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WO1997029129A1 - Anticorps specifiques des complexes matures formes par les glycoproteines e1 et e2 du virus de l'hepatite c - Google Patents

Anticorps specifiques des complexes matures formes par les glycoproteines e1 et e2 du virus de l'hepatite c Download PDF

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WO1997029129A1
WO1997029129A1 PCT/FR1997/000232 FR9700232W WO9729129A1 WO 1997029129 A1 WO1997029129 A1 WO 1997029129A1 FR 9700232 W FR9700232 W FR 9700232W WO 9729129 A1 WO9729129 A1 WO 9729129A1
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hcv
complexes
antibody
glycoproteins
antibodies
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PCT/FR1997/000232
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Jean Dubuisson
André PILLEZ
Original Assignee
Institut Pasteur De Lille
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    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the subject of the present invention is an antibody which specifically recognizes the mature complexes between the E1 and E2 glycoproteins of
  • HCV hepatitis C viruses
  • It also relates to a method for determining the presence of these complexes, as well as a method for isolating or purifying these complexes.
  • HCV hepatitis C virus
  • This polyprotein is then cleaved by viral or host proteinases, to produce at least ten separate products.
  • This polyprotein thus has the following sequence:
  • Cleavages in the structural region of the polyprotein are catalyzed by a signal peptidase from the host localized in the endoplasmic reticulum.
  • the cleavage at the NS2 / NS3 site is carried out by a proteinase coded by the HCV, which is included in the
  • HCV glycoproteins, E1 and E2 interact to form a
  • HCV glycoprotein complexes have recently been characterized by Dubuisson et al ((1994), Journal of Virology, Vol 68, n ⁇ 10, 6147-6160).
  • two forms of E1 E2 complexes are detected: on the one hand a heterodimer of E1 and E2 stabilized by non-covalent bonds, and on the other hand a fraction made up of heterogeneous aggregates linked by disulfide bridges , which in the majority of cases have an incorrect conformation.
  • the HCV glycoprotein complex present in the virion has not been characterized, due to the small quantities of HCV particles present in the tissues of the infected liver or in the blood, and the absence of a cellular system allowing multiplication. HCV.
  • the antibodies directed against the HCV glycoproteins currently available recognize epitopes independent of the conformation of the molecules, or mixtures of epitopes dependent and independent of the conformation. Therefore, it is not possible to distinguish the synthetic pathways leading to mature complexes; that is to say having a correct conformation, those leading to aggregates having incorrect conformations.
  • the present invention therefore relates to an antibody characterized in that it specifically binds to the complexes formed between the glycoproteins E1 and E2 of HCV which have a correct conformation, that is to say a conformation stabilized by non-covalent bonds
  • this antibody is a monoclonal antibody, produced by a line of hybridomas II is preferably the antibody H2 produced by the hybridoma clone deposited on February 9, 1996 with the National Collection of Cultures of Microorganisms the Institut Pasteur (CNCM) under n ° l-1673
  • CNCM National Collection of Cultures of Microorganisms the Institut Pasteur
  • the present invention also relates to a method for determining the presence of complexes formed between the glycoproteins E1 and E2 of HCV having a correct conformation, in a biological sample comprising the following steps
  • Such a method is particularly useful for determining the purity of a preparation intended for vaccination, in particular for determining the proportion of complexes having a correct conformation and likely to induce the protection of the host vis-à-vis HCV.
  • the present invention further relates to a process for the purification and / or isolation of complexes having a correct conformation comprising the following steps:
  • Such a method can for example be carried out by passing a biological sample over an affinity column to which an antibody according to the present invention is fixed.
  • E2 are retained on the column and the complexes E1 E2 are advantageously released by modification of the ionic strength of the buffer of the column.
  • kits containing in particular an antibody as described above.
  • the present invention further relates to preparations characterized in that they contain complexes having a correct conformation, stabilized by non-covalent bonds, in a substantially pure form, that is to say substantially free of aggregates. not having a correct conformation, in particular having disulphide bridges.
  • a preparation contains at least 80% of complexes having a correct conformation, preferably 90% and even more preferably 95% of these complexes.
  • Such preparations can be used as vaccines, or can enter into the composition of diagnostic kits, for example to determine the amount of anti-HCV antibody present in the serum or in the blood of an individual.
  • FIG. 1 illustrates the kinetics of precipitation of glycoproteins
  • FIG. 2 illustrates the association of HCV glycoproteins with calnexin.
  • HepG2 cells co-infected with vTF7-3 and vHCV1-1488 were lysed with 1% digitonin in TBS buffer then the lysate was immunoprecipitated with anti-HCV (A4 and H2) or anti-HCV antibodies.
  • calnexin The immunoprecipitates were revealed by Western blotting using anti-calnexin antibodies.
  • FIG. 3 illustrates the oxidation of the glycoprotein E1.
  • HepG2 co-infected with vTF7-3 and vHCV1 -1488 were labeled for five minutes and then a hunting experiment was carried out for 4 hours.
  • the E1 glycoprotein was immunoprecipitated with the A4 anti-E1 antibody or coprecipitated with the H2 anti-E2 antibody.
  • the immunoprecipitates were analyzed under non-reducing conditions on SDS-10% PAGE.
  • VTF7-3 alone was used as a control (M).
  • the sizes (in kilodaltons) of the molecular weight markers are shown on the right of the figure.
  • FIG. 4 illustrates the sensitivity of HCV glycoproteins to treatment with V8 protease.
  • HepG2 cells co-infected with vTF7-3 and vHCV1 -1488 were labeled for five minutes and then a hunting experiment was carried out for four hours.
  • Cell lysates were then treated with different concentrations of V8 protease for five minutes at 37 ° C and cooled in ice. After immunoprecipitation with monoclonal antibodies A4 or H2, the samples were separated on an SDS-10% PAGE gel.
  • FIG. 5 illustrates the kinetics of shaping E2 and assembling the complex.
  • vTF7-3 and vHCV1 -1488 were labeled for five minutes and a hunting experiment was carried out during the times indicated (in hours). After immunoprecipitation, the samples were separated on SDS-10% PAGE and analyzed using the Posphorlmager. vTF7-3 alone was used as a control.
