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WO1996035430A1 - TRAITEMENT ET PREVENTION DE MALADIES ASSOCIEES A NF-λB - Google Patents

TRAITEMENT ET PREVENTION DE MALADIES ASSOCIEES A NF-λB Download PDF

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WO1996035430A1
WO1996035430A1 PCT/JP1996/001234 JP9601234W WO9635430A1 WO 1996035430 A1 WO1996035430 A1 WO 1996035430A1 JP 9601234 W JP9601234 W JP 9601234W WO 9635430 A1 WO9635430 A1 WO 9635430A1
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WO
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disease
treatment
prevention
caused
ischemic
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Application number
PCT/JP1996/001234
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English (en)
French (fr)
Inventor
Ryuichi Morishita
Toshio Ogiwara
Toshiko Sugimoto
Kazuhiro Maeda
Ikuo Kawamura
Toshiyuki Chiba
Original Assignee
Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd.
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Publication date
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    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates

Definitions

  • the present invention relates to the prevention or treatment of various diseases caused by NF- ⁇ B, which is known as one of transcription factors such as cytokine ⁇ adhesion factor.
  • NF- ⁇ B which is known as one of transcription factors such as cytokine ⁇ adhesion factor.
  • NF-? K B Deco I NF containing the decoy - for the treatment of diseases caused by kappa beta and prevention agents and therapy and prevention.
  • NF- ⁇ transcriptional factors
  • NF- ⁇ transcriptional factor
  • IL- ⁇ transcriptional factor
  • IL- ⁇ consists of 65 and 50 heterodimers.
  • the inhibitor I ⁇ is present in the cytoplasm in a bound form, and nuclear translocation is blocked.
  • I ⁇ is phosphorylated and degraded, so that NF- ⁇ is activated and translocated into the nucleus.
  • NF- ⁇ promotes transcription of downstream genes by binding to the NF- ⁇ binding site on the chromosome.
  • Genes controlled by NF-1 include, for example, cytokines such as IL-11, IL-16 and IL-18, and adhesion factors such as VCAM-1 and ICAM-1. Disclosure of the invention
  • NF-? Diseases caused by kappa B i.e., Ri diseases der due to unwanted activation of genes that control the transcription regulatory factor NF-? Kappa beta, such Examples of such diseases include ischemic diseases, inflammatory diseases, autoimmune diseases, cancer metastasis, invasion, and cachexia.
  • Ischemic diseases include ischemic organ diseases (eg, myocardial infarction, acute heart failure, chronic heart failure, etc., ischemic brain diseases such as cerebral infarction, and ischemic lung diseases such as pulmonary infarction), organ transplantation ⁇ Poor prognosis after organ surgery (eg, worse prognosis for heart transplant, heart surgery, kidney transplant, kidney surgery, liver transplant, liver surgery, bone marrow transplant, skin transplant, corneal transplant, lung transplant, etc.), reperfusion injury, Restenosis after PTC is included.
  • Inflammatory diseases include various inflammations such as nephritis, hepatitis, arthritis, acute renal failure, chronic renal failure, arteriosclerosis and the like.
  • Autoimmune diseases include rheumatism, multiple sclerosis, Hashimoto's thyroiditis and the like.
  • pharmaceuticals containing the NF- / cB decoy as a main component obtained by the present invention include reperfusion injury of ischemic disease, worsening of prognosis after organ transplantation or organ surgery, restenosis after PTCA, and cancer. It is suitable for the treatment and prevention of cachexia such as transposition 'infiltration and weight loss associated with the occurrence of cancer.
  • the decoys are NF-? Kappa B that used in the present invention include may be a compound that specifically antagonizes the nucleic acid binding site of present on the chromosome NF-? Kappa beta, for example, nucleic acids and analogs thereof.
  • Preferred examples of NF- ⁇ decoys include oligonucleotides containing the nucleic acid sequence GGGATT TCCC (sequence number 5 in SEQ ID NO: 1 and sequences 8 to 17 from the end) or a complement thereof, a mutant thereof, or Compounds containing these in the molecule are mentioned.
  • the oligonucleotide may be DNA or RNA, and may include a modified nucleic acid or / and a pseudonucleic acid in the oligonucleotide. Further, these oligonucleotides, mutants thereof, or compounds containing them in the molecule may be single-stranded or double-stranded, and may be linear or cyclic. Mutants are those in which a part of the above sequence is mutated, substituted, inserted, or deleted, and NF- / B is The nucleic acids that specifically antagonize the nucleic acid binding sites that bind are shown.
  • More preferred decoy of NF- ⁇ B is a double-stranded oligonucleotide containing one or several of the above nucleic acid sequences or a mutant thereof.
  • the oligonucleotide used in the present invention may be an oligonucleotide having a thiophosphate diester bond (S-oligo) in which the oxygen atom of the phosphodiester bond is substituted with a zeo atom, or a methylphosphine having no charge in the phosphodiester bond.
  • Oligonucleotides that have been modified to make them less susceptible to degradation in vivo, such as oligonucleotides substituted with a single group, are included.
