択、 組み合わせれば、 本発明で使用される 抗体を分離、 精製することができる。 クロマトグラフィーとしては、 例えば、 イオン 交換クロマトグラフィー、 疎水クロマトグラフィー、 ゲルろ過等が挙げられる。 これ らのクロマトグラフィーは HPLC (High performance l iquid chromatography) に適用 し得る。 また、 逆相 HPLC (reverse phase HPLC) を用いてもよい。
上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は ELISA等により行うことができ る。 すなわち、 吸光度の測定による場合には、 PBS (-)で適当に希釈した後、 280nmの 吸光度を測定し、 lmg/mlを 1. 350Dとして算出する。 また、 EL ISAによる場合は以下 のように測定することができる。 すなわち、 0. 1M重炭酸緩衝液 （PH9. 6) で l g/ml に希釈したャギ抗ヒト IgG (TAG製） 100 i 1を 96穴プレート （Nunc製） に加え、 4 °C で一晩インキュベーションし、 抗体を固相化する。 ブロッキングの後、 適宜希釈した 本発明で使用される抗体又は抗体を含むサンプル、 あるいは標品としてヒト IgG (CAPPEL製） 100 1を添加し、 室温にて 1時間インキュベーションする。
洗浄後、 5000 倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒト IgG (BIO SOURCE 製） 100 ^ 1を加え、 室温にて 1時間インキュベートする。 洗浄後、 基質溶液を加え インキュべ一ションの後、 MI CR0PLATE READER Model 3550 (Bio-Rad製）を用いて 05nm での吸光度を測定し、 目的の抗体の濃度を算出する。
IL-6受容体部分べプチドは IL-6受容体のアミノ酸配列において IL-6と IL-6受容 体との結合に係わる領域の一部又は全部のアミノ酸配列からなるペプチドである。 こ のようなペプチドは、 通常 1 0〜8 0、 好ましくは 2 0〜5 0、 より好ましくは 2 0 〜4 0個のアミノ酸残基からなる。
IL-6受容体部分べプチドは IL- 6受容体のアミノ酸配列において、 IL- 6と IL-6受 容体との結合に係わる領域を特定し、その特定した領域の一部又は全部のアミノ酸配 列に基づいて通常知られる方法、例えば遺伝子工学的手法又はペプチド合成法により 作製することができる。
IL-6受容体部分べプチドを遺伝子工学的手法により作製するには、所望のぺプチド をコードする DM配列を発現ベクターに組み込み、 前記組換え型抗体の発現、 産生及 び精製方法に準じて得ることができる。
IL-6受容体部分べプチドをぺプチド合成法により作製するには、ぺプチド合成にお いて通常用いられている方法、例えば固相合成法又は液相合成法を用いることができ る。
具体的には、 続医薬品の開発第 1 4巻ペプチド合成 監修矢島治明廣川書店 1991 年に記載の方法に準じて行えばよい。 固相合成法としては、 例えば有機溶媒に不溶性 である支持体に合成しょうとするペプチドの C末端に対応するアミノ酸を結合させ、 α -ァミノ基及び側鎖官能基を適切な保護基で保護したアミノ酸を C末端から N末端 方向の順番に 1アミノ酸ずつ縮合させる反応と樹脂上に結合したアミノ酸又はぺプ チドのひ-ァミノ基の該保護基を脱離させる反応を交互に繰り返すことにより、 ぺプ チド鎖を伸長させる方法が用いられる。 固相ペプチド合成法は、 用いられる保護基の 種類により Boc法と Fmoc法に大別される。
このようにして目的とするぺプチドを合成した後、脱保護反応及びべプチド鎖の支 持体からの切断反応をする。 ペプチド鎖との切断反応には、 Boc法ではフッ化水素又 はトリフルォロメタンスルホン酸を、又 Fmoc法では TFAを通常用いることができる。 Boc法では、 例えばフッ化水素中で上記保護ペプチド樹脂をァニソ一ル存在下で処理 する。 次いで、 保護基の脱離と支持体からの切断をしペプチドを回収する。 これを凍 結乾燥することにより、 粗ペプチドが得られる。 一方、 Fmoc法では、 例えば TFA中で 上記と同様の操作で脱保護反応及びべプチド鎖の支持体からの切断反応を行うこと ができる。