  • FIG. 6 relates to the characterization of the oligomers.
  • HepG2 cells co-infected with vTF7-3 and vHCV1 -1488 were labeled for five minutes and then a hunting experiment was carried out for four hours.
  • the cells were lysed using buffer containing NP-40 and sedimented through sucrose gradients (5-20%).
  • Immunoprecipitations with antibodies A4 or H2 were performed on each fraction and the samples were separated on SDS-10% PAGE. Molecular mass markers have been sedimented in parallel sucrose gradients and are indicated at the top of the figure.
  • FIG. 7 illustrates the sensitivity of the HCV glycoproteins to treatment with endo H.
  • HepG2 cells co-infected with vTF7-3 and vHCVI -1488 (vHCV) or vTF7-3 alone (M) were labeled for five minutes, then a hunting experiment was carried out during the times indicated (in hours).
  • Cell iysates were immunoprecipitated with the antibody H2 and then treated with endo H.
  • the samples were separated on SDS-13% PAGE. Deglycosylated proteins are indicated with an asterisk.
  • the migrations of molecular weight markers are indicated on the right of the figure.
  • Figure 8 illustrates the co-location of HCV glycoproteins
  • the plasmids for the expression of DNA segments complementary to the H strain of HCV were provided by CM. Rice. They were built as follows. PTM3 / HCV1 -745 (C-E1 -E2) was assembled by ligation of three fragments, one derived from pTM3 / HCV1 C 966 (Ncol-Stul); and two fragments derived from pTM3 / HCV364-1207.A / 746X (Ncol-Hindlll, Ascl- Stul). Before ligation, the Hind III site was filled in with T4 DNA polymerase.
  • PTM3 / HCV1-809 (C-E1-E2-p7) was constructed in several stages using the PCR technique up to the TAA and TAG termination codons in tandem position, immediately following the C-terminus of p7 (residue 809). The region amplified by PCR was verified by sequence analysis.
  • PSINre ⁇ 5 / HCV171-383 (E1) which contains an N-terminal signal sequence (residues 171 -191) preceding E1 (residues 192-383), was constructed by ligating the appropriate fragments of pSINrep5 / HCVsigE1-myc (Xhol-Sstl) and pSINrep ⁇ (Xbal-Sstl); (Bredenbeek et al .; (1993) J. Virol. 67, 6439-6446).
  • pSINrep5 / HCV370-745 (E2) was assembled by ligation of appropriate fragments of pTM3 / HCV364-1207.A / 746.X (Ascl-Hindlll) and pSINrep5 / HCV370-809 (Ascl-Stul). Before ligation, the HindIII site was filled in with T4 DNA polymerase.
  • CV-1 ATCC CCL70
  • HepG2 ATCC HB-8065
  • BHK-21 ATCC CCL10
  • ATCC CCL10 American Type Culture Collection
  • CV-1 and HepG2 cells were cultured in modified Dulbecco essential medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS).
  • DMEM modified Dulbecco essential medium
  • FBS fetal bovine serum
  • BHK-21 monolayer cells were cultured in BHK medium supplemented with 5% FBS and 10% tryptose phosphate medium.
  • vTF7-3 Stocks of vTF7-3, a recombinant vaccinia virus expressing T7 DNA-dependent RNA polymerase (Fuerst et al., (1986) Proc. NatI. Acad. Sci. USA, 83, 8122-8126), and vaccinia-HCV recombinants (vHCV1- 746; vHCVI-809, vHCV1-1488; vHCV1-3011) which contain sequences of the H strain of HCV (Grakoui et al. (1993) J. Virol. 67, 1385-1395) ; Lin et al., (1994) J.
  • Virol., 68, 5063-5073 were cultured on monolayers of partially purified CV-1 cells (Hruby et al., (1979) J. Virol., 29, 705-715), and the titers of infectious particles were determined by titrations in lysis plaques, on CV-1 cells.
  • HepG2 cells co-infected with vTF7-3 and vHCVI-1488 were lysed with 0.5% NP-40 in TBS (pH 7.4).
  • the HCV glycoprotein complexes were sedimented through a sucrose gradient as described below.
  • HCV glycoprotein complexes Fractions containing E1E2 heterodimers (Dubuisson et al. (1994) J. Virol., 68, 6147-6160) were pooled and the HCV glycoprotein complexes were purified by immunoaffinity on protein A-Sepharose beads (Pharmacia- LKB) carrying the anti-E1 monoclonal antibody A4. The HCV glycoprotein complexes linked to the immunoreactive beads were injected into BALB / c mice in order to produce hybridomas secreting antibodies specific for HCV glycoproteins, as described by Harlow and Lane ((1988) Antibodies: a laboratory manual. Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.).
  • the screening was carried out on 96-well plates containing HepG2 cells co-infected with vTF7-3 and vHCV-1-1488, fixed with paraformaldehyde and permeabilized with Triton X-100 as described by Dubuisson et al. ((1994) J. Virol., 68, 6147-6160).
  • Stocks of concentrated monoclonal antibodies were produced in vitro using MiniPerm equipment (Heraeus) and following the manufacturer's recommendations.
  • the AF8 anti-cal nexin monoclonal antibody was kindly provided by Mr. B. Brenner. It is described by Hochstenbach et al., (1992) Proc. National Acad. Sci. USA, 89, 4734-4738).
  • HepG2 cells co-infected with vaccinia-HCV recombinants were fixed fifteen hours after infection with picric acid and formaldehyde, coated in Tissue Tek (Miles Laboratories), frozen in liquid nitrogen and cut in a cryostat as described by Poulez et al., ((1994) Neuroscience, 58, 207-215). Sections 2 to 3 ⁇ m thick were then revealed by immunofluorescence. Simultaneous double labeling was carried out by incubating the sections overnight at 4 ° C.
  • a monoclonal antibody which selectively recognizes the E1 E2 complexes correctly formed and assembled has therefore been isolated and characterized.
  • E1 and E2 heterodimers were purified by sedimentation through a sucrose gradient to remove most of the aggregates and injected into BALB / c mice to produce monoclonal antibodies.