  • a general chemical synthesis method or a biochemical synthesis method can be used as a method for producing the NF— / cB decoy used in the present invention.
  • a nucleic acid is used as a decoy of NF- ⁇ B
  • a nucleic acid synthesis method generally used in gene engineering can be used.
  • a target decoy nucleotide is directly synthesized using a DNA synthesizer.
  • nucleic acids containing the nucleic acids or a part thereof the nucleic acids may be amplified using a PCR method or a cloning vector.
  • nucleic acid obtained by these methods may be cleaved with a restriction enzyme or the like, and then bound with a DNA ligase or the like to produce the desired nucleic acid. Further, in order to obtain a more stable decoy nucleotide in a cell, the nucleic acid may be subjected to chemical modification such as alkylation or acylation at the base, sugar or phosphate moiety.
  • the preparation containing the NF- / cB decoy as the main component obtained by the present invention is not particularly limited as long as the preparation is such that the active ingredient is taken up into the cells of the affected area or the cells of the target tissue. Instead, it is administered orally, parenterally, topically or topically, using NF- NFB decoy alone or in combination with a conventional carrier.
  • These preparations may be in the form of liquid dosage forms such as solutions, suspensions, syrups, ribosome preparations, emulsions, syrups, etc., or in the form of solid dosage forms such as tablets, granules, powders and capsules. There may be.
  • the above formulation contains various carriers, auxiliaries, stabilizers, lubricants, and other commonly used additives such as lactose, citrate, tartaric acid, stearic acid, magnesium stearate, clay, sucrose, and corn starch. , Talc, gelatin, agar, pectin, falling raw oil, olive oil, cocoa butter, ethylene glycol, etc. can be added.
  • auxiliaries such as lactose, citrate, tartaric acid, stearic acid, magnesium stearate, clay, sucrose, and corn starch.
  • Talc agar, pectin, falling raw oil, olive oil, cocoa butter, ethylene glycol, etc.
  • ribosome preparations such as ribosome preparations utilizing liposome and endocytosis, preparations containing cationic lipids such as lipofectamine (manufactured by Lifetech Oriental), or virus preparations using retrovirus vector-1 or adenovirus vector This is advantageous, and a membrane-fused ribosome preparation is particularly preferred.
  • the ribosome structure can be any of large single-walled ribosomes (LUV), multilayer ribosomes (MLV), and small single-walled ribosomes (SUV).
  • the size can be about 200 to 1000 nm for LUV, about 400 to 3500 nra for MLV, and about 20 to 50 nm for SUV.
  • an MLV of 200 to 1000 nm is used.
  • the method for producing the liposome is not particularly limited as long as the decoy is retained, and a conventional method such as a reverse phase evaporation method (Szoka, F., et al .: Biochim, Biophys. Acta, Vol. 601 559) (1980)), ether injection method (Deamer, DW: Ann. NY Acad. Sci., Vol. 308250 (1978)), surfactant method (Brunner, J., et al .: Biochim. Biophys. Acta, Vol. 55). 322 (1976)).
  • a reverse phase evaporation method Szoka, F., et al .: Biochim, Biophys. Acta, Vol. 601 559) (1980)
  • ether injection method Deamer, DW: Ann. NY Acad. Sci., Vol. 308250 (1978)
  • surfactant method Brunner, J., et al .: Biochim. Biophys. Acta, Vol. 55). 322
  • Phospholipids cholesterols, nitrogen lipids, and the like are used as lipids for forming the liposome structure.
  • Phospholipids are generally suitable, and phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol, and phosphatidylinositol are generally used.
  • Toyl phosphatidyl choline dipalmi Toyl phosphatidyl ethano-lamine, dipalmi toinole phosphatidyl serine, eleostearoyl phosphatidyl choline, ele Synthetic phospholipids such as osteoalloinolephosphatidylethanolamine and eleostearoylphosphatidylserine can be used. These lipids containing phospholipids can be used alone or in combination of two or more. At this time, the binding rate of an electrically negative decoy nucleotide can be increased by using a molecule having a positive group such as ethanolamine-choline in the molecule. In addition to these main phospholipids at the time of ribosome formation, additives generally known as additives for ribosome formation, such as cholesterols, stearylamine, ⁇ -tocopherol, and the like can also be used.
  • the liposome obtained in this way promotes the uptake into the cells of the affected area or the cells of the target tissue, and is therefore a membrane fusion promoting substance, for example, a membrane purified from Sendai virus, inactivated Sendai virus, or Sendai virus.
  • a fusion-promoting protein, polyethylene render recall, and the like can be added.
  • a specific example of a method for producing a ribosome preparation is as follows.For example, the liposome-forming substance is dissolved together with cholesterol and the like in an organic solvent such as tetrahydrofuran, chloroform, ethanol, and the like. Then, the solvent is distilled off under reduced pressure to form a liposome-forming substance film on the inner surface of the container. This was added to the NF-? Kappa you containing decoy ⁇ buffer stirred, after addition of further membrane fusion promoting substance the desired the resulting ribosomes, isolating the ribosomes. Thus ribosome containing decoy is NF-?