得られた粗ペプチドは、 HPLCに適用することにより分離、 精製することができる。 その溶出にあたり、 蛋白質の精製に通常用いられる水-ァセトニトリル系溶媒を使用 して最適条件下で行えばよい。得られたクロマトグラフィーのプロファイルのピーク に該当する画分を分取し、 これを凍結乾燥する。 このようにして精製したペプチド画 分について、 マススペクトル分析による分子量解析、 アミノ酸組成分析、 又はアミノ 酸配列解析等により同定する。
本発明の眼炎症疾患治療剤は、眼炎症疾患の治療および/または予防において使用 することが可能である。
本発明において 「眼炎症疾患治療」 とは、 眼炎症疾患の抑制、 眼炎症疾患の発生率 の低下、 眼炎症疾患の治療、 眼炎症疾患の症状の改善などを意味する。 本発明の治療剤で治療することのできる眼炎症疾患には、 汎ぶどう膜炎、 前部ぶど う膜炎、 中間部ぶどう膜炎、 強膜炎、 角膜炎、 眼窩炎症、 視神経炎、 ドライアイ、 糖 尿病網膜症、 増殖硝子体網膜症および術後炎症が含まれる。
本発明で使用される IL- 6受容体阻害剤の眼炎症疾患治療剤としての効果は、 例え ばシグナル伝達阻害活性を指標として評価することができるがこれに限定されない。
IL-6受容体阻害剤のシグナル伝達阻害活性は、通常用いられる方法により評価するこ とができる。 具体的には、 IL-6依存性ヒト骨髄腫株（S6B45，KP醒 2)、 ヒトレンネルト Tリンパ腫細胞株 KT3、 あるいは IL-6依存性細胞 MH60. BSF2を培養し、 これに IL-6 を添加し、 同時に IL- 6受容体阻害剤を共存させることにより IL- 6依存性細胞の ¾- チミジン取込みを測定すればよい。また、 IL-6受容体発現細胞である U266を培養し、 1251標識 IL- 6を添加し、 同時に IL- 6受容体阻害剤を加えることにより、 IL- 6受容体 発現細胞に結合した1251標識 IL- 6を測定する。 上記アツセィ系において、 IL- 6受容 体阻害剤を存在させる群に加え IL-6受容体阻害剤を含まない陰性コントロール群を おき、両者で得られた結果を比較すれば IL- 6受容体阻害剤の IL- 6受容体阻害活性を 評価することができる。
後述する実施例に示すように、 IRBPぺプチド免疫により誘導した自己免疫性ブドウ 膜炎 （EAU) マウスにおいて、 抗 IL- 6受容体抗体を EAU誘導直前に投与することで、 EAUの炎症の程度を著しく抑制することが可能であった。 また、 IRBPペプチド再刺激 試験の結果、 TH17細胞のみが分泌するとされている IL- 17のみが抗 IL-6受容体抗体 投与マウスで有意な分泌低下を認め、 その他の炎症性サイトカインは抗 IL- 6受容体 抗体投与により変化を認めなかった。本発明者らは特定の理論に拘束されるものでは ないが、抗 IL- 6受容体抗体の抑制効果が CD4陽性 Τ細胞の TH17細胞への分化抑制を 介して行われているものと推測している。
本発明の眼炎症疾患治療剤が投与される対象は哺乳動物である。 哺乳動物は、 好ま しくはヒトである。
本発明の眼炎症疾患治療剤は、 医薬品の形態で投与することが可能であり、 経口的 または非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。 例えば、 点滴などの 静脈内注射、 筋肉内注射、 腹腔内注射、 皮下注射、 坐薬、 注腸、 経口性腸溶剤などを 選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。 有効投与量は、 一回につき体重 lkgあたり O. Olmgから lOOmgの範囲で選ばれる。 あ るいは、 患者あたり l〜1000mg、 好ましくは 5〜50mgの投与量を選ぶことができる。 好ましい投与量、 投与方法の具体的な例としては、 たとえば抗 IL-6受容体抗体の場 合、 体重 lkgあたり 1ヶ月 （4週間） に 0. 5mgから 40mg、 好ましくは lmgから 20mg を 1回から数回に分けて、 例えば 2回 Z週、 1回/週、 1回 / 2週、 1回 Z 4週など の投与スケジュールで点滴などの静脈内注射、 皮下注射、 筋肉内注射などの方法で、 投与する方法などである。 投与スケジュールは、 患者の状態の観察および血液検査値 の動向を観察しながら 2回 週あるいは 1回 週から 1回 / 2週、 1回/' 3週、 1回 ノ 4週のように投与間隔を延ばしていくなど調整することも可能である。