  • H2 monoclonal antibody
  • FIG. 1, Dubuisson et al., (1994), previously cited HCV glycoproteins precipitated by the monoclonal antibody H2 are not detected until 45 minutes after the start of hunting, and their intensity increases during hunting. This absence of detection during the first 45 minutes of the proteins precipitated by the antibody H2 suggests that the formation of the epitope recognized by this antibody depends on the conformation of E1 and / or E2.
  • the motif obtained with the H2 antibody is identical under non-reducing or reducing conditions.
  • the complexes linked by disulfide bridge, and / or the aggregates were detected in the upper part of the gel obtained with the antibody A4.
  • Separate expression of the HCV glycoproteins has shown that the H2 antibody recognizes E2 or the precursor of E2, called E2-p7, but not E1.
  • the monoclonal antibody H2 does not recognize denatured E2, as shown by analyzes carried out by Western type transfer.
  • HCV glycoprotein complexes precipitated by the monoclonal antibody H2. It has been shown previously that the HCV glycoproteins associate very quickly with calnexin and then dissociate slowly (Dubuisson et al., (1996) previously cited).
  • Calnexin is a protein called "chaperone" of the lectin type present in the endoplasmic reticulum, which transiently associates with neosynthesized polypeptides. It also combines with conformation intermediates of secreted glycoproteins, during their maturation, until they present a correct conformation (Bergeron et al. (1994) Trends Biochem. Sci., 19, 124-129); (Hammond and Helenius, (1995) Curr. Opin. Cell Biol., 7, 523-529). As shown in Figure 2, the H2 antibody does not co-precipitate calnexin with the HCV glycoproteins which suggests that they have been dissociated from calnexin and have a correct conformation.
  • the H2 antibody selectively recognizes the glycoprotein complexes which are dissociated from calnexin and resistant to protease action, properties which are characteristic of glycoproteic oligomers having a correct conformation and correctly assembled.
  • H2 antibody Using the H2 antibody, the kinetics of the formation of HCV glycoprotein oligomers was studied. As shown in Figure 5, the level of H2 antibody reacting with E2 becomes detectable after one hour and shows an optimum after 4 hours of hunting.
  • the formation and the size distribution of the oligomers recognized by H2 were studied by carrying out hunting experiments followed by a separation of the complexes, dissolved in a nonionic detergent, by sedimentation in sucrose gradients.
  • the proteins E1 and E2 precipitated by the antibody H2 sediment in the gradient between molecular weights between 68 KDa and 158 KDa ( Figure 6) which could indicate that heterodimeric complexes are formed, as suggested by (Dubuisson et al. ( 1994) previously cited). No change in the sucrose gradient sedimentation of this complex is observed after different hunting durations (1, 2 and 4 hours).
  • the distribution of the E1 E2 complexes reacting with H2 is narrow, compared to the wide distribution observed for the complexes precipitated by the antibody A4.
  • Immunolabelling experiments indicate that mature intracellular complexes are present at the same locations as protein disulfide isomerase (PDI), a protein that is located in the endoplasmic reticulum ( Figure 8).
  • PDI protein disulfide isomerase

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Abstract

Anticorps caractérisé en ce qu'il se fixe spécifiquement sur les complexes matures formés entre les glycoprotéines E1 et E2 du VHC qui présentent une conformation stabilisée par des liaisons non-covalentes. Cet anticorps peut être utilisé pour déterminer la présence de complexes E1E2, ou pour les purifier.

Description

ANTICORPS SPECIFIQUES DES COMPLEXES MATURES FORMES PAR LES GLYCOPROTEINES El ET E2 DU VIRUS DE L' HEPATITE C
La présente invention a pour objet un anticorps reconnaissant spécifiquement les complexes matures entre les glycoprotéines E1 et E2 du
10 virus de l'hépatite C (VHC) présentant une conformation stabilisée par des liaisons non covalentes.
Elle est en outre relative à un procédé de détermination de la présence de ces complexes, ainsi qu'un procédé d'isolement ou de purification de ces complexes
15 Le virus de l'hépatite C (VHC) est le principal agent responsable des hépatites non-A, non-B. Le VHC qui appartient à la famille des Flavivindae, est un virus enveloppé présentant un génome à ARN simple brin de polarité positive d'environ 9.500 nucléotides. Son génome contient une région non codante hautement conservée à l'extrémité 5', suivie d'un long cadre ouvert
20 de lecture de 9.030 à 9.099 nucléotides qui est traduit en une seule polyprotéme de 3.010 à 3.033 acides aminés
Cette polyprotéine est ensuite clivée par des protéinases virales ou de l'hôte, afin de produire au moins dix produits distincts. Cette polyprotéine présente ainsi la séquence suivante:
25 NH2-C-E1 -E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH.
Les clivages dans ia région structurale de la polyprotéine (C/E1 , E1/E2, et E2/p7 et p7/NS2) sont catalysés par une signal-peptidase de l'hôte localisée dans le réticulum endoplasmique. Le clivage au site NS2/NS3 est effectué par une protéinase codée par le VHC, qui est incluse dans les
30 régions NS2 et la serine protéinase NS3. Les clivages aux sites C/E1 , E1/E2 et NS2/NS3 sont cotraductionnels, tandis que ceux aux sites E2/P7 et p7/NS2 ont lieu après la traduction et donnent naissance à deux précurseurs pour E2. E2-NS2 et E2-p7.
Les glycoprotéines du VHC, E1 et E2, interagissent afin de former un
35 complexe que l'on suppose être une sous-unité fonctionnelle des virions VHC.
Les complexes de glycoprotéines du VHC ont été récemment caractérisés par Dubuisson et al ((1994), Journal of Virology, Vol 68, nα10, 6147-6160). En présence de détergents non ioniques, deux formes de complexes E1 E2 sont détectées: d'une part un hétérodimère de E1 et E2 stabilisé par des liaisons non covalentes, et d'autre part une fraction constituée d'agrégats hétérogènes liés par des ponts disulfures, qui dans la majorité des cas présentent une conformation incorrecte.