  • Kappa beta obtained can be used in either suspended in a suitable solvent, or when it was re-dispersed in a suitable solvent those sputum lyophilization treatment .
  • the membrane fusion promoter may be added after isolation of the ribosome and before use.
  • NF- (c ⁇ ⁇ ⁇ ) as a main component obtained in this manner can be administered by various methods depending on the type of disease, the type of decoy used, and the like.
  • ischemic disease inflammatory disease
  • invasion and cachexia can be administered intravascularly, applied to a diseased site, administered to a diseased site, or administered intravascularly to a diseased site.
  • PTC II when PTC II is performed for organ infarction, etc., it can be administered to the affected blood vessel at the same time or before and after it.
  • the organ to be transplanted may be treated with the preparation used in the present application in advance and used.
  • rheumatoid arthritis rheumatism and the like it can be directly injected into the joint and used.
  • the dose of the NF-KB decoy is appropriately selected depending on the age and other conditions of the patient, the type of disease, the type of decoy used, and the like.
  • the dose can be given from 10 to 10 or 00 nmole per dose once to several times a day.
  • nucleotides having the same base composition as the decoy nucleotide of c B but having a random sequence were synthesized. After heating these nucleotides at 80 ° C. for 30 minutes, they were cooled to room temperature over 2 hours to obtain double-stranded DNA.
  • Phosphatidylserine, phosphatidylcholine and cholesterol were dissolved in tetrahydrofuran in a weight ratio of 1: 4.8: 2 (total 10 mg ).
  • the tetrahydrofuran was removed from the lipid solution using a rotary evaporator to attach the lipid to the flask surface.
  • 200 ml of a physiological saline solution (BSS; 139 mM NaCl, 5.4 mM KC1, 5.4 mM KC1, lOmM Tris-HCl, pH 7.6) containing the NF- ⁇ B decoy oligonucleotide (0.7 mg) obtained in Example 1 was added to the flask.
  • NF- / c A ribosome suspension containing the decoy oligonucleotide of B was prepared. 3 minutes before using purified Sendai virus (strain Z: 10,000 hemaglutinating units) to the obtained liposome suspension (containing 0.5 ml and 10 mg of lipid), UV irradiation (lOerg / ⁇ 2 / sec), and mixed to make a total of 4 ml with BSS. The mixture was kept at 4 ° C. for 5 minutes and then gently shaken at 37 a C for 30 minutes.
  • Sendai virus strain Z: 10,000 hemaglutinating units
  • the top layer is collected, the concentration is adjusted with BSS, and the liposome containing 8 n ⁇ of NF- / cB decoy oligonucleotide is encapsulated.
  • the formulation was obtained.
  • a preparation was obtained using the scrambled decoy oligonucleotide obtained in Example 1 instead of the NF-KB decoy oligonucleotide.
  • a force neuron was inserted into the left carotid artery close to the airway and placed in the vicinity of the aortic valve of the heart (near the inlet of the coronary artery). .
  • he applied force to the trachea and connected it to a ventilator to perform artificial respiration.
  • an incision was made between the left thoracic ribs, and the left anterior descending branch of the rat heart was ligated with a thread to create ischemia.
  • the ligated thread was cut, and immediately after reperfusion was started, the NF-KB decoy nucleotide and the scrambled decoy nucleotide encapsulated in the ribosome prepared in Example 2 were injected into the coronary artery at a 1.5 m IZ rat. Administered by force-neutral indwelling in the vicinity. After that, the chest is closed and the trachea is sutured and left alive. Twenty-four hours later, the rats were anesthetized again, the hearts were removed, washed with physiological saline, and the rat ventricle was cut into six sections, and TTC (tetrazolium chloride) staining was performed. Six sections were photographed and image analysis was performed for each. The infarct area was calculated according to the following equation.
  • Infarct rate (%) sum of infarct areas of 6 sections ⁇ sum of areas of 6 sections X 100 The statistical calculation was performed by inter-multiple comparison (Anova).
  • mice Seven-week-old C57BLZ6 female mice were intravenously administered 1 ⁇ 10 4 mouse reticulosarcoma M5076 cells, and 24 hours later, 0.2 ml of NF-KB decoy nucleotide produced in the same manner as in Example 2 (6 nmoles) was administered intravenously.
  • the control group received 0.2 ml of physiological saline.
  • the number of tumor nodules on the surface of the liver was counted under a stereoscopic microscope.
  • Ten mice were used per group. Kruskal-Wallis test and Dunnett's multiple comparison test were used for statistical analysis.
  • the mean number of tumor nodules in the control group was 166 and the median was 173 (116 to 198), whereas in the NF- ⁇ B decoy-treated group, the mean was 29 and the median was 27 (19 to 54). ), And a significant difference was observed between the NF- »cB decoy-administered group and the control group with a risk factor of 1% or less.
  • a 7-week-old male BALB / c mouse was implanted subcutaneously with a 2 mm square tumor piece of mouse colon cancer Co 1 on 26, and from day 7 0.2 ml (6 nmoles) of NF- ⁇ B decoy or scrambled decoy was administered into the tumor, and the body weight and the tumor weight were measured over time. Also, on the 13th day, epididymal fat and gastrocnemius muscle were excised, and their weight was measured. Further, the wet weight of carcass excluding all remaining organs and tumors was measured. The tumor weight was calculated by the following formula using the major axis and minor axis of each tumor.