本発明の眼炎症疾患治療剤には、保存剤や安定剤等の製剤上許容しうる担体が添加 されていてもよい。 製剤上許容しうる担体とは、 上記の薬剤とともに投与可能な材料 を意味する。製剤上許容される材料としては、例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、 賦形剤、 緩衝剤、 防腐剤、 界面活性剤、 キレ一ト剤 (EDTA等)、 結合剤等を挙げること ができる。
本発明において、 界面活性剤としては非イオン界面活性剤を挙げることができ、 例 えばソルビタンモノ力プリレート、 ソルビタンモノラウレート、 ソルビタンモノパル ミテート等のソルビタン脂肪酸エステル；グリセリンモノカプリレート、 グリセリン モノミリステート、 グリセリンモノステアレート等のグリセリン脂肪酸エステル；デ カグリセリルモノステアレート、 デカグリセリルジステアレート、 デカグリセリルモ ノリノレート等のポリグリセリン脂肪酸エステル；ポリォキシエチレンソルビタンモ ノラウレート、 ポリオキシエチレンソルビタンモノォレエート、 ポリオキシエチレン
テアレート等のポリォキシエチレンソルビ夕ン脂肪酸エステル；ポリォキシエチレン ソルピットテトラステアレート、ポリオキシエチレンソルビットテトラオレエート等 のポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル；ポリオキシエチレングリセリルモ ノステアレート等のポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ポリエチレング リコールジステアレート等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシェ チレンラウリルエーテル等のポリォキシエチレンアルキルエーテル；ポリォキシェチ 口ピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル等のポリ フエニルエーテル等のポリォキシエチレンアルキルフエ二ルェ一テル；ポリォキシェ チレンヒマシ油、 ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 （ポリオキシエチレン水素ヒマシ 油）等のポリオキシエチレン硬化ヒマシ油；ポリオキシエチレンソルビットミツロウ 等のポリオキシエチレンミツロウ誘導体；ポリオキシエチレンラノリン等のポリオキ シエチレンラノリン誘導体；ポリオキシエチレンステアリン酸アミド等のポリオキシ エチレン脂肪酸アミド等の H L B 6〜1 8を有するもの、等を典型的例として挙げる ことができる。
また、 界面活性剤としては陰イオン界面活性剤も挙げることができ、 例えばセチル 硫酸ナトリウム、 ラウリル硫酸ナトリウム、 ォレイル硫酸ナトリウム等の炭素原子数 1 0〜1 8のアルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンラウリル硫酸 ナトリゥム等の、エチレンォキシドの平均付加モル数が 2〜 4でアルキル基の炭素原 子数が 1 0〜1 8であるポリオキシエチレンアルキルェ一テル硫酸塩；ラウリルスル ホコハク酸エステルナトリウム等の、 アルキル基の炭素原子数が 8〜1 8のアルキル スルホコハク酸エステル塩；天然系の界面活性剤、 例えばレシチン、 グリセ口リン脂 質；スフィンゴミエリン等のフィンゴリン脂質；炭素原子数 1 2〜 1 8の脂肪酸のシ ョ糖脂肪酸エステル等を典型的例として挙げることができる。
本発明の薬剤には、 これらの界面活性剤の 1種または 2種以上を組み合わせて添加 することができる。 本発明の製剤で使用する好ましい界面活性剤は、 ポリソルべ一ト