De plus, les cinétiques d'association entre E1 et E2 ont été étudiées et il s'avère que la formation de complexes E1E2 stables est lente et assez inefficace.
Il a enfin été montré que E1 et E2 s'associent de manière rapide avec la calnexine, mais se dissocient lentement (Dubuisson et Rice, 1996, Journal of Virology, 778-786).
Le complexe glycoprotéique du VHC présent dans le virion n'a pas été caractérisé, en raison des faibles quantités de particules de VHC présentes dans les tissus du foie infecté ou dans le sang, et de l'absence d'un système cellulaire permettant la multiplication du VHC.
Les anticorps dirigés contre les glycoprotéines du VHC actuellement disponibles reconnaissent des épitopes indépendants de la conformation des molécules, ou des mélanges d'épitopes dépendants et indépendants de la conformation. De ce fait, il n'est pas possible de distinguer les voies de synthèse conduisant à des complexes matures; c'est-à-dire présentant une conformation correcte, de celles conduisant à des agrégats ayant des conformations incorrectes.
Il est pourtant indispensable de pouvoir distinguer les complexes matures, c'est-à-dire présentant une conformation correcte, des agrégats dont la conformation est incorrecte. En particulier, une telle distinction est essentielle pour la fabrication de vaccins contenant E1 et E2 pour immuniser contre le VHC.
La distinction de ces deux formes est aussi indispensable dans un cadre diagnostique, tant pour le dosage des complexes, dans le cas par exemple d'une infection par un virus, que pour la détection d'anticorps, par exemple pour déterminer le taux d'anticorps anti-VHC d'un individu.
Enfin, la distinction des complexes et des agrégats permettrait d'améliorer les moyens d'étude de l'assemblage du VHC. 7/29129 PC17FR97/00232
Le demandeur s'est donc attaché à trouver un moyen permettant de distinguer, de manière efficace et dénuée d'ambiguïté, les complexes présentant une conformation correcte et les agrégats présentant une conformation incorrecte II a ainsi trouvé qu'il était possible de distinguer ces deux formes moléculaires à l'aide d'anticorps reconnaissant de manière spécifique des épitopes liés à l'état de conformation des protéines constituant ces complexes
Il a aussi montré que les formes présentant une conformation incorrecte prédominaient par rapport aux formes correctement conformées
La présente invention est donc relative à un anticorps caractérisé en ce qu'il se fixe de manière spécifique sur les complexes formés entre les glycoprotéines E1 et E2 du VHC qui présentent une conformation correcte, c'est-à-dire une conformation stabilisée par des liaisons non-covalentes De manière avantageuse cet anticorps est un anticorps monoclonal, produit par une lignée d'hybπdomes II est préférentiellement l'anticorps H2 produit par le clone d'hybndome déposé le 9 Février 1996 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur (CNCM) sous le n°l-1673 Ces anticorps peuvent être avantageusement utilisés soit pour la détermination de la présence de ces complexes dans des préparations biologiques, soit pour la purification de ces complexes à partir de telles préparations
Ainsi, la présente invention est encore relative à un procédé de détermination de la présence de complexes formés entre les glycoprotéines E1 et E2 du VHC présentant une conformation correcte, dans un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes
- mise en présence dudit échantillon et d'un anticorps tel que défini ci-dessus, et en particulier de l'anticorps produit par ia souche d'hybndome n°l-1673, et
- détermination de ia présence d'immunocomplexes formes entre les glycoprotéines et les anticorps.
Un tel procédé est particulièrement utile pour déterminer la pureté d'une préparation destinée à la vaccination, en particulier afin de déterminer la proportion de complexes présentant une conformation correcte et susceptibles d'induire la protection de l'hôte vis-à-vis du VHC.
La présente invention a en outre pour objet un procédé de purification et/ou d'isolement de complexes présentant une conformation correcte comprenant les étapes suivantes:
- mise en contact d'échantillons biologiques contenant ces complexes avec un anticorps tel que décrit ci-dessus, et en particulier avec un anticorps produit par le clone d'hybridome déposé sous le n°l-1673.
- isolement du complexe immunologique formé. Un tel procédé peut par exemple être mis en oeuvre par passage d'un échantillon biologique sur une colonne d'affinité sur laquelle est fixé un anticorps selon la présente invention. Les complexes immunologiques formés entre l'anticorps et les complexes E<| E2 sont retenus sur la colonne et les complexes E1 E2 sont avantageusement relargués par modification de la force ionique du tampon de la colonne.
D'autres objets de la présente invention sont des trousses de diagnostic (ou kits) contenant en particulier un anticorps tel que décrit ci- dessus.
La présente invention est de plus relative à des préparations caractérisées en ce qu'elles contiennent des complexes présentant une conformation correcte, stabilisée par des liaisons non-covalentes, sous une forme substantiellement pure, c'est-à-dire substantiellement dépourvue d'agrégats ne présentant pas une conformation correcte, en particulier présentant des ponts disulfures. Avantageusement, une telle préparation contient au minimum 80% de complexes présentant une conformation correcte, préférentiellement 90% et encore plus préférentiellement 95% de ces complexes.
De telles préparations peuvent être utilisées comme vaccins, ou encore peuvent entrer dans la composition de trousses de diagnostic, par exemple afin de déterminer la quantité d'anticorps anti-VHC présente dans le sérum ou dans le sang d'un individu.
Pour la mise en oeuvre de la présente invention, l'homme du métier pourra se référer aux ouvrages suivants : Sambroock et al., ((1989), Molecular cloning: a laboratory manuel. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.); et Harlow et Lane ((1988), Antibodies: a laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. ) ou l'une de leurs récentes rééditions
La présente invention est illustrée, sans pour autant être limitée, par les exemples suivants, dans lesquels: La figure 1 illustre les cinétiques de précipitation des glycoprotéines
E1 et E2 par les anticorps monoclonaux A4 (figure 1 a) ou H2 (figure 1 b). Des cellules HepG2 co-infectées avec vTF7-3 et HCW1 -1488 ont été marquées durant cinq minutes et une expérience de chasse a été ensuite effectuée durant le temps indiqué (en minutes). Après immunoprécipitation les échantillons ont été séparés sur gel SDS-10%PAGE dans des conditions réductrices ou non réductrices. Le vTF7-3 seul a été utilisé comme témoin (M). Des protéines spécifiques du VHC sont indiquées à gauche. Les tailles en kilodaltons des marqueurs de poids moléculaire sont indiquées à droite.