  • Tumor weight (mg) major axis X minor axis 2 Z2
  • mice Ten mice were used per group. One-way analysis of variance and Dunnett's multiple comparison test were used for statistical analysis.

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Description

明 細 書
NF- /c Bに起因する疾患の治療および予防剤 技術分野
本発明は、 サイトカインゃ接着因子等の転写調節因子の 1つとして知られる NF 一 κ Bに起因する様々な疾患の予防又は治療に関する。 詳細には NF— K Bのデコ ィ、 該デコイを含有する N F - κ Βに起因する疾患の治療および予防剤ならびに治 療および予防方法に関する。 背景技術
喘息、 ガン、 心臓病、 自己免疫疾患およびウィルス感染症などの様々な疾患は、 異なる症状を示すにも拘わらず、 1種類または数種類の蛋白質が、 過剰発現あるい は過少発現したことが原因の多くを占めることが示唆されている。 また、 蛋白質の 発現には様々な転写活性化因子および転写抑制因子等の転写調節因子が関与してい る。 転写調節因子の 1つとして知られている NF— κ Βは、 6 5と 5 0のへテ 口ダイマーからなっている。 通常は、 細胞質内に阻害因子 I κ Βが結合した形で存 在し、核移行が阻止されている。 ところが、何らかの原因でサイトカインゃ、虚血、 再灌流といった何らかの刺激が加わると I κ Βがリン酸化され、 分解されることに より、 NF— κ Βは活性化されて核内に移行する。 NF— κ Βは染色体の NF— κ Β結合部位に結合することにより、 その下流にある遺伝子の転写を促進する。 NF 一 により制御される遺伝子には、 例えば、 I L一 1、 I L一 6、 I L一 8など のサイトカイン類や、 VCAM— 1や I CAM— 1などの接着因子がある。 発明の開示
これらのサイトカイン類ゃ接着因子の生産の活性化が、虚血性疾患、炎症性疾患、 自己免疫疾患、 ガンの転移浸潤、 悪液質等の種々の疾患を引き起こす一つの原因と なっていると予測し、 鋭意研究の結果、 NF— κ Βに起因する疾患の治療には、 Ν F- <c Βの核酸結合部位に対するデコイ、 つまり NF— / c Bが結合する核酸部位と 特異的に拮抗する化合物を投与することにより N F—/ c Bにより活性化される遺伝 子の発現を抑制することが非常に有効であることを見いだし、 本発明を完成した。 すなわち、 本発明は、 N F— ft Bのデコイを主成分として含有する、 N F— K B に起因する種々の疾患の治療および予防剤及びその予防治療方法を提供するもので ある。
本発明の治療予防剤の対象とする疾患は、 N F— κ Bに起因する疾患、すなわち、 転写調節因子 N F— κ Βが制御する遺伝子の所望しない活性化に起因する疾患であ り、 このような疾患としては、 例えば虚血性疾患、 炎症性疾患、 自己免疫疾患、 ガ ンの転移 '浸潤、 悪液質等が挙げられる。 虚血性疾患としては虚血性臓器疾患 （例 えば心筋梗塞、 急性心不全、 慢性心不全等の虚血性心疾患、 脳梗塞等の虚血性脳疾 患および肺梗塞等の虚血性肺疾患等）、臓器移植 ·臓器手術後の予後の悪化（例えば 心移植、 心臓手術、 腎移植、 腎臓手術、 肝移植、 肝臓手術、 骨髄移植、 皮膚移植、 角膜移植、 肺移植等の予後の悪化）、 再灌流障害、 P T C Α後の再狭窄等が挙げら れる。 炎症性疾患としては腎炎、 肝炎、 関節炎等の種々の炎症、 急性腎不全、 慢性 腎不全、 動脈硬化等が挙げられる。 また、 自己免疫疾患としてはリューマチ、 多発 性硬化症、 橋本甲状腺炎等が挙げられる。 特に本発明により得られる N F— /c Bの デコイを主成分として含有する医薬品は、 虚血性疾患の再灌流障害、 臓器移植又は 臓器の手術後の予後の悪化、 P T C A後の再狭窄、 ガンの転位 '浸潤、 ガン発生後 に伴う体重減少等の悪液質の治療および予防には好適である。