2 0 , 4 0， 6 0又は 8 0などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであ り、 ポリソルべ一ト 2 0及び 8 0が特に好ましい。 また、 ポロキサマ一 （プルロニッ ク ー6 8 (登録商標） など） に代表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレ ングリコールも好ましい。
界面活性剤の添加量は使用する界面活性剤の種類により異なるが、ポリソルべ一ト 2 0又はポリソルべ一ト 8 0の場合では、 一般には 0 . 0 0 1〜： L 0 O m g /mLで あり、 好ましくは 0 . 0 0 3〜5 O m gZmLであり、 さらに好ましくは 0 . 0 0 5 〜2 m g //m;Lでめる。
本発明において緩衝剤としては、 リン酸、 クェン酸緩衝液、 酢酸、 リンゴ酸、 酒石 酸、 コハク酸、乳酸、 リン酸カリウム、 ダルコン酸、力プリル酸、デォキシコール酸、 サリチル酸、 トリエタノールァミン、 フマル酸等 他の有機酸等、 あるいは、 炭酸緩 衝液、 トリス緩衝液、 ヒスチジン緩衝液、 イミダゾ一ル緩衝液等を挙げることが出来 る。
また溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解することによって溶液製剤を調製 してもよい。 緩衝液の濃度は一般には 1〜 5 0 O mMであり、 好ましくは 5〜1 0 0 mMであり、 さらに好ましくは 1 0〜 2 0 mMである。
また、 本発明の治療剤は、 その他の低分子量のポリペプチド、 血清アルブミン、 ゼ ラチンや免疫グロブリン等の蛋白質、 アミノ酸、 多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、 糖アルコールを含んでいてもよい。
本発明においてアミノ酸としては、 塩基性アミノ酸、 例えばアルギニン、 リジン、 ヒスチジン、オル二チン等、またはこれらのアミノ酸の無機塩（好ましくは、塩酸塩、 リン酸塩の形、 すなわちリン酸アミノ酸） を挙げることが出来る。 遊離アミノ酸が使 用される場合、 好ましい pH値は、 適当な生理的に許容される緩衝物質、 例えば無機 酸、 特に塩酸、 リン酸、 硫酸、 酢酸、 蟻酸又はこれらの塩の添加により調整される。 この場合、リン酸塩の使用は、特に安定な凍結乾燥物が得られる点で特に有利である。 調製物が有機酸、 例えばリンゴ酸、 酒石酸、 クェン酸、 コハク酸、 フマル酸等を実質 的に含有しない場合あるいは対応する陰イオン （リンゴ酸イオン、 酒石酸イオン、 ク ェン酸イオン、 コハク酸イオン、 フマル酸イオン等） が存在しない場合に、 特に有利 である。 好ましいアミノ酸はアルギニン、 リジン、 ヒスチジン、 またはオル二チンで ある。 さらに、 酸性アミノ酸、 例えばグルタミン酸及びァスパラギン酸、 及びその塩 の形 （好ましくはナトリウム塩） あるいは中性アミノ酸、 例えばイソロイシン、 ロイ シン、 グリシン、 セリン、 スレオニン、 バリン、 メチォニン、 システィン、 またはァ ラニン、 あるいは芳香族アミノ酸、 例えばフエ二ルァラニン、 チロシン、 トリプトフ ァン、 または誘導体の N-ァセチルトリプトフアンを使用することもできる。
本発明において、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物としては、例えばデキストラン、 グルコース、 フラク 1 ^一ス、 ラクト一ス、 キシロース、 マンノース、 マルト一ス、 ス クロ一ス， トレハロース、 ラフイノ一ス等を挙げることができる。
本発明において、 糖アルコールとしては、 例えばマンニトール、 ソルビトール、 ィ ノシトール等を挙げることができる。
本発明の薬剤を注射用の水溶液とする場合には、 例えば生理食塩水、 ブドウ糖やそ の他の補助薬 （例えば、 D-ソルビトール、 D-マンノース、 D-マンニトール、 塩化ナト リウム） を含む等張液と混合することができる、 また該水溶液は、 適当な溶解補助剤
(例えばアルコール（エタノール等）、 ポリアルコール（プロピレングリコール、 PEG 等)、 非イオン性界面活性剤 (ポリソルベート 80、 HC0- 50)等） と併用してもよい。 所望によりさらに希釈剤、 溶解補助剤、 p H調整剤、 無痛化剤、 含硫還元剤、 酸化 防止剤等を含有してもよい。