La figure 2 illustre l'association des glycoprotéines du VHC avec la calnexine. Dans cette figure , des cellules HepG2 co-infectées avec vTF7-3 et vHCV1-1488 ont été lysées par 1 % de digitonine dans du tampon TBS puis le lysat a été immunoprécipité avec des anticorps anti-VHC (A4 et H2) ou anti- calnéxine. Les immunoprécipités ont été révélés par transfert de type Western à t'aide d'anticorps anti-calnéxine. La figure 3 illustre l'oxydation de la glycoprotéine E1. Des cellules
HepG2 co-infectées avec vTF7-3 et vHCV1 -1488 ont été marquées durant cinq minutes puis une expérience de chasse a été effectuée durant 4 heures. La glycoprotéine E1 a été immunoprécipitée avec l'anticorps A4 anti-E1 ou coprécipitée avec l'anticorps H2 anti-E2. Les immunoprécipités ont été analysés dans des conditions non réductrices sur SDS-10%PAGE. Le vTF7-3 seul a été utilisé comme témoin (M). Les tailles ( en kilodaltons) des marqueurs de poids moléculaire sont indiquées sur la droite de la figure.
La figure 4 illustre la sensibilité de glycoprotéines du VHC au traitement par la protéase V8. Des cellules HepG2 co-infectées avec vTF7-3 et vHCV1 -1488 ont été marquées durant cinq minutes puis une expérience de chasse a été effectuée durant quatre heures. Des lysats cellulaires ont été alors traités avec différentes concentrations de protéase V8 durant cinq minutes à 37°C et refroidis dans de la glace. Après immunoprécipitation avec les anticorps monoclonaux A4 ou H2, les échantillons ont été séparés sur un gel SDS-10%PAGE. La figure 5 illustre la cinétique de mise en conformation de E2 et d'assemblage du complexe. Les cellules HepG2 co-infectées avec vTF7-3 et vHCV1 -1488 (vHCV) ont été marquées durant cinq minutes et une expérience de chasse a été effectuée durant les temps indiqués ( en heures). Après immunoprécipitation, les échantillons ont été séparés sur SDS-10%PAGE et analysés à l'aide du Posphorlmager. vTF7-3 seul a été utilisé comme témoin.
La figure 6 est relative à la caractérisation des oligomères. Des cellules HepG2 co-infectées avec vTF7-3 et vHCV1 -1488 ont été marquées durant cinq minutes puis une expérience de chasse a été effectuée durant quatre heures. Les cellules ont été lysées à l'aide de tampon contenant du NP-40 et sédimentées à travers des gradients de saccharose (5-20%). Les immunoprécipitations avec les anticorps A4 ou H2 ont été effectuées sur chaque fraction et les échantillons ont été séparés sur SDS-10%PAGE. Des marqueurs de masse moléculaire ont été sédimentés dans des gradients de saccharose parallèles et sont indiqués en haut de la figure.
La figure 7 illustre la sensibilité des glycoprotéines du VHC au traitement par l'endo H. Des cellules HepG2 co-infectées avec vTF7-3 et vHCVI -1488 (vHCV) ou vTF7-3 seul (M) ont été marquées durant cinq minutes, puis une expérience de chasse a été effectuée durant les temps indiqués (en heures). Des iysats cellulaires ont été immunoprécipités avec l'anticorps H2 puis traités par de l'endo H. Les échantillons ont été séparés sur SDS-13%PAGE. Des protéines déglycosylées sont indiquées à l'aide d'astérisque. Les migrations de marqueurs de poids moléculaire sont indiquées sur la droite de la figure. La figure 8 illustre la colocalisation de glycoprotéines du VHC
(Fig.δB) et de PDI (Fig. 8A), analysée par immunofluorescence respectivement à l'aide d'anticorps anti-PD1 et de l'anticorps H2. EXEMPLES: Matériels et méthodes Plasmides:
Les plasmides pour l'expression de segments d'ADN complémentaire de la souche H du VHC ont été fournis par CM. Rice. Ils ont été construits comme suit. Le pTM3/HCV1 -745(C-E1 -E2) a été assemblé par ligature de trois fragments, l'un dérivé de pTM3/HCV1 C 966 (Ncol-Stul); et deux fragments dérivés de pTM3/HCV364-1207.A/746X (Ncol-Hindlll, Ascl- Stul). Avant la ligation, le site Hind III a été comblé avec l'ADN polymerase de T4. Le pTM3/HCV1-809 (C-E1-E2-p7) a été construit en plusieurs étapes en utilisant la technique de PCR jusqu'aux codons de terminaison TAA et TAG en positon tandem, suivant immédiatement l'extrémité C-terminale de p7 (résidu 809). La région amplifiée par PCR a été vérifiée par analyse de séquence.
PSINreρ5/HCV171-383(E1 ) qui contient une séquence signal N- terminale (résidus 171 -191 ) précédent E1 (résidus 192-383), a été construit en ligaturant les fragments appropriés de pSINrep5/HCVsigE1-myc (Xhol- Sstl) et pSINrepδ (Xbal-Sstl); (Bredenbeek et al.; (1993) J. Virol. 67, 6439- 6446). pSINrep5/HCV370-745 (E2) a été assemblé par ligature des fragments appropriés de pTM3/HCV364-1207.A/746.X (Ascl-Hindlll) et pSINrep5/HCV370-809 (Ascl-Stul). Avant la ligature, le site Hindlll a été rempli à l'aide de l'ADN polymerase T4. Cellules et virus:
Les lignées cellulaires CV-1 (ATCC CCL70), HepG2 (ATCC HB- 8065) et BHK-21 (ATCC CCL10) ont été obtenues à l'American Type Culture Collection (ATCC). Les cellules CV-1 et HepG2 ont été mises en culture dans du milieu essentiel de Dulbecco modifié (DMEM) complémenté avec du sérum de foetus bovin à 10% (FBS). Les cellules monocouches BHK-21 ont été mises en culture dans du milieu BHK complémenté avec 5% de FBS et 10% de milieu tryptose phosphate.