本発明で用いられる N F— κ Bのデコイとしては、 染色体上に存在する N F— κ Βの核酸結合部位と特異的に拮抗する化合物であればよく、 例えば核酸およびその 類似体が含まれる。 好ましい N F— κ Βのデコイの例としては、 核酸配列 GGGATT TCCC (配列表の配列番号 1の 5， 末端から 8から 1 7番目の配列） またはその相補 体を含むオリゴヌクレオチド、 その変異体、 またはこれらを分子内に含む化合物が あげられる。 オリゴヌクレオチドは D N Aでも R N Αでもよく、 またそのオリゴヌ グレオチド内に核酸修飾体または/および擬核酸を含むものであってもよい。 ま た、 これらのオリゴヌクレオチド、 その変異体、 またはこれらを分子内に含む化合 物は 1本鎖でも 2本鎖であってもよく、 線状であっても環状であってもよい。 変異 体とは上記配列の一部が、 変異、 置換、 挿入、 欠失しているもので、 N F—/ Bが 結合する核酸結合部位と特異的に拮抗する核酸を示す。 さらに好ましい N F— κ B のデコイしては、 上記核酸配列を 1つまたは数個含む 2本鎖オリゴヌクレオチドま たはその変異体があげられる。 本発明で用いられるオリゴヌクレオチドは、 リン酸 ジエステル結合部の酸素原子をィォゥ原子で置換したチオリン酸ジエステル結合を もつオリゴヌクレオチド （S—オリゴ）、 または、 リン酸ジエステル結合を電荷をも たないメチルホスフエ一ト基で置換したオリゴヌクレオチド等の生体内でオリゴヌ クレオチドが分解を受けにくくするために改変したオリゴヌクレオチド等が含まれ る。
本発明で用いられる N F—/ c Bのデコイの製造方法としては、 一般的な化学合成 法または生化学合成法を用いることが出来る。 例えば N F— κ Bのデコイとして核 酸を用いる場合、遣伝子工学で一般的に用いられる核酸合成法を用いることが出来、 例えば、 D NA合成装置を用いて目的のデコイヌクレオチドを直接合成してもよい し、 またこれらの核酸、 それを含む核酸またはその一部を合成した後、 P C R法ま たはクローニングベクター等を用いて核酸を増幅してもよい。 さらに、 これらの方 法により得られた核酸を、 制限酵素等を用いて切断後、 D N Aリガ一ゼ等を用いて 結合等を行い目的とする核酸を製造してもよい。 また、 さらに細胞内でより安定な デコイヌクレオチドを得るために、 核酸の塩基、 糖、 リン酸部分を例えばアルキル 化、 ァシル化等の化学修飾を施してもよい。
本発明により得られる N F—/ c Bのデコイを主成分として含有する製剤は、 主薬 が患部の細胞または目的とする組織の細胞内に取り込まれるような製剤であれば特 に限定されるものではなく、 N F— Κ Bのデコイ単独で、 もしくは慣用の担体と混 合して、 経口投与、 非経口投与、 局所投与ないしは外用の形で投与される。 これら の製剤は溶液、 懸濁液、 シロップ、 リボソーム製剤、 乳剤、 シロップ等の液体の投 与形態であってもよいし、 錠剤、 顆粒剤、 粉末剤、 カプセル剤などの固形の投与形 態であってもよい。 必要に応じ、 上記製剤には各種の担体、 助剤、 安定剤、 潤滑剤、 その他一般に使用される添加剤、 例えば乳糖、 クェン酸、 酒石酸、 ステアリン酸、 ステアリン酸マグネシウム、 白陶土、 蔗糖、 コーンスターチ、 タルク、 ゼラチン、 寒天、 ぺクチン、 落下生油、 オリ一ブ油、 カカオバター、 エチレングリコールなど を添加することができる。 特に、 NF— KBのデコイとして核酸またはその修飾体を用いる場合には、好ま しい製剤としては一般に用いられている遺伝子導入法で用いられる形態、 例えばセ ンダイウィルス等を用いた膜融合リボソーム製剤やエンドサイ トーシスを利用する リボソーム製剤等のリボソーム製剤、 リポフエク トァミン （ライフテックオリエン タル社製） 等のカチオン性脂質を含有する製剤またはレトロウイルスベクタ一、 ァ デノウィルスベクター等を用いるウィルス製剤を用いるのが有利であり、 特に膜融 合リボソーム製剤が好ましい。
リボソーム製剤は、 そのリボソームの構造体が、 大きな 1枚膜リボソーム （LU V)、 多重層リボソーム （MLV)、 小さな一枚膜リボソーム （SUV) のいずれで あってもよい。 その大きさも、 LUVでは 200から 1000 nm、 ML Vでは 40 0から 3500 nra、 SUVでは 20から 50 nm程度の粒子系をとり得るが、 セン ダイウィルス等を用いる膜融合リポソーム製剤の場合は粒子系 200から 1000 nmの MLVを用いるのが好ましい。
リポソームの製造方法は、 デコイが保持されるものであれば特に限定されるもの ではなく、慣用の方法、例えば逆相蒸発法（Szoka,F. ,etal:Biochim, Biophys. Acta, Vol.601 559(1980))、 エーテル注入法 （Deamer, D. W. ： Ann. N. Y. Acad. Sci.， Vol.308250(1978))、 界面活性剤法 （Brunner, J. , etal: Biochim. Biophys. Acta, Vol. 55 322(1976)) 等を用いて製造することができる。