本発明において、 含硫還元剤としては、 例えば、 N—ァセチルシスティン、 N—ァ セチルホモシスティン、 チォクト酸、 チォジグリコール、 チォエタノールァミン、 チ オダリセロール、 チォソルビトール、 チォグリコール酸及びその塩、 チォ硫酸ナトリ ゥム、 ダル夕チオン、 並びに炭素原子数 1〜7のチオアルカン酸等のスルフヒドリル 基を有するもの等を挙げることができる。
また、 本発明において酸化防止剤としては、 例えば、 エリソルビン酸、 ジブチルヒ ドロキシトルエン、 ブチルヒドロキシァニソ一ル、 α—トコフエロール、 酢酸トコフ エロール、 L—ァスコルビン酸及びその塩、 Lーァスコルビン酸パルミテート、 L— ァスコルビン酸ステアレート、 亜硫酸水素ナトリウム、 亜硫酸ナトリウム、 没食子酸 トリァミル、 没食子酸プロピルあるいはエチレンジァミン四酢酸ニナトリウム （E D Τ Α)、 ピロリン酸ナトリウム、 メタリン酸ナトリウム等のキレート剤を挙げること が出来る。
また、 必要に応じ、 マイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、 ゼラチン、 ポリ [メチルメタクリル酸]等のマイクロカプセリレ）に封入したり、 コロイドドラッグ デリバリーシステム（リボソーム、 アルブミンミクロスフエア、 マイクロエマルジョ ン、ナノ粒子及びナノカプセル等）とすることもできる（"Remington s Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed., 1980等参照）。 さらに、 薬剤を徐放性の薬剤とす る方法も公知であり、本発明に適用し得る（Langer et al.， J.Biomed.Mater.Res. 1981， 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. 1982, 12: 98-105；米国特許第 3, 773, 919号；欧 州特許出願公開（EP)第 58,481号； Sidmanet al., Biopolyraers 1983, 22: 547-556;EP 第 133， 988号）。
使用される製剤上許容しうる担体は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合 せて選択されるが、 これらに限定されるものではない。
本発明は、 IL- 6受容体阻害剤を、眼炎症疾患を発症した対象または発症する可能性 がある対象に投与する工程を含む、対象において眼炎症疾患を治療および/または予 防する方法に関する。
本発明において、 「対象」 とは、 本発明の眼炎症疾患治療剤を投与する生物体、 該 生物体の体内の一部分をいう。 生物体は、 特に限定されるものではないが、 動物 （例 えば、 ヒト、 家畜動物種、 野生動物） を含む。
また、 「生物体の体内の一部分」 については特に限定されないが、 好ましくは眼ま たは眼周辺領域などを挙げることが出来る。
本発明において、 「投与する」 とは、 経口的、 あるいは非経口的に投与することが 含まれる。 経口的な投与としては、 経口剤という形での投与を挙げることができ、 経 口剤としては、 顆粒剤、 散剤、 錠剤、 カプセル剤、 溶剤、 乳剤、 あるいは懸濁剤等の 剤型を選択することができる。
非経口的な投与としては、 注射剤という形での投与を挙げることができ、 注射剤と しては、 皮下注射剤、 筋肉注射剤、 あるいは腹腔内注射剤等を挙げることができる。 また、投与すべきオリゴヌクレオチドを含む遺伝子を遺伝子治療の手法を用いて生体 に導入することにより、 本発明の方法の効果を達成することができる。 また、 本発明 の薬剤を、 処置を施したい領域に局所的に投与することもできる。 例えば、 手術中の 局所注入、 カテーテルの使用、 または本発明のペプチドをコードする DNAの標的化遺 伝子送達により投与することも可能である。
本発明の方法を実践する際に、 本発明の薬剤は、 少なくとも 1つの既知の療法剤と 共に薬学的組成物の一部として投与されてもよい。 または、 本発明の薬剤は、 少なく とも 1つの既知の炎症性疾患治療剤と同時に投与されてもよい。一つの態様において、 本発明の薬剤および既知の炎症性疾患治療剤は、 実質的に同時に投与されてもよい。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組 み入れられる。