Des stocks de vTF7-3, un virus de la vaccine recombinant exprimant l'ARN polymerase ADN-dépendante de T7 (Fuerst et al., (1986) Proc. NatI. Acad. Sci. USA, 83, 8122-8126), et des recombinants vaccine-VHC (vHCV1- 746; vHCVI-809, vHCV1-1488; vHCV1-3011 ) qui contiennent des séquences de la souche H du VHC (Grakoui et al. (1993)J. Virol. 67, 1385-1395); Lin et al., (1994) J. Virol., 68, 5063-5073 ) ont été mis en culture sur des monocouches de cellules CV-1 , partiellement purifiés, (Hruby et al., (1979)J. Virol., 29, 705-715), et les titres en particules infectieuses ont été déterminés par des titrages en plages de lyse, sur cellules CV-1.
Des stocks de virus recombinant Sindbis exprimant les glycoprotéines E1 (SINrep5/HCV-H171-383) ou E2 (SINreρ5/HCV-H370-746) avec leurs séquences signal respectives ont été générés dans des cellules 7/29129 PC17FR97/00232
BHK-21 comme décrit précédemment par Bredenbeek et al. ((1993) J. Virol.
67, 6439-6446 ).
Anticorps.
Des anticorps monoclonaux A4 anti-E1 et A11 anti-E2 ont été précédemment décrits par Dubuisson et al.( (1994) J. Virol. 68, 6147-6160 .
Pour produire d'autres anticorps monoclonaux anti-glycoprotéine du VHC, des cellules HepG2 co-infectées avec vTF7-3 et vHCVI-1488 ont été lysées avec 0,5% de NP-40 dans du TBS (pH 7,4).
Les complexes glycoproteiques du VHC ont été sédimentés à travers un gradient de sucrose comme décrit ci-après.
Des fractions contenant des hétérodimères E1E2 (Dubuisson et al.(1994) J. Virol., 68, 6147-6160) ont été réunies et les complexes glycoproteiques du VHC ont été purifiés par immunoaffinité sur des billes de protéine A-Sépharose (Pharmacia-LKB) portant l'anticorps monoclonal A4 anti-E1. Les complexes glycoproteiques du VHC liés aux billes immunoréactives ont été injectés à des souris BALB/c afin de produire des hybridomes sécrétant des anticorps spécifiques des glycoprotéines du VHC, comme décrit par Harlow et Lane ((1988) Antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.). Le criblage a été effectué sur des plaques de 96 puits contenant des cellules HepG2 co- infectées avec vTF7-3 et vHCV-1-1488, fixées avec du paraformaldéhyde et perméabilisées avec du Triton X-100 comme décrit par Dubuisson et al. ((1994) J. Virol., 68, 6147-6160). Des stocks d'anticorps monoclonaux concentrés ont été produits in vitro en utilisant un appareillage MiniPerm (Heraeus) et en suivant les recommandations du fabricant.
L'anticorps monoclonal AF8 anti-cal nexine a été fourni gracieusement par Mr. B. Brenner. Il est décrit par Hochstenbach et al., (1992) Proc. National Acad. Sci. USA, 89, 4734-4738).
Un antiserum de lapin à rencontre de la protéine disulfure isomérase (PDI) a été fourni par StressGen.
Marquage métabolique et immunoprécipitation.
Des cellules ont été infectées et leurs protéines ont été marquées radioactivement par incorporation métabolique de (35 S) translabel (ICN), comme décrit précédemment par Dubuisson et al., ((1994) J. Virol. 68, 6147- 6160), (1996) J. Virol., 70, 778-786). Des cellules infectées et marquées ont été ensuite lysées avec 0,5% de NP-40 dans 10 mM de Tris-CI (pH 7,5), 150 mM NaCl, et 2 mM d'EDTA. 20 mM d'iodoacétamide ont été inclus dans le tampon de lyse dans les expériences de mise en évidence de la formation des ponts disulfures intramoléculaires. Les immunoprécipitations ont été effectuées comme décrites précédemment (Dubuisson et al. (1996), J. Virol., 70, 778-786 précédemment cité). Dans le cas d'expériences quantitatives, les gels ont été analysés en utilisant le Phosphorlmager commercialisé par Molecular Dynamics. Centrifuqation à travers un gradient de saccharose. Les Iysats de cellules infectées et marquées ont été déposés sur un gradient de 10 ml de saccharose 5-20% dans du TBS contenant 0, 1 % de NP- 40. Après ceπtrifugation à 4°C durant 24 heures, à 36.000 rpm dans un rotor Beckman SW41 , onze fractions ont été récoltées à partir du bas du gradient et analysées par immunoprécipitation comme décrit ci-dessus. Des marqueurs de masse moléculaire ( Combithek, protéine de calibration I; Boehringer-Mannheim) ont été centrifugés parallèlement dans un gradient de saccharose. Immuπomarquaqe.
Des cellules HepG2 co-infectées avec des recombinants vaccine- VHC ont été fixées quinze heures après l'infection avec de l'acide picrique et du formaldehyde, enrobées dans du Tissue Tek (Miles Laboratories), congelées dans de l'azote liquide et coupées dans un cryostat comme décrit par Pillez et al.,( (1994) Neuroscience, 58, 207-215). Des sections de 2 à 3 μm d'épaisseur ont été ensuite révélées par immunofluorescence. Un double marquage simultané a été effectué en incubant les coupes toute la nuit à 4°C avec de l'antisérum de lapin dirigé contre de la PDl (dilution 1/200) et contre l'anticorps monoclonal H2 (dilution 1/400) puis en les incubant à la température ambiante durant 1 heure avec des immunoglobulines d'âne anti- souris (FITC) et anti-lapin (TRITC) (dilution 1/100: Jackson Immunoreseach). Des coupes ont également été préparées pour la microscopie électronique, après révélation par une technique d'immunoperoxidase comme décrit par Pillez et al.(( 1994) Neuroscience, 58, 207-215). EXEMPLE 1 : Identification d'un anticorps monoclonal qui reconnaît sélectivement les glycoprotéines du VHC associées de manière non covalente. Des complexes entre E1 et E2 ont été récemment caractérisés (Dubuisson et al., (1994) précédemment cité). En présence de détergents non-ioniques, deux formes des complexes E1 E2 ont été détectées: d'une part un hétérodimère de E1 et E2 stabilisé par des liaisons non-covalentes et d'autre part des agrégats hétérogènes liés par des ponts disulfures qui représentent très probablement des complexes présentant une mauvaise conformation.