リポソーム構造を形成十るための脂質としてはリン脂質、 コレステロール類ゃ窒 素脂質等が用いられるが、 一般的にはリン脂質が好適であり、 ホスファチジルコリ ン、 ホスファチジルセリン、 ホスファチジルグリセロール、 ホスファチジルイノシ トール、 ホスファチジルエタノールァミン、 ホスファチジン酸、 カルジォリピン、 スフインゴミエリン、 卵黄レシチン、 大豆レシチン、 リゾレシチン、 等の天然リン 脂質、 あるいはこれらを常法によって水素添加したものの他、 ジセチルホスフエ一 ト、 ジステアロイルホスファチジルコリン、 ジパルミ トイルホスファチジルコリン、 ジパルミ トイルホスファチジルェタノ—ルァミン、 ジパルミ トイノレホスファチジル セリン、 エレォステアロイルホスファチジルコリン、 エレォステアロイノレホスファ チジルエタノールァミン、 エレォステアロイルホスファチジルセリン等の合成リン 脂質等を使用することができる。 これらのリン脂質を含む脂質類は単独で用いることもできるが、 2種以上を併用 することも可能である。 このとき、 エタノールアミンゃコリン等の陽性基をもつ原 子団を分子内に持つものを用いることにより、 電気的に陰性なデコイヌクレオチド の結合率を増加させることもできる。 これらリボソーム形成時の主要リン脂質の他 に一般にリボソーム形成用添加剤として知られるコレステロール類， ステアリルァ ミン、 α—トコフエロール等の添加剤を用いることもできる。
このようにして得られるリポソ一ムは患部の細胞または目的とする組織の細胞内 に取り込みを促進するために、 膜融合促進物質、 例えばセンダイウィルス、 不活化 センダイウィルス、 センダイウィルスより精製された膜融合促進蛋白質、 ポリェチ レンダリコール等を加えることができる。
リボソーム製剤の製造法の例を具体的に説明すると、 たとえば前記したリポソ一 ム形成物質をコレステロール等と共にテトラヒ ドロフラン、 クロ口ホルム、 ェタノ ール等の有機溶媒に溶解し、 これを適当な容器に入れて減圧下に溶媒を留去して容 器内面にリポソーム形成物質の膜を形成する。 これに N F— κ Βのデコイを含有す る緩衝液を加えて攪拌し、 得られたリボソームにさらに所望により前記した膜融合 促進物質を加えた後、 リボソームを単離する。 このようにして得られる N F— κ Β のデコイを含有するリボソームは適当な溶媒中に懸濁させるか、 或いはいつたん凍 結乾燥したものを適当な溶媒に再分散させて治療に用いることができる。 膜融合促 進物質はリボソーム単離後、 使用までの間に加えてもよい。
この様にして得られた N F— κ Βのデコイを主成分として含有する製剤における、 デコイの含有割合は、 N F— κ Βに起因する疾患を有効に阻止できる量が含有され ていれば特に限定されず、 適用疾患、 適用部位、 投与形態および投与方法に応じて 種々設定することができる。
この様にして得られる N F— (c Βを主成分として含有する医薬品は、疾患の種類、 使用するデコイの種類等により各種の方法で投与することができ、 例えば虚血性疾 患、 炎症性疾患、 自己免疫疾患およびガンの転移 '浸潤、 悪液質においては血管内 投与、 疾患部位に塗布、 疾患部位内に投与または疾患部位に血管内投与等する事が できる。 さらに具体的な例としては、 たとえば臓器梗塞等で P T C Αを行う場合に は、 同時またはその前後に患部血管に投与する事ができ、 また、 臓器移植等では移 植する臓器を予め本願で用いられる製剤で処置して用いてもよい。 また、 たとえば 変形関節炎リュゥマチ等では直接関節内に注入して用いることもできる。
N F - K Bのデコイの投与量は、年齢その他患者の条件、疾病の種類、使用する デコイの種類等により適宜選択されるが、 例えば血液内投与、 筋肉内投与、 関節内 投与等では一般には 1回あたり 1 0から 1 0、 0 0 0 nmoleを 1日 1回から数回投 与する事ができる。 発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例 1 N F— κ Bのデコイ （デコイオリゴヌクレオイド） の合成
D N A合成機で S—オリゴ用いて、それぞれ下記の塩基配列を持つ N F— K Bの デコイオリゴヌクレオチドおよびスクランブルデコイオリゴヌクレオチド（ N.F—
(c Bのデコイヌクレオチドと同じ塩基組成を持つが配列がランダムなヌクレオチ ド） を合成した。 これらのヌクレオチドを 8 0度、 3 0分加熱した後、 室温に 2時 間かけて室温まで冷却し、 2本鎖 D N Aを得た。
N F - κ Bデコイオリゴヌクレオチド
CCTTGAAGGGATTTCCCTCC GGAACTTCCCTAAAGGGAGG
スクランブルデコイオリゴヌクレオチド
TTGCCGTACCTGACTTAGCC AACGGCATGGACTGAATCGG
実施例 2 リポソーム製剤の製造