本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、 本発明はこれに限定されない。
種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。
実施例
実施例 1 ：マウスにおける自己免疫性ブドウ膜炎 （EAU) の誘導
マウス
WTC57BL/6 メス、 8〜10週）をすベての実験に使用した。 マウスの取り扱いは Association for Research in Vision and Ophthalmology の Statement for the Use of Animals in
Ophthalmic and Vision Researchに準拠した。
自己免疫性ブドウ膜炎 （EAU) 誘導
光受容器に介在するレチノール結合タンパク質である IRBPのアミノ酸残基 1から
20位より合成されたペプチドを抗原として用いて免疫し、マウス実験的自己免疫性ブ ドウ膜炎 （EAU) を、 誘導した。
すなわち、 IRBP peptidel-20 ( GPTHLFQPSLVLDMAKVLLD) (Gene Net Co. Ltd. (Fukuoka,
Japan)) 2mg/0.7m 1 DMSO/m 1 と結核死菌 H37RA (Sigma- Aldrich (St. Louis, M0) および DIFCO (Detroit, MO)) 10 mg/ml を添加した CFAを 1： 1で混和、 乳化した。 こ のアジュバントをマウスに 0.2m 1/匹 (後頭部に 0.1、 足底に 0.05、 径部に 0.05、
IRBP 200 g) 皮下注射した。 さらに PTX (pertussus toxin百日咳菌毒素) 0.5^g/ 匹を腹腔内に投与した。
実施例 2 ： EAUマウスにおける血清 IL- 6濃度の経時的変化
EAU誘導前、 誘導後 1, 3， 7, 14， 2 1， 28日におけるマウスの末梢血を採 取し、 血清 IL-6を ELISAで測定した。
得られた結果を図 1に示す。血清 IL- 6濃度は EAU誘導後 14日目をピ クとした山 型を呈した。 実施例 3 ：抗マウス IL- 6受容体抗体による EAU発症抑制
EAUマウスを 2群に分けて、一方には抗マウス IL- 6受容体抗体（本願図面では alL - 6R Abと記載する） （n=12) を、 他方にはコントロールとしてラット精製]: gG (本願図面 では Control Abと記載する） （n=13) を 8mg/匹腹腔内に投与した。 抗マウス IL- 6受容 体抗体としては、 MR16-1 (中外製薬社製） を用いた。
評価方法
眼底検査
眼底検査はミドリン Pにて散瞳した後、 細隙灯顕微鏡にて施行した。 網膜血管の拡 張、 白色の点状、 線状病変、 網膜出血や剥離を観察、 評価した。 Clinical score (0 〜4の 5段階）は Thurau らの記述したものに若干修正を加えて以下のように評価した。 Grade 0 ： no change (変化なし)
Grade 1 ： mild vasuculitis; く 5 focal lesions； = linear lesion
(軽度血管炎； 5つ未満の局所病変、 1つ以下の連なる病変）
Grade 2 ： Multiple (>5) chorioretinal lesions and/or infiltrations; severe vasculitis (large size, thick wall, infiltrations)； く 5 linear lesions
(多発する 5つ以上の網脈膜病変と細胞浸潤；重い血管炎 （大きいサイズ、 血管壁の肥 厚、 細胞浸潤） 5つ未満の連なる病変）
Grade 3 ： Pattern of linear lesions； large confluent lesions； subret inal naovascul ization; ret inal hemorrhage; papilledema