Un anticorps monoclonal qui reconnaît sélectivement les complexes E1 E2 correctement conformés et assemblés a donc été isolé et caractérisé. Des hétérodimères E1 et E2 ont été purifiés par sédimentation à travers un gradient de saccharose afin d'éliminer la plupart des agrégats et injectés à des souris BALB/c afin de produire des anticorps monoclonaux.
Il a été montré à l'aide d'expériences de chasse, qu'un anticorps monoclonal (H2), produit par une souche d'hybridome déposée auprès de la CNCM sous le n°l-1673, présente un motif d'immunoprecipitation diffèrent de ceux précédemment décrits pour d'autres anticorps monoclonaux (figure 1 , Dubuisson et al., (1994), précédemment cité). Les glycoprotéines du VHC précipitées par l'anticorps monoclonal H2 ne sont pas détectées avant 45 minutes après le début de la chasse, et leur intensité augmente durant la chasse. Cette absence de détection durant les premières 45 minutes des protéines précipitées par l'anticorps H2 suggère que la formation de l'épitope reconnu par cet anticorps dépend de la conformation de E1 et/ou E2.
Le motif obtenu avec l'anticorps H2 est identique dans des conditions non réductrices ou réductrices. Par contre, dans les conditions non réductrices, les complexes liés par pont disulfure, et/ou les agrégats ont été détectés dans la partie supérieure du gel obtenu avec l'anticorps A4. L'expression séparée des glycoprotéines du VHC a montré que l'anticorps H2 reconnaît E2 ou le précurseur de E2, appelé E2-p7, mais non E1. De plus, l'anticorps monoclonal H2 ne reconnaît pas E2 dénaturé, comme le montrent des analyses effectuées par transfert de type Western.
Ces résultats indiquent donc que les anticorps H2 reconnaissent un épitope présent sur E2 et précipitent de manière spécifique des glycoprotéines du VHC associées de manière non-covalente, qui forment un complexe natif. EXEMPLE 2:
Propriétés des complexes glycoproteiques du VHC précipités par l'anticorps monoclonal H2. II a été montré précédemment que les glycoprotéines du VHC s'associent très rapidement avec la calnexine puis se dissocient lentement (Dubuisson et al.,( 1996) précédemment cité).
La calnexine est une protéine dite "chaperon" du type lectine présente dans le réticulum endoplasmique, qui s'associe de manière transitoire avec des polypeptides néosynthétisés. Elle s'associe aussi avec des intermédiaires de conformation de glycoprotéines sécrétées, durant leur maturation, jusqu'à ce qu'elles présentent une conformation correcte (Bergeron et al. (1994) Trends Biochem. Sci., 19, 124-129); (Hammond et Helenius, (1995) Curr. Opin. Cell Biol., 7, 523-529). Comme le montre la figure 2, l'anticorps H2 ne co-précipite pas la calnexine avec les glycoprotéines du VHC ce qui suggère qu'elles ont été dissociées de la calnexine et présentent une conformation correcte. Il a été montré (Dubuisson et al., (1996) précédemment cité) que le repliement de E1 est lent, comme indiqué par l'apparition lente des ponts disulfures intramoleculaires. Dans des conditions non réductrices, l'anticorps A4 anti-E1 précédemment décrit précipite deux formes de E1 , qui correspondent aux formes réduites et oxydées. Seule la forme oxydée de E1 est immunoprécipitée par H2 (figure 3). La mobilité de cette dernière n'a pas été modifiée par un traitement in vivo par le DTT, ce qui indique que la co- précipitation de E1 par H2 se fait alors que la conformation est correcte .
On sait que l'acquisition de la résistance à des protéases est en corrélation avec l'état de repliement d'une protéine. La sensibilité des glycoprotéines de VHC à des digestions protéasiques a donc été testée. Comme le montre la figure 4, les glycoprotéines du VHC précipitées par l'anticorps H2 ne sont pas sensibles à l'action de la protéase V8, dans les conditions expérimentales indiquées pour la figure 8, tandis que celles précipitées par l'anticorps A4 sont partiellement dégradées. A une concentration de 100 μg/ml, seule une faible fraction (environ 5%) des glycoprotéines est résistante et peut être précipitée par l'anticorps A4. La quantité de ces formes résistantes est à peu près identique à la quantité précipitée par l'anticorps H2, avant ou après la digestion protéasique.
Ces résultats indiquent que la majorité des glycoprotéines du VHC exprimées dans les vaccins sont dans une mauvaise conformation et sont sensibles à la protéase même après 4 heures de chasse.
L'anticorps H2 reconnaît de manière sélective les complexes glycoprotéines qui sont dissociés de la calnexine et résistants à l'action protéasique, propriétés qui sont caractéristiques d'oligomères glycoproteiques présentant une conformation correcte et correctement assemblés. EXEMPLE 3:
Cinétique d'assemblage et comportement oligomérigue des complexes glycoproteiques du VHC .
En utilisant l'anticorps H2, la cinétique de formation des oligomères des glycoprotéines du VHC a été étudiée. Comme le montre la figure 5, le niveau d'anticorps H2 réagissant avec E2 devient détectable après une heure et montre un optimum après 4 heures de chasse.