フォスファチジルセリン、 フォスファチジルコリンおよびコレステロールを重量 比 1 : 4. 8 : 2 (合計 10mg) をテトラヒドロフランに溶解させた。 ロータリーエバポレ 一ターを用いて、 この脂質溶液からテトラハイド口フランを除去し、 脂質をフラス コ表面に付着させた。 このフラスコに、 実施例 1で得られた N F— κ Bデコイオリ ゴヌクレオチド （0. 7mg) を含む生理食塩水 （BSS ; 139mM NaCl, 5. 4mM KC1, lOmM Tris-HCl, pH 7. 6) 200mlに加え、 常法により、 攙拌及び超音波処理し、 N F—/ c Bのデコイオリゴヌクレオチドを含むリボソーム懸濁液を調製した。 得られたリポ ソ一ム懸濁液 （0. 5ml, 10mgの脂質を含有） に、 精製したセンダイウィルス （Z株： 10000 hemaglutinating units ) を使用する 3分前に UV照射 （l lOerg/瞧 2/sec) で不活化したものを混合し、 BSSで合計 4ml とした。 混合物を 4 °Cで 5分問保持し た後、 3 7 aCで穏やかに 3 0分間振とうした。 スクロース密度勾配遠心により、 リ ポソームに結合していないセンダイウィルスを除いた後、 最上層を採取し、 BSS で 濃度を調節し、 8 n Μの N F— /c Bデコイオリゴヌクレオチドが封入されたリポソ 一ム製剤を得た。 同様に N F— K Bデコイオリゴヌクレオチドの代わりに実施例 1 で得られたスクランブルデコイオリゴヌクレオチドを用いて製剤を得た。
実施例 3 再灌流モデル実験
( 1 ) 実験方法
9 - 1 0週齢の S Dラシトをペントバルビタールナトリゥムで麻酔した後、 気道 に近接した左頸動脈に力ニューレを挿入し心臓の大動脈弁の近傍 （冠動脈の流入口 の近く） に留置した。 さらに、 気管に力ニューレをほどこし、 人工呼吸器につない で人工呼吸をおこなった。 その後、 左胸部肋間を切開し、 ラット心臓の左前下行枝 を糸で結紮し、 虚血を作成した。 3 0分後、 結紮した糸を切り、 再灌流を開始した 後すぐに実施例 2で作成したリボソームに封入した N F— K Bデコイヌクレオチド およびスクランブルデコイヌクレオチドを 1 . 5 m I Zラットで冠動脈の流入口の 近くに留置した力ニューレにより投与した。 その後、 閉胸し、 気管も縫合し生存放 置しておく。 2 4時間後、 ラットを再度麻酔し、 心臓を取り出し、 生理食塩水で洗 浄した後、 ラット心室を 6切片に切断し、 T T C (塩化テトラゾリゥム） 染色を行 つた。 6切片の写真を取り、 それぞれ画像解析を行った。 なお、 梗塞領域は以下の 式に従って算出した。
梗塞率 （％) = 6切片の梗塞面積の和ノ 6切片の面積の和 X 1 0 0 なお、 統計計算は多重間比較 （A n o v a ) にて実施した。
( 2 ) 結果
結果を表 1に示した。 無処置群とスクランブルデコイ投与群においては、 両間に ほぼ同程度の心筋梗塞の発生が観察されたが、 N F— K Bデコイヌクレオチド投与 群ではその発生が 1 9 %と、 無処置群並びにスクランブルデコイ投与群に比し梗塞 が有意 （Pく 0.01)に抑制されていた c
Figure imgf000010_0001
なお、 梗塞直前投与においても同様に抑制効果が得られた。
実施例 4 ガン転移の抑制
(1) 実験方法
7週令の C 57BLZ6系雌性マウスに、 マウス細網肉腫 M5076細胞 1 X 1 04個を静脈内投与し、 その 24時間後に、 実施例 2と同様にして製造した NF— K Bデコイヌクレオチド 0.2ml (6nmoles) を静脈內投与した。 コントロール群には 生理食塩水 0.2mlを投与した。 M 5076の静脈内投与後 14 S目に解剖し、 肝臓 表面上の腫瘍結節数を実体顕微鏡下で計数した。 一群当たり 10匹のマウスを用い た。 統計学的解析には、 Kruskal-Wallisの検定及び Dunnettの多重比較検定を用い た。
(2) 結果
コント口ール群の腫瘍結節数が、平均値 166、 中央値 173 (1 16〜 198) であったのに対し NF— κ Bデコイ投与群では、 平均値 29、 中央値 27 (19〜 54)であり、 NF— »c Bデコイ投与群とコント口一ノレ群との間には危険率 1%以 下で有意な差が認められた。
実施例 5 悪液質の抑制
(1) 実験方法
7週令の BALB/c系雄性マウスに、 マウス結腸ガン Co 1 o n 26の 2mm角 の腫瘍片を皮下移植し、 その 7日目から NF—κ Bデコイまたはスクランブルデコ ィ各 0.2ml (6nmoles) を腫瘍内に投与し、 経時的に体重及び腫瘍重量を計測した。 また、 13日目に解剖し、 副睾丸脂肪及び腓腹筋を摘出し、 その重量を測定した。 さらに、 残ったすベての臓器及び腫瘍を除いたカルカス湿重量を測定した。 腫瘍重 量は、 各腫瘍の長径及び短径ょり以下の式にて腫瘍重量を計算した。
腫瘍重量 （mg) =長径 X短径 2Z2
一群当たり 10匹のマウスを用いた。 統計学的解析には、 一元配置分散分析及び Dunnettの多重比較検定を用いた。