(連なる病変の組み合わせ、 大きな網膜全体を覆うような病変や網膜下の新生血管や 網膜出血、 乳頭浮腫の組み合わせ）
Grade 4 ： large retinal detachment, retinal atrophy
(大きな網膜はく離、 網膜萎縮）
組織学的評価
組織学的評価を行うためには、 眼球を摘出、 OCTコンパウンドに封入、 _80°Cで凍 結保存し、 ΙΟμιη厚の切片を作成、 HE (へマトキシリン ·ェォジン） 染色を行って評価 した。
抗マウス IL- 6受容体抗体による EAU発症抑制効果試験 ( 1 ) ΕΑϋ誘導直前に抗マウス IL- 6受容体抗体を投与したときの EAU発症抑制に及ぼす 効果
IRBPペプチドによる EAU誘導の直前に上記 2群に各抗体を投与し、 18日目に眼底検査 および組織学的評価を行った。
眼底検査
眼底検査の結果を図 2 (Cl inical score) および図 3 (眼底所見） に示す。 図 2か ら明らかなように、 本モデルにおける炎症のピークである誘導後 1 8日目において、 抗マウス IL-6受容体抗体投与マウスでは、 コント口ール抗体投与マウスに比較して著 明な炎症抑制が認められた。 また、 図 3から明らかなように、 コントロール抗体投与 マウスでは視神経乳頭浮腫が著明で、 周囲の血管が白鞘化しているのに対し、 抗マウ ス IL- 6受容体抗体投与マウスでは視神経乳頭の輪郭が清明で、血管にもほとんど異常 を認めなかった。
組織学的評価
組織学的評価の結果を図 4に示す。抗マウス IL- 6受容体抗体投与マウスでは炎症細 胞の網膜への浸潤をほとんど認めず、 網膜組織破壊も抑制されていた。
( 2 ) 免疫誘導ペプチド （IRBP) による再刺激試験
マウスの頸部、 腋下、 甩径リンパ節から回収したリンパ球に対して MiniMACS™ Separator (Mi l tenyi Biotec Gladbach, Germany )で CD4陽性 T細胞を精製した。 この
CD4陽性 T細胞 (2 X 10 cel ls/200 1/wel l ) と irradiated APC (wi ld type C57B6 マウスの脾臓を取り出し、 20グレイ放射線照射） を 1 : 5で混合して、 IRBPlO ^ g/mlを 加えて 48時間培養した。 上清を回収し、 Bi o- Pl ex™ (Bio-Rad Laborator ies) を使用 してサイト力イン ELISAを測定した。 測定したサイト力インは IFN—ア、 IL- 17、 MIP-1 ひ、 GM - CSF、 TNF- ο;である。
得られた結果を図 5に示す。 TH17細胞のみが分泌するとされている IL- 17のみが抗 マウス IL- 6受容体抗体投与マウスで有意な分泌低下を認めた。 その他の炎症性サイ トカインは抗マウス IL- 6受容体抗体投与により変化を認めなかった。

Claims

請求の範囲
1 . インターロイキン 6 (IL- 6) 受容体阻害剤を有効成分とする眼炎症疾患治療剤 および/または予防剤。
2 . IL-6受容体阻害剤がヒト IL-6受容体阻害剤である請求項 1に記載の眼炎症疾 患治療剤および Zまたは予防剤。
3 . IL-6受容体阻害剤が抗 IL-6受容体抗体である請求項 1に記載の眼炎症疾患治 療剤および Zまたは予防剤。
4. 抗 IL-6受容体抗体がキメラ抗体、 ヒト化抗体またはヒト抗体である請求項 3 に記載の眼炎症疾患治療剤および Zまたは予防剤。
5 . 眼炎症疾患が、 汎ぶどう膜炎、 前部ぶどう膜炎、 中間部ぶどう膜炎、 強膜炎、 角膜炎、 眼窩炎症、 視神経炎、 ドライアイ、 糖尿病網膜症、 増殖硝子体網膜症または 術後炎症のいずれかである請求項 1から 4のいずれかに記載の眼炎症疾患治療剤お よび _/または予防剤。
6 . IL-6受容体阻害剤を、眼炎症疾患を発症した対象または発症する可能性がある 対象に投与する工程を含む、対象において眼炎症疾患を治療および Zまたは予防する 方法。
7 . 眼炎症疾患治療剤および/"または予防剤の製造のためのィン夕一ロイキン 6 (IL-6) 受容体阻害剤の使用。
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