Les niveaux de protéine E1 coprécipitée sont parallèles à ceux de E2 et le rapport E1/E2 est similaire durant la totalité de l'expérience. Ces résultats suggèrent que l'apparition de la réactivité à H2 coïncide avec la formation tardive d'oligomères E1 E2 correctement assemblés et présentant une conformation correcte. Des résultats similaires ont été obtenus en utilisant des recombinants de la vaccine exprimant la polyprotéine du VHC entière ou des formes tronquées se terminant à l'extrémité C-terminale de E2 ou de p7, ce qui indique que les séquences en aval de E2 n'influencent pas de manière marquante l'assemblage des oligomères glycoproteiques.
La formation et la distribution en taille des oligomères reconnus par H2 ont été étudiées en effectuant des expériences de chasse suivies par une séparation des complexes, solubilisés dans un détergent non-ionique, par sédimentation dans des gradients de saccharose. Les protéines E1 et E2 précipitées par l'anticorps H2 sédimentent dans le gradient entre des masses moléculaires comprises entre 68 KDa et 158 KDa (figure 6) ce qui pourrait indiquer que des complexes hétérodimères sont formés, comme suggéré par (Dubuisson et al. (1994) précédemment cité). Aucun changement dans la sédimentation en gradient de saccharose de ce complexe n'est observé après différentes durées de chasse (1 , 2 et 4 heures). La distribution des complexes E1 E2 réagissant avec H2 est étroite, comparée à la distribution large observée pour les complexes précipités par l'anticorps A4. Ceci reflète probablement une homogénéité plus importante parmi les complexes E1 E2 correctement assemblés et présentant une conformation correcte, par comparaison avec l'hétérogénéité en taille de ceux reconnus par l'anticorps A4, qui comprennent des complexes présentant une conformation incorrecte. EXEMPLE 4:
Localisation cellulaire des complexes E1 E2 réagissant avec l'anticorps H2
L'acquisition de ia résistance à l'endo-β-N-acétylglucosaminidase H (endo H) dans des expériences de chasse, est considérée comme un marqueur du transit intracellulaire des complexes E1 E2 réagissant avec l'anticorps H2.
Aucune résistance endo-H n'a été détectée (figure 7) même après 8 heures de chasse, ce qui suggère que ce complexe n'est pas transporté à travers l'appareil de Golgi. Des résultats similaires ont été obtenus en utilisant les constructions d'expression vaccine-VHC décrites ci-dessus. L'absence de reconnaissance de formes résistantes à l'endo-H n'est pas due au masquage de l'épitope reconnu par H2, puisque cet anticorps monoclonal peut précipiter une forme sécrétée de E2 qui a acquis des glycannes complexes, comme le montre la résistance à l'endo-H. E2-p7 , qui est facilement distingué de E2 seulement après déglycosylation (Grakoui et al. (1993); Lin et al., (1994)) est aussi précipité par l'anticorps H2 (figure 7). Ceci suggère que deux complexes matures existent: E1 E2 et E1 E2-p7.
Des expériences d'immunomarquage indiquent que les complexes matures intracellulaires sont présents aux mêmes localisations que la protéine disulfure isomérase (PDI), une protéine qui est située dans le réticulum endoplasmique (figure 8).
Des observations en microscopie électronique confirment la localisation dans le réticulum endoplasmique des glycoprotéines du VHC reconnues par l'anticorps H2. Aucun marquage de la surface cellulaire n'a été observé.
De plus, la sécrétion de glycoprotéines du VHC à partir de cellules HepG2 n'est pas détectée en utilisant l'anticorps H2 ou d'autres anticorps monoclonaux spécifiques des glycoprotéines. Ces résultats indiquent que les complexes E1 et E2 (et E1E2-p7) présentant une conformation correcte ainsi que ceux ne présentant pas une conformation correcte sont retenus dans le réticulum endoplasmique. Les complexes matures identifiés par l'anticorps H2 seraient donc des complexes de prébourgeonnement. Il est en effet suggéré que l'acquisition de l'enveloppe virale (bourgeonnement) a lieu au niveau du réticulum endoplasmique pour les Flaviviridae (Pettersson, 1991, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 170, 67-104).

Claims

REVENDICATIONS
1. Anticorps caractérisé en ce qu'il se fixe spécifiquement sur les complexes matures formés entre les glycoprotéines E1 et E2 du VHC qui présentant une conformation stabilisée par des liaisons non-covalentes.
2. Anticorps selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est monoclonal.
3. Anticorps selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisé en ce qu'il est produit par le clone d'hybridome déposé le 9 Février 1996 sous le N°l-1673 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur (CNCM).
4. Procédé de détermination de la présence de complexes formés entre les glycoprotéines E1 et E2 du VHC présentant une conformation stabilisée par liaison non covalente, dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes:
- mise en présence dudit échantillon et l'un des anticorps selon l'une des revendications 1 à 3, et
- détermination de la présence des immunocomplexes formés entre les glycoprotéines et les anticorps.
5. Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que ledit échantillon est une préparation destinée à la vaccination.
6. Procédé de purification et/ou d'isolement de complexes formés entre les glycoprotéines E1 et E2 du VHC, présentant une conformation stabilisée par liaison non covalente, à partir d'un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes:
- mise en contact dudit échantillon contenant ces complexes avec un anticorps selon l'une des revendications 1 à 3 et,
- isolement de l'immuno complexe formé.
7. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que les anticorps sont immobilisés sur une colonne d'affinité.
8. Préparation caractérisée en ce qu'elle contient des complexes formés entre les glycoprotéines E1 et E2 du VHC, présentant une conformation stabilisée par liaison non covalente, sous une forme substantiellement pure.
9. Préparation selon la revendication 8 caractérisée en ce qu'elle contient au minimum 80%, préférentiellement 90% et encore plus préférentiellement 95% de complexes présentant une conformation stabilisée par liaison covalente.
10. Trousse de diagnostic caractérisée en ce qu'elle comprend une préparation selon l'une des revendications 8 et 9.
11. Vaccin caractérisé en ce qu'il comprend une préparation selon l'une des revendications 8 et 9.
12. Trousse de diagnostic caractérisée en ce qu'elle comprend un anticorps selon l'une des revendications 1 à 3.
13. Utilisation de la préparation selon l'une des revendications 8 et 9 pour la fabrication d'un vaccin pour l'immunisation envers le VHC.
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