(2) 結果
担癌群においては腫瘍の増殖に伴い、 体重、 副睾丸脂肪重量、 腓腹筋重量及び力 ルカス湿重量の有意な減少が認められた。 NF— κ Βデコイ投与群では、体重を 4 7%、 副睾丸脂肪重量を 42%、 腓腹筋重量を 60%及びカルカス湿重量を 52% 改善させたが、 スクランブルデコイ投与群では全く回復作用を示さなかった。 腫瘍 重量には明らかな作用は認められなかった。 配列表
( 1 ) 配列番号： 1 ：
( i ) 配列の特徴
(A) 配列の長さ ： 20
(B) 配列の型：核酸
(C) 鎖の数： 2本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
( i i ) 配列の種類：合成 DNA
( i i i ) 配列：配列番号： 1 ：
CCTTGAAGGG ATTTCCCTCC 20 ( 1 ) 配列番号： 2 ：
( i ) 配列の特徴
(A) 配列の長さ ： 20
(B) 配列の型：核酸
(C) 鎖の数： 2本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
( i i) 配列の種類：合成 DNA ( i i i)配列：配列番号： 2 ：
TTGCCGTACC TGACTTAGCC 20

Claims

請求の範囲
1. NF-κΒのデコイを含有する N F-κ Βに起因する疾患の治療および予防剤。
2. NF— κΒに起因する疾患が虚血性疾患、 炎症性疾患、 自己免疫疾患である請 求の範囲第 1項記載の治療および予防剤。
3. NF- K Bに起因する疾患が虚血性疾患である請求の範囲第 1項記載の治療お よび予防剤。
4. NF-κ Βに起因する疾患が虚血性疾患の再灌流障害、 臓器移植又は臓器の手 術後の予後の悪化、 P T C A後の再狭窄である請求の範囲第 1項記載の治療および 予防剤。
5. NF—»cBに起因する疾患が虚血性心疾患の再灌流障害、 心臓移植又は心臓の 手術後の予後の悪化、 PTC A後の再狭窄である請求の範囲第 1項記載の治療およ び予防剤。
6. NF— κΒに起因する疾患がガンの転移 '浸潤、 悪疫質である請求の範囲第 1 項記載の治療および予防剤。
7. 配列表の配列番号： 1に記載された配列の 5' 末端から 8から 17番目で表さ れる配列をもつ核酸およびその変異体を含む核酸。
8. NF— Κ Βのデコイが請求の範囲第 7項記載の核酸である請求の範囲第 1項記 載の治療および予防剤。
9. 請求の範囲第 7項記載の NF—κΒのデコイを含有するリボソーム製剤。
1 0. NF— K Bのデコイの有効量を哺乳動物に投与することからなる NF— κ Β に起因する疾患の治療および予防方法。
11. NF— κ Βに起因する疾患が虚血性疾患、 炎症性疾患、 自己免疫疾患である 請求の範囲第 10項記載の治療および予防方法。
12. NF— κΒに起因する疾患が虚血性疾患である請求の範囲第 10項記載の治 療および予防方法。
13. NF— κ Βに起因する疾患が虚血性疾患の再灌流障害、 臓器移植又は臓器の 手術後の予後の悪化、 PTC Α後の再狭窄である請求の範囲第 10項記載の治療お よび予防方法。
14. NF—K Bに起因する疾患が虚血性心疾患の再灌流障害、 心臓移植又は心臓 の手術後の予後の悪化、 PTC A後の再狭窄である請求の範囲第 10項記載の治療 および予防方法。
15. NF— K Bに起因する疾患がガンの転移.浸潤、 悪疫質である請求の範囲第 10項記載の治療および予防方法。
16. NF— KBのデコイが請求の範囲第 7項記載の核酸である請求の範囲第 10 項記載の治療および予防方法。
17. NF— κ Bのデコイの NF—/ c Bに起因する疾患の治療および予防のための 使用。
18. NF— ΚΒに起因する疾患が虚血性疾患、 炎症性疾患、 自己免疫疾患である 請求の範囲第 17項記載の治療および予防のための使用。
19. NF— κΒに起因する疾患が虚血性疾患である請求の範囲第 17項記載の治 療ぉよび予防のための使用。
20. NF—) cBに 因する疾患が虚血性疾患の再灌流障害、 臓器移植又は臓器の 手術後の予後の悪化、 PTC A後の再狭窄である請求の範囲第 17項記載の治療お よび予防のための使用。
21. NF— κ Bに起因する疾患が虚血性心疾患の再灌流障害、 心臓移植又は心臓 の手術後の予後の悪化、 PTC A後の再狭窄である請求の範囲第 17項記載の治療 および予防のための使用。
22. NF— KBに起因する疾患がガンの転移，浸潤、 悪疫質である請求の範囲第 17項記載の治療および予防のための使用。
23. NF— KBのデコイが請求の範囲第 7項記載の核酸である請求の範囲第 17 項記載の治療および予防のための使用。
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